Validacion y Confirmacion de Metodos26

7/28/2019 Validacion y Confirmacion de Metodos26

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VALIDACIN Y CONFIRMACIN DE MTODOS 2011 Versin 1

Introduccin

El objetivo final de la validacin de un mtodo analtico es asegurar que los resultados de lasmediciones en los anlisis de rutina se encuentran lo suficientemente cerca del valor verdadero(desconocido) del contenido del analito en la muestra. El laboratorio elige los mtodos de ensayo deacuerdo con las reglamentaciones vigentes (cuando es pertinente), de acuerdo con los requisitos delusuario final (cliente), o a requerimiento de ste.

Una vez elegido el mtodo existen tres posibilidades:

a) Que el mtodo sea normalizado y se aplique tal cual dice la norma. b) Que el mtodo sea una modificacin de un mtodo normalizado.c) Que el mtodo se haya desarrollado en el laboratorio o se haya obtenido de bibliografa.

Segn el caso elegido, el alcance de la validacin ser diferente:

Mtodo Parmetros de Validacina) Normalizado repetibilidad, veracidad, incertidumbre, lmite de deteccin (si aplica),carta de control (material de referencia), participacin en ensayos deaptitud.

b) Modificacin de unmtodo normalizado

Dependiendo de la modificacin, se evalan que parmetros deben ser verificados.

c) mtodo propio Evaluar todos los parmetros posibles, dependiendo del mtodo.

2) Parmetros de validacin.

Selectividad

LinealidadLmite de deteccin, Nivel crtico.Lmite de cuantificacinPrecisin (repetibilidad y precisin intermedia)VeracidadRango de trabajoRobustezIncertidumbre de medicinSesgoRepetibilidad

Parmetros a validar segn el mtodo (caso c)Tipo de mtodo

Parmetro Cualitativo Trazas Componentesmayoritarios Propiedad fsica

Selectividad x x x -Linealidad - x depende dependeL.de deteccin x x - -L.de cuantific. - x - -Precisin - x x x

Veracidad - x x xRango - x x xRobustez - x x xIncertidumbre x x x x

Fernando Veyretou Esp. en Ing. en Calidad


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Efecto de las modificaciones al mtodo de ensayo sobre los parmetros de validacin (caso b)Mtodo de extraccin Selectividad, veracidadMatriz de la muestra Selectividad, veracidad, precisin, LD, LQExtensin del rango Linealidad, precisinCambios en el pH Robustez

Cambio de operador Repetibilidad, veracidadSistema de deteccin Selectividad, linealidad, rango de trabajo

3) Determinacin de los parmetros de validacin.

3.1) Selectividad especificidad.

Segn la tcnica analtica utilizada, se harn estudios de selectividad teniendo en cuenta losiguiente:

Como es impracticable considerar todas las interferencias posibles, se aconseja estudiar loscasos ms importantes (que produzcan ms interferencia) y probables. La selectividad de unmtodo puede expresarse cuantitativamente por medio de la razn mxima tolerada (maximumtolerated ratio - Trmx), que es la relacin entre la concentracin de interferencia (Cint)respecto del analito (Ca), que produce un desvo en la respuesta analtica que produce un sesgoen la estimacin de la concentracin del analito que cae fuera del intervalo de confianza quederiva del clculo de la incertidumbre expandida. Esto no siempre es aplicable ya que previamente hay que conocer la naturaleza de las posibles interferencias para poder realizar elensayo.Llevar a cabo anlisis de:a) Blanco de reactivos. b) Soluciones de analito en el solvente adecuado segn la tcnica y en concentracionessimilares a las presentes en las muestras de ensayo.c) Matriz libre de analito. (de ser necesario, preparar una matriz sinttica a partir de losconocimientos previos de la muestra).d) Matriz con agregado de analito (usar concentraciones similares a b).

3.2) LinealidadSi corresponde, segn el mtodo analtico, realizar curva de calibracin de acuerdo a losiguiente.a) El analista determina el mbito lineal en funcin de los conocimientos previos de la

magnitud a medir. Este debe ser tal que en la medida de lo posible caiga aproximadamenteen el centro de la curva.

b) Analizar al menos seis puntos de la curva, incluido el blanco.c) Los puntos debern estar igualmente espaciados.d) Hacer tres replicados de cada punto, en lo posible de manera aleatoria.

Evaluar la linealidad del mtodo por medio de una inspeccin visual de la recta, grfico deresiduos y estadstica de la regresin. En funcin de los resultados obtenidos y de lascaractersticas de la muestras, se determinar posteriormente la estrategia a seguir en lasmediciones de rutina, es decir, el uso de un solo punto, algunos o todos los puntos de lacalibracin.


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Estimacin de los parmetros de la regresin:

Medir las respuestas analticas de los patrones de concentracin conocida, por triplicado (n=3).Para el caso en que se miden 6 patrones por triplicado, el nmero de niveles de diferentesconcentracin (p) es 6, y el nmero total de puntos de la recta de calibrado (m) es 18.

El anlisis de los datos, implica el clculo de la pendiente A y la ordenada al origen B de larecta de regresin, ajustada a la ecuacin y A x B= + . Los valores estimados de A y B secalculan mediante:

1

2

1

( )(

( )

m

i i xy i

m xx

ii

) x x y yQ A

Q x x

=

=

= =

(1)

B y A x= (2)

donde xi es la concentracin de cada uno de losm patrones, x es el promedio de lasconcentraciones de calibrado, es la respuesta en cada punto ei y y es el promedio de lasrespuestas de los patrones de calibrado.Adems de A y B, se calcula el desvo estndar de estos parmetros, mediante las siguientesfrmulas:

/ y x A

xx

ss

Q= (3)

2

/1

B y x xx

xs sm Q

= + (4)

siendo el desvo estndar de los residuos de la regresin:

2

1/

( )

2

m

ii

y x

y ys

m=

=

(5)

donde es la respuesta experimental a cada patrn e representa la respuesta estimada encada punto, o sea,

i y i y

ii y Ax B= + .Estos parmetros dan una idea de la bondad de la regresin. Es deseable que sea lo ms pequeo posible, a pesar que su valor est limitado por el ruido instrumental. La distribucin delos residuos, es decir el modo en que los valores

/ y xs

( i y y) debe ser analizada, hacer un grfico para ver la adecuacin de los datos al modelo lineal.

Observacin: el coeficiente de correlacin, a pesar de su amplio uso como indicador delinealidad, resulta engaoso e inapropiado para este fin, y no debe ser usado (ref 2 A3)



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3.3) Lmites de deteccin y cuantificacin.

El lmite de deteccin que es la mnima concentracin detectable de manera confiable por latcnica, se calcula en funcin del desvo estndar de la concentracin predicha para unamuestra blanco (s0). Para estimar este valor, se usa la siguiente ecuacin:

2/

0

1 1 y x xx

s xs

A n m Q= + + (6)

usualmente se usa n=3, como ya se mencion antes.El lmite de deteccin es igual a: 0,05;m-2 0LOD = 2 t s El valor t, se obtiene de la tabla de distribucin Student:

TABLA 1

Dist t 1 cola alfa=0,05GL t GL t1 6,31 13 1,77

2 2,92 14 1,763 2,35 15 1,754 2,13 17 1,745 2,02 18 1,736 1,94 20 1,727 1,89 23 1,718 1,86 27 1,709 1,83 32 1,69

10 1,81 39 1,6811 1,80 52 1,6712 1,78 77 1,66

infinito 1,64

El lmite de cuantificacin LOQ, que es la mnima concentracin cuantificable en formaconfiable, se toma como la concentracin correspondiente a 10 veces el desvo estndar:LOQ = 10 s0 Por lo que se asegura que el desvo estndar relativo (DSR) para una concentracin igual alLOQ sea del 10%, el que se toma como el mximo DSR aceptable para cuantificar.



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3.4) Precisin y precisin intermedia.

Es conveniente (en caso que sea posible) utilizar tres niveles de concentracin (bajo, medio,alto) cubriendo el rango de trabajo con un nmeron de replicados en cada nivel deconcentracinm.Es conveniente quen se encuentre entre 2 y 5. Se analizann replicados de cada muestra denivelm durante un mnimo de 5 das ( p). No es necesario que sean das seguidos.Con estos datos se realiza un anlisis de la varianza (ANOVA) del cual se puede obtener unaestimacin de la repetibilidad (precisin) y precisin intermedia, y compararlas, considerandolos diferentes das como principal fuente de variacin.Clculo de la varianza de repetibilidad:

2

1 12( )

( 1)

p n

ij ii j

r

z z

S p n

= =

=

(7)

siendo 1

n

ij j

i

z

zn

==

la varianza entre das se calcula:

22

2 1( )

1

p

i

i r B

z zS

S p n

=

=

(8)

siendo 1 1

p n

iji j

z

z pn

= ==

y la varianza de precisin intermedia se calcula:

2 2 Ri r BS S S = +

2 (9)

Calcular los desvos estndar de las varianzas mencionadas, obteniendo la raz cuadrada de lasmismas.Calcular los desvos estndar relativos para cada parmetro:

r r

SD RSD z= (10)

Ri Ri

SD RSD

z= (11)

Para comparar la variabilidad entre das con la repetibilidad, se hace un test de Fischer:Se calcula la varianza entre das ( ) pero sin corregir por la repetibilidad ( ):2 E s

2r s

2

2 1( )

1

p

i

i

E

z zS

p

=

=

i

n y se calcula es estadstico F:2

2

E

r

S F

S =

el valor F, se compara con el de la tabla F para =0.05 con p-1 grados de libertad en elnumerador y pn-p grados de libertad en el denominador.(Tabla 2).



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Tabla 2 Tabla de Fischer alfa =0,05

GL Num 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10GL Den

1 161 199 216 225 230 234 237 239 241 2422 18,5 19,0 19,2 19,2 19,3 19,3 19,4 19,4 19,4 19,4

3 10,13 9,55 9,28 9,12 9,01 8,94 8,89 8,85 8,81 8,794 7,71 6,94 6,59 6,39 6,26 6,16 6,09 6,04 6,00 5,965 6,61 5,79 5,41 5,19 5,05 4,95 4,88 4,82 4,77 4,746 5,99 5,14 4,76 4,53 4,39 4,28 4,21 4,15 4,10 4,067 5,59 4,74 4,35 4,12 3,97 3,87 3,79 3,73 3,68 3,648 5,32 4,46 4,07 3,84 3,69 3,58 3,50 3,44 3,39 3,359 5,12 4,26 3,86 3,63 3,48 3,37 3,29 3,23 3,18 3,14

10 4,96 4,10 3,71 3,48 3,33 3,22 3,14 3,07 3,02 2,9811 4,84 3,98 3,59 3,36 3,20 3,09 3,01 2,95 2,90 2,8512 4,75 3,89 3,49 3,26 3,11 3,00 2,91 2,85 2,80 2,7513 4,67 3,81 3,41 3,18 3,03 2,92 2,83 2,77 2,71 2,6714 4,60 3,74 3,34 3,11 2,96 2,85 2,76 2,70 2,65 2,6015 4,54 3,68 3,29 3,06 2,90 2,79 2,71 2,64 2,59 2,5416 4,49 3,63 3,24 3,01 2,85 2,74 2,66 2,59 2,54 2,4917 4,45 3,59 3,20 2,96 2,81 2,70 2,61 2,55 2,49 2,4518 4,41 3,55 3,16 2,93 2,77 2,66 2,58 2,51 2,46 2,4119 4,38 3,52 3,13 2,90 2,74 2,63 2,54 2,48 2,42 2,3820 4,35 3,49 3,10 2,87 2,71 2,60 2,51 2,45 2,39 2,3521 4,32 3,47 3,07 2,84 2,68 2,57 2,49 2,42 2,37 2,3222 4,30 3,44 3,05 2,82 2,66 2,55 2,46 2,40 2,34 2,3023 4,28 3,42 3,03 2,80 2,64 2,53 2,44 2,37 2,32 2,2724 4,26 3,40 3,01 2,78 2,62 2,51 2,42 2,36 2,30 2,25

25 4,24 3,39 2,99 2,76 2,60 2,49 2,40 2,34 2,28 2,2430 4,17 3,32 2,92 2,69 2,53 2,42 2,33 2,27 2,21 2,1635 4,12 3,27 2,87 2,64 2,49 2,37 2,29 2,22 2,16 2,1140 4,08 3,23 2,84 2,61 2,45 2,34 2,25 2,18 2,12 2,0850 4,03 3,18 2,79 2,56 2,40 2,29 2,20 2,13 2,07 2,0360 4,00 3,15 2,76 2,53 2,37 2,25 2,17 2,10 2,04 1,9980 3,96 3,11 2,72 2,49 2,33 2,21 2,13 2,06 2,00 1,95

100 3,94 3,09 2,70 2,46 2,31 2,19 2,10 2,03 1,97 1,93

Este mismo estudio de comparacin de varianzas, puede realizarse utilizando las herramientasestadsticas de Excel Anlisis de la varianza de un factor.

Si el valor F calculado es mayor que el F de tabla, quiere decir que hay diferencia significativaentre las varianzas y esto requiere un estudio para analizar las causas de tal diferencia y su posterior eliminacin.


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3.5) Veracidad

Se puede estimar a partir de estudios interlaboratorios, materiales de referencia certificados, osobre material fortificado (Spike).

En caso que se cuente con un material de referencia certificado (MRC) se realizan un nmeron de determinaciones del mencionado material. Cada determinacin incluye todo el procesoanaltico. Si no se cuenta con el MRC, se realiza un fortificado sobre una matriz sin analito, osobre una muestra que contiene analito, pero deber realizarse el anlisis antes y despus delfortificado.

Se determina el sesgo de la siguiente forma:

ref Sesgo X X = (12)

o expresado como recuperacin:ref

X R

X = (13)

Se evala mediante una prueba t si la diferencia es estadsticamente significativa ( =0,05)

2 2( ) ( )

ref

ref

X X t

su

n

=

+

(14)

siendo:Xref : Valor del MRC X : promedio de las determinaciones experimentales.Uref : incertidumbre estndar del valor de referencia.S: desviacin estndar de las determinaciones experimentales. N: nmero de determinaciones experimentales.

El valor de t, se compara con el valor tabulado para n-1 grados de libertad y nivel designificacin =0,05. (TABLA 3)

TABLA 3

Dist t 2 colas alfa=0,05GL t GL t1 12,71 13 2,162 4,30 14 2,143 3,18 15 2,134 2,78 16 2,125 2,57 17 2,116 2,45 18 2,107 2,36 19 2,098 2,31 20 2,099 2,26 21 2,08

10 2,23 22 2,0711 2,20 23 2,0712 2,18 24 2,06



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Si el valor del t calculado es menor que el t de la tabla, se concluye que no hay diferenciasignificativa. Si existiera diferencia significativa, los resultados de las mediciones se corregirn por el factor correspondiente o si se decide no corregir, el sesgo se contemplar en el clculo dela incertidumbre de la medicin.Ver el procedimiento de clculo de incertidumbre, para la inclusin de estos datos en suclculo, como as tambin los datos obtenidos de estudios interlaboratorios.

Muestras fortificadas:Proceder de manera similar, aunque en este caso, hay que calcular la incertidumbre de lamuestra fortificada que se calcula combinando la incertidumbre del certificado del fabricante,y la incertidumbre debida al procedimiento de fortificado. Ver procedimiento de clculo deincertidumbre. Recordar que se pueden combinar incertidumbres que tengan las mismasunidades, caso contrario hay que transformarlas en incertidumbres relativas, hacer lacombinacin de las incertidumbres, y luego volver a transformarla en incertidumbre estndar para aplicar la frmula (14).

3.6) Rango de trabajo

El rango de trabajo queda definido en funcin del intervalo de valores de la magnitud que fueevaluado en los puntos precisin y veracidad.

3.7) Robustez

Personal responsable del laboratorio, establecer qu parmetros del mtodo de ensayo podranser crticos y se realizarn ensayos con dichos parmetros modificados.Se realizar una cantidadn de ensayos (mnimo 3) en las condiciones habituales del mtodo yuna cantidad igual de ensayos con los parmetros modificados. Se calcularn las medias y losdesvos estndar de ambos grupos de mediciones y se realizar una prueba t para diferencia de

medias. Si el valor del estadstico t es mayor que el valor crtico para un =0.05 y 2(n-1) gradosde libertad, se considerar que el parmetro modificado afecta la medicin.

1 2

2 21 2

X X t

s sn

=

+(15)

t : estadstico t, se compara con el valor de la tabla 3 para 2(n-1) GL.

Si el t calculado es mayor que el t de la tabla, se considera que el factor modificado afecta a lamedicin.Alternativamente, si existieran varios factores a considerar, se podr realizar un anlisis de lavarianza de dos o ms factores, utilizando un diseo factorial. En este ltimo caso, deberintervenir personal con los conocimientos estadsticos adecuados.

3.8) Incertidumbre de medicin

Ver clculo de incertidumbre por separado en otro documento.

3.9) Sesgover 3.5

3.10) Repetibilidadver 3.4



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4) Informe de validacin

Se realiza un informe de validacin, en el que se indicar la siguiente informacin:

Alcance de la validacin: Parmetro a medir (analito, propiedad fsica o qumica, ndice, etc),matriz de la muestra y rango de validacin.

Instrumental utilizado. Detallar los equipos utilizados y su identificacin. Detallar otrosmateriales como ser matraces, buretas, etc y su correspondiente identificacin.

Muestras utilizadas, materiales de referencia y reactivos indicado el lote siempre que sea posible.

Personal involucrado en las mediciones y que realiz el informe de validacin (nombre yapellido).

Las mediciones realizadas incluyendo los registros que correspondan (por ej cromatogramas).En caso de utilizar equipos similares, especificar en qu equipo se hizo cada medicin.

Los resultados obtenidos y las conclusiones.

Fecha, firma y aclaracin del personal responsable de aprobar el informe.

Referencias

(1) Gua para validacin de mtodos de ensayo. DC-LE-05 V.2 11/06/2008 O.A.A.

(2) Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis. Pure Appl.Chem., Vol. 74, No. 5, pp. 835-855, 2002 M. Thompson et al.

(3) A practical guide to analytical method validation, including measurement uncertainty andaccuracy profiles. A Gustavo Gonzlez, M. ngeles Herrador. Trends in AnalyticalChemistry, Vol. 26, No. 3, 2007.


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INFORME DE VALIDACIN

1) Alcance:Parmetro a medir:Rango:Matriz:

2) Instrumental utilizado:Equipos:Otro instrumental:

3) Muestras patrn, estndares y/o materiales de referencia.

4) Reactivos:Droga: Fabricante: Lote:

5) Mediciones:

6) Resultados:

7) Conclusiones:

8) Personal involucrado

9) Elaborado por: Fecha:

10) Aprobado por: Fecha:


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