Entendiendo un Western Blot (o al menos,intentndolo)Que es un Western Blot?Desarrollada en el laboratorio de George Stark, en Stanford, es una tcnica analtica que se usa para detectar y cuantificar protenas especificas en una muestra determinada, una muestra que por norma general tiene una gran cantidad de protenas, unas que nos interesarn, y otras que no. Bsicamente, lo que ms adelante profundizaremos, se puede resumir en realizar una electroforesis que nos separa las protenas segn un determinado criterio, una transferencia del gel resultante, a una membrana adsorbente (proceso por el cual tomos, iones o molculas son atrapadas o retenidas en la superficie de un material). y posteriormente, se detecta la protena de inters , y se estudia la unin antgeno-anticuerpo, y se observan los resultados, viendo si hay ms, si hay menos, si ha cambiado su configuracin

Que necesitamos saber, para entenderlo?Pues que leis poquito a poquito los prrafos inferiores, con calma y paciencia, y si algo no os queda claro, aunque lo haya intentado, tirad de Intern, ese gran sabelotodo. Y un pequeo glosario:Electroforesis discontinua: Electroforesis donde hay dos tipos de geles, un gel concentrador (stacking) de poros grandes, y un gel separador (running), de poros pequeos.PVDF: Fluoropolimero inerte qumicamente, se usa en Western Blot porque es afn a las protenas, ms concretamente a los aminocidos.Anticuerpo: Inmunoglobulinas. Son glucoprotenas que neutralizan elementos externos (antgenos), como bacterias, parsitos, viruscada anticuerpo es nico y especfico para cada tipo de antgeno.Antgeno: Protenas o polisacridos. Sustancias externas que desencandenan la formacin de anticuerpos y puede causar una respuesta inmunitaria mediante la activacin de linfocitos.PBS(Tampn fosfato salino): Solucin acuosa y salina que contiene cloruro de sodio, fosfato de sodio, cloruro de potasio y fosfato de potasio. Se usa principalmente para mantener un pH estable-SDS: Dodecil sulfato de sodio. Detergente de carga negativa. Se une a las protenas y les confiere dicha carga. Esta unin se da en una proporcin constante, cada gramo de protena se une a 1,4 g de SDS, sea cual sea la protena.Anticuerpo primario: Se une y marca la protena de inters.Anticuerpo secundario: Determinan si el anticuerpo primario se uni a la protena de inters, los hay de diversos tipos segn como los queramos o podamos detectar luego: Ligados a enzimas (veremos un cambio de color), de marcado radiactivo, de marcada fluorescente (emitir fluorescencia..)Anticuerpo monoclonal: Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos idnticos, porque son producidos por un solo tipo de clula del sistema inmune. Se unen a un eptopo en partcular, una nica regin del antgeno.Anticuerpo policlonal:Son anticuerpos derivados de diferentes tipos de linfocitos. Los anticuerpos policlonales son una mezcla de inmunoglobulinas secretados en contra de un antgeno concreto.Cmo se prepara y realiza un Western Blot, y en que se basa?Paso 1. Preparacin de la muestra.Lo primero de todo, como es obvio, es disponer de una muestra, ya sean muestras tomadas de un tejido (cerebro de rata, por ejemplo), o de un cultivo celular directamente. Debemos asegurarnos que en dicha muestra tenemos una cantidad de protenas suficientemente alta como para poder trabajar.Trabajamos siempre en eppendorfs!Debemos coger la muestra, y lo primero que se hace es introducirla en unBufferde Extraccin. Cuando buscamos purificar y estudiar proteinas, lo primero que se debe hacer es romper las clulas , y extraer de el la fraccin de proteina. Todo esto con elbufferde extraccin. Es un proceso importante, ya que los mtodos que se usan, tanto fsicos como qumicos, si no se hacen bien, pueden afectar a la integridad de la protena, degradarla, y en cualquier caso, afectar a nuestros resultados.Tambin pueden usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y solubilicen las protenas. Es muy recomendable aadir albufferde extraccin inhibidores de proteasas y fosfatasas que evitan la digestin por las enzimas celulares de las protenas y de las fosfoprotenas, respectivamente, y si no los usamos, corremos el riesgo de perder la muestra deseada.Lo primero es lavar la muestra con PBS, y se resuspende en un volumen x, que para tener concordancia con lo de abajo, diremos que es 250 uL de: Bufferde extraccin, que lleva (para 25 mL) Tris-HCl 50mM: Como tampn. NaCl 120 mM IGEPAL al 0,5%. : Detergente que ayuda a la lisis de las clulas. Ph 8.0 NaF 100 mM : Antifosfatasa, la fosfatasa esuna enzima hidrolasa responsable de eliminar grupos de fosfatos de varios tipos de molculas como nucletidos, protenasy no nos interesan que nos toques las protenas, que las hemos extrado nosotros pa algo. NaVO3 200 uM : Proporciona actividad higroscpica, quees la capacidad de algunas sustancias de absorber humedad del medio circundante. Antiproteasas (1 pastilla en 2 ml de agua, que se aaden a estos 25 mL totales) , y que creo que no hace falta decir para que se usan(shhhh, que se cargan las protenas)Despus se homogeniza la muestra, ya sea con un homogenizador, o sonicando, si es asrecordad usar cascos! Despus de la homogeinizacin, debemos centrifugar, por norma general a 13.000 rpm, durante 10 minutos, y a 4C, que ayuda a conservar mejor el material biolgico.Nota: Recordad que la sonicacin es el acto de aplicacin de la energa del sonido, generalmente ultrasonido, para agitar las partculas de una muestra, por ello he dicho que es recomendable usar cascos, por el bien de vuestros tmpanos.

Despus de tener nuestro pellet (En los procesos de centrifugado, se denomina pellet al material sedimentado), debemos, con sumo cuidado para no afectar al pellet, vaciar el eppendorf, sin brusquedades, en un papel limpio y dejarlo abierto para que seque bien, no debe quedar nada delbufferde extraccin.Paso 2. Cuantificacin de protenasPorqu cuantificar protenas? Es muy simple, cuando ms adelante debamos cargar protenas, para que los resultados tengan algo de sentido, tendremos que saber cuanta protena tenemos, para cargar lo mismo y que los resultados no dependan de cuanta protena hemos cargado, si no de las caractersticas de la protena cargada.Cmo se hace? Por norma general se usaBCAProtein Assay Kit , un kit que ya viene preparado (y que como todos los kits, no sabes que llevan para que no lo puedas preparar y te veas obligado a comprarlo a la casa).Como este paso con el kit es siempre igual (que yo sepa), en este caso si os voy a poner un protocolo, que estaqu.Hacemos todas esas diluciones entre en la curva estndar que tiene que tener vuestro laboratorio, donde veris que longitud de onda corresponde a que cantidad de BCA, y extrapolando con vuestra longitud de onda, y teniendo en cuenta las diluciones que habis hecho, sabremos que cantidad de protena tenemos.As ya sabemos la cantidad de protena que tenemos en nuestras muestras, y jugando con disoluciones, podremos cargar la cantidad deseada de protena siempre que queramos.Paso 3. Electroforesis en gel.La funcin de la electroforesis es separar, basndose en uno o varios criterios, las protenas. Estos criterios suelen ser: peso molecular, punto isoelctrico, y carga elctrica.Si solo se usa un criterio, estamos ante un gel en 1 dimensin, si por ejemplo, se combinan en el mismo gel, el peso molecular y el punto isoelctrico, estamos ante un gel bidimensional.

La electroforesis ms comn, que no la nica, es la SDS-PAGE (polyacrilamide gel electrophoresis), que usa gel de poliacrilamida, y SDS, que es un tampn de dodecilsulfato, que no es ms que un detergente, que acta rompiendo enlaces no covalentes en las protenas, desnaturalizandolas, y obligando a las proteinas a adquirir su conformacin primaria, lo que permite una mejor clasificacin sin interferencias debidas a las posibles conformaciones (que recordemos que hay hasta cuatro).El SDS lo que hace es unirse a las zonas apolares de un polipptido, lo que proporciona al polipptido una carga negativa que resulta proporcional al nmero de aminocidos, y es lo que acaba por obligar a la protena a adoptar su conformacin primaria.Las protenas presentan una carga elctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pHdiferente al de su punto isoelctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse cuando se someten a uncampo elctrico. La velocidad de migracin es proporcional a la relacin entre las cargas de la protena y sumasa. Cuanto mayor carga por unidad de masa ms rpida ser la migracin.Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es que son qumicamente inertes,transparentes y estables en un rango amplio de pHs, temperatura y fuerza inica.Cosas que debemos tener en cuenta cuando hacemos una electroforesis con geles de poliacrilamida:a) Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerizacin de la acrilamida por accin de un agenteentrecruzador (cross-linking), la bis-acrilamida en presencia de un iniciador y un catalizador. Comoiniciador se suele utilizar TEMED (N,N,N,N-tetrametilnediamina) y como catalizador el in persulfato(S2O8-) que se aade en forma de persulfato amnico (APS). En algunas situaciones, como por ejemplo en elisoelectroenfoque en el que la presencia de persulfato puede interferir con la electroforesis se empleanriboflavina y TEMED.Que componentes lleva y porqu? Tris como tampn, es inocuo para las protenas. Glicina como fuente de iones de arrastre, o lentos, se sita en un valor inferior a la de la protena mas lenta conocida, con carga negativa. Acrilamida, que en disolucin acuosa autopolimeriza de forma espontnea y lenta, y en presencia de un sistema generador de radicales libres, los monmeros de acrilamida se activan, y reaccionaran para formar polmeros de larga cadena. Estos polimeros no forman un gel, son viscosos, debido a que las cadenas pueden deslizarse unas sobre otras, por eso se utiliza. Biscarilamida, polimeriza conjuntamente con la acrilamida pero establece puentes entre las cadenas lineales de acrilamida, evitando el deslizamiento de las anteriores, y produciendo de esta manera la formacin de gel. SDS, explicado arriba. APS, Persulfato amnico, que genera radicales libres, y es lo que como ya hemos dicho antes, inicia la reaccin de polimerizacin de acrilamida, que lleva finalmente a la formacin del gel. TEMED,N,N,N,N-tetrametiletilenodiamina, es otro iniciador.La tasa de polimerizacin y las propiedades del gel resultante dependen de la concentracin de APS y TEMED.Aumentando su contenido se disminuye la longitud media de la cadena de polmero y se incrementa la turbidez del gel, al tiempo que disminuye su elasticidad. Por contra, disminuyendo la cantidad de iniciadores se obtiene el efecto inverso. Se debe, por tanto, utilizar la menor concentracin posible de catalizadores que permita la polimerizacin en un tiempo ptimo.b) Las soluciones de acrilamida se desgasifican pues el oxgeno es un inhibidor de la polimerizacin.Adems, durante la polimerizacin se libera calor que podra provocar la formacin de burbujas en el seno del gel.Cmo desgasificamos?Muy simple, aadimos toda el agua que podamos (evitando que rebose), que adems mantendr hidratado al gel, pero recordad, usad agua bidestilada!c) La velocidad de polimerizacin viene determinada por la concentracin de persulfato (APS catalizador) yTEMED (iniciador).d) La porosidad del gel la determina las proporciones relativas de poliacrilamida y bis-acrilamida, siendomenor el poro cuanta ms bisacrilamida vs. acrilamida se use.e) El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina el rango de separacin del gel. Habitualmente los geles se denominan en funcin del % de acrilamida/bisacrilamida que contienen. As, la mayora de las protenas se separan bien en el rango de 5 a 10%. Un menor porcentaje (mayor tamao de poro) es mejor para separar protenas de gran tamao.Por norma general se emplean sistemas de dos tampones, conocido como sistema discontinuo. Este sistema permite la separacinde volmenes relativamente grandes de muestra sin prdida de resolucin. Usaremos dos geles, que llevan los mismos componentes, pero en diferente concentracin, y cada uno de ellos puede estar en un porcentaje determinado, dependiente de la cantidad de protena que disponemos, yo como novato no se que relacin se sigue, as que si tenis jefe, preguntadselo a l, y si noenhorabuena, sois jefes. Por poner un ejemplo, y digo un ejemplo porque cada laboratorio es un mundo:

En los sistemas discontnuos el primergel, que es el Running, asegura la migracin de todas las protenas en el frente de migracin, provocndose la acumulacinde todas las que se han cargado en el pocillo. La separacin realmente comienza a partir del momento en elque el frente de migracin alcanza la frontera del segundo gel, el stacking. El gel que queda al final en la parte superior (stacking), es de mayor poro(menor porcentaje de acrilamida+bisacrilamida) y tiene un pH ms cido que el segundo gel que es el querealmente separa las protenas. Como ya hemos dicho este sistema es especialmente adecuado para analizar muestras diluidas sinperder resolucin.Para la realizacin de la electroforesis, tras preparar los geles de poliacrilamida, al porcentaje que necesitis, que ser el medio donde colocaremos la protena de nuestra muestra, debemos colocarlos en la unidad de electroforesis, que si es la primera vez que la preparais, es as:Para solo un gel:

Ms moderno, con 4G y para dos geles:

Se prepara el tampn de electroforesis (tris/glicina) y se aade en los reservorios interior y exterior, y debemos retirar las posibles burbujas de aire del interior de los pocillos (vamos, como ya hemos dicho antes, a llenarlo de agua!)Con la ayuda de una micropipeta cargamos las protenas de nuestra muestra (antes del paso I!), y recordadlo, seguid un orden que conozcis.Dnde se cargan las protenas?Una vez colocados los dos geles, antes de echar elbuffer/tampn tenemos que colocar en el gel concentrador, un peine (ver paso G), que nos crear unos pocillos en dicho gel, que ser donde cargaremos nuestra protena.En el primer pocillo (aunque podis hacerlo donde queris), aadid un marcador de peso molecular, para despus saber el peso molecular de vuestras muestras, observando el marcador y vuestra muestra, y la distancia que hanrecorrido tras la electroforesis.Se conectan los electrodos a la cubeta de electroforesis, y a la fuente de alimentacin, y conectamos la corriente elctrica, recordad antes de todo que los electrodos estn correctamente colocados, cada color con su color, rojo con rojo y negro con negro, y recordad que el voltaje es variable dependiendo del espesor del gel, de la cantidad de protenapero que nunca debe bajar de 100V, y se deja correr hasta que el frente azul, que son nuestras protenas, llegan a la parte inferior del gel, y nada ms sacarlo, recordad recortar una esquina del gel para saber en que posicin estaba orientado, y as sabremos que muestra hay en cada pocillo, porqueantes lo habis apuntado! oms os vale tener buena memoria.

Finalizada la electroforesis, sacados los geles, y marcados para saber su orientacin, pasamos al punto 3.Paso 4. Tincin del gelSimplemente se coloca el gel, en un tupper (para entendernos), con un colorante de protenas, el Azul de Coomassie (bueno, con sensibilidad hasta 50 ng) u otro igualmente vlido, que nos dir, segn la intensidad, la cantidad de protena existente (de forma cualitativa), o si directamente no existe protena. El Azul de Coomassie es de tipo aninico y se une a protenas de forma inespecfica.

Debemos dejar el gel, junto a la solucin de Azul de Coomassie (anexo), de un volumen de diez veces el del gel, en agitacin suave durante unos 30 minutos aproximadamente, tras los cuales, podremos recoger con la ayuda de una pipeta la solucin, y almacenarla para futuras tinciones.Con el objetivo de limpiar mejor el gel, y que no quede teido de azul por todos sitios, si no solo el los lugares en los que hay protenas, se deja de nuevo en agitacin suave el gel junto a una solucin para desteir, que se debe cambiar tantas veces como sea necesario, es decir, cada vez que veamos que la solucin para desteir a pasado de ser incolora a azul (lo que indica que ha limpiado el gel), y este proceso puede durar el tiempo deseado, hasta obtener el resultado espero. En mi caso, esta solucin para desteir, la preparo con: 925 mL de agua destilada MiliQ, o bidestilada. 50 mL de Metanol. 75 mL de cido Actico puro.Recordad hacerlo en la campana, que el actico te deja KO! Y tambin, recordad que debis echar el metanol y el actico en los 925 mL de agua, y no al revs, por motivos armamentsticosya sabisBUM!Pasado el tiempo necesario para la destincin, limpiamos el gel con agua destilada, y si es necesario, ya podemos conservar el gel a 4C durante un largo periodo de tiempo, si fuese necesario esperar antes de proseguir con el siguiente paso, la transferencia.Quedar algo as:

Paso 5. Transferencia.Paso que permite que las protenas sean accesibles a la deteccin por anticuerpos. Simplemente, los resultados son mucho mejores, y desde siempre se ha hecho as, se se transfiere a las protenas desde el gel de poliacrilamida, a una membrana que, normalmente, es de nitrocelulosa o PVDF. En las membranas de nitrocelulosa, las protenas interaccionan con esta mediante enlaces no covalentes de naturaleza hidrfoba. Por otro lado, en las membranas de PVDF, resulta que el fluoruro de polivinilideno, inerte qumicamente, es afn a las protenas, mediante enlaces hidrofbicos y de dipolos membrana protena.Las dos opciones son igual de vlidas, pero debis saber que las de PVDF son ms caras, por el hecho de ser ms resistentes, no son tan fciles de quebrar como las de nitrocelulosa, y pueden someterse a varias pruebas consecutivas.La transferencia puede hacerse mediante tres mtodos: Difusin, vaco, o electrotransferencia, este ltimo es el ms usado con diferencia, y el que mejores resultados ofrece, pero no viene mal explicar los otros mtodos y as sacamos algo de Historia del Western Blot.Transferencia por difusin: Su propio nombre lo indica, simplemente se ponen en contacto el gel y la membrana, y por simple difusin, se transfiere. Se ponen en contacto entre s y con un tampn, que asciende por capilaridad hacia el papel de filtro, que se habr colocado encima de la membrana, y mientras lo hace, arrastrara a las protenas hasta la membrana, donde quedarn retenidas.La cantidad de protena transferida no es muy alta, aunque es funcional, pero est siendo remplazado por los otros mtodos, aunque una modificacin est dndole de nuevo algo de uso, ya que permite a partir de un mismo gel, transferir el contenido a varias membranas, pero esto solo sirve si no hace falta cuantificar protenas, y ya os digo yo, que esto no suele ser lo comn.Transferencia al vacio: Al mtodo anterior, se le aade el poder de succin de una bomba, que se conecta a un sistema de secado de planchas de gel, que lleva a as protenas desde el gel hasta su retencin en la membrana. Interesante porque la cantidad de proteina transferida es mayor, y vlido tanto para proteinas de alto, como de bajo peso molecular.

ElectrotransferenciaElectrotransferencia:La que vais a usar, con diferencia la ms usada y la ms recomendada. Al igual que durante la realizacin de la electroforesis, se usa una corriente elctrica y un tampn (Bufferde transferencia), que rellena la cubeta de electrotransferencia, como resultado se transfieren las protenas. En este caso, se usan los siguientes elementos, que se colocan partiendo desde el polo negativo (ctodo, rojo!) al positivo (nodo, azul!): Esponja 2-3 papeles de filtro Whatman n3empapados enbufferde transferencia Gel Membrana 2-3 papeles de filtro Whatman n3 empapados enbufferde transferencia EsponjaA este conjunto se le conoce como Sandwich, y una vez montado, debis meterlo en la cubeta con el negro del sandwich (no la parte torrada del sandwich que trais de casa), orientado hacia el polo negro de la cubeta.Al conectar las corriente, a una determinada potencia que depende de diversos factores (que no debe bajar de 100V), las protenas se desplazarn hacia el polo positivo, y quedarn retenidas en la membrana.Os informo de que hay dos tipos de electrotransferencia:Hmeda: La que yo he usado todas las veces que he hecho electrotransferencia, as que ante las dudas ya sabis. Para que podis ver la diferencia que hay entre los dos mtodos, aunque no queria y lo estoy haciendo, os pongo un ejemplo de como varia elbufferde transferencia en ambos casos: Tris base 25 mM Glicina 192 mM pH 8,2 20% de metanol (v/v)Semi-seca:Es ms rpida que la anterior, pero no se recomienda para protenas mayores a 100kDa. Cmo podris ver, es ms ligera (menos glicina) y permite que las protenas corran ms rpido y se transfieran antes, pero no siempre funciona, as que limitaros a usarla cuando os lo digan o cuando esteis seguros de que vuestras protenas pesan menos de 100 kDa. Tris base 50 mM Glicina 40 mM 0,04% de SDS (p/v) 20% de metanol.Quedar una copia del gel, pero en la membrana, algo as (como vis, ya no es gel):

Paso 6. Bloqueo.Con este paso simplemente se trata de bloquear la unin de protenas a la membrana, que puedan unirse a esta en los lugares que hayan quedado libres, posteriormente a la transferencia. Sin este paso, el anticuerpo, que es de naturaleza proteica, podra unirse en esos huecos libres (recordemos que la membrana es afn a las protenas), y dificultar la distincin del complejo antgeno-anticuerpo que se trata de obtener.Para bloquear, se suele usar una solucin proteca, que incluye albmina de suero bovino (BSA), leche en polvo o casena, y algo de detergente, como Tween 20. Esta solucin proteca rellena los huecos libres, y como el anticuerpo que se usar es especfico, no se unir en estos huecos,ya que no habr en ellos la proteina que el anticuerpo busca, con lo cual no nos molestarn para los siguientes pasos.Paso 7. Deteccin.Se trata de buscar en la membrana una determinada protena, y por este mismo motivo se usa un anticuerpo especfico, unido a una enzima, que si encuentra su sustrato ( la protena indicada, o ms bien su antgeno), se producir una reaccin y podremos observar a la protena por diversos mtodos. Hay muchos procesos que llevan a una deteccin, voy a mencionar el ms famoso o conocido, o que directamenteutilizo yo y considero ms moln.Deteccin en dos pasos: El de toda la vida! Se tiene que usar un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario.Anticuerpo primarioEl que se une a la protena buscada. El anticuerpo se consigue inoculando la protena a un animal, que puede ser casi cualquiera de los que vemos en un zoo, conejos, monos, o, mucho ms ecolgico, procedente de un cultivo celular. Esto desencadena en el animal una respuesta inmune, produciendo as un anticuerpo, primario, porque reconoce la protena. Cogemos la membrana que habamos bloqueado y se deja en agitacin moderada junto a una disolucin, pequeisisisisisisima, de anticuerpo primario, que solo tiene desde 0,5 a 5 ug/ml, y se usan microlitros. Los anticuerpos se guardan en un congelador a -20C, por norma general, y son caros, as que ms vale que no os vean malgastando alguno. Cogemos el mismotupperque tenamos, previo lavado, y juntamos la membrana junto a la ya mencionado disolucin, que lleva cloruro de sodio, algo de detergente (Tween 20), y en ocasiones BSA o otras protenas. Se deja incubando desde media hora hasta Overnight, es decir, durante toda la noche.Lavado del anticuerpo primario.Para lavar la membrana y dejarla limpia de anticuerpo primario, se puede usar TBS, 2 lavados de 30 segundos. El TBS ( oBuffersalino de Tris), se prepara de forma muy simple con: 50mM Tris. 150 mM NaCl Ajustar pH con HCl hasta 7,6.La forma ms simple de prepararlo es usar unas tabletas ya preparadas de TBS, que vienen formuladas para diluirlas en 500 ml de agua desionizada.Puede usarse tambin T-TBS, que no esms que TBS al que se le aade Tween 20, un detergente, que ofrece mejores resultado. Se prepara: 50 mM Tris, un tampn cido base. 150 mM NaCl 0,05% Tween 20, un detergente que ayuda a realizar una limpieza mejor. Ajustar pH con HCl (diluido, si no el pH bajar de forma drstica) hasta 7,6.Cabe indicar que tambin venden pastillas ya preparadas con esta formulacin para ser diluidas en 500 mL de agua desionizada.

Anticuerpo secundario.Tras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario que no se ha unido, se expone al anticuerpo secundario. ste reconoce de forma especfica una regin concreta del anticuerpo primario, a la cual se une, y estos secundarios suelen estar marcados para ser detectables por diversos mtodos (unin a biotina, a una enzima reporter como la fosfatasa alcalina, etc.). Varios de estos anticuerpos se unirn a cada anticuerpo primario, por lo que acaban resultando en una amplificacin del anticuerpo primario, y no solo eso, si no que ahora podemos detectar al anticuerpo primario. Un anticuerpo secundario anti-ratn es aquel capaz de reconocer casi todos los anticuerpos primarios obtenidos de ratones. Y as con el resto de anticuerpos secundarios anti-(inserte animal), anti-cabra, anti-conejo cabe indicar que pueden emplearse tambin protenas y no anticuerpos, como las protenas A y G.Lavado del anticuerpo secundario.Para lavar la membrana y dejarla limpia de anticuerpo secundario, pueden darse 3 lavados de 3 minutos de T-TBS, que no es ms que TBS al que se le ha aadido Tween 20. (explicada su preparacin arriba)Paso 8. AnlisisSimplemente, dependiendo del tipo de anticuerpo secundario que hayamos usado, lo analizaremos de una determinada forma. Os recomiendo ver el glosario de nuevo:Anlisis colorimtricoConsidero que el ms sencillo. La deteccin colorimtrica depende de la incubacin del Western blot con un sustrato unido al anticuerpo secundarioque es una enzima reporter , (una peroxidasa, por ejemplo) , producindose una reaccin que acaba en un cambio de color. La cuantificacin proteica se evala por densitometra (intensidad o densidad de la protena, de lo que vemos de protena, de la mancha) o por espectrometra, que nos indicar un determinado valor de longitud de onda, equivalente a una determinada cantidad.AnlisisquimioluminiscenteLa deteccin quimioluminiscente requieren la incubacin de la membrana con un sustrato que trae unido el anticuerpo secundario, que emitir luminiscencia al ser expuesto al reporter . El ms usado es el luminol. Se analiza la imagen por densitometra. Actualmente, hay programas que permiten la obtencin del peso molecular, flipa colega!

Anlisisradiactivo (ya no se usa)Se coloca una pelcula fotogrfica contra el Western blot y la actividad radiactiva del marcador que lleva unido el anticuerpo secundario, provoca la aparicin en ella de regiones oscuras, que corresponden con las bandas de las protenas de inters. Alto precio y peligroso para la saludCACA!AnlisisfluorescenteMuy usado. Marcadores fluorescentes que van unidos al anticuerpo secundario, a los cuales se les excita luminicamente, y se detecta su cambio mediante un fotosensor, como una cmara CCD equipado con los filtros de emisin apropiados. Se consigue una imagen digital del Western Blot que puede ser analizada para obtener el peso molecular o la cuantificacin proteica. Bueno, bonito, y no tan barato!

Paso 9. ResultadoResultado del Western blot: una membrana con las protenas separadas en la electroforesis unidas, de las que slo se disciernen aquellas contra las se ha aadido un anticuerpo. Despus de esto podemos escanearlas y estudiarlas de mil maneras diferentes, que no son motivo de esta entrada. (vase la x que marca la orientacin)Por reaccin colorimtrica:

Por fluorescencia:

Nota 1: La utilizacin de hielo en los procesos de electroforesis y electrotransferencia, aporta mejores resultados._________________________________________________________________________________