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REVISIN DE TEMA

Staphylococcus aureus resistente a vancomicinaCarlos Andrs Rodrguez 1,2, Omar Vesga 1,3

1 Grupo Investigador de Problemas en Enfermedades Infecciosas GRIPE, Medelln, Colombia.2 Departamento de Farmacologa y Toxicologa, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medelln,

Colombia.3 Seccin de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina,

Universidad de Antioquia, Medelln, Colombia.

Objetivo. Revisar la evolucin y mecanismos moleculares de la resistencia de Staphylococcusaureus a vancomicina.Fuente de los datos. Se consult la base de datos MEDLINE y se seleccionaron artculos tiporeportes de caso, estudios bioqumicos, de microscopa electrnica y biologa molecularpertinentes.Sntesis. Despus de casi 40 aos de eficacia ininterrumpida de la vancomicina, en 1997 sereportaron los primeros casos de fracaso teraputico debido a cepas de Staphylococcus aureuscon resistencia intermedia, denominadas VISA (concentracin inhibitoria mnima, CIM, 8 a 16g/ml), as como a cepas con resistencia heterognea hVISA (CIM global = 4 g/ml, pero consubpoblaciones VISA), en las cuales la resistencia est mediada por engrosamiento de lapared celular y disminucin de su entrecruzamiento, lo que afecta la llegada del antibitico alblanco principal, los monmeros del peptidoglicano en la membrana plasmtica. En 2002 seaisl la primera de las 3 cepas reportadas hasta la fecha con resistencia total al antibitico,denominadas VRSA (CIM>32 g/ml), en las que se encontr el transposn Tn1546 provenientede Enterococcus spp, responsable del reemplazo de la terminacin D-Ala-D-Ala por D-Ala-D-lactato en los precursores de la pared celular con prdida de la afinidad por el glicopptido.Conclusiones. La resistencia a vancomicina es una realidad en S. aureus, mediada en el casode VISA por alteraciones en la pared celular que atrapan el antibitico antes de llegar al sitiode accin, y en el caso de VRSA, por transferencia desde Enterococcus spp. de genes quellevan a la modificacin del blanco molecular.Palabras clave: Staphylococcus aureus, peptidoglicano, biosntesis, antibiticos glicopptidos,vancomicina, resistencia microbiana a drogas, resistencia a vancomicina.Vancomycin-resistant Staphylococcus aureusThe evolution and molecular mechanisms of vancomycin resistance in Staphylococcus aureuswere reviewed. Case reports and research studies on biochemestry, electron microscopy andmolecular biology of Staphylococcus aureus were selected from Medline database andsummarized in the following review. After almost 40 years of successful treatment of S. aureuswith vancomycin, several cases of clinical failures have been reported (since 1997). S. aureusstrains have appeared with intermediate susceptibility (MIC 8-16 g/ml), as well as strains withheterogeneous resistance (global MIC 4 g/ml), but with subpopulations of intermediatesusceptibility. In these cases, resistance is mediated by cell wall thickening with reduced crosslinking. This traps the antibiotic before it reaches its major target, the murein monomers in thecell membrane. In 2002, a total vancomycin resistant strain (MIC 32 g/ml) was reported withvanA genes from Enterococcus spp. These genes induce the change of D-Ala-D-Ala terminusfor D-Ala-D-lactate in the cell wall precursors, leading to loss of affinity for glycopeptides.Vancomycin resistance in S. aureus has appeared; it is mediated by cell wall modifications thattrap the antibiotic before it reaches its action site. In strains with total resistance, Enterococcusspp. genes have been acquired that lead to modification of the glycopeptide target.Key words: Staphylococcus aureus; peptidoglycan; biosynthesis; antibiotics, glycopeptide;vancomycin; drug resistance, microbial; vancomycin resistance.

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Correspondencia:Omar Vesga, Calle 62 # 52-59 Laboratorio 630. Sede deInvestigacin Universitaria, Universidad de Antioquia,Medelln, Colombia.Tel: (4)2106541ovesgam@medicina.udea.edu.coRecibido: 14/04/05; aceptado: 26/08/05

Staphylococcus aureus es un microorganismoGram-positivo perteneciente a la familia Micrococ-caceae que se distingue de otras especies deestafilococos por la coloracin dorada de suscolonias y el resultado positivo en las pruebas decoagulasa, fermentacin del manitol ydesoxirribonucleasa (1). La descripcin clsica dela enfermedad estafiloccica y el papel de la bac-teria en la sepsis y formacin de abscesos sedebe a Sir Alexander Ogston, a finales del sigloXIX (1). En la actualidad S. aureus contina siendouno de los patgenos ms importantes y verstilesde la especie humana, ocupando un lugarpreponderante en las infecciones de piel y tejidosblandos, osteomielitis, neumona, endocarditis ybacteriemias (2), cuyo tratamiento se hace cadavez ms complejo debido a la gran capacidad delmicroorganismo de desarrollar resistencia a losantibiticos (figura 1) mediante una amplia gamade mecanismos que incluyen la produccin deenzimas, la sntesis de blancos moleculares debaja afinidad por los antimicrobianos, lasmutaciones o modificacin enzimtica (e.g.,metilacin) de protenas o cidos nucleicos, lageneracin de formas persistentes de crecimientolento con defectos en el transporte de electrones(conocidas como variantes de colonias pequeas)y las alteraciones en la sntesis o la estructura dela pared celular (2,3).El tratamiento de las infecciones estafiloccicasha evolucionado desde el inicio de la eraantibitica como consecuencia de la emergenciade la resistencia y el desarrollo de nuevosantibacterianos. La penicilina empez a utilizarseampliamente a partir de 1944, y tan solo 2 aosdespus, la resistencia en S. aureus mediada porla produccin de -lactamasas alcanzaba 6% delos aislamientos; para 1948 este porcentajesuperaba 50% (4). Durante los aos 50 sediseminaron las cepas resistentes a la penicilina,as como a los antibiticos recin introducidoseritromicina, cloranfenicol, estreptomicina y

Figura 1. Evolucin de la resistencia antimicrobiana en S.aureus. Abreviaturas: MRSA: Staphylococcus aureusmeticilino-resistente, VISA: Staphylococcus aureus conresistencia intermedia a vancomicina, VRSA: Staphylococcusaureus con resistencia total a vancomicina.

tetraciclina (5). El problema se soluciontemporalmente a comienzos de la dcada del 60con el desarrollo de las primeras cefalosporinas,cefalotina y cefaloridina, estables frente a la beta-lactamasa estafiloccica, reemplazadas luego porlas 6-acil penicilinas, meticilina, nafcilina yoxacilina. Infortunadamente, en 1961, el mismoao en que la meticilina alcanz el mercado, seaisl la primera cepa de S. aureus resistente(MRSA, por methicillin-resistant S. aureus) (6),productora de una protena ligadora de penicilina(PBP, por penicillin-binding protein) adicional, PBP2A o 2, con muy baja afinidad por los -lactmicos(7). Despus de una diseminacin inicial durantelos aos 60, MRSA declin casi hasta cero enlos aos 70, para reaparecer a mediados de ladcada del 80 (8). Desde entonces es un problemacreciente en los hospitales, donde alcanza hasta50% de los aislamientos (9), y ha empezado aextenderse a la comunidad (10).Los glicopptidos han sido el pilar del tratamientode las infecciones por MRSA desde la introduccinde estos antibiticos en 1958; sin embargo, elaislamiento de enterococos resistentes (VRE,vancomycin-resistant Enterococci) y deestafilococos coagulasa-negativos consusceptibilidad disminuida a finales de la dcadade 1980 (11), hicieron temer la aparicin deresistencia en S. aureus. Casi una dcadadespus, en 1997, se report en Japn la primeracepa con una concentracin inhibitoria mnima(CIM) para vancomicina de 8 g/ml (12) y el primeraislamiento con una CIM >32 g/ml se registren Estados Unidos a mediados de 2002 (13).

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Definiciones: VISA, hVISA, VRSALa literatura sobre la resistencia a vancomicinaen S. aureus se presta a confusin por lasdiferencias en los puntos de corte usados en variospases. El CLSI (Clinical Laboratory StandardsInstitute, antes NCCLS) de los Estados Unidos(14) y la SFM (Socit Franaise de Microbiologie)(15) utilizan 3 categoras: sensible (CIM 4 g/ml), intermedio (CIM entre 8 y 16 g/ml) yresistente (CIM 32 g/ml); mientras que la BSAC(British Society for Antimicrobial Chemotherapy)y el SRGA (Swedish Reference Group forAntibiotics) slo 2 categoras: sensible (CIM 4g/ml) y resistente (CIM 8 g/ml) (16,17). Estoha llevado al uso impreciso de los acrnimos VISA(vancomycin-intermediate S. aureus) y VRSA(vancomycin-resistant S. aureus). Debido a quelas cepas VISA y VRSA aisladas son resistentestambin a teicoplanina (otro glicopptido noaprobado en Estados Unidos), se han propuestolos trminos GISA y GRSA (por glycopeptide-intermediate y glycopeptide-resistant S. aureus)como ms adecuados; sin embargo, lasdiferencias entre pases en los puntos de cortepara este antibitico, y el aislamiento de cepasresistentes a teicoplanina sensibles avancomicina, no hacen recomendable el uso deesta terminologa. En adelante, la revisin seceir a los acrnimos VISA y VRSA de acuerdocon las definiciones del CLSI (14).Existe otra categora correspondiente a cepas deS. aureus con CIM 4 g/ml (sensibles) en laspruebas estndar, pero que presentansubpoblaciones con CIM 8-16 g/ml al realizar unperfil de anlisis poblacional (PAP, del inglspopulation analysis profile). Estas cepas se handenominado hetero-VISA (hVISA) (ver msadelante).Resistencia intermedia a vancomicina: cepasVISAEn 1997, Hiramatsu et al. (12) reportaron elaislamiento en Japn de una cepa MRSA en unpaciente de 4 meses de edad sometido a cirugacardiaca quien, despus del procedimiento,present fiebre y signos de infeccin en la heridaquirrgica. Recibi 29 das de terapia convancomicina (45 mg/kg/da) sin respuesta, por lo

que se agreg arbekacina (aminoglicsidoaprobado en Japn para MRSA). Despus de unamejora inicial reapareci la fiebre y se form unabsceso subcutneo, por lo que el tratamiento secambi a ampicilina-sulbactam ms arbekacina,y el paciente fue dado de alta 17 das despus.La cepa MRSA aislada, denominada Mu50, tenauna CIM para vancomicina de 8 g/mldeterminada por microdilucin en caldo. Desdeentonces se han reportado cepas VISA en Europa(18,19), Estados Unidos (20-23), Asia (24) y Brasil(25). El grupo colombiano de resistenciaantimicrobiana, RESCOL (26), tras analizar 296aislamientos nosocomiales de S.aureus en elperodo 2001-2002 encontr 52% de resistenciaa meticilina, pero ninguna cepa VISA mediante latcnica de tamizaje en agar infusin cerebrocorazn (BHIA, Brain-Heart infusion Agar) con 6g/ml de vancomicina segn recomendacin delCLSI y de los Centers for Disease Control (CDC)(27). Debe anotarse que el mtodo empleado porlos investigadores de RESCOL para detectar VISAtiene una muy baja sensibilidad (22%, veradelante).Los casos reportados de infecciones por VISAno permiten establecer factores de riesgoespecficos; sin embargo, se encuentran algunospuntos comunes: los pacientes presentabanenfermedades de base similares (cncer, diabetesmellitus e insuficiencia renal), la mayora habansido sometidos a dilisis y tenan bacteriemiasasociadas con catteres o material protsico, yhaban sido expuestos a dosis plenas devancomicina por perodos muy prolongados (entre6 y 18 semanas) 3 a 6 meses antes de la deteccinde la infeccin por VISA (28). Adems, losreportes de los Estados Unidos sugieren que lascepas VISA se desarrollaron a partir de cepas deMRSA que infectaron previamente los pacientes,dada la identidad entre sus patrones deelectroforesis de campo pulsado (PFGE, pulsed-field gel electrophoresis) (21-23).La vancomicina es un antibitico del grupo de losglicopptidos que tiene como blanco principal lassubunidades D-Ala-D-Ala en los monmeros delpeptidoglicano de las bacterias Gram positivas,que sirven como precursores de la sntesis de lapared celular. La resistencia en las cepas VISA

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no est mediada por un mecanismo nico, sinoque parece involucrar una compleja reorganizacinde la sntesis de la pared celular. A continuacinrevisaremos el mecanismo de sntesis de la paredcelular de S. aureus (figuras 2 y 3), y los ajustesque hace la bacteria a su metabolismo antes dedesplegar el fenotipo resistente.El principal componente de la pared celular de S.aureus es el peptidoglicano, una matriz depolisacrido compuesta de subunidadesalternantes de N-acetilglucosamina (GlcNAc) ycido N-acetilmurmico (MurNac). El paso inicial(figura 2) en la produccin del monmero depeptidoglicano es la formacin de glucosamina-6-fosfato (GlcNH2-6-P) a partir de glucosa,fructosa o glucosamina importadas al citoplasmadesde el medio exterior. Luego GlcNH2-6-P semodifica en GlcNH2-1-P y es acetilada para formarUDP-GlcNAc, la cual se combina con enolpiruvatoderivado de glucosa para formar UDP-MurNAc.Una L-alanina se incorpora luego al residuo UDP-MurNac, seguida por D-glutamato, L-lisina, y D-alanil-D-alanina para formar un pentapptido,constituyendo as el nucletido de Parks (29). Estees luego transferido al C55undecaprenilfosfato para

formar el lpido I del transportador de membranadel peptidoglicano, liberando UMP en el proceso(30). El siguiente paso implica la transferenciasecuencial de 5 residuos de glicina al componenteL-lisina del pentapptido para formar una cadenalateral de pentaglicinas. El residuo D-glutamatoes luego transformado por amidacin en D-glutamina, usando L-glutamina como donador deNH4+, reaccin que slo ocurre si la concentracinde este aminocido en la clula es alta (31). Acontinuacin se agrega GlcNAc al complejoC55undecaprenil-P-P-MurNAc usando UDP-GlcNAc como donante, formndose el lpido II,que es transferido a la cara externa de la mem-brana citoplasmtica, donde las transglicosilasasunen el precursor GlcNAc-MurNAc-pentapptido-pentaglicina a las cadenas existentes depeptidoglicano (figura 3). Ms tarde, lastranspeptidasas unen la cadena de pentaglicinade un monmero al residuo D-alanina en lapenltima posicin del pentapptido de la cadenavecina, liberndose el ltimo residuo de D-alaninay dando origen a un entrecruzamiento de cadenasque confiere rigidez a la estructura (30). El pasofinal en el procesamiento de la pared celular esrealizado por carboxipeptidasas, que remueven

Figura 2. Produccin de los monmeros de peptidoglicano en S. aureus. Abreviaturas, GPI: glucosa-6-P isomerasa, GlmS:glucosamina sintetasa, GlmM: glucosamina-6-P mutasa, MurA: UPD-GlcNAc-enolpiruvil transferasa, MurB: UDP-MurNAc-deshidrogenasa. (Modificada de Avison et al. (29) con permiso de Oxford University Press).

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Figura 3. Procesamiento del peptidoglicano en S. aureus. Las subunidades nuevas de GlcNAc-MurNAc-pentapptido-pentaglicina son unidas por las transglicosilasas y luego incorporadas a la red existente de peptidoglicano por medio de lastranspeptidasas que entrecruzan los pentapptidos con las pentaglicinas. El paso final de las carboxipeptidasas es necesariosolamente si el pentapptido terminal no es entrecruzado. La presencia de D-glutamina (D-Gln en lugar de D-Glu) esnecesaria para una transpeptidacin eficiente. (Modificada de Avison et al. (29), con permiso de Oxford University Press).

las alaninas terminales en las unidades que nofueron entrecruzadas por las transpeptidasas (30).Como no todos los pentapptidos son utilizados,siempre queda un nmero de residuos D-Ala-D-Ala sin procesar en la pared celular que se estimallegan a ser 6 x 106 por cada clula de S. aureus(31).Existen por tanto 2 tipos de blanco para lavancomicina: en primer lugar, los residuos libresde D-Ala-D-Ala en las capas terminadas depeptidoglicano y, en segundo, los monmeros depeptidoglicano que emergen de la membranaplasmtica, los cuales son el sustrato de lastransglicosilasas (32). La unin del glicopptido alos primeros blancos no interfiere con la sntesisde peptidoglicano, pero s con la transpeptidacin

mediada por las PBP; en cambio, si el antibiticose une a los monmeros en la membrana, lasntesis de la pared celular se detiene y las clulasdejan de multiplicarse. Es muy importante anotarque para llegar a estos monmeros, las molculasde vancomicina tienen que atravesar por lo menos20 capas de peptidoglicano sin ser atrapadas porlos primeros blancos (33).El mecanismo de resistencia a vancomicina hasido estudiado extensamente en la primera cepaVISA, Mu50 (33,34) (cuadro1). Las pruebasbioqumicas y la microscopa electrnica indicanque esta cepa produce mayores cantidades depeptidoglicano (debido a la mayor incorporacinde GlcNAc, la mayor concentracin de monmerosde peptidoglicano y la mayor produccin de PBP2

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y 2A), y que su pared celular es ms gruesa (entre30 y 40 capas de peptidoglicano). Comoconsecuencia, un mayor nmero de molculas devancomicina pueden ser atrapadas antes de llegara la membrana citoplasmtica, donde actan lastransglicosilasas. Este mecanismo se hadenominado atrapamiento de afinidad.Adicionalmente, se ha visto que la estructuraexterna de la pared celular se distorsiona por lasmolculas secuestradas de vancomicina, lo queimpide aun ms la entrada de otras molculas delantibitico (35). Este hallazgo fundamental no selimita a la cepa Mu50. Cui et al. (36) midieron pormicroscopa electrnica el grosor de la paredcelular de 16 cepas VISA recuperadas en sietepases diferentes, obteniendo una media de 31,3nm (desviacin estndar 2,62) y las compararoncon 7 cepas susceptibles VSSA (vancomycin-susceptible S. aureus) cuyo grosor medio fue de23,99 nm (desviacin estndar 2,04). Adems,encontraron una correlacin significativa (r =0,908, p < 0,001) entre la CIM para vancomicinay el grosor de la pared.Adems del engrosamiento de la pared, se haobservado una disminucin en el grado deentrecruzamiento (cross-linking) de las cadenasde peptidoglicano (cuadro 1), lo cual aumenta elnmero de D-Ala-D-Ala libres en las capasexternas de la pared y por tanto ms antibiticopuede ser atrapado antes de llegar al sitio deaccin (31). Se han planteado 2 hiptesis paraexplicar este fenmeno: la disminucin de laamidacin de los muropptidos y la reduccin enla expresin de la PBP4.Como ya se mencion, durante las fases previasa la transferencia de los precursores de la pared

celular a travs de la membrana, el D-glutamatodel pentapptido es convertido por amidacin (apartir de L-glutamina que se transforma en L-glutamato al donar el grupo NH4+) en D-glutamina.Sin embargo, en Mu50 se encuentra una mayorproporcin de muropptidos no amidados (34), loscuales se consideran pobres sustratos para lastranspeptidasas, lo que, en consecuencia, generamenos entrecruzamientos (35). El anabolismo delpeptidoglicano es altamente dependiente de ladisponibilidad de L-glutamina, que acta comodonante de grupos NH4+ para convertir fructosa-6-fosfato en GlcNH2-6-P en la produccin de UDP-GlcNAc, y para producir UDP-MurNAc por mediodel fosfoenolpiruvato (figura 2). La regeneracinde L-glutamina a partir de L-glutamato estmediada por la enzima glutamina sintetasa, quees una de las ms estrictamente reguladas enlas bacterias (37). La va de regulacin de laglutamina sintetasa en S. aureus no se conoce,pero las vas intermedias son las mismas que enEscherichia coli, en la cual la enzima es inhibidapor la GlcNH2-6-P y activada por la presencia de2-cetoglutarato o L-glutamato (37,38). En la cepaMu50 existe evidencia de que la clula utilizapreferencialmente glucosa en lugar deglucosamina para producir peptidoglicano y, portanto, las reservas de L-glutamina se depletandebido a la mayor produccin de GlcNH2-6-P y,subsecuentemente, GlcNAc (35). Lo anterior llevaa que la L-glutamina disponible para la amidacindel D-glutamato en el pentapptido de losprecursores tambin disminuya y, en consecuencia,haya una menor transpeptidacin (39).Con respecto a la expresin de PBP4, losexperimentos de Sieradzki y Tomasz (40,41)resultaron en la obtencin por subcultivosecuencial de 2 mutantes altamente resistentesa vancomicina (CIM 72 g/ml), denominadas VMy TNM. La resistencia se relacionaba con elengrosamiento de la pared celular y la liberacinal medio de grandes cantidades de peptidoglicanocon una disminucin hasta de 85% en su gradode entrecruzamiento y, por tanto, una mayorcantidad de D-Ala-D-Ala libre para atrapar elantibitico. En ambas cepas la expresin dePBP4, una carboxipeptidasa y transpeptidasasecundaria que se requiere para el

Cuadro 1. Mecanismos implicados en la resistenciaintermedia a vancomicina.

Mecanismos Referencias

Engrosamiento de la pared celular 33, 35, 36 Aumento en la captacin de GlcNAc Incremento de monmeros de peptidoglicano Sobreexpresin de PBP 2 y 2aDisminucin del entrecruzamiento Disminucin en la amidacin de los

muropptidos Reduccin en la expresin de PBP4 34, 35, 41,43

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entrecruzamiento de la pared celular (42), estabadisminuida o anulada. Se observaron resultadossimilares en cepas clnicas de VISA en estudiosde Finan et al. (43). Aunque las hiptesismencionadas explican parcialmente el mecanismode resistencia a vancomicina, se han aislado unaspocas cepas VISA que no tienen estasalteraciones en la pared celular, lo que hace pensarque la resistencia debe obedecer a mecanismosalternativos an sin estudiar (44).Estudios genmicos en S. aureus Mu50La activacin de la sntesis de la pared celularobservada en la cepa Mu50 debe ocurrir enmltiples puntos de la va metablica, por lo cualla mutacin de un slo gen o la adquisicin de ungen exgeno es una explicacin poco probable.En su lugar, la sobreexpresin de varios genesasociados a la sntesis del peptidoglicano serauna hiptesis ms factible. Kuroda et al. (45)prepararon libreras de ADNc de la cepa Mu50 yde una cepa sensible a vancomicina, y hallaronvarios genes sobreexpresados. En primer lugar,se identific un gen denominado vraR (por vanco-mycin resistance associated), similar al gen yvqCde Bacillus subtilis, conocido como un reguladorde respuesta, que al introducirse mediante un vec-tor a la cepa control elev su CIM de 0,5 a 2,0 g/ml. Tambin encontraron 3 genes con alta similitudcon el opern de fructosa en B. subtilis (fruR, fruB,fruA), 2 genes involucrados en la sntesis decidos grasos (vraA-C) y 4 genes de nuevostransportadores de la familia ABC: ATP-bindingcassettes (vraDE, vraFG), muy similares altransportador de glutamina glnQ. Estos hallazgospueden relacionarse con el direccionamiento delmetabolismo de los azcares glucosa y fructosahacia la sntesis de la pared celular, y con unamayor captacin de nutrientes del medio paramantener su alta tasa de produccin.Otra aproximacin presentan Avison et al. (29)basndose en la comparacin de las secuenciaspublicadas del genoma completo de Mu50 y devarias cepas MRSA sensibles a vancomicina(46). El anlisis in silico revel 17 mutaciones deprdida de funcin en genes con funciones yacaracterizadas. Se destaca la completa disrupcindel gen murA, que codifica la UDP-GlcNAc-

enolpiruvil transferasa, necesaria para la sntesisdel UDP-MurNAc (47); del gen mrp, anlogo defmtB, gen cuya inactivacin disminuye laresistencia a meticilina en cepas MRSA (48), yde los genes odhA y sdhB, que codifican por lasenzimas 2-cetoglutarato deshidrogenasa ysuccinato deshidrogenasa, respectivamente. Esnotable el hallazgo de estas deleciones enenzimas encargadas de reacciones clave en lasntesis de la pared celular y de metabolitosintermediarios de la glutamina y la glucosamina,lo que est en concordancia con las alteracionesbioqumicas reportadas en la cepa Mu50 (33).Tambin es destacable la prdida del gen mutS,que codifica una protena reparadora del ADN.Estudios anteriores han mostrado que la prdidade la funcin de este gen conduce a un fenotipode hipermutacin (100 veces ms mutacionesespontneas comparadas con las cepas mutS+),asociado al desarrollo de resistencia a antibiticosy a una disminucin de la adaptabilidad evolutiva(fitness, en la literatura inglesa) (49), lo cual puedeexplicar los mayores tiempos de generacinreportados para la cepa Mu50 en comparacin concepas VSSA (36).Resistencia intermedia heterognea avancomicina: cepas hVISAEl fenmeno de la heterorresistencia, o sea, ladistribucin no homognea del fenotipo resistenteen una poblacin bacteriana, se conoce en S.aureus desde el desarrollo de la resistencia ameticilina (50). A comienzos de los aos 1980 seobserv que si bien todas las clulas de MRSAen una poblacin dada posean el gen mecA, laCIM de meticilina variaba desde unos pocosmicrogramos por mililitro por encima del punto decorte de susceptibilidad hasta niveles cientos deveces ms altos, hecho que se atribuye a laexpresin diferencial de otros determinantesgenticos involucrados en la resistencia, talescomo el gen femA (51). Se postula que el uso decarbapenems y cefalosporinas de tercerageneracin para tratar estas cepas MRSAheterogneas, que al principio aparecansusceptibles, condujo a la seleccin de lassubpoblaciones ms resistentes y al predominiode MRSA homogneo (52). En el caso devancomicina, las cepas hVISA tienen

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subpoblaciones de clulas con resistenciaintermedia (CIM entre 8 y 16 g/ml), mientras laCIM global est en el rango de susceptibilidad(< 4 g/ml). La vancomicina crea una presinselectiva que favorece el predominio de lassubpoblaciones de clulas ms resistentes,generando hVISA y, eventualmente, con laexposicin continua, una poblacin uniforme deVISA (53). La primera cepa hVISA, Mu3, fueaislada en Japn en 1996 en un paciente de 64aos con neumona por MRSA tratada sin xitocon vancomicina durante 12 das, conagravamiento del cuadro en los ltimos 4 das deterapia. Aunque la CIM de este aislamiento erade 4 g/ml, algunas subpoblaciones podan creceren medios con vancomicina a concentracionesentre 5 y 9 g/ml, indicando la presencia deresistencia heterognea. La electroforesis decampo pulsado mostr que esta cepa tena unpatrn indistinguible de Mu50, aislada unos mesesdespus en el mismo hospital, lo que sugiere queMu3 puede ser su origen. Adems, el cultivoseriado de la cepa hVISA en concentracionescrecientes de vancomicina dio origen asubpoblaciones con un nivel de resistencia similaral de Mu50. Este fenmeno in vitro es sugestivode que la colonizacin o infeccin con VISA puedeser precedida por infeccin con hVISA, y luego laexposicin prolongada al antibitico lleva a laaparicin de una poblacin con resistenciauniforme (54).Actualmente no hay un mtodo estandarizado paraidentificar las cepas hVISA. El anlisis poblacionalse ha propuesto como la tcnica ms precisa. Enste, las diluciones seriadas de una suspensininicial de 108 UFC/ml se siembran en cajas dePetri con BHIA con vancomicina (BHIA-V) aconcentraciones crecientes y a las 48 horas sedetermina el nmero de colonias viables, registrandolos datos en una grfica semilogartmica. Sinembargo, la naturaleza laboriosa de esta tcnicay el requerimiento de un costoso equipoelectrnico para siembra espiral en medio slido(Spiral Plating Apparatus), la hacen poco prcticapara la mayora de laboratorios. En su lugar,Hiramatsu et al. (54) propusieron una tcnicasimplificada que consiste en inocular 10 l de unasuspensin de 108 UFC/ml en BHIA con 4 g de

vancomicina por ml (tcnica BHIA-V4). Elcrecimiento a las 24 horas se considera VISApotencial y a las 48 horas hVISA potencial. Elestado hVISA se confirma si se encuentransubpoblaciones con CIM de 8 g/ml quepermanecen estables durante ms de 9 das enmedio libre de antibitico. Otros mtodosreportados en la literatura utilizan mediosdiferentes como el agar Mueller-Hinton (MHA), ovaran los inculos y las concentraciones devancomicina. Walsh et al. (55) probaron 284 cepasde MRSA y 45 cepas de VISA y hVISAcomparando las tcnicas de BHIA-V4, MHA con5 g/ml de vancomicina, dilucin en caldo, dilucinen agar, y el E-test, con el PAP como estndarde oro. La sensibilidad y especificidadencontradas fueron: BHIA, 22 y 97%; MHA, 20 y99%, dilucin en caldo, 11 y 100%, y dilucin enagar, 20 y 100%, mientras que el E-test con uninculo de 2,0 McFarland alcanz 96% y 97%,respectivamente.Los reportes de hVISA son ms frecuentes entrecepas resistentes a la meticilina. De 7.920 cepasde S. aureus aisladas en diferentes pases en elperodo de 1997 a 2001, 1,67% (132 aislamientos)fue reportado como hVISA (53), aunque estafrecuencia puede ser mayor dada la carencia deun mtodo estandarizado y sensible para ladeteccin de heterorresistencia. En el mismoestudio se encontr una frecuencia 43 vecesmayor de hVISA en las cepas meticilinoresistentes (131 entre 6.052, 2,16%) que en lascepas meticilino sensibles de S. aureus (1 entre1.868, 0,05%), hecho sugestivo de que estascepas ms expuestas a los antibiticos tendranmayor capacidad para desarrollar resistenciaheterognea.La significancia clnica de hVISA no se ha definidocon exactitud, en particular debido a que algunosconsideran que la vancomicina tiene menor efectobactericida contra S. aureus que los -lactmicosy que su penetracin al sitio de la infeccin eslimitada por el gran tamao de la molcula,caractersticas que podran por s solas explicarlas fallas teraputicas observadas en infeccionespor estas cepas (56,57). Desde un punto de vistabiolgico, el status hVISA conferira una ventajade supervivencia a S. aureus, ya que si bien dosis

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teraputicas de vancomicina eliminan 99,9% dela poblacin, la fraccin restante sobrevive y escapaz de crecer a concentraciones de antibiticode 4 g/ml o superiores. Estas clulas VISAgastan gran cantidad de energa para engrosar lapared celular y tienen una adaptabilidad evolutiva(fitness) menor que las cepas VSSA, por lo cualtienden a revertir al fenotipo hVISA una vez cesala presin del antibitico. Sin embargo, cuandose exponen nuevamente a vancomicina generanmutantes resistentes con una alta frecuencia, loque asegura la supervivencia de la cepa (58).Resistencia total a vancomicina: cepas VRSAEn 1992, Noble et al. (59) reportaron latransferencia in vitro y sobre la piel de un ratnde los genes de resistencia a vancomicina de unacepa de Enterococcus faecalis a S. aureus,confirindole resistencia total (CIM > 32 g/ml).Desde entonces se ha postulado que puede ocurrirtransferencia de material gentico si los dosmicroorganismos comparten el mismo nichoecolgico. Al respecto, estudios de Ray et al. (60)demostraron que hasta 62% de los pacientescolonizados con VRE tienen tambin S. aureusen el tracto gastrointestinal, constituyendo unreservorio potencial para la aparicin de cepasresistentes.En junio de 2002 se aisl la primera cepa clnicade VRSA (13), con una CIM para vancomicina de1.024 g/ml, en una paciente de 40 aos residenteen Detroit, Michigan, Estados Unidos, condiagnstico de hipertensin, diabetes mellitus,enfermedad vascular perifrica y falla renal crnicaen hemodilisis, quien haba recibido vancomicinapreviamente para tratar infecciones recurrentesde lceras en miembros inferiores por MRSA y E.faecalis. Despus de una amputacin, la pacientedesarroll bacteriemia por MRSA y un abscesoasociado a un injerto arteriovenoso para accesode dilisis. El injerto fue retirado y la dilisis serealiz por medio de catteres temporalescolocados secuencialmente. El sitio de accesodel tercer catter mostr signos de infeccin, porlo que fue retirado y de la punta se aislaron S.aureus y E. faecalis resistentes a vancomicina.Los mismos microorganismos se aislaron en 2lceras plantares. Despus de desbridamiento

quirrgico y 14 das de trimetoprim-sulfametoxazolms metronidazol, la paciente fue dada de alta y,para diciembre de 2002, las lceras habansanado. Los cultivos de las axilas, narinas,ombligo y recto fueron negativos para VRSA y nose aisl el microorganismo en ninguno de loscontactos del paciente (61). Dos meses despusse report la segunda cepa VRSA (62) en unpaciente de 70 aos residente en Hershey,Pennsylvania, quien padeca obesidad mrbida yuna lcera crnica en el tobillo, en la cual se habaaislado previamente MRSA y VRE. Sorprendente-mente, el paciente no haba sido hospitalizado nihaba recibido vancomicina en los 5 aos previos(63). El tercer caso de VRSA se report en marzode 2004 en un paciente hospitalizado en NuevaYork (CIM > 256 g/ml), que se encuentraactualmente en estudio por parte de lasautoridades sanitarias (64).La caracterstica comn de los 3 aislamientos esla presencia del fenotipo VanA, que confiereresistencia a vancomicina mediante la sustitucindel extremo D-Ala-D-Ala del monmero depeptidoglicano por D-Ala-D-Lactato, cuya afinidadpor el antibitico es 1.000 veces menor que la delmonmero silvestre. La resistencia est mediadapor un complejo de genes: vanS, vanR (genesreguladores), vanA, vanH, vanX (genes efectores).La protena VanS se autofosforila en presenciade vancomicina y transfiere el grupo fosfato aVanR, que es un factor de transcripcin para losdems genes. VanX es una dipeptidasa quehidroliza los residuos D-Ala-D-Ala para que no seincorporen a la pared celular blancos susceptiblesa vancomicina. VanA cataliza la formacin de D-Ala-D-Lactato y VanH, una alfa-cetocidoreductasa que se encarga de aportar el D-lactatonecesario (65). El anlisis molecular del primeraislamiento revel la presencia de un plsmidoconjugativo en el cual estaba integrado el genvanA (66), con 100% de homologa con lasecuencia prototipo aislada en VRE, el transposnTn1546, demostrndose as la transferenciainterespecies de este determinante de resistencia,que adems es transferible a otras cepas de S.aureus. El anlisis del segundo aislamiento (67)mostr igualmente la presencia del transposnTn1546, pero con algunas secuencias truncadas,

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lo que podra explicar el menor nivel de resistenciade esta cepa (CIM 32 g/ml vs. 1024 g/ml delprimer aislamiento).ConclusionesLas cepas VISA y hVISA han desarrollado unmecanismo de resistencia completamente nuevo,consistente en el atrapamiento de la vancomicinaen la pared celular bacteriana, por el cual elantibitico retiene su estructura y actividadbiolgica, pero pierde la disponibilidad parainteractuar con el blanco molecular. Adicionalmente,las observaciones sobre el carcter reversible delfenotipo resistente y la disminucin de fitness queacarrea la resistencia han llevado a autores comoHiramatsu (58) a postular la dinmica hVISA-VISAcomo una estrategia evolutiva que le permite a S.aureus adaptarse en ambientes con alta presinde antibiticos (en este caso glicopptidos),manteniendo un equilibrio entre la supervivenciade la cepa y el alto costo biolgico de laresistencia. Esta disminucin de la adaptabilidadevolutiva de las cepas VISA es probablemente larazn por la cual no se han diseminado, pero laacumulacin de mutaciones adicionales quecompensen tal desventaja evolutiva es unaposibilidad latente, como se ha evidenciado en elcaso de E. coli y Mycobacterium tuberculosisresistentes a estreptomicina, las cuales, despusde sufrir un dficit inicial en la velocidad decrecimiento, llegan a igualar o incluso superar asus contrapartes sensibles tras un periodo dereplicacin en medio libre de antibitico (68). Deotro lado, la presin continua de los antibiticos yla coexistencia de microorganismos que confrecuencia creciente portan mecanismos deresistencia transferibles y ms eficientes (Entero-coccus spp.) han hecho inevitable la aparicin delas cepas VRSA, escasas hasta la fecha, perocon un peligroso potencial de diseminacin.Finalmente, aunque la resistencia a vancomicinaen S. aureus es una realidad, la situacin hastaahora no es tan crtica como se pronosticaba (69),ya que las cepas encontradas no sonpanresistentes y, de hecho, han sido tratadasexitosamente con antibiticos de amplio usoclnico como trimetoprim-sulfametoxazol, o recinaprobados, como linezolid. Adems, estas cepasson susceptibles a casi todos los antibiticos

desarrollados recientemente contra cocos Gram-positivos, incluidos quinupristina/dalfopristina,daptomicina, oritavancina y tigeciclina. Sin em-bargo, es de suma importancia implementarestrategias rigurosas de monitorizacin paradetectar y tratar rpidamente nuevos aislamientos,aplicar medidas adecuadas de barrera para evitarla diseminacin, e insistir incansablemente en eluso prudente de los antimicrobianos (70).

AgradecimientosAgradecemos a los estudiantes del GrupoInvestigador de Problemas en EnfermedadesInfecciosas, GRIPE, por su colaboracin durantela bsqueda bibliogrfica.

Conflictos de intersLos autores son profesores (asistente y asociadorespectivamente) de la Facultad de Medicina dela Universidad de Antioquia y declaran que no sepresentaron conflictos de inters en la elaboracinde este manuscrito.

FinanciacinAparte de su asignacin como docentes de laFacultad de Medicina de la Universidad deAntioquia, los autores no recibieron ningunafinanciacin para la realizacin de este artculo.

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