Evaluacin de la posible presencia de contaminantes en el agua corriente: Un anlisis de la mitosis en Allium cepa (cebolla)

Fundamentacin

Lamitosises un proceso que ocurre en el ncleo de las clulaseucariotasy que precede inmediatamente a la divisin celular, consistente en el reparto equitativo del material hereditario (ADN) caracterstico (Rubenstein y Wick, S., 2008). La mitosis cumple un rol fundamental durante el ciclo celular, y los cambios en cada fase pueden mostrar alteraciones que indiquen situaciones de contaminacin, estrs, entre otros, que pueden ser producidos por factores ambientales o por la infeccin de organismos patgenos (hongos, bacterias u otros).

Se conoce que en la cuidad de Pilar, (Buenos Aires, Argentina) existen napas de algunas zonas que estn contaminados con metales pesados. Recientemente se ha publicado en el diario La Nacin1 una denuncia sobre contaminacin en barrios de Pilar. En este contexto, se propone realizar bioensayos con Allium cepa incubada con agua de red para observar si existe algn cambio en el porcentaje de clulas en las distintas fases mitticas, o en la morfologa celular debido a la presencia de algn contaminante. Estos resultados sern comparados con cebollas incubadas en agua mineral. La evaluacin del estado de agua potable de una localidad es de suma importancia ya que se trata de agua de red que los habitantes de una localidad consumen diariamente y la contaminacin de la misma puede traer inconvenientes en la salud clasificables desde leves a profundos. Si bien las autoridades municipales realizan las pruebas necesarias para asegurar que el agua de red se encuentre en niveles de contaminantes no significativos para la salud, es importante recordar que localmente estas pruebas pueden variar debido al almacenamiento del agua de red en tanques hogareos e inclusive por existencia de filtraciones en las caeras de distribucin que pueden no ser detectadas rpidamente. En este sentido el aporte que puede realizarse desde este sencillo estudio puede ser significativo y tomarse sus resultados, en caso de ser negativos, como una llamada de atencin para la profundizacin en la realizacin de pruebas qumicas de mayor confiabilidad.

Introduccin

En los ltimos aos se observa un creciente inters por el desarrollo y empleo de pruebas biolgicas para evaluar los potenciales efectos txicos y genotxicos de la contaminacin sobre los seres humanos y los ecosistemas (Morais Lemes y Marin Morales, 2009).

Cuando un bulbo de cebolla (Allium cepa) se rehidrata, se produce unaestimulacin del crecimiento de las clulas, lo cual permite laelongacin de las races de laplanta. Sin embargo, cuando la hidratacin se lleva a caboen presencia de sustancias txicas, la divisin celular de los meristemos radiculares puede inhibirse, yasea retardando el proceso de mitosis o destruyendo las clulas. Estetipo de alteraciones generalmente impide el crecimiento normal de la raz y, por tanto, su elongacin (Fiskesj, 1985,1993, 1997). La genotoxicidad tambin puede evidenciarse en cambios morfolgicos de la clulas, como por ejemplo la aparicin de microncleos, aparicin de puentes o cromosomas errantes, anafase desorganizadas, aumento del tamao del ncleo y/o nuclolo, ncleos lobulados, clulas polinucleadas (Andrioli, et al. 2006). Desde hace varias dcadas se utiliza en el monitoreo ambiental A. cepa ya que ha resultado un excelente bioindicador de genotoxicidad y efectos mutagnicos (Freyre et al, 2009, Andrioli, et al. 2006). Por otra parte, es un ensayo de reducido costo, rpida evaluacin de resultados y amplia disponibilidad del material biolgico, siendo su mayor ventaja la fcil observacin de los ncleos al microscopio lo que favorece la evaluacin e interpretacin de las observaciones.

En la localidad de Pilar de la Provincia de Buenos Aires, se han detectado niveles altos de cromatos, nitratos y arsnico en las aguas provenientes de agua de pozos1,2. Estas evidencias indicaran que probablemente las mismas no sean aptas para el consumo humano.

Segn el Cdigo Alimentario Argentino, el mximo permitido de arsnico es de 0,010 mg/litro. En los casos denunciados, llegan al 0,029 y 0,040 mg/l. En el caso de los nitratos, el valor mximo aceptado es de 45 mg/l y los informes privados detectaron que llega a los 60 mg/l.2

Se presume que al estar las aguas de Pilar contaminadas con distintos agentes txicos, estos mismos tendrn efectos sobre el crecimiento de las races de las cebollas incubadas, y tambin se vern afectados los porcentajes porcentaje de clulas en las distintas fases mitticas de clulas de Allium cepa comparando siempre con el control de agua mineral.

En un ensayo realizado en la Cuidad de Mxico, en el cual se estudi la presencia de contaminantes en las aguas y su relacin con la mutagnesis, no se observ una correlacin entre el ndice de divisin mittica, el porcentaje de las fases en las que se hallaban las clulas y la presencia de contaminantes en el agua. Los porcentajes entre agua testigo y problema presentaron valores semejantes. (SIDALIN, CCH Plantel Oriente-Evaluacin genotoxicolgica de dos muestras de agua usando Allium test- Cuidad de Mxico, 2012). La ausencia de efectos genotxicos apreciables en esto bioensayos no implica que las aguas sean potables para el consumo humano ya que otros factores pueden estar involucrados que no muestran efectos en A. cepa. Se acepta en general una confiabilidad del 80 % versus otros sistemas de prueba (Andrioli, et al, 2006)

Pregunta de investigacin: Existirn diferencias en el porcentaje de clulas en las distintas fases mitticas de clulas de Allium cepa incubada en agua corriente comparada con las incubadas en agua mineral? Se observarn cambios morfolgicos (tamao del ncleo, del nuclolo o de la clula) entre los dos grupos experimentales? Se observarn diferencias en la longitud de las races incubadas durante los tres das)

Variable Independiente: Fases de la mitosis en las cebollas incubadas, tipo de agua (agua corriente y agua mineral), tiempo de incubacin (tres das)

Variable Dependiente: Porcentaje de clulas en cada fase de mitosis en los dos tratamientos utilizados (agua mineral y una corriente). Crecimiento total de las races (cm)

1Diario La Nacin- 10 de Agosto 2000 http://www.lanacion.com.ar/28230-denuncian-que-hay-contaminacion-en-barrios-de-pilar)

2http://www.minutouno.com/notas/129875-aguas-contaminadas-encountries-pilar- Nota publicada el 30 de Noviembre del 2001- Diario onlin e Minuto Uno.

Variables de control y Mtodos de control

Tamao y origen de las cebollas puestas a incubar:

Las cebollas fueron compradas el mismo da y en el mismo lugar, se pesaron y seleccionaron cebollas de 150 g10g utilizando una balanza NUTRI 100 ( 1g)

Tiempo total de incubacin ( 3 das) y Hora en la que se inicia y finaliza la incubacin:

La hora de inicio de la incubacin fue a las 10:00 hs (AM) debido a que en este horario es el punto mximo de la mitosis. Se finaliz a las 72 horas de incubacin que se midi con un cronmetro.

Volumen de agua utilizado en cada incubacin y origen del agua utilizada en la incubacin:

El volumen de agua de incubacin fue medido con probeta de 100 cm31cm3. La medicin se realiz utilizando agua corriente extrada en cada ocasin de la misma canilla del laboratorio y agua mineral Villavicencio de 2000 cm3 fueron comprada en el Market Pilar.

Temperatura de incubacin de las cebollas:

La incubacin fue realizada a temperatura ambiente del laboratorio (entre 22 y 24C) Para evitar cambios bruscos los vaso de incubacin fueron introducidos en un bao trmico donde se midi la temperatura con un termmetro digital SEM 200 ( 0,1C)

Microscopio y objetivo de observacin:

Se utiliz el mismo microscopio marca DIG con un aumento 100 X con una superficie de ocular de 0.1 cm2.

Nmero de clula observadas por cada raz y nmero total de races observadas por cada tratamiento:

Se contaron 50 clulas al azar en total para cada raz y se observaron cinco races por cada tratamiento, en total se observaron 500 clulas (250 clulas por tratamiento)

Volumen de reactivos utilizados en la preparacin de los preparados permanentes de las races:

Se utilizaron 2 cm3 de HCl 1N y 2 cm3 de Carnoy, medidos midieron con pipeta de 5cm3 (0,1 cm3) y 3 gotas de Orceina

Tiempo de incubacin con el colorante temperatura de incubacin:

El tiempo de incubacin con el colorante fue medido con cronmetro digital cronometrado durante 15 minutos (CRONOS 0,001 s) y la temperatura de incubacin a 60C se control con una bao trmico y termmetro digital SEM 200 ( 0,1C)

Longitud inicial y final de la races:

Se estableci utilizar las races con crecimiento de 0,2 cm iniciales que fueron medidos con un calibre de plstico ( 0,05 cm) y la longitud final al trmino de la experiencia se midi utilizando el mismo calibre

MATERIALES Y MTODOS

Se obtuvieron cebollas (Allium cepa) y el agua mineral de un supermercado de Pilar. Las cebollas fueron trasladadas al laboratorio el mismo da de la compra donde se cepillaron, lavaron y pesaron utilizando una balanza NUTRI 100 ( 1g). Se seleccionaron cebollas de 150 g 10g.

Se incubaron cinco cebollas con agua mineral Villavicencio (control) y 5 cebollas con agua de red obtenida de una de las canillas del laboratorio. El volumen de agua de incubacin fue de 100 cm3, medido con probeta volumtrica. Se midi, previa a la incubacin, la longitud inicial de 5 races en cada una de las cinco cebollas de cada tratamiento. La longitud tomada para el muestreo inicial se fij en 0,2 cm de crecimiento inicial. Las races seleccionadas fueron las cercanas al centro de la cada cebolla y se cortaron las races adyacentes para no confundir el seguimiento al finalizar la observacin. .

A continuacin se utilizaron 5 vasos de precipitados por tratamiento, y se colocaron 100 ml de agua mineral o de red segn corresponda. En cada vaso se coloc una cebolla. (Figura 1) y a su vez los vasos fueron colocados en un bao trmico con un termmetro para evitar cambios bruscos en la temperatura de incubacin durante los das siguientes.

La incubacin fue por 72 horas y al finalizar se retiraron las cebollas del agua, se registr la longitud final de las races seleccionadas y se cortaron enteras de cada cebolla.

Figura 1- Dispositivo utilizado para hacer la incubacin. En el vaso de precipitados se coloca agua mineral o agua de red, segn el tratamiento que corresponda, y se incuba las cebollas por 72 horas.

Las races fueron colocadas en tubos de ensayo junto con 2 ml de acido clorhdrico 1N y 2 cm3 Carnoy (3:1 etanol- cido actico). Los tubos de ensayo se colocaron en bao mara a 60 C por 15 minutos, al cabo del cual las races fueron retiradas del bao y eliminado el HCl y el Carnoy, con tres lavados con agua destilada. En los mismos tubos, se colocaron 3 gotas de orceina por 15 minutos.

Con una pinza se tomaron las races y se colocaron sobre el portaobjetos. Se cort la punta de cada una y se cubri con cubreobjetos, haciendo presin, de manera de disgregar la raz. Luego se observ al microscopio a 100X.

El porcentaje de incremento del crecimiento de races (ICR) se calcul de acuerdo con:

ICR = ((LF-LI)/LI) *100(1)

DONDE:

ICR = porcentaje de incremento del crecimiento de las races medidos entre el da 1 y el da 3y expresado en porcentaje.

LI = longitud inicial de las races en la hora cero de incubacin y expresado en cm

LF = longitud final de las races a las 72 horas de iniciada la incubacin y expresado en cm

Se seleccion una cebolla por cada tratamiento a las que se efectu la tincin en cinco de las races (en total 10 races) y la posterior observacin al microscopio de las mitosis en cada caso. Se realiz una observacin de 250 clulas totales entre ambos tratamientos. Para realizar el clculo del ndice mittico y del ndice de clulas en cada fase de la divisin celular se utilizaron las siguientes ecuaciones

(2)

(3)

Los resultados se compararon mediante las barras de error, correspondientes a los desvos estndar de cada muestra, los cuales se analizaron mediante un grfico de barras. La longitud de las races se compar como porcentaje de crecimiento relativo al control (agua mineral). Los valores en cado caso se analizaron utilizando un t-Student.

Resultados

Crecimiento radicular: En la Tabla 1 se presentan los datos de crecimiento radicular al cabo de 72 horas de incubacin de A. cepa en agua corriente y agua mineral. Los resultados muestran en general baja dispersin en ambos tratamientos respecto del promedio. En ambos tratamientos se observaron dramticos incrementos de porcentajes de crecimiento siendo mayores para las cebollas incubadas en agua corriente (calculados de acuerdo con ecuacin 1, Tabla 2). En este ltimo caso se evidenci hasta 990% de crecimiento respecto de la longitud inicial de las races mientras que para el agua mineral el valor mximo fue de 900% (Fig. 2).

Tabla 1: Longitudes iniciales y finales de cebollas (A. cepa) incubadas en agua mineral (tratamiento control) y agua corriente.

C1, C2, C3, C4 Y C5: cebollas incubadas en cada tratamiento, en cada una de las celdas se anota el valor inicial y final de la longitud de cada raz LONG INI. Longitud inicial en la hora cero de incubacin, LONG FIN. Longitud final de cada una de las races en la hora 72 y final del experimento. PROM C1 a C5: promedios de crecimiento de 5 races en la cebolla 1 (C1), cebolla 2 (C2), cebolla 3 (C3), cebolla 4 (C4) y cebolla 5 (C5).

Tratamiento

C1

(cm0,05cm)

C2

(cm0,05cm)

C3

(cm0,05cm)

C4

(cm0,05cm)

C5

(cm0,05cm)

Promedio General SD

LONG.INI MINERAL

(N=5)

0,21

0,21

0,20

0,20

0,22

0,20

0,20

0,21

0,22

0,23

0,20

0,22

0,21

0,23

0,24

0,20

0,20

0,22

0,21

0,22

0,20

0,21

0,20

0,21

0,21

PROM C1 a C5 SD

0,210,01

0,220,01

0,210,01

0,220,01

0,210,01

0,210,01

LONG.FIN

MINERAL

(N=5)

1,80

1,80

1,81

1,82

1,80

1,74

1,75

1,75

1,75

1.74

1,78

1,78

1,77

1,75

1,76

1,88

1,89

1,87

1,89

1,88

2,10

2,10

2,08

2,00

2,10

PROM C1 a C5 SD

1,800,01

1,750,01

1,770,02

1,880,02

2,010,01

1,860,14

LONG. INI

CORRIENTE

(N=5)

0,20

0,21

0,20

0,22

0,20

0,22

0,22

0,21

0,20

0,20

0,22

0,25

0,22

0,21

0,21

0,22

0,22

0,21

0,20

0,20

0,22

0,22

0,21

0,20

0,20

PROM C1 a C5 SD

0,210,01

0,220,01

0,210,01

0,220,01

0,210,01

0,220,02

LONG.FIN

CORRIENTE

(N=5)

1,92

1,92

1,90

1,93

1,90

2,10

2,10

2,00

2,00

2,11

2,12

2,15

2,16

2,15

2,18

2,10

2,10

2,00

2,00

2,11

2,12

2,15

2,16

2,15

2,18

2,070, 11

PROM C1 a C5 SD

1,910,02

2,060,03

2,150,02

2,010,01

2,150,02

TABLA 2: Porcentaje de incremento de crecimiento de las cebollas incubadas en agua mineral (control) y agua corriente.

Se presenta en cada caso el incremento calculado con la ecuacin 1 correspondiente al promedio de cinco races para cada cebolla de cada tratamiento. El promedio General corresponde al promedio de la cinco cebollas de cada tratamiento.

(1) Agua mineral (% 2%)

(2) Agua corriente (% 2%)

757

860

775

855

710

760

845

852

900

990

Promedio General

(% 2%)

798

863

Desvo Estndar

75

82

Fig. 2: Porcentaje de incremento de crecimiento de las races de A. cepa incubadas en agua mineral Control (1) y Agua corriente (2)

Tal como se desprende de la observacin de la Fig. 2 las barras de error se superponen por lo cual no existiran diferencias significativas en el crecimiento de races de A. cepa incubada en agua mineral (control) y agua corriente proveniente de la red de agua potable de la ciudad de Pilar (Buenos Aires). La aplicacin del T- Student con un valor de = 0,05 fue P (T. ISSN 1561-3003.

http://www.pilar.com.ar/index.php?option=com_content&view=article&catid=75:agua-potable-en-pilar&id=104:pilar-y-el-agua-potable-&Itemid=63- Visitado el 18/12/2014.

http://www.pilardetodos.com.ar/20100522/aguanota.html- Visitado el 18/12/2014

http://www.minutouno.com/notas/129875-aguas-contaminadas-encountries-pilar- Visitado el 18/12/2014.

SIDALIN, CCH Plantel Oriente-Evaluacin genotoxicolgica de dos muestras de agua usando Allium test- Cuidad de Mexico, 2012.

ANDRIOLI, N.; WULFF, A.; MUDRY, M. Allium cepa como biomonitor de toxicidad y genotoxicidad de metronidazol.Theora, 2006, vol. 15, p. 9-16p.

Rubenstein, Irwin, and Susan M. Wick, 2008. Cell. World Book Online Reference Center. ).

FREYRE, S., ESTRADA, M., BOLAOS, H. 2009. Estudio preliminar de citotoxicidad y genotoxicidad de un extracto de origen vegetal conocido como palmo rosado en clulas meristemticas de Allium cepa.Memorias, 5: 12-17.

82.05257659337907282.052576593379072797.24675324675331863.38528138528147

Tratamientos de incubacin

Porcentaje de incremento de crecimiento de Races de A. cepa (%)

agua mineral5.21536192416212345.215361924162123428.8agua corriente3.34664010613630233.346640106136302340.799999999999997

Tratamientos de incubacin

INDICE MITTICO (%) EN LA RICES DE A. cepa

agua mineralPROFASEMETAFASEANAFASETELOFASE33.14285714285714622.28571428571428511.66666666666666632agua red11.8606033078181136.29435591916269925.705103799791124310.07709289650397511.8606033078181136.29435591916269925.705103799791124310.077092896503975PROFASEMETAFASEANAFASETELOFASE23.17676767676767526.4545454545454527.78787878787878922.580808080808083

porcentaje de clulas en cada fase de mitosis (%)