.1.

NDICE

I. PRESENTACIN............................................................................................3

II. COMIT E INSTITUCIONES ORGANIZADORAS.............................4

III. COMIT DE HONOR....................................................................................5

IV. COMIT CIENTFICO...................................................................................6

V. INSTITUCIONES PATROCINADORAS Y COLABORADORAS...7

VI. FIRMAS COMERCIALES............................................................................8

VII. INFORMACIN GENERAL .......................................................................9

VIII. PROGRAMA...................................................................................................11

IX. CONFERENCIA INAUGURAL................................................................17

X. MESAS REDONDAS ..................................................................................23

XI. CONFERENCIA DE CLAUSURA ..........................................................89

XII. COMUNICACIONES (PSTERS) POR REAS TEMTICAS.....95

XIII. PRESENTACIONES ORALES I y II ................................................... 247

XIV. RELACIN DE COMUNICACIONES POR REAS TEMTICAS.....267

XV. RELACIN DE CONGRESISTAS....................................................... 281

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PRESENTACINEl Instituto de Productos Lcteos de Asturias (IPLA-CSIC) y el

Departamento de Biologa Funcional de la Universidad de Oviedo, en calidad deorganizadores, les dan la bienvenida al XII Congreso Nacional de Microbiologade los Alimentos (SEM), con el que Asturias, una de las comunidades autnomasen las que el sector agroalimentario ha adquirido un notable desarrollo, se suma alconjunto de regiones a las que la Sociedad Espaola de Microbiologa ha confiadola organizacin de un congreso sobre esta disciplina cientfica.

El Congreso se articula en torno a dos Conferencias Plenarias (Inaugural yde Clausura) que nos mostrarn, por un lado, los avances cientficos alcanzadoscuando se combinan en perfecta simbiosis la Microbiologa Clsica y la BiologaMolecular y, por otro, el camino a seguir para transferir los resultados de lainvestigacin a la industria agroalimentaria, favoreciendo as la accesibilidad de losmismos a la sociedad. Junto con las Conferencias Plenarias, las cuatro MesasRedondas nos darn una visin profunda y actual de temas de gran relevanciapara el sector agroalimentario, entre los que se incluyen los relacionados con losProcesos Fermentativos, los Residuos de Antibiticos, los Probiticos y lasNuevas Tecnologas en la Conservacin de los Alimentos.

La importancia de los temas que se abordarn en el Congreso y lacategora cientfica de los conferenciantes han sido decisivas para que laConsejera de Salud y Servicios Sociales del Principado de Asturias declarara esteCongreso de inters sanitario.

Las 125 comunicaciones, distribuidas en diez reas temticas, constituirnun buen reflejo de las lneas de investigacin que actualmente desarrollan losmicrobilogos espaoles y algunos microbilogos iberoamericanos, a los queagradecemos especialmente su presencia. Del conjunto de comunicaciones, docesern presentadas oralmente, al haber sido consideradas por el Comit Cientficocomo especialmente relevantes.

Nuestro agradecimiento al Ayuntamiento de Oviedo por permitirnosutilizar como sede del Congreso el Auditorio Prncipe Felipe, edificio singularde reciente inauguracin. Tendrn pues la oportunidad de disfrutar de lahospitalidad de la ciudad de Oviedo y de la multitud de actividades ldicas que secelebrarn estos das, al coincidir el Congreso con sus fiestas patronales.

Asimismo, nuestro agradecimiento a las Instituciones Pblicas que hancontribuido con su aportacin econmica a la financiacin de los gastos deorganizacin; agradecimiento que hacemos extensivo a las Firmas Comercialesque acuden a mostrar aquellos productos y equipos ms novedosos que, sinninguna duda, facilitarn nuestro trabajo.

El Comit Organizador

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COMIT E INSTITUCIONES ORGANIZADORASINSTITUCIONES

CSIC (Instituto de Productos Lcteos de Asturias) UNIVERSIDAD DE OVIEDO (Departamento de Biologa Funcional)

COMIT ORGANIZADOR Presidenta: Ana Rodrguez Gonzlez Vicepresidenta: Covadonga Barbs Miguel Secretario/Tesorero: Baltasar Mayo Prez

Responsables de Area:

Juan Carlos Bada Gancedo Victoria Bascarn Rodrguez Teresa Delgado Hervs Clara Gonzlez de los Reyes-Gaviln Alma Hernndez de Rojas Beatriz Martnez Fernndez

Vocales:

Miguel Angel Alvarez Gonzlez Roberto Crcoba Ruiz Jos Luis Caso Machicado Susana Delgado Palacio Mara Fernndez Garca Fernanda Fernndez Gutirrez Pilar Garca Surez M Jos Gonzlez Fernndez Miguel Gueimonde Fernndez Vctor Ladero Losada Carmen Madera Gonzlez Abelardo Margolles Barros M Cruz Martn Martn Luis Noriega Prez Isabel Nuo Prado Natalia Rilla Villar Claudia Snchez Lara Juan E. Surez Fernndez

Secretara: M del Pilar Garcia Arenas

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COMIT DE HONOR

Excmo. Sr. D. Vicente Alvarez ArecesPresidente del Principado de Asturias

Ilmo. Sr. D. Gabino de Lorenzo FerreraAlcalde Presidente del Ayuntamiento de Oviedo

Excmo. y Magnfico Sr. D. Juan A. Vzquez GarcaRector de la Universidad de Oviedo

Ilmo. Sr. D. Csar Nombela CanoPresidente del CSIC

Ilmo. Sr. D. Carlos Hardisson RumeuPresidente de la Sociedad Espaola de Microbiologa

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COMIT CIENTFICO

Vocales:

Dr. Juan Llaneza Llaneza Dra. M Carmen Mendoza Fernndez Dr. Manuel Nez Gutirrez Dr. Juan A. Ordez Pereda Dr. Daniel Ramn Vidal Dra. Begoa Sesma Vea Dr. Juan E. Surez Fernndez Dr. Federico Uruburu Fernndez

Coordinadora:

Dra. Ana Rodrguez Gonzlez

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INSTITUCIONES PATROCINADORAS YCOLABORADORAS

CSIC

Universidad de Oviedo

Cajastur Consejera de Cultura. Principado de Asturias Consejera de Salud y Servicios Sociales. Principado de Asturias Ministerio de Ciencia y Tecnologa.

Secretara de Estado de Poltica Cientfica y Tecnolgica.Direccin General de Investigacin.

Ayuntamiento de Oviedo

Sociedad Regional de Turismo. Principado de Asturias

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FIRMAS COMERCIALES

Stand expositor

Bioser, S.A. Foss Electric Espaa, S.A. Francisco Soria Melguizo, S.A. Instrumentos Testo, S.A. Merck Farma y Qumica, S.A. Oxoid, S.A. Panreac Qumica, S.A. Tecasa (Tecnologa Agraria, S.A.) Hispanlab S.A. Biomeriux Espaa, S.A. Biocheck S.A. Scharlab S.L.

Presentacin oral

Bio-Rad Laboratories, S.A.

Aporte de material y documentacin

Biocen, S.L. Mundiprensa-Libros, S.A. Pacisa y Giralt, S.L. Oxoid, S.A. Biomeriux Espaa, S.A.

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INFORMACIN GENERALFechas:

18, 19 y 20 de Septiembre de 2000

Sede:

Auditorio Prncipe FelipeC/ Prez de la Sala33007 Oviedo

El Acto Inaugural y las Sesiones Cientficas tendrn lugar en la Sala de Msica de Cmara(Planta Baja)

Stands y Psters se situarn en el Vestbulo Principal (Planta Baja) La Asamblea General del Grupo de Microbiologa de Alimentos de la SEM se celebrar en la

Sala de Conferencias de la Tercera Planta. Cctel de Bienvenida y Cafs se servirn en la Sala de Exposiciones (Planta Baja) Las Comidas se servirn en el Vestbulo de la Planta Segunda. Los autobuses que trasladarn a los Congresistas al Restaurante La Gruta Cena de

Clausura- saldrn de la misma Sede del Congreso.

Secretara del Congreso:

Instituto de Productos Lcteos de Asturias (IPLA-CSIC)Apdo. 8533300-Villaviciosa, Asturias, EspaaTlfnos.: +34 98 589 21 31/ +34 98 589 22 31Fax: +34 98 589 22 33e-mail: xllcongmical@greencom.netpgina web: http://veterinaria.unex.es/sem/XIIcongr.htm

Durante la celebracin del Congreso la Secretara estar situada en el Vestbulo Principal delAuditorio.

Inscripciones:

La cuota de Inscripcin incluye:Documentacin del CongresoAsistencia a las sesiones cientficasCertificado de AsistenciaTraduccin simultneaCctel de Bienvenida (lunes, 18)Caf (martes, 19 y mircoles, 20)Comida (martes, 19 y mircoles, 20)Cena de Clausura (mircoles, 20)

La cuota de acompaante incluye:Acceso al recinto del CongresoCctel de BienvenidaExcursin de jornada completa incluyendo comida (martes, 19)Excursin de media jornada (mircoles, 20). Comida en el Auditorio.Cena de Clausura.

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PLANO DE OVIEDO

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PROGRAMA

Primera Jornada

Lunes, 18 de Septiembre de 2000

17.00 h. Entrega de Documentacin y Despliegue de Psters

Visita a Stands de Expositores

19.00 h. Apertura Oficial del Congreso

19.30 h. Conferencia Inaugural:

Avances en la microbiologa de levaduras vnicasDr. Daniel Ramn Vidal (IATA-CSIC, Valencia, Espaa)

20.30 h. Cctel de Bienvenida(Sala de Exposiciones del Auditorio Prncipe Felipe)

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Segunda Jornada

Martes, 19 de Septiembre de 2000

8.45 h. Mesa Redonda: Procesos fermentativos en alimentos

Genetically improved starter strains: opportunities for the dairyindustry.Dr. Beat Mollet (Nestl Research Center, Suiza)Control de la fermentacin en sidras mediante tcnicas de biologamolecular.Dra. Carmen Cabranes Benduero (SERIDA, Principado Asturias,Espaa)Biotecnologa de levaduras: una herramienta para construirlevaduras de panadera a la carta.Dr. Jos Antonio Prieto Alamn (IATA-CSIC, Valencia, Espaa)

10.45 h. Caf (Sala de Exposiciones del Auditorio)Sesin de Psters (Los responsables de los psters con nmero pardeben situarse a pie de pster)Visita a Expositores

11.30 h Mesa Redonda: Residuos de antibiticos en alimentos.

Control de Residuos de Antibiticos. Diez Aos del Plan Nacionalde ResiduosDr. Vicente Caldern (I.S. Carlos III, Majadahonda, Madrid).Aspectos reguladores de los residuos de medicamentosveterinarios en los alimentosDr. Luis F. Corbaln (Agencia Espaola del Medicamento, Madrid)Resistencia antibitica en cepas humanas de origen zoonticoDr. Emilio Prez-Trallero (Servicio de Microbiologa. ComplejoHospitalario Donostia, San Sebastin, Espaa)

13.30 h Sesin de Psters y Visita a Expositores

14.00 h Comida (En El Restaurante Auditorio)

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15.45 h Presentaciones Orales:Bio-Rad Laboratories, S.A. y Psters Seleccionados I

PROBELIATM: deteccin rpida y fiable de microorganismos enalimentos mediante tcnicas de PCR.Bio-Rad Laboratories, S.A. Life Science Group.

Deteccin de Listeria monocytogenes en carne mediante PCR.Rosa Aznar y B. Alarcn.

Estudio comparativo de los cambios estructurales y ultraestructuralesque se producen durante la autolisis de las levaduras en un mediovnico modelo y en vinos espumosos elaborados por el mtodotradicional.Adolfo J. Martnez-Rodrguez, A.V. Carrascosa y M.C. Polo.

Comparacin de dos mtodos de extraccin de RNA para la deteccindel RNA de enterovirus y VHA en mejillones mediante RT-PCR.Nerea Casas y Ester Suen

Efecto antiproliferativo de tres cepas de Enterococcus faecium en unalnea celular de mieloma.Adriana Zabala, R. Martn, A. Haza, L. Fernndez, J.M. Rodrguez y P.Morales

Efecto del SO2 y otros componentes del vino sobre la actividadATPasa y la sntesis de protenas en diferentes cepas de Oenococcusoeni.Ramn Carret, A. Bordons y M. Constant

Purificacin, reconstitucin y caracterizacin funcional deLmra, unaprotena de membrana de Lactococcus lactis implicada en laresistencia a antibiticos y compuestos citotxicos.Abelardo Margolles, M. Putman, H.W. van Veen y W. Konings

17.30 h Asamblea General del Grupo de Microbiologa de Alimentos de la SEM

17.30 h-19.30 h Sesin de Psters y Visita a Expositores(Responsables de psters con nmero impar deben situarse a pie depster)

18.30 h. Reunin Sobre Normalizacin de Tcnicas y Mtodos MicrobiolgicosDr. Jos Martnez Peinado (Vicepresidente de la SEM)

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Tercera Jornada

Mircoles, 20 de Septiembre de 2000

8.45 h Mesa Redonda: Probiticos en alimentos

Probiotics: Present knowledge and future prospectsDra. Annick Mercenier (Instituto Pasteur, Lille, Francia)Probiticos en nutricin animalDra. Margarita Garriga (IRTA, Girona, Espaa)Aplicacin de lactobacilos de origen humano en el tratamiento detrastornos digestivosDra. Covadonga Barbs (Area Microbiologa, Univ. de Oviedo, Espaa)

10.45 h Caf (Sala de Exposiciones del Auditorio)Sesin de Psters (Responsables de psters con nmero impar debensituarse a pie de pster)Visita a expositores

11.30 h. Mesa Redonda: Nuevas tecnologas en conservacin de alimentos

Pasteurizacin de alimentos por mtodos no trmicosDr. Gustavo V. Barbosa-Cnovas (Washington State University,Pullman, WA, USA)Utilizacin de las altas presiones para la conservacin dealimentosDr. Buenaventura Guamis (Facultad de Veterinaria, UniversidadAutnoma de Barcelona, Espaa)La conservacin de alimentos por ultrasonidosDr. Javier Raso Pueyo (Facultad de Veterinaria, Universidad deZaragoza, Espaa)

13.30 h Sesin de Psters y Visita a Expositores

14.00 h. Comida (En El Restaurante Auditorio)

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15.30 h Presentaciones Orales:Psters seleccionados II

Influencia de Penicillium chrysogenum y Debaryomyces hansenii enla generacin de compuestos voltiles en jamn curadoAlberto Martn, J.J. Crdoba, M.J. Benito, M. Alonso y M.A. Asensio

Efecto de la competicin fngica en la colonizacin de granos demaz por Fusarium moniliforme, F. proliferatum y F. graminearum yen la produccin de fumonisina b, y de zearalenonaAndrea Velluti, S. Marn, L. Bettucci, A. Ramos y V. Sanchis.

Combinacin de bacteriocinas y cepas de Lactobacillus plantarumproductoras de bacteriocinas en la fermentacin y conservacin dezanahoriasRufino Jimnez Daz, B. Floriano, A. Maldonado, L. Rejano, A.H.Snchez y J.L. Ruiz

Caracterizacin de la respuesta al estrs por fro en cepas delevadura de panaderaSonia Rodrguez-Vargas, F. Randez-Gil y F. Estruch

Desarrollo de una tcnica impedanciomtrica para la deteccin deresiduos de antibiticos en carnesManuel Lpez-Cabanillas, A.X. Roig Sagus y J.J. Rodrguez Jerez

Desarrollo de un sistema para la generacin de bacterias del cidolctico recombinantes de grado alimentarioMiguel A. Alvarez, M.C. Martn y J.E. Surez

17.30 h Sesin de psters y Visita a Expositores (Responsables de psters connmero par deben situarse a pie de pster)

18.00 h Conferencia de Clausura:Del laboratorio a la empresa: un ejemplo de transferencia detecnologaProf. Dra. Silvia Gonzlez Cienfuegos (CERELA, S.M. Tucumn,Argentina)

19.00 h Acto de Clausura: Sntesis y PerspectivasDr. Juan A. Ordez Pereda (Presidente del Grupo Especializado deMicrobiologa de los Alimentos de la SEM)

19.30 h Retirada de psters

21.30 h Cena de Congreso: Hotel-Restaurante La Gruta

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CONFERENCIAINAUGURAL

Moderador: Dr. Juan Evaristo Surez Fernndez

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AVANCES EN LA MICROBIOLOGA DE LEVADURAS VNICAS.DANIEL RAMN

Departamento de Biotecnologa; Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos;Consejo Superior de Investigaciones Cientficas.

46100-Valencia, Espaa

Para cualquier microbilogo el nombre de Louis Pasteur evoca un tiempo glorioso, quizsromntico, pero sin duda apasionante, de la historia de nuestra disciplina cientfica. Para aquellosque trabajamos en microbiologa enolgica aun ms, ya que fue l quin estableci las basesmicrobiolgicas de la fermentacin alcohlica, orientando definitivamente sus trabajos a travs dedicho estudio hacia las ciencias de la vida. Han pasado ms de cien aos, una buena parte de loscuales han sido cientficamente baldos. Sorprendentemente, los ltimos diez aos han dado lugara avances considerables, obtenidos en buena medida gracias a la aplicacin de tcnicas debiologa molecular. Nuestro pas ha tenido un papel relevante en dichos trabajos, y nuestro grupoha tenido la fortuna de poder participar en algunas de estas investigaciones. A lo largo de estacomunicacin pretendo repasar los distintos focos de investigacin en microbiologa delevaduras vnicas, prestando especial atencin a aquellos en los que la participacin hispana hasido ms intensa.

Construir la casa desde los cimientos: la seleccin de levaduras vnicas.

La transformacin del mosto en vino es una reaccin microbiolgica que conlleva eldesarrollo secuencial de varias cepas de levaduras y bacterias cido lcticas. Tradicionalmente losvinos se han producido mediante fermentaciones naturales llevadas a cabo por levadurasprovenientes de las uvas y las bodegas. Las especies predominantes en la superficie del grano deuva son miembros de los gneros Kloeckera y Hanseniospora pero en el mosto inicial tambines posible detectar especies de Candida, Cryptococcus, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia yRhodotura. Tras tres o cuatro das de fermentacin Saccharomyces cerevisiae comienza apredominar y es la especie responsable de la fermentacin alcohlica durante el proceso devinificacin.

Son numerosos los estudios, en nuestro pas y fuera del mismo, que han demostrado unagran variabilidad en la cantidad y distribucin de especies microbianas en los granos de uva.Estas variaciones se deben a las condiciones climatolgicas, la variedad de uva y el grado demaduracin de la misma, el uso de fungicidas y el dao fsico de los granos durante la recogida.Las diferencias entre la microbiota de los mostos son claras, tanto cuando se comparan mostosde diferentes regiones como cuando se comparan diferentes cosechas en la misma zona. Portodo ello los bodegueros han comenzado a usar durante los ltimos aos cultivos de levadurasvnicas aisladas de su zona. Estos cultivos se usan en forma de levaduras secas seleccionadas quese inoculan en el mosto para llevar a cabo una fermentacin controlada. El resultado es un vino,campaa tras campaa, con unas propiedades enolgicas repetitivas tpicas de la D.O.

La seleccin de dichas levaduras se basa en diferentes criterios. Como un ejemplopodemos mencionar la seleccin por parte de nuestro grupo de una levadura de los mostos de laD.O. Alicante usando un esquema de seleccin basado en: i) la produccin de factor killer, ii) elperfil de fermentacin, y iii) el anlisis sensorial de los vinos producidos. En muchas D.O.espaolas se han llevado a cabo esquemas de seleccin similares y, como consecuencia de ello,se dispone de muchas levaduras vnicas aisladas de distintas D.O. espaolas. Este tesorobiolgico se encuentra en nuestra opinin demasiado disperso, y resultara de extraordinariointers cientfico localizar todos estos aislados en la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo(CECT). En este sentido resulta importante destacar el reciente acuerdo CSIC-Universitat deValncia, por el que a travs de un proyecto FEDER la coleccin de levaduras industriales delInstituto de Fermentaciones Industriales del Consejo Superior de Investigaciones Cientficas(CSIC) est siendo reordenada y replicada en la CECT.

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Marcando cepas: utilizacin de las tcnicas de biologa molecular para la taxonoma de laslevaduras vnicas y el estudio de la dinmica poblacional de las fermentaciones vnicas.

La identificacin de levaduras vnicas es importante por dos razones. Por un lado parafacilitar el control de calidad durante la produccin de las levaduras secas, y por otro paragarantizar la imposicin de la levadura inoculada. La mayora de levaduras vnicas pertenecen a laespecie S. cerevisiae y no pueden ser diferenciadas entre ellas por tcnicas microbiolgicasconvencionales. Por ello se han empleado distintas tcnicas moleculares para llevar a cabo suidentificacin. Esta tcnicas incluyen entre otras la hibridacin DNA-DNA, el anlisis decariotipos, el anlisis de restriccin del DNA mitocondrial (mtDNA) y el anlisis depolimorfismos por PCR. Se han llevado a cabo estudios comparativos entre estos mtodos quedemuestran que el anlisis del mtDNA es una opcin excelente dada su relativa simplicidad,costo y disponibilidad tcnica. En parte, la opcin del anlisis del mtDNA ha venido mediada porel desarrollo de mtodos simplificados capaces de diferenciar cepas de S. cerevisiae extraidas delmismo mosto. Usando dicho mtodo se han estudiado las dinmicas poblacionales defermentaciones vnicas naturales e inoculadas. En estos trabajos se ha podido demostrar que enun mosto inicial conviven decenas de cepas de la especie S. cerevisiae pero slo unas pocas deellas llegan a alcanzar niveles significativos durante la fermentacin. En otras palabras, el mostoes un reservorio natural de cepas de la especie S. cerevisiae pero hacer vino es el trabajo de tanslo algunas de ellas. En fermentaciones naturales se pueden detectar dos situaciones. Si el perfilde mtDNA entre las cepas iniciales es muy distinto (comparten pocos fragmentos de restriccin)se observa una sustitucin de las especies predominantes durante la vinificacin. Si por elcontrario es alto, aunque se detectan sustituciones secundarias se puede observar la imposicinde una de las cepas. En las fermentaciones inoculadas la levadura sembrada se impone a lo largode la fermentacin, pero lo hace sin suprimir el desarrollo de las levaduras oxidativas yapiculadas durante los primeros das de fermentacin, de forma que estos microorganismospueden ejercer su accin beneficiosa en el aroma de los caldos finales. Estos resultados suponenun avance considerable en la comprensin de la dinmica poblacional de las fermentacionesmicrobianas y hubieran sido imposibles de conseguir sin el concurso de las tcnicasmoleculares.

El resto de tcnicas enumeradas anteriormente han sido, y son, utilizadas intensamente parael marcaje de levaduras. Su uso ha permitido establecer casos de fraudes en la venta de levadurasvnicas comerciales. Es importante destacar que nuestro pas se ha destacado en el empleo de lasmismas. La aplicacin de la tcnica de anlisis del mtDNA en el esclarecimiento de la taxonomade levaduras vnicas (estudios sobre el complejo Saccharomyces sensu stricto o clasificacin delevaduras oxidativas y apiculadas de comienzo de fermentacin) ha sido una constante de trabajoen el Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos (CSIC) en colaboracin con la CECT.Dicho grupo ha transferido esta tecnologa a varias bodegas espaolas como Miguel Torres S.A.o Bodegas Torre Oria. Utilizando esta misma tcnica, el grupo del Departamento de Gentica dela Universidad de Sevilla ha realizado un estudio exhaustivo de las levaduras responsables de lacrianza biolgica de los vinos finos de Jerez, correlacionando dichos aspectos moleculares conaspectos fisiolgicos. En una interesante colaboracin entre el Centro de Investigacin yDesarrollo del CSIC en Barcelona y las bodegas Ramn Nadal del Peneds, se ha llevado a caboun trabajo similar, correlacionando en este caso los perfiles de mtDNA de distintas levaduras decava con sus distintas propiedades fisilogicas. Asimismo el grupo del Departamento deMicrobiologa de la Universitat Rovira i Virgili de Tarragona ha realizado un estudio molecularexhaustivo de las levaduras aisladas de vinos catalanes. La tcnica de electroforesis en campopulsante ha sido usada por varios grupos espaoles, entre otros los anteriormente mencionadosde la Universidad de Sevilla, la CECT y el IATA de Valencia, para estudiar las dotacionescromosmicas de las levaduras vnicas pertecientes a denominaciones de origen espaolas.Tambin el grupo del Departamento de Microbiologa de la Universidad de Crdoba ha utilizadoesta tcnica para diferenciar levaduras aisladas de la zona de Montilla-Moriles. El limitado poderde resolucin de esta tcnica en el caso de las levaduras vnicas, as como su tediosidad, ha hechoque su prctica haya cado en desuso frente a la tcnica del mtDNA. Varios grupos espaoleshan usado diversas modalidades de la tcnica de PCR, en particular la denominada PCR-RAPD,para diferenciar distintas cepas de levaduras vnicas. Por ejemplo, el grupo de la Universidad de

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Castilla-La Mancha la ha utilizado con xito para diferenciar distintos aislados de la zona deValdepeas. Tambin lo ha utilizado el grupo del Departamento de Microbiologa de laUniversidad Politcnica de Madrid y el grupo del Centro de Investigacin y DesarrolloAgroalimentario de Murcia. Es interesante destacar el desarrollo de un mtodo de nested PCRpor parte del grupo del departamento de Gentica de la Universidad de Mlaga y bodegasOsborne que permite la deteccin rpida y fiable de mnimas contaminaciones por Dekkera yBrettanomyces en sherry. En resumen, gracias al empleo de tcnicas moleculares elconocimiento de la microbiologa vnica ha avanzado considerablemente en nuestro pas durantelos ltimos aos.

Diseo racional de leveaduras vnicas: aplicacin de tcnicas de Ingeniera gentica.

El uso de levaduras inoculadas y la demostracin formal mediante tcnicas moleculares desu imposicin, junto con los avances en biotecnologa, abren la puerta a la modificacin genticade las levaduras vnicas. Es posible construir cepas que expresen actividades metablicas deinters que ejerzan efectos beneficiosos en las caractersticas organolpticas de los vinos. Lamodificacin gentica de las levaduras vnicas exige conocer promotores de genes de levadurasque se expresen especficamente durante determinados tiempos de la fermentacin. Por ellonuestro grupo inici proyectos encaminados a entender la regulacin de la expresin gnica enS. cerevisiae durante la vinificacin. En la actualidad se dispone de varios promotores que seinducen especficamente durante la fase logartmica o la fase estacionaria de vinificacin. En esteapartado de herramientas tambin merece la pena destacar que en nuestro grupo se handesarrollado protocolos de transformacin para las levaduras vnicas que rinden levadurasrecombinantes GRAS (generally recognized as safe).

Con estas herramientas hemos construido levaduras vnicas transgnicas que expresangenes que codifican celulasas y hemicelulasas. La adicin de estos enzimas para solventarproblemas de filtracin o incrementar aromas afrutados es una prctica habitual en las bodegas,pero la heterogeneidad de las preparaciones comerciales (una mezcla de enzimas que vara de lotea lote) ha hecho de su uso algo impredecible. Nuestro grupo ha construido diversas levadurasvnicas recombinantes que contienen genes de hongos filamentosos que codifican -L-arabinofuranosidasa, -glucosidasas, endo--(1,4)-glucanasas, ramnosidasas o endo--(1,4)-xilanasas. Todas estas levaduras son capaces de secretar los enzimas correspondientes al mostoen cantidades suficientes para llevar a cabo el proceso tecnolgico y producir vino con adecuadascaractersticas organolpticas. Estas cepas pueden ser usadas como herramientas para investigarel papel individual de cada enzima con el objetivo final de construir una cepa de hongofilamentoso capaz de secretar al medio de cultivo la combinacin adecuada de enzimas. Tambinse ha construido una levadura transgnica que contiene un gen fngico que codifica una pectatoliasa para solventar problemas de filtracin y disponemos de levaduras transgnicas que influyenen el color del vino, presentan nuevos perfiles de polisacridos de reserva o incrementan losniveles de resveratrol.

No somos el nico grupo trabajando en Espaa en estos temas. El grupo delDepartamento de Microbiologa de la Universidad de Santiago ha clonado y secuenciado el genFLO2 implicado en la floculacin. El producto de este gen activa los genes FLO1 del brazoderecho del cromosoma I e incluso de pseudogenes semejantes a FLO1. Este mismo grupo haclonado un gen de Saccharomyces cerevisiae denominado GU1 que codifica unaendopoligalacturonasa.

Conclusiones.

Asistimos al comienzo de una nueva era en microbiologa enolgica. La OIV (OfficeInternational de la Vigen et du Vin) empieza a discutir el uso de levaduras transgnicas en laproduccin de vinos. Durante los primeros aos de nuestro trabajo omos crticas constantes anuestro trabajo: era ciencia bsica, no se podra aplicar a ningn problema tecnolgico. FuePasteur quin dijo que no haba ms que un tipo de ciencia, y que de la buena ciencia (la nica)

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surgan las aplicaciones. Son varias las bodegas espaolas que comienzan a usar estas tcnicas.Los resultados que se han obtenido hasta ahora son significativos, probablemente inesperadoscinco aos atrs. Puede la enologa cerrar los ojos a esta revolucin?.

Agradecimientos

El autor quiere dedicar esta Conferencia Inaugural al Dr. Rafael Vila que hasta fechasrecientes fu responsable de la microbiologa clsica en el IATA. El autor agradece a todos losmiembros de su grupo el entusiasmo, la cooperacin y, sobre todo, la amistad en el trabajo queda a da entre todos han creado en el laboratorio. Las investigaciones del grupo han sidosubvencionadas por ayudas de la Generalitat Valenciana, la CICYT y la D.G. XII de la UE.

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MESA REDONDA IProcesos fermentativos en alimentos

Moderadora: Dra. Aida Pesce de Ruiz Holgado

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GENETICALLY IMPROVED STARTER STRAINS: OPPORTUNITIES FORTHE DAIRY INDUSTRY

BEAT MOLLETNestl Research Center, Nestec Ltd.,

Vers-chez-les-Blanc, 1000 Lausanne 26, Switzerland

Abstract

Milk can be fermented in a variety of different products varying in appearance, flavor,texture and health beneficial properties. The art of producing such different products is based ondifferent technologies and in the selection of the lactic acid bacteria used in the fermentationprocess. The emergence of modern biotechnology with molecular biology and genetics as newtechnological tools advanced molecular selection procedures to allow screening of thousands ofnatural strains and mutants, and to improve strains by direct genetic engineering. This articleillustrates examples of both applications in starter strain development for dairy fermentations.Furthermore, it partitions the nature of genetic modifications into three groups: i) one-stepgenetic events like deletions, gene amplifications, plasmid insertions or losses; ii) multi-stepgenetic rearrangements with DNA of a same species; and iii) trans-species genetic modifications.The nature of the genetic alteration has an impact for the safety assessment and legalimplications in different countries.

Introduction

From the enormous variety of food preservation processes by lactic acid bacteria, thefermentation of milk is probably the best-studied and advanced example. Milk can be fermentedinto a variety of different products, varying in appearance, flavor, texture and health beneficialproperties. The art of producing such products is based on the different technologies and on theselection of specific bacterial starter cultures; from using remains of fermented milk of theformer day to the use of sophisticated starter strains which arrive to the factory in frozen orfreeze dried form. Over the last decades, more and more defined starter cultures were selectedand developed for specific product and quality ranges. Many of these strains are now availableand commercialized by specialized culture producing companies. It is a necessity for the foodcompanies to further distinguish their products by superior quality and taste, and by offeringinnovative new products satisfying the consumer needs. Hence, food companies started todevelop their proprietary starter cultures for the preparation for their own fermented dairyproducts.

The new age of strain developmentIn earlier times, once the importance of lactic acid bacteria had been recognized for the

fermentation process, starter strains were selected and combined by trial and error. Today, thedairy industry disposes of a modern microbiology, including an analytical biochemistry andfermentation technology. Furthermore, the emergence of molecular biology and gene technologyhas enabled a more thorough investigation and understanding of the role of lactic acid bacteria inthe transformation of milk to cheese and yogurt products. Technological aspects likefermentation and storage conditions, influences on taste and texture, as well as health andnutritional effects of the lactic acid bacteria are becoming comprehensible in molecular terms.Thus, molecular biology fostered the development of genetically based selection tools tospecifically screen among hundreds or thousands of natural lactic acid bacteria strains ormutants to look for the one(s) with the exact correct requirement. In this way identified strainshave been selected but not modified by modern gene technology.

Further advancements in molecular biology of lactic acid bacteria, however, gave rise togenetic tools to isolate, modify and re-introduce genes into a variety of different strains. Thus, itbecame feasible to genetically alter some specific traits of a starter strain, or to transfer them to

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another, more preferable strain for a specific application. In most cases, this technology allows amuch more precise and directed development of the starter strains, leading e.g. to technologicallyhigh performing strains with at the same time excellent organoleptic characteristics. Furthermore,this technology also opens doors to real product innovations which would be very difficult, oreven impossible, to achieve with classical techniques. A priori, such newly developed strains haveto be considered as genetically engineered because a part of their genetic make-up, as small as itmay be, has been altered by a direct human intervention. However, from a safety and a foodlegislative point of view, it is appropriate to differentiate between the extent and the nature of thegenetic modifications introduced. An earlier work on the advance of modern starter straindevelopment already proposed to distinguish between strictly homologous, quasi-homologousand heterologous applications of gene technology for food microorganisms (Niederberger,1989). Similarly, I will partition the different kinds of genetic modifications feasible and ofpotential industrial applicability into three groups.

- The first group comprises genetic modifications, which could also be foundspontaneously in nature and are due to a one-step genetic recombination, transformation,segregation or mutation event. Such modifications include simple genetic deletions, geneamplifications, insertions or loss of a plasmid. Principally, the same appropriate mutation canbe found in nature, but a classical screening to find such a spontaneous mutation may bedifficult because of e.g. inappropriate selection tools.- The second group comprises more complex genetic modifications rearranging variousparts of the genetic information of a strain, by e.g. multiple rearrangements of the DNA of aspecific strain, or introducting and expressing gene(s) from another strain of a same species.Such modifications can be found in nature and are part of the natural evolution process oflactic acid bacteria. However, a direct selection to find such a genetic modificationspontaneously may be impossible, or at least very difficult and time consuming.- The third group describes genetic modifications implicating trans-species translocationsof genetic information. This may be genes or control signals exchanged between differentlactic acid bacteria species, or deriving from other food-grade microorganisms like someBacilli, yeasts or moulds. Although horizontal gene transfer between microorganisms iswell documented, one can not expect to find such a desired modified strain spontaneously innature.

In the following chapters, I will present examples for the individual groups of geneticalterations in lactic acid bacteria. The first chapter demonstrates the occurrence of a naturalgenetic modification, spontaneously selected from nature, and which already found its way intocommercial production and onto the product shelves in European super-markets.

Spontaneous genetic deletion for a mild, shelf-stable yogurtYogurt results from growth association between Streptococcus thermophilus and

Lactobacillus bulgaricus. They grow together in milk where they ferment lactose to lactate andlower the pH from neutral to about 4.5 - 4.2. Upon storage of the final product at 4 - 12 C forseveral days (in the supermarkets or at the consumers home), the pH of the yogurt may dropfurther to values below 4.0. This post-acidification leads to a gradually increasing acid and bittertaste of the yogurt, thus degrading the initial organoleptic quality of the product.

S. thermophilus ferments milk into a mild but non aromatic product. It is L. bulgaricuswhich mostly contributes to the typical yogurt flavor and lowers the pH to values below 4.2(Oberman, 1985). The approach to limit post-acidification and still produce the yogurt flavor wasto regulate growth and maintenance of L. bulgaricus by controlling its energy metabolism.Hence, L. bulgaricus starter strains were screened for the presence of spontaneous Lac minusmutants, having no or reduced residual -galactosidase activity. Mutants were identified havinggenetic deletions within the -galactosidase gene (lacZ) or expanding beyond the lac region,thereby inactivating a further gene vital for growth in milk, encoding the cell wall boundproteinase (Mollet and Delley, 1990; Germond et al., 1995). Such Lac minus and Lac-Prt minusmutants were not able to grow in milk as single-strain cultures without the supplementation of

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glucose and peptones. However, if grown in mixed cultures together with a lactose fermentingS. thermophilus strain, Lac minus L. bulgaricus strains were able to grow in spite of the absenceof glucose. Hence, S. thermophilus provides the mutant L. bulgaricus strains with the necessaryenergy to propagate in milk. Once the fermentation process has been terminated, growth andlactose metabolism of S. thermophilus and L. bulgaricus cease, resulting in a mild, non post-acidifying yogurt product. Such products have been shown to keep their mild taste andorganoleptic properties for more than 6 months stored at 4C (Mollet, 1996).

Genetic deletion for an improved clinical probiotic productLactobacillus johnsonii La1 is a probiotic lactic acid bacterium commercialized in many

countries as part of a mixed cultured fermented milk. It has intensively been investigated inclinical-nutritional studies for its health beneficial effects, i.e. survival in the gastrointestinal tractand positive immuno-modulating effect of the host (Brassart and Schiffrin, 1997; Link-Amster etal., 1994; Schiffrin et al., 1995). La1 is cultured in milk, where it ferments lactose to a racemicmixture of D- and L-lactate in a ca. 60:40% ratio. As with standard yogurt products, the presenceof D-lactate in the La1 containing milk product and the capacity of the strain to produce D-lactate after ingestion does not pose an adverse effect for the vast majority of the adultpopulation. Nevertheless, it is documented that D-lactate producing colonizing intestinallactobacilli are a main factor in the pathogenesis of D-lactic acidosis and encephalopathy ofpatients suffering from short bowel syndrome and intestinal failures (Bongaerts et al., 1995;Hudson et al., 1990; Scully et al., 1989). In view of the probiotic and immuno-defensestimulating effects of L. johnsonii La1, a non-D-lactate-producing variant would help thesepatients in reconstituting their intestinal micro-flora after e.g. an antibiotic treatment. Anotherapplication of a non-D-lactate producing La1 strain would be in the nutrition of infants forbuilding-up and regulating their intestinal flora. Because of liver immaturity, newborn infants failto completely metabolize ingested or in situ produced D-lactate and, hence, the WHO does notrecommend its use for infant products (F.A.O./O.M.S. 1967; 1974).

Lactic acid is formed via reduction of pyruvate by lactate dehydrogenase (LDH) for theregeneration of NAD+. Thereby, the two isomeric forms of lactate, D(-) and L(+), are formed bydistinct stereospecific NAD-dependent LDHs. Recently, the gene encoding the D-lactatedehydrogenase (ldhD) of L. johnsonii has been identified and isolated (Lapierre et al., personalcommunication). A small in vitro generated deletion was introduced into the coding ldhDsequence, thus inactivating the functionality of the gene. The copy of this truncated gene wasthen used to genetically replace the genomically located original ldhD gene of La1. Theexperiment was designed in such a way that at the end of the procedure no DNA fragmentsderiving from the plasmid vectors or the antibiotic resistance markers used in the constructionswere still present in La1. Thus, the new construct is equivalent to La1 with the exception of asmall DNA fragment missing within the ldhD gene. It was also shown that this new straineffectively re-routes pyruvate to L-lactate, and does not produce D-lactate anymore (Lapierre etal., personal communication). This technology to inactivate the ldhD gene rather than a screeningfor a spontaneous deletion event at this locus was chosen because the presence (and necessity)of a functional L-lactate dehydrogenase gene makes an effective selection procedure verydifficult. Very important as well is the fact that the use of a targeted gene disruption versus ascreening procedure for induced or spontaneous mutations prevents the accumulation ofnumerous uncharacterized mutations all over the bacterial genome. This adds to the safety aspectof the technology and better guarantees the preservation of the desired health beneficial characterof the strain.

Transfer of the exo-cellular polysaccharide gene-cluster for a creamier yogurtOver the past ten years, consumer preferences in the yogurt market have moved towards

sweeter, thicker yogurt with a low or no fat content. Increasing thickening properties of theyogurt are required to compensate for the lower fat content. This could be achieved by adding

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stabilizers, gums, pectins or starch. However, the use of exocellular polysaccharide ("slime")producing bacteria for the fermentation process satisfies much better the market need for"natural" products and the legal definition of yogurt in some European countries (e.g. Holland,France). The use of exocellular polysaccharides (EPS) producing strains increases the viscosityof yogurt and decreases susceptibility to syneresis. A significant characteristic, and problem forthe yogurt industry, is the instability of the slimy property. Often, the spontaneous loss of theEPS producing ability of lactic acid bacteria has been related to the involvement and instability ofplasmid encoded genes (Neve et al., 1988; Vescovo et al., 1989). However, this seems not to betrue for the thermophilic bacteria like Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus,which often do not contain plasmids.

The structure of several of the EPS produced by thermophilic lactic acid bacteria havebeen determined and revealed their nature as heteropolysaccharides (Doco et al., 1990; Gruter etal., 1993; Yamamoto et al., 1994; Lemoine et al., 1997). By taking advantage of an agar plateassay, containing ruthenium-red, colonies of EPS and non-EPS producing yogurt bacteria can bedifferentiated and genetic experimentation became practicable (Stingele and Mollet, 1995).Today, several genetic clusters involved in EPS synthesis and secretion have been identified fromropy starter strains and genetic transfers of the EPS character between different starter strainshas been documented (Stingele et al., 1996; Griffin et al., 1996; Van Kranenburg et al., 1997).

In this way it becomes now feasible to transfer a good texturing property of a selectedEPS producing strain to another, non-EPS producer but industrially or organoleptically moreinteresting starter strain. Furthermore, the knowledge of the functions of the differentglycosyltransferases encoded by the gene clusters in the generation of the heteropolysaccharidestructures would allow to modify existing EPS structures, and ultimately to design novel EPSwith new sugar compositions and ordering of the sugar moieties. Such genetic transfers andmodifications could be achieved by exchanging DNA between strains of a same species, withomitting all vector and marker genes used in the genetic shaping of the strain.

Metabolic engineering of lactic acid bacteria to produce L-alanine instead of lactateLactic acid bacteria are used in the dairy industry primarily for their role to convert

lactose to lactic acid in order to acidify and preserve the raw material milk. Thereby, dependingon the starter strains and process technology used, different products are obtained varying inflavor and texture. In the recent past, consumer preferences in the yogurt and acidified milkmarket have moved towards milder and sweeter products. Furthermore, the market place oncheese products is very multifarious and competitive, and producers are looking for new strainsto differentiate their products. Hence, it would be interesting to evaluate and develop novel starterstrains giving new flavor characteristics to the fermented products.

In the last few years, progress has been achieved in understanding the lactose metabolismof different lactic acid bacteria and the generation of flavors related to the secondary end-products deviating from this pathway (Snoep et al., 1992; Platteeuw et al., 1995; de Vos, 1996;Ferain et al., 1996; Goupil et al., 1996; Swindell et al., 1996). One of the best-studied species isLactococcus lactis, which displays a simple fermentation metabolism where lactose or glucose ismainly converted to L-lactate. The last step in this metabolism is conducted by the L-lactatedehydrogenase, converting pyruvate to L-lactate. To re-route pyruvate to L-alanine, the L-alaninedehydrogenase gene (alaDH) of a Bacillus species, unrelated to lactic acid bacteria, has beencloned and over-expressed in L. lactis (Hols et al., 1999). For controlled expression of thealaDH, the gene was linked to a nisin inducible, food-grade promoter system (de Ruyter et al.,1996; Kuipers et al., 1997). Thereby, it was possible to re-direct ca. 1/3 of the total carbon fluxof L. lactis to generate and secrete alanine instead of L-lactate. Further improvements of thestrain by inactivation of the residual L-lactate dehydrogenase as well as the alanine racemasegenes resulted finally in a strain converting sugar stoichiometrically to L-alanine. The efficiencyof this bioconversion process was reported to reach 99% (Hols et al., 1999). The use of such aL. lactis biocatalyst for converting cheap sugars into stereospecific L-alanine opens interestingperspectives for producing amino acids in a food micro-organism for applications in food.

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Furthermore, it is becoming feasible to genetically engineer for example one of the yogurt starterstrains in such a way that it produces L-alanine during the production process, instead of lactate.Thus, by optimally pairing lactate and alanine producing strains, yogurt products with a sweetalanine taste can be produced.

This example shows a quite complex genetic construct in L. lactis, importing andexpressing a gene, the alaDH, not naturally found in lactic acid bacteria. It also shows thepotential of using trans-species genetic engineering in developing novel starter strains forfermentation processes, demonstrating real product innovations.

Conclusions

The above mentioned examples illustrate the vast potential lactic acid bacteria bear fortodays and tomorrows applications in different domains of the dairy industry. They willcontinue to play an important role for the fermentation processes of a variety of different foodproducts by contributing to their conservation, flavor development, texture and health beneficialproperties. They will also be used increasingly as a natural source for food ingredients andadditives to non-fermented products to accomplish for example organoleptic, texturing orprobiotic purposes. The progress in molecular biology and genetic engineering will furtherbroaden the possibilities of using lactic acid bacteria in food and may allow in the future toimprove existing products and to develop novel products and applications.

Lactic acid bacteria have a history of safe use in fermented food products. They areconsidered as non-toxic and have never been identified as causative agents in disease orinfections. Nevertheless, all newly isolated or genetically altered lactic acid bacteria and theirproduced fermented food have to be carefully evaluated for their harmlessness to the consumerand the environment. They are subjected to stringent safety and regulatory procedures in thesame way, as do all new food products, which are commercialized and sold to the consumer. Infact, it was only with the help of molecular biology that it became possible to correctly classifyand group the diverse species of the lactic acid bacteria to better identify their origins, theirnatural habitats and dissemination in nature and in the intestines of humans and animals. Thisknowledge and the possibility to trace individual strains all along the food chain and the digestivetract further contributes to a better evaluation of potential risk factors and finally add to a betterconfidence and safety. An intelligent, responsible development and use of genetically improvedmicroorganisms will lead us into the new millenium and will bring exiting new food products tothe consumers.

Acknowledgments:

I am very gratefull to P. Niederberger and A. Constable for the valuable discussions andcritical reading of the manuscript.

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CONTROL DE LA FERMENTACION EN SIDRAS MEDIANTE TECNICAS DEBIOLOGIA MOLECULAR

CARMEN CABRANES Y ROSA PANDOSERIDA. Principado de Asturias, 33300 Villaviciosa, Asturias, Espaa

Introduccin

Asturias es la comunidad Autnoma que mas volumen de sidra elabora, estimndose laproduccin en ms del 60% de la manufacturada a nivel nacional. La elaboracin de sidra tieneuna gran relevancia socioeconmica, situndose en el sector agroalimentario asturiano acontinuacin del sector lcteo y crnico.

La sidra es el producto resultante de la fermentacin del mosto de manzana. Es por ello,que la fermentacin es el proceso fundamental de la manufactura de la sidra; en consecuencia, elcorrecto control del proceso fermentativo posibilitar la obtencin de productos de una calidadpredecible.

En el momento actual, la fermentacin es conducida por la microflora indgena que vieneincorporada en la materia prima o en los tiles de elaboracin; en consecuencia, no existe uncontrol del proceso fermentativo y es por ello que se viene manufacturando sidra con una granvariabilidad en lo que a su calidad y propiedades organolpticas se refiere; este hecho, esespecialmente relevante en el caso de la sidra no sometida a procesos de estabilizacin, como esel caso de la denominada sidra natural.

Teniendo en cuenta las necesidades del sector se ha trabajado en los siguientes aspectosrelacionados con la fermentacin de la sidra:

Seleccin y caracterizacin bioqumica y gentica de una levadura sidrera aislada de mostos ysidras asturianos.

Introduccin del denominado carcter killer en el starter seleccionado, dotando de estaforma a la levadura iniciadora de una mayor facilidad para inplantarse en el ecosistemaformado por microflora espontnea.

Puesta a punto de un mtodo de anlisis rpido y fiable que permita el seguimiento defermentaciones espontneas e inducidas.

Aplicacin al seguimiento de una fermentacin dirigida por el iniciador seleccionado en elLaboratorio.

1. Obtencin de un starter o cultivo iniciador para la induccin de la fermentacinalcohlica.

Para seleccionar las levaduras que actualmente utilizamos como iniciadores de lafermentacin se parti del aislamiento, identificacin y caracterizacin bioqumica de ms de milcepas de levaduras que aislamos de distintos lagares de Asturias y de la bodega piloto delSERIDA. La caracterizacin bioqumica se realiz mediante fermentaciones controladas enfermentadores-reactores de dos litros de capacidad, ensayos que se repitieron en cincuenta litrosy, posteriormente, en doscientos cincuenta y mil litros.

Como cualquier estudio de este tipo, el trabajo se comenz por un estudio ecolgico quepermitiese conocer las especies presentes de forma espontnea en nuestras sidras, la seleccin dedistintas cepas de Saccharomyces cerevisiae y su caracterizacin bioqumica. Para realizarposteriormente microfermentaciones y fermentaciones controladas a distintas escalas. A partir deeste trabajo llevado a cabo durante varios aos se seleccion la cepa Saccharomyces cerevisiaeC6 depositada en la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo, segn el tratado de Budapest con elnmero CECT 11.311.

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Los resultados de esta lnea de trabajo permiten al sector sidrero disponer en el momentoactual de un iniciador de la fermentacin, autctono que contribuye a conseguir en los caldosfermentados los aromas y las caractersticas organolpticas propias de nuestras sidras.

Los ensayos y fermentaciones llevados a cabo en nuestro llagar piloto junto con losrealizados por distintos llagares colaboradores y su utilizacin como remedio de urgenciaen refermentaciones encaminadas a corregir alteraciones de sidras de distintos elaboradores noshacen confiar en su utilidad para el sector.

2. Introduccin del factor killer mediante fusin de protoplatos en Saccharomycescerevisiae C6.

Algunas levaduras poseen una curiosa capacidad para producir toxinas que afectan deforma letal a otras especies e incluso a razas o cepas de su misma especie. Esto les proporcionauna ventaja ecolgica en la colonizacin de ecosistemas ricos en nutrientes como los mostos demanzana. Esta circunstancia tiene una aplicacin tecnolgica evidente. Existen distintos tipos detoxinas que se conocen con los nombres de K1, K2, K3. El factor killer estudiado en cepas k1demostr no ser transmitido de forma Mendeliana. Se transmite en la citoduccin, donde slohay mezcla del material citoplasmtico. Esta es una caracterstica muy interesante, ya que en lamayor parte de los casos la mezcla de los genomas de la levadura killer y la cepa receptoraresulta indeseable.

Parece demostrado que los preparados de las toxinas killer pueden proteger al productoen fermentacin de la accin de levaduras salvajes. Nos planteamos como alternativa a lautilizacin de preparados de toxinas la incorporacin del factor killer en nuestra cepainiciadora Saccharomyces cerevisiae C6, por una tcnica convencional tal como la fusin deprotoplastos.

Para ello, se realiz una fusin de protoplastos entre una cepa Saccharomyces cerevisiaeK1 y nuestra Saccharomyces cerevisiae C6.

Los protoplastos son clulas de levaduras a las que se ha tratado con enzimasdegradantes de la pared celular tipo zymoliasa o novozyme, y a las que se coloca en un medioisotnico que permita a la clula mantener su estructura. Para conseguir la fusin se obtienenprotoplastos de dos cultivos en la fase exponencial de las dos cepas parentales. Estos se lavan, semezclan en idnticas proporciones y la mezcla de fusin se crece sobre agar de regeneracin conel objeto de recuperar los productos de fusin.

Como resultado de esta lnea de trabajo, disponemos en nuestro laboratorio de una cepainiciadora con capacidad para secretar la toxina K1, si bien es preciso sealar que esta cepa no hasido probada en fermentaciones controladas.

3. Puesta a punto de un mtodo para el seguimiento de fermentaciones espontneas einducidas

Los mtodos clsicos para distinguir e identificar levaduras, basados en caractersticasmorfolgicas de la clula y de la colonia y en pruebas fisiolgicas y bioqumicas nos permiten,con suerte, llegar al nivel de especie o de raza, informacin sta que resulta claramenteinsuficiente para nuestros fines.

Para realizar un control de las fermentaciones debemos de ser capaces de distinguirindividuos de la misma especie y raza y para ello resulta extremadamente til laaplicacin de tcnicas de biologa molecular.

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A continuacin expondremos las distintas tcnicas que hemos ensayado para resolvernuestro problema, todas ellas haban sido probadas previamente para levadura enolgicas ocerveceras.

A- Anlisis de ADN mitocondrial

En realidad la tcnica se basa en una extraccin mas o menos convencional delADN total de la clula de levadura y el tratamiento posterior del mismo con 2 enzimas derestriccin (Rsa I y Hinf I) que reconocen y cortan un gran nmero de puntos en el DNAnuclear, pero muy pocos en el DNA mitocondrial (2) pudiendo ser estos fragmentosseparados posteriormente por una electroforesis en agarosa y visualizados con luz UVdespus de haber sido previamente teidos con bromuro de etidio.

Aunque la tcnica es buena presenta el inconveniente, al menos en nuestro caso,de ser muy sensible al estado fisiolgico de la clula, provocando esto que sureproducibilidad no sea exactamente del 100% .

Otro de sus inconvenientes es comn a otras tcnicas y es el hecho de que seanecesario partir de colonias o clones aislados, lo cual supone que es necesario invertir untiempo y un trabajo previo en este aislamiento, y el tiempo es obviamente un factor crticocuando estamos hablando de procesos industriales.

De todos formas la tcnica nos permite conocer si el starter aadido estarealmente dirigiendo la fermentacin de la sidra, e incluso el equilibrio y la proporcin delas diferentes especies de levaduras espontneas en 3 das a partir de la toma de muestra.

B- Aplicacin de una tcnica de DNA fingerprinting con sonda no radiactiva.

De forma abreviada el mtodo consiste en una extraccin de ADN total, eltratamiento y corte del mismo mediante 4 enzimas de restriccin (EcoRI, HindIII, PstI ySalI) y la separacin de los fragmentos obtenidos mediante la electroforesis en agarosa.

Posteriormente los fragmentos obtenidos de DNA se transfieren del gel deagarosa a una membrana de nylon (Southern blotting) . El DNA se fija a la membrana denylon por UV cross-linking.

A continuacin se realiza una hibridacin utilizando una sonda (Ty1-15) marcadacon digoxigenina. La sonda se prepara previamente por amplificacin de una secuenciade 1409 pb de Ty1-15 utilizando PCR (la reaccin en cadena de la polimerasa).

Los hbridos obtenidos se revelan colorimtricamente empleando un anticuerpoanti-digoxigenina (3).

Como es fcil deducir de la descripcin del mtodo, ste es ligeramente mslaborioso que el anterior, y presenta el mismo inconveniente en cuanto al requerimientode partir de colonias aisladas. Sin embargo, nuestros resultados nos hacen pensar que latcnica en muy buena para distinguir cepas estrechamente relacionadas procedentes de unnicho ecolgico muy prximo, y por supuesto distingue perfectamente aquellas cepasmenos relacionadas.

C- Aplicacin de la PCR al control de las fermentaciones.En principio el mtodo presenta la ventaja de no precisar de una purificacin

previa del DNA siendo suficiente liberar el material gentico con mtodos fsicos talescomo el congelado en nitrgeno lquido con posterior hervido del preparado. Sin

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embargo en la prctica nuestros resultados nos han hecho concluir que los resultados sonmucho mejores cuando se ha realizado una purificacin previa del DNA.

Los primers o cebadores utilizados fueron dirigidos a las zonas de uninintrn-exn. Los intrones no son esenciales para la expresin de los genes, por lo quehan evolucionado con una presin mnima, existiendo zonas muy conservadas (1).

Como toda reaccin de PCR precisa para que se produzca de un DNA molde, deuno o mas cebadores, de una mezcla de bases nitrogenadas, una solucin tampn en laque transcurra la reaccin y por supuesto de la DNA polimerasa.

El preparado se somete a varios ciclos de amplificacin en un termociclador.

Los productos de amplificacin se separan en gel de agarosa medianteelectroforesis.

Podemos tener resultados a las 48-72 horas. El mtodo es sencillo y reproducible,pero continuamos teniendo el inconveniente del tiempo de respuesta.

La solucin a este problema ( en la que se esta trabajando actualmente) pasa porlocalizar un banda especfica en nuestra Saccharomyces cerevisiae C6 , el aislamiento ysecuenciacin de la misma y la preparacin de unos primers especficos que nos permitandistinguir nuestra levadura a partir de extractos crudos de sidra, sin necesidad de realizarun cultivo y aislamiento previo de las colonias.

4- Aplicacin de la PCR al seguimiento de una fermentacin inducidaPara llevar a cabo el seguimiento de cuatro toneles inoculados con la cepa

Saccharomyces cerevisiae C6, se realizaron muestreos sucesivos en cinco etapas del proceso deelaboracin, coincidiendo el primero de ellos con el momento previo a la inoculacin de la cepainiciadora

Los resultados obtenidos hacen pensar que la diversidad de especies inicial se verpidamente sustituida por la levadura seleccionada, que rpidamente presenta una frecuencia deaislamiento del 100% de las cepas muestreadas al azar.

De todo lo dicho se desprende que en el momento actual el sector elaborador de sidra enAsturias dispone de algunas innovaciones tecnolgicas encaminadas a dirigir y controlar lafermentacin de forma que el producto obtenido presente de forma reproducible esaspropiedades que tanto apreciamos en nuestras sidras.

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BIOTECNOLOGA DE LEVADURAS: UNA HERRAMIENTA PARACONSTRUIR LEVADURAS DE PANADERA A LA CARTA.

JOSE ANTONIO PRIETO ALAMANDepartamento de Biotecnologa; Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos;

Consejo Superior de Investigaciones Cientficas. 46100-Valencia, Espaa

El proceso de panificacin constituye una de las aplicaciones ms habituales de labiotecnologa de alimentos. El trmino pan abarca una gran variedad de productos quedifieren en su formulacin, ingredientes o condiciones de procesamiento. No obstante, en lamayora de stos, el uso de levadura de panadera es esencial para obtener un producto de altacalidad conforme a las demandas del consumidor. La levadura produce el CO2 responsable delincremento en el volumen de la masa, contribuye al aroma y sabor del pan, y modifica laspropiedades reolgicas de la masa.

La introduccin en los ltimos aos de la tecnologa del ADN recombinante, ha abierto laposibilidad de modificar de forma dirigida propiedades especficas de la levadura, o de utilizarsta como una fbrica celular capaz de elaborar protenas o metabolitos de inters en el procesode panificacin (Randez-Gil y col., 1999). Esta tecnologa ofrece as la oportunidad de construircepas con mayor produccin de gas, ms resistentes a estrs, o capaces de modificar la reologade la masa, el sabor o la vida media del pan.

Desarrollo de cepas de levadura con capacidad para utilizar nuevas fuentes de carbonoEl medio de cultivo comnmente utilizado por la industria para la produccin de levadura

de panadera, es el medio industrial de melaza. La melaza, es un subproducto de la industriaazucarera, con un contenido en azcares, principalmente sacarosa, en torno al 40-45% de supeso, un disacarido que Saccharomyces fermenta rpidamente. Adems, las melazasproporcionan aminocidos y vitaminas esenciales, son un substrato barato y de fcil transporte.No obstante, la introduccin en los ltimos aos de procesos ms eficientes de extraccin deazcar, ha ido reduciendo progresivamente el contenido en sacarosa de las melazas, haciendo destas, un medio de cultivo menos productivo. Dos estrategias distintas han sido abordadas paradar solucin a este problema: (i) aprovechamiento de melibiosa y (ii) utilizacin de medios depropagacin alternativos.

(i) Cepas de levadura de panadera que utilizan melibiosa. Las melazas contienen, ademsde sacarosa, aproximadamente un 8% de rafinosa (fructosa-glucosa-galactosa), que eshidrolizada por la enzima invertasa, para rendir fructosa, un azcar fcilmente asimilable, ymelibiosa. Este ltimo disacarido no es utilizado por S. cerevisiae, al carecer este organismo deactividad -galactosidasa. Sin embargo, esta enzima, codificada por el gen MEL1, esta presenteen otras especies de Saccharomyces. Cepas de levadura de panadera con actividad -galactosidasa, han sido obtenidas mediante expresin heterloga del gen MEL1 de S. bayanus(Gasent-Ramrez y col., 1995).

(ii) Fuentes de carbono alternativas. La expresin de genes heterlogos en S. cerevisiae,ha permitido dotar a la levadura de la habilidad para utilizar nuevas materias primas diferentes ala melaza, como celulosa, almidn o suero lcteo. En la actualidad, se dispone de cepasindustriales de levadura capaces de producir de forma combinada todas las actividadesenzimticas requeridas para una hidrlisis completa del almidn, esto es, -amilasa, glucoamilasay pululanasa (Janse y Pretorius, 1995). Asimismo, se han construido cepas industriales delevadura que expresan un sistema celuloltico completo, endoglucanasa, celobiohidrolasa y -glucosidasa, y que crecen sobre residuos de celulosa de diferentes orgenes (Van Rensburg ycol., 1998). Recientemente, Adam y colaboradores (1999), han obtenido cepas de levadura depanadera capaces de utilizar lactosa, mediante expresin heterloga de los genes LAC4 y LAC12de Kluyveromyces lactis, que codifican para -galactosidasa y lactosa permeasa, respectivamente.

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No obstante, la aplicacin prctica de estas cepas recombinantes, requiere una evaluacinprofunda de sus propiedades, no slo en trminos de rendimiento en biomasa y poderfermentativo, sino tambin respecto a su efecto en la reologa de la masa o en la calidad del pan.

Crioresistencia y osmotolerancia

Durante las ltimas dcadas la produccin de masas congeladas para panadera y,especialmente, para bollera, ha experimentado un progreso constante en la industria panadera.Sin embargo, el desarrollo de una tecnologa que permita la fabricacin de un producto decalidad similar al obtenido con masas frescas se ha visto limitado por la sensibilidad al procesode congelacin/descongelacin de las cepas de la levadura Saccharomyces cerevisiae y a lareduccin de la capacidad fermentativa de las masas congeladas con el tiempo dealmacenamiento (Attfield, 1997; Randez-Gil y col., 1999). En el caso concreto de las masasdulces, un problema aadido es la necesaria osmotolerancia de las cepas de levadura, dada lasaltas concentraciones de azcar (10-25%) utilizadas en la fabricacin de estos productos, quelimitan el crecimiento (Myers y col., 1997) y la capacidad fermentativa.

Crioresistencia. Durante la congelacin/descongelacin de microorganismos se sucedenuna serie de procesos que daan a las clulas y que, a menudo, conducen a la muerte de lasmismas. La capacidad de la levadura para enfrentarse a este tipo de estrs depende de muchosfactores, entre ellos, la fase de crecimiento, el estatus nutricional, la velocidad de congelacin, lapresencia de crioprotectores y, sobre todo, las caractersticas intrnsecas de las cepas (Randez-Gily col., 1999). En cuanto a estas caractersticas, la obtencin de cepas con mayor resistencia alfro, se ha llevado a cabo de forma emprica, a partir de colecciones de levaduras o cepas salvajes,seleccionadas por su mayor viabilidad en masas congeladas (Oda y col., 1986; Nakagawa yOuchi, 1994). Estudios bsicos en estas cepas, han sugerido la existencia de una correlacinentre crioresistencia y algunos factores celulares, como contenido en trehalosa o composicin enlpidos de la membrana (Van Dijck y col., 1995; Kim y col., 1996; Murakami y col., 1995;Glinas y col., 1991). No obstante, la mayora de los resultados de estos anlisis soncontradictorios. Adems, es evidente que las cepas existentes en el mercado no renen lascaractersticas deseadas.

Una posibilidad para mejorar esta situacin, sera la utilizacin de aproximacionesgenticas y moleculares. Sin embargo, los estudios sobre los mecanismos especficos deproteccin frente a bajas temperaturas en levaduras son escasos. Kondo e Inouye (1991) hanidentificado un gen, TIP1, inducible por bajas temperaturas. Se han descrito otros dos geneshomlogos a TIP1 en S. cerevisiae, TIR1 y TIR2. No obstante, la triple delecin de estos genesno da lugar a un fenotipo obvio (Kawalski y col., 1995). Recientemente, Randez-Gil y col.(2000), han aislado e identificado, mediante anlisis diferencial de la expresin de mRNA encepas de levadura de panadera, un grupo de transcritos inducidos durante el proceso decongelacin/descongelacin. Los cDNAs clonados presentan homologa con genes de S.cerevisiae, en la mayora de los casos, implicados en la respuesta al dao celular o en rutasmetablicas. Anlisis de la regin del promotor de estos genes, ha permitido identificarsecuencias consenso, que podran participar en la regulacin de la respuesta transcripcional alestrs por fro. La identificacin de factores transcripcionales envueltos en dicha respuesta,permitira as el desarrollo de nuevas estrategias para la construccin de cepas de levadura depanadera con mayor crioresistencia.

Osmotolerancia. Una estrategia comn a cualquier clula, que permite ajustar laosmolaridad del citosol respecto a cambios en la concentracin externa de solutos, es laproduccin y acumulacin de osmolitos compatibles (Hohmann, 1997). El osmolito compatibleutilizado por Saccharomyces cerevisiae es el glicerol. La acumulacin de glicerol es controlada ados niveles, produccin y retencin. Bajo condiciones de alta osmolaridad, la sntesis de gliceroles controlada por GPD1, un gen clave en el proceso (Larsson y col., 1993; Albertyn y col.,1994). La accin de GPD1 es regulada a nivel transcripcional y depende principalmente de laruta HOG (High Osmolarity Glycerol), una ruta de transduccin de la seal, formada por MAP

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quinasas y activada por cambios en la osmolaridad del medio (Gustin y col., 1998; Posas y col.,1998).

La acumulacin de glicerol tambin es controlada por su nivel de retencin. Se hacaracterizado la protena Fps1p como una protena canal responsable del eflujo de glicerol(Luyten y col., 1995). La presencia de un canal permite a la clula controlar y ajustar lapermeabilidad de la membrana al glicerol. En condiciones de estrs osmtico, el canal estcerrado y el glicerol se acumula en el interior celular.

Estrategias encaminadas a aumentar la osmotolerancia de cepas industriales se hanbasado en la posible ingenierizacin del metabolismo del glicerol en Saccharomyces cerevisiae,mediante un aumento de su produccin y una mejor retencin del mismo. Sin embargo estasestrategias han resultado negativas. La sobre-expresin de GPD1, apenas aumenta el contenidode glicerol intracelular (Albertyn y col., 1994). Por su parte, la expresin de una protena Fps1pcon el extremo C-terminal truncado, permite a la clula acumular ms glicerol en condiciones deestrs osmtico, pero este hecho es letal para la clula en condiciones de crecimiento isotnico(Tamas y col., 1999). Finalmente, la hiperactivacin de la ruta de MAP-quinasas, tambin es letalpara la clula (Maeda y col., 1994).

Expresin de genes de utilidad en el proceso de panificacinEl empleo de enzimas en la industria de panadera es una prctica habitual que tiene por

objeto paliar defectos y/o estandarizar la calidad de las harinas. Sin embargo, el uso de enzimasen esta industria presenta algunos inconvenientes. La principal fuente de estos preparados es elsobrenadante del medio de cultivo del microorganismo productor (normalmente hongosfilamentosos o bacterias), el cual secreta adicionalmente otras enzimas que pueden afectarnegativamente a la calidad del pan. Adems, puesto que la proporcin del principio activo puedediferir de lote a lote, el panadero debe ajustar la dosis del producto comercial cuando utiliza unnuevo lote. Finalmente y, ms importante, estas enzimas pueden actuar como alergenosincrementando la prevalencia de hipersensibilidad ocupacional en forma de alergias drmicas y/obronquiales (Baur y col., 1998; Sander y col., 1998).

Una alternativa al uso tradicional de enzimas es la construccin y aplicacin tecnolgicade levaduras transgnicas, capaces de producir por s mismas aquellas enzimas requeridas en elproceso, conservando al mismo tiempo la capacidad para producir el CO2 necesario, y todas laspropiedades inherentes al uso tradicional de levadura (Randez-Gil y col., 1999).

Las posibilidades de esta estrategia fueron exploradas inicialmente por nuestro grupo detrabajo con la construccin de cepas de levadura de panadera capaces de expresar y secretar laenzima -amilasa de A. oryzae (Randez-Gil y col., 1995). Masas panarias elaboradas con estostransformantes resultaron en panes con un mayor volumen, una textura inicial ms blanda, y unamenor velocidad de endurecimiento, efectos similares a los obtenidos por la adicin exgena depreparados comerciales conteniendo -amilasa (van Dam y Hille, 1992). Adems, la utilizacinde esta levadura permite reducir la contaminacin ambiental en forma de polvo de -amilasa ypor tanto la respuesta alrgica entre un colectivo de trabajadores sensibilizados (Moneo y col.1995; datos no publicados).

A pesar de la importancia de este trabajo, el xito de esta estrategia dependa en buenaparte de la posibilidad de cumplir una serie de requisitos: 1) Era necesario obtener una gama delevaduras de panadera capaces de producir otras actividades enzimticas normalmenteencontradas en los preparados comerciales, e incluso de combinar la produccin simultnea devarias de ellas; 2) La produccin de la enzima deba ser regulable, de forma que simule ladosificacin controlada que efecta el panadero, y 3) Se hace estrictamente necesario laadecuacin de estas levaduras a la normativa que regula la utilizacin de O.M.G.

En la actualidad se dispone de estirpes de levadura de panadera que producen la enzimaarabinofuranosidasa de A. niger, diferentes tipos de xilanasas de A. nidulans, la enzima lipasa 2

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de Geotrichum candidum o la cutinasa de A. oryzae (Monfort y col., 1997, 1999a), y se trabajaen la construccin de levaduras con actividad esterasa y lipoxigenasa. Adems, se ha logrado laexpresin combinada de -amilasa y xilanasa (Monfort y col., 1996).

Por otra parte, se dispone de una coleccin de plsmidos con promotores de levadura dedistinta fuerza, que permiten regular la produccin de una protena heterloga en mediosindustriales en funcin de los requerimientos tecnolgicos, e incluso el momento en que esta seproduce (Monfort y col., 1999b).

Finalmente, se ha llevado a cabo la integracin estable en el genoma de levadura delcDNA de la -amilasa de A. oryzae, mediante la utilizacin de cassettes de expresinflanqueados por DNA ribosmico y que carecen de secuencias de origen bacteriano (Nieto ycol., 1999). Anlisis de los transformantes amilolticos obtenidos mostr que stos eranfuncionales en ensayos de panificacin y estables al menos durante 200 generaciones.

Conclusiones y perspectivas

La introduccin de la tecnologa del ADN recombinante, ha abierto la posibilidad deconstruir nuevas cepas de levadura de panadera capaces de satisfacer los requerimientos deindustriales y consumidores, e incluso de resolver o reducir algunos problemas de salud pblicao de contaminacin ambiental.

En un futuro prximo, el mayor reto biotecnolgico en esta rea ser, sin duda, laobtencin de nuevas cepas de levadura con mayor crioresistencia y osmotolerancia. En estesentido, es necesario mejorar nuestros conocimientos bsicos sobre qu genes son regulados demanera coordinada bajo estas condiciones de estrs y, cmo la regulacin de rutas de respuesta aestrs puede ser aplicada a la mejora de caractersticas de inters industrial en levadura depanadera.

La aplicacin comercial de estas levaduras puede encontrar sin embargo algunasdificultades, como su aceptacin por parte de los sectores industriales implicados y en especialdel consumidor. No obstante, es claro que el uso de organismos modificados genticamente seva a incrementar en los prximos aos y que es slo una cuestin de tiempo que lleguemos a laconclusin de que los beneficios superan con mucho los potenciales riesgos.

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MESA REDONDA IIResiduos de Antibiticos en Alimentos

Moderadora: Dra. Mara Luisa Garca Lpez

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CONTROL DE RESIDUOS DE ANTIBITICOS:DIEZ AOS DEL PLAN NACIONAL DE RESIDUOS

VICENTE CALDERN PASCUALCentro Nacional de Alimentacin. Instituto de Salud Carlos III

28220 Majadahonda, Madrid, Espaa.

INTRODUCCION

Los antibiticos se utilizan ampliamente en los animales destinados al consumo humanoo productores de alimentos. Segn datos de la Federacin Europea de Sanidad Animal (Fedesa),en 1997 un 33 % del consumo (toneladas de principio activo) de antibiticos en la UninEuropea se destin al uso teraputico en animales y un 15 % al uso como aditivos en piensofrente a un 52 % utilizado en medicina.

Esta utilizacin est regulada, tanto en lo que se refiere a su uso como medicamentos(Ley 109/1995), como a su uso como aditivos promotores del crecimiento (Directiva70/524/CEE). A diferencia de algunos compuestos de efecto hormonal, los antibiticos seutilizan, en muchas ocasiones, de forma legal requirindose el respeto a los tiempos de espera operiodos de supresin necesarios para asegurar que en los alimentos procedentes del animaltratado no permanezcan residuos peligrosos para el consumidor. Prcticamente todos losalimentos de origen animal pueden contener residuos de antibiticos: carne, vsceras y derivados,leche y productos lcteos, pescado y productos de acuicultura, huevos o miel.

Si no se utilizan en las condiciones establecidas, se pueden producir problemas queafecten tanto a la industria alimentaria como a la poblacin en general. La presencia de residuosde antibiticos en los alimentos tiene importantes repercusiones para la industria alimentaria yaque puede impedir la produccin de alimentos en los que intervienen cultivos bacterianos talescomo yogur, queso o embutidos.

Los consumidores tambin se pueden ver afectados por la presencia de residuos en losalimentos debido a su toxicidad y poder alergnico.

La poblacin en general tambin sufre las consecuencias del empleo indiscriminado deantibiticos ya que las resistencias seleccionadas en la poblacin animal pueden ser transferidasa la flora bacteriana patgena para el hombre.

MARCO LEGAL

Como consecuencia de la importancia de estos problemas sanitarios, con el fin deproteger la salud de los consumidores y para facilitar los intercambios comerciales de alimentosde manera que los sistemas de control de los distintos pases tengan un reconocimiento mutuoque impida el establecimiento de barreras, surge una legislacin de mbito europeo.

Esta legislacin incluye:

Directiva sobre el control de residuos (96/23/CE de 29-4-96, DOCE N L 125)

Decisiones sobre muestreo para control de residuos(97/747/CE de 27-10-97, DOCE N L 303)(98/179/CE de 23-2-98, DOCE N L 65)

Reglamentos sobre Limites Mximos de Residuos(CE N 2377/90 de 26-6-90, DOCE N L 224) y sus modificaciones

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El objetivo del plan de control de residuos es:Detectar cualquier tratamiento ilegal (utilizacin de productos no autorizados o deproductos autorizados pero en condiciones distintas de las establecidas).Comprobar si los residuos de medicamentos veterinarios cumplen los lmites mximosde residuos fijados en los anexos I y III del Reglamento CEE 2377/90.

PLANES NACIONALES DE RESIDUOS

Para realizar estos controles surgen Planes Nacionales de Residuos en cada uno de lospases de la Unin Europea. En Espaa se denomina PNIR: Plan Nacional de I