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UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS

ROL DE LA INSULINA EN LA VÍA NEURAL HIPOTÁLAMO-OVARIO EN UN MODELO DE OVARIO POLIQUÍSTICO INDUCIDO POR ESTRÉS CRÓNICO.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctor en Farmacología

Por

MAURICIO DANIEL DORFMAN PESSÓ

Directores de Tesis

Profesor Dr. Hernán Enrique Lara Peñaloza

Profesor Dr. Víctor Domingo Ramírez

Santiago – Chile 2008

UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS

INFORME DE APROBACION

TESIS DE DOCTORADO

Se informa a la comisión de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile que la Tesis de Doctorado presentada por el candidato

MAURICIO DANIEL DORFMAN PESSÓ ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito de Tesis para el Grado de Doctor en Farmacología, en el examen de defensa de Tesis rendido el …………………………………………………………………. Directores de Tesis: - Dr. Hernán Lara P. ________________ - Dr. Víctor D. Ramírez ________________ Comisión Informante de Tesis: - Dr. Javier Puente (Presidente) ________________ - Dr. Luis Núñez ________________ - Dra. Margarita Vega ________________ - Dra. Teresa Sir-Petermann ________________ - Dr. Luis Michea ________________

Dedicada a Isaac Pessó (Z.L.), cuyos consejos y ejemplos fueron

siempre de gran valor para las decisiones que he tomado a lo largo de este

camino.

AGRADECIMIENTOS:

Al Dr. Hernán Lara por la oportunidad que me dio de realizar la tesis de

doctorado en su laboratorio y por toda la ayuda, consejos y enseñanzas que

me ha entregado durante todos estos años.

Al Dr. Víctor Domingo Ramírez por darme el honor de tenerlo como director

de tesis, por toda la entrega y dedicación en la gestación y desarrollo de este

trabajo de tesis y por la motivación que me dio en los momentos difíciles.

A mis compañeros de laboratorio: Pablo Jara, Ramón Sotomayor, Alfonso

Paredes, Mónika Greiner, Eric Acuña, Gonzalo Cruz, Claudio Araya, Sergio

Hernández, Ariel Díaz, Guillermo Elorza, Gabriel Aravena, Nicolás Crisosto y

Leticia Luna por su amistad, colaboración y excelente disposición.

Al grupo de investigación comandado por las Doctoras Margarita Vega y

Carmen Romero por permitirme realizar los análisis de Western Blot en su

laboratorio y enriquecer este trabajo mediante sus comentarios en los

seminarios de grupo.

Al Dr. Luis Michea por facilitarme la infraestructura de su laboratorio para las

determinaciones de mRNA por PCR en tiempo real.

A la Dra. Elisabet Stener-Victorin por acogerme durante un mes en su

laboratorio de la Universidad de Gotemburgo, Suecia, en donde aprendí la

técnica del clamp hiperinsulinémico-euglicémico.

A Alejandra De Calisto, Fernanda Schäufler (veterinarias encargadas del

bioterio), Fredy y Juan Carlos (funcionarios del bioterio), por su ayuda en los

procedimientos realizados con los animales.

A Don Francisco Cortés por su ayuda con los cortes y tinciones de los

tejidos.

A los miembros de la Comisión Evaluadora, Dra. Teresa Sir-Petermann, Dra.

Margarita Vega, Dr. Luis Michea, Dr. Javier Puente y Dr. Luis Núñez por

aceptar participar de esta comisión y por sus comentarios y correcciones que

enriquecieron este trabajo.

Un agradecimiento muy especial a mi familia: Araceli, mi novia, por su amor,

cariño, paciencia y gran sostén durante los últimos 10 años de mi vida. A mis

padres, abuelita, hermano y cuñada. A mis suegros y cuñados, gracias a

todos ustedes por su constante apoyo y preocupación.

FINANCIAMIENTO: La realización de esta tesis fue financiada por proyectos de investigación,

becas de mantenimiento, apoyo de tesis y de estadía en el extranjero de las

siguientes instituciones:

Proyecto del Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (FONDECYT)

• Proyecto FONDECYT Nº 1050765 “Cambios en la actividad nerviosa

simpática durante el desarrollo neonatal predispone al ovario poliquístico

en la vida adulta”

Investigador Responsable: Dr. Hernán Lara P.

Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT):

• Beca de Mantención Estudiante de Doctorado(2004-2007)

• Beca de Apoyo a la Realización de Tesis Doctoral Nº 24060026 (2006-

2007)

• Beca de Termino de Tesis Doctoral (2008)

Becario: Mauricio Dorfman Pessó

Programa de Mejoramiento de la Calidad y Equidad de la Educación Superior (MECESUP):

• Beca para estadía corta en el extranjero. Proyecto MECESUP UCH 0208

(2006)

Becario: Mauricio Dorfman Pessó

PUBLICACION: Los resultados de esta tesis han dado origen a un artículo científico,

aceptado para publicación en la revista internacional “Biology of

Reproduction”.

Dorfman M, Ramirez VD, Stener-Victorin E, Lara HE. “Chronic-Intermittent

cold stress in rats induce selective ovarian insulin resistance”. Biology of

Reproduction (In Press).

PRESENTACIONES A CONGRESOS: Los resultados de esta tesis han sido presentados en los siguientes

congresos científicos:

1. Dorfman M, Ramirez VD, Sotomayor R, Jara P, Lara HE. Rol de la

insulina en la inervación simpática ovárica en un modelo de ovario

poliquístico inducido por estrés crónico.

XVII Reunión Anual de la Sociedad Chilena de Reproducción y Desarrollo. Exposición de póster, Reñaca, Chile, 2006.

2. Dorfman M, Ramírez VD, Stener-Victorin E, Lara HE. Determinación de la

resistencia a la insulina in vivo por el método del clamp hiperinsulinémico

euglicémico en ratas.

XXVIII Congreso Anual de la Sociedad de Farmacología de Chile.

Exposición de póster Olmué, Chile, 2006.

3. Dorfman M, Ramírez VD, Lara HE. El estrés induce resistencia tejido

específico a la insulina.

XXIX Congreso Anual de la Sociedad de Farmacología de Chile.

Exposición oral. Trabajo incorporación a la sociedad de Farmacología de

Chile. Iquique, Chile, 2007.

ÍNDICE GENERAL ÍNDICE GENERAL ..........................................................................................................1

ÍNDICE FIGURAS ...........................................................................................................4

RESUMEN ......................................................................................................................7

ABSTRACT .....................................................................................................................9

INTRODUCCIÓN...........................................................................................................10

1) Fisiología ovárica ......................................................................................................10 2) Regulación de las funciones ováricas.......................................................................11

2.1) Regulación endocrina: .....................................................................................11

2.2) Regulación nerviosa: .......................................................................................12

3) Inervación simpática y síndrome de ovario poliquístico ............................................13 4) Estrés ........................................................................................................................15

4.1) Definición de estrés: ........................................................................................15

4.2) Clasificación de los estímulos estresores:.......................................................15

4.3) Efecto del estrés crónico sobre la condición poliquística ................................16

4.4) Efecto del estrés sobre el síndrome metabólico..............................................17

5) Resistencia a la insulina............................................................................................17 5.1) Definición: ........................................................................................................17

5.2) Acciones de la insulina: ...................................................................................19

5.3) Resistencia a la insulina e hiperinsulinemia compensatoria en el SOP: .........19

HIPÓTESIS ...................................................................................................................21

OBJETIVO GENERAL ..................................................................................................21

OBJETIVOS ESPECÍFICOS .........................................................................................21

� Objetivo específico Nº1: ..................................................................................21



MATERIALES Y MÉTODOS .........................................................................................22

1) Animales y grupo experimentales .............................................................................22 2) Protocolo de estrés por frío crónico intermitente.......................................................22 3) Seguimiento de los animales ....................................................................................23

3.1) Ciclicidad estral:...............................................................................................23

3.2) Peso corporal: .................................................................................................23

3.3) Ingesta de alimento: ........................................................................................23

4) Procedimientos experimentales finalizado el protocolo de estrés.............................24

1

4.1) Prueba de tolerancia a la glucosa: ..................................................................24

4.2) Clamp hiperinsulinémico euglicémico:.............................................................24

4.3) Liberación de noradrenalina ovárica:...............................................................26

4.3.1) Liberación inducida con estímulo eléctrico: ..................................................26

4.3.2) Liberación inducida con estímulo de K+ 80 mM:...........................................27

4.4) Secreción de hormonas esteroidales ováricas ................................................27

4.5) Separación de células de granulosa y teca-interstical.....................................28

4.6) Nivel de mRNA para Irs-1, Irs-2, Glut-1, Glut-4 y Fshr por PCR en tiempo real........................................................................................................................28

4.7) Nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 por Wetern Blot.........................................30

5) Administración de insulina intracerebroventricular durante el protocolo de estrés ...31 6) Procedimientos experimentales finalizada la administración ICV de insulina...........32

6.1) Morfología ovárica ...........................................................................................32

6.2) Determinación de los niveles séricos de estradiol, androstenediona, progesterona, insulina y glucosa.....................................................................32

6.3) Determinación de catecolaminas en la médula adrenal ..................................33

6.4) Determinación del contenido de noradrenalina en ovario y ganglio celíaco mediante HPLC ...............................................................................................33

7) Análisis estadístico....................................................................................................34 RESULTADOS ..............................................................................................................35

1) Caracterización del modelo de estrés por frío crónico intermitente ..........................35 1.1) Efecto del estrés sobre la ciclicidad estral.......................................................35

1.2) Efecto del estrés sobre el crecimiento e ingesta de alimento..........................36

1.3) Efecto del estrés sobre el grado de sensibilidad a la insulina .........................38

1.4) Efecto del estrés sobre la tolerancia a la glucosa ...........................................39

1.5) Efecto del estrés sobre la actividad nerviosa simpática ..................................40

2) Efecto local de la insulina sobre la actividad nerviosa simpática ovárica .................41 2.1) Efecto de la insulina sobre la liberación de NA ovárica inducida con estímulo

eléctrico ...........................................................................................................41

2.2) Efecto de la insulina sobre la liberación de NA ovárica inducida con estímulo depolarizante con K+ 80 mM ...........................................................................43

2.4) Efecto de la insulina sobre la secreción de esteroides ováricos .....................46

3) Determinación de la expresión de IRS-1, IRS-2, GLUT-1 y GLUT-4 ........................48 3.1) Nivel de mRNA para Irs-1, Irs-2, Glut-1 y Glut-4 en ovario y músculo tibialis .48

3.2) Nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 en ovario y músculo tibialis.......................50

3.3) Nivel de mRNA para Irs-1 y Glut-4 en células de granulosa y teca-intersticial52

2

3.4) Nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 en células de granulosa y teca-intersticial 54

4) Administración de insulina intracerebroventricular....................................................56 4.1) Control del implante de la cánula ....................................................................56

4.2) Efecto de la insulina administrada ICV sobre aspectos metabólicos ..............57

4.2) Efecto de la insulina administrada ICV sobre la concentración plasmática de P, ∆4 y E2 .............................................................................................................59

4.3) Efecto de la insulina administrada ICV sobre la actividad nerviosa simpática ovárica.............................................................................................................60

4.3.1) Contenido de noradrenalina en el ganglio celíaco:.......................................60

4.3.2) Contenido de noradrenalina en el ovario:.....................................................61

4.4) Efecto de la insulina administrada ICV sobre la morfología ovárica................62

DISCUSIÓN ..................................................................................................................65

1) Cambios metabólicos en el modelo de estrés crónico por frío..................................65 2) Efectos de la insulina aplicada localmente sobre la actividad nerviosa ovárica en el

modelo de estrés por frío..........................................................................................67 3) Efectos de la insulina aplicada ICV sobre la actividad nerviosa ovárica en el modelo

de estrés por frío.......................................................................................................71 ESQUEMA FINAL .........................................................................................................75

CONCLUSIONES..........................................................................................................76

REFERENCIAS.............................................................................................................77

3

ÍNDICE FIGURAS Figura 1: Esquema de la regulación endocrina y nerviosa del ovario.......................... 13 Figura 2: Representación esquemática de la transducción de señal de la insulina en

células de músculo esquelético.................................................................... 18 Figura 3: Representación esquemática de la relación entre la hiperinsulinemia y la

hiperandrogenemia en mujeres SOP insulina resistentes. Posible rol de la insulina sobre el eje de regulación nervioso ovárica.................................... 20

Figura 4: Representación gráfica de la concentración de insulina y glucosa durante el clamp............................................................................................................ 25

Figura 5: Efecto del estrés sobre la ciclicidad estral.................................................... 35 Figura 6: Efecto del estrés sobre el crecimiento e ingesta de alimento....................... 37 Figura 7: Efecto del estrés sobre la velocidad de infusión de glucosa, determinada

mediante el clamp hiperinsulinémico euglicémico........................................ 38 Figura 8: Prueba de tolerancia a la glucosa en ratas control y estresadas.................. 39 Figura 9: Efecto del estés por frío crónico sobre la actividad nerviosa simpática........ 40 Figura 10: Efecto de la insulina sobre la liberación, inducida con estímulo

depolarizante eléctrico, de [3H]NA ovárica en ratas control y ratas sometidas a estrés por frío......................................................................... 42

Figura 11: Efecto de la insulina sobre la liberación de NA ovárica inducida con estímulo depolarizante eléctrico................................................................. 42

Figura 12: Efecto de la insulina sobre la liberación, inducida con estímulo depolarizante de alta concentración de potasio, de [3H]NA ovárica en ratas control y ratas sometidas a estrés por frío................................................. 44

Figura 13: Efecto de la insulina sobre la liberación de NA ovárica inducida con estímulo depolarizante K+ 80 mM.............................................................. 44

Figura 14: Efecto de la insulina sobre la liberación basal de NA ovárica.................... 45 Figura 15: Efecto de la insulina sobre la secreción de hormonas esteroidales

ováricas...................................................................................................... 47 Figura 16: Cambios en el mRNA para Irs-1 y Glut-4 en ovario y músculo tibialis de

ratas control y estresadas.......................................................................... 48 Figura 17: Cambios en el mRNA para Irs-2 y Glut-1 en ovario y músculo tibialis de

ratas control y estresadas.......................................................................... 49 Figura 18: Efecto del estrés frío sobre el nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 en ovario

y músculo.................................................................................................... 51 Figura 19: Concentración relativa del mRNA de Fshr en células de granulosa y teca-

intersticial.................................................................................................... 52 Figura 20: Cambios en el mRNA para Irs-1 y Glut-4 en fracción de células de

granulosa y teca-intersticial de ratas control y estresadas......................... 53 Figura 21: Cambios en el nivel de para IRS-1 y GLUT-4 en fracción de células teca-

intersticial y granulosas de ratas control y estresadas............................... 55

4

Figura 22: Control del implante de la cánula colocada en el tercer ventrículo............ 56 Figura 23: Efecto de la insulina administrada ICV sobre la ganancia de peso y

consumo de alimento en animales control y sometidos a estrés por frío.. 58 Figura 24: Efecto de la insulina administrada ICV sobre la insulina y glucosa

plasmática en animales control y sometidos a estrés por frío................... 58 Figura 25: Efecto de la insulina administrada ICV sobre el contenido de NA en el

ganglio celíaco de ratas control y sometidos............................................. 60 Figura 26: Efecto de la insulina administrada ICV sobre el contenido de NA en el

ovario de ratas control y sometidos a estrés por frío................................. 61 Figura 27: Efecto de la insulina administrada ICV sobre la morfometría ovárica........ 63 Figura 28: Efecto de la insulina administrada ICV sobre la morfología ovárica........... 64 Figura 29: Esquema del efecto propuesto para la insulina sobre la actividad nerviosa

ovárica…………………………………………………………………………….70 Figura 30: Esquema de los resultados obtenidos………………………………............. 75

5

ABREVIATURAS A : Adrenalina ANOVA : Análisis de varianza DTT : Ditiotreitol E2 : Estradiol ELISA : Inmunoensayo unido a enzima EV : Estradiol valerato FAA : Folículo antral atrésico FAN : Folículo antral normal FPAA : Folículo preantral atrésico FPAN : Folículo preantral normal FSH : Hormona folículo estimulante FSHR : Receptor de FSH FTIII : Folículo tipo III GLUT : Transportador de glucosa GnRH : Factor liberador de gonadotropinas hCG : Gonadotropina coriónica humana HHO : Hipotálamo-hipófisis-ovario HPLC : Cromatografía líquida de alta resolución ICV : Intracerebroventricular Ins : Insulina IRS : Sustrato del receptor de insulina LH : Hormona luteinizante NA : Noradrenalina NPV : Núcleo paraventricular P : Progesterona PI3K : Fosfoinositol-3 quinasa PKB : Proteína quinasa B PMSF : Fluoruro de fenilmetilsulfonilo PQ : Prequiste PTG : Prueba de tolerancia a la glucosa Q : Quiste RT-PCR : Reacción en cadena de la polimerasa acoplada a transcripción reversa SNA : Sistema nervioso autonómico SON : Nervio ovárico superior SOP : Síndrome de ovario poliquístico Vehic : Vehículo ∆4 : Androstenediona

6

RESUMEN

El estrés crónico, en combinación con la sobrealimentación y la falta de

ejercicio, contribuye al desarrollo del síndrome metabólico, aumentando el riesgo de

enfermedades cardiovasculares y diabetes tipo 2. Se ha demostrado que el estrés

afecta a cada componente del síndrome metabólico y entre ellos, al síndrome de ovario

poliquístico (SOP), principal causa de infertilidad en mujeres en edad fértil.

Hemos descrito que el estrés por frío crónico en ratas provoca cambios

morfológicos en los folículos ováricos similares a los encontrados en el SOP. Para

conocer si este modelo de estrés está asociado a cambios metabólicos, determinamos

la sensibilidad a insulina y el efecto de esta hormona sobre la actividad nerviosa

ovárica (factor involucrado en la génesis y mantención del SOP) y por ende, si el estrés

es un factor potencial en el desarrollo del SOP.

A nivel metabólico, los animales sometido a estrés por frío crónico aumentaron

la sensibilidad a la insulina, determinada mediante el clamp hiperinsulinémico

euglicémico. Al mismo tiempo, estos animales aumentaron su ingesta alimenticia,

manteniendo la misma ganancia de peso que sus respectivos controles. La actividad

nerviosa simpática ovárica aumentó cuando los ovarios de animales control fueron

incubados con insulina, sin embargo, no hubo cambio en los ovarios de ratas

estresadas. Estos resultados sugirieron una resistencia a la insulina tejido específico, la

cual fue apoyada al determinar el nivel de mRNA y proteína IRS-1 y GLUT-4. Ambas

moléculas de la ruta de señalización intracelular de insulina, disminuyeron en los

ovarios de las ratas sometidas a estrés, siendo las células de la teca-intersticial en las

que se observó preferencialmente esta disminución. Al administrar insulina

intracerebroventricular (ICV), la actividad nerviosa ovárica no fue modificada, ni

ocurrieron cambios en el desarrollo folicular, sin embargo, las ratas estresadas

infundidas con insulina ICV no disminuyeron la ganancia de peso, la glicemia ni la

insulinemia, como lo hicieron sus respectivos controles, apoyando una pérdida de

sensibilidad a insulina hipotalámica inducida por el estrés.

7

Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que el estrés por frío

crónico intermitente provoca una resistencia a la insulina que es tejido específica, y que

la insulina tiene un efecto estimulador de la actividad nerviosa simpática ovárica.

Probablemente, la resistencia insulínica en ovario e hipotálamo son en parte

responsables de los cambios en la función reproductiva y metabólica de la condición

poliquística inducida por estrés crónico.

8

ABSTRACT

The chronic stress in combination with overfeeding and lack of exercise

contributes to health problems known as metabolic syndrome, increasing the risk of

cardiovascular disease and type 2 diabetes. It has been shown that stress affects each

component of metabolic syndrome, including the polycystic ovary syndrome (PCOS),

the major cause of infertility in women of reproductive age.

We have previously described that rats exposed to chronic cold stress show

follicular changes similar to those found in PCOS patients. To find out if this model of

stress is associated with metabolic changes, we determined insulin sensitivity and the

effect of this hormone on the ovarian nervous activity (a factor involved in the genesis

and maintenance of PCOS).

The animals exposed to chronic cold stress increased the insulin sensitivity,

measured by hyperinsulinemic euglycemic clamp. These animals increased their food

intake and they maintained the same gain weight than their respective controls. The

ovarian sympathetic nerve activity was increased when the ovaries from control rats

were incubated with insulin, however it was not change in the ovaries of stressed rats.

These results suggested the presence of specific tissue insulin resistance, which was

supported by determining the IRS-1 and GLUT-4 level of mRNA and protein. Both

molecules, involved in the intracellular insulin signaling, were decreased in the stress

rats ovaries, preferentially in theca-interstitial cells. When we administrated insulin

intracerebroventricular (ICV), the ovarian nerve activity and the follicular development

were not changed. However, stressed rats infused with insulin ICV did not decrease the

gain weight, glycaemia and plasmatic insulin, as did their respective controls. These

results supporting a loss of hypothalamic insulin sensitivity induced by stress.

The results of this study show that chronic intermittent cold stress produce

specific-tissue insulin resistance. Indeed, the insulin has a stimulating effect of the

ovarian sympathetic nervous activity. Probably the ovarian and hypothalamus insulin

resistance are in part responsible for the changes in metabolic and reproductive

function of the polycystic condition induced by chronic stress.

9

INTRODUCCIÓN

1) Fisiología ovárica El ovario es la gónada femenina, cuyas principales funciones son la

esteroidogénesis y la ovulación. Los folículos son la unidad funcional del ovario de

mamíferos y la función de cada uno de ellos es proveer todo el apoyo necesario a la

célula germinal femenina (ovocito), para alcanzar su máximo potencial, ser liberados

del ovario y tener el potencial de ser fecundados por un espermatozoide para producir

un embrión. El ovario está formado, además de los folículos en diferentes etapas de

maduración, por tejido conectivo laxo, vasos sanguíneos y nervios, cuyos terminales

nerviosos se proyectan hacia la corteza ovárica (región en la cual se encuentran

ubicados los folículos) (1).

Las células foliculares somáticas (granulosa y teca) contribuyen de diversas

formas al cumplimiento de la ovulación, esencial para la reproducción y sobrevida de

las especies. Ellas proveen los requerimientos nutritivos para el crecimiento y

maduración de los ovocitos contenidos en los folículos seleccionados para la ovulación.

Al mismo tiempo que contribuyen a la atresia y destrucción de los ovocitos de folículos

no seleccionados (1).

Las células de la granulosa rodean e interaccionan directamente con el ovocito,

mientras que las células de la teca se encuentran en la periferia de los folículos,

separadas de las células de la granulosa por la lámina basal. A medida que los

folículos son reclutados, desde folículos primordiales hasta su máximo desarrollo

(folículos preovulatorios), estos aumentan en número de células de granulosa y teca y

se incrementa el tamaño del ovocito. Una vez que el o los ovocitos (dependiendo de la

especie) son liberados desde los folículos preovulatorios, estos últimos forman cuerpos

lúteos, fundamentales para que ocurra la implantación del embrión en el caso que

hubiese ocurrido la fecundación (1).

Además de la ovulación, la secreción de hormonas esteroidales por parte de las

células que forman parte del ovario, es otra función principal de la gónada femenina.

Las células de la teca sintetizan y secretan principalmente andrógenos, las células de

la granulosa estrógenos y las células lúteas progesterona. Estas hormonas actúan

sobre una amplia variedad de tejidos blanco y órganos que no sólo comprenden el

10

sistema reproductivo, sino que incluyen variados otros órganos y sistemas, como el

sistema nervioso central, músculo esquelético, sistema cardiovascular, hígado, tejido

adiposo, etc. Complementario al efecto hormonal sobre estructuras lejanas al ovario,

los esteroides producidos por las células foliculares actúan localmente sobre los

propios folículos, de forma autocrina (sobre las mismas células que los secretan) y/o

paracrina (sobre células vecinas). Estos efectos hormonales contribuyen al correcto

funcionamiento del sistema reproductivo femenino (1).

2) Regulación de las funciones ováricas Las funciones ováricas, principalmente la ovulación y la secreción de hormonas

esteroidales, son finamente reguladas tanto por señales sistémicas como locales. En

este contexto el eje endocrino hipotálamo-hipófisis-ovario (HHO) y el eje neural

hipotálamo-ovario participan de forma coordinada para mantener la homeostasis del

ovario (fig. 1).

2.1) Regulación endocrina: El eje endocrino HHO es comandado por neuronas GnRHérgicas, ubicadas en

el hipotálamo, las cuales liberan en forma de pulsos el Factor Liberador de

Gonadotropinas (GnRH) a la circulación portal hipofisiaria. Este factor estimula la

liberación de las gonadotropinas, hormona luteinizante (LH) y folículo estimulante

(FSH) desde la hipófisis anterior. Estas últimas actúan sobre receptores específicos

localizados en las células ováricas, controlando de esta forma la ovulación y la

secreción de hormonas esteroidales (1). Los receptores de LH se ubican en las células

de la teca, de la granulosa y de células intersticiales, mientras que los receptores de

FSH se ubican en las células de la granulosa. La hormona FSH es responsable del

reclutamiento y crecimiento folicular y de la síntesis de estrógenos durante la fase

folicular del ciclo ovárico. Por su parte, la hormona LH es responsable de la ovulación y

la formación de los cuerpos lúteos. Finalmente, los esteroides ováricos, producidos

como consecuencia de la acción de las gonadotropinas sobre sus respectivos

receptores, tienen la capacidad de actuar sobre el hipotálamo e hipófisis, produciendo

un control del eje endocrino a través de retroalimentación negativa y positiva (1).

11

2.2) Regulación nerviosa: Muchas evidencias han permitido postular que las funciones ováricas, además

de la regulación hormonal clásica, está controlada a través de mecanismos neuronales

de origen cerebral (2, 3). Kawakami y col. fueron, sin embargo, los primeros que

presentaron evidencias sobre la existencia de una vía de control neural directa desde

el hipotálamo al ovario (4). Aunque estos autores no entregaron evidencias

neuroanatómicas directas sobre esta vía, este hallazgo permitió el desarrollo de

estudios neuroquímicos sobre la relación funcional entre el sistema nervioso

autonómico (SNA) y el ovario. El uso de la técnica de trazado viral transneuronal,

permitió a Gerendai y col., definir al núcleo paraventricular (NPV) del hipotálamo como

la región del cerebro desde donde se proyectan las neuronas, que hacen su último

relevo sináptico en el ganglio celíaco y finalmente inervan al ovario (5).

El ovario recibe principalmente inervación simpática y sensorial, con una

pequeña contingencia de fibras parasimpáticas (6). Los nervios simpáticos liberan

desde sus terminales nerviosos principalmente el neurotransmisor noradrenalina (NA).

La inervación llega al ovario por dos rutas: a) el plexo nervioso, que viaja junto a los

vasos sanguíneos y b) el nervio ovárico superior (SON), el cual está asociado al

ligamento suspensorio y lleva la mayoría de las fibras noradrenérgicas que inervan los

folículos (7). Los nervios simpáticos ováricos participan en el desarrollo folicular,

secreción de esteroides y ovulación (8, 9). Por lo tanto, cambios en la actividad

nerviosa del ovario pueden alterar la correcta fisiología ovárica y desencadenar

eventos que lleven a patologías ováricas.

12

Figura 1: Esquema de la regulación endocrina y nerviosa del ovario. GnRH: hormona liberadora de gonadotroipinas; LH: hormona luteinizante; FSH: hormona folículo estimulante; P: progesterona; A: androgenos; E: estrógenos; SON: nervio ovárico superior; NA: noradrenalina. 3) Inervación simpática y síndrome de ovario poliquístico

El síndrome de ovario poliquístico (SOP) es ampliamente reconocido como la

causa más común de infertilidad en mujeres y afecta entre el 5-10% de las mujeres en

edad reproductiva (10). Los criterios de diagnóstico de este síndrome fueron

redefinidos en el Congreso de Rotterdam (Holanda, 2003), en el cual se acordó que

para diagnosticar SOP debe coexistir a lo menos dos de los tres criterios siguientes: 1)

irregularidades menstruales, 2) signos bioquímicos o clínicos de exceso de andrógenos

y 3) morfología de ovario poliquístico. Además, este síndrome está fuertemente

asociado a desordenes metabólicos, en los que destacan defectos en la acción y

secreción de insulina, lo cual le sitúa como un importante factor de riesgo de diabetes

mellitus tipo 2 (11).

Si bien la etiología del SOP aún es desconocida, esta parece ser multifactorial,

en la cual estarían involucrados componentes genéticos y ambientales. Este síndrome

HHiippoottáállaammoo

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13

fue considerado por mucho tiempo un desorden principalmente reproductivo, sin

embargo, en la actualidad variados descubrimientos le han otorgado implicaciones

metabólicas.

Existen diversas investigaciones que apuntan a que cambios locales que

alteren la esteroidogénesis podrían ser los eventos iniciales del síndrome. El grupo de

investigación de nuestro laboratorio ha obtenido importantes evidencias de que

cambios en la actividad nerviosa simpática del ovario participan en el desarrollo y

mantención del ovario poliquístico en la rata (12-14). En el modelo animal de ovario

poliquístico inducido mediante la administración de una dosis única de valerato de

estradiol (EV), estrógeno de vida media larga, se producen cambios profundos en la

homeostasis de las catecolaminas ováricas. Estos cambios se iniciaron antes del

desarrollo de quistes ováricos y se mantuvieron incluso después de que los quistes se

formaran. Las alteraciones involucraron un aumento en el contenido de NA ovárica,

aumento en la liberación de NA desde los terminales nerviosos que llegan al ovario y

un “down-regulation” de los receptores β-adrenérgicos en las células de la teca y el

intersticio del ovario (12). Otro modelo animal de ovario poliquístico, que evita el

estradiol como evento primario, es el inducido con estrés por frío crónico intermitente,

en el cual se ha demostrado la activación de los nervios simpáticos ováricos y la

aparición de estructuras quísticas (15-17). Finalmente, la administración del agonista β-

adrenérgico isoproterenol durante 10 días, como forma de remedar una activación

simpática, provocó la aparición de quistes ováricos después de 30 días de finalizado el

tratamiento (13). Estas alteraciones encontradas en la inervación simpática del ovario

de rata, parecen tener relevancia clínica, ya que un estudio realizado recientemente en

Suecia, demostró por primera vez, con un registro intraneural de la actividad nerviosa

simpática, un aumento del tono nervioso simpático en mujeres con SOP (18),

concordante con el mayor nivel de estrés demostrado en estas pacientes (19).

La variedad de evidencias presentadas claramente apoyan la participación de la

actividad nerviosa simpática ovárica en el desarrollo y/o mantención de la condición

poliquística.

14

4) Estrés

4.1) Definición de estrés: El término estrés fue introducido por Selye, quien lo definió como una

respuesta no específica del cuerpo frente a cualquier demanda que éste tuviera (20).

Años más tarde Weiner, Chrousos, Gold, Goldstein y McEwen hicieron importantes

contribuciones al concepto de estrés. Específicamente, Weiner introdujo el concepto de

especificidad de la respuesta al estrés, mediante la descripción del estrés como

presiones selectivas físicas y sociales del medio ambiente que rodea al organismo

(agentes estresores). Estos estímulos amenazan o presentan un desafío al organismo,

el cual reacciona con un patrón de respuestas compensatorias (21). En esta misma

línea, Chrousos y Gold definieron el estrés como un estado de falta de armonía o

amenaza de la homeostasis, que evocan respuestas tanto específicas como

inespecíficas (22). Por último, McEwen agregó el término “alostasis” a lo que a estrés

se refiere. Este concepto se refiere a los procesos de adaptación del organismo,

mediante la producción de diversos mediadores como esteroides adrenales,

catecolaminas, citoquinas, mediadores tisulares y genes de respuesta temprana (23).

Sin duda que las adaptaciones fisiológicas son un elemento fundamental para

mantener la homeostasis de un organismo cuando éste es sometido a condiciones

ambientales adversas.

4.2) Clasificación de los estímulos estresores: Un estímulo estresor puede considerarse como un agente que interrumpe la

homeostasis. En general, los estresores pueden dividirse en cuatro categorías: a)

estresores físicos, b) estresores psicológicos, c) estresores sociales y d) estresores

que alteran la homeostasis cardiovascular y metabólica. Entre los estresores físicos se

incluyen el frío, el calor, la radiación intensa, el ruido, la vibración, entre otros. Por otra

parte, los estresores psicológicos afectan profundamente los procesos emocionales y

pueden resultar en cambios de comportamiento, como ansiedad, miedo, o frustración.

El estrés de tipo social para un animal corresponde a la colocación de éste en el

territorio de un animal dominante, y en los seres humanos, al desempleo y la

separación matrimonial, entre otros. Los estresores que perturban la homeostasis

cardiovascular o metabólica incluyen el ejercicio, la inclinación vertical, la exposición de

15

calor, la hipoglucemia, y la hemorragia (24). Muchos de los factores estresantes que se

han descrito, se utilizan en animales investigación, como modelos de activación de

diferentes vías neuroendocrinas.

En términos de duración, el estrés puede dividirse en dos categorías

principales: agudo y crónico. El estrés agudo corresponde a un estímulo único con

tiempo de duración limitado, en cambio el crónico puede ser una exposición única pero

prolongada o varias exposiciones al agente estresor (estrés crónico intermitente) (24).

4.3) Efecto del estrés crónico sobre la condición poliquística El estrés es una característica que prevalece en las mujeres con SOP (19), lo

cual sugiere que podría jugar un rol importante en la etiología de este desorden

endocrino-metabólico. En nuestro grupo de trabajo, hemos demostrado la capacidad

del estrés de activar la inervación simpática ovárica e inducir cambios en el desarrollo

folicular y la formación de quistes en ratas (16, 17). Los tipos de estrés que se han

utilizado han sido crónicos, con un mínimo de 3 semanas de duración. Ésto debido

principalmente a la cinética de crecimiento folicular en los roedores, la cual ha

mostrado que desde que entran al pool de folículos en crecimiento hasta que alcanzan

el estado preovulatorio transcurren aproximadamente 20 días (25). Uno de los modelos

de estrés usados fue el estrés combinado de restricción de movimiento y frío, sin

embargo, después de 11 semanas de tratamiento los cambios ováricos encontrados a

las 3 semanas fueron revertidos (17). El estrés por restricción de movimiento induce

una fuerte respuesta del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal, aumentando los corticoides

plasmáticos. Estos últimos inhiben la actividad nerviosa simpática (26, 27), lo cual

podría explicar la reversión de los cambios ováricos en el modelo de estrés combinado.

Por otra parte, el estrés por frío crónico de 4 semanas no afecta el nivel de corticoides

plasmáticos (28), lo cual fue corroborado por nuestro grupo de trabajo (16), e hizo de

éste un buen modelo de estrés para inducir cambios en la actividad nerviosa simpática

ovárica. Los cambios ováricos observados en el modelo de estrés por frío crónico dan

cuenta de un retardo en el desarrollo folicular y muestran la aparición de folículos con

hipertrofia tecal, similar a lo observado en ovarios de mujeres con SOP (29).

Las alteraciones metabólicas, como la resistencia a la insulina y la intolerancia a

la glucosa, que acompañan al ovario poliquístico en un gran número de pacientes, han

16

sido relacionadas con un alto grado de estrés. Sin embargo, en nuestro modelo

experimental aún se desconoce si existen cambios a nivel metabólico.

4.4) Efecto del estrés sobre el síndrome metabólico El síndrome metabólico es un conjunto de factores de riesgo que aumentan el

riesgo de enfermedad cardiaca y diabetes tipo 2. Las características del síndrome

metabólico son obesidad abdominal, dislipidemia (triglicéridos aumentados, alta

concentración de lipoproteínas de baja densidad y baja concentración de lipoproteínas

de alta densidad), presión sanguínea elevada y resistencia a la insulina (con o sin

intolerancia a la glucosa) (30). Varios autores han discutido el posible efecto del estrés

sobre los componentes del síndrome metabólico, por ejemplo, Taran Chandola y cols.,

mostraron evidencias clínicas de una relación entre estresores psicológicos y

enfermedad cardiaca (31); Rosmond R., demostró que alteraciones psicológicas y

socioeconómicas pueden relacionarse con resistencia a la insulina y obesidad visceral

(32). Por otra parte, investigaciones en animales han demostrado que diferentes tipos

de estresores, tales como estrés acústico y restricción de movimiento, alteran el control

de la glicemia, pudiendo desencadenar resistencia a la insulina, intolerancia a la

glucosa y/o diabetes tipo 2 (33, 34).

5) Resistencia a la insulina

5.1) Definición: La resistencia a la insulina, uno de los aspectos del síndrome metabólico, se

caracteriza por una respuesta defectuosa o anómala de la insulina en tejidos

periféricos: músculo esquelético, hígado y tejido adiposo, donde no ejerce de forma

adecuada sus acciones biológicas, condicionando como mecanismo de compensación

un incremento en la secreción de insulina (35). Los defectos moleculares de la

actividad insulínica varían dependiendo del tejido estudiado. La cascada de

transducción normal de la insulina se inicia con la unión a su receptor de membrana, el

cual corresponde a un heterotetrámero compuesto de dos subunidades α y dos β

unidos por puentes disúlfuro. Este receptor del tipo tirosina quinasa autofosforila

residuos de tirosina en su subunidad intracelular β, cuando las moléculas de insulina se

unen al receptor. Posteriormente, se fosforila el sustrato del receptor de insulina (IRS),

17

el cual se une transitoriamente al receptor de insulina activado y sirve como molécula

de anclaje para otras proteínas que poseen dominios de unión, tal como la

fosfoinositol-3 quinasa (PI3K). La PI3K a su vez fosforila a la proteína quinasa B (PKB

o AKT), la cual fosforila a la glicógeno sintasa quinasa-3 (GSK-3). Esta última inhibe la

síntesis de glicógeno al inhibir la glicógeno sintasa. La activación de la PI3-K conduce

también a la traslocación del transportador de glucosa dependiente de insulina (GLUT-

4) a la superficie celular, lo cual induce la captación de glucosa por parte de las células

(figura 2) (36). Algunos de los cambios que ocurren en los tejidos cuando se está en

presencia de resistencia a la insulina son la disminución de la activación de la PI3K y la

expresión de IRS-1 y GLUT-4 (37)

PI3-K

IRS p85 p110

PKB

PKC

Figura 2: Representación esquemática de la transducción de señal de la insulina en células de músculo esquelético.

18

5.2) Acciones de la insulina: La acción clásica de la insulina es el control del metabolismo de la glucosa a

través de una retroalimentación dual que une a la insulina plasmática con la glicemia.

Es decir, cuando aumenta la concentración de glucosa plasmática se induce la

secreción de insulina desde las células beta pancreáticas, lo cual inhibe la

gluconeogénesis hepática. Sin embargo, un gran número de acciones nuevas de la

insulina se han propuesto a partir de estudios in vivo e in vitro (38). A nivel de sistema

nervioso autonómico y central se ha demostrado que la insulina sistémica tiene un

efecto excitatorio de las ramas simpáticas del sistema nervioso autonómico, aún

cuando se prevenga la hipoglicemia (39). En estudios de liberación de noradrenalina

desde tejido aórtico in vitro se ha demostrado un aumento de la liberación del

neurotransmisor cuando éste se incuba en presencia de insulina (40), lo que hace

posible un efecto de la insulina sobre neuronas simpáticas ováricas.

Por otra parte, existe variada evidencia que indica que la insulina actúa en el

cerebro. La insulina atraviesa la barrera hematoencefálica y alcanza diferentes zonas

del cerebro. En algunas regiones, especialmente en áreas periventriculares, la barrera

hematoencefálica está incompleta, y precisamente en esas brechas la insulina puede

difundir hacia el núcleo arcuato y paraventricular, en donde se une a receptores

específicos que están expresados abundantemente en sus neuronas (41). Las

funciones de la insulina sobre estos núcleos no son del todo claras, sin embargo,

existen estudios que demuestran un efecto sobre el control de la ingesta de alimento,

el crecimiento neuronal, el gasto energético y la reproducción (42, 43).

Cabe mencionar que la transducción de señal de la insulina en diferentes

tejidos puede sufrir modificaciones distintas. En esta línea, se han descrito en la

literatura, tanto en humanos como en modelos animales, cambios en la sensibilidad a

la insulina tejido y/o función específica (44, 45).

5.3) Resistencia a la insulina e hiperinsulinemia compensatoria en el SOP: La hiperinsulinemia y la resistencia a la insulina juegan un importante papel en

la patogénesis del SOP y el síndrome metabólico. Estos últimos son considerados

factores de riesgo para diabetes mellitus tipo 2. Las mujeres con SOP presentan

19

resistencia a la insulina en un porcentaje mayor al 50 %, la cual es independiente del

grado de obesidad de las pacientes (46).

La relación propuesta entre la hiperinsulinemia compensatoria a la resistencia a

la insulina y el SOP, corresponde al efecto de la insulina sobre el eje endocrino

hipotálamo-hipófisis-ovario. Específicamente, la insulina actuaría a nivel hipotalámico e

hipofisiario cambiando el patrón de secreción de las gonadotropinas y a nivel ovárico

aumentaría la secreción de andrógenos (47, 48). Estas alteraciones en el eje de

regulación endocrino de la función ovárica, podrían ser en parte responsables de la

patología poliquística. Sin embargo, hasta el momento se desconoce el efecto que

pudiera tener la insulina sobre el eje de regulación neural de la función ovárica, ya sea

actuando directamente sobre terminales nerviosos simpáticos ováricos o centralmente

en donde está el origen de la vía nerviosa que inerva el ovario (ver figura 3). Tampoco

se sabe si el estrés por frío crónico intermitente, descrito previamente como un modelo

de ovario poliquístico (16), pudiera tener cambios en la sensibilidad a la insulina en

diferentes órganos blanco.

Estrés Figura 3: Representación esquemática de la relación entre la hiperinsulinemia y la hiperandrogenemia en mujeres SOP insulina resistentes (derecha). Posible rol de la insulina sobre el eje de regulación nervioso ovárico (izquierda) con probables cambios en la sensibilidad a la insulina en un modelo de estrés crónico.

GnRH

LH

A

E2

∆4

Ovario

∆4

E2 y ∆4

Resistencia a insulina

Hiperinsulinemia GG.. CCeelliiaaccoo

SSOONN NNAA

HHiippoottáállaammoo ?

?

A ∆4E2

Ovario

20

Los antecedentes mencionados anteriormente apoyan la hipótesis de que la

insulina puede regular la homeostasis de la función reproductiva, alterando la actividad

nerviosa simpática ovárica, ya sea a nivel de sistema nervioso central y/o a nivel local,

directamente sobre los terminales nerviosos ováricos.

HIPÓTESIS

“En el ovario poliquístico inducido mediante estrés crónico por frío, la insulina

activa la inervación simpática ovárica y modifica la esteroidogénesis mediante un

efecto central y/o periférico, alterando el desarrollo folicular”

OBJETIVO GENERAL

Estudiar el efecto de la insulina, aplicada central y localmente, sobre la

actividad simpática del ovario de rata, en un modelo de ovario poliquístico inducido por

estrés crónico.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Objetivo específico Nº1:

“Determinar los cambios en la acción y secreción de insulina en el modelo de

ovario poliquístico inducido por estrés frío crónico”


“Estudiar el efecto in vitro de la insulina sobre la actividad simpática ovárica y la

secreción de hormonas esteroidales del ovario en el modelo de ovario

poliquístico inducido por estrés crónico”


“Estudiar el efecto de la insulina aplicada centralmente sobre la actividad

simpática del ovario en el modelo de ovario poliquístico inducido por estrés

crónico”

21

MATERIALES Y MÉTODOS

1) Animales y grupo experimentales Se usaron ratas hembras, adultas, de aproximadamente 200 gramos, de la

cepa Sprague-Dawley, provenientes del bioterio de animales de la Facultad de

Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile. Los animales se

mantuvieron en cajas individuales a 23º C en un régimen de 12 horas de luz y 12 horas

de oscuridad (luz apagada de 7 p.m. a 7 a.m.), con alimento y agua ad libitum. Un total

de 81 ratas fueron utilizadas en esta tesis, de las cuales 15 se usaron en el

experimento del clamp hiperinsulinémico euglicémico, 10 en la prueba de tolerancia a

la glucosa, 18 en los experimentos de liberación de NA, 10 en la cuantificación del nivel

de mRNA, 10 en los análisis del nivel de proteína, 8 en la secreción in vitro de

hormonas esteroidales y 20 en los experimentos de administración de insulina

intracerebroventricular. Todos los procedimientos con animales fueron previamente

aprobados por el Comité de Bioética de la Facultad de Ciencias Químicas y

Farmacéuticas y Facultad de Medicina de la Universidad de Chile.

Para el desarrollo de los objetivos 1 y 2 los animales fueron divididos al azar en

2 grupos experimentales: 1) grupo control (mantenidos a 23º C) y 2) grupo estrés por

frío (4º C por 3 horas/día, de lunes a viernes, por 4 semanas). En el caso del objetivo

número 3 los animales fueron separados en 4 grupos experimentales: 1) grupo control

infundido con vehículo (Control Vehic), 2) grupo control infundido con insulina (Control

Ins), 3) grupo estresado infundido con vehículo (Estrés Vehíc) y 4) grupo estresado

infundido con insulina (Estrés Ins).

2) Protocolo de estrés por frío crónico intermitente Para los experimentos de esta tesis, solamente se utilizaron las ratas que

tuvieron ciclos estrales regulares de 4 días. El procedimiento de estrés utilizado ha sido

previamente descrito por nuestro grupo de trabajo (16). Este consiste en colocar las

ratas a 4 ºC por 3 horas cada día, de lunes a viernes, durante 4 semanas. Tanto los

animales control como los estresados fueron manipulados diariamente por el mismo

operador y mantenidos en la misma habitación. Una vez terminado el procedimiento de

22

estrés, los animales fueron eutanasiados 24 horas después. Durante el protocolo de

estrés, se siguió la ciclicidad estral, peso corporal e ingesta de alimento.

3) Seguimiento de los animales

3.1) Ciclicidad estral: Las etapas del ciclo se determinaron mediante el análisis microscópico del tipo

de células predominantes en un frotis vaginal obtenido diariamente (lunes a viernes),

tanto en el grupo de ratas control, como en el de ratas estresadas. Las etapas son:

Proestro: se caracteriza citológicamente por la presencia de células epiteliales

nucleadas, bien redondeadas. La duración de esta etapa es de 12 a 24 horas

Estro: citológicamente se caracteriza por la presencia de células escamosas agrupadas

y con formas irregulares. Esta etapa tiene una duración entre 24 y 48 horas y

corresponde al periodo de receptividad sexual de la hembra.

Metaestro o Diestro 1: el frotis vaginal se caracteriza por la presencia de leucocitos y

células escamosas. La duración es entre 12 y 24 horas.

Diestro 2: se caracteriza por una gran presencia de leucocitos en el frotis vaginal. La

duración de esta etapa es de aproximadamente 48 horas.

3.2) Peso corporal: Los animales fueron pesados en una balanza granataria diariamente, de lunes a

viernes, durante las cuatro semanas de duración del protocolo de estrés.

3.3) Ingesta de alimento: Para determinar el consumo de alimento, se determinó la diferencia de peso

entre el alimento colocado a cada animal y el alimento sobrante después de dos días.

Este procedimiento se repitió durante todo el tratamiento, tanto para los animales

control, como para los estresados.

23

Una vez finalizado el último evento de estrés, se esperó 24 horas para hacer los

experimentos correspondientes.

4) Procedimientos experimentales finalizado el protocolo de estrés

4.1) Prueba de tolerancia a la glucosa: Mediante esta prueba se determinó la capacidad de los animales de secretar

insulina en respuesta a un secretagogo (glucosa) y de regular la glicemia. Los animales

de ambos grupos experimentales (control y estrés) se mantuvieron en ayuna por 12

horas antes de comenzar la prueba. Las ratas fueron anestesiadas con 120 mg/kg de

tiopental sódico vía i.p. Posteriormente a los animales se les insertó una cánula en la

arteria carótida y se administró 2 g/kg de glucosa vía i.p. La colección de sangre, desde

la cánula implantada en la arteria, se realizó a los 0, 5, 15, 30, 60 y 120 minutos

después de la carga de glucosa. Los tiempos de colección nos permitieron observar en

la curva de glucosa plasmática versus tiempo, la capacidad del animal de regular la

glicemia. La determinación de insulina sérica se realizó en los mismos sueros, lo cual

nos permitió conocer la capacidad del páncreas de responder frente a un secretagogo

como la glucosa. La insulina se midió con un kit de ELISA específico para rata (Alpco

Diagnostics, Windham,NH). Por su parte, la glucosa se determinó mediante un ensayo

enzimático colorimétrico (Human, Weisbaden, Germany).

4.2) Clamp hiperinsulinémico euglicémico: Existen diversos métodos para determinar el grado de resistencia a la insulina,

sin embargo el procedimiento más válido para este fin corresponde al clamp

hiperinsulinémico euglicémico (49). Después de 24 horas de finalizado el

procedimiento de estrés crónico, se procedió a realizar el siguiente protocolo

experimental, similar a lo descrito anteriormente (50): las ratas se mantuvieron

anestesiadas durante todo el experimento, aproximadamente 90 minutos desde la

administración del anestésico (tiopental sódico 120 mg/kg i.p.). Los animales se

colocaron sobre una manta temperada con el fin de mantener la temperatura corporal.

Se insertaron dos catéteres, uno en la arteria carótida izquierda y el otro en la vena

yugular derecha, utilizados para la colección de sangre e infusiones de glucosa e

insulina respectivamente. Además se colocó un catéter en la tráquea para permitir al

24

animal una mejor respiración. Posteriormente, se tomó una muestra de sangre basal

en la cual se midió inmediatamente la glicemia con un Accucheck Comfort

Glucometer™. Una mezcla de insulina (100 U/ml; Humalog, Eli Lilly, West Ryde,

Australia) con 0.2 ml de albúmina y 0.9 % de NaCl se infundió a un flujo de 24, 16 y 12

mU/kg/min al minuto 1, 2 y 3 respectivamente. Inmediatamente después se cambió el

flujo a 8 mU/kg/min y se administró a esta velocidad por todo el experimento. La

euglicemia se mantuvo mediante la infusión de una solución de glucosa al 30 % p/v en

0.9 % de NaCl. Cada 5 minutos se midió la glicemia del animal en una gota de sangre

obtenida desde la arteria carótida y se varió el flujo de glucosa con la finalidad de

mantener una glicemia cercana a 6 mmol/l (ver figura 4). Al terminar el experimento se

colectó una muestra de sangre para medir la concentración de insulina. La velocidad

de infusión de glucosa se calculó con el promedio de al menos los últimos 3 valores en

el estado estacionario (cuando la glucosa en la sangre es estable a 6.0 mmol/l,

aproximadamente a los 60 minutos) y fue corregida por el peso corporal del animal.

Figura 4: Representación gráfica de la concentración de insulina (gráfico izquierda) y glucosa (gráfico derecha) durante el clamp. El minuto cero corresponde al momento en que comienza la infusión de insulina y glucosa. En el gráfico de concentración de glucosa plasmática se muestra la curva de velocidad de infusión de glucosa, la cual es la variable que se utiliza finalmente para determinar el grado de sensibilidad a la insulina.

Glu

cosa

(mm

ol/L

)

Min

01

2

34

5

6

7

89

-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70

25

20

15

10

5

0 Velo

cida

d de

infu

sión

de

Glu

cosa

(mg/

kg/m

in)

Glu

cosa

(mm

ol/L

)

Min

01

2

34

5

6

7

89

-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70

25

20

15

10

5

0 Velo

cida

d de

infu

sión

de

Glu

cosa

(mg/

kg/m

in)

-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70

150

250

50

100

200

0

Min

liU

)

-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70

150

250

/ml

Insu

na(µ

50

100

200

0

Min-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70

150

250

50

100

200

0

Min

liU

)/m

lna

(µIn

su

25

4.3) Liberación de noradrenalina ovárica: La liberación de neurotransmisores es una prueba funcional de la actividad

nerviosa. En el caso particular de la liberación de NA ovárica, esta representa la

actividad de los nervios simpáticos que inervan el ovario. Después de 24 horas de

finalizado el procedimiento de estrés los animales se eutanasiaron y los ovarios

rápidamente se disectaron e incubaron en buffer Krebs (NaCl 118.6 mM, KCl 4.7 mM,

KH2PO4 1.2 mM, MgSO4 1.2mM, NaHCO3 250 mM, CaCl2 2.5 mM, glucosa 4.5 mg/ml,

ácido ascórbico 0.1 mg/ml) pH 7.4, en presencia de mezcla O2/CO2 (95:5) por 20

minutos y luego se incubaron con 2 µCi [3H]-NA (specific activity 74.9 Ci/mmol, Perkin

Elmer, Boston, MA) por 30 minutos a 37º C. La radioactividad no retenida por el tejido

fue lavada mediante la incubación de los ovarios con buffer Krebs sin [3H]-NA durante

60 minutos (6 lavados continuos de 10 minutos cada uno). Dependiendo del tipo de

estímulo aplicado, para simular un potencial de acción e inducir liberación de NA, es

como se procedió a continuación.

4.3.1) Liberación inducida con estímulo eléctrico:

Los ovarios se transfirieron a una cámara de superfusión termoregulada y se

perfundieron con buffer Krebs a un flujo de 2.5 ml/min. Simultáneamente se utilizaron

dos cámaras de superfusión, colocándose un ovario en cada una de ellas. Se tomaron

3 fracciones de 1 minuto como secreción basal (B), luego ambos ovarios se

sometieron a un estímulo eléctrico (80V, 10Hz, 2ms, 1 minuto) en ausencia de insulina

(estímulo control) y se tomó una fracción de 1 minuto correspondiente al estímulo (E).

Finalmente, se tomaron 4 fracciones de 1 minutos correspondientes a los post-

estímulos (PE). Posteriormente, en una de las cámaras de superfusión se cambió el

buffer por Krebs con insulina (10 UI/l). Luego de 10 minutos de lavado del tejido, es

decir, con flujo de buffer en ambas cámaras de superfusión, se repitió el protocolo de

estimulación. La finalidad de realizar dos estímulos en cada ovario es expresar los

resultados como razón entre ambos estímulos (E2/E1), de tal forma de independizarse

de variables del tejido o de la cámara de superfusión, que hicieran obtener errores en

las comparaciones de ambos ovarios.

26

Una vez terminado ambos estímulos, los ovarios se homogeneizaron en ácido

perclórico 0.4 M, se centrifugó a 15.000 g por 10 minutos y se determinó el remanente

de [3H]-NA en el tejido y la [3H]-NA de las fracciones con un contador de centelleo

(Packard Liquid Scintillation Analyzer 1600TR con un 72.5 % de eficiencia para tritio).

El eflujo de NA se calculó y expresó como el porcentaje de liberación fraccional

(porcentaje del total de radioactividad presente en el ovario en cualquier momento). La

cantidad total de NA liberada se calculó como el área bajo la curva después de la

estimulación menos el eflujo basal.

4.3.2) Liberación inducida con estímulo de K+ 80 mM: Cada par de ovarios, proveniente de cada rata, se separaron al azar e

incubaron en pocillos (placas de 24 pocillos), que contienen 1.5 ml de buffer Krebs. Los

ovarios se cambiaron al siguiente pocillo cada 2 minutos. Después de 3 incubaciones

de 2 minutos cada una (basales), los ovarios se estimularon por despolarización con un

medio isotónico que contenía KCl 80 mM y NaCl 43.3 mM (buffer Krebs K+). Los

ovarios posteriormente fueron lavados por 30 minutos antes de ser sometidos a un

segundo periodo de estimulación. Esta vez uno de los ovarios se incubó con buffer

Krebs suplementado con insulina (10 UI/l) y el otro se mantuvo en las mismas

condiciones utilizadas en el primer periodo de estimulación. El motivo de la realización

de dos estímulos consecutivos en cada ovario y la forma de expresar los resultados es

la misma descrita anteriormente para la estimulación inducida con estímulo eléctrico.

4.4) Secreción de hormonas esteroidales ováricas Una vez finalizada las 4 semanas de estrés, se esperó 24 horas para eutanasiar

a los animales y se disecó los ovarios. Estos se dividieron en dos partes y se incubaron

en 2 ml de buffer Krebs-Ringer (NaCl 118.6 mM, KCl 4.7 mM, KH2PO4 1.2 mM, MgSO4

1.2mM, NaHCO3 250 mM, CaCl2 2.5 mM, glucosa 4.5 mg/ml, ácido ascórbico 0.1

mg/ml, EDTA 0.11 mg/ml, albúmina 0.1 mg/ml) pH 7.4, a 37 ºC en presencia de mezcla

O2/CO2 (95:5) durante 3 horas. Cada mitad de ovario (en total 4 por cada rata) fue

incubada en un pocillo distinto que contenía: 1) buffer Krebs-Ringer; 2) Krebs-Ringer

más hCG (2.5 UI/ml); 3) Krebs-Ringer más insulina (10 UI/l); 4) Krebs-Ringer más hCG

(2.5 UI/ml) e insulina (10 UI/l). El diseño experimental fue tal que permitió utilizar las 4

27

mitades simultaneamente. Una vez cumplida las 3 horas de incubación se recuperó el

sobrenadante y se determinó en este último la progesterona (P), androstenediona (∆4)

y estradiol (E2) secretado al medio por el ovario mediante un inmunoensayo (EIA, Alpco

Diagnostics, Windham, NH) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las

variaciones intra e inter ensayo fueron menos de 11 %, 7 % y 10 % para P, ∆4 y E2

respectivamente. El valor mímino detectable para P fue de 2.5 pg; para ∆4 1.25 pg; y

para E2 0.5 pg.

4.5) Separación de células de granulosa y teca-interstical La obtención de una fracción enriquecida de células de la granulosa a partir de

ovarios completo ha sido descrita previamente en la literatura (51). Una vez disectados

e incubados los ovarios en 50 µl de buffer Krebs, estos se pincharon con una aguja y

se colectó la suspensión de células en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml. Este

procedimiento se repitió tres veces, colectando finalmente un volumen de 150 µl de

suspensión de células de granulosa. La suspensión fue centrifugada a 250 g y lavada

tres veces con buffer Krebs. Tanto de la suspensión de células de granulosa como del

resto del ovario (principalmente células tecales-intersticiales) se extrajo el RNA total y

las proteínas para los análisis de PCR en tiempo real y western blot respectivamente.

Para comprobar la pureza de la preparación, se midió el nivel de mRNA para el

receptor de FSH en ambas fracciones, ya que este sólo se expresa en células de la

granulosa (52).

4.6) Nivel de mRNA para Irs-1, Irs-2, Glut-1, Glut-4 y Fshr por PCR en tiempo real

El RNA total se extrajo del músculo tibialis, ovario completo, células de

granulosa y teca-intersticial, mediante el método descrito por Chomczynski and Sacchi

(53). Se tomó 5 µg del total de RNA extraído de cada una de las muestras y se

sometieron a la reacción de transcripción reversa para obtener cDNA. La reacción se

llevó a cabo en presencia de dNTPs 1.6 mM, DTT 10 mM, partidores randomizados

176 nM (Invitrogen, Carlsbad, CA), RNasaOUT 25 U (Invitrogen, Carlsbad, CA) y

transcriptasa reversa SuperScript II 125 U (Invitrogen, Carlsbad, CA). El volumen final

de reacción fue de 30 µl y la reacción se llevó a cabo a 42 ºC por 60 minutos,

deteniéndose por calentamiento de las muestras a 75 ºC durante 10 minutos.

28

Posteriormente, los cDNA obtenidos se amplificaron mediante la reacción de PCR en

tiempo real, en presencia de partidores específicos para cada uno de los genes de

interés. El volumen final de esta reacción fue de 25 µl, de los cuales 12.5 µl

correspondieron a 2X Brilliant® Platinum SYBR Green QPCR Master Mix (Stratagene®,

1834 State Hwy. 71 West), 9.5 µl a agua estéril nanopura, 0.5 µl a cada uno de los

partidores y 2 µl a cDNA.

El perfil de temperatura utilizado en el termociclador para la reacción de PCR en

tiempo real fue el siguiente:

1) 10 minutos a 95 ºC (ciclo único)

2) 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 60 ºC, 30 segundos a 72 ºC, 7 segundos a 78

ºC (40 ciclos)

3) 1 minuto a 95 ºC, 7 segundos a 72 ºC, 7 segundos a 95 ºC (ciclo único)

La intensidad de fluorescencia de la doble hebra formada unida al reactivo

SYBR-Green I, medida al final de cada ciclo de elongación (etapa 2), refleja la cantidad

de producto PCR formado. Para determinar la especificidad del producto formado se

realizó una “curva de melting” entre 72-95 ºC, bajo continua medición de fluorescencia

(etapa 3). Cada amplicón o producto PCR formado tiene una temperatura de

desapareamiento específica (melting point). La cantidad de mRNA inicial de cada gen

de interés se calculó, determinando el ciclo en el cual comenzó el aumento lineal del

producto PCR. El valor de ciclo se interpoló en una curva estándar obtenida por

diluciones seriadas de una muestra de concentración conocida.

Los partidores para Irs-1, Irs-2, Glut-1 y Glut-4 se diseñaron a partir de las

secuencias del Genebank y los partidores para Fshr se obtuvieron de la literatura (54)

(ver tabla 1). Para normalizar la cuantificación de los mRNA para Irs-1, Irs-2, Glut-1,

Glut-4 y Fshr, se midió en cada uno de los tejidos el gen de expresión constitutiva

subunidad ribosomal 18s y los resultados se expresaron como la razón entre el gen de

interés y el constitutivo. La medición del mRNA 18s se realizó utilizando partidores

disponibles comercialmente (Ambion, Austin, TX, USA) y se llevó a cabo en tubos de

PCR independientes para evitar interferencia con la amplificación de los genes de

interés.

29

Tabla 1: Partidores para Irs-1, Irs-2, Glut-1, Glut-4, Fshr y 18s de rata. Nombre Secuencia (5'-3') Código de acceso al

GenBank Irs-1 Sentido GGA AGC CAT GGA CAA ACG GAG TAG Antisentido TCT GGG CCA TAG TAG CAT TCT CAG

NM_012969

Irs-2 Sentido CCC TGT ACT TGC GGT GGT GGA G Antisentido CTG AGT GAT GAG GCT GGG TAT GAC

XM_001076309

Glut-1 Sentido CCT ACC GCC AGC CCA TCC TCA T Antisentido CCA CGA CGA ACA GCG ACA CCA C

NM_138827

Glut-4 Sentido CGT CCT CCT GCT TGG CTT CTT CAT Antisentido CCA CCA TTT TGC CCC TCA GTC ATT

NM_012751

Fshr Sentido CAT CAC TGT GTC CAA GGC CA Antisentido TGC GGA AGT TCT TGG TGA AAA

BC 137991

18s Sentido TCA AGA ACG AAA GTC GGA GG Antisentido GGA CAT CTA AGG GCA TCA CA

NM_X01117

4.7) Nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 por Wetern Blot La proteínas se extrajeron de ovarios, músculo tibialis, fracción de células de

granulosa y de teca-intersticial, mediante la homogeneización de los tejidos en un

homogenizador vidrio-vidrio con 200 µl de buffer de lisis (Tris-HCl 50 mM, NaCl 50 mM,

EGTA 1 mM, EDTA 1 mM, Triton 1 %; pH 7.4) suplementado con un cocktail inhibidor

de proteasas (SIGMA, St. Louis, Missouri, USA), PMSF y DTT. El homogenizado se

centrifugó a 16500 g por 10 minutos a 4 ºC y se procedió a recuperar el sobrenadante

en el cual se encuentran las proteínas. La determinación de proteínas totales se realizó

mediante el método de Lowry (55), el cual se basa en la formación de un complejo

entre las proteínas y el cobre en medio alcalino, el cual reacciona con el reactivo de

Folin (mezcla entre ácido fosfotúngstico y ácido fosfomolíbdico) y finalmente la

reducción de este compuesto es detectado colorimétricamente a una absorbancia de

660 nm. La separación de las proteínas se realizó en un gel de poliacrilamida con SDS

al 8 %, en el cual se cargaron 50 µg de proteína de cada muestra. La electroforesis se

realizó con una diferencia de potencial constante de 100 V y una duración de

aproximadamente 1 hora. Posteriormente las proteínas se transfirieron a una

membrana de nitrocelulosa en una cámara electroforética de transferencia, con

intensidad de corriente constante a 300 mA durante 3 horas. Finalizada la

30

transferencia, la nitrocelulosa fue bloqueada con leche en polvo al 5 % en TBST (20

mM Tris, 137 mM NaCl, 0. % Tween-20, pH 7.6) por 1 hora a temperatura ambiente

con agitación. La membrana fue incubada toda la noche a 4 ºC con el anticuerpo

primario correspondiente diluido en TBST: anti-IRS-1 (C-20, Santa Cruz,

Biotechnology, Inc., USA; dilución 1:100), anti-GLUT-4 (H-61, Santa Cruz,

Biotechnology; dilución 1:100) o anti-β-tubulin (3F3-G2, Santa Cruz, Biotechnology;

dilución 1:1000). Al día siguiente las membranas fueron lavadas tres veces (7 minutos

cada vez) con TBST e incubadas con el anticuerpo secundario anti-rabbit (IRS-1 y

GLUT-4) o anti-mouse (β-tubulin), por 1 hora a temperatura ambiente con agitación. La

detección se realizó mediante quimioluminiscencia con el sistema de detección de

western blot ECL plus (Amersham Biosciences). Las películas fotográficas se

escanearon y la intensidad de las bandas se midió con el programa UN-SCAN-IT (Silk

Scientific, Orem, Utah). Los resultados se expresaron como la razón entre la intensidad

de banda de la proteína de interés y la proteína de expresión constitutiva β-tubulina

(utilizada también como control de carga).

5) Administración de insulina intracerebroventricular durante el protocolo de estrés Una semana antes de comenzar el procedimiento de estrés los animales fueron

canulados en el tercer ventrículo. Para ello, las ratas se anestesiaron con una mezcla

de ketamina (60mg/Kg) y xilacina (10mg/Kg) administrada vía i.p. Posteriormente, se

implantaron cánulas de acero inoxidable de 24 G con diámetro externo de 0.5 mm en el

tercer ventrículo (3V) de acuerdo a las siguientes coordenadas respecto a Bregma: (-)

0.28 mm antero-posterior, 0,0 mm medio-lateral y (-) 0,81 mm dorso-ventral desde el

cráneo del animal, según el Atlas de coordenadas estereotáxicas de cerebro de rata de

Paxinos & Watson (56) y de acuerdo a lo publicado anteriormente (3). Luego de la

cirugía los animales permanecieron en recuperación y antes de comenzar el protocolo

de estrés se dividieron en 4 grupos: 1) control vehículo, 2) control insulina, 3) estrés

vehículo y 4) estrés insulina. La administración de vehículo (solución fisiológica, NaCl

0.9 %) o insulina (1 UI/kg) se realizó durante 7 días (última semana de estrés). La

forma de administración fue mediante infusión continua con bomba de perfusión a un

flujo de 1 µl/minuto. Posteriormente, se procedió a eutanasiar los animales y disecar

31

los órganos (ovario, ganglio celiaco, medula adrenal, músculo tibialis, cerebro

completo) que fueron inmediatamente congelados a -80 ºC hasta el momento de hacer

los análisis. Uno de los ovarios se fijó para el análisis morfológico.

6) Procedimientos experimentales finalizada la administración ICV de insulina 6.1) Morfología ovárica Los ovarios se fijaron con Zamboni (p-formaldehído 4 %, ácido pícrico saturado

y buffer fosfato salino 0.1 M) durante 16 horas, luego se traspasó a buffer salino por 24

horas y finalmente se deshidrató con sacarosa 20 % en buffer fosfato salino. Finalizado

el proceso de fijación los ovarios fueron incluidos en parafina, cortados a un grosor de

8 µm y teñidos con hematoxilina-eosina. El conteo de estructuras en el ovario se

realizó en el corte central, correspondiente al corte de mayor diámetro. Se analizó la

presencia de folículos preantrales normales (FPAN), folículos preantrales atrésicos

(FPAA), folículos antrales normales (FAN), folículos antrales atrésicos (FAA), cuerpos

lúteos (CL) y folículos anómalos, entre los cuales se considera a los folículos con

hipertrofia tecal (FHT), folículos tipo III (FTIII), prequistes (PQ) y quistes (Q) (57). Los

folículos preantrales, principalmente secundarios, fueron definidos como folículos que

carecen de cavidad antral y que poseen dos o más capas de células de granulosa. Los

folículos atrésicos por su parte fueron definidos como aquellos folículos con más del 5

% de células con núcleo picnótico y que muestran a veces degradación de la célula

germinal. Los folículos antrales corresponden a aquellos que poseen una cavidad

antral. Para normalizar los resultados obtenidos de la morfometría, se determinó el

área del corte central mediante el programa computacional Rhino Cero y se expresaron

los resultados como el número de folículos/mm2.

6.2) Determinación de los niveles séricos de estradiol, androstenediona, progesterona, insulina y glucosa

Al momento de eutanasiar los animales se colectó muestras de sangre, las

cuales se mantuvieron a 4 ºC durante aproximadamente 18 horas, luego se

centrifugaron a 3000 g y finalmente se colectó y congeló el suero a -20 ºC para su

posterior análisis. Las hormonas esteroidales se midieron mediante un inmunoensayo

(EIA, Alpco Diagnostics, Windham, NH) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

32

Las variaciones intra e inter ensayo fueron menos de 11 %, 7 % y 10 % para P, ∆4 y E2

respectivamente. El valor mímino detectable para P fue de 0.1 ng/ml; para ∆4 de 0.05

ng/ml; y para E2 de 10 ng/ml. La insulina por su parte se determinó con un ELISA

específico para rata (Alpco Diagnostics, Windham,NH) y la glucosa con un Accucheck

Comfort Glucometer™.

6.3) Determinación de catecolaminas en la médula adrenal Al momento de la medición las adrenales se descongelaron, pesaron y

homogenizaron con 1 ml de ácido perclórico (PCA) en un homogenizador vidrio-vidrio,

posteriormente el homogenizado se centrifugó a 13000 rpm por 10 minutos a 4 ºC y el

sobrenadante rescatado se utilizó directamente para la cuantificación de catecolaminas

por el método de Von Euler y Hamberg (58). Este método se basa en la oxidación de

adrenalina y noradrenalina a adrenocromo y noradrenocromo, moléculas que

presentan una absorción a una longitud de onda de 540 nm. La oxidación se realizó en

presencia de una solución de I2/I- a pH 6.0 y la medición se realizó con un

espectrofotómetro Jenway 6405 UV/Vis.

6.4) Determinación del contenido de noradrenalina en ovario y ganglio celíaco mediante HPLC Los ovarios y ganglios congelados previamente, se homogenizaron el día de la

determinación de NA, en 300 µl y 1 ml de PCA 0.2 N respectivamente, en un

homogenizador vidrio-vidrio. El homogenizado se centrifugó a 13000 rpm por 10

minutos y el sobrenadante rescatado se filtró con membranas de 0.22 µm de diámetro

de poro (MillexTM, Millipore Sao Paulo, Brazil). Posteriormente 20 µl de las muestras

filtradas se inyectaron en un sistema de cromatografía líquida de alta resolución

acoplado a un detector electroquímico (HPLC-EC) con la siguiente configuración:

Inyector Rheodyne, bomba Waters multisolvente (Modelo 600-E, waters, millipore

Corporation, Milford, MA), columna BAS (Modelo MF-6213, fase II ODS-3, Bioanalitycal

System, West Alfayate, IN) y detector electroquímico de pulso (Modelo 464, Waters,

Millipore Corporation, Milford, MA).

La fase móvil utilizada en la cromatografía fue la siguiente: NaH2PO4 0.1 M,

Octal-Sulfato 0.86 mM, EDTA 1 mM y acetonitrilo 0.5 % v/v, ajustado a pH 2.6). Las

33

condiciones de detección fueron las siguientes: potencial amperométrico de oxidación

de 0.650 V, sensibilidad de detección 1 nA y flujo de fase móvil de 1 ml/min. El tiempo

de retención aproximado fue de 4.1 minuto para NA y las áreas de los picos calculadas

para cada muestra se interpolaron en una curva estándar, que se construyó con la

medición de diferentes concentraciones de noradrenalina bitartrato (Sigma, St. Louis,

MO).

7) Análisis estadístico Las diferencias entre los grupos control y experimental se analizaron con la

prueba de t de Student y las comparaciones entre varios grupos se realizó mediante un

análisis de varianza (ANOVA), seguido por una prueba de comparación múltiple para

desigual número de replicas (Newman-Keuls). El nivel de significancia fue definido

como p<0,05.

34

RESULTADOS 1) Caracterización del modelo de estrés por frío crónico intermitente

1.1) Efecto del estrés sobre la ciclicidad estral Durante el procedimiento de estrés no hubo cambios en la ciclicidad estral en

ninguno de los grupos experimentales, control (fig. 5 A) y estrés (fig. 5 B), lo cual

concuerda con los resultados previamente descritos por nuestro grupo de trabajo (16).

La figura 5 C muestra el número de días promedio en cada una de las etapas del ciclo

que permaneció cada grupo experimental.

Figura 5: Efecto del estrés sobre la ciclicidad estral. El panel A muestra la ciclicidad de las ratas control (n = 6) y el panel B la ciclicidad de las ratas sometidas a estrés crónico por frío durante 4 semanas (n = 6). El panel C muestra los mismos datos de A y B, pero expresados como el porcentaje de días en cada etapa (diestro y metaestro han sido considerados en diestro) P: proestro; E: estro; M: metaestro; D: Diestro.

0

15

30

45

60D EP

Control EstrésC

% D

ías

4 semanas de estrés por frío B

A

35

1.2) Efecto del estrés sobre el crecimiento e ingesta de alimento La curva de crecimiento fue similar entre el grupo control y el de ratas

estresadas (fig. 6 A), al mismo tiempo que no hubo cambios en la ganancia de peso

entre el primero y último día de tratamiento (fig. 6 B). Sin embargo, el consumo de

alimento tendió a ser mayor en los animales estresados durante todo el tratamiento,

alcanzando significancia estadística sólo durante la cuarta semana de estrés (fig. 6 C).

Para investigar si las ratas sometidas a estrés crónico tuvieron algún grado de

resistencia a la insulina y/o fueron intolerantes a la glucosa, determinamos la

sensibilidad a la insulina in vivo mediante el método del clamp hiperinsulinémico

euglicémico y realizamos una prueba de tolerancia a la glucosa.

36

0 5 10 15 20 25 30 35 40150

200

250

300ControlEstrés

Primer día de estrés

A

Días

Peso

pro

med

io (g

)

Antes del

estré

sSem

-1Sem

-2Sem

-3Sem

-410

15

20

25

30ControlEstrés

**

C

Inge

sta

de a

limen

to (g

/día

)

0

10

20

30

40

50ControlEstrés

B

Gan

anci

a de

pes

o (g

)

Figura 6: Efecto del estrés sobre el crecimiento e ingesta de alimento. En A se muestra el crecimiento de las ratas, expresado como el peso corporal promedio diario. En B se refleja el crecimiento como la ganancia de peso desde el primero hasta el último día de estrés. En el panel C se observa la ingesta de alimento diaria durante cada semana de tratamiento (Sem: semana). Cada punto o barra corresponde al promedio del peso corporal, diferencia de peso o ingesta diaria de alimento de al menos 6 animales ± el error estándar. **p‹0.01 vs. control Sem-4.

37

1.3) Efecto del estrés sobre el grado de sensibilidad a la insulina La técnica del clamp hiperinsulinémico euglicémico es la más válida para

determinar el grado de sensibilidad a la insulina. En esta técnica la glucosa plasmática

se mantiene en estado estacionario dentro de un rango euglicémico (~6 mmol/l),

mientras que la insulina plasmática se eleva hasta alcanzar un plateau deseado

(estado hiperinsulinémico). A mayor velocidad de flujo de glucosa, requerido para

alcanzar el estado euglicémico, mayor es la sensibilidad a la insulina y viceversa. Tal

como se muestra en la figura 7, la velocidad de infusión de glucosa fue

significativamente mayor en los animales estresados por cuatro semanas, lo cual

sugiere que estos animales tienen mayor incorporación y utilización de la glucosa que

sus respectivos controles. El valor de insulina plasmática en el estado estacionario fue

de 95.1 ± 7.3 mU/l, lo cual corrobora el estado hiperinsulinémico.

Control Estrés0

20

40

60

*

Velo

cida

d de

infu

sión

de

gluc

osa

(mg/

kg/m

in)

Figura 7: Efecto del estrés sobre la velocidad de infusión de glucosa, determinada mediante el clamp hiperinsulinémico euglicémico. Cada barra corresponde al promedio ± el error estándar de 9 ratas control y 6 ratas estresadas. *p‹0.05 vs. control.

38

1.4) Efecto del estrés sobre la tolerancia a la glucosa En el modelo de estrés crónico los animales fueron capaces de tolerar la

glicemia elevada, inducida con la PTG (fig. 8 A). En las mismas muestras de sangre

obtenidas durante la prueba de tolerancia a la glucosa se midió la insulina, con la

finalidad de relacionar la respuesta del páncreas de secretar insulina y la capacidad del

animal de regular la glicemia. Las insulinemias se muestran en la figura 8 B, en donde

se puede observar que ambos grupos experimentales respondieron de la misma forma

al secretagogo glucosa, secretando insulina de forma muy similar. La glicemia e

insulinemia basal de los animales control y estresados fue de 6.20±0.21 y 2.36±0.6;

5.82±0.42 y 1.54±0.34 respectivamente, sin alcanzar diferencias significativas en

ninguno de los parámetros.

0 15 30 45 60 75 90 105 1200

6

12

18

24ControlEstrés

A

Tiempo (min)

Glu

cosa

pla

smát

ica

(mm

ol/L

)

Figura 8: PTG en ratas control y estresadas (A). Insulina plasmática medida durante la PTG (B). Cada punto corresponde al promedio ± el error estándar de 5 animales para cada grupo experimental.

0 30 60 90 1200

4

8

12

16

20

24

28

32 ControlEstrés

B

Tiempo (min)

Insu

lina

plas

mát

ica

(µg/

L)

39

1.5) Efecto del estrés sobre la actividad nerviosa simpática Aunque el modelo de estrés crónico por frío ya había sido caracterizado

anteriormente en cuanto a su actividad nerviosa simpática generalizada y ovárica en

particular (16, 28), en este trabajo corroboramos los datos anteriormente publicados

respecto a este modelo animal. La concentración de A y NA plasmática no experimentó

modificaciones después de 4 semanas de estrés (figura 9 A), sin embargo en la

glándula adrenal hubo un aumento en el contenido de catecolaminas producto del

estrés crónico (figura 9 B). El contenido de NA en el ganglio celiaco se mantuvo sin

cambios, mientras que la NA ovárica aumentó, una vez finalizado el estrés, sin

alcanzar significancia estadística (figura 9 C y D).

0

10

20

30

40

50Adrenalina Noradrenalina

EstrésControlA

Cat

ecol

amin

as (n

g/m

l de

plas

ma)

0

20

40

60 Control Estrés

*

B

Cat

ecol

amin

as (µ

g/ad

rena

l)

Figura 9: Efecto del estés por frío crónico sobre la actividad nerviosa simpática. En A se muestra la concentración de adrenalina y noradrenalina en el plasma, en B el contenido de catecolaminas en la médula adrenal, en C el contenido de noradrenalina en el ganglio celíaco y en D la concentración de noradrenalina en el ovario en ratas control y estresadas. Los valores están expresados como el promedio ± el error estándar de 5 experimentos individuales. *p‹0.05 vs. control

0

20

40

60

Control Estrés

Nor

adre

nalin

a (n

g/ga

o)

C

0.0

0.2

0.4

0.6

Control Estrés

Nor

adre

nalin

a (n

g/m

g O

vario

)

D

ngli

40

2) Efecto local de la insulina sobre la actividad nerviosa simpática ovárica 2.1) Efecto de la insulina sobre la liberación de NA ovárica inducida con estímulo eléctrico La determinación de la liberación de [3H]-NA ovárica, como forma de medir la

actividad nerviosa simpática ovárica ha sido utilizada ampliamente por nuestro grupo

de trabajo (12, 59). Los ovarios de los animales control y sometidos a estrés crónico

fueron incubados en cámaras de superfusión, en donde se sometieron a

despolarización por medio de un estímulo eléctrico que simula un potencial de acción.

En este experimento el flujo de solución Krebs o Krebs complementado con insulina es

continuo y la colección de fracciones es cada 1 minuto, por lo tanto, no hay

acumulación de moléculas secretadas por el tejido ovárico en el medio de incubación.

La liberación inducida del neurotransmisor en estas condiciones experimentales no

mostró diferencias cuando el ovario estuvo o no incubado en presencia de insulina en

ambos grupos experimentales, control (fig. 10 A-B) y estrés (fig. 10 C-D). Los valores

presentados bajo cada gráfico corresponden a la cantidad total de NA liberada bajo

estimulación (señalada por el área blanca o achurada según corresponda, A1-2). Cada

ovario se estimuló dos veces de forma consecutiva y la razón de las áreas obtenidas

en cada experimento se presenta en la figura 11, la cual confirma que no hubo

diferencias significativas cuando se agregó insulina al medio de superfusión.

41

Figura 10: Efecto de la insulina sobre la liberación, inducida con estímulo depolarizante eléctrico, de [3H]NA ovárica en ratas control (panel A y B) y ratas sometidas a estrés por frío (panel C y D). Los ovarios fueron preincubados con [3H]NA y luego sometidos a 2 estímulos (600 pulsos a 80 V, 2 mseg de longitud y 10 Hz por 1 min). La insulina fue agregada al medio de perfusión 14 minutos antes del segundo estímulo. Los resultados corresponden al porcentaje de liberación fraccional y representan el promedio ± el error estándar de al menos 4 experimentos individuales.

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

- -+Ins +Ins

Control Estrés

A 2/A

1

Figura 11: Efecto de la insulina sobre la liberación de NA ovárica inducida con estímulo depolarizante eléctrico. El gráfico muestra las razones entre el estímulo 2 (A2) y el estímulo 1 (A1) realizados para cada ovario. Las barras blancas corresponden a dos estimulaciones consecutivas en presencia de solución krebs, mientras que para las barras grises el primer estímulo fue con krebs y el segundo con krebs + insulina. Cada valor representa el promedio ± el error estándar de al menos 4 experimentos individuales.

42

2.2) Efecto de la insulina sobre la liberación de NA ovárica inducida con estímulo depolarizante con K+ 80 mM En este caso la incubación de los ovarios se hizo en estanco, es decir, la

solución Krebs o Krebs suplementada con insulina, se mantuvo en los pocillos con los

ovarios sumergidos. De tal forma que, cualquier molécula secretada al medio de

incubación podría acumularse durante el tiempo en que se mantenga el ovario en este

medio (2 minutos en cada pocillo). Sin embargo, la insulina en estas condiciones

tampoco fue capaz de modificar la liberación de NA basal ni inducida con el estímulo

despolarizante en los animales control (fig. 12 A-B) y estresados (fig. 12 C-D). Al igual

que en el caso anterior, los valores presentados sobre cada gráfico corresponden a la

cantidad total de NA liberada bajo estimulación (señalada por el área blanca o

achurada según corresponda, A1-2). Cada ovario se estimuló dos veces de forma

consecutiva y la razón de las áreas obtenidas en cada experimento se presenta en la

figura 13, la cual confirma que no hubo diferencias significativas cuando se agregó

insulina al pocillo de incubación.

43

Figura 12: Efecto de la insulina sobre la liberación, inducida con estímulo depolarizante de alta concentración de potasio, de [3H]NA ovárica en ratas control (panel A y B) y ratas sometidas a estrés por frío (panel C y D). Los ovarios fueron preincubados con [3H]NA y luego sometidos a 2 estímulos con K+ 80 mM. La insulina fue agregada al medio de incubación 30 minutos antes del segundo estímulo. Los resultados corresponden al porcentaje de liberación fraccional y representan el promedio ± el error estándar de al menos 4 experimentos individuales.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

- -+ Ins + Ins

Control Estrés

A2/

A1

Figura 13: Efecto de la insulina sobre la liberación de NA ovárica inducida con estímulo depolarizante K+ 80 mM. El gráfico muestra las razones entre el estímulo 2 (A2) y el estímulo 1 (A1) realizados para cada ovario. Las barras blancas corresponden a dos estimulaciones consecutivas en presencia de solución krebs, mientras que para las barras grises el primer estímulo fue con krebs y el segundo con krebs + insulina. Cada valor representa el promedio ± el error estándar de al menos 4 experimentos individuales.

44

2.3) Efecto de la insulina sobre la liberación basal de NA ovárica En la literatura Chi y cols. habían descrito que la insulina aumentaba la

liberación basal de NA en tejido aórtico, cuando este era incubado por 30 minutos (40).

Al realizar ese procedimiento experimental con los ovarios, observamos un aumento en

la liberación de NA inducido por la insulina en los ovarios de ratas control, sin embargo,

no fue capaz de inducir el mismo efecto sobre los ovarios de ratas estresadas (fig. 14).

Este resultado sugirió que los animales sometidos a estrés crónico tenían un grado de

resistencia a la insulina, que probablemente estaba dado por cambios en la expresión

de moléculas de la transducción de señal de la insulina

- + Ins - + Ins0

1

2

3

4

5

6

7Control Estrés

*

Libe

raci

ón d

e NA

(%)

Figura 14: Efecto de la insulina sobre la liberación basal de NA ovárica. Las barras blancas corresponden a la liberación basal de NA en ausencia de insulina y las barras grises en presencia de insulina. Los resultados corresponden al porcentaje de liberación y representan el promedio ± el error estándar de al menos 4 experimentos individuales. *p‹0.05 vs. control -

45

2.4) Efecto de la insulina sobre la secreción de esteroides ováricos La misma dosis de insulina (10 UI/l) usadas en el experimento de liberación de

NA, fue utilizada para determinar si la insulina modifica la secreción de esteroides

ováricos. En el experimento se incluyó la gonadotropina coriónica humana (hCG) como

control positivo de estimulación de esteroides ováricos y se probó también el efecto de

la insulina en presencia de hCG, ya que en la literatura se ha descrito un efecto

sinérgico entre la insulina y las gonadotropinas sobre la liberación de hormonas

esteroidales (48). La insulina no modificó la secreción de progesterona (fig. 15 A),

androstenediona (fig. 15 B) ni estradiol (fig. 15 C) en ninguno de los grupos

experimentales. La hCG tendió a aumentar la secreción de progesterona y

androstenediona, sin modificar la secreción de estradiol. El efecto sinérgico de la

insulina junto con hCG sólo pudo observarse en la secreción de progesterona.

46

Krebs hCG Ins hCG + Ins0

1

2

3ControlEstrés

*

**

APr

oges

tero

na (n

g/m

l/mg

ovar

io)


10

20

30ControlEstrés

B

And

rost

ened

iona

(pg/

ml/

mg

ovar

io)


10

20

30ControlEstrés

C

Estr

adio

l (pg

/ml/m

g ov

ario

)

Figura 15: Efecto de la insulina sobre la secreción de hormonas esteroidales ováricas. A: secreción de P; B: secreción de ∆4; C: secreción de E2. Las barras blancas corresponden a la secreción ovárica de animales control y las barras grises de animales sometidos a estrés crónico. Los valores están expresados como el promedio ± el error estándar de 5 experimentos individuales. *p‹0.05 y **p‹0.01 vs. secreción basal (Krebs).

47

3) Determinación de la expresión de IRS-1, IRS-2, GLUT-1 y GLUT-4 3.1) Nivel de mRNA para Irs-1, Irs-2, Glut-1 y Glut-4 en ovario y músculo tibialis Con el fin de corroborar si los cambios en la sensibilidad a la insulina,

encontrada en la periferia y en el ovario de las ratas sometidas a estrés crónico fueron

tejido específicos, se midió la expresión de mRNA para Irs-1, Irs-2, Glut-1 y Glut-4 en

músculo y ovario. La expresión de Irs-1 y Glut-4 en los ovarios de ratas expuestas al

frío, fue significativamente menor que en los animales control (fig. 16 A-B), mientras

que en el músculo no se encontró cambios en la expresión de Irs-1 ni Glut-4 (fig. 16 C-

D). La expresión de Irs-2 y Glut-1 no mostró cambios en ovario ni músculo (fig. 17 A-

D).

Control Estrés0.00

0.04

0.08

0.12

*

B

Raz

ónG

lut-4

/18s

0

6

12

18

*

AOvario

Raz

ónIrs

-1/1

8s

0

10

20

30

40

50

60C

Músculo

Raz

ónIrs

-1/1

8s

Control Estrés0

2

4

6

8

D

Raz

ónG

lut-4

/18s

Figura 16: Cambios en el mRNA para Irs-1 y Glut-4 en ovario (A-B) y músculo tibialis (C-D) de ratas control y estresadas. Para normalizar la medición del mRNA por medio del PCR en tiempo real, en cada protocolo se midió el mRNA ribosomal 18s. Los valores representan el promedio ± el error estándar de 5 ovarios y músculos individuales para cada condición experimental. *p‹0.05 vs. control.

48

0

3

6

9

12

15Ovario

A

Raz

ónIrs

-2/1

8s

0

10

20

30

40

50

60Músculo

C

Raz

ónIrs

-2/1

8s

Control Estrés0.0

2.5

5.0

7.5

10.0B

Raz

ón G

lut-1

/18s

Control Estrés0.0

0.1

0.2

0.3

0.4D

Raz

ón G

lut-1

/18s

Figura 17: Cambios en el mRNA para Irs-2 y Glut-1 en ovario (A-B) y músculo tibialis (C-D) de ratas control y estresadas. Para normalizar la medición del mRNA por medio del PCR en tiempo real, en cada protocolo se midió el mRNA ribosomal 18s. Los valores representan el promedio ± el error estándar de 5 ovarios y músculos individuales para cada condición experimental.

49

3.2) Nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 en ovario y músculo tibialis Los cambios en el nivel de mRNA se complementaron con la determinación del

nivel de proteína de IRS-1 y GLUT-4, mediante western blot. La determinación

demostró un patrón similar al observado al medir el mRNA. En los gráficos B y C de la

figura 18 está cuantificada la intensidad de los pixeles de las bandas obtenidas en el

wester blot (panel A) para las muestras de ovario. El resultado muestra una

disminución significativa del nivel de IRS-1 y GLUT-4 en los ovarios de los animales

estresados. En el tejido muscular tibialis no se observó cambios en el nivel de proteína

IRS-1 ni GLUT-4 (figura 18 E-F). Estos resultados confirman la disminución de la

expresión de IRS-1 y GLUT-4 en los ovarios de los animales estresados y apoyan la

resistencia a la insulina encontrada en cuanto a la actividad nerviosa simpática ovárica.

50

A Ovario Estrés Control IRS-1 GLUT-4 β-TUB

Control Estrés0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

*

IRS-

1 (U

nida

des a

rbitr

aria

s)

Control Estrés0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

*

GL

UT

-4 (U

nida

des a

rbitr

aria

s)

C B

D Músculo Estrés Control

IRS-1 GLUT-4

β-TUB

Control Estrés0.00

0.05

0.10

0.15

IRS-

1 (U

nida

des a

rbitr

aria

s)

E F

Control Estrés0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

GL

UT

-4 (U

nida

des a

rbitr

aria

s)

Figura 18: Efecto del estrés frío sobre el nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 en ovario (A, B, C) y músculo (D, E, F). En A se muestra el western blot para IRS-1, GLUT-4 y ß-TUBULINA en el ovario. B y C representan la cuantificación de las respectivas bandas. En D se muestra el the western blot para IRS-1, GLUT-4 y ß-TUBULINA en músculo. E y F representan la cuantificación de las respectivas bandas. La intensidad de las bandas fue medida con el programa UN-SCAN-IT y los resultados fueron normalizados con su correspondiente banda de ß-TUBULINA. Los valores representan el promedio ± el error estándar de 5 ovarios y músculos individuales para cada condición experimental. *p‹0.05 vs. control.

51

3.3) Nivel de mRNA para Irs-1 y Glut-4 en células de granulosa y teca-intersticial La disminución de la expresión de IRS-1 y GLUT-4 en los ovarios, aumenta la

posibilidad de que diferentes tipos celulares estén involucrados en la resistencia a la

insulina ovárica. Para elucidar esta incógnita, estudiamos la expresión de IRS-1 y

GLUT-4 en una fracción enriquecida de células de granulosa y en otra de células

tecales e intersticiales. Para comprobar la pureza de la preparación, se midió el nivel

de mRNA para el receptor de FSH en ambas fracciones, ya que este sólo se expresa

en células de la granulosa (52). Más del 99 % del mRNA para Fshr se encontró

presente en la fracción de células de granulosa (fig. 19)

Las células de la teca-intersticial mostraron la misma magnitud de disminución

del mRNA de Irs-1 y Glut-4 que en el ovario completo (fig. 20 A-B), mientras que en la

fracción de granulosas no hubo cambios en el nivel de estos mRNAs (fig. 20 C-D).

0.00

0.02

0.04

0.063

4

5

6 GranulosaTeca-intersticial

Raz

ónFs

hr/1

8s

Figura 19: Concentración relativa del mRNA de Fshr en células de granulosa y teca-intersticial. La diferencia alcanza los dos órdenes de magnitud entre una fracción y la otra. Cada barra representa el promedio ± el error estándar de 5 ovarios individuales.

52

0

5

10

15

20

25C

Granulosa

Raz

ónIrs

-1/1

8s

Control Stress0

4

8

12D

Raz

ónG

lut-4

/18s

Control Estrés0.0

0.5

1.0

1.5

*

B

Raz

ónG

lut-4

/18s

0.0

0.5

1.0

1.5

*

Teca-IntersticialA

Raz

ónIrs

-1/1

8s

Figura 20: Cambios en el mRNA para Irs-1 y Glut-4 en fracción de células de granulosa (A-B) y teca-intersticial (C-D) de ratas control y estresadas. Para normalizar la medición del mRNA por medio del PCR en tiempo real, en cada protocolo se midió el mRNA ribosomal 18s. Los valores representan el promedio ± el error estándar de 5 ovarios y músculos individuales para cada condición experimental. *p‹0.05 vs. control.

53

3.4) Nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 en células de granulosa y teca-intersticial La determinación del nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 en las fracciones

celulares de granulosa y teca-intersticial se realizó mediante ensayo de western blot.

En la fracción de células de granulosa disminuyó sólo el nivel de IRS-1 en los animales

estresados, manteniéndose sin cambios el nivel de GLUT-4 (figura 21 B-C). En la

fracción de células teca-intersticial la disminución fue tanto en el nivel de IRS-1 como

de GLUT-4 en los animales sometidos a estrés (figura 21 E-F). Estos resultados

sugieren que las células de la teca-intersticial son las preferentemente involucradas en

la carencia de respuesta de liberación de NA desde el ovario después de la

estimulación con insulina.

54

A Granulosa

Estrés Control Figura 21: Efecto del estrés por frío sobre el nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 en células de granulosa (A, B, C) y teca-intersticial (D, E, F). En A se muestra el western blot para IRS-1, GLUT-4 y ß-TUBULINA en la fracción de células de la granulosa. B y C representan la cuantificación de las respectivas bandas. En D se muestra el western blot para IRS-1, GLUT-4 y ß-TUBULINA en la fracción de células teca-intersticial. E y F representan la cuantificación de las respectivas bandas. La intensidad de las bandas fue medida con el programa UN-SCAN-IT y los resultados fueron normalizados con su correspondiente banda de ß-TUBULINA. Los valores representan el promedio ± el error estándar de 4 ovarios de ratas control y 5 ovarios de ratas estresadas. *p‹0.05 vs. control.

IRS-1

GLUT-4

β-TUB

Teca-intersticial

IRS-1

GLUT-4

Control Estrés

D

β-TUB

Control Stress0.00

0.05

0.10

0.15

*

IRS-

1 (U

nida

des a

rbitr

aria

s)B

Control Stress0.0

0.1

0.2

0.3

GL

UT

-4 (U

nida

des a

rbitr

aria

s)

C

Control Stress0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

*

IRS-

1 (U

nida

des a

rbitr

aria

s)

E F

Control Stress0.0

0.1

0.2

0.3

*

GL

UT

-4 (U

nida

des a

rbitr

aria

s)

55

4) Administración de insulina intracerebroventricular 4.1) Control del implante de la cánula Para verificar la ubicación de la cánula implantada en los animales, los cerebros

fueron cortados y fotografiados bajo microscopía de luz. La foto, representativa de 18

cerebros canulados, muestra la ubicación de la cánula en el tercer ventrículo (figura

22).

HipocampoHipocampo

Ventrículolateral

Ventrículolateral 3er Ventrículo3er Ventrículo

Cánula

HipocampoHipocampo

Ventrículolateral

Ventrículolateral 3er Ventrículo3er Ventrículo

Cánula

Figura 22: Control del implante de la cánula colocada en el tercer ventrículo. En el panel de la izquierda se muestra un esquema de un corte coronal en -2.80 mm según Bregma, en el que se indica el hipocampo, los ventrículos laterales y el tercer ventrículo. Las mismas estructuras se indican en el panel de la derecha, que corresponde a un corte coronal de un cerebro de rata, canulado según las coordenadas del Atlas Paxinos en el tercer ventrículo (-2.80 mm antero-posterior, 0,00 mm medio-lateral y -8.1 mm dorso-ventral).

56

4.2) Efecto de la insulina administrada ICV sobre aspectos metabólicos La administración ICV de insulina (1U/kg/día) durante 7 días (última semana de

tratamiento de estrés) provocó una disminución significativa (p<0.001) de la ganancia

de peso en los animales controles comparado con aquellos que sólo recibieron una

infusión de suero fisiológico (vehículo), figura 23 A. Los animales estresados

disminuyeron la ganancia de peso corporal independiente del tratamiento ICV que

recibieron (vehículo o insulina), cuando se compararon con el grupo control vehículo.

Sin embargo, la disminución del peso corporal de los animales infundidos con insulina

ICV comparados con sus respectivos controles (control vehículo o estrés vehículo)

mostró que el efecto de la insulina en los animales estresados fue mucho menor, lo

cual sugiere una posible resistencia al efecto de insulina en el sistema nervioso central

en los animales sometidos a estrés crónico. El consumo de alimento fue

significativamente menor en los animales sometidos a estrés crónico independiente del

tratamiento ICV que recibieron (vehículo o insulina), cuando estos se compararon con

los animales control vehículo (fig. 23 B). El papel anorexígeno que juega la insulina a

nivel del sistema nervioso central (28), fue confirmado sólo parcialmente en nuestros

resultados, ya que la administración de insulina ICV en los animales control sólo tendió

a disminuir la ingesta de alimento.

La insulina administrada en el tercer ventrículo provoca una disminución de la

gluconeogénesis hepática y como consecuencia disminuye también el nivel basal de

insulina plasmática (60). Al igual que lo descrito en la literatura, la administración de

insulina ICV provocó una disminución significativa de la insulinemia y glicemia en

animales control, mientras que en los animales estresados, la insulina administrada

ICV no produjo cambios (figura 24 A-B). Estos resultados apoyan nuevamente un

estado de resistencia a la insulina a nivel de sistema nervioso central en los animales

sometidos a estrés crónico.

57

-10

-5

0

5

10

*********

A

#

- -+ +Control Estrés

Insulina

Gan

anci

a de

Pes

o (%

)

0

10

20

30

* *

B

Control Estrés- -+ +Insulina

Con

sum

o de

alim

ento

(g/d

ía)

Figura 23: Efecto de la insulina administrada ICV sobre la ganancia de peso (A) y consumo de alimento (B) en animales control y sometidos a estrés por frío. La ganancia de peso fue expresada como el porcentaje de peso ganado o perdido después de terminado el protocolo de infusión ICV, tomando como 100 % el valor de peso corporal que tenían los animales antes de comenzar el tratamiento de infusión. Los valores representan el promedio ± el error estándar de al menos 4 animales para cada condición experimental. *p‹0.05 vs. Control -; ***p‹0.001 vs. Control -; #p<0.05 vs. diferencia entre Control + y Control -.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

*

Insulina - -+ +Control Estrés

A

Insu

lina

plas

mát

ica

(µg/

l)

0

2

4

6

8

Control EstrésInsulina - -+ +

*

B

Glu

cosa

pla

mát

ica

(mm

ol/L

)

Figura 24: Efecto de la insulina administrada ICV sobre la insulina (A) y glucosa (B) plasmática en animales control y sometidos a estrés por frío. Los valores representan el promedio ± el error estándar de al menos 4 animales para cada condición experimental. *p‹0.05 vs. Control -

58

4.2) Efecto de la insulina administrada ICV sobre la concentración plasmática de P, ∆4 y E2

La relación descrita entre la señalización de insulina a nivel de sistema nervioso

central y la función reproductiva ha sido centrada en el efecto de insulina sobre el eje

neuroendocrino, hipotálamo-hipófisis-ovario (47, 48). Los receptores de insulina

expresados en neuronas GnRH o en algunos centros superiores pueden mediar la

síntesis o secreción de GnRH (43). En nuestro interés de determinar si la insulina, en

nuestro modelo experimental, altera el eje endocrino, determinamos la concentración

de hormonas ováricas en los distintos grupos experimentales. Como se muestra en la

tabla 2, no hubo cambios en la concentración plasmática de progesterona,

androstenediona y estradiol. Esto sugiere que el efecto de insulina administrado ICV in

vivo durante 7 días no altera la secreción de hormonas esteroidales ováricas ni altera

la ciclicidad de los animales (datos no mostrados).

Tabla 2: Efecto de la insulina ICV sobre la concentración plasmática de progesterona (P), androstenediona (∆4) y estradiol (E2)

Control Estrés Vehículo Insulina Vehículo Insulina

P (ng/ml) 6.51±1.70 5.00±1.08 4.68±1.43 3.83±2.21 ∆4 (ng/ml) 0.24±0.06 0.18±0.03 0.18±0.03 0.16±0.02

E2 (pg/ml) BLD 2.75±0.88 1.93±0.65 BLD

BLD: Bajo límite de detección

59

4.3) Efecto de la insulina administrada ICV sobre la actividad nerviosa simpática ovárica 4.3.1) Contenido de noradrenalina en el ganglio celíaco: El ganglio celíaco es el último relevo sináptico de las proyecciones nerviosas,

que se originan en el hipotálamo e inervan al ovario. La figura 25 muestra que la

administración de insulina ICV no modifica el contenido de NA en el ganglio celíaco en

los animales control ni estresados. Lo que sugiere que la vía nerviosa que controla la

función ovárica no parece alterarse por la acción de la insulina ICV.

0

20

40

60

80

100

Nor

adre

nalin

a (n

g/ga

nglio

)


Figura 25: Efecto de la insulina administrada ICV sobre el contenido de NA en el ganglio celíaco de ratas control y sometidos a estrés por frío. Vehic: vehículo; Ins: insulina. Los valores representan el promedio ± el error estándar de al menos 4 animales para cada condición experimental.

60

4.3.2) Contenido de noradrenalina en el ovario: Al igual que lo ocurrido en el ganglio celíaco el contenido de NA en el ovario no

se modificó con la administración de insulina ICV en ambos grupos experimentales (fig.

26). Lo que apoya la ausencia de efecto de la insulina ICV sobre la actividad nerviosa

simpática del ovario. Los animales estresados mostraron una clara tendencia al

aumento del contenido de NA al compararlos con sus respectivos controles (p=0.053),

independiente del efecto de la insulina administrada ICV, lo cual concuerda con lo

observado anteriormente en que los animales sometidos a este protocolo de estrés

aumentan la actividad nerviosa simpática del ovario (16).

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Nor

adre

nalin

a (n

g/m

g O

vario

)


Figura 26: Efecto de la insulina administrada ICV sobre el contenido de NA en el ovario de ratas control y sometidos a estrés por frío. Los valores representan el promedio ± el error estándar de al menos 4 animales para cada condición experimental.

61

4.4) Efecto de la insulina administrada ICV sobre la morfología ovárica La insulina aplicada ICV no parece ejercer efecto alguno en la morfología

ovárica. El número de folículos saludables y atrésicos por mm2 no se ven modificados

por efecto de la insulina administrada durante 7 días en el tercer ventrículo en los

animales control y estresados. Sin embargo, el estrés por frío, independiente del efecto

de insulina ICV, disminuye el número total de folículos por mm2 (2.61 ± 0.34 control

vehículo vs. 0.43 ± 0.08 estrés vehículo, p<0.05). Al investigar qué tipo de folículos son

los que dan cuenta de una disminución en el número total de folículos, encontramos

que los folículos preantrales y antrales normales disminuyeron significativamente en los

ovarios de los animales expuestos al estrés por frío (fig. 27 A), de forma similar a lo

descrito anteriormente por nuestro grupo de trabajo (16). El número de cuerpos lúteos

por mm2 se redujo alrededor de un 50 % en los animales estresados (fig. 27 B). Los

folículos anómalos, entre los cuales se encuentran los folículos con hipertrofia tecal,

tipo III, prequistes y quistes, tendieron a incrementarse en los ovarios de animales

estresados (fig. 27 C), apoyando los resultados publicados anteriormente en este

modelo animal (16).

62

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0Control Vehíc Control Ins Estrés Vehíc Estrés Ins

Normal Atrésico Normal Atrésico

Preantral Antral

**

*** **

***

Den

sida

d de

Fol

ícul

os (n

º/mm

2 )

A

0

1

2

3

4Control VehícControl InsEstrés VehícEstrés Ins

**

Cue

rpos

Lút

eos/

mm

2

B

0

1

2

3

4Control VehícControl InsEstrés VehícEstrés Ins

Núm

ero

de fó

licul

os a

nóm

alos

/co

rte

cent

ralC

Figura 27: Efecto de la insulina administrada ICV sobre la morfometría ovárica de ratas control y estresadas infundidas con insulina ICV. En A se observa la densidad de folículos preantrales normales, preantrales atrésicos, antrales normales y antrales atrésicos. El el gráfico B se muestra la densidad de cuerpos lúteos y en C se contabilizaron los folículos anómalos (hipertecosis, tipo III, prequistes y quistes) en cada uno de los grupos experimentales. Los valores representan el promedio ± el error estándar de al menos 4 animales para cada condición experimental. *p‹0.05, **p‹0.01, ***p‹0.001

63

A Control

CL

CL

CL CL

FAN

CL

CL

CL

FAA

FTIII

CL

CL

EstrésD

CL

FTIII

C

CL PQ

CL

CL

CL Estrés

CL

Control B

Figura 28: Efecto de la insulina administrada ICV sobre la morfología ovárica de ratas control y estresadas infundidas con insulina ICV. Las fotos corresponden al corte central de un ovario de rata control infundida con vehículo (A), rata control infundida con insulina (B), rata estresada infundida con vehículo (C) y rata estresada infundida con insulina (D). Las fotos son representativas de cada grupo experimental. CL: cuerpo lúteo; FAN: folículo antral normal; FAA: folículo antral atrésico; FTIII: folículo tipo III; PQ: prequiste.

64

DISCUSIÓN

En esta tesis se estudió el efecto de la insulina sobre la actividad nerviosa

simpática ovárica y cómo el estrés crónico intermitente por frío es capaz de modificar la

respuesta de esta hormona. Los resultados obtenidos sugieren fuertemente que el

estrés crónico por frío desarrolla una resistencia a la insulina, ovario e hipotálamo

específica. Estos resultados abren la posibilidad de que alteraciones en la cascada de

transducción de señal de la insulina en el ovario, inducida por estrés crónico, pueda ser

un evento inicial responsable de provocar cambios en la fisiología ovárica.

Previamente, se ha descrito en la literatura que este modelo animal de estrés crónico

por frío provoca cambios en el desarrollo folicular ovárico, entre los que destacan la

hipertrofia de las células de la teca y una luteinización prematura de la teca. Además,

estos cambios fueron asociados con la activación de la inervación simpática del ovario

(16). Algunas de las características encontradas en este modelo animal han sido

observadas en el SOP humano (29). Una característica común asociada con la

patología poliquística es la resistencia a la insulina y la hiperinsulinemia compensatoria.

Un gran número de evidencias relacionan al SOP con la hiperinsulinemia, mediante un

efecto de la insulina sobre el eje de regulación endocrina del ovario. Específicamente,

la insulina aumenta la esteroidogénesis ovárica al actuar directamente sobre

receptores ubicados en las células de la teca y de la granulosa (61, 62). Además, la

insulina es capaz de modificar la secreción de gonadotropinas hipofisiarias, cambiando

la relación entre LH y FSH, lo cual ocurre en algunas pacientes con SOP. Si bien estos

cambios hormonales provocados por la insulina parecen ser importantes en el

desarrollo o mantención del SOP, hasta ahora no existían evidencias sobre el rol que

podría jugar la insulina sobre el eje de regulación nerviosa que, en forma

complementaria a la endocrina, participa en el control de la fisiología ovárica.

1) Cambios metabólicos en el modelo de estrés crónico por frío Ante cualquier tipo de agente estresor, los organismos sufren adaptaciones

fisiológicas con el fin de mantener la homeostasis corporal. La exposición de ratas al

65

estrés por frío crónico no provocó cambios en la secreción de insulina por parte del

páncreas cuando fue estimulado con un secretagogo como la glucosa (prueba de

tolerancia a la glucosa). Sin embargo, la acción de la insulina sufrió modificaciones, ya

que al analizar la sensibilidad de la insulina, mediante el clamp hiperinsulinémico

euglicémico, se observó un aumento de ésta, sugiriendo una mayor eficiencia en la

incorporación de glucosa por parte de los tejidos blanco de esta hormona,

principalmente la musculatura esquelética y el tejido adiposo. La exposición de

animales homeotérmicos al frío produce como respuesta inicial, una disminución en la

pérdida y un aumento de la generación de calor. Para lograr esto último debe ocurrir un

aumento en la demanda energética, que se traduce en una pérdida de peso o aumento

en la ingesta de alimento. En resultados similares a los encontrados en esta tesis,

Gasparetti y cols., mostró que ratas expuestas durante 8 días continuos a estrés por

frío sufrieron una caída temprana en el peso corporal, un aumento en la ingesta diaria

de alimento y una mayor captación de glucosa (44). El procedimiento de estrés

utilizado en nuestro trabajo, si bien no afectó el peso corporal, provocó un aumento

significativo en la ingesta de alimento durante la última semana de estrés. El aumento

en la ingesta de alimento, sin un aumento concomitante en la curva de crecimiento ni

ganancia neta de peso, sugiere que los animales mantuvieron el balance ente el

consumo de alimento y el gasto energético. La termogénesis, que involucra

inicialmente lipólisis, inducida mediante un aumento en la activación del sistema

nervioso simpático (63), puede ser uno de los mecanismos utilizados para mantener la

homeostasis del animal. En la literatura se ha descrito que la activación nerviosa

simpática producida mediante un agente estresor produce a nivel pancreático una

disminución en la secreción de insulina, esto mediado principalmente por el efecto de

la NA sobre los receptores α2-adrenérgicos postsinápticos ubicados en las células β-

pancreáticas (64). Sin embargo, en el modelo de estrés por frío crónico intermitente, la

insulina basal de los animales fue igual a la de sus respectivos controles, indicando

probablemente que hubo mecanismos de adaptación a nivel pancreático, quizás

atribuibles a un “down-regulation” de los receptores α2-adrenérgicos. Por otra parte, la

administración de insulina en el tercer ventrículo mostró una respuesta disminuida a

esta hormona en cuanto a cambios periféricos se refiere, comparada con los animales

control (revisar más adelante en la discusión). Al ser la insulina una señal de saciedad

66

alimenticia en el hipotálamo, podemos sugerir que en este modelo de estrés la insulina

pierde su capacidad de generar saciedad a nivel central, pudiendo también participar

como agente causal de la mayor ingesta de alimento.

2) Efectos de la insulina aplicada localmente sobre la actividad nerviosa ovárica en el modelo de estrés por frío Existen diversos efectos atribuidos a la insulina, distintos a su acción clásica de

regulación de la glicemia, entre los cuales se encuentra la modulación de la actividad

nerviosa autonómica (39, 40). A nivel ovárico a la insulina se le ha atribuido la función

de potenciar el efecto esteroidogénico de las gonadotropinas (48, 62), sin embargo,

hasta ahora se desconocía el efecto de esta hormona sobre la actividad nerviosa

simpática del ovario.

El aumento en la sensibilidad a la insulina encontrada en los animales

estresados, abrió la posibilidad de que los ovarios de estos animales respondieran más

que sus respectivos controles al ser incubados en presencia de insulina. La insulina no

modificó la liberación de NA inducida por estímulo despolarizante eléctrico o con alta

concentración de K+, apuntando a que esta hormona no participa en los mecanismos

que involucran la liberación de NA producidos en el terminal nervioso después de

generado un potencial de acción. La liberación basal de NA de 1 minuto en el protocolo

de estimulación eléctrica y de 2 minutos en el protocolo de estimulación con alta

concentración de K+, no fue afectada por la presencia de insulina en ninguno de los

grupos experimentales. La actividad nerviosa simpática de los ovarios de animales

control fue modificada por la insulina de forma similar a la demostrada anteriormente

en tejido aórtico (40). Es decir, aumentando la liberación basal de NA luego de 30

minutos de incubación. Sin embargo, la insulina fue incapaz de modificar la actividad

nerviosa simpática en los ovarios de los animales estresados. Este resultado sugirió

que como consecuencia del estrés crónico, el ovario experimentó cambios que llevaron

a la resistencia a la insulina en los nervios simpáticos ováricos o, posiblemente, en otro

tipo de células ováricas, si suponemos que el efecto de la insulina sobre la liberación

de NA desde los terminales nervioso que llegan al ovario fue indirecto. El hecho que la

liberación haya sido aumentada sólo después de 30 minutos en el protocolo de

incubación en estanco, sugiere que los cambios inducidos por la insulina sobre los

67

terminales nerviosos son indirectos. Es decir, probablemente esta hormona actúa

sobre células ováricas, las cuales en respuesta a esta estimulación secretan al medio

de cultivo algún factor estimulador de la liberación basal de NA.

En este trabajo se ha descrito por primera vez un efecto estimulador de la

insulina sobre la actividad nerviosa simpática ovárica. Esto podría tener una gran

relevancia en la patología del SOP, si suponemos que las pacientes con SOP

hiperinsulinémicas (más del 50 % de las pacientes con SOP), podrían tener

alteraciones en la regulación nerviosa de la gónada, la cual se sabe que participa en la

génesis y mantención del SOP (12-14).

La concentración de insulina que provocó el aumento en la liberación de NA, no

afectó la secreción de hormonas esteroidales ováricas, progesterona, androstenediona

y estradiol, indicando quizás una selectividad en el efecto de esta hormona. Estudios

previos en los que se utilizaron células de la granulosa provenientes de pacientes

PCOS con resistencia a la insulina mostraron que la insulina mantiene su efecto

estimulatorio sobre la esteroidogénesis ovárica, contrastado con su daño en la acción

metabólica (65). En nuestro modelo, utilizando cultivos con ovario completo, no

encontramos cambios de la esteroidogénesis al incubarlos sólo en presencia de

insulina. La posible explicación es que el tiempo de incubación (3 horas) no fue

suficiente para producir el efecto sobre la esteroidogénesis o que es necesaria la co-

incubación con una gonadotropina para potenciar el efecto esteroidogénico, tal como

ha sido descrito anteriormente (62). Cuando incubamos los ovarios en presencia de

hCG, estos respondieron a la secreción de progesterona y en menor grado a la de

androstenediona, cuando se comparó con su secreción basal, lo cual está de acuerdo

con el efecto esperado para esta hormona. Cuando co-incubamos los ovarios con

insulina y hCG, sólo observamos en la secreción de progesterona un aumento al

comparar con la secreción obtenida con hCG solamente. No hubo diferencias entre la

secreción de esteroides en ovarios de ratas control y estresadas, por lo que el efecto

de resistencia a la insulina parece ser función específica, tal como se ha demostrado

en células de granulosa de pacientes SOP insulina resistentes (45).

El aumento en la sensibilidad a la insulina en el animal completo encontrada en

este modelo de estrés y la presencia de resistencia a esta hormona en la función

nerviosa ovárica, supone cambios en la señalización de la insulina que serían tejido

68

específico. Para corroborar esto último, determinamos la expresión de moléculas

involucradas en la transducción de señal de la insulina, tanto en tejido muscular como

ovárico. Los resultados apoyaron la hipótesis de una regulación en la señalización de

insulina tejido específico, ya que en los animales estresados hubo una disminución de

IRS-1 y GLUT-4, tanto en lo que respecta al mRNA como a la proteína, mientras que

en el músculo tibialis no hubo cambios significativos de estas moléculas. Los cambios

encontrados en el mRNA apoyan lo sugerido anteriormente sobre que el efecto de la

insulina sobre la liberación de NA sería indirecto, ya que el mRNA no se encuentra en

los terminales nerviosos, sino que estaría en el cuerpo neuronal, parte ausente en los

ovarios disecados. Por lo tanto, las células ováricas en donde se han descrito

receptores para insulina (granulosa y teca) serían los responsables de la resistencia a

la insulina y por ende de la incapacidad de la insulina de activar la inervación simpática

en los animales estresados.

Para comprobar el tipo de célula ovárica involucrada, separamos las células de

la granulosa de la fracción teca-intersticial y determinamos la expresión de IRS-1 y

GLUT-4. Tanto el mRNA como la proteína IRS-1 y GLUT-4 disminuyó

significativamente en la fracción de células teca-intersticial y no en las células de la

granulosa en los animales sometidos a estrés por frío. Sólo la proteína IRS-1

disminuyó en las células de la granulosa después de las 4 semanas de estrés.

Estudios realizados en células de granulosa humanan de pacientes PCOS con

resistencia a la insulina, han demostrado que existe resistencia a la insulina en estas

células en cuanto a su capacidad de incorporar glucosa y almacenar glicógeno (45),

manteniendo intacto el efecto esteroidogénico descrito para la insulina (65). En nuestro

modelo animal, los principales cambios aparecen en las células de la teca-intersticial,

precisamente las únicas células intraováricas directamente inervadas por los

terminales nerviosos simpáticos. Jones y cols. encontraron que la infusión de

adrenalina a animales previamente adrenalectomizados, disminuyó la transcripción de

GLUT-4, sugiriendo que las catecolaminas disminuyen la expresión de este

transportador (66). Este antecedente apoya nuestra teoría de que la disminución de la

expresión de IRS-1 y GLUT-4 en las células teca-intersticial se debe al aumento en el

flujo de NA ovárico durante el tratamiento de estrés (descrito previamente por nuestro

grupo de trabajo en este modelo experimental (16)).

69

Nosotros proponemos que la insulina podría ser un modulador local de la

actividad nerviosa simpática ovárica. En los animales control la insulina aumenta el

tono nervioso simpático del ovario, probablemente mediante un mecanismo indirecto,

tal como se mencionó anteriormente. Cuando la actividad nerviosa ovárica aumenta,

como consecuencia del estrés crónico, la NA liberada induciría un mecanismo

compensatorio sobre las células de la teca-intersticial, las cuales disminuyen la

expresión de moléculas que participan en la señalización de la insulina, inhibiendo de

esta forma el efecto de la insulina sobre la liberación de la NA desde los terminales

nerviosos (figura 29).

Figura 29: Esquema del efecto propuesto para la insulina sobre la liberación de NA ovárica (1) y de la pérdida de sensibilidad a la insulina producto de la activación nerviosa simpática ovárica inducida por el estrés crónico (2).

La regulación del tono nervioso simpático ovárico, que realiza la insulina, podría

ser mediada por la secreción del factor de crecimiento nervioso (NGF) desde las

células de la teca. Esta neurotrofina es sintetizada en el ovario, preferentemente en las

células de la teca y cumple la función de crecimiento, diferenciación y sobrevida de las

Estrés

NA

Terminal nervioso simpático

Células de la teca

Células de la granulosa

GLUT-4

IRS-1

Noradrenalina

β2

IRI

?

I

? NA

β2-adrenérgico

I

GLUT-4 IRS-1

Insulina Receptor insulina

2

?

1

70

neuronas que inervan directamente a esta capa de células tecales (67). Además, el

NGF modula la transmisión sináptica entre neuronas y órganos blanco (68), por lo

tanto, pudiese ser un candidato a intermediario entre la insulina y la activación del tono

nervioso simpático ovárico. Otras moléculas que pudieran ser secretadas desde la teca

y estimular la liberación de NA, podrían ser las hormonas esteroidales secretadas por

la teca, androstenediona y progesterona. Estas hormonas son secretadas como

respuesta a la estimulación de insulina y tienen efectos rápidos sobre la

neurotransmisión, actuando sobre receptores de membrana (69).

La respuesta disminuida a la insulina de las células ováricas podría afectar

además otras funciones del ovario, como por ejemplo el desarrollo folicular. El receptor

de insulina tiene una expresión diferencial en diferentes etapas del desarrollo folicular

(70), por lo que la resistencia a la insulina ovárica podría ser partícipe de los daños en

el desarrollo folicular observados en ratas expuestas al estrés por frío (15, 16).

3) Efectos de la insulina aplicada ICV sobre la actividad nerviosa ovárica en el modelo de estrés por frío

En el sistema nervioso central los receptores de insulina están expresados en

diferentes zonas entre las cuales se encuentra el hipotálamo y la hipófisis (41, 71). La

función de la insulina a nivel central ha sido asociada a la regulación de la ingesta de

alimento, gasto energético y más recientemente al control de la función reproductiva

(43, 47, 60). Como se ha descrito en la introducción de esta tesis, el hipotálamo es la

región del cerebro desde donde se proyectan las neuronas, que hacen su último relevo

sináptico en el ganglio celíaco y finalmente inervan al ovario (5). Por lo que la insulina,

que atraviesa la barrera hematoencefálica, tal vez modula el control nervioso ovárico,

tal como se demostró localmente en el ovario.

Los cambios diferenciales en la sensibilidad a la insulina, encontrados a nivel

sistémico y en el ovario en el modelo de estrés crónico, abren la posibilidad que a nivel

del sistema nervioso central también existan cambios en la sensibilidad a la insulina,

que pudiera en parte ser responsable de los cambios reproductivos descritos para el

modelo de estrés crónico (16).

La administración de insulina en el tercer ventrículo a animales control redujo

fuertemente la ganancia de peso, sin reducir de forma significativa el consumo de

71

alimento. Por el contrario en los animales estresados la disminución de la ganancia de

peso fue significativamente menor y la ingesta de alimento no sufrió cambios cuando

comparamos la administración de vehículo vs. insulina. Estos resultados concuerdan

con lo descrito en la literatura en que la insulina a nivel hipotalámico disminuye

drásticamente la ganancia de peso (72), sin embargo, al mismo tiempo su principal

efecto es anorexígeno y por lo tanto el consumo de alimento también ha sido

observado disminuir en animales de experimentación (72). Lamentablemente no

tenemos los datos de cómo era el consumo de alimento de las ratas antes de iniciar la

infusión ICV y, por lo tanto, no pudimos comparar el cambio en la conducta alimenticia

entre antes y después de la infusión. Probablemente, hubiéramos encontrado cambios

a lo menos en los animales control, ya que la disminución en la ganancia de masa

corporal es mucho mayor en estos animales. Esto último sugiere que en el sistema

nervioso central la señalización celular de la insulina ha sufrido algún tipo de alteración

en los animales sometidos a estrés por frío, tal como lo observamos a nivel ovárico. Es

interesante destacar que los animales estresados y canulados, infundidos con

vehículo, sufrieron cambios en la ingesta de alimento y ganancia de peso, que no

fueron observadas en el animal control infundido con vehículo ni en los animales

estresados sin canulación. Esto supone que el estrés por frío adicionado al estrés

producido por la canulación y la infusión diaria, se potenciaron y causaron un efecto

que no es observado cuando se utiliza sólo uno de los agentes estresores. En la

literatura está descrito que la aplicación de un segundo estímulo estresor diferente, a

un animal previamente estresado, produce una alteración exagerada, comparada al

efecto producido en un animal que no se ha estresado previamente (28).

Obici y cols. ha mostrado que la administración central de insulina aumenta la

sensibilidad a la insulina en tejidos periféricos, disminuyendo la glicemia, debido

principalmente a un efecto inhibitorio de la gluconeogénesis hepática (60). En nuestro

trabajo confirmamos la disminución de la glicemia al administrar insulina ICV, sin

embargo, los animales sometidos a estrés crónico por frío volvieron a mostrar un grado

de resistencia a nivel central, ya que la glicemia no disminuyó en ellos. Un efecto

similar ocurrió con la insulina plasmática en los animales control y estresados después

de administrar insulina ICV. La insulinemia disminuyó significativamente en los

controles y no en los estresados, apoyando la resistencia central a la insulina. El efecto

72

sobre la disminución de la insulinemia puede explicarse como consecuencia del menor

nivel de glicemia o como un efecto estimulador de la insulina sobre la actividad

nerviosa simpática que se origina en el hipotálamo y llega al páncreas, la cual

finalmente a través de receptores postsinápticos α2-adrenérgicos inhibe la secreción

de insulina (73). Para corroborar la resistencia a la insulina hipotalámica en este

modelo de estrés, será necesario medir la expresión de moléculas de la transducción

de señal de la insulina en el hipotálamo, como por ejemplo PI3K. La inactivación

farmacológica de esta quinasa, revierte la reducción de la producción de glucosa

inducida por la insulina administrada ICV (60).

La actividad nerviosa simpática ovárica no fue alterada por la administración de

insulina ICV. El contenido de NA tanto en el ganglio celíaco, como en el ovario se

mantuvo sin cambios después de la administración de 7 dosis de insulina en el tercer

ventrículo. Es posible que la insulina, al igual como ocurrió cuando se incubó

directamente en el ovario, aumente el tono nervioso simpático, reflejándose a nivel

periférico en un leve aumento en el eflujo del neurotransmisor desde los terminales

nerviosos a su órgano blanco, sin alcanzar a producirse cambios en el contenido de NA

en los terminales nerviosos. El hecho que la administración de insulina ICV no

produjera cambios en la actividad nerviosa simpática ovárica puede explicar el por qué

no encontramos cambios en el desarrollo folicular en estos animales. El estrés por frío,

tal como habíamos demostrado anteriormente (16), disminuye la población total de

folículos e incrementa los folículos anómalos. La drástica disminución en la densidad

de cuerpos lúteos observada en los animales estresados no había sido percibida

anteriormente, debido a que habíamos contado las estructuras de todo el ovario y no

sólo del corte central, por lo que no había sido necesario normalizar por el área

analizada. En es trabajo observamos que si bien el número de cuerpos lúteos no es

significativamente menor en los animales estresados, al dividir el número de cuerpos

lúteos por el área analizada, el valor se reduce significativamente al compararlo con

sus respectivos controles. Probablemente, los cuerpos lúteos son de mayor tamaño, lo

cual hace que el mismo número de estos ocupe una mayor área. Cuando las ratas son

estresadas mediante este mismo protocolo, pero extendiendo de 4 a 8 semanas la

duración del estrés, las ratas desarrollan quistes en los ovarios (15), lo cual apoya

nuestra teoría de que a las 4 semanas de estrés crónico por frío nos encontramos en

73

una etapa previa de ovario poliquístico y los cambios en la actividad nerviosa y en la

sensibilidad a la insulina pueden ser en parte responsables de la aparición de

estructuras quísticas posteriormente.

En esta tesis nosotros proponemos que el estrés por frío crónico intermitente,

como forma de estrés físico, activa los terminales nerviosos noradrenérgicos ováricos,

conduciendo a cambios en la sensibilidad a la insulina en las células teca-intersticial, lo

cual provoca alteraciones en la función y morfología ovárica, que podrían en parte ser

responsables de la etiología del ovario poliquístico inducido por estrés. Estos datos

podrían adquirir relevancia, ya que recientemente se ha demostrado que el PCOS

humano está asociado con un aumento en el tono nervioso simpático (18),

independiente de los cambios metabólicos generales del organismo.

74

ESQUEMA FINAL

Figura 30: Esquema de los cambios producidos en el modelo de estrés por frío crónico intermitente y de los efectos provocados por la insulina aplicada localmente sobre el ovario y centralmente en el tercer ventrículo.

CONTROL ESTRÉS

NIVEL METABÓLICO Aumento de la sensibilidad a la insulina periférica. Aumento del consumo de alimento.

A

E2

∆4

Ovario

Insulina

GG.. CCeelliiaaccoo

SSOONN NNAA


A

E2

∆4

Ovario

GG.. CCeelliiaaccoo

SSOONN NNAA


Liberación basal de NA Progesterona +hCG

Liberación basal de NA Progesterona +hCG

Peso corporal

Glicemia

Insulinemia

Peso corporal

Glicemia

Insulinemia

NIVEL OVÁRICO Disminución mRNA y proteína IRS-1 y GLUT-4 en células tecales. Disminución de la densidad total de folículos y cuerpos lúteos.

Act. Nerviosa simpática ovárica

Act. Nerviosa simpática ovárica

ICV

Ovario

75

CONCLUSIONES En el modelo de estrés por frío en rata, en el cual se han identificado cambios

ováricos similares a los encontrados en las mujeres con SOP, existe una resistencia a

la insulina ovárica e hipotalámica tejido-específica.

A nivel ovárico la insulina, además de su acción sobre la esteroidogénesis, tiene

un efecto activador del sistema nervioso simpático.

La insulina aplicada intracerebroventricular no es capaz de modificar la

actividad nerviosa simpática ovárica. Sin embargo, induce cambios metabólicos

conocidos para esta hormona en los animales control y no en los animales sometidos a

estrés.

Por lo tanto, el estrés crónico, además de activar la vía nerviosa ovárica y

producir cambios en la morfología del ovario, similares a los encontrados en pacientes

con SOP, reduce la respuesta a la insulina en el ovario e hipotálamo, los cuales

podrían ser eventos tempranos que desencadenen en alteraciones endocrinas y/o

metabólicas como el SOP, obesidad o diabetes tipo 2.

76

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