WESTERN BLOT

WESTERN BLOTLa tcnica del Western Blot (tambin llamado inmunoblotting debido a que se utilizan anticuerpos para detectar el antgeno o los antgenos especficos de inters) fue descrita por primera vez por Towbin et al. en 1979. La especificidad de la unin antgeno anticuerpo permite la deteccin de una nica protena dentro de una mezcla compleja de otras protenas. En la actualidad se utiliza como criterio de identificacin positivo de una protena especifica en una mezcla compleja y para obtener datos cualitativos y semicuantitativos sobre la misma.PASOSPreparacin de la muestra Obtener extracto de protenas a partir de cultivos celulares o tejidos:Una pequea cantidad del tejido se introduce en un buffer de extraccin. Despus se procede a homogeneizarlos. Por ltimo se centrifuga para obtener las protenas en el sobrenadante, la fraccin no precipitada.[]ElectroforesisLas protenas de la muestra sern separadas mediante una electroforesis en gel en funcin de uno o varios de estos criterios: punto isoelctrico, peso molecular y carga elctrica. La naturaleza de la separacin depende del tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel.

Transferencia de las protenas a una menbranaPara que las protenas sean accesibles a la deteccin por anticuerpos, se las transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF. Esta transferencia puede realizarse por difusin, capilaridad, por vaco o por electroelucin (o transferencia electrofortica), aunque ste ultimo es el ms ampliamente utilizado en la mayora de las ocasiones por su rapidez y alta eficacia de transferencia.

Este mtodo se basa en la movilidad electrofortica de las protenas para transferirlas desde el gel hasta la membrana e implica poner en contacto directo el gel de poliacrilamida con las protenas con la membrana de nitrocelulosa o de cualquier otro material adecuado para la unin de las mismas, formando un sndwich entre dos electrodos sumergidos en una solucin conductora.

Bloqueo de los sitios de unin inespecficosEs muy importante en un Western Blot bloquear los sitios de unin de la membrana sin reaccionar con el antgeno, para reducir la unin inespecfica de las protenas durante los siguientes pasos del ensayo. En la actualidad se utilizan una amplia variedad de tampones de bloqueo (desde la simple leche o suero normal y corriente hasta protenas altamente purificadas) para bloquear los sitios sin reaccionar de la membrana. Estos tampones de bloqueo, lo que hacen es incrementar la sensibilidad del ensayo reduciendo la interferencia por el ruido de fondo (background).

Lavado de la membranaComo otros Inmunoensayos, el Western Blot consiste en una serie de pasos de incubacin con diferentes reactivos (tampones de bloqueo, anticuerpos, etc.) separados por pasos de lavado. Estos lavados son necesarios para eliminar los excesos de reactivos no unidos y para reducir el ruido de fondo, ayudando a incrementar la relacin seal:ruido. Un lavado insuficiente de la membrana ocasionara un elevado ruido de fondo, mientras que un exceso del mismo puede ocasionar una disminucin de la sensibilidad debido al lavado del antgeno y/o anticuerpo de la membrana.Para realizar estos lavados, se pueden utilizar una gran variedad de tampones: tampones fisiolgicos como el TBS o el PBS sin ms conservantes, aunque en la mayora de las ocasiones se aade a los mismos un detergente como el Tween-20 (0,05%) para ayudar a eliminar el material unido inespecficamente.Anticuerpos primarios y secundariosLa eleccin del anticuerpo primario para un Western Blot depender del antgeno que se desee detectar y de los anticuerpos disponibles para ese antgeno en concreto. Se pueden utilizar tanto anticuerpos monoclonales como policlonales para realizar un Western Blot; los policlonales son bastante ms baratos, se tardan menos en producir y normalmente tienen una elevada afinidad por su antgeno; los monoclonales son muy valorados por su gran especificidad, pureza y consistencia que originan un menor ruido de fondo.De la misma manera, hay una gran variedad de anticuerpos secundarios marcados de diferentes maneras para la deteccin del Western Blot. Su eleccin depende de la especie en la que se haya obtenido el anticuerpo primario (la hospedadora); por ejemplo, si el anticuerpo primario es un anticuerpo monoclonal de ratn, entonces el secundario debe ser un anticuerpo anti-ratn obtenido en un hospedador diferente del ratn.Marcaje de anticuerposLa eleccin del anticuerpo secundario tambin depende del tipo de marcaje que se desee. Hace algunos aos se utilizaban mayoritariamente los radioistopos, pero eran muy caros y no ofrecen ninguna mejora de la relacin seal:ruido. Como marcajes alternativos, en los ltimos aos se han desarrollado los marcajes con biotina, fluorforos o enzimas: El uso de fluorforos requiere de menos pasos durante el proceso pero necesita de equipamiento especial para visualizar la fluorescencia, sobre todo si se desea tener un registro permanente de los resultados.

El marcaje con enzimas se utiliza ms ampliamente y, aunque necesita algunos pasos extra, suelen ser bastante sensibles.Las dos enzimas que ms se utilizan son la fosfatasa alcalina (AP) y la peroxidasa de rbano (HRP) y hay una amplia variedad de sustratos cromognicos, fluorognicos y quimioluminiscentes disponibles comercialmente para cada enzima.Tabla I. Comparacin de las enzimas HRP y APPeroxidasa de rbano (HRP)Fosfatasa alcalina (AP)

Tamao:40 kDa140 kDa

Precio:Relativamente barataRelativamente cara

Estabilidad:Estable a