VOLUMEN 17 NÚMEROS 1-4 AÑO 2000 - Acerca de INS · MINISTERIO DE SALUD Ministro Dr. Luis Solari...

VOLUMEN 17 NÚMEROS 1-4 AÑO 2000

Rev Med Exp 2000, XVII (1-2)

MINISTERIO DE SALUDMinistro

Dr. Luis Solari De la Fuente

Vice-MinistroDr. Fernando Carbone Campoverde

INSTITUTO NACIONAL DE SALUDJefe

Dr. Luis Fernando Llanos Zavalaga

Sub-JefeDra. Aida Cecilia Palacios Ramírez

Centro Nacional de Laboratoriosde Salud Pública

Dra. Susana Zurita MacalupúDirectora General

Centro Nacional de Alimentacióny Nutrición

Dra. Doris Jhusey SchreiberDirectora General

Centro Nacional de Control de CalidadDra. Rosa Guevara Ormeño

Directora General

Centro Nacional de Producción de BiológicosIng. Arnaldo Baquerizo Valladolid

Director General

Programa de Complementación AlimentariaPara grupos de Mayor Riesgo (PACFO)

Dr. Napoleón Chávez VillanuevaDirector General

Oficina Ejecutiva de Información CientíficaDr. Jorge Barnaby Rodríguez

Comité Editor

Presidente

Dra. Aida Palacios Ramírez

Secretario Técnico

Dr. César Cabezas Sánchez

Miembros

Dr. Jorge Alarcón VillaverdeQ.F. Zulema Arévalo ChongDr. Jorge Barnaby RodríguezDr. Zuño Burstein Rodríguez

Dr. Javier Cieza ZevallosDr. José Espinoza Babilón

Lic. Iván Gómez-Sánchez PrietoDr. Eduardo Gotuzzo HerenciaDr. Alfredo Guillén OneeglioDr. César Náquira Velarde

Lic. Margarita Rodríguez GutarraDr. Víctor Suárez Moreno

Responsables de Edición

Dr. Leonid Lecca GarcíaLic. Cecilia Gazzo Baca

Revista de Medicina Experimental del INSVol 17, Nº 1-4 Enero-Diciembre del 2000

La Revista de Medicina de Experimental es una publicación del InstitutoNacional de Salud que estimula la divulgación de trabajos teóricos o apor-tes prácticos desarrollados por técnicos y científicos que promuevan elavance y la aplicación de la investigación y experiencia científica en salud.

Los artículos firmados no expresan necesariamente la opinión de la revis-ta, siendo los autores los únicos responsables de los criterios por ellosemitidos.

Todos los derechos quedan reservados por el Instituto Nacional de Salud.Cualquier publicación, difusión y/o distribución de la información presenta-da queda autorizada siempre que se cite la fuente de origen.

© Copyright Enero-Diciembre del 2000 INS-PERU.

ISSN 0370-6192 Depósito Legal 2000-2856

Esta publicación se terminó de imprimir en Enero del 2002.

Carátula: Frontis del local centraldel Instituto Nacional de Salud

ARTES Y DISEÑOS LASER S.R.Ltda.Teodoro Cárdenas 124 - BSanta BeatrizLima 01 - PerúTelf.: 470-6172 Telefax: 472-4525E-mail: [email protected]

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Rev Med Exp 2000; 17 (1-4)

REVISTA DE MEDICINA EXPERIMENTALVol 17, N° 1-4, 2000

Contenido

Editorial

Trabajos Originales· Fenoloxidasa modificada: clave para identificar cepas de Cryptococcus neoformans -

Canelo C, Casquero J.· Tipificación molecular del Vibrio cholerae O1 en el Perú - Huguet J, Arias I, Montoya Y.

· Control de calidad de discos de sensibilidad antibiótica comercializados en el mercadoperuano (1998-1999) - Obregón G, Zavaleta A.

· Determinación de anticuerpos Ig M contra el virus dengue a partir de sangre absorbida en papel

filtro: un método alternativo y sencillo - García M, Cabezas C, Martos L, Gonzáles A, Acosta R.· Estudio de validación de la metodología para la determinación de vitamina A en alimen-

tos infantiles instantáneos por cromatografía líquida de alto rendimiento - Pérez R.

· Detección de anticuerpos IgG específicos para sarampión mediante la técnica deInmunofluorescencia indirecta - Nieto M, Ortiz A, Chauca J.

Comunicación Corta· Caracterización molecular de la secuencia parcial del gen de la glicoproteína NS1 del

virus dengue 1 proveniente de Máncora, Perú - Yábar C.

Tema de Revisión· Diagnóstico parasitológico de la leishmaniasis tegumentaria americana - Cuba C.

Revisión de Revistas

Galería Fotográfica

· Hidatidosis por Echinococcus granulosus en el Perú - Sánchez E.

· Reporte de caso: Toxocara sp. adulto - Beltrán M.

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REVISTA DE MEDICINA EXPERIMENTALVol 17, N° 1-4, 2000

Contents

Editorial

Original Papers· Modified phenoloxidase: key to identify strains of Cryptococcus neoformans -

Canelo C, Casquero J.· Molecular typification of Vibrio cholerae O1 from Peru - Huguet J, Arias I, Montoya Y.· Quality control of antibiotic sensitivity disks traded in the peruvian market (1998-

1999) - Obregón G, Zavaleta A.· Determination of IgM antibodies for dengue virus from blood absorbed in filter

paper: an alternative and simple method - García M, Cabezas C, Martos L,

Gonzáles A, Acosta R.· Validation study of the determination of vitamin A in instant food for children through

high performance liquid cromatography (HPLC) methodology - Pérez R.

· Indirect immunofluorescence test standardized for detection of measles specific IgGantibodies - Nieto M, Ortiz A, Chauca J.

Short Communications· Molecular characterization of the partial sequence of the glicoprotein NS1 of den-

gue virus 1 from Máncora, Perú - Yábar C.

Topics Review· Parasitological diagnosis of american tegumentary leishmaniasis - Cuba C.

Select Abstracts

Picture Gallery· Hidatidosis by Echinococcus granulosus in Peru - Sánchez E.· Case Report: Adult Toxocara sp. - Beltrán M.

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Editorial

Las enfermedades infecciosas en el Perú y en otras áreas del mundo, siguen constituyendo un serio problema de saludpública, pues cada vez más se hacen evidentes los factores condicionantes de las hoy llamadas enfermedades infecciosasemergentes y reemergentes. En efecto, los factores demográficos, ambientales, sociales, culturales, y la globalización conun desarrollo económico asimétrico, con cambios permanentes en tiempo y espacio, condicionan este nuevo espectro, quese refleja en elevadas tasas de prevalencia e incidencia de enfermedades casi ya controladas en el pasado, así como en laaparición de nuevas patologías.

Pese a que en el Perú, dentro de Latinoamérica, la producción científica y, por tanto, de sus publicaciones es limitada,un reflejo del panorama de la emergencia y reemergencia de enfermedades infecciosas, es que muchas de las investigacionesen salud en el país, estén orientadas a dichas patologías, y nuestra revista no es ajena a esta realidad.

En este número se incluyen artículos sobre una técnica para mejorar la identificación del Criptococcus neoformans,que ha tomado interés debido a su incremento junto a la pandemia del SIDA. En relación a enfermedades que han causadoserios brotes epidémicos en el país, como el cólera y el dengue, se reportan técnicas de biología molecular desarrolladas enel Instituto Nacional de Salud (INS), que en el caso del cólera ha permitido correlacionar cepas peruanas con las asiáticas,y dentro del país encontrar la relación existente entre cepas de periodos epidémicos e interepidémicos; mientras que en elcaso del dengue, se muestra la identidad de cepas peruanas con cepas de Hawai. En ambos casos, se muestra la utilidad deestas técnicas como instrumentos para dar una interpretación epidemiológica integral, conociendo las características delagente infeccioso. Igualmente, para dengue se reporta un método de diagnóstico utilizando papel filtro, el cual es sencilloy de bajo costo, y será de utilidad especialmente para estudios epidemiológicos.

Otro problema emergente en el mundo, es el desarrollo de resistencia de los gérmenes a los antimicrobianos, particu-larmente las bacterias. El control de este problema va desde el diagnóstico adecuado hasta el uso racional de losantibióticos. El artículo sobre control de calidad de discos de sensibilidad antibiótica nos da la alerta de la necesidad desistematizar el control de calidad de dichos discos para tener una información adecuada sobre el desarrollo de la resistencia,todo dentro de un plan global de vigilancia y control de la resistencia antibiótica.

Aunque paradójicamente, en los nuestros países, el desarrollo científico y tecnológico, no necesariamente ha mejo-rado el estado de salud de las poblaciones, se abriga la esperanza de que así sea, y su importancia se evidencia en logrosque se han obtenido en las Américas, como es la eliminación de la poliomielitis y el proceso en curso para la eliminacióndel sarampión. En ese sentido, se incluye la validación de una técnica para el diagnóstico de sarampión que puede serutilizada en la vigilancia y evaluación de las medidas de control.

Debemos destacar el tema de revisión sobre el diagnóstico parasitológico de la leishmaniasis tegumentaria americana,desarrollada por el Dr. César Cuba Cuba, destacado médico peruano que viene formando muchas generaciones de tropicalistasen el Brasil. Él hace una revisión exhaustiva del diagnóstico parasitológico de la leishmaniasis, que continúa siendo undesafío, aún cuando se han desarrollado técnicas moleculares, pero que aún no son aplicables para el diagnóstico en elcampo. En medio de la exuberante información existente con el desarrollo acelerado del internet, se hace necesaria unasistematización y consolidación de la información hecha por expertos, de manera que oriente a los investigadores en eltema, y consideramos que este artículo cumple con creces este objetivo.

La emergencia o reemergencia de las enfermedades, probablemente sea una manera diferente de llamar a los diferentesproblemas que, a través de la historia de la humanidad y en diferentes áreas del mundo, vienen ocurriendo, como elproblema alimentario y nutricional; en ese sentido, como parte de los aportes del INS en este campo, se incluye un artículosobre la validación de una metodología para la determinación de vitamina A en alimentos instantáneos.

Finalmente, debemos manifestar nuestro optimismo de lograr el grado de excelencia de la revista, siendo un reto lamejora progresiva de su calidad y continuidad como un legado a otras generaciones interesadas, siendo esto un compro-miso de todos quienes estamos involucrados en la investigación y la salud del país.

Comité Editor

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Rev Med Exp 2000; 17 (1-4)

SEDE CENTRALCápac Yupanqui 1400 - Jesús María

Lima - PerúCentral Telefónica: 471-9920

Fax: 471-7443Defensores del Morro 2268 (ex Huaylas) - Chorrillos

Central Telefónica: 251-6151Fax: 251-6151

Anexo 464e-mail: [email protected]

CENTRO NACIONALDE CONTROL DE CALIDAD

Análisis Físico Químico, Microbiología y Toxicológicopara Control de Calidad de:

lMedicamentos lCosméticoslArtículos Médicos lProductos BiológicoslInsumos para la Industria Farmacéutica

lMaterial Médico QuímicoDefensores del Morro 2268 (ex Huaylas) - Chorrillos

Central Telefónica 467-6696Fax: 467-1216

e-mail: [email protected]

CENTRO NACIONAL DE PRODUCCIONDE BIOLOGICOS

I. BIOLOGICOS DE USO HUMANOlVacunas lAntígenos

lSueros Hiperinmunes AntiponzoñososlReactivos de Diagnóstico

y Venta de Animales de ExperimentaciónII. BIOLOGICOS DE USO VETERINARIO

lVacunas lAntígenos lBacterinaslAnimales de laboratorio

III. ASESORIA EN PRODUCCION DE BIOLOGICOSDefensores del Morro 2268 (ex Huaylas) - Chorrillos

Central Telefónica 467-4499Directo: 467-0552

Fax: 467-0878e-mail: [email protected]

CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOSEN SALUD PÚBLICA

lDiagnóstico Referencial e Investigaciónen Bacteriología, Biología Molecular, Entomología,

Micología, Parasitología, Patología y VirologíalCentro de Vacunación Internacional

y Servicios EspecialesCápac Yupanqui 1400 - Jesús María

Central Telefónica 471-9920Fax: 471-2529

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CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIONY NUTRICION

lInformes de Ensayos y Certificados Físico-QuímicasMicrobiológicas de Alimentos y Muestras Biológicas

lInformes de Inspección de Plantas, Serviciosde Alimentación Colectiva

lMuestreolEvaluaciones Biológicas de Alimentación en Modelo

AnimallCertificado de Inocuidad de Envases Productos

Oleaginosos y No OleaginososlCertificado de Evaluación Sensorial/Panel Adultos

lEvaluación Nutricional Canastas, MenúesTizón y Bueno 276 - Jesús María

Central Telefónica: 463-9588Directo: 261-1131

Fax: 463-9617e-mail: [email protected]

‘‘ INVESTIGAR PARA PROTEGER LA SALUD ’’

65 AÑOS AL SERVICIO DEL PAIS

MINISTERIO DE SALUD

INSTITUTO NACIONAL DE SALUDINSTITUTO NACIONAL DE SALUD

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Rev Med Exp 2000; 17 (1-4)

FENOLOXIDASA MODIFICADA: CLAVE PARA IDENTIFICAR CEPAS DECryptococcus neoformans

Carlos Canelo D1, José Casquero C2.

1 Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos.2 División de Micología, Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pública, Instituto Nacional de Salud.

RESUMEN

Cryptococcus neoformans es la única levadura patógena capaz de sintetizar pigmentos como la melanina mediantela actividad de su enzima llamada fenoloxidasa. El objetivo del presente estudio fue implementar y estandarizar laprueba de la fenoloxidasa, como técnica complementaria en la identificación de cepas de C. neoformans. Se estudiaron21 cepas, identificadas previamente con métodos convencionales.

La prueba de la fenoloxidasa fue modificada debido a que su empleo originaba 9,6% (2/21) de falsa negatividad. Estaprueba modificada se optimizó a 28°C a partir de un medio con baja concentración de glucosa. Ningún aislamientofalso negativo fue encontrado luego de repetir tres veces el ensayo, y el pigmento melanina fue detectado con mayorrapidez.

Palabras claves: Monofenol Monooxigenasa; Cryptococcus neoformans; Pigmentos (fuente: BIREME).

ABSTRACT

Cryptococcus neoformans is the only pathogenic yeast capable of forming melanin pigment by enzymatic activity ofphenoloxidase. The objective of this study was to establish and standardize the phenoloxidase test as a complementarytechnique for identifying C. neoformans strains. We studied 21 strains identified through conventional methods.The phenoloxidase test was modified because its use caused 9,6% (2/21) false negatives. The test was modified andoptimized to 28ºC using a medium with low glucose concentration. No false negative results were found in threerepeated assays using each one of the strains; melanin pigment was quickly detected.

Key Words: Monophenol Monooxigenasa; Cryptococcus neoformans; Pigments (source: BIREME).

INTRODUCCION

Una característica que diferencia las cepas de C. neo-formans patógenas de las no patógenas y otras espe-cies de Cryptococcus, es su habilidad para formar unpigmento marrón o negro (melanina) a partir de compo-nentes difenólicos. Este proceso llamado melanogéne-sis puede realizarse in vitro como una prueba adicionalen la identificación de este hongo. La producción de me-lanina mediante la prueba de la L – DOPA - citrato férrico,es realizada por la enzima difenoloxidasa (laccasa) quepor oxidación convierte las catecolaminas (difenoles) ta-les como la 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA) en dopaqui-nona, siendo este el paso limitante; puesto que, presu-miblemente los siguientes pasos en la vía, tales como elrearreglo de dopaquinona a dopacromo y finalmente laautopolimerización a melaninas, son espontáneas

1, 2, 3.

La asociación del fenotipo melanina y la virulencia del C.neoformans, ha sido reportada por diversos estudios

4,5,6 que

sustentan la hipótesis que el sistema fenoloxidasa cata-liza la producción de pigmentos como la melanina, queprotege al hongo frente a los oxidantes generados porlas células efectoras del huésped.

Mediante estudios con microscopia de transmisión elec-trónica se determinó que la melanina de C. neoformansparece estar concentrada en el lado interno de la paredcelular, localización que le permitiría interactuar con sus-tancias del lado extracelular y prevenir su penetracióndentro de la levadura

3.

Estudios basados en la producción de este pigmentoque permite la identificación de cepas de C. neofor-mans

1,7, y cuyos resultados varían dependiendo de la me-

todología empleada, así como de las condiciones de tempe-ratura y de concentración de Agar Sabouraud Dextrosa (ASD)en que se realizan.

Correspondencia: José Casquero Cavero. Instituto Nacional de Salud.Calle Cápac Yupanqui 1400, Lima 11, Perú. Apartado Postal 471. Telf.:(0511) 4719920 – Fax: (0511) 4710179.Email: [email protected]

TRABAJOS ORIGINALES

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En nuestro medio, no se realiza la prueba de la fenoloxi-dasa como método complementario de identificación decepas de C. neoformans, por lo que el objetivo del pre-sente trabajo fue implementar y estandarizar una técnicapara detectar la actividad de la enzima fenoloxidasa en lalevadura.

MATERIALES Y METODOS

Estudio de tipo descriptivo realizado en 1999. Se em-plearon 21 cepas de C. neoformans las que fueron aisla-das a partir de LCR: 18 de las cuales fueron aisladas depacientes con Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida(SIDA), una de un paciente seronegativo para el virus dela inmunodeficiencia humana (VIH) y, en dos, no se cono-ció el factor predisponente por carecer de datos.

Como controles se emplearon las cepas H – 0058 - 620de Cryptococcus neoformans var. neoformans serotipo Ay H – 0058 - 628 de Cryptococcus neoformans var. gattiiserotipo B. Adicionalmente, se utilizó un aislamiento lo-cal de Candida albicans previamente tipificado.

Las cepas fueron repicadas en tubos con Agar Sabou-raud Dextrosa (ASD) y se incubaron a 28°C por 5 días.Después de haber logrado la reactivación de los cultivos,éstos fueron sembrados en tubos con ASD e incubadosa 28°C por 2 días. Previamente se realizó la identificaciónde las cepas por métodos convencionales

8-11.

PRUEBA DE LA FENOLOXIDASA MODIFICADA

Se estandarizó la prueba de la fenoloxidasa desarro-llada por Kaufmann y Merz

12 a temperaturas de 37°C y

28°C, para lo cual, cada una de las cepas incluidos loscontroles se repicaron en cuatro tubos, dos con ASD al4% y dos con ASD al 0,1%.

Uno de los tubos con ASD al 4% y otro con ASD al 0,1%repicados previamente, fueron incubados a 37°C por 2días. Los dos tubos restantes fueron incubados a 28°Cpor 2 días.

Después de la incubación, las cepas fueron sometidas ala prueba de la fenoloxidasa, la que se realizó por lo me-nos tres veces. Para la realización de esta prueba, serecortó un pedazo de papel Watman N° 1 en cuadraditosde 1 cm2, los cuales se colocaron en una placa de Petriestéril; se envolvió la placa con papel de aluminio y papelkraft, después se autoclavó. Luego con una pinza estérilse colocaron los cuadraditos de papel blanco autoclava-dos en una placa Petri estéril, con una micropipeta seinoculó a cada cuadradito 45 ml de la solución de L –DOPA – citrato férrico y se dejó secar en la incubadora. Seguardaron en frascos de boca ancha de color ámbar.

Los cuadraditos impregnados previamente con la solu-ción de L – DOPA – citrato férrico se humedecieron con25 ml de buffer fosfato, inoculándose 1 a 2 colonias delevaduras de cada cepa en estudio sobre la superficie decada cuadradito de papel humedecido, éstos se coloca-ron en número de seis en cada placa Petri estéril y seincubaron en cámara húmeda, los que fueron inocula-dos con levaduras que crecieron a 37°C ó 28°C fueron incuba-dos a 37°C ó 28°C por 18 h, y se examinaron cada 30 minutos,las tres primeras horas, y luego a las 18 horas en busca de laproducción de un pigmento marrón o negro (reacción positiva).

RESULTADOS

En las 21 cepas de C. neoformans se observaronlevaduras redondas con cápsulas pequeñas mediantela tinción negativa con tinta china, crecimiento a 37°C enASD, incapacidad para producir tubo germinativo en sue-ro humano, no formaron hifas o seudohifas ni clamidos-poras en Agar Corn Meal – Tween 80, y tampoco forma-ron película en caldo. Todas fueron ureasa positiva, y severificó la incapacidad de C. neoformans de reducir elnitrato a nitrito. Respecto al patrón de asimilación de azú-cares, 100% (21/21) de los aislamientos asimilaron laglucosa, galactosa, maltosa y sacarosa, pero no asimi-laron la lactosa. La asimilación de rafinosa fue variable.

PRUEBA DE LA FENOLOXIDASA A 37°C REALIZA-DA EN LAS CEPAS CULTIVADAS EN ASD AL 4%

Al hacer la lectura luego de 3h de incubación, 52,3%(11/21) de las cepas produjeron un pigmento marrón y,luego de 18h de incubación, 90,4% (19/21) produjeroneste pigmento, es decir que, al término de la lectura seencontró 9,6% (2/21) de cepas de C. neoformans falsasnegativas para la prueba de la fenoloxidasa a estas con-diciones. Luego de 90 minutos de iniciada la prueba, lasdos cepas control de C. neoformans produjeron el pig-mento marrón.

PRUEBA DE LA FENOLOXIDASA A 28°C REALIZA-DA EN LAS CEPAS QUE CRECIERON EN ASD AL 4%

Luego de la tercera hora de incubación, 90,4% (19/21)de las cepas fueron positivas a la prueba, y después de18 h de incubación, 100% (21/21) de las cepas produje-ron un pigmento de color marrón oscuro a negro, no en-contrándose, por tanto, ninguna cepa falsa negativa. Alrealizar la lectura a los 60 minutos, las dos cepas controldieron un resultado positivo evidente.

PRUEBA DE LA FENOLOXIDASA A 37°C REALIZA-DA EN LAS CEPAS QUE EN ASD AL 0,1%

La producción de pigmento fue menor, ya que des-pués de la tercera hora de iniciada la prueba, sólo 42,8%(9/21) de las cepas fueron positivas y, después de 18h deincubación, fueron sólo 57,1% (12/21). En estas condicio-nes, la prueba de la fenoloxidasa dió 42,8% (9/21) decepas de C. neoformans falsos negativos. A las dos ho-ras de incubación, una de las cepas control de C. neofor-mans formó pigmento y la otra lo hizo entre las 15 y 18 hde iniciada la prueba.

PRUEBA DE LA FENOLOXIDASA A 28°C REALIZA-DA EN LAS CEPAS QUE CRECIERON EN ASD AL 0,1%

La producción de pigmento fue de 95,2% (20/21) lue-go de 90 minutos de incubación, siendo la cepa restantepositiva entre las 3 y 18h. Es decir, luego de 18 h deempezada la prueba, 100% (21/21) de las cepas de C.neoformans fueron fenoloxidasa positivas. Respecto alas cepas control de C. neoformans, ambas produjeronpigmento marrón oscuro a negro en los primeros 30 mi-nutos de iniciada la prueba.

Los resultados de los diferentes ensayos realizados paraestandarizar la prueba de la fenoloxidasa se muestranen la Tabla 1.

Canelo C. y col.

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La melanina formada por C. neoformans mediante la prue-ba de la fenoloxidasa, realizada a diferentes condicionesde crecimiento del hongo se observan en las Figuras 1 y 2.

DISCUSION

En todos los ensayos para estandarizar la prueba dela fenoloxidasa, se inoculó 45 µl de la solución de L -dopa - citrato férrico y 25 µl de buffer fosfato, por cadacepa en estudio. Estos volúmenes no son críticos para laprueba y fueron empleados en el presente estudio porlos resultados satisfactorios que se obtuvieron en prue-bas anteriores. Sin embargo, estas cantidades puedenser modificadas de acuerdo a los requerimientos de cadalaboratorio.

Uno de los principales aportes de esta investigación esque se encontró un 9,5% (2/21) de aislamientos de C.neoformans falsos negativos en la prueba de la fenoloxi-dasa a 37°C , luego que los aislamientos fueran mante-nidos en ASD al 4%. Este ensayo estuvo basado en lametodología de Kaufman y Merz

12; excepto que, como ellos

no especificaron la concentración de glucosa del ASD ysólo lo mencionaron como tal, se empleó el convencio-nal ASD simple utilizado para el aislamiento, identificacióny mantenimiento de la gran mayoría de hongos patóge-nos. Este agar tiene una concentración igual a 4% deglucosa [peso/volúmen].

Al comparar nuestros resultados con la utilizada en lametodología de Kaufmann y Merz, a 28°C y 37°C en ASDal 0,1% y 4% de concentración de glucosa [peso/volú-men], obtuvimos mejores resultados a 28°C y cuandolas cepas crecieron en ASD al 0,1%. En estas condicio-nes, no se encontró ninguna cepa falsa negativa y losporcentajes acumulados de las cepas positivas a la pru-eba de la fenoloxidasa fueron: 90,4%, 95,2% y 100% luego de30 min - 60 min - 90 min - 2h y 18h de incubación, respec-tivamente (Tabla 1). Además se pudo distinguir que, demanera general, el pigmento producido a 28°C se visua-lizó como manchas de color marrón oscuro a negro in-tenso, lo cual facilitó la lectura (Figura 2).

La producción más rápida de melanina fue a 28°C que a37°C, similar a lo observado por Jacobson

13, quien al

estudiar las actividades de la superóxido dismutasa (SOD)y fenoloxidasa en C. neoformans, encontró que la activi-dad de ésta última era mayor a 25°C que a 37°C. Asímis-mo, Ikeda

14, demostró que la actividad de la fenoloxidasa

cuando es producida en cultivos a 37°C es menor que la

Fenoloxidasa modificada e identificación de C. neoformans

Tabla 1. Comparación de los porcentajes acumulados de las cepas positivas a la prueba de la fenoloxidasa.

a Kaufmann y Merz12

reportaron no haber encontrado ninguna cepa falsa negativa a partir de 30 cepas de origen clínico.b Se encontraron 2/21 cepas falsas negativas, al realizar la prueba de la fenoloxidasa bajo las mismas condiciones descritas por Kaufmann y Merz

12.

c Se encontraron 9/21 cepas con resultados falsos negativos.

Referencia Condición Nº de cepas Porcentaje acumulativo de las cepas positivas

probadas 30 min 60 min 90 min 2 h 3 h 18 h

Kaufmann y Merz21

ASD 4% y 37°C 30 10 32 63 82 100 100ª

Canelo C. (1999) ASD 4% y 37°C 21 9,5 23,8 42,8 47,6 52,3 90,4b

Canelo C. (1999) ASD 0,1% y 28°C 21 90,4 90,4 95,2 95,2 95,2 100

Canelo C. (1999) ASD 4% y 28°C 21 42,8 71,4 76,1 85,7 90,4 100

Canelo C. (1999) ASD 0,1% y 37°C 21 0 9,5 9,5 33,3 42,8 57,1c

Figura 1. Trazas de pigmentación marrón de 5 cepas de C. neoformans parala prueba de la fenoloxidasa a 37° C y en medio ASD al 4%. A la izquierda,el control negativo (Candida).

Figura 2. Manchas de pigmentación oscuro a negro de 5 cepas de C. neoformanspara la prueba de la fenoloxidasa a 28° C en medio ASD al 0,1%. A laizquierda, el control negativo (Candida).

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producida a 25°C, sugiriendo que enzimas químicamen-te distintas (isoenzimas) son sintetizadas a estas tem-peraturas. Estos experimentos apoyan la hipótesis de laregulación de la síntesis de la fenoloxidasa mediante latemperatura, pero la explicación de ello, es todavía des-conocida.

Antes de realizar la prueba de la fenoloxidasa a 28°C, loscultivos fueron mantenidos a esta temperatura por 48hen ASD al 0,1% teniendo en cuenta que en los aislamien-tos primarios en agar Sabouraud Dextrosa simple,C.neoformans var. neoformans crecen bien a 37°C y suscolonias llegan a ser visibles dentro de 2 a 3 días, encambio, muchos aislamientos C. neoformans var. gattiicrecen pobremente a 37°C y puede tomar hasta 4 ó 5días para formar colonias visibles. Es por ello, que lascepas de C. neoformans fueron incubadas a temperatu-ras menores a 37°C y cercanas a sus temperaturas ópti-mas de crecimiento de 30°C a 32°C

7.

La modificación del ASD simple por uno al 0,1% fue plan-teada en este estudio como una alternativa para evitarresultados falsos negativos en la producción de pigmen-tos como la melanina y, estuvo basado en que la fenolo-xidasa de C. neoformans es una enzima constitutiva sesintetiza en la fase estacionaria del crecimiento, cuandola mayor parte de glucosa es consumida. Esto fue obser-vado por Polacheck

4, quien descubrió que la glucosa re-

primía la actividad de la fenoloxidasa, en tanto que, Kwon- Chung y Bennett

7 encontró que una concentración mayor

al 0,1% de glucosa en los medios de cultivos inhiben laformación de melanina.

Para la identificación definitiva de C. neoformans, se in-cluyeron en nuestro estudio, dos pruebas adicionales,una para descartar la presencia de la enzima nitrato re-ductasa, y otra para detectar el pigmento melanina delhongo. Ambas pruebas no son empleadas de rutina enlos laboratorios, debiéndose considerar siempre, pues-to que otra especie de Cryptococcus tal como C. albidusha sido aislada de especímenes clínicos

14.

Mediante el presente trabajo de investigación se estan-darizó y modificó la prueba de la fenoloxidasa desarrolla-da por Kaufmann y Merz

12. El empleo de ésta eliminó los

resultados falsos negativos que eran encontrados con laprueba original y permitió la identificación específica deC. neoformans, puesto que, esta especie es la única den-tro de su género con actividad demostrable de fenoloxi-dasa. La metodología seguida en este trabajo, para laidentificación bioquímica de los aislamientos clínicos, estambién recomendable para aislamientos de origenambiental.

En caso de encontrar, aunque es muy raro, algún aisla-miento sospechoso de Cryptococcus neoformans urea-sa negativa, se sugiere emplear la prueba de la fenoloxi-dasa modificada en el presente estudio, puesto que laproducción de melanina es especifica para esta levadura.

Si la prueba de la fenoloxidasa se realiza a 28°C en elmedio de ASD al 4%, se debe tener en cuenta que unmedio rico en glucosa puede demorar o inhibir la forma-ción de melanina. Si esto ocurriera, se recomienda utili-zar la prueba anterior en el medio de ASD al 0,1%.

Se concluye que la detección del pigmento melaninamediante la prueba de la fenoloxidasa realizada en elmedio de ASD al 0,1% y a 28°C, fue más rápida que larealizada a partir de ASD al 4% y a 37°C, siendo ademásde fácil implementación y sin resultados falsos negativos.

AGRADECIMIENTOS

Nuestro agradecimiento al Instituto Nacional de Salud de Co-lombia por habernos proporcionado las cepas controles H – 0058- 620 de Cryptococcus neoformans var. neoformans serotipo A,y H – 0058 - 628 de Cryptococcus neoformans var. gattii serotipo B.

REFERENCIAS

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Canelo C. y col.

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Rev Med Exp 2000; 17 (1-4)

TIPIFICACION MOLECULAR DEL Vibrio cholerae O1 EN EL PERÚ

José Huguet T1, Isabel Arias B1, Ysabel Montoya P2.

1 Laboratorio de Enteropatógenos, División de Bacteriología, Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pública, Instituto Nacional deSalud.

2 División de Biología Molecular, Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pública, Instituto Nacional de Salud.

RESUMEN

Este estudio de ribotipificación en 75 cepas de Vibrio cholerae O1 permitió identificar tres variantes ribotípicas,referidas como Per1, Per2 y Per3, aisladas durante el periodo 1991 - 1999 en el Perú. La variante Per1 fue reportadatanto en la etapa epidémica y endémica del cólera, mientras que Per2 y Per3 se relacionaron sólo con la etapaendémica. Los resultados mostraron además una aparición constante y mayoritaria de la variante Per1, poniendo enevidencia la emergencia de un mismo grupo clonal en los brotes epidémicos del Perú. Las variantes ribotípicasencontradas fueron comparadas con los ribotipos de diferentes cepas referenciales de V. cholerae previamente carac-terizadas. Se observó una identidad total del ribotipo Per1 con la variante ribotípica de aislamientos Asiáticos (Tailandia),encontrándose además altos índices de similitud entre los ribotipos Per1, Per2 y Per3, y evidenciándose una estrecharelación entre las cepas peruanas y los aislamientos asiáticos.

Palabras claves: Vibrio cholerae; Ribotipificación; ARN ribosómico; Perú (fuente: BIREME).

ABSTRACT

Ribotyping of seventy five Vibrio cholerae O1 strains collected from 1991 to 1999, revealed three different ribotypes,referred to as Per1, Per2 and Per3. Per1 ribotype was found in both the endemic and epidemic periods, while Per2 andPer3 ribotypes were found only in the endemic period. The results showed a more frequent and constant presence ofribotype Per1, and indicated the emergence of the same clonal group in the aforementioned outbreaks. At the same time,new ribotypes were compared against ribotypes from previously characterized V. cholera referential strains. Thecomparative analysis using similar ratios revealed a total coincidence between Per1 ribotype and the ribotype fromThailand isolates, exhibiting high similarity ratios between Per1, Per2 and Per3 ribotypes. This finding supports theclose relationship between Peruvian and Asian strains of V. cholerae.

Key words: Vibrio cholerae; Ribotyping; RNA, ribosomal; Peru (source: BIREME).

Correspondencia: José Huguet Tapia. Instituto Nacional de Salud. CalleCápac Yupanqui 1400, Lima 11, Perú. Apartado Postal 471. Telf.: (0511)4719920 - Fax: (0511) 4710179.Email: [email protected]

INTRODUCCION

En 1991, el cólera apareció en forma epidémica envarias ciudades de la costa del Perú. El establecimientode reservorios para el Vibrio cholerae, favorecido, entreotros factores, por la existencia de malas condicioneshigiénico-sanitarias en la población, propiciaron los pro-cesos de recombinación genética entre cepas de V.cholerae, dando origen a la aparición de variantes, quepasarían inadvertidos debido a que no se cuenta contécnicas modernas para su detección.

En la actualidad, los métodos que analizan directamenteel ADN o ARN de los organismos han mostrado resulta-dos promisorios en el estudio epidemiológico del cóle-

ra1,2,3. El análisis en longitud de fragmentos de restric-ción (RFLP), es uno de los métodos más usados en lacaracterización de varios microorganismos de importan-cia médica. La agrupación de bacterias en un sistema detipificación usando sondas de genes que codifican el ARNribosomal, se denomina ribotipaje.

El presente trabajo tiene como objetivo describir la varia-bilidad genética en los aislamientos de V. cholerae ocu-rridos en el Perú durante la última década. Buscamos,mediante patrones moleculares, caracterizar las cepasde V. cholerae y correlacionar la variabilidad genética en-contrada a la curva epidemiológica de enfermedad entre1991-1999. Asímismo, buscar similitudes genotípicasentre cepas peruanas y aislamientos de otros lugares anivel mundial, utilizando como referencia en banco dedatos para patrones de hibridación, originados a partirdel gen codificante del ARN ribosomal 16S3.

Huguet J. y col.

10

Rev Med Exp 2000; 17 (1-4) Huguet J. y col.


SELECCIÓN DE CEPAS DE Vibrio cholerae O1

Todas las cepas fueron obtenidas del cepario del La-boratorio Referencial de Enteropatógenos del Instituto Na-cional de Salud.

Tomando en cuenta la naturaleza descriptiva del trabajo,se consideraron como puntos de referencia 11 departa-mentos del territorio peruano que reportaron casos decólera entre el periodo 1991-1999. Los puntos de refe-rencia fueron: Lima, La Libertad, Piura, Huancayo, Junín,Ayacucho, Puno, Ancash, Cusco, Cajamarca e Iquitos.Luego, el proceso de selección de cepas fue realizadoen forma aleatoria tomando en cuenta los brotes epidé-micos reportados en cada año de estudio. Las cepasfueron reactivadas en caldo alcalino peptonado y TCBSagar. Se excluyeron aquellas cepas que no presentabaninformación completa y detallada de la fecha y lugar deaislamiento, serogrupo y biotipo. A partir de estos proce-dimientos se seleccionaron un total de 75 cepas de Vibriocholerae O1.

Cada cepa fue codificada con las tres primeras letras dellugar de procedencia, seguidas del año de aislamiento yun número de orden respectivo (Tabla 1).

Las cepas de referencia utilizadas fueron: Cepa Vibriocholerae O1 ATCC14033. Biotipo El Tor, serotipo Inaba;Vibrio cholerae O139 Bengal tipificada y Cepa Vibriocholerae NoO1 tipificada y una cepa de Vibrio mimicus.Asímismo, se utilizaron esquemas ribotípicos anterior-mente reportados para realizar las comparaciones res-pectivas3.

PROCEDIMIENTOS

Extracción de ADN genómicoPara la extracción de ADN genómico se utilizó el mé-

todo fenol/cloformo4. Primero, se centrifugó 5 mL de sus-pensión bacteriana y el sedimento fue resuspendido ensolución de lisis conteniendo lisozima; posteriormente,se adicionó lauril sulfato de sodio (SDS) y proteinasa Kllevando a 65°C durante 2 horas. EL ADN fue extraídocon fenol/cloroformo, precipitado con etanol y resupendidoen agua tridestilada.

RibotipificaciónEl ADN obtenido de cada de V. cholerae fue

ribotipificado mediante el método descrito por Popovic3,digiriendo 8 mg de ADN con 5 U de enzima BglI durante 2horas. Posteriormente, los productos de restricción fue-ron sometidos a electroforesis en un gel de agarosa al1% y transferidos a una membrana de nylon mediante elmétodo de Southern blot5. Los productos de digestiónfijados en la membrana fueron hibridados con una son-da de ~1480 bp, correspondiente al gen codificante delARN ribosomal 16S (ADNr 16S) (Figura 1). El métodoutilizado fue el método quimioluminiscente6. La sondadel gen ADNr 16S fue obtenida mediante reacción en

cadena de la polimerasa (PCR), a partir de ADN de V.cholerae, utilizando iniciadores universales para su am-plificación7. Estos iniciadores utilizados fueron: RIBF5'AGAGTTGATMTGG3’ y RIBR5’ TACCTTGTTACGACTT3’; yel protocolo para la reacción en cadena de la polimerasafue: denaturación inicial 95°C por 5 minutos, luego 30veces el siguiente ciclo: 95°C por 30 segundos, 33°C por1,5 minutos y 72°C por 2 min. Finalmente se realizó unaextensión final a 72°C por 10 minutos. Toda la reacción sellevo a cabo en un termociclador Genamp 2400.

El proceso de hibridación con la sonda y los productosde restricción se llevó a cabo a 42°C durante 4 horas.Finalmente, la detección de la hibridación se reveló porautoradiografía4, observándose un patrón de bandas paracada cepa de V. cholerae. Cada variante obtenida porribotipificación (ribotipo) fue rotulada con las iniciales Per,seguida del código respectivo que identificaba la fecha ylugar de aislamiento.

Cálculo de cladogramasLos perfiles de hibridación obtenidos en el film fueron

esquematizados, alineando cada banda y tomando comoreferencia los pesos moleculares del marcador l HindIII.Todas las cepas ribotipadas fueron esquematizadas ycomparadas con las cepas ATCC14033, BengalO139 yV. cholerae NoO1. Las comparaciones con aislamientosa nivel mundial fueron realizadas utilizando como refe-rencia los esquemas de ribotipos reportados, en los cua-les se incluía una cepa V. cholerae Perú 19913.

Los índices de similitud para el cálculo de cladogramasfueron obtenidos usando la relación:

[número de bandas comunes de A y B]Indice entre A y B =

[(Número de bandas de A) + (número de bandas de B) -(número de bandas comunes de A y B)]8.

Los cladogramas fueron diseñados ordenando los índi-ces de similitud por cada patrón ribotípico en una tablade doble entrada, utilizando como interfase el editor detextos NOTEPAD (Windows 97) y archivándolo en formatoTXT. El archivo TXT fue evaluado con el algoritmo "Méto-do de emparejamiento por pares usando promedios arit-méticos" (UPGMA-Unweighted pair group method usingarithmetic average)9.

Figura 1. Representación esquemática del gen rDNA16S, rDNA23S y rDNA5Sbacteriano. Para el presente estudio se amplificó casi la totalidad del genrDNA16S utilizando los iniciadores (indicados con las flechas) RIBF y RIBR.Mediante PCR se obtuvo la sonda de ~1480 bp.

RIBF

RIBR

rDNA16 S rDNA23S rDNA5S

1544 bp ~2900 bp 120 bp

Espacio intergénico (431-711

b )

S

bp.)

bp

11

Rev Med Exp 2000; 17 (1-4)

CODIGO LUGAR Fecha de aislamiento SEROTIPO REPORTADO RIBOTIPO Lib911 Lima Feb-91 Inaba Per1 Lib912 Lima Feb-91 Inaba Per1 Lib913 Lima Feb-91 Inaba Per1 Pun911 Puno Feb-91 Inaba Per1 Lib911 La libertad Mar-91 Inaba Per1 Lib912 La libertad Oct-91 Inaba Per1 Iqu911 Iquitos Sep-91 Inaba Per1 Iqu912 Iquitos Sep-91 Inaba Per1 Hua911 Huancayo Mar-91 Inaba Per1 Piu911 Piura Oct-91 Inaba Per1 Piu912 Piura Mar-91 Inaba Per1 Piu912 Piura Mar-91 Inaba Per1 Lim914 Lima Ene-91 Inaba Per1 Lim921 Lima Mar-92 Inaba Per1 Lim922 Lima Ene-92 Inaba Per1 Lim923 Lima Ene-92 Ogawa Per1 Lib921 La libertad Feb-92 Inaba Per1 Lib922 La libertad Feb-92 Ogawa Per1 Iqu921 Iquitos Ene-92 Ogawa Per1 Pun921 Puno Ene-92 Inaba Per1 Pun922 Puno Ene-92 Inaba Per1 Pun923 Puno Ene-92 Inaba Per1 Hua921 Huancayo Feb-92 Inaba Per1 Hua922 Huancayo Feb-92 Inaba Per1 Jun921 Junin Feb-92 Inaba Per1 Piu921 Piura Mar-92 Ogawa Per1 Lim931 Lima Ene-93 Ogawa Per2 Lim932 Lima Ene-93 Ogawa Per3 Lim933 Lima Ene-93 Inaba Per1 Lim934 Lima Ene-93 Ogawa Per1 Lim935 Lima Ene-93 Ogawa Per1 Lim941 Lima Ene-94 Ogawa Per2 Lim942 Lima Ene-94 Ogawa Per3 Lib941 la Libertad Feb-94 Ogawa Per1 Lib942 La libertad Mar-94 Ogawa Per1 Lim951 Lima Mar-95 Ogawa Per2 Lim952 Lima Feb-95 Ogawa Per1 Aya951 Ayacucho Feb-95 Ogawa Per1 Aya952 Ayacucho Feb-95 Ogawa Per1 Anc951 Ancash(Chimbote) Mar-95 Ogawa Per1 Anc951 Ancash(Chimbote) Mar-95 Ogawa Per1 Anc953 Ancash(Chimbote) Mar-95 Ogawa Per2 Lim961 Lima Feb-96 Ogawa Per1 Lib961 La libertad Abr-96 Ogawa Per2 Lib962 La libertad Abr-96 Ogawa Per1 Lim962 Lima May-96 Ogawa Per1 Lim971 Lima Dic-96 Ogawa Per1 Cus971 Cusco Oct-97 Ogawa Per1 Lib971 La libertad Oct-97 Ogawa Per1 Cus972 Cusco Oct-97 Ogawa Per1 Pun971 Puno Oct-97 Ogawa Per1 Iqu971 Iquitos Oct-97 Ogawa Per1 Lib972 La libertad Oct-97 Ogawa Per1 Lim972 Lima Feb-98 Ogawa Per1 Lim981 Lima Feb-98 Ogawa Per1 Lim982 Lima Mar-98 Ogawa Per1 Lim983 Lima Mar-98 Ogawa Per1 Lib981 La libertad Feb-98 Ogawa Per1 Cus981 Cusco Feb-98 Ogawa Per1 Cus982 Cusco Feb-98 Ogawa Per1 Cus983 Cusco Ene-98 Ogawa Per1 Caj981 Cajamarca Ene-99 Ogawa Per1 Jun981 junin Feb-98 Ogawa Per1 Jun982 Junin Feb-98 Ogawa Per1 Iqu981 Iquitos Ene-98 Ogawa Per1 Iqu982 Iquitos Feb-98 Ogawa Per1 Hua981 Huancayo Feb-98 Ogawa Per1 Hua982 Huancayo Mar-98 Ogawa Per1 Hua983 Huancayo Mar-98 Ogawa Per1 Hua984 Huancayo Mar-98 Ogawa Per1 Aya991 Ayacucho Ene-99 Ogawa Per1 Lim991 Lima Ene-99 Ogawa Per1 Caj991 Cajamarca Ene-99 Ogawa Per1

RESULTADOS

Tres perfiles ribotípicos distintos fueron observadosen las 75 cepas evaluadas. El perfil ribotípico predomi-nante en las cepas de V. cholerae fue Per1, alcanzando92% del total de cepas seleccionadas y apareciendo entodos los años con la mayor frecuencia. Los ribotiposrestantes (Per2, Per3) se presentaron en menor númeroy estuvieron relacionados a los años 1993, 1994, 1995 y1996, apareciendo tanto en aislamientos de Lima comodel norte del País (Tabla 1).

Tabla 1. Distribución de ribotipos encontrados por lugar y tiempo.

Tipificación molecular en Vibrio cholerae O1

El ribotipo Per1 mostró un patrón de nueve bandas defi-nidas (8,0; 6,8; 6,6; 5,8; 5,6; 4,0; 3,5; 3,0 y 2,3 Kb), elribotipo Per2 mostró un patrón de 10 bandas definidas(8,0; 6,8; 6,6; 5,8; 5,6; 5,0; 4,0; 3,5; 3,0 y 2,3 Kb), y el ribotipoPer3 mostró un patrón de 9 bandas definidas (8,0; 6,8;6,6; 5,8; 5,6; 5,0; 4,0; 3,5 y 3,0 Kb) (Figura 2).

Para la cepa ATCC 14033 se obtuvo un patrón de RFLPsimilar al ribotipo Per1, con la diferencia en la ausenciade la banda de 6,6 Kb y la presencia de la banda de 5,0kb. Para la cepa O139 Bengal se obtuvo un patrón debandas similar a la variante Per1, con la adición de dosbandas de 12 y 7,5 Kb. Para la cepa NoO1 se obtuvo unpatrón distinto a las cepas anteriormente evaluadas, consolo tres bandas en común de 8,0; 3 y 2,3 Kb. con lasvariantes Per1 y Per2. No se encontró similaridad enninguno de los casos con la cepa de Vibrio mimicus.(Figura 2 y 3).

Fig. 3. Ribotipos encontrados para cepas ATCC 14033, Vibrio choleraeNoO1 y Vibrio cholerae Bengal O139. Figura A: Film autoradiográfico. FiguraB: Esquema ribotípico. El esquema representa las bandas de hibridacióncomunes para las variantes encontradas y las cepas ATCC 14033 y O139Bengal. Carril 1: Ribotipo Per1, Carril 2: Ribotipo encontrado para cepa Vibriocholerae ATCC 14033, Carril 3: Ribotipo encontrado para cepa Vibrio choleraeO139, Carril 4: Ribotipo encontrado para Vibrio mimicus (cepa referencial).Carril 5: Ribotipo encontrado para Vibrio cholerae NoO1.

Figura 2. Ribotipos encontrados para cepas de Vibrio cholerae. Figura A:Film autoradiográfico, Figura B: Esquema ribotípico. En las figuras se muestranlos ribotipos Per1, Per2 y Per3 con sus respectivos esquemas, los cualesindican los pesos moleculares de las bandas de hibridación.

8.0 Kb.

6.8 Kb.6.6 Kb.5.8 Kb.5.6 Kb5.0 Kb4.0 Kb.

3.5 Kb.3.0 Kb

2.3 Kb.

8.0 Kb.

6.8 Kb.6.6 Kb.5.8 Kb.5.6 Kb5.0 Kb4.0 Kb.

3.5 Kb.3.0 Kb

2.3 Kb.

A B

2.3 Kb.

23.1 Kb.

9.4 Kb.

6.6 Kb.

4.3 Kb.

A B

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

12

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Figura 4. Cladograma de ribotipos peruanos y cepas ATCC 14033, NoO1 yBengal: El cladograma grafica los índices de similitud calculados para lascepas evaluadas, relacionándolas en grupos muy cercanos a las variantesencontradas y a las cepas ATCC14033 y O139 Bengal. Deja en una ramaaparte a la cepa no toxigénica NoO1: Per1, Per2 y Per3 ribotipos encontra-dos en la presente tesis. O139: cepa Bengal O139 ribotipada. ATCC14033:cepa referencial de Vibrio cholerae toxigénico O1. NoO1: cepa no toxigénicade Vibrio cholerae. La escala en la parte inferior indica las medidas desimilitud entre las variantes evaluadas.

Un segundo cladograma mostró dos grupos bien dife-renciados (Grupo Clásico y Grupo El Tor). El grupo deno-minado Clásico involucró aislamientos de brotes en In-dia 1960, 1949, 1941, 1940, y Bangladesh 1960 y 1972.En tanto que el grupo denominado El Tor involucró a ce-pas relacionadas con la séptima pandemia, en las quese destacó las cepas aisladas en brotes peruanos.

Los análisis de los ribopatrones indicaron una identidadtotal del ribotipo Per1 con el ribotipo de los aislamientosPerú 1991 y Tailandia 1991, estudiados por Popovic3.

Dentro del grupo el Tor se pudo establecer subgrupos,en los cuales se relacionó a los tres ribotipos encontra-

dos en el presente estudio. Estos tres ribotipos se en-contraron en un mismo clado junto con aislamientos deFilipinas y Ruanda, indicando además una alta similitudcon los aislamientos asiáticos (1992) y con Islas del Pa-cifico Sur - Islas Gilbert - Oceanía (1977). Otros aisla-mientos relacionados a las variantes peruanas fueronCalifornia (1991), Hawai (1991), Rumania (1991) y unacepa aislada de un brote en Guatemala, en 1990 (Figura 5).

DISCUSION

Revisando la distribución de los ribotipos encontra-dos destaca la aparición constante de Per1 en todos loslugares estudiados, evidenciándose su distribución uni-forme y mayor frecuencia. Los dos restantes ribotiposPer2 y Per3, aparecieron también en diferentes lugaresdel Perú, aunque con una menor frecuencia de presenta-ción.

La presencia de un ribotipo dominante Per1 reportado enel presente trabajo, reafirma el momento endémico delcólera en el Perú. Trabajos anteriores también publicanla presencia constante de este ribotipo Per13,11, reforzan-do la teoría que en cada brote epidémico ocurrido enLatinoamérica reemerge la misma variante genética deV. cholerae.

Partiendo del análisis de patrones numéricos y obtenien-do los índices de similitud, se calculó el cladograma, elcual graficaba la similitud entre los ribotipos obtenidos ylas cepas referenciales de V. cholerae (ATCC14033,NoO1 y O139 Bengal). Los resultados agruparon a losribotipos obtenidos junto con las cepas de V. choleraeATCC 14033 y también con la cepa O139 Bengal, dejan-do en una rama distante a la cepa de V. cholerae NoO1.Los ribotipos Per2 y Per3 fueron subagrupados en unarama, relacionándose en similitud con el ribotipo Per1 yla cepa referencial ATCC 14033 (Figura 4).

Per3

Per2

ATCC

Per1

14033

0139

No01

0.1

Figura 5. Cladograma de similitud entre cepas referenciales y aislamientosperuanos ribotipados: El cladograma agrupa a las variantes ribotípicas en-contradas en el presente trabajo junto con los aislamientos de Islas Gilberty Tailandia. Además se representa la diferencia encontrada entre los Vibriosbiotipo El Tor y El Clásico. Ribotipos encontrados en el presente trabajo:Per1, Per2 y Per3. Ribotipos de cepas referenciales biotipo El Tor: Per91(Perú 1991), Tha91 (Tailandia 1991), IsGil66 (Islas Gilbert-Oceanía 1966),Ruanda88 (Ruanda 1988), Filip63 (Filipinas 1963), Guate20 (Guatemala 1990),Hawaii91(Hawai 1991), Rumania91 (Rumania 1991), Califo91 (California 1991),Lou78 (Lousiana 1978), Austral84 (Australia 1984), Austral77 (Australia1977). Ribotipos de cepas referenciales biotipo Clásico: IndC41b (India1941), IndC41a (India 1941), BanglaC72 (Bangladesh 1972), India60 (India1960), BanglaC60 (Bangladesh 1960); IndC49(India 1949) India40(India 1940).La escala en la parte inferior indica las medidas de similitud entre lasvariantes evaluadas.

Per91/Tha91

Per1

IsGil66

Per3

Per2

Ruanda88

Filp63

Guate90

Hawaii91

Rumania91

Califo91

Lou78

Austral84

Austral77

IndC41b

IndC41a

BanglaC72

India60

BanglaC60

IndC49

India40

Biotipo El Tor

Biotipo Clásico

0.1

13

Rev Med Exp 2000; 17 (1-4)

En cuanto a la distribución cronológica, Per1 mantieneuna frecuencia alta, estando relacionada con el inicio dela epidemia en el Perú y los últimos brotes reportados en1999; en tanto que las variantes encontradas Per2 y Per3fueron aisladas en los años 1993, 1994, 1995 y 1996, yse correlacionan con el descenso de la curva epidémicay emergen a comienzos de una etapa endémica en elPerú.

Utilizando relaciones basadas en índices de similitud secorrobora a la epidemia latinoamericana del cólera comouna extensión de la séptima pandemia, agrupándose alos ribotipos encontrados en un grupo homogéneo deri-vado de cepas asiáticas, ya descritas con anterioridadpor otros autores3.

Los resultados obtenidos al agrupar los patrones de re-ferencia en el ámbito mundial con los ribotipos obteni-dos en el presente trabajo coinciden con la agrupaciónfenotípica de Vibrios en lo que respecta al biotipo. Todaslas variantes de V. cholerae pertenecientes al biotipo Clá-sico se agrupan en una rama mayor, mientras que lasvariantes pertenecientes al grupo El Tor pertenecen a ungrupo homogéneo, como se describió anteriormente.Adicionalmente, se presenta una subagrupación en lasvariantes del grupo El Tor, encontrándose posibles rela-ciones entre epidemias provocadas por la misma cepa(Per1/Tha91)3,12, brotes aislados (Guate90)3 o variantesprovenientes de reservorios o zonas endémicas de cóle-ra (Austral77, Austral84)3. Esta correlación demuestra laeficacia del método de ribotipaje cuando se utiliza unbanco de variantes como referencia y se compara connuevo ribotipos encontrados. Ello debido a la excelenterepetitividad de la prueba y su aceptable discriminación.

El análisis entre ribotipos encontrados en cepas perua-nas y cepas de referencia Bengal y NoO1 indican una altasimilitud entre la cepa O139 con el grupo al que pertene-cen las cepas peruanas, encontrándose más alejado elgrupo de las cepas NoO1. Este hecho corrobora los re-sultados obtenidos por otros autores, respecto a la rela-ción entre cepas toxigénicas O1 de V. cholerae y la ceparesponsable de epidemias en Asia O139 - Bengal10,11.

Se reconoce variabilidad en las poblaciones de V.cholerae O1 en el Perú, encontrándose tres variantesribotípicas muy similares entre sí y relacionadas con ais-lamientos asiáticos de la séptima pandemia del cólera.Sin embargo, cabe mencionar que la variante Per1 seencuentra relacionada a la mayoría de brotes epidémi-cos de cólera en el país, lo cual también es corroboradopor un estudio realizado en la ciudad de Lima en el perio-do 1991-199511.

En la actualidad se están empleando nuevas metodologíasque permiten una mayor discriminación entre cepasbacterianas. La electroforesis en campo pulsado es unade las técnicas que ha cobrado una mayor importanciaen la tipificación de bacterias11 y otras, como el polimorfismoen longitud de fragmentos amplificados (AFLP - Amplified-

fragment length polymorphism)12 también está siendocada día mas usada. Sin embargo, la ribotipifcación nodeja de ser una herramienta de suma importancia para elestudio en la variabilidad y epidemiología del cólera y otrasenfermedades transmisibles, repotenciando lasmetodologías convencionales para el estudio de epidemias.

Finalmente, teniendo en cuenta las comparaciones en-tre serogrupos, serotipos, biotipos y ribotipos se podríaestablecer el sistema de ribotipificación como una nuevaescala para la identificación y taxonomía en V. cholerae.

REFERENCIAS

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Tipificación molecular en Vibrio cholerae O1

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CONTROL DE CALIDAD DE DISCOS DE SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICACOMERCIALIZADOS EN EL MERCADO PERUANO (1998-1999)

George Obregón B1, Alfonso Zavaleta M2.

1 División de Garantía de la Calidad, Centro Nacional de Control de Calidad, Instituto Nacional de Salud.2 Departamento de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia.

RESUMEN

Objetivo: Se realizó el control de calidad de los discos utilizados en la evaluación de la sensibilidad demicroorganismos patógenos frente a los antibióticos. Materiales y métodos: Se evaluó la calidad de 36 lotes de discosde sensibilidad antibiótica de cinco marcas de diverso origen de fabricación, comercializadas en el mercado peruano,empleando la norma M2-A5, Suplemento M100-S7 del NCCLS (método de Kirby–Bauer). Se evaluaron lotes de discosde amicacina, amoxicilina/ácido clavulánico, ampicilina, ceftazidima, cefuroxima, cloranfenicol, eritromicina,estreptomicina, gentamicina y penicilina. Los resultados fueron comparados con los valores indicados en la norma,utilizando para ello la prueba de límites de confianza (t0,05). Resultados: 41,7% del total de lotes de discos evaluadoscumplieron los requisitos de la norma; 48,3% de los lotes de discos de fabricación extranjera evaluados cumplieroncon dichos requisitos, a diferencia de los discos nacionales, los cuales no cumplieron con los parámetros de la normaen ninguno de los casos. Conclusiones: La elevada proporción de discos no conformes sugiere que la calidad de losdiscos de sensibilidad antibiótica comercializados en el Perú no es la óptima, por lo que es necesario realizar monitoreosy controles periódicos a fin de asegurar la calidad de este producto en el mercado peruano.

Palabras clave: Control de calidad; Antibióticos; Perú (fuente: BIREME).

ABSTRACT

Objective: We performed quality control testing of the disks used to assess the susceptibility of pathogenic microor-ganisms to antibiotics. Materials and Methods: The quality of 36 lots of antibiotic sensitivity disks of five different brandstraded in the Peruvian market was assessed using NCCLS¨s (Kirby-Bauer technique) M2-A5, supplement M100-S7standard. Lots of disks of Amicacine, Amoxiciline/Clavulánic Acid, Ampiciline, Ceftazidime, Cefuroxime, Cloranphenicol,Erithromicyn, Estreptomicyn, Gentamicyn and Penicillin were assessed. The findings were compared to the valuesstated in the standards, using the Confidence Limits Test (t0.05). Findings: 41,7% of the lots of disks assessed met therequirements stated by the standards; 48.3% of the disks manufactured abroad met the aforementioned requirements.On the other hand, none of the disks manufactured in Perú met the requirements. Conclusions: The high proportion ofdisks that do not meet the requirements point out that the quality of the antibiotic sensitivity disks available in Perú is notoptimal and that, in order to assure the quality of this product in the Peruvian market, surveys and controls should beperformed periodically.

Key words: Quality control; Antibiotic; Peru (source: BIREME).

INTRODUCCIÓN

El creciente aumento de microorganismos resistentesa los antibióticos en el mundo, como consecuencia deluso indiscriminado o no racional de los antibióticos, tantoen medicina humana como en medicina veterinaria, hanocasionado la aparición de cepas seleccionadas degérmenes resistentes asociados a patologías severas, y

en ocasiones, epidemias asociadas a un incremento dela mortalidad producto de las infecciones ocasionadaspor estos gérmenes1,2,3. Ello trajo consigo, elestablecimiento, desde 1977, en varios países, deprogramas nacionales de farmacovigilancia, y la creaciónde programas nacionales de resistencia de bacteriana alos antibióticos, sobre todo, de aquellas que provocanlas denominadas infecciones intrahospitalarias (IIH).

La metodología empleada por los programas de vigilanciaincluye las técnicas de difusión en agar, susceptibles deestandarización y control, y que proporcionan resultados

Correspondencia: George Obregón Beltran. Centro Nacional de Control deCalidad. Instituto Nacional de Salud. Av. Defensores del Morro 2268 (exHuaylas), Chorrillos, Perú. Telf.: (0511) 4676669 – Fax: (0511) 4671216.Email: [email protected]

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precisos y claros que pueden ser comparados4,5,6. Enese contexto, en 1966, la Organización Mundial de laSalud (OMS) recomendó la utilización con fines clínicosdel método modificado por Kirby-Bauer para discos desensibilidad antibiótica (DSA) debido a su sencillez yreproducibilidad7,8. Asímismo, la Administración deAlimentos y Drogas de los Estados Unidos deNorteamérica (FDA), publicó en 1972 el primer métodonormalizado internacionalmente, el que luego esadoptado en 1990, con pequeñas modificaciones, por elComité Nacional para Estándares de Laboratorio Clínicode los Estados Unidos de Norteamérica (NCCLS). Eneste procedimiento se establecen los parámetrosmicrobiológicos para la evaluación de los DSA.

En la actualidad, la prueba de sensibilidad antimicrobiana,está regulada por la norma M2-A7, Suplemento M100-S10, aprobada el año 2000 por el NCCLS9, siendo este elmétodo de difusión de discos descrito de manera máscompleta, para el cual se han desarrollado tablas deinterpretación, respaldadas por datos clínicos y delaboratorio realizados en diversos hospitales einstituciones de salud en los EE.UU. Este método esutilizado para microorganismos de crecimiento rápido yha sido modificado para microorganismos de crecimientofastidioso, sin embargo, aún no se han desarrolladoestándares reproducibles para la interpretación de losresultados de algunos microorganismos (p. ej. Coryne-bacterium spp, Bacillus spp, Campylobacter). Asimismo,la obtención de resultados satisfactorios con las cepaspatrones de control de calidad no garantiza que seobtendrán también resultados satisfactorios con losaislamientos clínicos. Sin embargo, las principalesventajas de este método radican en ser una normainternacional estandarizada, validada y de amplia difusióna nivel mundial.

En el mercado peruano se pueden obtener comercial-mente DSA de fabricación nacional, chilena, norteameri-cana, francesa y británica. Cabe mencionar, que nuestropaís carece de una norma técnica para la evaluación dedichos productos. En reporte previo sobre la calidad delos DSA comercializados en el mercado peruano, se ana-lizaron 24 lotes de 18 discos comerciales pertenecientesa dos marcas (una nacional y otra norteamericana),obteniéndose que sólo la mitad de los lotes evaluadoscumplieron con los requisitos de calidad exigidos en lanorma M2-A5, Suplemento M100-S710, mientras que66,7% del total de DSA norteamericanos ensayados cum-plieron con dicha norma. Sobre la base de estos resulta-dos se sugirió la realización de un mayor número de eva-luaciones con el objetivo de conocer la real calidad de losDSA comercializados en el mercado nacional11. El pre-sente estudio aplicó los criterios establecidos en la nor-ma M2-A5, Suplemento M100-S710 del NCCLS a 36 lotesde DSA de 5 marcas comercializadas en el mercado na-cional, evaluadas durante el período agosto 1998 – agosto1999.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se evaluaron un total de 36 lotes de DSA de 5 marcasdisponibles en el mercado peruano: Emerme (Perú, 5lotes), Sensidiscos-EMV (Chile, 8 lotes), Oxoid (Inglate-rra, 7 lotes), y 2 de origen norteamericano (8 lotes de lamarca BBL y 8 lotes de la marca Difco). Los lotes de DSAevaluados fueron proporcionados por diversos provee-dores de DSA comerciales. La muestra fue seleccionadapor muestreo aleatorio simple. Todos los discos se en-sayaron siguiendo los criterios establecidos por la nor-ma M2-A5: “Normas para el desempeño de pruebas dediscos de sensibilidad antimicrobiana” del NCCLS10.

En el estudio se evaluaron discos conteniendo amicacina30 µg, amoxicilina/ácido clavulánico 20/10 µg, ampicilina10 µg, ceftazidima 30 µg, cefuroxima 30 µg, cloranfenicol30 µg, eritromicina 15 µg, estreptomicina 10 µg,gentamicina 10 µg y penicilina 10 UI. Los discos nacio-nales analizados presentaron fechas de expiración parael año 1999, los discos de fabricación chilena fecha deexpiración para el año 2000, los discos británicos fechasde expiración comprendidas entre los años 2000-2001,los discos norteamericanos marca BBL fechas de expi-ración comprendidas entre los años 2000-2001, y losdiscos norteamericanos marca Difco fechas de expira-ción entre los años 2000-2002.

Los discos fueron enfrentados a cepas de Escherichiacoli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853y Staphylococcus aureus ATCC 2592310 y los diámetrosde los halos de inhibición de los DSA registrados en losanálisis de control de calidad, fueron comparados conlos registros de los diámetros de zona indicados en lanorma M2-A5, Suplemento M100-S7, utilizándose paraello la prueba de límites de confianza (t0,05) y la distribu-ción t de Student. Para la conformidad de los discos eva-luados se siguieron los siguientes criterios:

- Cuando los valores registrados del diámetro de lazona de inhibición antimicrobiana (mm) cumplen conlos valores indicados en la norma M100-S10 delNCCLS; y

- De cada 20 repeticiones de discos de sensibilidadantimicrobiana evaluados con un determinado mi-croorganismo de control, sólo un resultado puedesalir defectuoso.

Además, si el diámetro de la zona de inhibición antimicrobianaexcedió en 1 mm en el límite superior o fue menor en 1mm en el límite inferior del diámetro de zona indicado enla norma, el resultado fue considerado no conforme10.

Finalmente, con la intención de comparar la variabilidadde los rangos del diámetro de la zona de inhibiciónantimicrobiana de los discos analizados, se realizó elanálisis de coeficiente de variabilidad (CV)12.

Control de calidad de DSA

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RESULTADOS

Los resultados de la evaluación de la calidad de losDSA se muestran en las Tablas 1 a 5.

En la tabla 1 se muestran los resultados de la evaluaciónde DSA nacionales, apreciándose la no conformidad con

los parámetros de la norma en ninguno de los casos.

En la tabla 2 se registran los resultados de los DSA chile-nos (Sensidiscos-EMV), mostrando valores de no con-formidad en la mitad de los casos (50,00%).

V.E = Valores experimentales.V.T = Valores Teóricos (Norma M2-A5, Suplemento M100-S7, NCCLS).

Tabla 1. Valores registrados de límites de confianza de los diámetros de zona de los discos de sensibilidad antibiótica de fabricación nacional (Emerme).

V.E = Valores experimentales.V.T = Valores Teóricos (Norma M2-A5, Suplemento M100-S7, NCCLS).

Tabla 2. Valores registrados de límites de confianza de los diámetros de zona de los discos de sensibilidad antibiótica de fabricación chilena (Sensidiscos-EMV).

V.T V.E V.T V.E V.T V.E

Amicacina 30 mg 19,0 - 26,0 17,9 - 26,1 18,0 - 26,0 13,7 - 24,2 20,0 - 26,0 15,8 - 22,4 No conforme

Cloranfenicol 30 mg 21,0 - 27,0 24,9 - 31,6 - - 19,0 - 26,0 20,2 - 28,2 No conforme

Estreptomicina 10 mg 12,0 - 20,0 19,9 - 24,1 - - 14,0 - 22,0 10,0 - 14,6 No conforme

Gentamicina 10 mg 19,0 - 26,0 20,0 - 27,1 16,0 - 21,0 10,7 - 19,6 19,0 - 27,0 18,1 - 27,5 No conforme

Penicilina 10 UI - - - - 26,0 - 37,0 45,3 - 51,4 No conforme

LÍMITES DE CONFIANZA

t0,05(AL 95% DE PROBABILIDAD) (mm)DISCO DE

SENSIBILIDAD

ANTIBIÓTICAOBSERVACIONES

E. coli

ATCC 25922

P. aeruginosa

ATCC 27853

S. aureus

ATCC 25923


Amicacina 30 mg 19,0 - 26,0 18,7 - 25,4 18,0 - 26,0 19,1 - 21,4 20,0 - 26,0 19,3 - 23,0 Conforme

Amox./Ac. Clavulánico 20/10 mg 19,0 - 25,0 16,3 - 19,4 - - 28,0 - 36,0 34,1 - 38,9 No conforme

Ampicilina 10 mg 16,0 - 22,0 15,3 - 18,4 - - 27,0 - 35,0 32,1 - 37,2 No conforme

Ceftazidime 30 mg 25,0 - 32,0 24,2 - 26,6 22,0 - 29,0 21,2 - 24,1 16,0 - 20,0 17,4 - 20,6 ConformeCefuroxime 30 mg 20,0 - 26,0 17,2 - 20,0 - - 27,0 - 35,0 26,8 - 30,7 No conforme

Cloranfenicol 30 mg 21,0 - 27,0 23,0 - 27,3 - - 19,0 - 26,0 22,0 - 26,8 No conforme

Estreptomicina 10 mg 12,0 - 20,0 12,1 - 15,1 - - 14,0 - 22,0 13,7 - 16,1 ConformeGentamicina 10 mg 19,0 - 26,0 18,3 - 21,0 16,0 - 21,0 16,0 - 21,0 19,0 - 27,0 19,2 - 22,5 Conforme



SENSIBILIDAD


E. coli

ATCC 25922

P. aeruginosa

ATCC 27853

S. aureus

ATCC 25923

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Ceftazidime 30 mg 25,0 - 32,0 18,7 - 24,0 22,0 - 29,0 29,4 - 32,7 16,0 - 20,0 21,2 - 25,3 No conforme

Cefuroxime 30 mg 20,0 - 26,0 18,4 - 21,5 - - 27,0 - 35,0 31,8 - 34,3 No conforme

Cloranfenicol 30 mg 21,0 - 27,0 24,2 - 26,6 - - 19,0 - 26,0 22,0 - 26,8 ConformeEritromicina 15 mg - - - - 22,0 - 30,0 28,2 - 33,4 No conforme


Gentamicina 10 mg 19,0 - 26,0 21,1 - 23,8 16,0 - 21,0 17,7 - 19,9 19,0 - 27,0 22,5 - 26.0 Conforme

En la tabla 3 se presentan los resultados de los DSAbritánicos (Oxoid), siendo el porcentaje de no conformi-dad mayor que en cualquier otro caso (71,43%).

En las tablas 4 y 5 se muestran los valores experimenta-les de los DSA norteamericanos, presentando no confor-midad tanto BBL (62,50%) como Difco (25,00%).

Tabla 4. Valores registrados de límites de confianza de los diámetros de zona de los discos de sensibilidad antibiótica de fabricación norteamericana (BBL).

V.E= Valores experimentales.V.T = Valores Teóricos (Norma M2-A5, Suplemento M100-S7, NCCLS).



SENSIBILIDAD


E. coli

ATCC 25922

P. aeruginosa

ATCC 27853

S. aureus

ATCC 25923

Tabla 3. Valores registrados de límites de confianza de los diámetros de zona de los discos de sensibilidad antibiótica de fabricación británica (Oxoid).

V.E= Valores experimentales.V.T = Valores Teóricos (Norma M2-A5, Suplemento M100-S7, NCCLS).


Amicacina 30 mg 19,0 - 26,0 22,7 - 25,7 18,0 - 26,0 20,2 - 25,3 20,0 - 26,0 18,6 - 22,6 No conforme



Cefuroxime 30 mg 20,0 - 26,0 19,7 - 23,7 - - 27,0 - 35,0 29,3 - 31,9 Conforme


Gentamicina 10 mg 19,0 - 26,0 19,6 - 23,6 16,0 - 21,0 15,9 -19,3 19,0 - 27,0 19,7 - 24,0 Conforme

Penicilina 10 UI - - - - 26,0 - 37,0 37,2 - 39,6 No conforme



SENSIBILIDAD


E. coli

ATCC 25922

P. aeruginosa

ATCC 27853

S. aureus

ATCC 25923


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Tabla 5. Valores registrados de límites de confianza de los diámetros de zona de los discos de sensibilidad antibiótica de fabricación norteamericana (DIFCO).

V.E= Valores experimentales.

V.T = Valores Teóricos (Norma M2-A5, Suplemento M100-S7, NCCLS).

De manera general, se registraron dos tipos de no con-formidades. En el primer caso (figura 1) se presentó noconformidad por deficiencia en la actividad antibiótica delos discos evaluados marca Emerme de amicacina,estreptomicina y discos BBL de cefuroxima, todos con

valores de CV mayores a 5, así como los Sensidiscossensidiscos-EMV de amoxicilina/ácido clavulánico,cefuroxima, cloranfenicol y discos Oxoid de ampicilina,amicacina y ceftazidima, estos últimos con valores de CViguales o menores a 5.



Amox./Ac. Clavulánico 20/10 mg 19,0 - 25,0 19,6 - 21,8 - - 28,0 - 36,0 40,9 - 44,9 No conforme

Ampicilina 10 mg 16,0 - 22,0 16,3 - 18,8 - - 27,0 - 35,0 27,2 - 33,6 Conforme


Cefuroxime 30 mg 20,0 - 26,0 20,2 - 22,6 - - 27,0 - 35,0 31,8 - 34,2 Conforme

Cloranfenicol 30 mg 21,0 - 27,0 25,5 - 27,6 - - 19,0 - 26,0 20,8 - 24,6 Conforme

Eritromicina 15 mg - - - - 22,0 - 30,0 23,8 - 27,6 Conforme

Gentamicina 10 mg 19,0 - 26,0 20,8 - 23,3 16,0 - 21,0 17,6 - 20,8 19,0 - 27,0 22,0 - 24,8 Conforme



SENSIBILIDAD OBSERVACIONES

E. coli

ATCC 25922

P. aeruginosa

ATCC 27853

S. aureus

ATCC 25923

Figura 1. Comparación de los límites de confianza de diámetros de inhibición de discos de Ceftazidime 30 µg frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923.

Staphylococcus aureus ATCC 25923 frente a Ceftazidime 30 µg

Diámetros de los Halos de Inhibición Antibiótica(en mm)

Límites de los diámetros de zona de inhibición* = 16,00–20,00

Discos de fabricación norteamericana-BBL** = 21,20–25,27 No conforme

Discos de fabricación norteamericana-DIFCO** = 18,70–23,40 No conforme

Discos de fabricación chilena-Sensidiscos-EMV** = 17,40–20,60 Conforme

Discos de fabricación británica-Oxoid** = 18,20–20,20 Conforme

16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 (mm)

* Según Estándar Internacional M2-A5, M100 - S7 (NCCLS).

** t0,05 (al 95% de Probabilidad).

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En el segundo caso (figura 2) se presentó no conformi-dad por exceso de actividad antibiótica de los discosmarca Emerme de cloranfenicol y gentamicina, así comoen los Sensidiscos sensidiscos-EMV de ampicilina, dis-cos BBL y Difco de ceftazidima, todos con valores de CV

mayores a 5, así como discos BBL de ampicilina yeritromicina, discos Difco de amoxicilina/ácido clavulánico,discos BBL y Oxoid de estreptomicina y discos Emerme yOxoid de penicilina, estos últimos con valores de CV igua-les o menores a 5.

Se determinó que 41,67% de los lotes de discos evalua-dos, cumplieron con los parámetros de la norma. Se ob-servó que cerca de la mitad de los discos de las marcasextranjeras fueron conformes (48,4%). Los lotes de dis-cos nacionales evaluados no cumplieron con losparámetros de la norma en ninguno de los casos, tantopor exceso como por deficiencia de la actividad antibiótica,además se observó que presentaron halos de inhibicióndefectuosos.La mayoría de los discos extranjeros no conformes(51,61%) presentaron un exceso de potencia en su res-pectiva concentración antibiótica, a excepción de laamicacina, ampicilina y ceftazidima (discos Oxoid),cefuroxime (discos BBL y sensidiscos-EMV) y amoxicilina/ácido clavulánico y cloranfenicol (sensidiscos-EMV), queregistraron valores menores a los señalados por la nor-ma M2-A5, Suplemento M100-S710.Los discos extranjeros presentaron coeficientes de va-riabilidad (CV) menores a 5 (Sensidiscos-EMV=4,1;Oxoid=4,0, BBL=3,7, y Difco=4,4), lo cual se verifica enrangos de actividad estrechos y valores que están dentrode los límites de la norma, a diferencia de los discosnacionales Emerme que presentaron en promedio valo-

res mayores del coeficiente de variación (CV=10,2), y comoconsecuencia rangos amplios que no cumplen con loslímites establecidos (Figura 3).


Staphylococcus aureus ATCC 25923 frente a Estreptomicina 10 µgDiámetros de los Halos de Inhibición Antibiótica

(en mm)

Límites de los diámetros de zona de inhibición* = 14,00–22,00

Discos de fabricación nacional-Emerme** = 10,00–14,60 No conforme

Discos de fabricación norteamericana-BBL** = 18,50–21,20 Conforme

Discos de fabricación chilena-Sensidiscos-EMV** = 13,70–16,10 Conforme

Discos de fabricación británica-Oxoid** = 13,50–15,90 Conforme

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 (mm)

* Según Estándar Internacional M2-A5, M100 - S7 (NCCLS).

** t0,05 (al 95% de Probabilidad).

Figura 2. Comparación de los límites de confianza de diámetros de inhibición de discos de Estreptomicina 10 µg frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923.

Figura 3. Coeficiente de Variabilidad (CV) de discos de sensibilidadantimicrobiana de fabricación nacional (Emerme), chilena (Sensidiscos-EMV),británica (Oxoid) y norteamericana (marcas BBL y DIFCO).

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DISCUSION

Los resultados porcentuales de lotes aceptados(41,67%) y rechazados (58,40%) obtenidos en el presen-te estudio, efectuado con un mayor número de marcas(n=5) y número de lotes (n=36), son similares a lo repor-tado previamente, donde 50,00% de los lotes de DSAevaluados arrojaron resultados no conformes11.

Se ha observado una disminución en la proporción dediscos extranjeros que cumplieron con los requisitos dela norma. Así, en el estudio previo 66,60% de los lotes dediscos extranjeros cumplieron los requisitos, en esteestudio sólo 48,30% cumplieron los requisitos de la nor-ma empleada. Esta disminución del porcentaje de lotesconformes se podría asociar al mayor número de mar-cas y lotes evaluados en este estudio.

Por otro lado, los discos de la marca evaluada de discosfabricados en nuestro país no cumplieron con los requi-sitos exigidos por la norma en ninguno de los casos, aligual que en el anterior estudio11.

Los resultados del CV de los DSA evaluados (CVextranjero <5; CVnacional = 10,20), fueron bastante similares a los re-gistrados en el anterior trabajo11, lo cual se verifica enrangos de actividad estrechos, para los DSA de origenextranjero, evidenciando una calidad homogénea, com-portamiento que fue opuesto en los DSA nacionales. Sedeterminó que la homogeneidad encontrada en los DSAextranjeros no condicionó el cumplimiento de las especi-ficaciones de la norma.

La calidad de los DSA está condicionada a la naturalezadel antibiótico, procesos de manufactura y control de ca-lidad del laboratorio fabricante, también puede verse afec-tada por condiciones de conservación inadecuadas,involucrando variables como la temperatura y la hume-dad durante el almacenamiento de los mismos. Los re-sultados obtenidos sugieren que la calidad de los DSAcomercializados en el Perú no es la más adecuada, cons-tituyéndose en fuente potencial de distorsión o error, yaque la información recopilada podría estar induciendo afalsas interpretaciones en torno a los verdaderos proble-mas de resistencia bacteriana a los antibióticos, lo cualafectaría negativamente la correcta toma de decisionespor parte de las autoridades del sector salud en el dise-ño de programas de resistencia bacteriana.

Dado que el uso racional de los antibióticos en enfermedadescomunes, así como en las infecciones intrahospitalariasse basa en pruebas de laboratorio que emplean frecuen-temente discos para la prueba de sensibilidad antibiótica,es indispensable la puesta en marcha de un programade control de calidad de dichos productos, a fin de garan-tizar la suficiencia de los programas de utilizaciónantibiótica desarrollados por el Ministerio de Salud del Perú.

Asimismo, es necesario que en el país se considere eldesarrollo de una norma para el control de calidad deDSA, así como implementar un plan nacional de capaci-tación para el personal integrante del Sistema Nacionalde DSA en la ejecución estandarizada de la Prueba deSensibilidad de DSA, método Kirby-Bauer. También, es

recomendable la ejecución de proyectos periódicos devigilancia de estos productos a fin de garantizar el cum-plimiento de los requisitos mínimos de calidad exigidospor la normativa internacional.

AGRADECIMIENTOS

Al personal técnico de la División de Microbiología del CentroNacional de Control de Calidad del INS por el apoyo brindadodurante la realización de este estudio.

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Obregón G. y col.

21

Rev Med Exp 2000; 17 (1-4)

DETERMINACION DE ANTICUERPOS IgM CONTRA EL VIRUS DENGUEA PARTIR DE SANGRE ABSORBIDA EN PAPEL FILTRO: UN MÉTODO

ALTERNATIVO Y SENCILLO.

María García M1, César Cabezas S2, Leonor Martos D3, Antero Gonzáles P3, Rosa Acosta C1.

1 División de Virología, Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pública, Instituto Nacional de Salud.2 Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pública, Instituto Nacional de Salud.3 Centro de Salud de Bagua Grande, Cajamarca, Perú.

RESUMEN

Objetivo: Se propone como alternativa la obtención de muestras de sangre total en papel filtro, para la determina-ción de anticuerpos IgM contra dengue, por ser un método de recolección sencillo y no requerir de muchos cuidados enel envío al laboratorio. Materiales y métodos: De 100 pacientes con diagnóstico clínico de dengue clásico, se obtuvieronen forma simultánea, muestras de suero en tubos al vacío y de sangre total en papel filtro. Ambas muestras fueronevaluadas con el método serológico ELISA Captura de IgM a los 30 días de obtenida la muestra. Resultados: De las 100muestras 25 fueron positivas y 75 negativas en suero, y 24 positivas y 74 negativas en papel filtro. Se obtuvo unaconcordancia por índice Kappa de 0,97, sensibilidad y especificidad de 96,0% y 98,0% respectivamente; el valor predictivopositivo fue 96,0%, y valor predictivo negativo fue 98,0%. Conclusión: Se evidencia muy buena sensibilidad, especifici-dad y concordancia en la determinación de IgM contra dengue, al utilizar papel filtro en la obtención de muestra desangre.

Palabra clave: Dengue/diagnóstico; Filtros de papel; Test de ELISA (fuente: BIREME).

ABSTRACT

Objective: This study proposes the use of filter paper, in whole blood samples to test for Dengue, as an alternatemethod, due to the fact that it is very simple and does not require of much detail for shipping samples to the laboratory.Materials and Methods: Using vacutainers and filter papers, whole blood sample obtained simultaneously from 100patients diagnosed as classic dengue. All samples were tested using IgM capture ELISA. Findings: Out of 100 samples,25 were positive and 75 were negative in sera, in filter paper 24 positive and 74 negative, with a Kappa concordance indexof 0,97 and a sensitivity and specificity of 96,0% and 98,0% respectively: the positive predictive value was 96.0% and thenegative predictive value was 98,0%. Conclusions: A very good sensitivity, specificity and concordance in the determinationof IgM antibodies against Dengue is evidenced using filter paper when obtaining blood samples.

Key words: Dengue/diagnosis; Paper filters; Enzyme-linked immunosorbent assay (source: BIREME).

Correspondencia: María García Mendoza. Instituto Nacional de Salud.Calle Cápac Yupanqui 1400, Lima 11, Perú. Apartado Postal 471. Telf.:(0511) 4719920 – Fax: (0511) 4710179.Email: pgarcí[email protected]

INTRODUCCIÓN

Los virus dengue pertenecen a la familia Flaviviridae yal género Flavivirus, son virus ARN cuyo tamaño oscilaentre 40 y 70 nm, se ensamblan y liberan en el citoplas-ma principalmente en asociación con la membranascitoplasmáticas. Todos los Flavivirus comparten un de-terminante antigénico género específico que parece es-tar asociado con la nucleocápside1.

La infección por virus dengue causa una enfermedad cuyoespectro incluye dos formas, el dengue clásico que cur-sa con fiebre, cefalea, malestar general, dolor retro-orbitario, dolores en músculos y articulaciones, así comoerupción en algunos casos; y la Fiebre Hemorrágica porDengue/Sindrome de Shock por Dengue (FDH/SSD), quees la forma grave de la enfermedad, y se presenta conmayor frecuencia en los menores de 15 años

2.

Esta enfermedad se ha venido notificando en las Améri-cas desde hace más de 200 años. La primera epidemiade dengue clásico de las Américas documentada porlaboratorio estuvo relacionada con el serotipo 3 y afectó

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Rev Med Exp 2000; 17 (1-4) García M. y col.

al Caribe y a Venezuela en 1963-1964, aunque con ante-rioridad, se había aislado el virus de dengue 2 en estasregiones, en una situación no epidémica3. En 1968-1969,otra epidemia afectó a varias islas del Caribe donde seaislaron los serotipos 2 y 3, y, en la década de 1970,Colombia se vió afectada por extensos brotes asociadosa los mismos serotipos4. En 1977, se introdujo en lasAméricas el serotipo 1, que después de su deteccióninicial en Jamaica se propagó a la mayoría de las islasdel Caribe causando brotes explosivos4,5. En 1990, seprodujo la primera epidemia de dengue clásico en el Perú,habiéndose registrado un total de 9,623 casos, en losdepartamentos de Loreto, San Martín, y Ucayali; aislán-dose el serotipo 1 hasta 1995, desde entonces se hanpresentado casos de dengue con este serotipo tambiénen otros departamentos como Tumbes, Piura, Huánuco,Junín, y Cajamarca. En 1995, se aisló el serotipo 2 enPiura, y a inicios de 1996, en Bagua Grande (Amazo-nas)6,7 . Bajo este panorama es inminente la introduccióndel dengue hemorrágico, y es pertinente la evaluaciónserológica de la población susceptible, así como el con-tar con métodos accesibles para la vigilanciaepidemiológica del dengue.

Desde la introducción de la técnica de ELISA se ha eva-luado la opción de utilizar el papel filtro, como un métodofácil y de bajo costo para obtener y transportar muestrasde sangre entera y a partir de ello detectar anticuerpospara el diagnóstico serológico en enfermedades virales8,9.En el Perú, ya se evaluó con éxito su uso para detectaranticuerpos10, siendo esto útil para estudios deseroprevalencia en poblaciones afectadas por dengue.

Debido a la importancia de realizar la vigilancia de infec-ciones agudas e identificar la presencia de brotes dedengue mediante la detección de IgM, se planteó el pre-sente estudio, con el objetivo de evaluar la utilidad delpapel filtro en nuestro medio, para la obtención de san-gre total y la posterior detección de anticuerpos IgM con-tra el virus dengue, comparándola con la detección deanticuerpos en suero obtenido clásicamente utilizandotubos al vacío.


POBLACIÓN DE ESTUDIO

Las muestras utilizadas en el presente estudio co-rrespondieron a un brote de dengue ocurrido entre no-viembre de 1995 y marzo del 1996, en Bagua Grande,localidad ubicada en la selva alta del departamento deAmazonas, habiéndose registrado 399 casos clínicamentediagnosticados.

En base a los registros epidemiológicos, se realizaronvisitas domiciliarias y se seleccionaron inicialmente 112pacientes que, de acuerdo a los criterios de la Organiza-ción Panamericana de la Salud (OPS), tenían diagnósti-co clínico de dengue clásico en los últimos 3 meses (ene-ro - marzo 1996) y el antecedente epidemiológico de resi-

dir en una área con presencia de Aedes aegypti. Se obtu-vo el consentimiento de los pacientes, habiéndose obte-nido muestras de sangre en 100 de los 112 pacientesinicialmente elegidos. La información clínica yepidemiológica se obtuvo a través de una ficha elabora-da para tal fin.

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO

Identificados los casos y, previa autorización del pa-ciente, se procedió a obtener 2 muestras en cada uno deellos: una de sangre (suero) utilizando tubo de extracciónal vacío y otra de sangre total en papel filtro.

Obtención de sangre en papel filtro

Se utilizó papel filtro WHATMAN Nº3 en el cual se mar-caron círculos de 16 mm de diámetro que absorben 50uLde sangre total aproximadamente, volumen que fue en-contrado mediante ensayos previos9 (Figura 1).

Figura 1. Papel Whatman N°3 con los círculos de 16 mm, delimitados paradepositar la muestra de sangre y la identificación con el código del paciente.

La obtención de la muestra se realizó mediante la pun-ción con una lanceta en el pulpejo lateral del dedo medio,dejando fluir la sangre espontáneamente dentro del cír-culo marcado en el papel filtro, tratando que la muestracubra el diámetro indicado (volumen aproximado50uL)(Figura 2); se dejó secar al medio ambiente en unlugar protegido de la luz solar directa, luego se colocaronen bolsas de plástico y fueron transportadas al laborato-rio a temperatura ambiente, junto con la ficha clínico-epidemiológica respectiva. En el laboratorio se conser-varon también a temperatura ambiente y se procesaronal mes de obtenidas8.

Figura 2. Procedimiento de obtención de sangre utilizando papel filtroWhatman N°3.

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Obtención de muestra de sangre en tubo de extracción alvacío para separar suero (Vacutainer)

Se extrajo por punción venosa 10 ml de sangre total,utilizando tubos al vacío en los 100 pacientes a los quetambién se les tomó muestra en papel filtro. Se centrifugóa 2500 rpm y se procedió a separar el suero y mantener-los a -10°C hasta su envío al Laboratorio de Virología delInstituto Nacional de Salud, donde se conservaron a -20°Chasta su procesamiento17.

Prueba de ELISA de captura de IgM (MAC-ELISA) Modificado

Las muestras de sangre total en papel filtro y las desuero fueron procesadas para la determinación deanticuerpos lgM contra dengue, utilizando la técnica ELISACaptura de IgM, a los 30 días después de su extracción.

Elución de la muestraSe recortaron los círculos de papel filtro absorbidos

con sangre total y se colocaron en viales que contenían2ml de buffer fosfato salino (PBS) con leche descremada(LD) al 2,5% pH 7,2 a 4°C durante toda la noche, obte-niendo una dilución de 1:40 como lo requiere el métodoutilizado.

Procedimiento

Los pozos fueron sensibilizados con 100 uL de anti-IgM humano a una dilución de 1:800, y obtenida median-te titulación, en buffer carbonato bicarbonato pH 9,5. Seincubó la placa a 4°C de 14 a 20 horas, se lavó 5 vecescon PBS + tween 20 al 0,05%, se agregó 100 uL de buffercarbonato-bicarbonato + leche descremada al 2,5%, seincubó a 37°C por 30 minutos, se lavó 5 veces. Los sue-ros fueron diluidos a 1:40 a con PBS + LD al 2,5%. Luego,se agregó 100 uL del suero problema o las muestraseluidas y los controles positivo y negativos en los pozosrespectivos, se incubó a 37°C por 2 horas, y se lavó 5 veces.

El antígeno (virus dengue 1 cepa Hawaii) utilizado en laprueba fue producido en cerebro de ratón lactante, tratadocon sucrosa y acetona e inactivado con ß-propiolactona17.

La dilución fue 1:400 en PBS + LD al 2,5% + Suero Huma-no Normal al 1,0%. La prueba utilizó también un antígenocontrol normal (cerebro ratón no infectado con el mismotratamiento).

Se agregó 100 uL de antígeno (dengue 1) y Antígeno con-trol normal en los pozos correspondientes a la mismadilución del antígeno viral, se incubó a 4°C por 12 horas,y se lavó la placa 5 veces. El conjugado empleado fueuna inmunoglobulina IgG anti-flavivirus marcada conperoxidasa (6B6C-1). Se utilizó una dilución de 1:6000 enPBS + LD al 2,5%, se agregó 50 uL de conjugado a todoslos pozos excepto los controles de sustrato, se incubó a37°C por 1 hora, y se lavó la placa 7 veces. Luego seagregó el sustrato (OPD en buffer fosfato-citrato pH 5,0 +H2O2), se dejó a temperatura ambiente por 15 minutos,protegido de la luz, y finalmente, se mezcló la reaccióncon ácido sulfúrico al 2N.

El VALOR DE CORTE se obtuvo mediante : Promedio delos negativos+3DS, considerando en la prueba el valorde 0,2 como rango para la evaluación de los resultadospara evitar falsos positivos por reacciones cruzadas porotros virus.

Densidades ópticas < 0,2 : NEGATIVO.Densidades ópticas > 0,2 : POSITIVO.

RESULTADOS

Se analizaron 100 muestras de suero de igual núme-ro de pacientes, obtenidos de tubos al vacío encontrandoque 25 (25,0%) de ellas presentaban anticuerpos IgM y75 (75,0%) no presentaban anticuerpos IgM, variandoligeramente con los resultados de las muestras obteni-das a partir de papel filtro, donde hubo coincidencia en24 de los positivos y en 74 de los negativos. Una muestrapositiva en el suero no fue detectada en papel filtro (falsonegativo), y una muestra negativa en el suero fue positivaen el papel filtro (falso positivo). Los resultados

Tabla 1. Resultado comparativo de IgM Anti-Dengue, en suero y papel filtro, utilizando la prueba de ELISA Captura IgM (MAC-ELISA)

SUERO

POSITIVO NEGATIVO TOTAL

P POSITIVO 24 01 25 A P NEGATIVO 01 74 75 E L

TOTAL 25 75 100

Concordancia (Indice Kappa) = 0,97 MBSensibilidad : 96,0 %Especificidad: 98,0 %Valor predictivo Positivo = 96,0 %Valor predictivo Negativo = 98,0 %

Diagnóstico de dengue utilizando de papel filtro

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serológicos a partir de muestras de suero y obtenidas enpapel filtro, fueron sometidos a análisis estadístico18,presentando una sensibilidad para ELISA Captura IgMde 96,0%, especificidad de 98,0%, valor predictivo positi-vo de 96,0% y valor predictivo negativo de 98,0%. Asimismo al aplicar la prueba de concordancia del IndiceKappa, se obtuvo un resultado de 0,97 para ELISA Cap-tura IgM.

Los resultados de la prueba de ELISA IgM de Captura(MAC-ELISA), comparando las muestras de suero y lasmuestras obtenidas en papel filtro se observan en la Ta-bla 1.

DISCUSION

Conociendo la necesidad de contar con métodos deobtención de muestras que permitan superar inconve-nientes como el transporte, la rapidez y el costo querepresenta, además de su aplicabilidad en los sistemasde vigilancia, se planteó este trabajo en el cual seestandarizó la obtención de sangre total en papel filtro.Algunos autores recomiendan esta forma de recoleccióncomo un buen método para almacenar muestras de san-gre en condiciones de campo, particularmente en áreasrurales, donde usualmente no se cuenta con sistemasde refrigeración10,11.

Los resultados obtenidos en este estudio, muestran unalto porcentaje de sensibilidad, especificidad, y concor-dancia en las muestras de sangre total obtenida en pa-pel filtro, cuando lo comparamos con las muestras desuero para la detección de anticuerpos IgM contra dengue.

Estos resultados son comparables a los estudios reali-zados por Guzmán8 y Vásquez20, quienes emplearon pa-pel filtro para la recolección de sangre y detectaronanticuerpos totales por los métodos de Inhibición de laHemaglutinación8 y ELISA de Inhibición19, y anticuerposIgM por ELISA IgM de Captura20,21.

La sensibilidad obtenida en este estudio fué 96,0% paraELISA de Captura IgM, siendo inferior a la obtenida porVásquez, que fue 98,1% 20,y similar a los resultados re-portados por la OPS cuando las muestras en papel filtrofueron almacenadas a temperatura ambiente y procesa-das a 15 días, 30 días y a los tres meses9.

La sensibilidad reportada en estudios donde se detec-tan anticuerpos totales fué 99,0% a 96,0%, cuando lasmuestras fueron procesadas a los 15, 90 y 180 días des-pués de la obtención, y de 96,0% cuando las muestrasfueron procesadas al mes de su obtención, similar alresultado obtenido a los 180 días cuando las muestrasson conservadas a 4°C , lo cual nos hace pensar en ladegradación de los anticuerpos IgM

19,21. En nuestro estu-

dio, la disminución de la sensibilidad de la prueba podríaser atribuida a la calidad de almacenaje de las muestrasya que se obtiene una mayor sensibilidad cuando lasmuestras son almacenadas a 4°C10, mientras que ennuestro caso las muestras fueron almacenadas a tem-

peratura ambiente en bolsas de plástico por espacio de30 días. Los autores hacen énfasis en el tiempo en quedeben ser procesadas las muestras obtenidas en papelfiltro que debe ser no mayor de 30 días inclusive a tempe-ratura ambiente20, aunque en condiciones de campo, noes siempre factible contar con una cadena de frio.

Cuando se estudiaron otras etiologías comoTripanozomas, VIH, Sarampión, Encefalitis Japone-sa10,11,12,13,14, Burke13 encontró que al conservar suerosabsorvidos en papel filtro y en bolsas de polietileno congel de sílica a temperaturas menores o iguales de 25°Cdurante un año, los niveles de anticuerpos disminuyensólo en un título. Estas condiciones podrían también ex-plicar la sensibilidad obtenida en nuestro estudio, conrespecto a los reportados en otros trabajos 9,20,21.

De acuerdo a los resultados obtenidos, consideramosque pueden utilizarse muestras de sangre obtenidas enpapel filtro para la detección de anticuerpos IgM contradengue por ELISA de Captura IgM, teniendo en la obten-ción de muestra de sangre total en condiciones de cam-po como ventajas la facilidad de su realización y trans-porte, además del bajo costo. Asimismo, este mismométodo puede ser utilizado para detección de IgG antiDengue para encuestas sero-epidemiológicas que deli-miten zonas de riesgo, así como para facilitar la vigilan-cia epidemiológica del Dengue con soporte laboratorialcon un margen de error no muy significativo.

Sobre esta base se recomienda también validar el usode papel filtro como una alternativa para obtener mues-tras de sangre total para las evaluaciones en otras pato-logías infecciosas de origen viral, como fiebre amarilla,sarampión, rubeola, hepatitis viral, etc.

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Diagnóstico de dengue utilizando de papel filtro

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Rev Med Exp 2000; 17 (1-4)

ESTUDIO DE VALIDACIÓN DE LA METODOLOGÍA PARA LA DETERMI-NACIÓN DE VITAMINA A EN ALIMENTOS INFANTILES INSTANTÁNEOS

POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC)

Ruth Pérez Calderón.

* División de Química, Centro Nacional de Alimentación y Nutrición, Instituto Nacional de Salud.

RESUMEN

Con la finalidad de controlar la calidad de alimentos infantiles instantáneos se efectuó la validación de la metodologíapara la determinación de la vitamina A por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Para la precisión delsistema se evaluaron tres parámetros: tiempo de retención, área y altura, hallándose una desviación estándar relativa(RSD) máxima de 1,78%. En la linealidad se obtuvo un coeficiente de correlación r=0,99 y una precisión con un RSD de2,70%. La exactitud del método se evaluó en términos de recuperación mediante la adición de vitamina A al alimentoobteniéndose un porcentaje de recuperación de 97,98%; y para la sensibilidad del método se obtuvo un límite dedetección (LOD) de 0,06 mg/g y un límite de cuantificación (LOQ) de 0,58 mg/g. Con los resultados obtenidos sedemuestra que el método en estudio es preciso, exacto, lineal y altamente sensible para ser utilizado en el control decalidad de alimentos infantiles instantáneos para la determinación de vitamina A.

Palabras claves: Vitamina A; Cromatografía líquida; Alimentos infantiles (fuente: BIREME).

ABSTRACT

Validation of the methodology used to determine Vitamin A through High Performance Liquid Cromatography (HPLC)was performed to assess instant food for children.Three parameters were assessed in order to determine the system´saccuracy: retention time, area and height and a maximum variation (RSD) of 1.78% was found. A correlative coefficient ofr=0.99 was obtained for the lineal parameter, and an accuracy with 2.70% for RSD. The accuracy of the method wasevaluated in terms of recovery through the addition of Vitamin A to the food, the recovery percentage obtained was97.98%, and for the sensitivity a limit of detection (LOD) 0,06ug/g was obtained, as well as a limit of quantification (LOQ)0,58%. The findings demonstrate that the method assessed is accurate, exact, lineal and highly sensitive to be used inquality control of instant food for children for the determination of Vitamin A.

Key Words: Vitamin A; Liquid cromatography; Infant food (source: BIREME).

Correspondencia: Ruth Pérez Calderón. Centro Nacional de Alimentacióny Nutrición. Tizón y Bueno 276, Lima 11, Perú. Telf.: (0511) 4639588 – Fax:(0511) 4639617.Email: [email protected]

INTRODUCCION

Vitamina A es el nombre genérico utilizado paradescribir al retinol, sus ésteres y los correspondientesisómeros. Sólo está presente, como tal, en los alimentosde origen animal, aunque en los vegetales se encuentracomo provitamina A en forma de carotenos.

Los diferentes carotenos se transforman en vitamina Aen el cuerpo humano, se almacenan en el hígado engrandes cantidades y también en el tejido graso de lapiel (palmas de las manos y pies, principalmente), por loque podemos subsistir largos períodos sin su aporte1.

La principal función de la vitamina A es la protección de lapiel y su intervención en el proceso de visión de la retina.También participa en la elaboración de enzimas en elhígado y de hormonas sexuales y suprarrenales. El déficitde vitamina A produce ceguera nocturna, sequedad enlos ojos (membrana conjuntiva) y en la piel, y afeccionesdiversas de las mucosas. En cambio, el exceso de estavitamina produce trastornos como alteraciones óseas, eincluso inflamaciones y hemorragias en diversos tejidos.

La vitamina A se encuentra principalmente en productosanimales tales como leche, crema, mantequilla, queso,huevos, carne, hígado, riñón y aceite de hígado de bacalao.Por lo general, se encuentra como ésteres de ácidosgrasos de cadena larga pero también se encuentra comoretinol. Se destruye muy fácilmente con la luz, con la

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temperatura elevada y con los utensilios de cocina dehierro o cobre2.

Los alimentos infantiles instantáneos, en su gran mayoría,son fortificados normalmente utilizando formulacionesespeciales que mejoran su estabilidad y valor nutritivo,siendo la ingesta diaria recomendada (RDA) de 400 -700 mg de vitamina A, para niños de 1-10 años de edad3.

En el Perú, los programas de complementaciónalimentaria distribuyen alimentos instantáneos a lapoblación con alto riesgo de desnutrición; en ese sentido,el desarrollo de tecnologías adecuadas para laevaluación de micronutrientes como la vitamina A, sonnecesarias para el control de calidad de los productosdesignados a los beneficiarios de estos programas.

El análisis de las vitaminas en los alimentos es un grandesafío para los analistas dado que se asocia conproblemas significativos. Muchos de estos problemashan sido eliminados gracias a los recientes avances enla tecnología y el desarrollo de nuevos enfoquesanalíticos. A pesar de ello, no es una tarea fácil analizarvitaminas y se necesita experiencia y los conocimientosadecuados para producir resultados reproducibles, quesean exactos y válidos.

El primer método válido para la determinación deVitamina A fue un bioensayo4; luego, se establecieron losmétodo espectrofotométrico y fotométrico5, sin embargo,ambos métodos están expuestos a interferencias, desdealgunas sustancias como carotenos, derivados yproductos de descomposición de la vitamina A quepodrían absorber luz en la misma región ultravioleta odar colores similares con los reactivos utilizados en ladeterminación fotométrica. Es así, que estos métodosno son lo suficientemente específicos para determinaresta vitamina, además que la confiabilidad de susresultados depende del éxito en los pasos de purificacióny los procedimientos de trabajo.

Como vemos, el problema realmente no son los métodosde determinación, sino más bien los procedimientos deextracción, ya que debido a su inestabilidad, algunosautores prefieren extraer separadamente cada vitaminaliposoluble6.

En ese sentido, y buscando una óptima metodología deanálisis, en el presente estudio se realizó la validaciónde la metodología por HPLC para la determinación devitamina A contenida en alimentos infantiles instantáneos.


EQUIPOS

Se utilizó un equipo de cromatografía líquida de altorendimiento (HPLC), marca Shimadzu, modelo LC10A,con inyector automático, bomba con sistema de degasificación,con integrador o sistema de registro, software para elprocesado de datos cromatográficos, detector de arreglode diodos (longitud de onda variable). La columnacromatográfica fue de acero inoxidable LC-18 para fase

reversa, de 25 cm x 4,6 mm de diámetro interno, 5mm dediámetro de partícula, y guarda columna con cartuchoC18, Supelco. Las condiciones típicas de operación fue-ron: sistema isocrático, flujo 1,2 mL/min, volumen de in-yección 20 ml, detección UV 242 nm, temperatura de hor-no, ambiente, y tiempo de corrida 7 min. La fase móvil fuemetanol al 100% grado HPLC.

REACTIVOS

Metanol grado HPLC( Merk), estándar all-trans Retinol:Vitamina A (Sigma), hexano p.a. (Merck), etanol absolutop.a. (Merk), solución de hidróxido de potasio al 50%, BHTó Acido Ascórbico (antioxidantes), y agua tridestilada ogrado HPLC. Solución stock estándar de vitamina A: Sedisolvieron 100 mg del estándar en 100 mL de etanolabsoluto, con aproximadamente 0,002 g de BHT, y seguardó la solución en congelación (-20°C), se verificó lapureza del estándar mediante la medición de su espec-tro de absorción (la vitamina A y los correspondientesésteres muestran un espectro de absorción característi-co, donde la posición del pico máximo depende del sol-vente): en etanol, el retinol a 325 nm, tiene un coeficientede extinción (E 1% - 1cm.) de 1843).

PROCEDIMIENTO

Se pesaron 20 g de la muestra de alimento infantil(papilla) en un balón de base plana, se colocó un mag-neto y se adicionó 70 mL de etanol absoluto. Se coloca-ron los tubos de reflujo y se agitó la mezcla hasta suebullición con corriente de nitrógeno. Luego, se adicionó20 mL de solución de KOH al 50% y se saponificó lamezcla por 30 minutos con agitación moderada. Antesde finalizar esta etapa se enjuagó el contenido con 50 mLde agua en 3 porciones. La solución se enfrió a tempera-tura ambiente y luego se filtró al vacío. Se colocó inme-diatamente el contenido en una pera de separación de250 mL y se adicionó 50 mL de hexano p.a. para proce-der a la extracción. Se agitó la mezcla por 20 segundos yal separarse las fases se colocó la capa superior (faseorgánica) en un balón de 250 mL de base redonda quecontenía aproximadamente 0,5 g de BHT ó ácidoascórbico. Se efectuó dos veces más la extracción y sejuntaron los extractos en el balón de 250 mL. Se evaporóa sequedad el solvente, haciendo uso de un rotavaporcon baño de agua a 40°C, se diluyó inmediatamente conmetanol grado HPLC el residuo, y se llevó a volumen enun matraz volumétrico de 10 mL. Finalmente, se pasó la so-lución final por un filtro de 0,2 mm, llenándolos en viales ám-bar de 2 mL para colocarlos en el inyector del cromatógrafo.

CÁLCULOS

Concentración de Vitamina A (mg/g ó ppm ) = Am x Cs x D As Wm

Donde: Am (Area del pico de vitamina A en la muestra), As(Area del pico de vitamina A en el estándar), Cs (Concen-tración de vitamina A en el estándar, mg/ml), D (Factor dedilución), Wm (Peso de la muestra, g).

Determinación de vitamina A por HPLC

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Rev Med Exp 2000; 17 (1-4) Pérez R.

DISEÑO EXPERIMENTAL

Se analizaron muestras de papilla realizándose losensayos en las muestras previamente homogenizadascon 2 analistas en 2 días diferentes para cuantificar lavitamina A expresada en mg/g. Cada analista realizó 08ensayos por día, bajo condiciones de repetibilidad yreproducibilidad. La temperatura en el área de cromatografíalíquida fue 23°C + 2°C. La precisión del método analíticose estudió sobre el sistema, evaluando la dispersión de4 inyecciones por cada uno de los 5 niveles de concen-tración de la solución estándar de vitamina A; y sobre elmétodo, evaluando la dispersión de la preparación de lamuestra. La evaluación correspondió a todo el procedi-miento, desde la preparación de la muestra hasta la me-dición del analito por parte del instrumento.

La exactitud del método se evaluó en términos de recu-peración. El analito se adicionó a la matriz, disuelto en elmismo solvente usado para la extracción, y se dejó encontacto con ésta por muchas horas antes de la extrac-ción, para permitir su interacción. Para tal efecto, se tra-bajó con 3 niveles de concentración diferentes adiciona-dos a la muestra. Las concentraciones de trabajo adicio-nadas fueron las siguientes: Nivel 1 = 3 ppm; Nivel 2 = 5ppm; Nivel 3 = 7 ppm. Se tomaron 0,76 mL, 1,27 mL y1,78 mL de una solución estándar de 100 ppm de vitami-na A y se adicionaron a 6 muestras de papilla por nivel.Se dejó en contacto la solución estándar con las mues-tras durante toda la noche bajo refrigeración y, al día si-guiente, se realizó el tratamiento y se hicieron las lectu-ras de los resultados de las 18 muestras.

La especificidad del método se representó mediante losespectros y el reporte de su correspondiente pureza conlas muestras empleadas para la evaluación de la preci-sión y con la solución estándar. La evaluación de la es-pecificidad del sistema se realizó mediante el softwaredel equipo, trabajándose con la solución estándar y laevaluación. La determinación de los límites de deteccióny cuantificación se evaluó sobre las muestras emplea-das para la prueba de precisión. Estos parámetros tam-bién fueron determinados por el software del equipo6.

RESULTADOS

En la Figura 1 se muestran los cromatogramas re-presentativos de dos concentraciones (mayor y menor)de vitamina A para la curva de calibración. El tiempo deretención de la vitamina A fue 3,91 ± 0,5 min, siendo eltiempo total de análisis para una muestra de 7 min. Larespuesta de detección fue lineal en el rango de concen-traciones de 5 – 15 mg/g (Figura 2), obteniéndose uncoeficiente de correlación r=0,99. El límite de deteccióndel método en base a la señal / ruido (S/N) fue de 0,06 mg/gy el límite de cuantificación de 0,58 mg/g. El perfil de laprecisión que se obtuvo en 16 determinaciones poranalista en dos días diferentes, fue: CV de repetibilidadde 3,09% para el analista A, y 2,25% para el analista B vs.en tanto, el método oficial de la AOAC (CV de 3,62%); el

CV de reproducibilidad fue 2,70 % vs el obtenido por elmétodo oficial (de 9,72%).

Los resultados de la precisión del sistema, basados enla variación del tiempo de retención, área y altura; se mues-tran en la Tabla 1. La recuperación obtenida fue de 97,98%vs. la obtenida por el método oficial de la AOAC (de 98,8%).

Tr: tiempo de retención.A: área.H: altura.

Tabla 1. Precisión del Sistema

%RSD , teórico %RSD, experimental

5 ppm 7 ppm 9 ppm 12 ppm 15 ppm

Tr < 10% A 0,43 0,62 0,44 0,47 0,32A < 3% H 1,78 1,045 0,64 0,89 0,66H > 3% Tr 0,12 0,061 0,061 0,032 0,064

Figura 1. Cromatogramas de la curva de calibración correspondientes a5ppm y 15ppm de vitamina A.

Figura 2. Curva de calibración de Vitamina A.

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La especificidad del método se muestra en la Figura3, donde se observa la ausencia de interferencias debi-do a la adecuada extracción del analito, y además semuestra la comparación del espectro del estándar purovs el espectro del analito en la muestra.

DISCUSION

Varias técnicas han sido propuestas para la medi-ción de la vitamina A en alimentos infantiles ó fórmulasinfantiles. Cada una de ellas tiene sus ventajas y limita-ciones, pero, comparado con otros métodos por HPLC,nuestra metodología propuesta tiene la ventaja de que eltratamiento de la muestra se realiza en menos tiempo,en relación al método oficial de la AOAC 992.06 VitaminaA (Retinol) in Milk-Based Infant Formula. Además, la co-lumna que se utiliza en el método propuesto (C18) esmás comercial que la columna del método de la AOAC(ciano), ya que esta última trabaja en fase normal siendo,por tanto, más difícil de controlar y por la naturaleza nopolar del extracto, se debe usar cromatografía en fasereversa. El tiempo de corrida por muestra es tambiénmás corto en nuestra metodología (7 minutos), compa-rado con el método oficial que es de 10 minutos. Estascaracterísticas contribuyen al menor costo del análisis.

Es necesario tener presente que tanto la saponificación,la isomerización y la ruptura de la vitamina A son retarda-dos por la adición del antioxidante (ácido ascórbico) y eluso de nitrógeno, el cual interfiere con los agentes deoxidación presentes. Asimismo, el retinol y sus ésteresson rápidamente destruidos por la luz, el oxígeno y losácidos, por lo que deben almacenarse en frascos ámbaro cubiertos con papel platino o su equivalente.

La muestra y el extracto de la muestra deben protegersede la luz y la oxidación, evitándose la luz solar directa y laluz brillante. La iluminación artificial es mejor proporcio-nada por tubos fluorescentes dorados ó equivalentes.En ciertos casos, las diferentes etapas en el procedi-miento deberían realizarse en material de vidrio ámbarpara prevenir la degradación.

Dado que el calor también contribuye a la isomerización oa una posterior alteración de las vitaminas, debería evi-tarse el calor innecesario. Por lo tanto, debe tenerse cui-dado que, por ejemplo, la evaporación de los solventesse realice lo más suave posible utilizando un evaporadorrotatorio, con un buen control de la temperatura, un enfria-miento adecuado de los condensadores y un vacío óptimo.Además, se debe hacer un control espectrofotométricode la pureza del estándar.

De acuerdo a los resultados obtenidos, podemos con-cluir que el Método de ensayo CENAN-DQ.ME.16: Métodopara la Determinación de Vitamina A (retinol) en alimen-tos infantiles instantáneos por HPLC es preciso, exacto,específico y sensible para los parámetros evaluados eneste estudio, ya que se encuentran dentro de los rangosestablecidos.

REFERENCIAS

1. Curso de Alimentación y Salud. 1998 Octubre 07; pág.1. URL disponible en: http://laisla.com/uned/guianutr/compdt1.htm

2. Morón C, Zacarías Y. Producción y manejo de datos decomposición química de alimentos en nutrición. Universidadde Chile. Instituto de Nutrición y Técnica de los Alimentos(INTA). Santiago de Chile; 1999.

3. Curso de Alimentación y Salud. Recomendaciones RDA1996 sobre vitaminas. URL disponible en: http://laisla.com/uned/guianutr/tablvita

4. Jebrell WH, Harris RS. The vitamins. Vol. 1. 2nd ed. NewYork: Academic Press; 1967.

5. Freed M. Methods of vitamin assay. 3ra ed. The Associa-tion of vitamins Chemists. New York: Interscience Publish-ers; 1966.

6. Rougereau A, Person O, Rougereau G. Determination ofvitamins. In: ROCHE. Analysis of food constituents. Chapter 9.1987.

Determinación de vitamina A por HPLC

Figura 3. Cromatograma de muestra con espectro del analito.

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DETECCIÓN DE ANTICUERPOS IgG ESPECÍFICOS PARA SARAMPIÓNMEDIANTE LA TÉCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

Mónica Nieto Z1, Ana Ortiz A2, José Chauca C3

1 Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas, Universidad Nacional Federico Villarreal.2 División de Virología, Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pública, Instituto Nacional de Salud.3 Instituto de Medicina Tropical “Alexander Von Humboldt”, Universidad Peruana Cayetano Heredia.

RESUMEN

La técnica de inmunofluorescencia indirecta para detectar anticuerpos IgG específicos a sarampión (IFI-IgG) fueevaluada con la prueba de neutralización por reducción de placas (PRN) con 128 muestras de suero de personas conedades entre 0 y 15 años, 64 con antecedente de vacunación y 64 sin éste antecedente. El IFI-IgG alcanzó una sensibi-lidad de 80,4% y una especificidad de 100,0%, mostrando ser una prueba sencilla, reproducible, y tener correlación conPRN, aunque menos sensible que ésta última, especialmente cuando la PRN estimó títulos bajos de anticuerpos. Seconcluye que la técnica IFI-IgG puede ser usada como método de rutina para la confirmación de sarampión en mues-tras de fase aguda y convalesciente de la enfermedad (sueros pareados), así como para estudios de prevalencia deanticuerpos en la comunidad, aunque no reemplazaría a la PRN.

Palabras claves: Técnica del anticuerpo fluorescente indirecta; IgG; Sarampión (fuente: BIREME).

ABSTRACT

Indirect Immunofluorescence testing for detection of measles specific IgG antibodies (IF-IgG) performed in NationalInstitute of Health (Perú) was assessed using Plaque Reduction Neutralization test (PRN) in 128 sera from people agedbetween 0 and 15 years, 64 vaccinated and 64 unvaccinated. IF-IgG facilitated the detection of IgG antibodies, showingbe simple to perform, good reproducibility and correlation with PRN, although it was less sensible than this, especiallywhen the titers for antibodies were low. IFI-IgG technique can be used as a routine method for the confirmation ofmeasles in samples from acute and convalescent phase of the illness (serum pairs) and it would be also useful instudies of antibodies prevalence in the community, although it would not replace PRN. 95.31% of the vaccinated groupand 71.88% of the unvaccinated group were positive for measles using PRN.

Keys word: Fluorescent antibody technique, Indirect; IgG; Measles (source: BIREME).

INTRODUCCION

Correspondencia: Ana Ortiz Armas. Instituto Nacional de Salud. CalleCápac Yupanqui 1400, Lima 11, Perú. Apartado Postal 471. Telf.: (0511)4719920 - Fax: (0511) 4710179.Email: [email protected]

El sarampión es una enfermedad infecciosa altamentecontagiosa, de etiología viral, importante como problemade salud pública debido a que su impacto en lamorbilidad y mortalidad de los niños ha sido reconocidopor muchos años en todo el mundo1-6. En 1994, laOrganización Panamericana de la Salud (OPS) sepropuso la meta de erradicar el sarampión en todos lospaíses de América para el año 2000; sin embargo, a pesarde la extensión de las coberturas de vacunación y ladisminución del número de casos notificados, estaenfermedad sigue siendo un problema en muchos países5.

En el Perú, el sarampión ha sido la enfermedadinmunoprevenible más importante de las últimasdécadas, habiéndose notificado mayor número de casosen la niñez3,7. La última epidemia de gran magnitud fueen 1992 con un registro de 22 605 casos y 347defunciones, la que se extendió hasta 1993 con 1730casos y 24 defunciones2,3,7. Ante esta situación, elMinisterio de Salud ha efectuado acciones preventivaspara alcanzar la erradicación, logrando altas coberturasde vacunación durante los últimos cinco años, medianteintensas jornadas en menores de 15 años y la puesta enpráctica de un sistema de vigilancia epidemiológica8.

El número de individuos con anticuerpos contrasarampión varía en cada país y región, por lo que esnecesario realizar estudios periódicos de seroprevalenciaque determinen los grupos susceptibles que harían

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Rev Med Exp 2000; 17 (1-4)

posible la propagación de la enfermedad, pues laausencia de circulación del virus no impide la posibilidadde brotes1,9. Para dicho propósito, se requiere de unaprueba que sea eficaz, simple y de bajo costo, que permitarealizar en forma rápida un diagnóstico serológico de lacomunidad; por ello, el Laboratorio de VirusInmunoprevenibles y Respiratorios del Instituto Nacionalde Salud (INS) ha implementado la técnica deInmunofluorescencia Indirecta (IFI) para la detección deanticuerpos IgG contra sarampión. La técnica de IFI esampliamente utilizada y presenta muchas ventajascuando se desea determinar cuantitativamente los nivelesde anticuerpos10; sin embargo, antes de aplicar unatécnica, es necesario evaluar su utilidad comparándolacon un método referencial11 que en el caso de sarampiónes la prueba de Neutralización por Reducción de Placas(PRN), la cual es muy tediosa, costosa e involucra muchotiempo6,12,13.

En el presente estudio se realizó la evaluación de la de-tección de anticuerpos IgG específicos para el virus delsarampión mediante la técnica de InmunofluorescenciaIndirecta estandarizada en nuestro laboratorio.

MATERIALES Y MÉTODOS

SELECCIÓN DE LA MUESTRA

El estudio se realizó con muestras de suero conser-vadas a -20°C, en el Laboratorio de Virus Inmunopreveniblesy Respiratorios del INS, recepcionadas durante el año 1998de casos sospechosos de sarampión procedentes dediferentes departamentos del Perú.

Se incluyeron 128 muestras de personas con edadesentre 0 y 15 años, con datos completos sobre inmuniza-ción, agrupándolos en: a) 64 muestras de personas conantecedente de vacunación y b) 64 muestras de perso-nas sin antecedente de vacunación; cada muestra pre-sentó resultado negativo a infección por sarampión (IgMnegativo por ELISA). Se excluyeron las muestras de per-sonas de 16 años de edad a más, así como las mues-tras hemolizadas o contaminadas. Se emplearon sue-ros controles positivos, de pacientes con diagnósticopositivo a infección por sarampión (IgM positivo por ELISA),confirmados por el Instituto de Salud Pública de Chile: 2muestras positivas por respuesta a vacunación (de faseaguda y convalesciente) y 1 muestra positiva por respues-ta a infección natural (de fase convalesciente).

CULTIVO CELULAR

Se trabajó con la línea celular Vero (ATCC #CCL-81),la que se propagó en MEM-E (medio mínimo esencialcon sales de Earle) suplementado con SBF (suero bovi-no fetal), pH de 7,1-7,2. El crecimiento de las células semantuvo en medio con 8% de SBF y el mantenimiento enmedio con 2% de SBF; a temperatura de 37°C14.

VIRUS DE SARAMPIÓN

Se trabajó con el virus de sarampión cepa vacunalEdmonston-Zagreb, utilizados en el Programa Ampliadode Inmunizaciones (PAI), de características: viva, atenua-da, liofilizada, con 1000 TCID50, y desarrollada en célulasdiploides humanas (WI-38).

El virus fue replicado en dos pasajes en células Vero. Elantígeno de sarampión se obtuvo por lisis celular me-diante congelamiento y descongelamiento (temperaturaambiente y -70°C), seguido de centrifugación a 2500 rpm,por 15 minutos en refrigeración y la preservación delsobrenadante a -70°C15.

La titulación del antígeno de sarampión, se realizó por elmétodo de plaqueo en cultivo de células Vero16, para de-terminar la concentración de partículas virales infectantes(en UFP/mL).

PRUEBA DE NEUTRALIZACIÓN POR REDUCCIÓNDE PLACAS (PRN)

Se procedió según el método descrito por Albrecht12.Los sueros fueron diluidos seriadamente, al doble, em-pezando desde 1:4. Se determinó el título de anticuerposdel suero como la dilución del suero que redujo al 50% elnúmero de placas virales por el método de Karber17.

TÉCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA(IFI-IGG)

El fundamento de la técnica de inmunofluorescenciaindirecta para detectar anticuerpos IgG contra sarampiónse basó en los reportes de Riggs10.

En la producción de láminas para inmunofluorescenciase utilizó células Vero infectadas con virus de sarampióny células no infectadas (control de células normales).Las células presentaron 50-75% de efecto citopático, lasque fueron dispersadas con tripsina-EDTA yhomogenizadas con MEM-H (medio mínimo con salesde Hank), seguido de 3 lavados con MEM-H a 1200 rpmpor 5 minutos, el precipitado celular se resuspendió enMEM-H + 10% SBF para obtener una concentración de 5x 105 cel/mL. Luego, se dispensó 10 mL de suspensióncelular en cada pocillo de la lámina, así como, células noinfectadas, en la misma concentración. Las láminas sedejaron secar toda la noche y se fijaron en acetona a -20°Cpor 30 minutos, preservándose a -70°C hasta su uso.

Se empleó el conjugado anti-IgG humano marcado conFITC (isotiocianato de fluoresceína), de origen comercial(SIGMA), específico a la cadena G de la inmunoglobulinaG humana.

El título de anticuerpos IgG de los sueros se estimó me-diante diluciones seriadas al doble, en PBS 1X pH 7,2-7,4 empezando desde 1:4. Se colocó 10 mL de una dilu-ción del suero en cada 2 pocillos (antígeno y control decélulas normales), empleando 1 control positivo, 1 con-trol negativo y PBS 1X por cada prueba, se incubó a 37°C

Detección de IgG para sarampión mediante IFI

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Rev Med Exp 2000; 17 (1-4) Nieto M. y col.

en cámara húmeda por 30 minutos, se lavó 2 veces conPBS, se agregó 10 mL de conjugado y se incubó a 37°Cpor 30 minutos con 2 lavados posteriores; finalmente, sehizo el montaje de las láminas con buffer glicerinado,pH 8,5.

La lectura se realizó en el microscopio de inmunofluo-rescencia, siendo el título del suero la dilución mayor enque se observó 1+ de fluorescencia en las células.

La reproducibilidad de los resultados de la técnica IFI-IgG, se determinó estimando el título de anticuerpos en20 muestras de suero (elegidas de manera aleatoria),por repetición en dos tiempos diferentes, según Heck18.Se evaluó de manera paralela la estabilidad de las lámi-nas de inmunofluorescencia conservadas a -70°C, usan-do láminas producidas con 6 meses de anterioridad.

ANÁLISIS DE DATOS

El análisis consistió en determinar el grado de rela-ción lineal entre los títulos estimados por PRN e IFI-IgG,el porcentaje de respuesta positiva a la presencia deanticuerpos contra sarampión por PRN e IFI-IgG, y lareproducibilidad de PRN e IFI-IgG; para ello se recurrió alcoeficiente de correlación de Pearson en sus formasbivariante y parcial (controla 3 o más variables), interva-los de confianza al 95%, y el test de Wilcoxon19. Se utiliza-ron los programas SPSS/PC versión 9,0 y EPIINFO ver-sión 6,1 en el análisis estadísticos.

RESULTADOS

Los títulos de anticuerpos contra sarampión de lasmuestras séricas de personas vacunadas presentaronvalores entre 5 - 2089 por PRN y entre 4 - 1024 por IFI-IgG;las muestras séricas de personas sin antecedente devacunación mostraron títulos con valores entre 1 - 676por PRN y entre 0 - 512 por IFI-IgG.

De los 3 sueros controles positivos, sólo 2 fueron positi-vos por IFI-IgG (Tabla 1).

Tabla 1. Títulos de anticuerpos contra sarampión de sueros controlesestimados por PRN e IFI-IgG

Los títulos de anticuerpos son expresados como la inversa de la dilucióndel suero.GMT: Media geométrica de los títulos.a Persona con sarampión producido por respuesta a la vacunación.b Persona con sarampión producido por contacto con virus natural.

En la figura 1 se observa la dispersión de los títulos deanticuerpos contra sarampión de muestras séricas depersonas vacunadas, estimados por PRN e IFI-IgG. Elcoeficiente de correlación bivariante de Pearson (r) entre

los títulos estimados por ambos métodos fue significati-vo (r=0.941, p<0.001) así como el coeficiente de correla-ción parcial de Pearson (r=0.9388, p<0.001). La diferen-cia entre las formas bivariante y parcial no fue significati-va (0.2%).

La figura 2 muestra la dispersión de los títulos deanticuerpos contra sarampión de muestras séricas depersonas sin antecedente de vacunación, estimados porPRN e IFI-IgG. El coeficiente de correlación bivariante dePearson (r) entre los títulos estimados por ambos méto-dos fue significativo (r=0,88, p<0,001), así como el coefi-ciente de correlación parcial de Pearson (r=0,8345,p<0,001). En tanto que la diferencia entre las formasbivariante y parcial no fue significativa (5,2%).

Al evaluar la presencia de anticuerpos contra sarampióncon la prueba PRN fueron positivas: 95,31% (61/64) delas muestras de personas vacunadas y 71,88% (46/64) delas muestras de personas sin vacunar. Los intervalos deconfianza al 95% fueron: 86,91% - 99,02% y 59,24% -82,40% para vacunados y no vacunados, respectivamen-te. En el caso de la técnica IFI-IgG, fueron positivas: 93,75%(60/64) de las muestras de personas vacunadas y 40,63%(26/64) de las muestras de personas sin vacunar. Losintervalos de confianza al 95% fueron: 84,76% - 98,27% y28.51% - 53,63% para vacunados y no vacunados, res-pectivamente (Figura 3).

Sueros Controles Positivos Títulos de anticuerpos (GMT)

PRN IFI-IgG

Respuesta vacunal a – Fase aguda

Respuesta vacunal a – Fase convalesciente

Infección natural b - Fase convalesciente

9 (+)

708 (+)

5128 (+)

0 (-)

512 (+)

4096 (+)

Figura 1. Dispersión de los títulos de anticuerpos contra sarampión estima-dos por PRN e IFI-IgG en el grupo de personas vacunadas. Los títulos sonexpresados en su forma log + 0.5.

Figura 2. Dispersión de los títulos de anticuerpos contra sarampión estima-dos por PRN e IFI-IgG en el grupo de personas no vacunadas. Los títulosson expresados en su forma log + 0.5.

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En el grupo de muestras estudiadas, la técnica IFI-IgGmostró una sensibilidad de 80,4% y una especificidad de100%. IFI-IgG no detectó títulos menores a 16 y 32, en elgrupo de vacunados y no vacunados, respectivamente.

Finalmente, al evaluar la reproducibilidad, no se en-contró diferencias significativas entre los títulos estima-dos en dos réplicas por la técnica IFI-IgG (p=0,414).

DISCUSIÓN

El presente estudio se desarrolló para evaluar la de-tección de anticuerpos IgG específicos contra sarampiónpor la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI-IgG)estandarizada en el Instituto Nacional de Salud.

Este método es usado en diversas etiologías, y permitedeterminar de manera cuantitativa los niveles deanticuerpos10. Es de suma importancia para la confirma-ción diagnóstica de sarampión, ya que se pueden titularlos anticuerpos circulantes en fase aguda yconvalesciente en muestras de suero

20. También se

empleó en estudios seroepidemiológicos en la comuni-dad, para evaluar la inmunidad y detectar grupos de ries-go (susceptibles)

21 a esta enfermedad y aquellos que

requieren refuerzos de vacunación.

En nuestro estudio, para determinar la utilidad de la pruebaIFI-IgG, se empleó la prueba de Neutralización por Re-ducción de Placas (PRN) por su alta sensibilidad y espe-cificidad6,12,13,21. La relación entre IFI-IgG y PRN, se deter-minó analizando los títulos de anticuerpos contra saram-pión estimados por ambos métodos mediante el coefi-ciente de correlación de Pearson (r). En estudios deseroepidemiología se ha observado que los títulos va-rían de acuerdo a la edad2,22, y los niveles de anticuerposconferidos por la vacunación pueden decaer con el tiem-po de vacunación20; por lo que se determinó el coeficien-te de correlación de Pearson en sus formas bivariante yparcial, esta última incluyó las variables: edad y tiempode vacunación, pues estas podían distorsionar la rela-

ción entre los títulos de anticuerpos. Se consideraron dosgrupos de muestras séricas: a) de personas con antece-dente de vacunación y b) de personas sin antecedentede vacunación; los coeficientes de correlación de los títu-los de anticuerpos entre IFI-IgG y PRN, fueron significati-vos para ambos grupos. Es importante señalar que enambos grupos, la corrección del coeficiente de correla-ción con las variables edad y tiempo de vacunación nodistorsionó la relación entre los títulos de anticuerpos, pues noexistió diferencia significativa, siendo menores al 10%, entrelos valores determinados por las formas bivariante y parcial19.

En la figura 2, se observó la dispersión de los títulos deanticuerpos de muestras de personas sin antecedentede vacunación, donde el coeficiente de correlación fuemenor al de vacunados, por lo que el gráfico presentó uncomportamiento diferente en los títulos bajos. Los títulosmayores o iguales a 8 fueron considerados positivos paraPRN de acuerdo al CDC17. Según el estudio realizado porDe Souza21 en inmunofluorescencia, los títulos mayoreso iguales a 5 se consideraron positivos. En el presenteestudio las diluciones de las muestras séricas eninmunofluorescencia iniciaron en 1:4, considerándose positi-vas aquellas con títulos mayores o iguales a 8 (1:8).

Con respecto a los porcentajes de respuesta positiva porPRN e IFI-IgG en personas vacunadas y no vacunadas(Figura 3), como era de esperarse, se observó mayorrespuesta positiva en los vacunados, existiendo seme-janza entre los intervalos de confianza de IFI-IgG y PRN;sin embargo, IFI-IgG presentó problemas para detectartítulos menores a 16. De manera contraria, los intervalosde confianza para ambos métodos en los no vacunadosno tuvieron valores comunes, lo que hace suponer queambas pruebas tienen un comportamiento diferente eneste caso; asimismo, IFI-IgG no detectó eficazmente lostítulos de anticuerpos menores a 32.

Por otro lado, se emplearon 3 controles positivos (IgMpositivos por ELISA): dos por respuesta a la vacunación(de fase aguda y convalesciente) y uno por infección na-tural (de fase convalesciente). La tabla 1 muestra que lostres controles fueron positivos por PRN; sin embargo,sólo dos sueros (de fase convaleciente) fueron positivospor IFI-IgG. La muestra de fase aguda negativa por IFI-IgG fue obtenida un día posterior al exantema, en que losniveles de anticuerpos en el suero son mínimos, espe-cialmente las inmunoglobulinas G20, observándose nueva-mente que IFI-IgG no detectó los niveles bajos de anticuerpos.

La seroconversión es un incremento significativo mayora 4 títulos entre dos muestras séricas obtenidas en faseaguda y convalesciente (sueros pareados) de la enfer-medad23, dicho incremento fue evidente mediante la téc-nica de IFI-IgG, en los sueros pareados positivos por res-puesta vacunal.

Se evaluó la utilidad de la técnica de inmunofluorescenciaindirecta determinando su sensibilidad y especificidadpara detectar anticuerpos IgG contra sarampión en sue-ro humano enfrentándola con la prueba PRN sobre labase de los resultados (positivo y negativo) de las 128muestras en estudio. La prueba PRN detecta toda clasede inmunoglobulinas específicas al virus del Sarampión6,por ello, es importante mencionar que las muestras enestudio presentaron resultado negativo a anticuerpos IgM

Detección de IgG para sarampión mediante IFI

Figura 3. Porcentaje de respuesta positiva a PRN e IFI-IgG. La barra deerror indica el intervalo de confianza (IC) al 95%.

Vacunados PRN

No Vacunados PRN

Vacunados IFI

No Vacunados IFI

% de Respuesta Positiva

0 20 40 60 80 100

34

Rev Med Exp 2000; 17 (1-4)

contra Sarampión (por ELISA), por lo que aparentementeambas técnicas detectaron lo mismo, es decir anticuerposIgG. La técnica IFI-IgG presentó una sensibilidad menora PRN, lo que se evidenció claramente cuando los títulosde anticuerpos fueron bajos. De acuerdo a otros investi-gadores4,6,12,21,24 la prueba PRN capta títulos muy bajosen comparación con otros métodos; de manera similar ybajo las condiciones en que el presente estudio fue rea-lizado, en tanto que la técnica IFI-IgG no fue útil para cap-tar los títulos bajos de anticuerpos. La especificidad de latécnica IFI-IgG fue alta y comparable con PRN.

La variabilidad de una prueba se mide mediante sureproducibilidad. Al respecto, en nuestro estudio no seencontró diferencias significativas entre los títulos de laprimera y segunda réplica por IFI-IgG. Además, las lámi-nas para IFI-IgG presentaron estabilidad de antígenohasta 6 meses después de su producción.

En conclusión, la técnica IFI-IgG puede ser de muchautilidad como método de rutina para confirmar y evaluarseroconversión en los casos de sarampión, por su apli-cación sencilla, y reproducibilidad; además de ser útilpara los estudios de seroprevalencia y facilitar la des-centralización a través de la Red Nacional de Laborato-rios de Referencia en Salud Pública, aunque teniendopresente que no puede sustituir a la prueba PRN, cuandolos niveles de anticuerpos son bajos.

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Nieto M. y col.

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COMUNICACIÓN CORTA

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA SECUENCIA PARCIAL DELGEN DE LA GLICOPROTEÍNA NS1 DEL VIRUS DENGUE 1 PROVENIENTE

DE MÁNCORA, PERU

Carlos Yábar Varas*

* División de Biología Molecular, Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pública, Instituto Nacional de Salud.

RESUMEN

Se caracterizó una región genética que codifica la glicoproteína NS1 del virus dengue 1 proveniente de Máncora,Piura. Comparaciones de secuencias de nucleótidos revelaron un 93,32% de identidad entre el aislamiento peruano yuna cepa de Hawai. A nivel de aminoácidos, se observaron cambios de tipo no conservativos en dominios epitópicos dereconocimiento humoral. De otro lado, el perfil hidropático de la región estudiada fue similar al de otros aislamientosreferenciales. Los resultados sugieren realizar mayores análisis de identidad genética y mutaciones en dominiosepitópicos en el virus dengue 1 peruano.

Palabras claves: Virus del dengue; Proteínas no estructurales virales;; Secuencia de bases; Perú (fuente: BIREME).

ABSTRACT

A 419bp-NS1 genetic region corresponding to Dengue virus 1 was characterised from an outbreak in Máncora Piura.The comparison of nucleotide sequences revealed that Peruvian isolates showed high correlation (93.32%) with aHawaii strain. Amino acids comparisons revealed non-conservative changes into humoral response epitope domains.On the other hand, the hydropathy profile of NS1 was similar to other referential strains. The results suggest that morecomparisons are needed regarding genetic identity and mutations into the epitope domain of Peruvian dengue 1 virus.

Key words: Dengue virus; Viral nonstructural proteins; Base sequence; Peru (source: BIREME).

Correspondencia: Carlos Yábar Varas. Av. Manuel C. de la Torre 477, LosFicus, Santa Anita, Lima, Perú. Telf.: 478-0401.E-mail: [email protected]

El Dengue es una enfermedad causada por un virusperteneciente a la familia Flaviviridae, el cual estransmitido al hombre a través de la picadura de un mos-quito del género Aedes. La enfermedad se manifiesta através de tres síndromes definidos como el Dengueclásico o benigno (DC), la Fiebre hemorrágica por Den-gue (FHD) y el Síndrome de Shock por Dengue (SSD)1.

El dengue en el Perú es actualmente un grave problemade salud pública. Uno de los principales brotes de den-gue clásico ocurrió en la ciudad de Máncora, el año de1997. Todos los casos reportados correspondieron a Den-gue 1

2.

A nivel molecular el virus presenta diez genes, de loscuales siete codifican proteínas no estructurales. La primera

proteína no estructural es conocida como NS1. La importanciade NS1 radica en sus propiedades antigénicas,inmunogénicas y su posible relación con manifestacioneshemorrágicas en pacientes infectados3-6.

En el presente estudio, se analizó una región del gen dela glicoproteína NS1 (del inglés nonstructural 1) del virusDengue 1 peruano a partir del brote de Máncora. El obje-tivo fue caracterizar una región de 419 pb que codifica laporción carboxiterminal de NS1 del virus Dengue 1 pe-ruano y compararla con otras cepas referenciales de Den-gue del mismo serotipo reportadas en el banco degenes7-9. La metodología para la amplificación de estefragmento en el Perú ha sido descrita previamente10, y lasecuencia correspondiente a NS1 fue reportada en elBanco de Genes

11.

De acuerdo a los datos de comparación de secuenciasde nucleótidos, el mayor porcentaje de identidad (% denucleótidos idénticos) fue hallado entre PERD1-97 y la

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cepa de Hawai-1974 (Tabla 1) con un índice de 93.32%.Estos datos se relacionan con un parentesco filogenéticohallado entre un aislamiento peruano del año 1990 y otroproveniente de Hawaii de 194412. Considerando que lassecuencias analizadas en este estudio pertenecen aaislamientos de años distintos a los referidosanteriormente, no es posible determinar que PERD1-97esté relacionado filogenéticamente a Hawai-1945. Sinembargo es probable que el mismo genotipo de dengue1 peruano de 1990 halla permanecido latente en lanaturaleza por lo menos hasta 1997, año en que fuecaracterizado PERD1-97. En consecuencia, seríaimportante realizar un estudio de comparación entrePERD1-97 y el aislamiento peruano caracterizado en

Tabla 1. Porcentaje de identidad (I%) entre el aislamiento peruano PERD197 y otras cepas referenciales del virusDengue 1 a nivel de la porción carboxiterminal de la glicoproteina NS1

Aislamiento % IDENTIDAD

PERD1-97 SIN-90 NAU-74 HAW-45 THAI-58

PERD1-97 100

SING-90 93,08 100

NAU-74 91,89 93,32 100

HAW-45 93,32 94,51 94,27 100

THAI-58 92,36 93,08 94,75 95,07 100

PERD1-97: cepa peruana de Máncora-Piura (Este trabajo), HAW-45: cepa de Hawaii año 19457, SIN-90: cepa S275/90 de Singapur año 19909, NAU-74: Cepa West Pac 74 de la Isla de Naurú, Western pacific año 19748, THAI-58: cepaThai-Sman de Thailandia año 19587.

1994, a fin de hallar algún tipo de relación filogenéticaentre ambos aislamientos.

De otro lado,111 transiciones fueron observadas frente a10 transversiones entre PERD1-97 y los cuatroaislamientos de referencia (Ver Tabla 2). La proporciónde 11:1 hallado en este estudio concuerda con trabajospreviamente publicados13 donde se menciona que estetipo de substituciones nucleotídicas probablementeresponda a una tasa de error generada por la propia ARNpolimerasa del virus durante los procesos deincorporación de purinas y pirimidinas para la replicaciónde ARN genómico. Eventualmente este proceso tiene unatasa de error relativamente pequeña y asegura la supervivenciadel virus a la alta presión de la selección natural.

Tabla 2. Transiciones y transversiones que ocurren a nivel de un fragmento de 419 pb del gen de la proteína NS1 del virus del Dengue-1 entre el aislamien-to peruano PERD1-97 y otras cepas refernciales.

PERD1-97: cepa peruana de Máncora-Piura (Este trabajo), HAW-45: cepa de Hawaii año 19457, SIN-90: cepa S275/90 de Singapur año 1990 (9), NAU-74:Cepa West Pac 74 de la Isla de Naurú, Western pacific año 19748, THAI-58: cepa Thai-Sman de Thailandia año 19587. Las transiciones indican cambios depirimidina a pirimidina o de Purina a Purina. Las transversiones indican cambios de pirimidina (Pi) a purina (Pu) viceversa.

TRANSICIONES

Pi ® Pu Pu ® Pi

A® G G® A T® C C® T C® G T® G C® A T® A G® C G® T A® C A® T

HAW-45 4 5 7 9 0 1 0 0 0 0 1 1 28

SIN-90 4 5 11 6 0 1 1 0 0 0 1 0 29

NAU-74 6 6 8 11 0 1 1 0 0 0 0 1 34

THAI-58 4 6 10 10 1 0 0 0 0 0 0 1 32

TOTAL 112 10

Cambios denucleotidos

en PERD1 con:

TRANSVERSIONES TOTAL

Número deSubstitucionescon PERD1-97

TransicionesTransversiones = 11,2

Yábar C.

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De otro lado, el número de cambios aminoacídicos detipo no conservativos entre PERD1-97 y los demásaislamientos referenciales fue relativamente bajo. Caberesaltar que la substitución de Serina(S) porFenilalanina(F) (posición 119) sólo estuvo presente enel aislamiento peruano mientras que en los demásaislamientos S fue conservado (Figura 1). Adicionalescomparaciones usando la misma región de NS1 entreFlavivirus (datos no mostrados en este trabajo) revelaronque S es altamente conservado con excepción del virusde la encefalitis asociado a ácaros (TBEV) donde solohubo un cambio conservativo por adenina.

Figura 1. Análisis comparativo de secuencias aminoacídicas correspon-dientes al fragmento de 419 pb del gen de la glicoproteína NS1 del virusDengue-1 entre el aislamiento peruano de Máncora-Piura PERD1-97 yaislamientos referenciales. PERD1-97: cepa peruana de Máncora-Piura(Este trabajo), HAW-45: cepa de Hawaii año 19457, SIN-90: cepa S275/90de Singapur año 19909, NAU-74: Cepa West Pac 74 de la Isla de Naurú,Western pacific año 19748, THAI-58: cepa Thai-Sman de Thailandia año19587. Los aminoacidos en negrita representan cambios no conservativos.La region subrrayada en PERD1-97 señala un supuesto sitio de glicosilacionAsb-xSer/Threo. La zona sombreada corresponde a un dominio epitópicocaracterizado por Putnak15.

Por último, el análisis de hidrofobicidad mostró un perfilhidropático similar entre PERD1-97 y las cuatro cepasreferenciales de dengue. Sin embargo un pequeño picohidrofóbico apareció a nivel del aminoácido F de laposición 119 de PERD1-97 (Figura 2).

Figura 2. Análisis de Hidrofobicidad de 139 aminoácidos de la porcióncarboxiterminal del gen glicoproteína NS1 del virus dengue 1. El eje de lasordenadas corresponde al índice de Hidrofobicidad; el eje de las abcisascorresponde al número de aminoácidos. PERD1-97: cepa peruana de Máncora-Piura (Este trabajo), HAW-45: cepa de Hawaii año 19457, SIN-90: cepa S275/90 de Singapur año 19909, NAU-74: Cepa West Pac 74 de la Isla de Naurú,Western pacific año 19748, THAI-58: cepa Thai-Sman de Thailandia año19587. La flecha indica la presencia de un pico Hidrofóbico en PERD1-97 porel cambio no conservativo del aminoácido Fenilalanina (F) en la posición 119.

SIN-90

PERD1-97

HAW-45

NAU-74

THAI-58

Caracterización molecular del virus dengue 1

N°AA 10 20 30PERD1-97 DMGYWIESEK NETWKLARAS FIEVKTCIWPHAW-45 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .V. .SING-90 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .V. .NAU-74 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .THAI-58 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

N°AA 40 50 60PERD1-97 KSHTLWSNGV WESEMIIPKI YGGPISQHNYHAW-45 . . . . . . . . . . L. . . . . . . . . . . . . . . . . . .SING-90 . . . . . . . . . . L. . . . . . . . . . . . . . . . . . .NAU-74 . . . . . . . . . . L. . . . . . . . . . . . . . . . . . .THAI-58 . . . . . . . . . . Q. . . . . . . . . . . . . . . . . . .

N°AA 70 80 90PERD1-97 RPGYFTQTAG PWHLGKLELD FDLCEGTTVVHAW-45 . . . . S. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .SING-90 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .NAU-74 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .THAI-58 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F. . . . . . .

N°AA 100 110 120PERD1-97 VDEHCGNRGP SLRTTTVTGK IIHEWCCRFCHAW-45 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S .SING-90 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S .NAU-74 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S .THAI-58 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S .

N°AA 130 139PERD1-97 TLPPLRFRGE DGCWYGMEI FIEVKTCIWPHAW-45 . . . . . . . K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .SING-90 . . . . . . . K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .NAU-74 . . . . . . . K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .THAI-58 . . . . . . . K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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De manera interesante el pico hidrofóbico alterado sehalló dentro de un dominio epitópico que fue reportadopor Putnak14 en otras cepas de dengue. Estos cambiosen regiones o dominios importantes de NS1 han sidorelacionados con procesos de evasión de la respuestainmune y virulencia del agente infeccioso tal como sehalló en el virus de la fiebre amarilla15. También se hademostrado que algunos dominios epitópicos de NS1son altamente homólogos a adhesinas e integrinas yque podrían generar procesos hemorrágicos6. Enconsecuencia la aparición de cambios no conservativosy/o la alteración de dominios epitópicos deben serampliamente estudiados en cepas peruanas de dengue1, con el fin de analizar con mayor detalle algún tipo deevento molecular en NS1 que este produciendoatenuación o exacerbación de la patogenicidad del virus.

Pese a estos pequeños cambios, los perfiles dehidrofobicidad entre PERD1-97 y las cepas de referenciafueron en general superponibles. Esta característica deconservación es propia de proteínas que cumplenimportantes roles biológicos. En el caso de NS1, algunosautores proponen que la proteína podría estar implicadaen procesos de replicación viral, específicamente comoparte de la maquinaria de replicación del ARN16.

En resumen a partir de los datos obtenidos en este trabajose sugiere profundizar el estudio de las comparacionesfilogenéticas entre diferentes aislamientos peruanos dedengue 1 a través del tiempo. Dichos datos ayudarían aestablecer si un mismo genotipo de dengue 1 seencuentra circulando en el país o están apareciendonuevos genotipos.

Asimismo el análisis de las variaciones genéticas enotros dominios importantes del gen que codifica NS1 debeser profundizado conjuntamente con estudiosinmunológicos que revelen la importancia de estoscambios durante la respuesta humoral frente al virus.Asimismo otros genes virales que codifican proteínasimplicadas en la virulencia y procesos de respuestainmune deberían ser analizados a fin de dilucidar lanaturaleza del dengue 1 que circula en el Perú.

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15. Muylaert I, Galler R, Rice C. Genetic Analysis of the yel-low fever virus NS1 protein: identification of a temperature-sensitive mutation wich blocks RNA acumulation. J GenVirol 1997; 71(1): 291-98.

16. Lindenbach BD, Rice CM. Genetic interaction of flavivirusnonstructural proteins NS1 and NS4A as a determinant ofreplicase function. J Virol 1999; 73(6): 4611-21.

Yábar C.

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TEMA DE REVISIÓN

DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO DE LA LEISHMANIASISTEGUMENTARIA AMERICANA

César Augusto Cuba Cuba*

* Departamento de Patología, Universidad de Brasilia, Brasil.

RESUMEN

La demostración directa o indirecta de Leishmania en las muestras patológicas continúa siendo un importantedesafío en el diagnóstico parasitológico de esta protozoosis. A pesar de los avances significativos surgidos en inves-tigaciones de biología molecular, muchas de sus técnicas con potencial aplicación diagnóstica, continúan siendosolamente herramientas de los laboratorios de investigación científica. Pocas de ellas se encuentran en fase devalorización clínica y epidemiológica en áreas endémicas, y quizás, de manera optimista, muy pocas estarían a dispo-sición de los laboratorios de diagnóstico de salud pública en la próxima década. Mientras tanto, seguiremos contandocon el auxilio de los llamados métodos clásicos de la Parasitología básica que todavía, en las manos de individuosexperimentados, diagnostican la gran mayoría de los casos.Este artículo identifica los métodos recomendados por los especialistas del tema, describe los procedimientos consa-grados por su sensibilidad y reproductibilidad, concluyendo que, éstos continuarán vigentes, siempre que sean correc-tamente ejecutados.

Palabras clave: Leishmaniasis cutánea/diagnóstico; Leishmaniasis mucotánea/diagnóstico; Parasitología/métodos (fuente: BIREME).

ABSTRACT

Direct or indirect demonstration of Leishmania in pathological samples still constitutes a critical challenge when itcomes to the parasitological diagnosis of this protozoose. In spite of significant and novel advances in the field ofmolecular biology of Leishmania, many of the techniques with a real potential diagnostic application, still continue to bethe tools for laboratory scientific investigation. Few methods are in the stage of clinical and epidemiological applicationin endemic areas. Being optimistic, very few techniques would be available at public health laboratories in the nextdecade in developing countries, where these parasites are prevalent. Meanwhile, we will have to continue to rely on theso called classical methods of Basic Protozoology, which under the supervision of experienced professionals willprovide a diagnosis for the great majority of the cases.

This overview identifies the methods recommended by experts in this field, it also describes the procedures widelyrecognized by its sensitiveness and reproducibility, and it demonstrates that these methods will continue to be used ifthey are appropriately performed.

Key words: Leishmaniasis cutaneous/diagnosis; Leishmaniasis mucotaneus/diagnosis; Parasitology/methods (source: BIREME).

INTRODUCCIÓN

El género Leishmania comprende protozoarios pará-sitos pertenecientes a la Familia Trypanosomatidae y alOrden Kinetoplastida, cuya principal característica estruc-tural es la de poseer un orgánulo citoplasmático: elkinetoplasto. La presencia de este último, es de capitalimportancia en la identificación morfológica de las fasesevolutivas del género Leishmania.

El ciclo evolutivo, aparentemente simple, transcurre endos huéspedes: un vertebrado (el hombre y otros mamí-feros susceptibles), y un invertebrado (un insecto, la hem-bra hematófaga de un flebótomo del género Lutzomyia(Diptera, Psychodiidae). En el flebótomo, dos formas evo-lutivas se desarrollan en el tubo digestivo: una formafiagelada, las promastigotes, con capacidad de multipli-

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carse asexualmente por división binaria longitudinal; yotra forma, que se diferencia morfológica yfisiológicamente para pre-adaptarse al parasitismointracelular en el hospedero mamífero, éstas son las for-mas de promastigotas metacíclicas o formas infectantes1.Cuando el insecto pica un vertebrado susceptible, lasformas metacíclicas son inoculadas en la piel y dermis, yson fagocitadas por las células del Sistema FagocitarioMononuclear (SFM). Las células invadidas permiten latransformación de las formas flageladas en formasamastigotes, en el interior de las vacuolas parasitóforas.Los amastigotes de Leishmania tienen la capacidad deevadir la acción parasiticida de las células del SFM y ade-más, de multiplicarse por división binaria simpleasexuada. Muchas de esas células liberan losamastigotes, en tanto que otras células, fagocitan losparásitos diseminando así el parasitismo en los tejidos,nódulos linfáticos y otras localizaciones tegumentarias.El resultado del proceso referido es la configuración decuadros cutáneos y mucosos polifacéticos. Sumariamente,son vistas lesiones de tipo ulceroso, nodular, necrótico,vegetante, plaquetiforme, etc. Este polimorfismo clínicode las leishmaniasis cutáneas y mucosas influenciansubstancialmente los procedimientos empleados en eldiagnóstico parasitológico.

Lamentablemente, cierto porcentaje de los individuosparasitados con algunas especies del sub-géneroViannia (ver Tabla 1) desarrollan lesiones metastásicascon localizaciones subcutáneas linfonodulares, llama-das formas «esporotricoides» causadas por L.(V).guyanensis2, y localización en ganglios linfáticos3,4 ymucosa del tracto respiratorio naso-buco-faríngeo-laringeos provocadas por L. braziliensis y, menos fre-cuentemente, por L. panamensis6,7.

Un cuadro clínico caracterizado por una anergia selectivaen la inmunidad celular del individuo afectado, es la enti-dad nosológica conocida como Leishmaniasis CutáneaDifusa (LCD). En América, los infectados con L.amazonensis presentan un parasitismo extremamenteagresivo e incurable: nódulos subcutáneos, y/o placascoalescentes, no ulceradas, que contienen un númeroimpresionante de amastigotes y que, generalmente, res-petan las mucosas. En individuos inmunocompetentes,parasitados por L. (L) amazonensis, las lesiones sondelimitadas, curables, pero interesantemente, presen-tan un porcentaje elevado de pacientes reactores negati-vos a la reacción de Montenegro8.

La preocupación de varios investigadores con relación ala etiopatogenia de las leishmanias es la comprobaciónde las vías probables de diseminación del parasitismopor Leishmania. La comprobación de la hipótesis de di-

fusión hematógena y/o linfática ha producido resultadoscontradictorios. Los cultivos de la llamada «cremaleucocitaria» de un paciente mucoso resultaron positi-vos según lo reportado por Bowdre9, en tanto que, losaislamientos de Leishmania de linfonódulos vecinos alas lesiones, refuerzan la hipótesis de diseminaciónhematogénica y/o linfática3. Nosotros fracasamos en losintentos de aislar L. (V) braziliensis en cultivos demonocitos circulantes, en pacientes cutáneos ymucocutáneos10,11. Recientemente, Silveira no logró de-mostrar, en sangre periférica de pacientes parasitadospor L. (L) Amazonensis, amastigotes circulantes usandohemocultivo12; y últimamente, el asunto ha sido actualiza-do por Martínez quien refiere haber aislado L. (V)braziliensis de dos pacientes con lesiones mucosas: losparásitos fueron evidenciados por centrifugación diferen-cial de células mononucleares de sangre circulante13.Todo esto no quiere decir que pensemos incluir comorutina diagnóstica, al hemocultivo, ya que consideramoseste fenómeno un hecho esporádico y de difícilreproducibilidad.

Las leishmaniasis tegumentarias son diagnosticadas,en conclusión, cuando se demuestra la presencia deamastigotes en las lesiones sugestivas de este parasi-tismo. Igualmente, si por cultivo «in vitro», comprobamosla evolución de formas promastigotes derivadas de lasrespectivas formas intracelulares.

Es bien conocido que, las leishmaniasis tegumentariasson causadas por una variedad de diferentes miembrosdel género Leishmania. Se sabe también que lapatogenicidad, abordaje terapéutico y los posibles méto-dos de control de este complejo síndrome de enferme-dades son determinados, en gran parte, por la especiede Leishmania. Es, por lo tanto, extremadamente impor-tante que en cualquier caso de leishmaniasis el agenteetiológico sea identificado. En ese sentido, los científicosvienen desplegando considerables esfuerzos para con-seguir métodos que asocien diagnóstico e identificaciónen forma simultánea. La sonda ideal sería aquella desensibilidad, especificidad y reproducibilidad total, apli-cada directamente en las muestras retiradas de las heri-das de los pacientes. Aparentemente los biólogosmoleculares estarían próximos a proporcionarnos estasherramientas.

La Tabla 1 nos muestra las especies de Leishmania des-critas que parasitan al hombre, así como su distribucióngeográfica en América. La especie predominante en lagran mayoría de focos endémicos y brotes epidémicos14

de Leishmaniasis Tegumentaria Americana (LTA) es L.V.braziliensis15-17; lamentablemente, esta es la especie másdifícil de diagnosticar y tratar.

Cuba C.

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Tabla 1. Agentes Etiológicos (Especies de Leishmania) de Leishmaniasis Tegumentaria Americana (LTA) y su distribución geográfica.

MÉTODOS Y TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO PARASITO-LÓGICO DE LTA

Debemos siempre tener en cuenta que los procedi-mientos empleados en el diagnóstico de LTA depende-rán, en gran parte, de la finalidad e infraestructura dellaboratorio en que actuemos. Si se trata de un laboratoriode investigación, que apoya logísticamente estudiosepidemiológicos en áreas endémicas, la metodologíaserá más compleja; sin embargo, si se trata de un labo-ratorio hospitalario o de una posta médica de salud, es-cogeremos las técnicas que por su simplicidad, costo yreproducibilidad sean las más efectivas y sensibles.

Por otro lado, sabemos que, debido al polimorfismo clí-nico de la LTA, los métodos de demostración y aislamiento

de los parásitos variarán en la obtención de las mues-tras.

La Tabla 2 presenta una revisión parcial de la literaturarecientemente publicada, y en el que pretendemos mos-trar la interdependencia que existe entre el tipo de proce-dimiento utilizado en la colecta de las muestras clínicas yla sensibilidad del diagnóstico parasitológico.

Dos alternativas surgen en el diagnóstico parasitológico.La primera será demostrar que el paciente está alber-gando Leishmania: lo haremos visualizando losamastigotes en los tejidos infectados. La segunda op-

Parásitos* Tipo de enfermedad Distribución geográfica

A) Sub-Género LEISHMANIA

Leishmania (Leishmania) mexicana Leishmaniasis cutánea México, Belize (LC) “úlcera de los chicleros”

Leishmania (Leishmania) venezuelensis LC Venezuela

Leishmania (Leishmania) amazonensis† Leishmaniasis cutánea Brasil, Ecuador, Difusa (LCD) Venezuela, México

Perú, Bolivia, GuyanaFrancesa, RepúblicaDominicana

B) Sub-Género VIANNIA

Leishmania (Viannia) braziliensis Leishmaniasis Brasil, Paraguay, Perúcutánea (LC), mucosa y Bolivia, Colombiacutáneo-mucosa (LCM) Argentina, Ecuador “espundia” Venezuela, Nicaragua

Leishmania (Viannia) guyanensis‡ LC “plan bois”, LCM Guyana Francesa, Brasil†(poco frecuente)‡ Perú, Colombia‡

Leishmania (Viannia) panamensis¶ LC, LCM (poco frecuente)¶ Panamá, Colombia¶

Ecuador, Nicaragua,Costa Rica

Leishmania (Viannia) colombiensis LC Colombia

Leishmania (Viannia) peruviana LC “Uta” Perú

Leishmania (Viannia) naiffii LC Brasil

Leishmania (Viannia) lainsoni LC Brasil

Leishmania (Viannia) shawii LC Brasil

* Lainson18

†, ‡, ¶ Algunas veces causando compromiso mucoso.

Diagnóstico parasitológico de LTA

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ción, será intentar aislar directamente de las lesionessospechosas, en cultivos «in vitro», los promastigotes.Ambas son las más recomendadas, aunque en la prác-tica, en los servicios de salud pública solamente losfrotices de material de las lesiones son ejecutados. Sinembargo, ambos procedimientos son aplicados de ruti-na en los estudios epidemiológicos, en muchos focosendémicos de América.

En la siguiente secuencia de este artículo discutire-mos algunas dificultades encontradas en la investiga-ción de Leishmania en pacientes. Se formularán reco-mendaciones y se señalarán pequeños detalles para re-forzar la habilidad de diagnosticar los parásitos.

COLECCIÓN DE MUESTRAS PATOLÓGICAS

1. Investigación de Amastigotes

1.1. De lesiones cutáneas:

La úlcera es la más frecuente presentación clínica deLTA. Independientemente de la especie de Leishmaniacausante del cuadro dermatológico, estas lesionesulcerosas francas generalmente se encuentran conta-minadas secundariamente con diversos patógenos. Pue-den estar presentes hongos como Paracoccidiodes

braziliensis, y Histoplasma capsulatum, Sporothrixschenckii y bacterias piogénicas, tipo Staphylococcus yStreptococcus, o también Mycobacterium.

Es práctica universal proceder a ejecutar una buena ta-rea aséptica previa, a la toma de la muestra. Se usanlíquidos antisépticos como agua oxigenada (10 volúme-nes), Furacin (0,22 mg/ml), alcohol al 95% o alcohol al70%. La finalidad es remover el material costroso, teji-dos necrotizados, pus y otros detritos de las lesiones.Incluso, algunos han realizado estudios comparativosentre el uso de la solución iodada con una solución deagua y jabón en la optimización de la asepsia de lasheridas, previas al cultivo de Leishmania, concluyendoque no existía diferencias en la utilización de uno u otroelemento en cuanto a su potencial interferencia en la via-bilidad del parásito.

Esta primera etapa del trabajo diagnóstico es importantey ha recibido la atención de muchos investigadores, quie-nes, dependiendo del método de recolección utilizado,han encontrado una eficiencia en sus resultados quevaría entre 18,0% y 52,0%. El porcentaje encontrado porNavin19 en 65 lesiones de pacientes infectados, supues-tamente, por L. (V) braziliensis y/o L. (L) mexicana, essorprendentemente elevado con relación a otras observa-ciones y a las nuestras. Pensamos que los autores diag-nosticaron pacientes infectados predominantemente por

Tabla 2 . Sensibilidad de los procedimientos utilizados en la demostración directa por frotices de amastigotes en LTA (lesiones cutáneas).

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Investigador/País Procedimientos No. (de lesiones/ SensibilidadInstrumentos pacientes) Diagnostica

No. de % dePositivos Positividad

Navin19 Biopsia- Bisturí 65 lesiones 34 52,0Guatemala (N( 10-15)

Raspado-Escobilla 65 lesiones 32 49,0Dental broach N° 6)

Aspirado con tubos 65 lesiones 34 52,0Capilares (hematocritos)

Weigle20 Biopsia-Bisturí 101 pacientes 33 32,7Colombia (N° 10-15) (parásitos +)

Biopsia “punch” 4mm 96 pacientes 20 20,8(Montenegro+)93 pacientes 26 27,9(parásitos +)

Urjel21 Raspado-Escobilla 32 pacientes 01 3,1(Dental broach N° 6) Raspado-Palito de 32 pacientes 06 18,7Fósforos (Matchstick)

Cuba Cuba Biopsia “punch” 4mm 120 pacientes 21 18,0(en preparación) (Montenegro+)

Raspado-Palito de 92 pacientes 30 32,6fósforos (Matchstick) (parásitos +)

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L. (L) mexicana, sub-género caracterizado por su eleva-da densidad parasitaria.

Cuando, por el contrario, los parásitos circulantes enáreas endémicas pertenecen al sub-género Viannia, laeficiencia de visualización y aislamiento de Leishmaniaes menor. Los resultados por frotices se sitúan en uníndice de alrededor de 30,0% - 40,0% de los pacientesinfectados.

Los datos de la literatura que mejor se comparan son losde Brasil y Colombia, esto debido al empleo de protoco-los similares de diagnóstico parasitológico. En Brasil,desde el inicio de nuestros estudios, observamos quevisualizar amastigotes de Leishmania en nuestros pa-cientes era tarea difícil. Esa dificultad, está relacionadacon la biología del parasitismo que cada especie exhibeen el hospedero humano: en 1981, diagnosticamos enlos frotices directos de las lesiones 25,0% de resultadospositivos, quince años después, esta figura mejoró a44,0%.

Sobre el aporte de la histopatología, siempre fue y conti-núa siendo difícil para un patólogo visualizar amastigotesde Leishmania en los cortes de tejido rutinariamente co-loreados por hematoxilina-eosina (H&E). Nosotros afir-mamos esto porque frecuentemente observamos quefragmentos de las mismas biopsias presentaban pará-sitos en los frotices coloreados por Giemsa. En nuestracasuística inicial, nuestro patólogo describió un 27,0%de histología positiva, similar a otras series de 28,0%22 ymuy parecidas a las de Weigle (21,0%)23, Navin (18,0%)19

y Dimier-David ( 26,6%)24 .

Es digno de mencionar el comentario de Ridley25, quedice que la mayoría de patólogos están de acuerdo queun diagnóstico histológico confiable de leishmaniasis esimposible sin la identificación del parásito. En este con-texto, una alternativa sería el empleo de la técnica deGiemsa-colophonium26, empleada en la coloración delos parásitos tisulares de malaria. En nuestra experien-cia, limitada a observaciones de leishmaniasis experi-mental en hamsters, los amastigotes de L. (V) braziliensisson bien evidenciados, especialmente por una nitidezmayor del kinetoplasto que se colorea de rojo intenso enlos cortes clarificados por el colophonium. De acuerdo anuestro conocimiento, esta técnica no ha sido evaluadaen muestras humanas clínicas de LTA.

Un avance importante en este campo ha sido la introduc-ción de técnicas inmunocitoquímicas. Sells27 utilizó conéxito relativo Ia técnica de inmunoperoxidasa indirecta(IMPI) con un antisuero policlonal de conejo para marcaramastigotes en dos pacientes con leishmaniasis. La IMPIfue también evaluada en 265 biopsias de lesionestegumentarias causadas por L. (V) braziliensis y L. (V)panamensis en Colombia; en este último estudio, laobservación y localización de los parásitos fue más efi-ciente usando el método de IMPI (61,0% de positividad,en 181 pacientes) que lo obtenido con la histopatología

convencional con H&E (34,8%), la eficiencia del métodode IMPI fue mayor en lesiones precoces (75% de los ca-sos con menos de 3 meses de evolución), 37,5% (6meses) y 21% en los de 12 meses a más. Asímismo, eluso combinado del examen directo e IMPI permitió undiagnóstico etiológico de 72,0%28.

De otro lado, Lynch29 y Anthony30 usaron anticuerposmonoclonales en la detección de amastigotes de lesio-nes cutáneas.

1.2 De lesiones Mucosas:

En relación con las formas mucosas únicas o múlti-ples, los procedimientos generalmente utilizados para eldiagnóstico de amastigotes son:

- La biopsia obtenida con la ayuda de pinzas cortantesespeciales (Cutting biopsy punch), después de la in-filtración con un anestésico local (xylocaina al 10%,por ejemplo). Se retira un número variable de frag-mentos de tejido en la dependencia de la extensióndel granuloma y de su accesibilidad.

- Los frotices de las biopsias que, fijados con alcoholmetílico o mejor, con líquido de Bouin, son colorea-dos por el método de Giemsa.

- Biopsias para estudios histopatológicos, fijadas conFormol-Zenker (neutro) al 10%, y cortes de Slim colo-readas por H&E.

Los datos parasitológicos cuantitativos de la infecciónmucosa son extremamente escasos. Muy pocas son laspublicaciones que localizan la eficacia y sensibilidad delos procedimientos empleados. Generalmente el análi-sis del parasitismo se realiza en las formas cutáneomucosas.Todos sabemos que L. (V) braziliensis es difícil de diag-nosticar en los granulomas mucosos31.

En 1981, nosotros informamos que de 27 pacientes, 5(19,9%) fueron amastigotes positivos en los frotices debiopsias. En otra serie de pacientes, en 1984, publica-mos los siguientes resultados para nuestros 51 pacien-tes evaluados: 27,4% de positividad en los frotices de lasbiopsias y 16,0% para los hallazgos histopatológicos.Estos resultados son opuestos a los de Dimier-David24

que publicaron una positividad de 17,7% en 112 froticesde individuos con lesiones mucosas. Ellos describierontambién que, en su casuística de 116 pacientes mucosos,la histopatología fue positiva en 28,4% constituyéndoseésta última, en su opinión, en la técnica más eficientepara la demostración parasitológica de L. (V) braziliensis.

Marsden32 llama la atención que es más fácil detectar losparásitos en lesiones mucosas múltiples, que en lesio-nes únicas de L. (V) braziliensis; Dimier-David24, en Bolivia,trabajando con infecciones causadas por L. (V)braziliensisen pacientes con lesiones mucosas múltiples y únicas,encontró similar información: 57,7% y 42,2% depositividad, respectivamente.


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2. Investigación de Promastigotes

De las fases evolutivas de Leishmania, la formapromastigote es la más fácil de ser cultivada «in vitro»,en ella se hacen la mayoría de las investigacionesparasitológicas. Enfatizando los aspectos médicos yepidemiológicos, los principales objetivos del cultivo deLeishmania son:

- El diagnóstico de la infección por los laboratoriosde Salud Pública y de hospitales.

- El aislamiento primario del parásito del hombre,flebótomos y otros reservorios mamíferos, en losestudios epidemiológicos.

- La preparación de «stocks» de Leishmania, paraestudios bioquímicos e inmunológicos de identifi-cación, o la elaboración de antígenos convenciona-les no purificados.

- El clonaje de «stocks» y cepas representativas paratests «in vitro» de susceptibilidad o resistencia alos quimioterapéuticos.

No es nuestra intención revisar la extensa literatura pu-blicada por diversos investigadores en relación al cultivo«in vitro» de Leishmania. Los lectores interesados pue-den remitirse a las revisiones del tema hechas porHendricks33, Jaffe34, y Evans35. Se dará énfasis a los pro-cedimientos y medios que, en nuestro concepto, han con-tribuido al mejor diagnóstico de LTA. Muchos de esosmétodos han sido empleados por nuestro grupo a lo lar-go de los últimos 18 años de investigaciones en L. (V)braziliensis.

Ya en la década del 70, era opinión generalizada que losparásitos pertenecientes al hoy, sub-género Viannia(braziliensis complex), eran difíciles de cultivar. Este he-cho era completamente opuesto a la facilidad con que secultivaban las leishmanias del sub-género Leishmania(mexicana complex) en cualquier medio de agar sangre.Hoy sabemos que no existe un único medio de cultivoartificial capaz de reunir características tales que consigacumplir los objetivos enunciados. Lo ideal sería un me-dio universal que sea sensible, líquido, liofilizable, quemantenga un tiempo de validez para su uso relativamen-te largo y, finalmente, sea protegido por antibióticos yantimicóticos36. Podemos afirmar que, continuamosaguardando la formulación de tal medio ideal, el que se-ría una gran contribución para los laboratorios de las áreasendémicas.

Diversos autores37-39 han abordado el tema empleandodiversos medios líquidos, normalmente utilizados en elcultivo de células de insectos, y también de células demamíferos, en Leishmania del Nuevo y Viejo Mundo. Sinembargo, la regla básica es que se requieren diferentesmedios de cultivo para cumplir diferentes finalidades, esdecir, no existe un medio universal que sirva para aislar,multiplicar el parásito y mantenerlo por largo tiempo ensubinóculos sucesivos y para obtener gran masa de célu-

las. Si bien existen medios que sirven para el transportey mantenimiento prolongado de los parásitos ya adapta-dos artificialmente, ellos no son tan eficientes para propi-ciar la transformación de amastigotes en promastigotes,paso indispensable para un eficiente aislamiento prima-rio del parásito en los pacientes de leishmaniasis. Ade-más, el crecimiento de las diversas especies deLeishmania y de los diversos «stocks» aislados en pun-tos geográficos distintos es variable, por lo que se nece-sita del uso de varios tipos de medios.

Por lo tanto, es recomendable que cada área endémicade LTA ensaye primero algunos medios conocidos porsu sensibilidad. Esto permitirá una mayor eficiencia futu-ra en el aislamiento de los parásitos que circulan en elfoco de transmisión.

3. Medios de Cultivo

3.1 Monofásicos (líquidos)

En el cultivo de Leishmania se han empleado me-dios de cultivo de células de mamíferos, suplementadoscon porcentajes variables de Suero Bovino Fetal (SBF).Algunos ejemplos de ellos, reportados en la literaturacon eficacia variable, son: el medio de Eagle, el medioMEM (Mínimal Essential Medium, 20%, SBF), el medio199 TC, y el Medio RPMI 1640. Estos medios son dedifícil aplicación y uso en las áreas endémicas de lospaíses pobres, ya que el costo y la necesidad de importa-ción dificultan su aprovechamiento.

También se utilizan medios líquidos empleados en elcultivo de células de insectos, como por ejemplo el me-dio de Schneider (muy empleado en el cultivo de célulasde Drosophila y que ha tenido mayor difusión en nues-tros países), el medio Grace y el medio de Mitsuhashi-Maramosch, estos dos últimos utilizados en aspectosbiológicos moleculares de Leishmania1. Es oportuno co-mentar que la concentración del SBF empleada, revistemucha importancia en el éxito del cultivo de Leishmania:todos los medios líquidos citados emplean concentra-ciones variables de SBF que fluctúan entre 10,0% y 20,0%.

3.2 Medios Bifásicos

Diversos autores han publicado listas detalladas demedios de cultivo sólidos, semisólidos y bifásicos em-pleados en el cultivo de los promastigotes y la cinética decrecimiento de Leishmania33,35. Citaremos únicamentelos más utilizados por los investigadores latinoamericanos:

- Medio Bifásico de Agar Sangre, NNN, 3N (Medio deNovy, McNeal, Nicolle)40: constituye el más antiguo yconocido medio empleado para el cultivo de parási-tos hemáticos y tisulares.

- Medio de Agar Sangre USAMRU38: medio de compo-sición simple, preparado con un agar base enrique-cido, consagrado por la mayoría de los investigado-res, en América.

- Medio de Senekjie: enriquecido con Bacto-peptonay Bacto-beef, ha sido constantemente utilizado enPanamá y Colombia con éxito en el diagnóstico de LTA.

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Entre algunas de las ventajas prácticas de la adopciónde medios bifásicos de agar sangre para el diagnósticoprimario se mencionan las siguientes:

- Son particularmente valiosos para el aislamiento pri-mario y el mantenimiento, por largo tiempo, de los«stocks» de Leishmania.

- Permiten la morfogénesis celular de amastigotes enpromastigotes, en la gran mayoría de los aislados deL. (V) braziliensis, y de otras especies del sub- géne-ro Viannia, así como del sub-género Leishmania.

- Son apropiados para los estudios de curvas de creci-miento, lográndose densidades de 107-108

promastigotes por mL de cultivo «in vitro». El mediopermite también el establecimiento de la fase esta-cionaria de crecimiento, en aproximadamente 6-7 días(ver Figura 2), característica importante para la mayoreficiencia de la infectividad de las cepas deLeishmania.

- Son de fácil preparación y de bajo costo, sobre todoen nuestro medio.

Entretanto, existen también algunos inconvenientes en-tre los cuales podríamos citar:

- La dificultad de poder estandarizarse, por ser quími-camente complejos y no definidos.

- No son apropiados para el crecimiento en masa delos flagelados por la presencia del agar, por lo que esnecesario utilizar mejor los medios líquidos para lapreparación de antígenos convencionales y célulaspara estudios bioquímicos.

Un medio bastante empleado y de eficiencia comproba-da en el aislamiento primario y conservación de «stocks»es el agar sangre USAMRU (agar enriquecido de laDIFCO). Diversos autores lo emplean validando su bue-na actuación y sensibilidad10,42-45 y nosotros lo adopta-mos como medio de rutina para el diagnóstico de LTA.Nuestro laboratorio en Brasilia, ha cultivado en los últi-mos años más de 500 aislados de L. (V) braziliensis, yeste medio ha servido para formar el Banco deCriopreservación de la Unidad de leishmaniasis con ce-pas criopreservadas por más de 18 años que sirven pararealizar modernos estudios de genética y de biologíamolecular en L. (V) braziliensis. Un ejemplo de ello es laMHOM/BR/83/LTB-300, cepa de referencia internacionalde la Organización Mundial de la Salud (OMS), productodel criobanco de Brasilia46.

Sin embargo, algunos autores prefieren el mediobifásico de Senekjie modificado por la adición de mediolíquido RPMI-1640 y con 30,0% de sangre desfibrinadade conejo47-48. El aislamiento primario de L. (V) guyanensisha sido logrado exitosamente en éste medio por Santrich6.

4. Métodos de Cultivo

4.1 Aislamiento primario de las lesiones cutáneas

Constituye el paso más importante del proceso diag-nóstico, ya que de este procedimiento dependerá el futu-ro establecimiento del parásito y su crecimiento «in vitro».

La sensibilidad del método está directamente relaciona-da con la correcta selección que hagamos del mediomás apropiado. Asimismo, la habilidad del investigadorpara escoger el local de la lesión que sea la de mayoractividad parasitaria, solo surge después de varios añosde experiencia y práctica.

En el contexto anterior, se aconseja un estudio pilotoempleando algunos medios conocidos. Este estudioservirá de marco referencial para saber con que parási-tos estamos trabajando en la región. Este abordaje esta-blecerá, en corto período de tiempo, el medio apropiadopara el aislamiento primario. Posteriormente, si estamosinteresados en estudios más profundos de la biología oepidemiología de las leishmanias, usaremos otros me-dios existentes en la literatura18.

Para la realización de los cultivos, nosotros preferimos latécnica de aspiración de las lesiones, por el procedimien-to descrito inicialmente por Hendricks38, ligeramente mo-dificado. Preferimos utilizar una jeringa más potente, de5mL, y una aguja de mayor calibre, 22G. El vehículo será0,2- 0,3 mL de suero fisiológico estéril (Figura 1).

Previamente, y conforme ya fue discutido, es crucial unriguroso proceso de asepsia y limpieza de las lesiones.Esto va íntimamente relacionado con los problemas decontaminación por otros microorganismos45,49. La super-ficie del área a ser trabajada es limpiada, de manerasistemática y en forma secuencial, con: agua oxigenada,agua estéril con detergente, alcohol iodado, alcohol al95%, y finalmente agua estéril. Este ritual ayudará a dis-minuir significativamente la contaminación bacteriana yfúngica. La muestra también puede ser obtenida a travésde una biopsia («punch»), y posteriormente triturada conla ayuda de un «tissues grinder», en una solución desuero fisiológico y antibióticos (Garamicina, 200 mg/ml;S-Fluorocytosine, 250 mg/mL). Algunas gotas de estehomogenizado serán inoculadas en los tubos de cultivo.Es importante señalar que la excesiva presencia de san-gre en las muestras colectadas es perjudicial para eldesarrollo del parásito. Según Evans35, la sangre contieneproteínas séricas altamente inhibitorias para el crecimiento delos promastigotes de Leishmania.


Figura 1. Aislamiento primario de Leishmania a partir de lesiones cutáneas.

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4.2 Aislamiento primario de las lesiones mucosas

Es bastante difícil aislar Leishmania de los granulomasmucosos, en medios de cultivo. La razón principal es laelevada contaminación de los tubos de cultivo, ya quetanto bacterias como hongos ambientales y del huéspedcrecen rápidamente en los medios eliminando la posibi-lidad del crecimiento del parásito. Nosotros hemos em-pleado algunos procedimientos para aliviar el problema,como el descrito por Herrer50. De manera similar, incuba-mos fragmentos de las biopsias de los tejidos mucososen altas concentraciones de antifúngicos (5-Fluorocytosine)y antibióticos (Gentamicina y Estreptomicina), a 4°C, du-rante 24 horas. Esto lo realizamos previamente a la ino-culación de los tubos de cultivo. Sin embargo la eficaciaes poco significativa.

Nuestro mejor hallazgo ha sido de 30,0% de positividaden pacientes mucosos en área endémica de L. (V)braziliensis22: Dimier-David24 en 94 pacientes bolivianoscon lesiones mucosas consiguió 23,0% de positividaddiagnóstica en medio NNN complementado conSchneider y antibióticos, como fase líquida. Los parási-tos aislados fueron identificados por Revollo como L. (V)braziliensis51.

DEMOSTRACIÓN DEL PARASITISMO PORLEISHMANIA MEDIANTE LA INOCULACIÓN DE ANI-MALES DE LABORATORIO

1. EN RATONES ISOGÉNICOS Y NO ISOGÉNICOS

La utilización de animales de laboratorio en infeccio-nes experimentales por diversas especies de Leishmaniaha permitido el establecimiento de algunos modelos enleishmaniasis. Estudios de nuevos agentes terapéuti-cos52-54, investigaciones sobre los mecanismos que go-biernan la patogenicidad del parásito, tanto humoral comocelular durante el curso de la infección experimental han

sido descritos en la literatura55-58. El curso de la infecciónen los ratones y, probablemente, en otros animales delaboratorio, es considerablemente influenciado tanto porla especie del parásito, como por los factores genéticosdel hospedero.

Diferentes cepas de ratones isogénicos varían en su com-portamiento frente a la infección por L. (L) tropica, L. (L)mexicana, L. (V) braziliensis L. (V), panamensis, etc. Lainnata susceptibilidad o resistencia al parásito esgenéticamente controlada59.

El conjunto de todas esas observaciones ha llevado a laconclusión que, existen disponibles importantes mode-los murinos experimentales que reproducen parcialmentela biología del parasitismo por Leishmania. Lamentable-mente, la utilidad diagnóstica de esos modelos es limi-tada sólo para la gran mayoría de las especies del sub-género Leishmania. Muy pocas son las especies del sub-género Viannia que han sido adaptadas a alguna cepade ratón «in bred». Hasta el presente no tenemos, toda-vía, un animal experimental de laboratorio que reproduz-ca la enfermedad mucosa provocada por L. (V)braziliensis. Estrictamente, hablando de diagnósticoparasitológico, sólo contamos con el concurso valiosodel hamster dorado, Mesocriectus auratus.

Para ilustración de nuestros lectores, a continuación ci-taremos algunas líneas de ratones isogénicos más co-múnmente utilizados por los investigadores con cepasde Leishmania del Nuevo Mundo (Tabla 3).

Otro roedor utilizado para estudios por su potencial comomodelo experimental con L. (V) panamensis es Mystromysalbicaudatus. En él, las lesiones nodulares son de lentaevolución (se tornan visibles a los 9-12 meses pos-ino-culación), y desaparecen posteriormente espontánea-mente, demostrando su poca sensibilidad a Leishmania;lógicamente, no es útil en el diagnóstico.

Tabla 3. Líneas de ratones isogénicos más comúnmente utilizadas con cepas de Leishmania del mundo.

LINEA DE RATÓN SUSCEPTIBILIDAD AUTORES

- C57 BL/6 Susceptible a L. (L.) mexicana Pérez58,Moriearty60

- BALB/C Susceptible a L. (L) mexicana Trotter52

- BALB/C Susceptible a L. (V) panamensis Childs61

- BALB/C Resistente a L. (V) braziliensis Cuba Cuba44

- DBA/1 Susceptible a L. (L) mexicana Trotter52

- DBA/2 Resistente a L. (V) braziliensis Cuba Cuba44

- C3H Susceptible a L. (L) mexicana Grimaldi62

- A/J Resistente a L. (V) braziliensis Cuba Cuba44

- A/J Susceptible a L. (V) panamensis Childs61

Cuba C.

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2. EN HAMSTERS DORADOS Mesocriectus auratus

Fue Adler quien relató que la primera vez que éstoscricétidos fueron empleados en la investigación deleishmaniasis ocurrió en el Mediterráneo (en la investi-gación de Kala-azar). Eso fue en 1930, por el equipo delDepartamento de Parasitología de la Universidad Hebreade Jerusalem. Después, este roedor fue distribuido porel citado autor a diversos centros de investigación deEuropa y América; aunque Rey63 ya estudiaba, en Esta-dos Unidos, una cepa que él llamó L. (V) braziliensisinoculada en hamsters.

Sin embargo, se atribuye a los investigadores ingleses64,el mérito de introducir el uso del hamster como parámetroesencial de la caracterización biológica de lasleishmaniasis del Nuevo Mundo. Por lo que, considera-mos que la crianza de los cricétidos es condición indis-pensable en todo laboratorio de investigación enleishmaniasis.

El procedimiento más adecuado para el aislamiento pri-mario de Leishmania utilizando los hamsters es por mediode las biopsias practicadas en las lesiones de los pa-cientes sospechosos de leishmaniasis. Estas son obte-nidas con la ayuda del «punch» de 4mm de diámetro ode una navaja de bisturí. Las biopsias son entonces tritu-radas utilizándose un «tissues grinder plain» de 15 mL ysuero fisiológico estéril. La suspensión de los tejidos esluego inoculada intradérmicamente (0, 1 mL) en la basede la nariz (dorso), patas posteriores (dorso) o amboslugares del hamster (Figura 2), aunque también se acos-tumbra inocular intraperitonealmente, pues muchos deestos parásitos tienden a visceralizar. Normalmente, seinyectan dos animales por paciente, los animales pasana ser examinados semanalmente, y permanecen en unasala de mantenimiento a temperatura adecuada (25°C).A la primera señal clínica de infección, se procede al tra-bajo de aislamiento y comprobación parasitológica.

Los siguientes datos deben ser sistemáticamente ano-tados:

- Período de incubación aproximado en el aislamien-to primario del parásito.

- Período de incubación aproximado en lasinoculaciones subsecuentes (hamster-hamster).

- Características evolutivas de las lesiones (tamaño,ulceración, necrosis de patas, etc.).

- Densidad parasitaria relativa en el local de inocula-ción.

- Metástasis: tiempo aproximado - locales observa-dos.

- Visceralización: tiempo aproximado, órganos com-prometidos, densidad parasitaria relativa.

Las cepas de L. (V) panamensis, L. (V) guyanensis y al-gunas L. (V) braziliensis visceralizan, colonizando princi-palmente ganglios regionales, bazo e hígado delhamster51,65,66. Este comportamiento de la L. (V) braziliensisha sido también documentado en cepas aisladas en losfocos endémicos de LTA, de Santiago del Estero y Salta,

Argentina67. Curiosamente, esto no se registra con lascepas colombianas de L. (V) b. raziliensis66 , y tampoco enlos parásitos aislados en Pará (Lainson, comunicaciónpersonal). De manera muy esporádica, es posible ob-servar un foco metastásico cutáneo con L. (V)braziliensis68, ya que esta especie puede visceralizar yluego producir lesiones metastásicas cutáneas, cuandoinyectamos formas metacíclicas del parásito69.

Concordamos con las observaciones de otros autoresque afirman que la técnica de inoculación del hamstercon el triturado de las biopsias de las lesiones, la mejory más eficiente manera de aislar Leishmania. Esto últi-mo es especialmente cierto tratándose de lesiones de«espundia», la forma más grave y mutilante del parasi-tismo por L. (v) braziliensis22,23,70 .

Con relación a la ruta y lugar de inoculación existen dis-crepancias pero, es la base de la nariz y el dorso de laspatas inyectadas con las formas amastigotes y promastigotes,intradérmicamente, las más usadas71.

3. EL USO DE LA INOCULACIÓN DE HAMSTERSEN EL DIAGNÓSTICO DE LTA

Nuestra eficiencia con este método es de 60% deéxito en la positividad de los animales inoculados con lasuspensión de la biopsia triturada y, de solo aproximada-mente 35%, cuando procedemos a aspirar, con aguja yjeringa las lesiones e inmediatamente inoculamos losanimales. Ambos procesos son complementarios al pro-ceso de aislamiento de Leishmania. Para comprobar elparasitismo del hamster inoculado no basta hacer unsimple frotis del lugar clínicamente positivo, es necesa-rio cultivar; ello porque el frotis apenas demostrará 25%de animales con amastigotes.

El cultivo efectuado hasta las primeras 3 semanas deinyectado el animal será significativamente más eficien-te72. Esto debe ser hecho toda vez que los lugares inyec-tados no presenten evidencia de infección. Por otro lado,


Figura 2. Hamster inoculados con parásitos de Leishmania. Se observanlesiones ulceradas en la base de la nariz y dorso de las patas.

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sabemos que existe un espectro de infección cuandotrabajamos con las cepas de Leishmania en el hamster:ciertos aislados primarios solo infectan el lugar de ino-culación pero no producen señal de inflamación eviden-te, esto ocurre en la presencia de amastigotes compro-bados por cultivo; otros producen lesiones nodulares querápidamente crecen y ulceran; y por último, algunos aisla-dos provocan lesiones evidentes y, concomitantementecompromiso visceral. Se debe pues prestar atención atodas estas posibilidades y evitar perder cepas que impi-dan hacer el diagnóstico.

A pesar que el empleo de este método de diagnóstico«in vivo» es lento con relación al cultivo directo y a laimpronta, la ventaja práctica esencial es que el animal«limpia» de contaminantes bacterianos y fúngicos lasmuestras patológicas. Esto es importante en las biopsiasobtenidas de las heridas mucosas.

Con relación a L. (V) braziliensis, Llanos-Cuentas73 tra-bajando con 71 pacientes cutáneos observó que el mé-todo con mejor rendimiento para diagnosticar Leishmaniafue la inoculación en el hamster (69,9% de positividad),seguidamente de la histología (48,0%), el cultivo «in vitro»(33,0%), y el frotis coloreado por Giemsa (31,5%). Lógi-camente, la demostración del parásito aumentó con elempleo de un mayor número de métodos, así, solamen-te frotices obtuvo 31,0% de positividad, adicionando lahistología 58,0%, y más la inoculación en hamster sealcanzó 80,0% de positividad acumulada. Esto constitu-ye el mejor rendimiento en el diagnóstico de LTA formacutánea. En contraste, en 55 pacientes mucosos los pa-rásitos fueron demostrados sólo en 48,0%, llamandola atención que, en pacientes con lesiones mucosasmúltiples, el parasitismo fue comprobado en 72,7%.

COMENTARIOS FINALES

El diagnóstico parasitológico de LTA es parte funda-mental del estudio de la enfermedad. Es condición obli-gatoria cuando se desea probar la acción de un nuevomedicamento y difundir el esquema terapéutico de unpaciente parasitado, entre otras utilidades clínico-epidemiológicas. Pensamos que muchas de las infec-ciones causadas por las diversas especies deLeishmania son difíciles de diagnosticar. Sin embargo,es el parasitismo por L. (V) braziliensis el que presentael mayor desafío al profesional de salud. Marsden revisa,más de una vez el asunto, y enfatiza la dificultad encon-trada por un clínico para demostrar el parasitismo por L.(V) braziliensis en pacientes con lesiones mucosas cró-nicas y mutilantes

3.

De los métodos diagnósticos descritos, dos son los quemerecen ser destacados por su eficiencia y sensibilidad:el cultivo «in vitro» y la inoculación en hamsters. Entre-tanto, en los estudios de investigación parasitológicahecha por diversos autores, comprobamos una gran va-riación en la sensibilidad, pues los índices fluctúan entre19,0% y 83,0%. Esto sería explicado por diferencias en la

metodología empleada, tiempo de la enfermedad y laforma clínica de los pacientes estudiados.

En leishmaniasis, tanto cutánea como mucosa, el éxitoen el aislamiento es inversamente proporcional al tiem-po de duración de la enfermedad. Además que el trata-miento específico previo disminuye la eficiencia de de-mostración del parásito. Sin embargo, nosotros obser-vamos que existe un parasitismo residual en individuosque han completado series regulares de Glucantime,siendo posible pues aislar parásitos viables en espaciode tiempo relativamente corto, después del tratamiento.

Debemos admitir que no existe una técnica de aislamientoque reúna todas las características necesarias a fin dediagnosticar parasitológicamente 100% de los pacien-tes con LTA, siendo de opinión generalizada, que el máxi-mo rendimiento se consigue con la combinación de 2 ó 3de ellas. Si a esto se asocian, la prueba de Montenegro yla serología por ELISA, el diagnóstico laboratorial de LTApuede llegar a más de 90,0%.

Cuando queremos no sólo diagnosticar, sino tambiénaislar el parásito del paciente, los métodos de cultivo sonmuy eficientes, si se trabajan con los cuidados sugeri-dos en esta revisión. No existe a disposición de los estu-diosos de leishmaniasis un único medio de cultivo «invitro» que tenga aplicación universal y soporte el creci-miento de todas las especies de Leishmania humanas.Esto implica la necesidad de estudios previos de evalua-ción que informen cual es el más apropiado para las 6especies de parásitos que circulan en la región endémica.

Tratándose de infecciones causadas por L. (V) braziliensis,el esfuerzo siempre tenderá a encontrar un método ideal,rápido, sencillo y barato para la diferenciación del agenteetiológico de esta entidad, con el resto de infeccionescausadas por otras leishmanias menos patogénicas yde mejor pronóstico. Un diagnóstico precoz es pues obli-gatorio en la leishmaniasis mucosa de fase inicial, paraquizá prevenir el compromiso más grave: el síndrome de«espundia».

Como resultado de lo descrito anteriormente, reciente-mente ha surgido una estrecha colaboración entre loslaboratorios de investigación de campo en leishmaniasisy los puestos de salud de áreas endémicas. Nuevas he-rramientas diagnósticas han surgido de la investigaciónefectuada en biología y genética moleculares. Se hanidentificado antígenos con potencial diagnóstico, productodel clonaje de genes que los codifican y, como resultadode la tecnología de ADN recombinante, han surgido pro-teínas. Todo esto nos lleva a creer en un futuro mejor enel campo del diagnóstico de LTA74.

Actualmente las técnicas de hibridización de los ácidosnucleicos permiten establecer relaciones nucleotídicasentre las leishmanias. El ADN-K de Leishmania tiene ca-racterísticas singulares que han permitido desarrollarmétodos basados en la detección de secuencias de

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nucleótidos del ADN-K pertenecientes a un organismodesconocido que resultan ser complementarios a lassecuencias de una cepa de referencia internacional. Estoha llevado a la descripción de un número considerablede sondas altamente sensibles en el diagnóstico de LTA.En el inicio de la década de 1980 estas sondas emplea-ban material radioactivo, eran sondas isotópicas, y losparásitos detectados provenían de cultivos y de anima-les experimentales, y la detección era por una hibridización«in situ»74,75; sin embargo, las sondas radioactivas deADN-K no proporcionaron adecuada sensibilidaddiagnóstica y fueron poco populares entre los investiga-dores de los países endémicos por razones obvias.

Posteriormente, De Bruijn76 presentó resultados muypromisorios cuando asoció la técnica del PCR(Polymerase Chain Reaction) a una hibridización «in situ»realizada en láminas de pacientes de Colombia, Vene-zuela y Perú, y que llevaron al autor a declarar que lasonda desarrollada era Leishmania complex específicay serviría para el diagnóstico de LTA. A su vez, Lópes77

publicó sus estudios realizados en Perú con pacientescutáneos y mucosos aplicando PCR directamente enmaterial de biopsia. A fin de validar clínicamente la sondadesarrollada en laboratorio, se tomaron muestras depacientes de ambientes rurales, las cuales fueron com-parativamente estudiadas mediante PCR-hibridizacióncon los métodos clásicos de frotices y cultivos «in vitro».Los autores relataron una sensibilidad significativamentemayor en el método de amplificación e hibridizacion delADN en el diagnóstico de campo.

Concluimos diciendo que todo este potencial para el diag-nóstico de LTA que surge del campo de la biologíamolecular requiere mayores estudios clínicos y de cam-po para su validación definitiva.

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Rev Med Exp 2000; 17 (1-4)

REVISIÓN DE REVISTAS

RECIENTES AVANCES DEL PROYECTO DEL GENOMA DELEISHMANIARecent developments from the Leishmania genomeprojectMyler PJ, Stuart KD.Curr Opin Microbiol 2000; 3(4): 412-6.

Se ha construido la primera librería completa de cós-midos de Leishmania major Friedlin, estando en caminoel secuenciamiento total de su genoma. Los cromoso-mas 1 y 3 han sido completamente secuenciados, y elcromosoma 4 esta virtualmente completo. Se calcula quela versión completa de todo el genoma (~25 megaba-ses) puede estar disponible en el 2003. Más de 600 ge-nes nuevos han sido completamente identificados, lo cualrepresenta ~8 % del total de genes (~8600 genes) deLeishmania. Los más importantes genes descritos porprimera vez están relacionados al metabolismo, a la sín-tesis de proteínas, a la localización celular de las proteí-nas, al transporte celular, y a la composición del riboso-ma. Sorprendentemente, una gran proporción (~69 %)de los genes nuevos permanecen no clasificados, el 40%de éstos son probablemente específicos de Leishma-nia. Los genes de Leishmania están organizados en gran-des grupos (o cluster), cada cluster abarca entre 100 a300 kilobases o más, dentro de estos clusters los genesestán adyacentes en la misma cadena de ADN.

Actualmente, existen serios esfuerzos en varios labora-torios para estudiar como estos genes se expresan y seregulan, empleando la tecnología de microarrays de ADNy realizando estudios de proteómica.

Blgo. Carlos Padilla Rojas.División de Biología Molecular, Centro Nacional de Labo-ratorios en Salud Pública, Instituto Nacional de Salud.

DIVERSIDAD GENÉTICA, DISTRIBUCIÓN Y CARACTERÍS-TICAS SEROLÓGICAS DE LA INFECCIÓN POR HANTAVI-RUS EN CINCO PAÍSES DE SUDAMÉRICA.Pádula PJ, Colavecchia SB, Martínez VP, Gonzáles DellaValle MO, Edelstein A, Miguel SDL, et al.Genetic diversity, distribution, and serological featuresof hantavirus infection in five countries in South AmericaPádula PJ, Colavecchia SB, Martínez VP, Gonzáles DellaValle MO, Edelstein A, Miguel SDL, et al.J Clin Microbiol 2000; 38(8): 3029-35.

En este estudio se informa de la diversidad genética,distribución geográfica y las características serológicasde la infección por Hantavirus en seis países de Suda-mérica, basándose en 87 casos de síndrome pulmonarpor Hantavirus (HPS) de Argentina, Bolivia, Chile, Para-guay y Uruguay. La respuesta de IgM alcanzó el máximoal primer o segundo día después del comienzo de los

síntomas. Los títulos de IgG se elevaron después de laprimera semana. Los títulos bajos o la ausencia de IgGestuvieron asociados con tasas de mortalidad más altas.

El análisis filogenético usando secuencias de la glico-proteína de envoltura (regiones G1 y G2), mostraron quelos casos de HPS de los cinco países fueron relaciona-dos al virus de los andes (AND) ó al virus de la LagunaNegra (LN). Dentro de las personas infectadas con elvirus AND, se encontró cinco linajes genéticos. Dos pa-cientes paraguayos fueron infectados con un virus dife-rente al virus de LN. De acuerdo a los resultados filoge-néticos, este virus esta más relacionado al virus ANDque al virus de LN, sugiriendo que esto probablementesea una variante viral portado Oligoryzomys circulante enParaguay. El estudio filogenético de estos virus contribui-rán a una mejor comprensión de la infección por Hantavi-rus humano en los países de Sudamérica.

Blga. Gisely Hijar Guerra.División de Biología Molecular, Centro Nacional de Labo-ratorios en Salud Pública, Instituto Nacional de Salud.

EVIDENCIA MOLECULAR DEL TEJIDO NORMAL NO GRAN-ULOMATOSO COMO REFUGIO DE MYCOBACTERIUMTUBERCULOSIS EN SU ESTADO LATENTE.Persistence of DNA from Mycobacterium tuberculosisin superficially normal lung tissue during latent infectionHernandez-Pando R, Jeyanathan M, Mengistu G, AguilarD, Orozco H, Harboe M, et al.Lancet 2000; 356(9248): 2133-8.

En los últimos años a pesar que existe un tratamientoefectivo, la Tuberculosis (TB) ha re-emergido como unade las enfermedades infecciosas de mayor mortalidaden el mundo. Se estima que un tercio de la población delplaneta se encuentra infectada con TB y una proporciónconsiderable de ellos mantiene una cepa resistente adrogas en infección latente. Esto representa una “bomba detiempo” en términos de casos futuros de TB difícil de tratar.

A pesar que M tuberculosis, el agente causante de la TB,es uno de los organismos cuyo genoma está completa-mente secuenciado, su capacidad de ocasionar infec-ción, persistir por largos periodos de tiempo completa-mente ignorado por el sistema inmune humano, y sufacultad para “reactivarse” ocasionando enfermedad, sonvarias de las grandes interrogantes que recientementese vienen estudiando.

Nuevas estrategias para la erradicación del organismoen su estado latente son necesarias, y una de las premi-sas para ello es justamente un mejor conocimiento delmecanismo de latencia y la localización de dicho orga-nismo en su estado latente.

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Rev Med Exp 2000; 17 (1-4)

Recientemente Hernandez-Pando y col. retoman una an-tigua controversia en relación a si los bacilos de la TB enestado latente en realidad se albergan en las viejas le-siones características llamados “granulomas tuberculo-sos”, como se creía anteriormente.

Experimentos que datan de inicios de este siglo mostra-ron evidencia que lesiones granulomatosas de necrop-sias de pacientes que murieron por otra causa que TB nocontienen bacilos TB cultivables, ni logran infectar a co-bayos, un modelo animal extremadamente sensible aTB. Posteriormente Opie y col. (1927) encontraron quebacilos TB podían ser recuperados a partir de tejido pul-monar normal no granulomatoso. Hernandez-Pandomuestra evidencia molecular de la presencia de ADN deM. tuberculosis en secciones de tejido pulmonar normalde necropsias de pacientes que murieron por otra causaque TB. Ellos, mediante PCR convencional y PCR ‘in-situ’,identificaron la presencia de ADN de la secuencia de in-serción IS6110, el cual está presente sólo en el comple-jo-M tuberculosis. De un total de 47 pacientes de México yEtiopia el 36 % y el 32% de secciones de tejido no-granu-lomatosos fue positivo mediante PCR convencional y PCR‘in situ’, respectivamente. Además, los autores tambiénidentificaron sorprendentemente la presencia de ADN demicobacterias en otras células además de macrófagos,tales como células endoteliales, fibroblastos y neumoci-tos tipo II.

Los hallazgos de Hernández-Pando son de trascenden-tal importancia, ya que no sólo muestra evidencias queayudan a resolver un tema discutido desde el siglo pasa-do, sino también muestra evidencia que la principal fuen-te de reactivación endógena de la TB en un episodio pos-primario podría estar en el tejido normal no-granuloma-toso y que el bacilo TB en su estado latente podría estaralbergándose en otras células, además de macrófago,sin la capacidad de procesar ni presentar antígenos forá-neos. Sin embargo, nuevos hallazgos son necesarios,ya que todavía existe la remota posibilidad que el ADNamplificado en el estudio de Hernandez-Pando provengade bacilos TB no viables o que sea producto de M. bovis-BCG y no de M. tuberculosis en su estado latente.

Blgo. Christian Baldeviano Vidalón.División de Biología Molecular, Centro Nacional de Labo-ratorios en Salud Pública, Instituto Nacional de Salud.

EPIDEMIOLOGÍA DE LA CANDIDIASIS NOSOCOMIAL: LAIMPORTANCIA DE LA TIPIFICACIÓN MOLECULAR.Epidemiology of nosocomial candidiasis: the importan-ce of molecular typingPfaller MA.Braz J Infect Dis 2000; 4(4): 161-7.

Durante la década pasada, las candidemias nosoco-miales se han incrementado significativamente en pa-cientes de todo grupo etáreo, especialmente en neona-tos y en pacientes mayores de 45 años. Esta enferme-dad es la cuarta causa más común de infección sanguí-nea alcanzando hasta un 30% de mortalidad.

El principal agente etiológico es Candida albicans (70%de infección invasiva); sin embargo, en centros oncológi-cos y de la tercera edad, se han reportado un incrementosignificativo de infecciones por C. glabrata y C. krusei,debido a su resistencia frente a los triazoles.

Actualmente, los estudios epidemiológicos requieren quelos patógenos nosocomiales sean caracterizados a ni-vel de subespecies con el objetivo de mejorar la defini-ción del proceso infeccioso y modo de transmisión. Lasmetodologías basadas en la tipificación molecular delADN han sido las más empleadas con este propósito,pero su validez depende de la reproducibilidad y discri-minación. El análisis de tipificación molecular de cepasaisladas en dos o más pacientes puede determinar silas infecciones están relacionadas, cruzadas o debido aexposición a una fuente de contaminación común.

Estos métodos también pueden ser empleados en ladiferenciación de reinfección o recaída, y en el desarrollode resistencia antifúngica durante la terapia antimicótica,las infecciones repetitivas con diferentes cepas de unmicroorganismo puede sugerir que el paciente está pre-dispuesto a una particular infección como resultado deuna exposición específica o defectos del hospedero.

Por otro lado, las estrategias para la prevención y controlde infecciones micóticas nosocomiales debe considerarreservorios endógenos y exógenos como fuentes de in-fección. La tipificación molecular ha establecido que elprincipal reservorio endógeno para estas levaduras es eltracto gastrointestinal. La evidencia para una infecciónnosocomial de este origen incluye cepas únicas del pa-ciente, a partir de múltiples áreas anatómicas, mostran-do tanto las cepas colonizante como infectantes, el mis-mo modelo de ADN Fingerprinting. Asimismo, la epide-miología de la adquisición exógena ha sido establecidapor la aplicación de métodos de tipificación molecularpara identificar cepas comunes entre aislamientos deorigen exógeno y de pacientes infectados.

Blgo. José Casquero Cavero.División de Micología, Centro Nacional de Laboratoriosen Salud Pública, Instituto Nacional de Salud.

UNA ASOCIACIÓN ENTRE INFECCIÓN CON VIRUS DE HE-PATITIS C Y DIABETES MELLITUS TIPO 2: CUÁL ES LACONECCIÓN?An Association between Hepatitis C Virus Infection andType 2 Diabetes Mellitus: What is the connection?Alexander GJ.Ann Intern Med 2000; 133(8): 650-2.

Al parecer existe estrecha relación entre hepatitis viralC (HVC) y diabetes mellitus tipo 2, lo cual no sorprendedebido a que la infección crónica por HVC produce cirro-sis que a su vez conduce a resistencia a la insulina,predisponiendo a la diabetes mellitus. Así lo demues-tran los diferentes estudios transversales realizados anivel mundial en diferentes grupos étnicos, y los diferen-

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Rev Med Exp 2000; 17 (1-4)

tes puntos de vista vertidos por especialistas en la mate-ria como hepatólogos, hematólogos y diabetólogos, quie-nes encuentran mayor frecuencia o porcentaje de preva-lencia de diabetes mellitus tipo 2 en aquellas personascon infección por HVC que en aquellos que no la tienen,e inclusive, en relación a otras patologías como hepatitisviral B, enfermedad alcohólica y colestasis hepática.

Asimismo, se postula que la infección por HVC modifica elmetabolismo de la glucosa, cuyos mecanismos aún noson claros. En pequeños estudios se encontró disminu-ción en plasma de insulina y peptido C en infectados conHVC; en pacientes con cirrosis se halló además una resis-tencia a la insulina y una disminución en la secreción de lamisma; por otro lado, la expresión hepática de proteína coreHVC estuvo estrechamente relacionada con el índice de masacorporal, nivel de alanina-aminotransferasa y esteatosis. Sinembargo todavía queda mucho por investigar en esta área.

Dra. Myriam Yasuda Espinoza.División de Patología, Centro Nacional de Laboratoriosen Salud Pública, Instituto Nacional de Salud.

INFECCIONES NOSOCOMIALES DEL TORRENTE SANGUÍ-NEO: ORGANISMOS, FACTORES DE RIESGO E IMPLICAN-CIAS.Nosocomial bloodstream infections: organisms, risk fac-tors, and implicationsKarchmer AW.Clin Infect Dis 2000; 31 Suppl 4: S139-43.

Existe en EE.UU. una alta incidencia de infeccionesnosocomiales, relacionada a la resistencia a drogas. Losgérmenes prevalentes en estas infecciones son los co-cos gram positivos (estafilococos, estreptococos, entero-cocos). Se sospecha que esta resistencia a los agentesmicrobianos es debida a múltiples factores, entre los quese encuentran el factor inmunosupresor del paciente, lamutación del microorganismo y su capacidad de resisten-cia al antibiótico, y el tratamiento mal llevado por el paciente.

Las infecciones intrahospitalarias debido a su alta inci-dencia es una preocupación de la ciencia médica, ya queestas son cada vez más frecuentes y resistentes a losantibióticos específicos, lo que significa un alto costo paralas organizaciones, el estado, e incluso, para el pacientey su calidad o expectativa de vida.

Estas infecciones intrahospitalarios en América Latina oen países del tercer mundo son de mayor prevalencia eincidencia debido a factores sociales, económicos, edu-cativos, y a la misma idiosincracia de los pacientes quese automedican, haciendo uso de profesionales no médi-cos o de servicios sucedáneos. Las características in-munológicas, nutricionales del huésped, así como lacapacidad infectante y poder mutágeno del microorganis-

mo que harán a las cepas resistentes, son hechos deconstante preocupación para la ciencia médica que seve estimulada a descubrir nuevos antibióticos.

Tec. Med. María Elena Muñoz Zambrano.División de Patología, Centro Nacional de Laboratoriosen Salud Pública, Instituto Nacional de Salud.

PCR MULTIPLEX: OPTIMIZACIÓN Y APLICACIÓN EN ELDIAGNÓSTICO VIROLÓGICO.Multiplex PCR: optimization and application in diagnos-tic virologyElnifro EM, Ashshi AM, Cooper RJ, Klapper PE.Clin Microbiol Rev 2000; 13(4): 559-70.

El PCR multiplex es un tipo especial de PCR (reacciónen cadena de la polimerasa) donde se amplifica más deuna secuencia blanco, esto se logra agregando en la reac-ción más de un par de primers (oligonucleótidos). El PCRmultiplex tiene la ventaja de ahorrar tiempo y esfuerzo den-tro del laboratorio, sin comprometer la efectividad de la prue-ba. El desarrollo del PCR multiplex debe ser abordado demanera racional para la inclusión o exclusión de primers depatógenos específicos en la prueba. Estos patógenospueden ser órgano - específicos o síntoma - específicos enrelación a la edad del paciente y las características epide-miológicas de estos patógenos. Las condiciones de PCR,como la compatibilidad entre los primers dentro de la reac-ción y la no interferencia, son de gran importancia técnica.Cuando sea posible, el PCR multiplex debe evitar el uso deprimers anidados que requieran una segunda ronda deamplificación. Esto debido a los resultados falsos positi-vos, consecuencia de la contaminación generada.

Durante la década pasada, numerosos estudios handemostrado la practibilidad de identificar patógenos vi-rales usando el PCR multiplex. Esta técnica se ha usadopara identificar enfermedades con sintomatología com-patible a virus o para la tipificación o subtipificación dediferentes cepas de virus de estudios epidemiológicos.Es así que se han desarrollado pruebas de PCRs multiplexpara el diagnóstico de enfermedades producidas por virusrespiratorios, neurológicos, infecciones genito - urinarias, in-fecciones oculares, pacientes inmunocomprometidos y otras.

El PCR Multiplex se proyecta como una herramienta dediagnóstico muy útil en el futuro inmediato, aunque expe-riencias propias en el laboratorio han demostrado quelos métodos clásicos (pruebas de rutina y aislamientos)no pueden dejarse de lado, y deben ir en paralelo, paracorroborar los resultados de las pruebas moleculares.

Dr. Ricardo López Ingunza.División de Virología, Centro Nacional de Laboratoriosen Salud Pública, Instituto Nacional de Salud.

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Rev Med Exp 2000; 17 (1-4) Sánchez E.

GALERIA FOTOGRAFICA

HIDATIDOSIS POR Echinococcus granulosus EN EL PERÚ

Echinococcus granulosus es un pequeño céstode pa-rásito, que causa la hidatidosis quística en el hombre yen ganado de abasto. Esta zoonosis constituye un im-portante problema de Salud Pública en la sierra del Perú,donde existen áreas hiperendémicas tales como Puno,Junín , Arequipa, Huancavelica y Cerro de Pasco.

Elizabeth Sánchez RomaníDivisión de ParasitologíaCentro Nacional de Laboratorios en Salud PúblicaInstituto Nacional de Salud

Las fotografías que a continuación se presentan corres-ponden al material biológico (quistes hidatídicos) de ga-nado vacuno y ovino obtenido de dichas áreas. Algunasde ellas (Fotos 2 y 3) fueron ganadores del primer premiodel Concurso de Fotografía Científica realizada en el Ins-tituto Nacional de Salud (1999).

Foto 1. Quistes hidatídicos de E. granulosus en pulmones e hígados de ganado ovino.

Foto 2. Quistes hidatídicos de E. granulosus en pulmones de ganado ovino.

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Rev Med Exp 2000; 17 (1-4) Hidatidosis por Echinococcus granulosus en el Perú

Foto 3. Protoescólices de E. granulosus de ganado ovino. Observación microscópica a 40 X de aumento. (a) Protoescólices invaginado, se

observan ganchos rostelares y gránulos calcáreos; (b) Protoescólices evaginado.

a b

Foto 4. Diferentes formas de los ganchos ros-

telares de protoescólices de E. granulosus, ob-

tenidos de arenillas de quistes hidatídicos, de

ganado vacuno y ovino procedentes de áreas

endémicas del Perú. Observación microscópica

a 100 X de aumento.

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Rev Med Exp 2000; 17 (1-4) Beltrán M.

REPORTE DE CASO DE Toxocara sp ADULTO

María Beltrán Fabián de E.División de ParasitologíaCentro Nacional de Laboratorios en Salud PúblicaInstituto Nacional de Salud

La toxocariosis es una enfermedad zoonótica de dis-tribución mundial. La infección humana, generalmentede presentación silenciosa, ocurre por la ingestión dehuevos infectantes (2° estadío) de Toxocaras.

Se presenta a continuación un caso de toxocariosis ais-lado de una paciente Z.M., de 42 años, procedente de

Los Olivos, Lima - Perú, quien presentó en la cavidad deuna molar superior extraída, 48 horas después del proce-dimiento, un especímen de Toxocara sp. hembra adulto enmovimiento, de 2,8 cm x 1,2 mm. Probablemente, el pri-mer caso de un parásito adulto aislado en la boca de unapersona.

Foto 1. Extremo anterior de Toxocara sp

adulto, coloreado con fucsina, de espe-

cimen aislado de la cavidad molar de una

paciente en Lima - Perú.

59

Rev Med Exp 2000; 17 (1-4) Reporte de caso de Toxocara sp adulto

Foto 2. Extremo anterior de Toxocara sp,

(a mayor acercamiento).

Foto 3. Extremo posterior de Toxocara sp.

Foto 4. Extremo anterior de Toxocara sp,

después del aclaramiento. Se aprecian los

3 labios.

Foto 5. Extremo posterior de Toxocara sp

después del aclaramiento. La flecha

señala la abertura anal.

60

Rev Med Exp 2000; 17 (1-4)

Fe de Erratas: REVISTA DE MEDICINA EXPERIMENTAL (VOLUMEN ANTERIOR).

Dice: REVISTA DE MEDICINA EXPERIMENTAL, VOLUMEN 15, NUMEROS 1-2, AÑO 1999.Debe decir: REVISTA DE MEDICINA EXPERIMENTAL, VOLUMEN 16, NUMEROS 1-2, AÑO 1999.

INSTRUCCIONES PARA LA PRESENTACION DE ARTICULOSEN LA REVISTA DE MEDICINA EXPERIMENTAL

La Revista de Medicina Experimental es el órgano oficial delINSTITUTO NACIONAL DE SALUD (INS), cuyo objetivo es la difu-sión de la producción científica vinculada a la salud, propiciar elintercambio con entidades similares en el país, como en el extran-jero, para mantener su nivel científico.

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Comité Editor considerará en casos especiales la reproducciónde artículos publicados en el extranjero, en razón a la importan-cia que tengan para su difusión en el país.

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jo, se ordenarán correlativamente según su aparición y se re-dactarán siguiendo las normas del Index Medicus Internacio-nal. Ejemplos:- Artículo: Autor/es. Título del artículo. Abreviatura interna-

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Ejemplo: Díez J, Cienfuegos M, Suárez E. Ruidos adventi-cios respiratorios. Med Clin (Barc) 1997; 109 (16): 632-634.

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