Universidad de Costa Rica Arabela Vega Aguilar Escuela de Agronomía Carné: A76908

Reguladores de crecimiento Noviembre 23 2011AF-5402

Efecto del 2,4-D y AIA en callogénesis de zanahoria ( Daucus carota )

Resumen

Se estudió el rol de dos auxinas, 2,4D y AIA en el establecimiento de callos a partir

de tejidos de raíz de zanahoria (Daucus carota) con el fin realizar una curva de

crecimiento. Se probaron dos protocolos distintos. El primero consistió en 10

repeticiones de un explante por frasco compuestos de cambium sobre MS

complementado con 1ppm de AIA y 1ppm de 2,4D bajo condiciones de día largo a

28°C donde se hicieron observaciones frecuentes y se midió el peso semanalmente. El

segundo protocolo consistió de 10 repeticiones por tratamiento de 1ppm de AIA, 2ppm

de AIA, 1ppm de 2,4D y 2ppm de 2,4D con 4 explantes por unidad experimental (placa

de Petri) bajo las mismas condiciones anteriores, realizando el mismo procedimiento de

documentación. Se obtuvo que el 2,4 D para ambos protocolos induce la formación de

callo en lapsos distintos mientras que el AIA produce la diferenciación de otros órganos

(raíces); se observó también la formación de pigmentos coloreados sobre los explantes

cultivados. Se concluye que se deben mejorar ambos protocolos para optimizar la

formación de callos.

Introducción

George et al (2008) definen un cultivo de callos o bien cultivo de tejidos como el

crecimiento y mantenimiento de masas de células enormemente desorganizadas que

surgen del crecimiento descoordinado y desorganizado de pequeños órganos de la

planta, piezas de tejido de la planta o células previamente cultivadas. Para la inducción

de callos de zanahorias se utilizan reguladores de crecimiento como el ácido 2,4

diclorofenoxiacético (2,4D) y el ácido indol acético (AIA) que al igual que la mayoría de

los reguladores de crecimiento se utilizan a muy bajas concentraciones ya que así son

capaces de modificar el crecimiento y morfogénesis de la planta.

Desde el descubrimiento de la embriogénesis somática por Stewart y Reinert la

zanahoria ha sido empleada como sistema modelo para investigar la gran cantidad de

aspectos bioquímicos, fisiológicos y genéticos del cultivo de células. (McDonald et al

1995)

A nivel celular el ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4 -D) es utilizado como regulador

de crecimiento con frecuencia para el cultivo in vitro ya que este es capaz de imitar a

las hormonas naturales del crecimiento de las plantas causando un crecimiento celular

anormal y acelerado (Bejarano et al 2007); en general el 2,4-D afecta el metabolismo

de la planta, síntesis de ácidos nucléicos y proteínas que alteran la actividad

enzimática, respiración y división celular, de ahí que su uso comercial más común es

como herbicida ya que ocasiona un crecimiento celular anormal acelerado causando

bloqueos y destrucción de los sistemas de transporte dentro de la planta

El ácido indolacético es una auxina natural que es considerada como inestable ya

que se degrada fácilmente en presencia de luz (Hall 2000) sin embargo es utilizada

como regulador de crecimiento ya que modifica el crecimiento y morfogénesis de la

planta, en general el AIA actúa en el crecimiento indiferenciado a nivel de meristemas

de modo que puede considerarse un inductor de callo en ciertos tejidos.

El establecimiento de cultivo de callo de zanahoria a partir de médula de raíz se va a

analizar en presencia de los reguladores de crecimiento mencionados anteriormente

con el propósito de crear una curva de crecimiento.

Materiales y métodos

El experimento fue realizado en el Laboratorio de Biotecnología del Centro de

Investigaciones Agronómicas de la Universidad de Costa Rica.

Se probaron dos protocolos distintos para estudiar el rol de dos diferentes auxinas

en el establecimiento de callos de zanahoria, para ambos el procedimiento de

desinfección fue el mismo que se describe a continuación:

Se tomaron dos zanahorias de aproximadamente 20cm de longitud y 4cm de

diámetro, estas se lavaron con agua corriente y jabón dentro de un recipiente agitando

manualmente, luego se pelaron eliminando aproximadamente 2mm de tejido.

Se cortaron las zanahorias en rebanadas de 1 centímetro de grueso, estas

rebanadas fueron sumergidas en una solución de etanol al 70% por 30 segundos y

posteriormente se sumergieron en hipoclorito de sodio al 10% durante 10 minutos en

agitación, a partir de este paso se trabajó en una cámara de flujo laminar.

Las rebanadas de zanahorias fueron lavadas cinco veces con aguada destilada y

estéril, con agitación dentro de un Erlenmeyer, durante 30 segundos.

Protocolo 1 Según Mc Donald et al 1995.

Se preparó medio de cultivo Murashige y Skoog (MS) según el protocolo del

laboratorio; éste se complementó con:

1ppm de 2,4D que se preparó a partir de una disolución madre de 500ppm

disuelta en EtOH y NaOH 1N y

1ppm de AIA que se preparó a partir de una sisolución madre de 1000ppm

disuelta en EtOH y NaOH 1 N.

Se vertieron 25ml por frasco y se esterilizaron en autoclave a 121°C y 15lb de

presión durante 25 minutos. Se pesó cada uno de los frascos individualmente.

Posterior a la desinfección se tomaron las rebanadas de zanahoria y se cortaron

cubos de tejido de la zona del cambium de un centímetro por lado, se colocó un cubo

de tejido de cambium por frasco, procurando que la superficie de uno de los lados del

cubo quedara en contacto con la superficie del medio de cultivo.

Se utilizaron 10 repeticiones por tratamiento, cada uno de los frascos donde se

colocó el tejido fue pesado y etiquetado según las condiciones planteadas.

Se volvió a pesar los frascos con los explantes y se calculó el peso de los explantes

por diferencia, finalmente se colocaron en un cuarto con 16 horas de luz por 8 horas de

oscuridad a una temperatura de 28°C.

Se realizaron observaciones cada tres días del desarrollo de los cultivos, se

descartaron los frascos con explantes contaminados; se documentó el tiempo de

aparición de los callos y semanalmente se pesaron para calcular la tasa de crecimiento

de cada callo.

Protocolo 2 Según PhytoTechnology Laboratories, Inc. (2003).

Se preparó medio de cultivo MS según el protocolo del laboratorio, este se

complementó con:

1ppm y 2ppm de 2,4D que se preparó a partir de una disolución madre de

500ppm disuelta en EtOH y NaOH 1N y

1ppm y 2ppm de AIA que se preparó a partir de una sisolución madre de

1000ppm disuelta en EtOH y NaOH 1 N.

Se esterilizó el medio de cultivo en autoclave a 121°C y 15lb de presión durante 25

minutos, se dispensó medio de cultivo en placas de Petri de manera que el medio

cubriera el fondo de la placa uniformemente y se pesó y etiquetó cada una de las

placas individualmente.

De las rebanadas de zanahoria se cortaron piezas de tejido de la región cambial del

floema secundario y se colocaron en las placas de Petri, ubicando 4 piezas por placa

con 10 repeticiones para cada tratamiento.

Cada uno de los frascos donde se colocó el tejido fue pesado y etiquetado según las

condiciones planteadas.

Se volvió a pesar los frascos con los explantes y se calculó el peso de los explantes

por diferencia, finalmente se sellaron con Parafilm y colocaron en un cuarto con 16

horas de luz por 8 horas de oscuridad a una temperatura de 28°C.

Se realizaron observaciones cada tres días del desarrollo de los cultivos, se

descartaron los frascos con explantes contaminados; se documentó el tiempo de

aparición de los callos y semanalmente se pesaron para calcular la tasa de crecimiento

de cada callo.

Resultados

Protocolo 1

De las observaciones y pesaje de los explantes semanalmente se descartó mucho

material por contaminación, 4 semanas después de haber iniciado el cultivo ya no se

contaba con suficiente material para generar una curva de crecimiento representativa

para cada uno de los tratamientos, los pesos obtenidos durante las 2 semanas iniciales

disminuyeron, sin embargo con el material restantes se documentó lo siguiente:

Formación de tejido nuevo sobre una cara del explante, color verde claro y blanco

que se considera como callo.

Figura 1. Aparición de callo en el tratamiento de 2,4D a los 21 días de cultivo.

Formación y crecimiento de nuevos callos

Figura 2.Formación y mantenimiento de callo en 2,4D a 29 días de cultivo.

Formación de pigmentos sobre explante en AIA.

Figura 3. Pigmentos sobre explante a 62 días de cultivo. a Antocianinas (morado). b

Clorofila (verde).

Diferenciación de tejido en raíces.

Figura 4. Formación de raíces en tratamientos de AIA.

ba

Protocolo 2

De las observaciones y pesaje de los explantes semanalmente se descartó mucho

material por contaminación, no se contaba con suficiente material para generar una

curva de crecimiento representativa para cada uno de los tratamientos, los pesos

obtenidos durante las 2 semanas iniciales disminuyeron, sin embargo con el material

restantes se documentó lo siguiente:

Figura 5. 7 días de cultivo en 2,4 D. a. presencia de tejido muerto (blanco). b.

contaminación sobre explantes (mancha verde).c.41 días en cultivo, contaminación.

Discusión

Jiménez y Bangerth (2001) establecen que la iniciación de suspensión de células en

zanahoria es sencilla a partir de casi cualquier parte de la planta cultivada en 2,4D, se

ha observado que en este medio se incrementan los niveles de AIA endógenos lo que

podría explicar la similitud de comportamiento en los tratamiento del primer protocolo

utilizado en dónde los callos para los tratamiento de AIA y 2,4 D son de aspecto similar.

El 2,4D fue según el experimento planteado el mejor inductor de callo en todos los

tratamientos realizados como se muestra en las figuras 1 y 2.

a b c

Para pejibaye, Valverde et al 1992 coinciden en que el 2,4D es el regulador de

crecimiento que induce la formación de callo, sin embargo destaca detalles

importantes como que aún en condiciones de oscuridad los tejidos en presencia de

2,4D sufren oxidación lo que explica la aparición de coloración leve (menos que para

AIA) en el tratamiento de 2,4D para ambos protocolos. Este autor indica también, que

después de 8 semanas una concentración de 30mg/L de 2,4D resulta tóxica o

inhibitoria ya que al mover los explantes a una condición de ausencia de 2,4D se

induce un nuevo crecimiento del tallo sobre el tejido oxidado.

La aparición de callo predominó en los tratamientos con 2,4D; se dio una aparición

más temprana en el protocolo 1 (21 días) en comparación con el protocolo 2 (41 días)

a pesar de que en el protocolo 2 se utilizaron explantes de menor tamaño con mayor

superficie expuesta con el fin de inducir la callogénesis con mayor facilidad.

Además del retardo en la callogénesis visto en el segundo protocolo se presentaron

algunos otros problemas como la muerte de tejido por errores en el procedimiento de

desinfección (figura 5a) que se le atribuyen a exceso en el tiempo de inmersión del

tejido y las concentraciones utilizadas, ya que algunos autores sugieren un máximo de

3% de NaClO y se utilizó 10%.

Asimismo el protocolo de desinfección fue deficiente en la limpieza del tejido ya que

en la figura 5b se observa contaminación originada por el tejido vegetal.

Otro punto importante para el protocolo 2 es el que sugiere Hall (2000) ya que se

debería considerar la calidad y concentración del agente gelificante que se utiliza en la

preparación del medio de cutlivo, además destaca que por lo general los materiales

disponibles comercialmente como el Phytagel son estables por un período prolongado

y no se unen excesivamente a los componente del medio; sin embargo en el ensayo

realizado, principalmente en el protocolo 2 se dificultó al manipulación del medio y

posterior crecimiento de los explantes ya que el medio se gelificó temprano y causó

una distribución desuniforme de los componentes como el azúcar que facilitaron la

reproducción y diseminación de patógenos entre las placas.

Hubo tres fuentes importantes de contaminación, la cristalería (en los bordes de los

frascos), mala manipulación dentro de la cámara (al centro del medio del cultivo) y

sobre el tejido vegetal; estos factores fueron determinantes en ambos protocolos ya

que debido al alto porcentaje de material descartado no se contaba con un cantidad

representativa de repeticiones para realizar un curva de crecimiento que se planteó en

los objetivos.

El aislamiento de antocianinas por lo general se ha estudiado en variedades de

zanahoria oscuras como la llamada “negra” o bien de color morado, Kammerer et al

(2004) sugieren que existen diferencias entre el contenido y composición de pigmentos

del tipo antocianinas entre cultivares y dentro del mismo cultivar en esta variedad de

zanahoria lo que indica que se requiere un estudio muy detallado y específico de este

fenómeno.

Sin embargo Narayan, y Venkataraman (2000) plantean un estudio en dónde a partir

de zanahorias de color “naranja pálido” se logran aislar dos pigmentos de antocianina;

este principio explica las coloraciones obtenidas en los explantes que se muestran en

la figura 3 ya que el genotipo de la zanahoria no fue escogido con ninguna

especificación y éste puede ser un genotipo alto en estos pigmentos.

Adicionado al contenido de pigmentos endógenos del tejido vegetal, la aparición de

antocianinas en zanahoria es señal de estrés, producido posiblemente por las

condiciones de deshidratación, agotamiento del medio y sensibilidad a las condiciones

de luz presentes lo que provocó una reacción fotosensible y de producción de clorofila.

Las condiciones de luminosidad asimismo afectaron principalmente al protocolo 1 ya

que el AIA se degrada en presencia de luz, aunado a este factor el medio de cultivo

complementado con AIA fue autoclavado lo que ocasionó mayor cantidad de pérdida

del mismo por ser insoluble en agua.

Finalmente, la presencia de raíces en el tratamiento de AIA que ilustra la figura 4 se

le atribuye principalmente a la diferenciación y especialización de tejidos como

respuesta a la ausencia de 2,4D que es el inductor de división celular por excelencia

como lo demuestran los tratamientos en dónde este cumplió su función.

The growth so induced has been measured in terms of the

Conclusiones y recomendaciones

Para evitar la muerte del tejido por causa del proceso de desinfección, se

recomienda reducir las concentraciones a no más de 1% para el etanol y no

más de 3% para el hipoclorito de sodio, reduciendo también los lapsos de

inmersión.

Definir previo al cultivo de los callos lo que se busca obtener (callos

embriogénico o no embriogénicos).

Comparar los tipos de corte utilizado para los explantes en igualdad de

condiciones para determinar cuál es el ideal.

Evaluar detalles como desinfección apropiada de cristalería y equipo de

trabajo para minimizar las pérdidas por contaminación.

Mejorar procedimiento de pesaje, utilizando pesaje directo de los explantes

para minimizar fuentes de error (transpiración, parafilm, desidratación, etc) o

bien realizar peso seco.

Mejorar condiciones de luminosidad según requerimientos (AIA).

Realizar mayor número de repeticiones para crear curva de crecimiento con

cantidad de datos representativos.

Literatura citada

Bejarano, F; Harikrishan, V.R.; Souza, J; Rozas, M.E.; Nivia, E.; Ramírez, F.;

Cárcamo, M.; González, H. 2007. 2,4D Razones para su prohibición mundial. RAP-AL.

Cooperativa Tlatolli. 1era edición. México.

George, E. F.; Hall, M. A.; De Klerk, G. 2008. Plant Propagation by Tissue Culture.

The Background. Volumen 1. Tercera Edición. 504p

Hall, R. E. 2000. Plant Cell Culture Initiation. Practical Tips. Molecular

Biotechnology, Humana Press Inc. 13p.

Jiménez, V. M.; Bangerth, F. 2001. Endogenous hormone levels in explants and in

embryogenic and non-embryogenic cultures of carrot. Physiologia Plantarum 111. 7p.

Kammerer, D.; Carle, R.; Schieber, A. 2004. Quatification of anthocyanins un black

carrot extracts (Daucus carota ssp. sativus var atroruben Alef.) and evaluation of their

color properties. EurFoodResTechnol. (219) 8p.

Mc Donald, K; Jackman, A; Thorup, J; Dandekar, A. 1995. Applied Biochemestry

and Biotechnology. 54.15p.

Narayan, M.S.; Venkataraman, L.V. 2000. Characterisation of anthocyanins derived

from carrot (Daucus carota) cell cultura. Food Chemistry 70. India. 3p.

PhytoTechnology Laboratories, Inc. 2003. Establishment and Maintenance of Carrot

Callus. Product Information Sheet. Kansas. EEUU.

Steward, F. C.; Rao, K.V.N. 1971. Investigation on the Growth and Metabolism of

Cultures Explants of Daucus carota. Universidad de Cornell. Nueva York. EE.UU.

Valverde, R.; Arias, O.; Thorpe T. 1992. Estudio histológico en callos de pejibaye

(Guilielma gasipaes). Agronomía Costarricense. 16 (2) 5p.