UT 2 Tecnicas Microbiologicas Ba Sicas 09-10

UT 2. TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS BÁSICAS A) NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

Un laboratorio de Microbiología es un lugar convenientemente habilitado donde se pueden

manejar y examinar microorganismos. Este tipo de trabajo debe ser llevado a cabo con una buena

técnica aséptica, y por tanto se requiere un ambiente limpio y ordenado y trabajar siempre en

condiciones de esterilidad (en la proximidad de la llama de un mechero de alcohol o de gas).

Aunque los microorganismos que se manipulen no sean considerados patógenos, todos los

cultivos de todos los microorganismos deben ser manejados con precaución por su potencial

patogenicidad. Por lo que es necesario cumplir dos REQUISITOS BÁSICOS:

1. Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus recipientes y medios de

cultivo para evitar el riesgo de contaminarse uno mismo o a un compañero.

2. Evitar que los microorganismos ambientales (presentes en piel, pelo, aire, ropa, etc.)

contaminen nuestras muestras.

Para mantener estas condiciones, es necesario respetar una serie de NORMAS DE

SEGURIDAD:

1. Es imprescindible el uso de bata de laboratorio.

2. Al iniciar y finalizar las prácticas, el estudiante se lavará las manos con agua y jabón.

3. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada práctica , y al

terminar, es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes más habituales

para esto son la lejía y el alcohol (etanol 96°).

4. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama.

5. Durante las prácticas está prohibido comer, beber y fumar. Cuando se manipulan

microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc.

6. Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realización de la práctica

deben estar apartados del lugar de trabajo.

7. Todos los utensilios usados deben estar estériles antes de su utilización. Para reutilizar material en

el que existiera algún cultivo microbiano (tubos de ensayo) deberán introducirse en una bolsa de

esterilización y llevarse al autoclave antes de lavarlos, para evitar la contaminación del personal.

8. Para deshacerse del material contaminado se utilizarán los recipientes adecuados, que serán

esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada contaminado por la fregadera o a la

basura común.

9. Bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.

10. Antes de comenzar la práctica se debe comprobar que no falta ningún material, dado que ello

puede paralizar e invalidar el trabajo realizado.

11. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que pueden crear

corrientes que originen contaminaciones o producir accidentes.

12. No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores manuales.

13. En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.) se

comunicará inmediatamente al profesor.

14. Todo el material sucio que quede después de realizar la práctica se llevará al fregadero para su

limpieza. No dejar nada en las mesas de trabajo.

15. Terminada la práctica cada alumno deberá anotar lo realizado, desde la preparación del material

hasta los resultados obtenidos.

B) LIMPIEZA DEL MATERIAL CONTAMINADO

En Microbiología es importante recordar la necesidad de una pulcra y esmerada limpieza del

material. Asimismo, es muy importante la recuperación del material reciclable y la eliminación del

material desechable. Todos los objetos sucios o contaminados deben recogerse en recipientes

adecuados, provistos de tapa.

Como los objetos contaminados contienen, con frecuencia, cantidades importantes de materia

orgánica (procedente de los medios de cultivo) que protegen a los microorganismos de los agentes

físicos o químicos utilizados en la descontaminación de los mismos, no puede asegurarse la total

destrucción de las formas vegetativas y mucho menos de las esporas. Por ello, se recomienda utilizar

mayores concentraciones de desinfectante y tiempos más largos de tratamiento que para la

desinfección o la esterilización de material limpio.

En Microbiología se define esterilización como la destrucción o eliminación total de todos los

microorganismos vivos en un objeto o material, incluido las endosporas bacterianas. El material que

se va a esterilizar debe prepararse de tal manera que se conserve sin contaminar una vez esterilizado:

- El material de vidrio, como tubos, matraces, frascos, etc, se cierran con algodón graso o

tapones metálicos para evitar la entrada o salida de los microorganismos. Además, cuando se

usa algodón, ha de cubrirse éste con un papel impermeabilizado. Una vez preparadas, se

introducen en estuches o cajas metálicas, o bien se envuelven individualmente en papel

satinado para ser posteriormente esterilizadas. Todo el material de vidrio se esteriliza con

calor seco, generalmente en un horno Pasteur.

- El material de plástico desechable ya se suministra estéril y listo para su uso. Por ejemplo,

las placas de Petri se introducen en bolsas de plástico selladas y se esterilizan con óxido de

etileno o radiaciones.

- Las soluciones y medios de cultivo líquidos se envasan en matraces o tubos y se esterilizan,

generalmente, en autoclave. Existen varios métodos para llevar a cabo el proceso de

esterilización y la elección de uno determinado viene condicionado por el tipo de material que

se quiere esterilizar.

Material

Mechero Bunsen, horno Pasteur o estufa de aire caliente, autoclaves, equipos de filtración y

materiales a tratar.

Técnicas

El método más comúnmente empleado para destruir los microorganismos es el calor, entre otras

razones porque es el más económico y el más fácil de controlar. El calor utilizado con este fin puede

aplicarse en forma de calor seco o de calor húmedo.

El calor seco destruye los microorganismos por efectos de oxidación y se requieren

temperaturas muy elevadas. El calor húmedo elimina los microorganismos a temperaturas menores,

ya que la presencia de agua acelera la rotura de los puentes de hidrógeno responsables de la estructura

terciaria de las proteínas, haciendo que éstas se desnaturalicen y pierdan por tanto su funcionalidad.

• La esterilización por calor seco puede hacerse por flameado o mediante estufas de aire caliente.

I) Flameado: Se emplea para esterilizar asas e hilos de siembra, pinzas, espátulas, etc.

Consiste en someter directamente a la acción de la llama de un mechero Bunsen o un

mechero de alcohol los utensilios que se vayan a esterilizar. Este método es rápido y su

eficacia es altísima, sin embargo no se puede aplicar a objetos termolábiles (plásticos).

II) Esterilización por aire caliente: Se lleva a cabo en estufas de aire caliente y consiste en

colocar los objetos que se van a esterilizar, debidamente protegidos para que no se

contaminen una vez esterilizados, en el interior de una estufa. Este procedimiento se

utiliza para esterilizar material de vidrio (Pipetas, matraces, tubos) u otros materiales

SECO

HÚMEDO

•Flameado •Estufa

•Ebullición •Vapor fluente •Vapor saturado

MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN

FÍSICOS

QUÍMICOS

CALOR

IRRADIACIÓN

FILTRACIÓN

termorresistentes. Las temperaturas a las que se someten estos materiales son muy

elevadas (160-180ºC durante cerca de 2 horas).

Estas temperaturas no pueden utilizarse para esterilizar líquidos (como medios de

cultivo), ya que al llegar a los 100ºC comenzarían a hervir y continuarían hirviendo sin

elevar su temperatura por encima del punto de ebullición del agua a presión atmosférica.

A 100ºC las esporas bacterianas pueden sobrevivir durante horas, y además la

evaporación produciría cambios en la concentración de los componentes del medio.

• El calor húmedo también se utiliza para la destrucción de los microorganismos siendo, como ya

se ha comentado, a igual temperatura, mucho más eficaz que el calor seco; con este tratamiento

las enzimas se desnaturalizan rápidamente, al igual que las membranas celulares. Además, el

vapor de agua, especialmente si se genera a sobrepresión, es un eficaz transmisor de calor al

interior de la célula microbiana. Se puede aplicar utilizando varios métodos: Ebullición, vapor

fluente y vapor saturado a presión.

I) Ebullición: El agua hirviendo (100ºC) tiene acción limitada, ya que aplicada durante 10

minutos va a destruir las formas vegetativas de los microorganismos, pero las esporas

bacterianas pueden sobrevivir incluso a tratamientos prolongados. Se podría utilizar el

baño María o baño de agua hirviente (sólo con fines de desinfección en el laboratorio),

cuando no se necesita alcanzar la esterilidad o cuando no se dispone de otros métodos

mejores, tanto para material (pinzas, tijeras, escalpelos) como para medios de cultivo que

no puedan esterilizarse en autoclave.

II) Vapor fluente: Esta técnica se emplea con frecuencia para esterilizar medios de cultivo

que no se puedan someter a una temperatura superior a 100ºC sin que pierdan alguna de

sus propiedades, como leche, azúcares, suero, etc. Se utiliza un autoclave a presión

atmosférica, con la espita abierta, donde nunca se superan los 100ºC, y se realiza el

proceso durante tres días consecutivos, dejándose a temperatura ambiente en los

intervalos entre dos tratamientos. La muestra se somete a calentamiento (100ºC) durante

30-45 minutos destruyéndose en este proceso las formas vegetativas pero no las

endosporas termorresistentes. Si éstas se encuentran presentes en la muestra germinan

después del calentamiento y estas formas vegetativas serán destruidas en los siguientes

ciclos. Este método de esterilización se denomina también esterilización fraccionada o

tindalización.

III) Vapor saturado a presión: La esterilización por esta técnica utiliza vapor de agua

saturado que se somete a una atmósfera extra de presión sobre la presión atmosférica

normal, elevándose con ello el punto de ebullición del agua de 100ºC a 121ºC y

consiguiéndose la destrucción de todos los microorganismos (salvo los termófilos

extremos) en un tiempo de 15 a 20 minutos. Esta temperatura es también necesaria para la

destrucción de las endosporas bacterianas, que presentan una alta resistencia térmica. El

vapor de agua difunde por ósmosis a través de las membranas de las esporas, coagulando

su protoplasma, fenómeno que se acentúa si el vapor es saturado y a sobrepresión. Esta

técnica de esterilización requiere el uso del autoclave.

El autoclave permite elevar la presión una o dos atmósferas sobre la presión atmosférica,

elevándose con ello la temperatura de ebullición del agua que se encuentra en su interior. Consta de

un recipiente metálico, generalmente de acero inoxidable, similar a una gran olla, en cuyo interior se

introduce el material a esterilizar que se coloca sobre una rejilla o placa agujereada. Después de cerrar

cuidadosamente la tapa, se conecta la fuente de calor y comienza a elevarse la temperatura en su

interior. La salida continua del chorro de vapor a través de la válvula nos indica que el aire contenido

en el interior del autoclave ha sido eliminado. La eliminación de este aire es importante ya que la

difusión del calor entre el vapor de agua y el aire es pobre, por lo que no se alcanzará la temperatura

esperada a la presión elegida y no se conseguirá la esterilización. La válvula se cierra cuando sólo sale

vapor de agua y, a partir de ese momento, comienza a elevarse la presión hasta una atmósfera sobre la

presión normal, elevándose como consecuencia la temperatura hasta 121ºC. Transcurridos 15-20

minutos, en estas condiciones, el material se ha esterilizado.

Es el incremento de temperatura por encima de los 100ºC y no la presión la que destruye los

microorganismos. Si se esterilizan volúmenes grandes de líquidos, es necesario mantener el material

en el autoclave durante períodos de tiempo más prolongados, pues se tarda más en alcanzar los 121ºC

en el centro de un gran volumen. Una vez transcurrido el tiempo necesario, se apaga el autoclave y

se deja descender la temperatura hasta que el indicador marque menos de 80ºC, que será cuando la

presión haya descendido hasta presión atmosférica. Se abre ligeramente la espita para comprobar que

no queda vapor a presión en el interior y ya se puede proceder a retirar todo el material esterilizado,

dejándolo enfriar a temperatura ambiente. El autoclave se utiliza para esterilizar medios de cultivo,

instrumentos, ropas, soluciones, jeringas, etc que puedan soportar altas temperaturas y una atmósfera

de sobrepresión.

• Para la esterilización de materiales líquidos sensibles al calor, como algunos medios de cultivo,

soluciones de antibióticos, enzimas, vacunas, etc. o también para gases, se utiliza la filtración. En

la esterilización por calor se destruyen los microorganismos del medio, mientras que la filtración

los retira de una forma mecánica, en lugar de destruirlos.

La filtración es el paso de un líquido o gas a través de un material filtrante, con poros lo

suficientemente pequeños como para retener células microbianas. Tanto los filtros de membrana

como los equipos de filtración con los que éstos se usan deben ser esterilizados por otros

métodos, generalmente vapor saturado a presión en el autoclave.

Los virus y algunas bacterias de tamaño muy pequeño como, por ejemplo, los micoplasmas, no

son retenidos por los filtros habituales.

C) MEDIOS DE CULTIVO

NECESIDADES NUTRITIVAS DE LAS BACTERIAS.

Los microorganismos para desarrollarse necesitan cierta cantidad de sustancias alimenticias

que artificialmente se les suministran en lo que se llaman medios de cultivo.

La mayoría de las bacterias son cultivables en medios artificiales, siempre que el medio de

cultivo les proporcione todos los elementos necesarios para su crecimiento y su multiplicación. En

este sentido, las necesidades de las bacterias son extremadamente variables. En general, todas las

bacterias patógenas para el hombre necesitan compuestos orgánicos para desarrollarse.

Además de unas determinadas condiciones físico-químicas, las necesidades nutritivas de las

bacterias podemos clasificarlas en:

a) NECESIDADES ELEMENTALES.

Constituyen las materias primas de los medios de cultivo:

- C, N, H, O, son necesarios en cantidades relativamente importantes.

- S, P, en cantidades un poco inferiores.

- K, Ca, Mg, Fe, Mn, Zn, Co, Cu, Mo, son también necesarios en pequeña cantidad

como componentes de enzimas, proteínas, etc.

b) NECESIDADES ENERGÉTICAS.

Son indispensables para cubrir los gastos del metabolismo. Según la fuente de energía que

utilicen las bacterias, se dividen en:

1) FOTOTROFAS O FOTOSINTÉTICAS: Energía luminosa.

1.1 fotoautótrofas o fotolitótrofas: c. inorgánicos.

1.2 fotoheterótrofas o fotoorganotrofas: c. orgánicos.

2) QUIMIOTROFAS O QUIMIOSINTÉTICAS: Oxidación de compuestos.

2.1 quimioautótrofas o quimiolitotrofas: c. inorgánicos.

2.2 quimioheterótrofas o quimioorganotrofas: c. orgánicos.

En el último grupo se incluyen la mayoría de las bacterias, tanto saprófitas como patógenas.

c) NECESIDADES ESPECÍFICAS DE CRECIMIENTO.

Teniendo en cuenta las necesidades elementales y energéticas se pueden preparar medios en

los cuales todas las bacterias no son capaces de crecer. Hace falta suministrarle un cierto número de

compuestos bien definidos, que no son sintetizados por las bacterias, y que son necesarios para su

desarrollo. Estos son los llamados FACTORES DE CRECIMIENTO, y que pueden ser: determinados

aminoácidos, bases púricas, pirimidínicas, vitaminas, determinados azúcares, los cuales dependen de

las necesidades de cada bacteria.

NECESIDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LAS BACTERIAS.

• Hidratación: Es esencial.

• Temperatura: Cada especie microbiana posee una temperatura óptima de crecimiento

clasificándose según esto en los siguientes grupos:

I.- Psicrófilas: capaces de desarrollarse a 0° C o menos. Su temperatura óptima aprox 15° C.

II.- Mesófilas: crecen mejor entre 25 y 40° C.

III.- Termófilas: crecen mejor entre 45 y 60° C.

• Presión osmótica: No muy alta. Aunque las bacterias toleran bien los cambios de presión

osmótica, los medios de cultivo se preparan en condiciones de isotonía. La mayoría de las

bacterias no toleran concentraciones salinas muy elevadas.

• pH: Es de gran importancia. Ha de estar cercano a la neutralidad: 7-7,6.

• tiempo de incubación necesario para que el germen adquiera vitalidad y se desarrolle.

Generalmente es de 24 a 48 horas.

• Concentración de oxígeno: Depende del tipo de bacterias:

o Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de oxígeno libre. Para desarrollar

bacterias aerobias se incuban los medios de cultivo en agitación constante o introduciendo

aire estéril en el medio.

o Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de oxígeno libre. Los anaerobios

estrictos son muy sensibles al O2 por lo que se debe evitar la exposición de estos

microorganismos al O2. Se puede obtener un ambiente de anaerobiosis por los siguientes

métodos:

A.- Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, como es el tioglicolato

sódico, para disminuir el contenido de O2.

B.- Quitando el O2 por procedimientos mecánicos y reemplazándolo por N2 o CO2.

C.- Mediante reacciones químicas dentro del recipiente que contiene el medio de

cultivo inoculado para combinar el oxígeno libre con otro compuesto. Por ejemplo: al

encender una vela se transforma el oxígeno en dióxido de carbono.

o Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia como en ausencia de

oxígeno libre.

o Microaerófilas: bacterias que crecen en presencia de pequeñas cantidades de oxígeno libre.

MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo es un compuesto constituido por elementos nutritivos y de soporte, capaz

de crear un ambiente adecuado para el crecimiento de microorganismos, con objeto de aislar las

diferentes especies bacterianas, proceder a su identificación y llevar a cabo una serie de estudios

complementarios.

CUALIDADES EXIGIBLES A UN MEDIO DE CULTIVO

1- COMPOSICIÓN: los medios de cultivo deben contener cualitativa y cuantitativamente las

sustancias exigidas para la supervivencia y crecimiento de los microorganismos. Básicamente pueden

contener:

o alimentos esenciales o nutrientes: son imprescindibles C, O, N, e H, en menores cantidades S

y P, y otros minerales como Mg, Ca, Fe, K etc.

o factores de crecimiento: son metabolitos que las bacterias no pueden sintetizar: aminoácidos,

vitaminas, azucares, etc.

o factores estimulantes: su presencia acelera el ritmo de la multiplicación bacteriana, o permite

la adaptación a un medio artificial de una bacteria aislada en un medio natural.

2- pH: en general las bacterias solo se desarrollan a un pH casi neutro (7-7,6). Existen sustancias

buffer o tampón para mantener un pH estable. Algunas bacterias exigen o soportan un pH particular

que se emplea para su aislamiento o su identificación.

3- HUMEDAD: se requiere una cantidad suficiente necesaria para el metabolismo bacteriano.

4- ESTERILIDAD: no es imprescindible para que el microorganismo crezca, pero si es necesaria esta

condición a la hora de llevar a cabo cualquier investigación bacteriana. Puede hacerse en:

- Autoclave: 110-120ºC, para la mayoría.

- Tyndalización o esterilización fraccionada: Varios calentamientos a 100ºC/3 días sucesivos.

Se deben de tener en cuenta, pero no son imprescindibles:

1- AUSENCIA DE SUSTANCIAS INHIBIDORAS las cuales inhiban parcial o completamente la

vitalidad y multiplicación de los gérmenes que queremos estudiar. Ej: colorantes (verde brillante),

metales pesados (bismuto).

2- PRESENCIA DE SUSTANCIAS FACILITADORAS: que favorezcan el desarrollo de los

microorganismos. Ej: sangre, vitaminas, factores de coagulación, etc.

3- ISOTENIA: es la concentración de ClNa, que en la mayor parte de los medios corresponde a un

8,5%.

PRINCIPALES TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO. CLASIFICACIÓN:

Los medios de cultivo utilizados en Bacteriología son numerosísimos y pueden clasificarse

según distintos criterios, pero todos ellos compatibles.

a) POR SU COMPOSICIÓN:

- Medios simples (agua, ClNa, peptona).

- Medios complejos o enriquecidos (aa.,vitaminas, proteínas).

b) POR SU CONSISTENCIA:

- Líquidos: se denominan caldos, y no poseen sustancias gelificantes.

- Sólidos: la sustancia gelificante es agar. El contenido de agar > 1%.

- Semisólidos: " " " agar. El contenido de agar < 1%.

c) POR SU UTILIZACIÓN:

- Medios generales o nutritivos.- Es aquel que soporta el crecimiento de una amplia

variedad de microorganismos sin exigencias nutritivas especiales.

- Medios de mantenimiento y conservación.

- Medios de enriquecimiento.- Aquel que favorece más el crecimiento de un determinado

tipo de bacterias por encima de otros también presentes en el inoculo.

- Medios de aislamiento

- Medios Selectivos.- Aquel que sólo permite el crecimiento de un biotipo entre los que se

presentan en el inóculo.

- Medios diferenciales o Medios de identificación.- Aquel que permite la distinción entre

biotipos próximos y relativamente parecidos.

- Medios de transporte.

MEDIOS GENERALES O NUTRITIVOS.

Tienen gran cantidad de nutrientes, favoreciendo el crecimiento de gran cantidad de

microorganismos (tanto Gram + como -).

Por ej.: CALDO NUTRITIVO (líquido)

AGAR NUTRITIVO (sólido)

Dentro de los medios generales, están los ENRIQUECIDOS con alguna sustancia (sangre =

agar sangre).

MEDIOS DE MANTENIMIENTO Y CONSERVACIÓN.

Son los medios utilizados cuando se quiere conservar una colonia durante un espacio mayor de

tiempo.

Los medios se envasan en tubos, que tienen menos superficie que las placas y evitan en parte la

desecación del medio. Los gérmenes son sembrados en profundidad, lejos del oxígeno ambiental, en

medio sólido, que evite la difusión de metabolitos tóxicos, y colocados los tubos en la nevera, a

temperaturas bajas para evitar al máximo su crecimiento y desarrollo.

Por ej.: AGAR NUTRITIVO.

MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO.

Son medios líquidos empleados para favorecer el crecimiento y desarrollo de una determinada

especie bacteriana. Se utilizan cuando la bacteria que se quiere investigar se encuentra en pequeño

número en comparación con la carga bacteriana de la muestra. Se utilizan como medios de

revitalización, y de ahí se pasa ya a los medios de aislamiento. Por ej.:

AGUA DE PEPTONA (Enriquecimiento gral).

CALDO SELENITO (Salmonella).

CALDO LACTOSADO (coliformes).

MÜLLER-KAUFFMANN (Salmonella).

EE DE MOSSEL (Enterobacterias).

GIOLITTI CANTONI (Estafilococos).

ROTHE (Estreptococos).

MEDIOS DE AISLAMIENTO.

Se emplean para el aislamiento de bacterias. Son medios sólidos. Pueden ser de aislamiento

general o selectivo de un microorganismo o grupo de microorganismos determinados.

En los medios selectivos se incorporan sustancias inhibidoras del desarrollo de un grupo de

bacterias, pero permiten en cambio, el crecimiento de otras.

Medios de aislamiento general.- Se utilizan para recuento bacteriano. Por ej.:

PLATE COUNT AGAR

AGAR NUTRITIVO

Medios de aislamiento selectivo.- Por ej.:

SS (Salmonella-Shigella).

XLD (xilosa-lisina-descarboxilasa)(Shigella).

HEKTOEN (Shigella).

AGAR VERDE BRILLANTE (Salmonella).

MAC CONKEY ( Enterobacterias).

LEVINE (Escherichia coli).

BAIRD-PARKER (Estafilococos).

SABOURAUD (Hongos y levaduras).

SPS (Clostridium).

MEDIOS DE DIFERENCIACIÓN E IDENTIFICACIÓN.

Los medios de identificación son de varios tipos, y comprenden medios líquidos, sólidos y

semisólidos. Se caracterizan por poseer en su composición alguna/s sustancia/s (indicadores de pH,

fuentes nutritivas, etc) que ponen de manifiesto los caracteres bioquímicos o enzimáticos de las

bacterias, y así poderlas identificar o diferenciar. Por ej.:

CALDO LACTOSADO (Dif. de Coliformes).

CALDO EVA o LITSKY (Dif. de Enterococos).

KLIGLER (Ident. de Entrobacterias: Coliformes).

CITRATO DE SIMMONS (Ident. de Enterobacterias).

DNasa (Ident. de Estafilococos).

VRBG - VRBA (Dif. de Enterobacterias).

MEDIOS DE TRANSPORTE

Su finalidad es el transporte de las bacterias sin multiplicarse, pues no tienen nutrientes, y los

otros componentes favorecen la estabilización del pH. Por ej: COREY-BLAIR AMIES

STUART

MEDIOS DE CULTIVO MÁS IMPORTANTES

1.- AGAR NUTRITIVO: es un medio para fines generales:

- cultivar la mayoría de microorganismos poco exigentes.

- efectuar recuentos de colonias.

- transporte de cepas.

- aislar microorganismos en cultivos puros.

2.- AGAR SANGRE: es un medio general enriquecido, generalmente con sangre de carnero

desfibrinada. En su preparación la sangre se debe introducir tras la esterilización del medio y una vez

enfriado, pero antes de que solidifique, para evitar que la sangre se hemolice.

Es de gran utilidad para la detección de estreptococos, gracias a la aparición de hemólisis

alrededor de las colonias.

3.- AGAR CHOCOLATE: es un medio general enriquecido.

Su composición es similar a la anterior, salvo que la sangre se añade al medio antes de

esterilizarlo, produciéndose hemólisis. Es de gran utilidad para detectar cocos Gram - y Haemofilus.

4.- AGAR MAC-CONKEY: es un medio de cultivo diferencial:

- fomenta el desarrollo de las enterobacterias (Gram -).

- Inhibe el desarrollo de bacterias Gram + gracias a la presencia de sales biliares.

Según las bacterias sean capaces de fermentar la lactosa, las colonias adquirirán una coloración

rojo-rosado o colonias blancas, transparentes o negras si no son fermentadas.

Es muy importante que la superficie del medio esté completamente seca cuando se inocule.

5.- CALDO DE SELENITO: es un medio líquido de enriquecimiento.

Se utiliza para el cultivo de salmonella en muestras de heces, orina y aguas cloacales.

Normalmente tras la incubación durante unas horas en este medio se pasa a una placa SS.

6.- AGAR SALMONELLA-SHIGELA o SS: es un medio altamente selectivo, especialmente

adaptado para el aislamiento de salmonella o shigela, las cuales forman colonias opacas o traslucidas

incoloras que generalmente son lisas.

Inhiben la formación de colonias de tipo contaminante, pero no las destruye. Se recomienda

utilizar paralelamente enriquecimiento en selenito.

7.- MEDIO DE CHAPMAN: es un medio de aislamiento específico de Estafilococos patógenos. Se

recomienda la incubación durante 36 horas a 37ºC.

- Los estafilococos patógenos producen colonias con zonas amarillas.

- Los no patógenos producen colonias pequeñas con zonas rojas o púrpura a su alrededor.

8.- MEDIO DE MULLER HINTON: se utiliza para determinar la susceptibilidad de los

microorganismos (antibiograma), debido a sus posibilidades de reproducción.

Se recomienda la adición del 5% de sangre para comprobar la sensibilidad de organismos

exigentes que necesitan enriquecimiento o para la determinación de reacciones hemolíticas.

9.- MEDIO DE KLIGER: se utiliza para la identificación de enterobacterias: E. Coli, Salmonella,

Shigela.

Este medio de cultivo siempre se coloca en tubo en pico de flauta o agar inclinado y la siembra

se realiza en picadura en la parte profunda y en estría en la superficie.

En este medio se valoran 4 características de los microorganismos:

- utilización de la glucosa.

- " " " lactosa

- producción de gas

- " de ácido sulfídrico (SH2).

Según los cambios de color y la aparición de burbujas o gas podremos identificar las enterobacterias.

PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

La preparación de los medios bacteriológicos ha sufrido un cambio espectacular debido a la

disponibilidad de medios comerciales deshidratados a punto para su utilización, con lo que se ahorra

tiempo y se disminuye la posibilidad de errores durante su preparación.

Aún así, existen algunos factores que pueden alterar la calidad del medio de cultivo:

• pesada incorrecta.

• uso de medios alterados por la exposición al calor y a la humedad.

• incorrecta medida del agua.

• uso del agua del grifo, etc.

El aspecto y la calidad del medio preparado depende con mucha frecuencia de la forma de

rehidratarlo y almacenarlo. Por ello es muy importante su correcta elaboración.

FUNDAMENTO: crear un ambiente adecuado para el crecimiento del microorganismo.

MATERIAL:

- matraces erlenmeyer

- vasos de precipitado

- mechero

- autoclave

- balanza

- pHmetro (opcional)

- placas de petri

- tubos

- algodón graso

- papel de aluminio o parafina

- pipetas, medidores o dosificadores

automáticos.

REACTIVOS:

- ingredientes para medios de cultivo o medios de cultivo deshidratados

- agua destilada o desionizada

- NaOH y ClH para ajustar el pH (si el medio es deshidratado no es necesario)

PREPARACIÓN.

Los medios que más se utilizan actualmente son los medios deshidratados. En la etiqueta de

todos los frascos se incluyen las instrucciones para reconstituir los medios deshidratados.

Para una buena preparación de los medios de cultivo es fundamental el empleo de instrumental

de vidrio y equipo limpio, exentos de sustancias detergentes.

La homogeneidad de la suspención debe ser total y la exposición al calor, si es precisa, será

mínima.

- PESADA: Tras calcular la cantidad de medio reconstituido que se va a utilizar, según la etiqueta

del mismo, determinaremos la cantidad necesaria de medio deshidratado. Pesar y reservar.

- HIDRATACIÓN: añadirle la cantidad adecuada de agua destilada o desionizada.

- Para la preparación del medio, se debe utilizar un matraz Erlenmeyer lo suficientemente

grande (2-3 veces el volumen total a preparar) para que se pueda remover bien con el fin de

disolver el medio.

- se calienta previamente el agua. (50-65ºC) (1/2 o 2/3 del agua necesario)

- se añaden los ingredientes o el medio preparado.

- se agita para homogeneizar la disolución, manteniendo la exposición al calor.

- La aplicación del calor debe ser directa y suave, con agitación constante

- Si el medio no contiene agar (líquido), se suelen disolver bien en agua precalentada,

no siendo necesario calentar después, aunque necesitan de una agitación vigorosa.

- Todos los medios que contienen agar (sólidos y semisólidos), requieren calor hasta

100ºC aprox., para que éste pueda fundirse. Es muy conveniente que antes de iniciar

el calentamiento se deje reposar el agar en el agua precalentada durante 5-10 minutos.

Una práctica aconsejable es retirar el medio del fuego cuando ha empezado a hervir y

volverlo a calentar hasta hierva de nuevo (2 o 3 veces) con agitación constante.

- Este calentamiento no debe hacerse nunca con una llama directa, para evitar quemar

el medio, y además se agita a intervalos frecuentes, por el mismo motivo, hasta que el

agar se haya fundido (que no se vean copos en las paredes del matraz).

- Hay que vigilar con frecuencia durante el calentamiento, porque el medio puede

hervir repentinamente y salirse del recipiente.

- Con el resto del agua se lavan las paredes del recipiente y se continua agitando y

calentando si es preciso

- ENFRIAR o ATEMPERAR

- AJUSTAR EL PH: es imprescindible cuando se parte de los ingredientes por separado. En

los medios deshidratados, excepto en circunstancias especiales, no es necesario ajustar el

pH. Si fuese necesario, se haría con Carbonato sódico 1N, Ácido fosfórico 0,01% NaOH o

ClH. El pH se comprobará con el phmetro o papel indicador.

Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas

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DISTRIBUCIÓN.

Depende del tipo de medio y de su finalidad. Si es posible, la distribución se hará en los

recipientes definitivos para realizar los cultivos; en su defecto en otros que permitan un buen

proceso de esterilización.

• Medios en tubo: Con una pipeta de boca ancha o dosificador se deposita en cada tubo la

cantidad de medio correspondiente (de 10 a 20 ml según la capacidad del tubo). Se tapa con

una torunda de algodón graso que se cubre, a su vez, con papel de aluminio, de filtro o

parafina, y se lleva a esterilizar. También se pueden usar tubos con tapones de rosca.

Para detectar la producción de gas de las bacterias, se puede colocar en el interior del tubo

el llamado tubo o campana de Durham.

• Medios en placa: el medio de cultivo estará en un matraz erlenmeyer (no ocupará mas de

2/3 de la capacidad del matraz, pues la ebullición en el autoclave, puede hacer que rebose).

Antes de esterilizarlo se tapa de igual forma que los tubos. Tras la esterilización y

ligeramente frío, se pasará a las placas.

ESTERILIZACIÓN

Generalmente se lleva a cabo en la autoclave:

- volúmenes de hasta 250 ml durante 15' a 1,2 atm (121ºC).

- volúmenes superiores a 250 ml se debe prolongar el tiempo de esterilización en

unos minutos.

Tener en cuenta no cargar demasiado el autoclave, para que pueda fluir libremente el

vapor.

Algunos medios de cultivo con ingredientes termolábiles se esterilizan por vapor fluente

o tindalización.

VERTIDO EN PLACAS

Tras la esterilización del medio se homogeneiza, moviéndolo en sentido rotatorio.

El vertido de las placas se debe realizar cuando el medio se encuentre en una temperatura

próxima a la gelificación (45 - 55 ºC) (se puede mantener la mano sobre el recipiente).

Para el llenado, se utilizarán pipetas estériles o un dosificador, o vertiendo directamente el

medio en la placa. Durante este procedimiento, extremar la técnica para mantener la esterilidad

del medio y de la placa, para ello:

- trabajar cerca del radio aséptico de acción de la llama del mechero (10 - 15 cm).

- tras quitar el algodón graso que tapa el matraz, pasar la boquilla de éste por la

llama.

- no abrir totalmente la placa de petri, solo lo imprescindible.

- sería ideal usar mascarilla.


16

ENFRIAMIENTO

- Medios líquidos: tal y como se extraen del autoclave se dejan enfriar a temperatura

ambiente.

- Medios sólidos:

* Tubos: se dejan solidificar a temperatura ambiente en :

- posición vertical: agar horizontal

- posición inclinada: agar inclinado o en flauta o en bisel.

* Placas: asegurarse de que no hay burbujas mediante movimientos rotatorios

de la placa. Solidificará en una superficie horizontal.

Cuando estén a una tª inferior a 45ºC colocar las placas invertidas, para evitar

que las gotas de humedad por condensación caigan sobre el medio,

favoreciendo su contaminación.


17

CONSERVACIÓN Y CONDICIONES DE USO DE INGREDIENTES Y MEDIO

- Ingredientes o medios de cultivo deshidratados:

* recipientes cerrados, protegidos de la luz y humedad.

* deben desecharse si apelotonan.

* algunos deben guardarse en la nevera.

* control de la fecha de caducidad.

- Medios hidratados y esterilizados:

* tiempo limitado de conservación: en nevera a 4ºC, de 4 a 6 semanas

a tª ambiente, de 1 a 2 semanas.

* no mantenerlos a tª inferior a 0ªC, ya que altera la estructura del gel.

* protegerlos de la luz.

* tubos o recipientes herméticos (mejor tapón de rosca que torundas de algodón).

* si no se va a usar inmediatamente, dejar el medio destinado a distribuir en placas, en

el recipiente inicial. Se aconseja refundir al baño maría o en autoclave a vapor fluente

durante 30', nunca aplicar calor directo.

* si el medio se coloca en las placas tener en cuenta:

- refrigeración inmediata, con precinto adhesivo en la placa.

- colocar boca a bajo (las gotas de condensación lo contaminan).

* si los medios están refrigerados, cuando se vayan a emplear, atemperarlos

previamente (en estufa o a tª ambiente), ya que la condensación de humedad

ambiental retrasa el crecimiento bacteriano.

CAUSAS DE ERROR EN LA PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

En la preparación de medios de cultivo bacteriano a partir de materiales deshidratados,

participan una serie de variables. Si no se controlan rígidamente, es probable, que el producto

final no de resultados satisfactorios. Algunos de los casos son:

- Pesada incorrecta del material seco por error humano o defectos en la balanza.

- Utilización del material seco obtenido de botes abiertos previamente, y que pueden

estar deteriorados por exposición a la humedad, calor, oxidación, etc.

- Medición incorrecta del agua o utilización de agua no destilada o desionizada.

- Empleo de recipientes no adecuados: metálicos no inoxidables, sucios, etc.

- Disolución incompleta, con lo que el medio será de consistencia no homogénea y

que por unas partes esté mas rígido que por otras.

- Calentamiento excesivo durante la esterilización y preparación, o por haberse

mantenido demasiado tiempo en estado de fusión, con lo que puede deshidratarse el

medio, disminuir el pH, formar precipitados, etc.


18

- Determinación incorrecta del pH, con lo que se produce la adición incorrecta de

ácido o base. Este error se puede producir por hacer la determinación del pH con el

medio de cultivo muy caliente.

- Adición de sustancias enriquecedoras (sangre) en condiciones incorrectas

(contaminada).

- Fallos derivados de un deficiente control de calidad del laboratorio.

ELIMINACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Cualquier medio de cultivo, sobre todo si se ha sembrado, es un posible foco de

contaminación por lo que se debe descontaminar tras su utilización.

Se puede realizar mediante:

- Inundación con una solución desinfectante: dejarlo actuar como mínimo durante 6

horas (se recomienda de 12 a 24 horas).

- Esterilización en autoclave.

- Incineración: se utiliza para microorganismos muy patógenos.

D) PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Debido a la carga microbiana que generalmente tienen los alimentos, es necesario hacer

diluciones de la muestra con objeto de poder obtener, en los medios de cultivo, colonias

perfectamente diferenciadas; de esta forma, podemos estudiarlas, contarlas y llegar al

aislamiento e identificación de los gérmenes existentes.

1. Tomar la muestra en condiciones asépticas. Para ello se pueden emplear cubiertos y botes

previamente esterilizados. Si transcurre un tiempo entre la toma de muestra y el análisis, se

mantendrá la muestra en refrigeración.

2. Homogeneización del alimento. Emplearemos un homogeneizador comercial de paletas

para que la distribución de los microorganismos en el medio sea homogénea (Stomacher).

Se pesan 10g del alimento en una bolsa de plástico estéril (especial para el homogeneizador)

y se añaden 90 ml de caldo de peptona estéril (= 25 g muestra + 225 ml diluyente). El

triturado de la muestra se realiza al menos durante 2 minutos, aunque el tiempo depende de

la consistencia del alimento.

3. Realizar una serie de diluciones decimales seriadas:

a) Mezclar bien el total de la muestra. Tener en cuenta que al añadir 90 ml de caldo de

peptona a los 10 g de muestra, se está realizando la primera dilución decimal (los

10g de la muestra van a implicar aproximadamente 10 ml de volumen). dilución

1/10

b) Preparar varios tubos con 9 ml de diluyente estéril (caldo de peptona)


19

c) Tomar 1 ml de muestra con una pipeta esteril y añadirlo al primer tubo dilución

1/100

d) Con otra pipeta estéril se toma 1 ml de la dilución anterior y se añade al 2º tubo

1/1000

e) Repetir el procedimiento hasta obtener la dilución deseada: 1/10000, 1/100000,

1/1000000.


20

E) TÉCN DE INOCULACIÓN-AISLAMIENTO

TÉCNICAS DE SIEMBRA

Siembra es la operación mediante la cual un microorganismo se deposita en un medio de

cultivo para su crecimiento.

Los objetivos de la siembra pueden ser:

- aislamiento de microorganismos.

- recuento.

- obtención de masa microbiana.

- identificación.

- mantener la viabilidad y vitabilidad de los microorganismos (resiembra).

Dependiendo de los objetivos se utilizarán distintas técnicas o métodos de siembra.

MANIPULACIÓN DE LAS MUESTRAS Y MATERIAL DE MICROBIOLOGÍA

En todas las técnicas de siembra se debe realizar una correcta manipulación, tanto de las

muestras como del material, para evitar la contaminación del cultivo por otros

microorganismos.

Se seguirán las siguientes normas:

- Trabajar en el radio de la llama del mechero (10 - 15 cm).

- Todo el material será estéril.

- El asa se flameará perpendicularmente a la llama del mechero, hasta el rojo vivo en

toda su longitud.

- Antes de usarla debe enfriarse, pues esterilizaría la muestra recogida.

- En las pipetas se flameará la punta y siempre estará dirigida hacia abajo.

- Los recipientes siempre estarán tapados; al abrirlos se hará oblicuamente dirigiendo

su apertura hacia la llama y flameando la boca al quitar y poner el tapón.

- Las placas de petri se manipularán semiabiertas y la abertura siempre orientada

hacia la llama. Otra forma sería mantener la placa orientada oblicuamente hacia la

llama y la tapa sobre la mesa orientada hacia abajo.

- Al sembrar tener cuidado, pues el agar se puede romper fácilmente.


21

PREPARACIÓN DEL INÓCULO (Sustancia que se inocula)

Cuando las muestras son muy viscosas o concentradas, y para técnicas en las que se

pretende el aislamiento, es necesario preparar el inóculo de siembra para obtener resultados

fiables.

Se obtiene a partir de un cultivo joven y puro o de un producto patológico.

Se toma con un asa estéril varias colonias de un cultivo o una porción de la muestra

biológica y se suspende en unos 5 ml de solución diluyente, tras lo cual se homogeneiza.

Como solución diluyente se puede usar:

- caldo de cultivo

- solución salina estéril

- agua destilada estéril.

MÉTODOS DE SIEMBRA

Siembra en estría o zig-zag

Siembra en estría múltiple

Técnica de los cuatro cuadrantes Por agotamiento

Técnica de los tres giros

Método A

Método B: inoculación previa vertido en placa

Aislamiento

Por dilución

Dilución en masa

Inoculación previo vertido en placa Técnica de Barry

Técnica de Kirby-Bauer

Técnica de inundación En placa Inoculación sobre la superficie del medio solidificado

Técnica de estría

Recuento o

siembras

cuantitativas

En tubo Métodos indirectos Medida de turbidez

Siembra por estría en superficie inclinada

Siembra en picadura Otras técnicas

de siembra En tubo

Siembra en medio líquido


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TÉCNICAS DE AISLAMIENTO

Se realizan en placas y su finalidad es la obtención de cepas puras.

Para poder llegar a la identificación de una bacteria es preciso separarla de otras que

puedan coexistir con ellas, para lo cual se realizan siembras de aislamiento, es decir, depositar el

inóculo o muestra en un medio apropiado para su desarrollo.

Al sembrar una bacteria en un medio sólido aparecen colonias admitiéndose que cada

colonia proviene de una sola bacteria. De este modo, una colonia puede ser resembrada en otro

medio, obteniéndose un cultivo puro, siendo muy importante que la muestra llegue sin

contaminación al medio.

1.- AISLAMIENTO POR AGOTAMIENTO

1.a.- Siembra en estria o en zig – zag

- Se deposita el inóculo en el extremo superior de la

placa.

- Se siembra con el asa, a partir del inóculo, con un

movimiento de zig - zag cada vez mas amplio (en la

línea media de la placa alcanza su máxima longitud).

Para ello el asa debe contactar suavemente con la

superficie del medio, no debiendo realizarse una

presión excesiva, pues se agrietaría.

- La siembra se efectúa (sin levantar el asa ni flamearla) hasta la zona distal del

comienzo, donde se obtendrán colonias aisladas.

1.b.- Siembra en estría múltiple

- Se deposita el inóculo en el extremo superior de la placa.

- Con el asa se reparte en varios tramos, siguiendo el borde de la placa. Entre cada tramo

se debe flamear el asa.

- Los segmentos seguidos describen un poliedro regular; el último tramo se efectúa hacía

el interior en el que se obtendrán las colonias aisladas.


23

1.c.- Técnica de los cuatro cuadrantes

- Se divide la placa en cuatro cuadrantes.

- Se deposita el inóculo en el extremo superior de uno

de los cuadrantes y se siembra en estría. (Este

cuadrante se corresponderá con el nº 1).

- Sin flamear el asa, se realiza la misma operación

sucesivamente en los otros 3 cuadrantes. - En cada

uno de ellos se sembrará el inóculo que queda

adherido al asa tras la siembra del anterior.

- En el último de los cuadrantes se encontrarán las colonias aisladas.

1.d.- Técnica de los tres giros

- Se siembra en estría la mitad de la placa.

- Flamear el asa.

- Se gira la placa 90º y se siembra en estría la mitad superior de la misma.

- Se repite las operaciones anteriores (siembra, flameo y giro).

- Las colonias aisladas aparecerán en la zona sembrada en último lugar.


24

2. AISLAMIENTO POR DILUCIÓN

Esta técnica se puede utilizar tanto para recuentos como para aislamiento de colonias. El

material que contiene las bacterias se diluye seriadamente. Se pueden utilizar varios métodos:

2.a.- Método A:

- En varios tubos disponemos de 9 ml de

caldo nutritivo o agua bidestilada estéril.

- Se toma 1 ml de la muestra, que se diluirá en

el primer tubo, obteniéndose la dilución 1/10

- Tras homogeneizar el tubo anterior, se

tomará 1 ml, que se deposita en el 2º tubo,

obteniéndose la dilución 1/100.

- Este proceso se realizará tantas veces se

desee, obteniéndose diluciones 1/1.000,

1/10.000.

- De cada dilución cogemos con pipetas estériles y distintas 0,1 ml, sembrándolo sobre

las placas con agar, por la técnica de inundación.

- En la última placa obtenemos colonias aisladas.

2.b.- Método B: Inoculación previa al vertido en placa

- Disponer tres tubos de medio de cultivo fundido a 45 - 50ºC, previamente marcados con

los numeros 1, 2 y 3.

- Tomar con el asa o con una pipeta, previamente esterilizadas, la muestra y sembrar en el

tubo nº 1.

- Homogeneizar por rotación entre las palmas de las manos y tomar un asa del mismo

resembrándolo al tubo nº 2. Dejar el primer tubo en el baño a 45ºC.

- Homogeneizar el tubo 2, tomar un asa y pasarla al 3. Dejar los dos tubos en el baño.

- Verter el contenido de cada uno de los tubos, homogeneizados de nuevo, en tres placas

estériles marcadas con los números 1, 2 y 3. Esperar a que solidifique el medio.

- En la placa 3 se obtendrán colonias aisladas.

- Si se utiliza para recuento, debemos saber el calibre del asa.


25

Técnica de dilución en masa

- En una placa de Petri vacía se deposita un pequeño volumen conocido de muestra y a

continuación se añade el medio de cultivo (agar nutritivo) fundido y atemperado

aproximadamente a 45ºC. Se mezclan ambos por rotación suave de la placa. De esta forma

los microorganismos se distribuirán de forma homogénea en el medio de cultivo,

permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.

- Otra variación de esta técnica consiste en inocular el medio de cultivo, fundido y

atemperado, contenido en un tubo, con un determinado volumen de la muestra. La

homogeneización de la muestra y el medio de cultivo se realiza por rotación del tubo entre

las manos, antes de verterlo sobre la placa.

- En ambos casos, tras la homogeneización, se dejan enfriar las placas hasta que se solidifique

el medio y posteriormente se incuban a la temperatura adecuada (siempre en posición

invertida).

- Aunque con esta técnica se obtienen colonias aisladas, generalmente sólo se utiliza para

determinar el número de microorganismos viables en una muestra, cuando éstos son

anaerobios facultativos o microaerófilos.


26

TÉCNICAS DE RECUENTO O SIEMBRAS CUANTITATIVAS

En este tipo de siembra nos interesa disponer del microorganismo uniformemente

distribuido en el medio. Este procedimiento es útil para el recuento de microorganismos. Se

utiliza para muestras de orina, cepillados alveolares, telescopaje, recuento de microorganismos

en alimentos, etc.

Se utiliza también para estudios de sensibilización a antibióticos.

1- RECUENTO EN PLACA

1.a.- inoculación previa al vertido en placa: TÉCNICA DE BARRY

- Se toman 0,1 ml del inóculo en un tubo y se añaden 25 ml del medio de cultivo

fundido (temperatura no superior a 45 - 55ºC, para no esterilizar el inóculo).

- Homogeneizar por rotación entre las palmas de las manos.

- Verter en la placa de petri.

1.b.- inoculación sobre la superficie del medio Solidificado:

TÉCNICA DE KIRBY-BAUER:

- Preparado el inóculo en un medio estéril, se introduce un hisopo o escobillón estéril

hasta que quede impregnado.

- Se elimina el exceso del inóculo presionando el hisopo, con un movimiento de rotación,

contra la pared del tubo.

- Se siembra la placa empleando la técnica de los 3 giros, pero pasando 2 o 3 veces el

hisopo por toda la superficie antes de efectuar cada giro, para distribuir uniformemente

el inóculo.

- Se deja secar la placa durante 4 o 5 minutos en posición semiabierta e invertida,

quedando lista para ser cultivada.

- se emplea para estudios de sensibilidad o inoculación directa del producto patológico.

dibujo


27

TÉCNICA DE INUNDACIÓN:

- Se añade a la placa 0,5 ml del inóculo, inundando el medio con un movimiento de

rotación, para distribuirlo por toda la superficie de la placa.

- Antes de incubar, dejar secar 10 - 15 minutos a temperatura ambiente (la placa debe

estar tapada).

TÉCNICA DE ESTRÍA:

- Flamear el asa.

- Se deposita una gota de inóculo o muestra en el centro de la placa, extendíendola

hacía la derecha e izquierda.

- Diseminar el inóculo en ángulo recto con respecto a la estría primaria, comenzando

del centro hacía arriba.

- se gira la placa 180º y se termina de diseminar la muestra en la otra mitad (del centro

hacía arriba).

Este último método es el mas utilizado, sobre todo en orinas.

dibujo

2- EN TUBO: MÉTODOS INDIRECTOS.

Existen métodos indirectos para el recuento de colonias, que si bien no miden

directamente el tamaño de una población, permiten obtenerlo por otra medida.

Entre ellos el más utilizado es:

MEDIDA DE TURBIDEZ: las partículas en suspensión, al ser atravesadas por un rayo

de luz de una determinada longitud de onda, hacen que ese rayo sufra una difracción. Cuantos

más microorganismos se desarrollen, mayor turbidez tendrá la suspensión y será la difracción.


28

C.- OTRAS TÉCNICAS DE SIEMBRA

SIEMBRA EN TUBO

1.a.- Siembra por estría en superficie inclinada

• Se toma la muestra con el asa y se introduce en

el tubo que contiene el medio.

• Deslizar el asa con movimientos de zig - zag

desde el fondo de la superficie y en progresión

ascendente.

• Se suele usar para obtener masa de

microorganismos, renovar cepas (resiembra) y

pruebas bioquímicas.

1.b.- Siembra en picadura

• Se siembra la muestra con la punta del hilo y se

punciona en el centro del medio (contenido en el

tubo) introduciendo la punta del hilo hasta 2 - 3

mm del fondo del tubo.

• Se extrae el hilo por la misma por la misma línea

que se introdujo.

• Si se trata de medio inclinado, se puede realizar

también una siembra en estría por la superficie

del medio.

• Cuando el agar es fluido, en lugar del hilo se puede utilizar el asa.

• Se suele emplear para técnicas de identificación (hidrólisis de principios inmediatos, Kliger,

motilidad, etc).

1.c.- Siembra en tubo en medio líquido

Una manera sencilla de obtener bacterias es hacerlas crecer en un medio líquido, en un

tubo de ensayo.

Formas de manifestarse el crecimiento bacteriano en un medio líquido:

- enturbiamiento: opacidad más o menos densa.

- formación de velo: pequeña masa de células que flotan en la parte superior del cultivo.

- sedimento: deposito de células que permanece en la parte inferior del cultivo, pero que

se pone nuevamente en suspensión si el tubo se sacude sucesivamente.

Formas de realizar la siembra en medio líquido


29

- con asa: se sumerge el asa cargada en el medio y se agita.

- con pipeta: se vierte el contenido de la pipeta sobre el medio de cultivo y se

homogeneiza.

- con escobillón o hisopo: de igual modo que con el asa.

Técnica:

- Tomar dos tubos de caldo común.

- Rotular un tubo "control" y dejar sin

inocular.

- Realizar la siembra en el otro tubo.

- Incubar el tubo sembrado en la

estufa a la tª y tiempo determinado.

- Examinar el cultivo para determinar

el crecimiento. No agitar el tubo

antes de hacer las primeras

observaciones, para determinar si ha

habido enturbiamiento, formación

de velo o sedimento.

NORMAS GENERALES TRAS LA SIEMBRA DE MUESTRAS BIOLÓGICAS

• Inmediatamente hecha la siembra, tanto en tubo como en placa, deben taparse o cerrarse los

recipientes:

.- Los tubos se taparán con torundas de algodón graso, parafina o tapón hermético.

.- Frascos y botellas con tapón de cierre hermético.

.- Matraces: igual que los tubos.

.- Placas de petri, por su diseño quedan perfectamente cerradas.

• Los distintos recipientes, para su cultivo se colocarán de la siguiente manera:

.- Tubos: en posición vertical colocados en gradillas.

.- Frascos, botellas y matraces: apoyados en su propia base.

.- Placas de petri: salvo raras excepciones (cultivo de hongos) se colocaran de forma

invertida.


30

CULTIVO O INCUBACIÓN DEL MEDIO

Tras la siembra de un medio de cultivo, este debe ser colocado en un ambiente

adecuado para el desarrollo de los microorganismos.

Los FACTORES que afectan al cultivo de microorganismos son:

1. Temperatura: generalmente se incuban a la tª fisiológica (35 - 37ºC), aunque determinados

microorganismos pueden requerir otra temperatura (psicotrofos: 22 ºC; coliformes fecales:

44ºC). Dichas temperaturas se consiguen en las estufas de cultivo que pueden ser:

2. Atmósfera: según sea aerobio, anaerobio o anaerobio facultativo. La anaerobiosis se

consigue a través de:

- Jarras de anaerobios: en las que se produce en su interior una reacción química

que genera CO2. Constan de un sobre generador de H y CO2, un indicador de

anaerobiosis y un catalizador.

- Cabinas de anaerobios: es una cámara que lleva incorporados unos guantes de

plástico para manipular el material que se encuentra en el interior. El ambiente

se mantiene anaeróbico mediante un catalizador (paladio e hidrógeno).

3. Protección ambiental: el microorganismo durante su incubación debe estar protegido de

agresiones externas y posibles contaminaciones, para garantizar los resultados.

El control de estos factores se puede llevar a cabo mediante estufas de cultivo.

- Estufas convencionales: en las que se incuban medios de cultivo con

microorganismos aerobios y anaerobios facultativos. Controlan la tª y la protección

ambiental.

- Estufas o incubadoras de CO2: son aquellas que además controlan el contenido de

CO2 y se utilizan en el cultivo de anaerobios.

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS

Para cultivar estas bacterias es necesario recurrir a distintos procedimientos para eliminar

el oxígeno o bien destruir el peróxido de hidrógeno formado. Para ello existen distintos

métodos:

1) Métodos físicos:

a- Ebullición: Se persigue eliminar el oxígeno haciendo hervir el tubo de ensayo con medio de

cultivo a baño María durante 20 minutos y enfriándolo bruscamente. Para evitar que el oxígeno

vuelva a incorporarse, se sellan los tubos con una sustancia inerte, como la mezcla “vaspar”,

(vaselina y parafina en partes iguales).


31

b- Eliminación del aire con bomba de vacío: Para esto se utilizan tubos especiales:

• Tubo Roux: Se realiza la siembra en estos dispositivos,

cargado con medio de cultivo. Se cierra a la llama el tubo a

la altura del estrangulamiento y por la rama lateral se hace

el vacío con una bomba, y se cierra también a la llama la

rama lateral (Fig.a).

• Tubo Fraenkel: Una vez sembrada la muestra dentro del

tubo, se hace pasar un gas inerte (nitrógeno, hidrógeno)

por la rama A, que burbujeará en el medio y efectuará un lavado; la mezcla de hidrógeno y

oxígeno saldrá por B, quedando al final una atmósfera de hidrógeno solamente. Ambas

ramas se cierran a la llama, luego se coloca en estufa de incubación (Fig.b).

2) Métodos químicos:

Hay ciertas sustancias químicas que tienen propiedades

reductoras, pero no pueden ser incorporadas al medio de cultivo

debido a que son tóxicas para las bacterias.

El pirogalato de sodio o potasio es lo más usado para este

fin, empleando tubos especiales o desecadores.

Se coloca el tubo de ensayo sembrado dentro de otro tubo

más grande que contiene ácido pirogálico e hidróxido de sodio o potasio. Se cierra con tapón de

goma y se sella con vaspar.

Hay sustancias reductoras que por ser no tóxicas se las puede agregar directamente al

medio de cultivo, por ejemplo: glucosa 2%, sulfito de sodio 0,1% y formiato de sodio 0,5%.

3) Métodos biológicos:

a- Medio de Tarozzi: Es un medio de cultivo común al que se le agrega trozos frescos de

órganos de animales (conejo, cobayo), ricos en catalasa (hígado, pulmón, cerebro).

b- Tejidos vegetales: Similar al caso anterior, se agregan tejidos vegetales ricos en catalasa, por

ejemplo: papa, zanahoria, granos de legumbres, etc.

c- Semillas: Colocando semillas de cereales en la base

de un desecador, estas actúan como reductoras durante el

proceso germinativo, tomando el oxígeno del medio y

desprendiendo dióxido de carbono, con lo cual se logra

el ambiente necesario para el desarrollo de los

microorganismos. En la parte superior del desecador se

colocan las cajas y tubos sembrados, se tapa y se coloca todo el dispositivo en estufa de cultivo.


32

4) Además de los métodos anteriormente descriptos (físicos, químicos y biológicos), una forma

directa de realizar el aislamiento de anaerobios es mediante el uso de la Pipeta de Vignal, cuyo

procedimiento es el siguiente:

Al medio de cultivo agarificado se lo

mantiene licuado a 45ºC, se siembra la muestra y se

succiona con la pipeta, que tiene sinuosidades; una

vez rellenada toda la pipeta con la mezcla de medio

de cultivo y muestra microbiana, se cierran los

extremos a la llama y se coloca en estufa de cultivo.

Donde se observen colonias aisladas se procede a cortar la pipeta con una lima y con una aguja

se toma la colonia elegida para obtener el cultivo puro.

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS MICROAEROBIOS:

a- Desecadores: Son dispositivos dentro de

los cuales van los tubos sembrados; se

realiza el vacío con una bomba y se inyecta

dióxido de carbono hasta lograr una presión

parcial de oxígeno inferior a la normal.

Una variante práctica de este método

es colocar una vela encendida dentro del

desecador o bajo una campana de vidrio,

cerrando herméticamente el dispositivo. La llama de la vela consume el oxígeno y libera

dióxido de carbono, logrando de esta forma un ambiente de microaerobiosis.

b- Estufas especiales: Una vez colocadas las cajas y tubos sembrados, estas estufas permiten

modificar la composición gaseosa interna, mediante el reemplazo de un gas por otro, brindando

de esta manera las condiciones microaerobias requeridas por los microorganismos en estudio.

c. Medios de cultivo semisólidos: Son medios cuya concentración de agar es de 0,5-0.8%, con

lo cual se logra una condición de microaerobiosis para el desarrollo subsuperficial de los

microorganismos, tales los casos de algunos fijadores de nitrógeno como Azospirillum y

Acetobacter.


33

F) TÉCN DE RECUENTO

RECUENTO EN PLACA DE LAS COLONIAS

Para realizar dicho contaje se toman las placas que contengan de 30 a 300 colonias

aproximadamente y en un contador de colonias se procede al contaje; también se puede hacer

manualmente.

El recuento de las bacterias nos da idea del grado de contaminación que hay en una

muestra.

Suponiendo que cada colonia procede de un solo microorganismo y que se han sembrado

con un asa calibrada (con un volumen determinado), el nº total de gérmenes será el resultado de

multiplicar el nº de colonias por el volumen del asa calibrada.

Ejem:

Contamos 50 colonias y han sido sembradas con un asa de 1/100 (volumen=0,01 ml)

en un volumen de 0,01 ml-------------crecen 50 colonias

" " " 1 ml ----------- " X "

X = 5.000 colonias/ ml muestra

Si la siembra se ha hecho por dilución, el recuento será:

Ejem: si la dilución es de 10-2 y el nº de colonias es de 50 en 0,1 ml del medio, el nº de

microorganismos será:

10-2 = 1/100

si en una dilución 10-2 ---------------50 colonias

" " " 1 ------------- X

X = 5.000 colonias en 0,1 ml

si en 0,1 ml --------------- 5.000 colonias

" 1 ml --------------- X

X = 50.000 colonias/ ml muestra

CALCULO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE

Se trata de una prueba presuntiva (se presupone que es un determinado microorganismo

porque tiene una determinada reacción positiva), por la cual se obtiene el número aproximado

de bacterias que había en la muestra. Para ello:

1. Se preparan 3 series de 3 tubos con medio de cultivo

2. Se realizan 3 diluciones seriadas de la muestra: 1/10, 1/100, 1/1000.


34

3. Se realizan las siembras:

a. se siembran los 3 tubos de la primera serie con 1 ml de la muestra 1/10

b. se siembran los 3 tubos de la segunda serie con 1 ml de la muestra 1/100

c. se siembran los 3 tubos de la tercera serie con 1 ml de la muestra 1/1000

4. Se incuban las 3 series.

5. Se leen los resultados y se extrapolan a la siguiente tabla.

NMP de microorganismos por g o ml. Utilizando 3 tubos

sembrados c/u con 1 ml de diluciones 10-1, 10-2, 10-3

Número de tubos positivos NMP/ g o ml

0 0 0 < 3

0 0 1 3

0 1 0 3

1 0 0 4

1 0 1 7

1 1 0 7

1 1 1 11

2 0 0 9

2 0 1 14

2 1 0 15

2 1 1 20

2 2 0 21

2 2 1 28

3 0 0 23

3 0 1 39

3 0 2 64

3 1 0 43

3 1 1 75

3 1 2 120

3 2 0 93

3 2 1 150

3 2 2 210

3 3 0 240

3 3 1 460

3 3 2 1100

3 3 3 >2400


35

G) EL MICROSCOPIO

El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño.

Es el instrumento que más se usa en los laboratorios que estudian los microorganismos.

Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un objeto

microscópico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño

original.

Actualmente existen dos tipos de microscopios: el óptico y el electrónico. En el

microscopio óptico el aumento del objeto se consigue usando un sistema de lentes que manipula

el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos. El microscopio electrónico utiliza un rayo

de electrones controlado por un campo magnético.

MICROSCOPIO OPTICO

Los microscopios ópticos suelen producir un aumento de 1000 veces el tamaño original.

Las lentes de un microscopio óptico son el condensador, el objetivo y el ocular:

• La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparación y para esto se utiliza el

condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de luz y

así, puede elegirse una posición que consiga el foco preciso.

• El objetivo es la lente situada cerca del objeto que se observa. El aumento primario del

objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular, donde se realiza

el aumento final.

Los microscopios que se usan normalmente en microbiología están equipados con tres

objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo de inmersión. Estos objetivos están montados

sobre una pieza que se llama revolver que puede rotarse para alinear el objetivo deseado

con el condensador.

• La imagen formada por el objetivo es finalmente aumentada por el ocular. El aumento total

de un microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo y de su ocular.

El microscopio compuesto es capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores

que el microscopio construido con una sola lente. Este último, llamado microscopio simple, se

usa principalmente como lupas y cristales de aumento.

Además del aumento, una propiedad importante de un microscopio es su poder

resolutivo; esto es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos.

Cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor será la definición de un objeto. Los microscopios

de gran poder resolutivo son especialmente buenos para ver pequeñas estructuras.

El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de la longitud de onda

utilizada y de una propiedad óptica de la lente conocida como apertura numérica.


36

Como los microscopios ópticos utilizan luz visible, la longitud de onda está fijada y es

por lo que la resolución de un objeto es función de la apertura numérica; cuanto mayor sea la

apertura, el objeto resuelto será más pequeño.

Un factor que afecta a la apertura numérica, además de la construcción de la lente, es el

medio a través del cual pasa la luz. Mientras que el objetivo esté separado del objeto por el aire,

su apertura numérica nunca será mayor de 1,0; para conseguir aperturas numéricas mayores que

ésta, el objetivo debe estar inmerso en un líquido de mayor índice de refracción que el aire.

A estos líquidos se les denomina aceites de inmersión que se utilizan con los objetivos de

inmersión obteniendo una apertura numérica entre 1,2 y 1,4. Aún así, al utilizarse la luz visible

(longitud de onda) estos microscopios llegan a tener un poder de resolución de

aproximadamente 0,25 µm, lo que significa que las partículas con un tamaño más pequeño de

0,25 µm no pueden distinguirse unas de otras.

PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

- OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.

- OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.

- CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.

- DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.

- FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

- SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.

- PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.

- CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular, …..

- REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los

objetivos.

Partes de un microscopio óptico��


37

- TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que

consigue el enfoque correcto.

MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina

completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar

en esas condiciones.

2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.

3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x

4. Para realizar el enfoque:

a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo

macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se

corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos

o ambos.

b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la

preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el

micrométrico hasta obtener un enfoque fino.

5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente

con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se

perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir

la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación

y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se

descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una

preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.

6. Empleo del objetivo de inmersión:

a. Bajar totalmente la platina.

b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la

zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.

c. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el

de x40.

d. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.

e. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.

f. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la

gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.

g. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de

inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo

de accidente es muy grande.


38

h. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a

usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea

enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.

i. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el

objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la

preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición

de observación.

j. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica.

Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.

MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES

1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de

observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la

misma y dejarlo cubierto con su funda.

2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para

evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe

guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.

3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente

con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.

4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio.

5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el

objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable).

En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el

aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de

alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se

aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción.

6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico,

platina, revólver y condensador).

7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la

preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo

agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del

ocular.

8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido,

secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol.

9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al

acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos.


39

Tipos de microscopios ópticos:

• Microscopio de campo claro: usa una fuente de luz directa, bien una bombilla, o bien la

luz solar. Ya que los microorganismos son transparentes, es difícil distinguirlos con este

tipo de microscopía, por lo que se suelen teñir.

• Microscopio de campo oscuro: usa un microscopio óptico equipado con un condensador y

objetivo especial que iluminan los microorganismos en la muestra frente a un fondo oscuro.

Este método se utiliza para visualizar microorganismos vivos sin teñir.

• Microscopio de fluorescencia: la muestra se tiñe con una sustancia fluorescente que

absorbe la energía de las ondas cortas de la luz (azul) y emite la luz de longitudes de ondas

más largas (verde). En esta técnica una sustancia fluorescente se une a un anticuerpo

específico de ciertos microorganismos. Si el anticuerpo fluorescente se une al

microorganismo, este microorganismo emite fluorescencia y se puede identificar.

• Microscopio de contraste de fases: es un microscopio óptico modificado que permite

contrastar sustancias de diferente grosor o densidad. Mediante un condensador y un

objetivo especial se controla la iluminación de tal manera que vaya en diferentes rutas a

través de las distintas partes de una célula. El resultado es una imagen con diferentes grados

de brillo y oscuridad. Con este método, el material denso aparece brillante, mientras que las

partes de la célula que tienen una densidad cercana al H2O (citoplasma) aparecen oscuras.

Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin necesidad de usar colorantes o matar

microorganismos.

MICROSCOPIO ELECTRONICO

Los microscopios electrónicos utilizan rayos de electrones en lugar de la luz, lo que les

permite tener un poder de resolución muy elevado. Es posible con el microscopio electrónico

resolver objetos separados por una distancia de 0,003 µm, y los aumentos pueden llegar a ser de

un millón de veces.

Microscopía Electrónica de Transmisión (MET).- A causa de la naturaleza de este

instrumento sólo pueden examinarse objetos muy delgados; incluso una sola bacteria es

demasiado gruesa para ser observada directamente. Por lo que, para preparar muestras para el

microscopio electrónico se necesitan técnicas especiales de cortes ultrafinos. Una sola célula

bacteriana puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas.

Microscopía Electrónica de Barrido (MEB).- Si sólo tiene que observarse el contorno de un

organismo, no son necesarias secciones finas por lo que se montan células enteras que se

recubren de una capa fina de un metal pesado (oro). El rayo de electrones es dirigido sobre la

preparación y los electrones dispersados por el metal pesado activan una pantalla de

observación produciendo una imagen.


40

H) OBSERVACION DE LOS MICROORGANISMOS: TINCIONES

Todos los microorganismos, excepto los virus, pueden ser observados mediante

microscopios ópticos, para que esta visualización sea óptima, deben cumplirse los siguientes

requisitos en cuanto a la preparación de la muestra:

- debe ser homogénea.

- si se usa colorante, la cantidad debe ser adecuada.

- técnica adecuada, en función al tipo de microorganismo a observar.

- ausencia de elementos contaminantes, bien en la propia muestra o en los

instrumentos de manipulación (asas, pipetas etc).

- los portas en los que se haga la extensión y los cubres estarán escrupulosamente

limpios.

Hemos señalado anteriormente la necesidad del empleo de una técnica adecuada en

función de lo que pretendamos estudiar, atendiendo a esto haremos una clasificación global,

según observemos gérmenes vivos o muertos (sometidos a determinadas tinciones). Ambas

técnicas tienen ventajas e inconvenientes, que veremos más detalladamente.

A continuación, vamos a describir las técnicas más comúnmente usadas para realizar

preparaciones para microscopios ópticos:

Método de la cámara húmeda Examen en fresco

Método de la gota pendiente Visualización

de gérmenes in vivo

Coloración Vital

T. Simple

T. de Gram T. Diferencial

T. AAR o de Ziehl-Neelsen

T. Negativa T. Especiales

T. Fluorescente

T. de cápsulas

T. de esporas

T. de flagelos

Tinciones bacterianas

T. Estructurales

T. de corpúsculos metacromáticos de Loëffler


41

VISUALIZACIÓN DE GÉRMENES "IN VIVO"

Consiste en observar los microorganismos vivos a través del microscopio con ayuda de

alguna sustancia que lo facilite, pero nunca interfiriendo. Dado que el microorganismo no está

muerto podemos observar su movilidad, morfología y agrupamiento.

Ventajas:

- apreciación más fiel de la realidad, de la morfología, agrupación y movilidad.

Desventajas:

- poco contraste entre la muestra y el fondo, así como entre las estructuras del

germen.

- manejo engorroso, pues es material vivo que puede contaminar.

- imposibilidad de almacenamiento de la preparación.

TÉCNICA PARA UNA BUENA OBSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

1- Adecuada utilización del microscopio:

- ideal verlos sobre fondo oscuro; en su defecto cerrar parcialmente el diafragma.

- para facilitar el enfoque, comenzar localizando el porta.

- comenzar con objetivos de menor aumento e ir aumentando hasta el de inmersión.

2- Crear un soporte adecuado para la visualización del microorganismo:

- a la muestra se le suele añadir un líquido o medio de montaje, generalmente suero

fisiológico.

- si la muestra se encuentra en estado líquido, depositar una gota de ésta sobre el

porta directamente.

3- Evitar la desecación (pues moriría el microorganismo), esto se consigue:

- sellando la cámara que hay entre el porta y el cubre, con vaselina o parafina

- reduciendo la intensidad de la luz.

TÉCNICAS DE VISUALIZACIÓN AL MICROSCOPIO

a) EXAMEN EN FRESCO

Objetivo: suspendiendo el microorganismo en un medio líquido transparente, es posible

observar al microscopio sus características morfológicas, movilidad y disposición.

a.1. MÉTODO DE LA CÁMARA HÚMEDA

Ventajas: - rapidez

- evita distorsiones ópticas por el efecto lupa de los portas excavados.

Desventajas:- la de toda determinación "in vivo": poco contraste

- la motilidad se observa con dificultad.


42

Material: mechero, porta, cubreobjetos, cultivo reciente, parafina líquida o vaselina y asa de

cultivo.

Técnica:

- Depositar en el centro del portaobjetos, perfectamente limpio y desengrasado, una

gota de agua estéril o s. fisiológico.

- Tomar con el asa estéril una muestra y realizar una suspensión con la gota de agua.

- Si el medio es líquido, simplemente depositar una gota en el porta.

- Colocar sobre la suspensión un cubreobjetos, evitando que se formen burbujas de

aire. Se puede sellar con vaselina o parafina para evitar la desecación.

- Observar al microscopio.

a.2.- MÉTODO DE LA GOTA PENDIENTE

Ventajas: - mejor observación de la motilidad debido al mayor grosor de la muestra.

- menor facilidad para la desecación.

Desventajas: - distorsión óptica.

- método lento y engorroso.

Material: porta-excavado, cubreobjetos, cultivo reciente, parafina líquida o vaselina y asa de

cultivo.

Técnica:

- Limpiar escrupulosamente un porta excavado y un cubre.

- Colocar en los bordes del cubre vaselina o un poco de agua.

- Poner una gota de suspensión microbiológica en el centro del cubre.

- Tomar el porta y colocarlo en la excavación justo encima de la gota, presionando para

que se unan.

- Invertirlos, procurando que quede suspendida la gota dentro de la excavación del porta,

sin que toque ningún borde, ya que se extendería.

- Observar al microscopio con objetivo de 40x.


43

b) COLORACIÓN VITAL

Es un proceso intermedio entre el examen en fresco y las técnicas de tinción.

Objetivo: contrastar algunas estructuras celulares con mayor intensidad y sin que se produzca la

muerte del microorganismo. Se puede observar también la movilidad.

Ventajas: - más contraste que los métodos anteriores, lo que permite mejorar la visión

morfológica, sin que se altere la motilidad y agrupación.

Desventajas: - es relativamente lento.

- se obtiene mayor información morfológica con una tinción de

microorganismos muertos.

Colorantes utilizados: no tiñen, sino que se acumulan en ciertas partes del germen. Se

caracterizan por ser muy poco tóxicos, al estar muy diluidos (aunque siempre terminan

matando al germen).

Azul de metileno: en solución acuosa, a una dilución 1/500 o 1/1000.

Rojo neutro: " " " " " " 1/1000.

Verde Janus: " " fisiológica " " 1/500.

Técnica:

- limpiar perfectamente porta y cubre.

- colocar una gota de suspensión en el centro del porta.

- añadir una gota de colorante con un asa de siembra o una pipeta pasteur y mezclarla

bien ayudados del asa y la pipeta.

- colocar el cubre, procurando que no se formen burbujas.

- observar al microscopio con objetivo de inmersión.

Interpretación: los microorganismos se observan coloreados de azul, rojo o verde (dependiendo

del colorante) en un medio acuoso del mismo color.

TINCIONES BACTERIANAS

En la mayoría de las ocasiones, para la observación de los microorganismos, estos son

teñidos, ya que de esta forma son más fáciles de visualizar y se pueden poner de manifiesto

características diferenciales.

TEÑIR es contrastar más un microorganismo y sus estructuras, mediante el empleo de un

colorante o varios que actúen de forma combinada.

Objetivo:

- hacer más visibles las bacterias

- distinguir las estructuras de los microorganismos por su comportamiento frente al

colorante.


44

Ventajas:

- mayor claridad en la observación de los microorganismos después de ser

coloreados.

- mayor contraste: se pueden demostrar mejor las diferencias entre células de

distintas especies e incluso de la misma.

- material de más fácil manipulación (no contaminante)

Desventajas:

- no se aprecia la morfología del microorganismo vivo, ya que el colorante lo mata.

- no se aprecia la movilidad.

TÉCNICA GENERAL DE TINCIÓN

La mayor parte de los métodos de tinción constan de los siguientes pasos:

1.- Rotulación: en un extremo del portaobjetos, para evitar errores.

2.- Extensión: sobre un portaobjetos, para obtener una película lo mas homogénea posible. Se

emplearán portaobjetos bien limpios, desengrasados y secos, desechando los rayados. La

extensión se realizará con:

o un asa de siembra

o un hisopo

o canto esmerilado de un portaobjetos.

o Si la muestra está en un medio líquido, depositar, con ayuda de un asa, una o varias

gotas sobre el porta.

o Si la muestra o el microorganismo están en un medio de cultivo sólido, se pone

previamente en el porta una gota de agua destilada o solución salina y se depositará una

colonia haciendo la extensión.

3- Desecación: tiene como finalidad eliminar el agua de la extensión para proceder a la fijación.

Se consigue dejando secar a tª ambiente, en estufa o al calor “suave” de la llama.

4- Fijación: consiste en la transformación de la composición físico-química del

microorganismo, manteniendo la morfología de sus estructuras lo más parecido a lo que tenía

"in vivo" (Por ej: coagula las proteínas, evitando que se alteren en las distintas fases de tinción).

Se produce la muerte del microorganismo, quedando la extensión adherida al portaobjetos.

La fijación se puede realizar por:

- calor: se consigue pasando 2 o 3 veces el porta, con la extensión hacia arriba, por la

llama del mechero, ayudados por las pinzas de madera. Cuando el porta está lo

suficientemente caliente para no aguantarlo con la mano, la fijación es completa.

- inmersión en soluciones fijadoras: metanol, alcohol etílico-acetona,etc.

5- Tinción: en la que el microorganismo capta el colorante. Este se dejará actuar durante un

tiempo determinado. Puede ser de varios tipos:


45

• Negativa: Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino el entorno, aumentando

de este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante

(nigrosina).

• Simple: Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la

tinción negativa, sólo nos permite observar la forma, el tamaño y el tipo de

agrupación de las células.

• Diferencial: Intervienen dos o más colorantes y cada uno diferencia una estructura.

El colorante que se usa en segundo lugar es de color diferente al del primero,

denominándose colorante de contraste.

Los colorantes son sustancias orgánicas capaces de teñir estructuras cuando se ponen en

contacto con ellas.

En ocasiones, los colorantes necesitan el concurso de mordientes, que son sustancias no

colorantes que refuerzan la acción de un colorante mediante el ataque a componentes celulares

que facilitan la acción de éste (lugol, fenol, etc.). Los mordientes pueden ir incorporados o no a

la solución del colorante.

6- Lavado: con agua destilada, para eliminar el exceso de colorante. El lavado se realizará entre

todos los pasos. El agua se vierte en el extremo del porta, nunca encima de la preparación.

7- Secado: con lo que mejora la visualización al microscopio. Se hará al aire o presionando

entre dos papeles de filtro.

8- Decoloración: a veces es interesante que determinadas bacterias pierdan el color que

tomaron, lo que permite diferenciarlas de las que no lo pierden. No se debe forzar la

decoloración, ya que pueden perder el color todas las bacterias.

9- Observación al microscopio: empezando con objetivo de poco aumento para ver si la

muestra está bien distribuida, suficientemente concentrada y si la morfología es buena. La

presencia de artefactos, como restos de colorante, polvo, hilos, etc, distorsionan la preparación y

pueden estropearla.

FACTORES QUE INFLUYEN EL LA TINCIÓN

- Pureza de colorantes y reactivos: deben ser lo mas puros posibles.

- Concentración del colorante: oscila entre 0,2 y 2 %, pudiendo variar.

- pH de la solución del colorante: los colorantes se dividen en:

azul de metileno fucsina fenicada safranina básicos

cristal violeta Rojo congo Eosina ácidos Nigrosina

anfóteros o neutros Sudán negro


46

- Temperatura: en general, temperaturas superiores a la ambiental, disminuyen el tiempo de

tinción.

- Sustancias adicionales: como sustancias tampones, decolorantes, etc.

- Tiempo de tinción: dependen del colorante, técnica de tinción, especie a teñir, etc. Suele

oscilar entre 1 y 10 minutos.

TIPOS DE TINCIONES Según la técnica aplicada, las tinciones se clasifican en:

1. Tinción simple: el teñido de los microorganismos se hará aplicando exclusivamente una

solución colorante. Nos proporciona información sobre la forma, agrupamiento y cantidad

de gérmenes.

2. Tinción diferencial: se utilizan dos colorantes de modo, que los gérmenes queden teñidos

con uno u otro, dependiendo del tipo que se trate. Pone de manifiesto las diferencias

existentes entre las distintas células bacterianas o entre las distintas partes de la misma

célula. Dentro de este tipo están:

- Tinción de Gram

- Tinción ácido alcohol resistente o de Ziehl- Neelsen.

3. Tinciones especiales:

- Tinción negativa

- Tinción fluorescente.

4- Tinciones estructurales: el colorante pone de manifiesto determinadas estructuras presentes

sólo en algunos gérmenes:

- Tinción de cápsulas

- " " Esporas

- " " Flagelos

- Tinción de corpúsculos metacromáticos de Loëffler

TINCIÓN SIMPLE:

Objetivo: observar la morfología, asociación y la cantidad de microorganismos mediante el uso

de un colorante. Se basa en la afinidad de éste, por los distintos componentes celulares, que

pueden ser de mayor o menor intensidad produciéndose un contraste diferenciador de las

estructuras celulares.

Colorantes más utilizados son: (1)⋅ Azul de metileno, (2) Violeta de Genciana, (3) Fucsina

Técnica:

- Rotular los datos oportunos

- Extender la muestra

- Secar

- Fijar

- Coloración durante 1 o 2 minutos.

- Lavar

- Dejar secar la preparación

- Observar al microscopio


47

Resultados e interpretación:

o si el colorante utilizado es azul de metileno o violeta de genciana, los

microorganismos aparecen teñidos de azul.

o Si es fucsina aparecerán teñidos de rojo.

TINCIONES DIFERENCIALES

TINCIÓN DE GRAM

Es la técnica de tinción diferencial más importante que se utiliza en bacterias. El primero

en describirla fue el danés Christian Gram.

Objetivo: es la clasificación de los gérmenes según la captación o no de los colorantes que

componen esta tinción.

Fundamento: los Gram + son aquellos que resisten la acción decolorante del disolvente alcohol

- acetona tras tratamiento con un colorante básico y lugol. Los Gram - son decolorados, siendo

posteriormente teñidos con un colorante de contraste como la fucsina diluida. Este hecho es

debido a la diferente composición de la pared celular de ambos grupos de microorganismos.

Reactivos:

⋅ 1er colorante: Violeta de Genciana o Cristal Violeta al 1%

⋅ Mordiente: Lugol (aumenta la afinidad entre el colorante y las células)

⋅ Decolorante: Alcohol-Acetona 1:1

⋅ Colorante de contraste: Fuchsina diluida o Safranina al 0,5%

Técnica:

- Rotular

- Extender

- Secar

- Fijar

- Cubrir con violeta de genciana (1’)

- Lavar con agua destilada

- Cubrir con lugol (1 min)


- Decolorar con alcohol-acetona, hasta que el disolvente salga exento de colorante

(aproximadamente 30 '')


- Cubrir con fucsina básica diluida (3') o safranina (1')

- Lavar con agua

- Secar

- Observar al microscopio


48

Mecanismo de acción o fundamento: Todas las bacterias toman el primer colorante (violeta de

genciana o cristal violeta) ayudadas por el mordiente (lugol), pero las Gram (-) lo pierden al

decolorar con alcohol-acetona, y pueden tomar el 2º colorante. Se cree que las Gram (-) pierden

el colorante por la gran cantidad de lípidos que tienen estas bacterias en la pared celular, que son

disueltos por el alcohol, de forma que quedan orificios por los que sale el colorante.

Interpretación: En base a la explicación anterior es fácil deducir la interpretación, así,

denominamos bacterias Gram (+) a aquellas que vistas al microscopio presentan una

coloración azul o violeta. Las bacterias Gram (-) presentarán una coloración rojiza.

Existen bacterias que, en determinadas fases del crecimiento, son Gram variables y

aparecen en la misma preparación unas células teñidas de azul y otras de rojo; esto ocurre en

algunas especies del Género Bacillus.

TINCIÓN DE ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENCIA DE ZIEHL-NEELSEN (AAR)

Objetivo: diferenciar las bacterias resistentes a la decoloración con ácido-alcohol de las

restantes. Las bacterias AAR pertencen al género Mycobacterium cuyas especies más

importantes son el bacilo de Koch y el de Hansen. (tuberculosis y lepra)

Reactivos:

⋅ Solución fenicada de fucsina (1er colorante)

⋅ Alcohol-clorhídrico (decolorante)

⋅ Azul de metileno (2º colorante)

Fundamento: Las bacterias AAR, como su nombre indica, son muy resistentes, tanto a la

coloración como a la decoloración. Se cree que las Micobacterias tienen en su pared gran

cantidad de lípidos, siendo los colorantes más soluble en éstos que en el líquido decolorante y,

por tanto no pierden el color, esto no ocurre con las bacterias no AAR. Para teñirlas hay que

forzar la coloración mediante calor.

Técnica:

- Rotular

- Extender

- Secar

- Fijar

- Cubrir la extensión con fuchsina fenicada y teñir en caliente de 5 a 10 min.; para

ello pasar una llama varias veces por debajo del porta hasta la emisión de vapores.

No dejar hervir. Añadir más colorante si es preciso, para evitar desecación. Esta

operación se realiza 3 veces a intervalos de 5 minutos. Podemos cubrir la extensión

con papel de filtro sobre el que se echa el colorante.

- Lavar con agua


49

- Decolorar con el ácido-alcohol, hasta que adquiera un color rosa claro,

aproximadamente 5 minutos.

- Lavar con agua

- Cubrir con azul de metileno durante 2 '

- Lavar con agua

- Secar al aire

- Observar al microscopio.

INTERPRETACIÓN: apreciamos un fondo azul y los bacilos AAR de color rojo.

Las bacterias teñidas según esta técnica se clasifican en:

- Ácido - alcohol resistente cuando retienen la fuchsina y quedan teñidas de color

rojo. (micobacterias)

- No ácido - alcohol resistente: si se decoloran por el alcohol- clorídrico y toman el

color de contraste de azul de metileno.

MÉTODO DE TAN-THIAN-HOK

Es un método que utiliza los mismos componentes que el Ziehl-Neelsen, pero su

procesamiento es más rápido y menos engorroso.

Composición de los colorantes:

- Kinyoun: fuschina, fenol, etanol, agua destilada

- Gabett: azul de metileno, ácido sulfúrico, alcohol absoluto y agua destilada.

Técnica:

- Tras realizar la extensión de la muestra, fijar a la llama

- Cubrir con la solución de Kinyoun durante 3'.

- Lavar durante 30''

- Cubrir con la solución de Gabett, durante 1'

- Lavar y secar.

Interpretación: Las bacterias AAR se observan rojas tras la decoloración.

TINCIONES ESPECIALES

TINCIÓN NEGATIVA

Objetivo: colorear el fondo, resaltando los microorganismos que quedan sin colorear.

Ventajas: permite ver la morfología externa del microorganismo: forma, cápsulas, flagelos,

asociación, etc. Es por lo tanto un método indirecto de probar la movilidad.


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Desventajas: no permite apreciar la movilidad del microorganismo, pues lo mata.

Colorantes: - tinta china

- solución acuosa de nigrosina al 1/100.

Técnica:

- En un porta limpio y desengrasado colocar 1 gota de colorante

- Con un asa de suspensión bacteriana, se extiende al microorganismo sobre la gota

del colorante, que debe formar al final una capa fina, pero no transparente (no hace

falta fijación previa).

- Mezclar hasta homogeneizar, con el asa de siembra.

- Dejar secar a tª ambiente.

- visualizar al microscopio.

TINCIÓN FLUORESCENTE

Objetivo: detectar bacterias cuando se encuentran en muy poca cantidad o se enmascaran con

restos de células. Por ejem. en LCR, sangre, etc.

Desventajas: - se necesita microscopio de fluorescencia.

- con frecuencia se observan artefactos.

TINCIONES ESTRUCTURALES

TINCIÓN DE CÁPSULAS

La cápsula es una capa gelatinosa, de espesor variable, situada alrededor de la pared

bacteriana. Según el MÉTODO ANTONY se colorea la cápsula de distinto color que el resto de

la bacteria

Objetivo: hacer visible la estructura mucopolisacárida que poseen algunos tipos de bacterias,

recubriendo la pared bacteriana.

Reactivos: - cristal violeta al 1% o violeta de genciana

- sulfato de cobre al 20%

Técnica:

⋅ extender, secar y no fijar la muestra.

⋅ bañar con cristal violeta 2 minutos.

⋅ lavar con la solución de sulfato de cobre.

⋅ secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión.

Interpretación: - las cápsulas se tiñen de color azul claro.

- las células " " " " azul oscuro.


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TINCIÓN DE ESPORAS de Wirtz

Las endosporas son formas de resistencia originadas por algunos grupos de bacterias

(Bacillus, Clostridium).

Objetivo: visualizar la espora.

Mecanismo de acción: consiste en introducir un colorante dentro de las esporas, haciendo que

luego lo pierda el resto de la célula y teñir luego esta con un colorante de contraste.

La espora ante las tinciones normales presenta resistencia a la coloración, por ello hay

que emplear técnicas específicas. Esto es debido a que la cápsula de las esporas, tienen distintas

características físico - químicas que las formas bacterianas normales.

Reactivos: - solución hidroalcohólica de verde de malaquita.

- solución acuosa de safranina.

- fucsina fenicada: solución fenicada diluida de fuscina básica.

Técnica:

- Hacer la extensión, secar y fijar a la llama.

- Cubrir con verde de malaquita en caliente, con emisión de vapores 3 minutos.

- Lavar con agua fría.

- Cubrir con safranina o fucsina 30 segundos.

- Lavar, secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión.

Interpretación: - las esporas se tiñen de verde y las células bacterianas se tiñen de rojo.


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TINCIÓN DE FLAGELOS

La observación de flagelos en preparaciones teñidas es muy difícil, debido a que se

retraen con mucha facilidad y se adhieren a la pared celular.

El diámetro de los flagelos bacterianos está por debajo del límite de resolución del

microscopio óptico, por lo que no son visibles, siendo necesario usar técnicas especiales de

tinción, de modo que el colorante adecuado forme una capa alrededor de cada flagelo,

aumentando así su diámetro aparente.

Las tinciones de flagelos se utilizan de manera específica, para diferenciar los miembros

del género Pseudomonas que tienen flagelos polares, de los miembros de Enterobacterias que

tienen flagelos periféricos.

Objetivo: colorear los flagelos presentes en algunas bacterias o parásitos móviles.

Tipos de tinciones:

1.- utilizan una sal de plata que se deposita sobre los flagelos.

2.- " fucsina básica.

Técnica general:

- Emplear un cultivo fresco de 24 horas.

- Los tiempos y composición de colorantes y reactivos varia según los autores,

básicamente todos emplean:

o fucsina básica fenicada en solución alcohólica.

o ácido tánico, como mordiente.

o sales: ClNa, (SO4)2AlK, (SO4)2AlNH4.

o a veces se añade un colorante de contraste.

- Los flagelos se observan de color rojo.

MÉTODO DE LEFSON

- Preparar la extensión en un portaobjetos cubriéndola con solución de dicromato.

- Lavar con agua, enjuagar en alcohol y secar.

- Inundar los portas con la solución colorante que lleva fucsina básica.

- Dejar reposar 10 minutos a tª ambiente (si hace calor) o en incubadora (si hace frío).

- Lavar con abundante agua.

- Secar y examinar.

TÉCNICA QUE UTILIZA UNA SAL DE PLATA

Reactivos:

- oxido ósmico 1%

- formalina 0,5%

- mordiente de Rhodes

- nitrato de plata 5%


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Técnica:

- Realizar un cultivo en medio inclinado durante 18 horas.

- Tomar una muestra y extenderla en un porta.

- Fijar al calor con vapores de óxido ósmico durante 2 minutos.

- Suspender las bacterias en formalina hasta que aparezca turbidez.

- Colocar el porta inclinado y dejar resbalar una gota de la suspensión anterior.

- Desecar al aire sin calor.

- Cubrir con el mordiente de Rhodes durante 3-5 minutos.

- Lavar con agua mediante inmersión.

- Teñir con AgNO3 calentado a 95ºC, durante 3-5 minutos.

- Lavar, secar y observar.

- Los flagelos aparecen visibles debido al precipitado del nitrato de plata.

TINCIÓN DE CORPÚSCULOS METACROMÁTICOS DE LOËFFLER

Reactivo: azul de metileno

Método: - Extensión

- Desecación

- Fijación al calor y enfriar

- Azul de metileno durante 5 min

- Lavar con agua

- Secar

- Observación con objetivo de inmersión.

Algunos microorganismos presentan en su interior corpúsculos metacromáticos, que se

tiñen más intensamente que el resto de la célula, tal es el caso de Lactobacillus. En esta tinción

se tiñen de azul más oscuro que el resto de la célula.

BIBLIOGRAFIA

• Dr. Pedro F. Mateos. Departamento de Microbiología y Genética. Facultad de Farmacia.

Universidad de Salamanca. Cultivo de los microorganismos: medios de cultivo. En:

http://edicion-micro.usal.es/web/educativo/micro2/tema02.html

• Casas Peláez, A. Apuntes de laboratorio de microbiología de aguas.

• Solano Goñi, C. Microbiología General. Guión de prácticas. Instituto de Agrobiotecnología

y Recursos Naturales. UPNA/CSIC. 2004.

• Pascual Anderson, MR; Calderón y Pascual, V. Microbiología alimentaria. Metodología

analítica para alimentos y bebidas. 2ª edición. Díaz de Santos. Madrid, 2000.

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