UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL DE BIOLOGIA EN ACUICULTURA

INFORME FINAL DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

Utilización de Vibrio spp. aislado de adultos de Argopecten purpuratus “concha de

abanico”, como antagonista de Aeromonas sp. en condiciones de laboratorio.

AUTORES:

Gonzalez Ferrer José Arturo

Velásquez Dávalos Darwin Alexander

ASESOR:

M. SC .Ángel Castro Alvarado

Nuevo Chimbote, diciembre de 2011

Introducción

Argopecten purpuratus“Concha de abanico”, es un bivalvo pectínido que habita en el

Pacifico suroriental a lo largo de la costa del Perú y Chile, su distribución abarca desde

Paita Perú (5ºS) hasta Valparaíso, Chile (33ºS). – esta especie vive, en las aguas costera

entre los 5 a 30 m de profundidad, (Farías et al, 1997).

La presencia constante de bacterias en los tejidos de moluscos bivalvos es considerada

un fenómeno natural, ya que debido a su capacidad de filtrar diferentes partículas entre

ellas las bacterias, concentraría en sus órganos una mayor carga de estos

microorganismos en comparación con otros invertebrados marinos (Prieur et al. 1990,

Araya et al. 1999).

El género Aeromonas, perteneciente a la familia Vibrionaceae, está formado por

bacilos gramnegativos, no esporulantes y anaerobios facultativos. Presentan numerosas

similitudes con la familia Enterobacteriaceae. El género se divide en dos grupos. El

grupo de las aeromonas psicrófilas inmóviles está formado por una única especie, A.

salmonicida, un patógeno obligado de peces que no se aborda más a fondo en este

documento. El grupo de las aeromonas mesófilas móviles (con un flagelo polar único),

considerado potencialmente peligroso para la salud humana, está formado por las

especies A. hydrophila, A. caviae, A. veronii subsp. sobria, A. jandaei, A. veronii subsp.

veronii y A. schubertii. Estas bacterias viven de manera habitual en el agua dulce y están

presentes en el agua, el suelo y muchos alimentos, especialmente en la carne y la leche.

Un método alternativo al uso de antibióticos y que está ganando aceptación en la

acuicultura es el uso de bacterias probióticas para controlar patógenos microbianos

(Gómez-Gil et al. 2000, Robertson et al. 2000, Balcázar et al. 2006). Estas

interacciones antagónicas de tipo bacteriana que involucran la inhibición del

crecimiento, corresponden a un mecanismo que puede ayudar a mantener la

composición de especies bacterianas a nivel de micro-escala (Long & Azam 2001).

Riquelme et al. (2001) y Araya et al. (1999), señalan que la adición de un antagonista

bacteriano podría implicar el desplazamiento de bacterias por la producción de

componentes inhibitorios, relaciones competitivas del espacio y una mejor utilización

del sustrato.

Los objetivos de este trabajo fueron la utiización de Vibrio spp. aislado de adultos de

Argopecten purpuratus “concha de abanico”, como antagonista de Aeromonas sp. en

condiciones de laboratorio y evaluar su uso como agente de control biológico de

Aeromonas sp.

Materiales y métodos

Se trabajo con 5 adultos de Argopecten Purpuratus “concha de abanico”, los cuales

presentaron una talla promedio de 8.5 cm, posteriormente se lavaron a individuos con

agua corrida por un lapso de 5 minutos aproximadamente, después de esto se extrajo

una muestra de contenido estomacal de cada individuo y se preparo una suspensión con

las mismas en solución salina, posteriormente se saco una azada de cada suspensión las

cuales fueron sembradas en placas con medio TCBS, para luego incubarlas en una

estufa convencional a 37 ºC por 72 horas.

Fig 1. Preparación de agar TCBS

Fig 2. Especímenes de A. Purpuratus “concha de abanico “

Fig 3. Obtención de las muestras de A. Purpuratus

Fig 4. Suspensión del contenido estomacal de adultos de Argopecten Purpuratus

Fig 5. Colonias de vibrio aisladas de adultos de Argopecten Purpuratus

Fig 6. Selección de colonias de vibrio y sembrado en frascos de penicilina con agar

común.

Fig 7. Incubación de las cepas aisladas

Una vez finalizado el periodo de incubación se puedo observar las características de las

colonias crecientes en cada placa, de donde posteriormente se seleccionaron 5 colonias

al azar para luego ser sembradas en frascos de penicilina con agar común para su

posterior uso.

Prueba de la capacidad inhibitoria de las bacterias aisladas de Argopecten

Purpuratus “concha de abanico “

Para hacer la prueba de inhibición bacteriana se utilizo Aeromonas sp como patógeno,

asimismo con la finalidad de tener cultivos de la misma edad y en las mismas

condiciones se volvió a sembrar las bacterias de vibrio aisladas a partir de adultos de

Argopecten Purpuratus “concha de abanico” en otros frascos de penicilina con agar

común, lo mismo se hizo con la bacteria patógena, una vez obtenido el cultivo joven de

cada bacteria se preparo una suspensión de de cada una, de donde se tomo un mililitro

de la suspensión de Aeromonas sp y se espacio en dos placas con agar común,

posteriormente se incubo por 20 minutos a 37 ºC, una vez culminado este tiempo se

coloco discos estériles en forma dispersa sobre el medio con Aeromonas sp para

posteriormente introducir una azada de la suspensión de cada bacteria de vibrio, y

finalmente se incubo a 37º C por 24 horas.

Fig. 8. Prueba de inhibición de las cepas aisladas de Vibrio sp mediante la utilización de

discos estériles.

Fig. 9. Colocación de los discos e incubación de las placas.

Prueba de fermentación de sacarosa: Para esta prueba se preparo el medio sacarosa

en tubos de ensayo, y posteriormente se coloco una azada de la suspensión de cada

bacteria de vibrio aislada de adultos de Argopecten purpuratus “concha de abanico “y

incubo a 37 ºC por 24 horas, de donde se puedo observar el cambio de color del medio,

debido a la fermentación de la sacarosa.

Prueba de oxidasa: Se puso una azada de la suspensión bacteriana de la bacteria 1 y 5

en la cinta de oxidasa de donde se pudo observar el cambio de color de la cinta

Fig. 10. Prueba de citocromo oxidasa

Coloración Gram: Para la coloración Gram se tomo una azada de la bacteria 1 y con

una de solución salina en una laminilla, posteriormente se fijó y asimismo se agrego

cristal violeta, lugol, alcohol acetona y safranina respectivamente en forma ordenada.

Finalmente se observó a inmersión a 100x.

Fig. 11. Lámina montada con tinción Gram.

Resultados

Los resultados determinaron que de las 5 cepas aisladas la 1 y 5 dieron positivo en la

prueba de sacarosa, las demás fueron negativas y sin formación de gas.

Asimismo se observó que únicamente las cepas 1 y 3 presentaron halo de inhibición,

siendo el mayor de 8 mm en la cepa 1, por lo que fue seleccionada para la prueba de

citocromo oxidasa que resultó positiva. De igual manera se obtuvo que la bacteria 1 fue

Gram positiva y presentó forma bacilar.

Fig. 12. Resultados de la prueba de sacarosa

Fig. 13. Prueba citocromo oxidasa positiva

Fig. 14. Formación de halos de inhibición en las cepas 1 y 5

Tabla 1. Medición de los halos de inhibición presentadas por las bacterias 1 y 5

Bacteria

N°

Medida de halo Medida de disco Inhibición

1 8 mm 5.5 mm 2.5 mm

5 6 mm 5.5 mm 0.5 mm

Tabla 2. Características de la bacteria 1.

Bacteria

N°

Sacarosa Oxidasa Coloración

Gram

Morfología

celular

Color de

Colonia

1 + + + bacilar amarilla

Fig. 15. Observación microscópica de la cepa seleccionada (bacteria 1).

Discusión

En la actualidad cada vez más se investiga sobre los aspectos benéficos o antagónicos

de la interacción de algunas especies bacterianas y los demás componentes del ciclo

microbiano (Leyton & Riquelme 2008). Estas interacciones antagónicas de tipo

bacteriana que involucran la inhibición del crecimiento, corresponden a un mecanismo

que puede ayudar a mantener la composición de especies bacterianas a nivel de micro-

escala (Long & Azam 2001). Riquelme et al. (2001) y Araya et al. (1999), señalan que

la adición de un antagonista bacteriano podría implicar el desplazamiento de bacterias

por la producción de componentes inhibitorios, relaciones competitivas del espacio y

una mejor utilización del sustrato.

En el estudio realizado se obtuvo que de las 5 cepas aisladas, sólo las cepas 1 y 5

presentaron halos de inhibición (Tabla 1), seleccionando la cepa 1 por presentar el halo

más grande. De esta manera, los resultados obtenidos indicarían que la bacteria 1 sería

aeróbica y no fermentadora o que fue corroborado en la prueba de sacarosa al no

observarse formación de gas en la campana Durham. Esto unido al hecho de ser Gram

positiva nos daría más datos en la identificación del género.

La bacteria 1 fue la que presentó el halo más grande con 8 mm de diámetro, siendo

pequeño en comparación con lo encontrado por Avendaño-Herrera et a. (2005) quienes

reportan que, las actividades inhibitorias de las cepas seleccionadas variaron desde

simples halos de inhibición de escasos 2 mm hasta potentes antagonismos bacterianos

de 30 mm de diámetro. Asimismo, León et al. (2010), reporta que los diámetros de

halo de inhibición variaron de 3,7 mm a 20 mm. Esto significaría que los porcentajes

de substancias inhibitorias en las bacterias muestran valores fluctuantes según las cepas

(Prescott et al., 1999).

Sin embargo, el tamaño del halo de inhibición del crecimiento bacteriano no tiene

relación lineal con el efecto bactericida de los antibióticos utilizados, ya que éste está

relacionado también con la concentración del mismo y con la capacidad de difusión del

antibiótico en el medio (Madigan et al., 2003; Prescott et al., 1999).

Además, la efectividad in vitro de un probiótico no garantiza los mismos resultados in

vivo (Campa-Córdova et al., 2011). De esta manera, para determinar la sensibilidad de

una determinada especie frente a un antibiótico, se realiza una comparación con datos

conocidos (Ajello García-Tello 2004; Fajardo, 2002).

Por otro lado, León et al, 2010 destaca el aislamiento de cepas pigmentadas de

amarillo, las cuales mostraron fuerte actividad inhibitoria contra Staphylococcus aureus,

así como las dos cepas de actinomicetos (EM-10 y EM-14) ambos procedentes de

Heliaster helianthus “estrella de mar”. Asimismo, García-Tello & Fajardo (2002)

aislaron 23 cepas hallándose morfología celular de bacillus y cocco siendo todas

oxidasa citocrómica positivas sólo 2 fueron Gram negativas, las demás fueron Gram

positivas colonias amarillas y cremas. Del mismo modo en la experiencia realizada se

observó que a bacteria seleccionada presentó color amarillo y forma bacilar, siendo

insuficiente estos datos para determinar el género por lo que debe hacerse más pruebas y

el análisis morfológico para este propósito.

Igualmente, en el estudio realizado, se determinó que la cepa seleccionada resultó ser

Gram positiva ofreciendo esto una ventaja pues, el uso de bacterias Gram positivas

como indicadoras de antibiosis permite recuperar mayor número de cepas marinas

gracias a la alta sensibilidad inhibitoria mostrada en comparación con las Gram

negativas (León et al, 2010).

Conclusiones

- Se aislaron 5 cepas de los ejemplares de A. purpuratus anualizados, teniéndose los

mejores resultados en la cepa 1 presentando un halo de inhibición de 8 mm de

diámetro.

- Se registró que la bacteria seleccionada presentó color de colonia amarilla, forma

bacilar y Gram positiva y tuvo resultado positivo a las pruebas de sacarosa y citocromo

oxidasa.

- Por los resultados obtenidos se sugiere su utilidad probiótica en acuicultura. No

obstante para medir su sensibilidad inhibitoria es pertinente determinar las

concentraciones y dosis apropiadas para efectivizar sus propiedades antagónicas en

Aeromonas sp.

Recomendaciones

Los resultados de este estudio son prometedores si se considera que los antibióticos son

cada vez más escasos, especialmente frente a patógenos causantes de enfermedades

emergentes y aquellos oportunistas de creciente importancia en organismos de cultivo

tales como A. purpuratus, a lo cual hay que agregar el incremento de la resistencia a

enfermedades por el uso indiscriminado de estos compuestos.

Por esta razón se considera pertinente las siguientes recomendaciones:

- Realizar estudios de identificación a nivel de género y morfología celular y presencia

o ausencia de flagelos, de las cepas aisladas con capacidad inhibitoria.

- Realizar pruebas de antibiosis utilizando la cepa seleccionada en este estudio, en

otros patógenos identificados en Argopecten purpuratus.

- Se hace necesario la realización de estudios adicionales para evaluar diferente

concentración/dosificación y determinar la que resulte más adecuada para mejorar la

condición fisiológica de los organismos en cultivo y su respuesta inmune ante agentes

patógenos y condiciones ambientales de estrés.

Bibliografía

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