Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgicos Tcnicas de observacin de microorganismos

Laboratorio de Diagnstico Clnico. 2 curso U.T. 13 -1 Bloque temtico III

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Tcnicas de observacin de microorganismos

El examen microscpico es el primer paso para el estudio de las muestras

microbiolgicas. Es un examen orientativo que nos proporciona datos como la presencia

de bacterias, su morfologa, movilidad y caractersticas tintoriales y estructurales.

Los microorganismos obtenidos a partir de una muestra clnica pueden verse

vivos o muertos, aunque para la investigacin de algunas caractersticas biolgicas

como la movilidad, es necesario observarlos vivos.

Las tcnicas de observacin microscpica de microorganismos pueden dividirse

en:

A. Examen en fresco (preparaciones sin teir)

- preparacin entre porta y cubre

B. Examen de preparaciones coloreadas:

- de grmenes vivos -> coloracin vital

- de grmenes muertos -> tinciones

C. Estudio de la movilidad bacteriana

- gota pendiente

A. Examen en fresco (preparaciones sin teir) Consiste en observar los microorganismos vivos que puede haber en el producto

examinado, sin fijacin ni tincin, en suspensin acuosa, pudiendo objetivar su

cantidad, sus caractersticas morfolgicas y su movilidad.

Es una tcnica de fcil realizacin, en la que el producto a examinar se sita

entre porta y cubre. Si el material procede de una toma en medio slido o de una toma

directa, se emulsionar en una gota de agua destilada o solucin salina. Si el material es

lquido se depositar directamente entre porta y cubre.

El volumen de la gota debe ser adecuado a las dimensiones del cubreobjetos ya

que, en caso contrario, un exceso de lquido se traducir en un desbordamiento de ste

bajo los lmites del cubre, o un cubre "flotante" que dificultar nuestra observacin por

la formacin de corrientes lquidas.

Si el producto va a permanecer mucho tiempo en el portaobjetos, es conveniente

prevenir la desecacin mediante la aplicacin de parafina en los bordes inferiores del

cubreobjetos.

La observacin se realiza, en general, con objetivo de 40x en microscopio de

campo claro. La microscopa de contraste de fases y de campo oscuro facilita mucho la

visin en fresco.

Los exmenes en fresco permiten, adems, observar la presencia de otros

elementos formes, como leucocitos, cristales, etc., que pueden ser de gran ayuda en la

valoracin de las muestras.

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B. Examen de preparaciones coloreadas Las tcnicas de coloracin permiten la observacin morfolgica con un mejor

contraste que en el examen en fresco, as como la observacin de estructuras celulares.

El examen microscpico de preparaciones teidas tiene una serie de pasos

comunes previos a la tincin, que son:

Preparacin del frotis:

- La extensin del material sobre el portaobjetos se har de diferentes formas, en

funcin de la procedencia del producto a examinar. Si el producto es lquido, se

depositar una pequea (muy pequea) cantidad de material en el centro del porta,

extendindolo con el asa hasta conseguir una capa fina y homognea.

- Si la extensin debe hacerse a partir de un cultivo en medio slido, la colonia

que vayamos a estudiar se mezclar con una gotita de agua destilada estril colocada en

el centro del porta. Conviene recordar que no es necesario depositar una gran cantidad

de producto, pues se dificultara la visualizacin, y que un exceso de agua solo

contribuye a aumentar el tiempo en secar la preparacin.

Por ltimo, si el producto se ha recogido con una torunda (exudados) debe

extenderse directamente sobre el portaobjetos, procurando que el algodn "ruede", en

vez de "frotar" el porta; de esta manera se consigue preservar mejor los elementos

celulares que pudiesen acompaar a las bacterias, a la vez que se conserva la agrupacin

de stas, en caso de que las hubiere.

Secado:

- Una vez efectuada la extensin del frotis debemos dejar secar al aire la

preparacin.

- Cuando la preparacin est seca la superficie del frotis pasa de ser brillante a

mate.

- El secado se puede acelerar calentando ligeramente la parte inferior del porta

(sin quemar).

Fijado:

- El ltimo paso antes de proceder a la tincin es la fijacin de la preparacin al

portaobjetos, mediante la coagulacin rpida de las albminas citoplasmticas. Con esto

conseguimos que el producto adherido al portaobjetos no sea eliminado, ni vea alteradas

sus caractersticas morfolgicas y estructurales en los procedimientos de tincin

posteriores.

- La fijacin puede hacerse por calor suave, pasando el porta sobre una llama o

mediante la utilizacin de placas calefactoras especiales a 37C.

- Tras la fijacin por calor es muy importante esperar a que la preparacin se

enfre antes de proceder a realizar cualquier procedimiento de tincin.

- Si el material que vamos a teir puede poseer abundante material celular

(leucocitos, clulas epiteliales, etc.) que conviene visualizar tambin, es preferible

recurrir al alcohol metlico para fijar la preparacin

- Una vez cubierta de alcohol la preparacin, se deja actuar durante un minuto,

eliminando despus el exceso y dejando secar a temperatura ambiente.

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Coloracin o tincin:

- La tincin consiste en cubrir la preparacin con uno o varios colorantes de

forma secuencial durante un tiempo determinado.

- La adicin de un colorante a un frotis sin enfriar puede provocar la

precipitacin del colorante y la visualizacin de artefactos que pueden confundirnos en

el proceso de observacin al microscopio.

- Tras la tincin, la preparacin se lava con agua, procurando que el chorro no caiga con fuerza sobre la preparacin y finalmente se seca al aire o mediante absorcin

con papel.

Tipos de preparaciones coloreadas:

Tinciones simples

- Azul de metileno

- Cristal violeta

- Fucsina

Tinciones dobles, compuestas o diferenciales

- Tincin de Gram

- Tincin de Ziehl-Nielsen

- Tincin de Tam-Thiam-Hok

Tinciones estructurales

- Tincin de cpsulas

- Tincin de flagelos

- Tincin de esporas

- Tincin de corpsculos metacromticos

Tinciones especiales:

- Tincin negativa

- Tinciones fluorescentes

- Tincin de auramina-rodamina

- Tincin con naranja de acridina

Tinciones simples Las tinciones simples se utilizan para observar la morfologa y el agrupamiento

bacterianos. Cualquier colorante es vlido para este tipo de tincin, aunque los ms

utilizados habitualmente son:

- Azul de metileno

- Cristal violeta

- Fucsina

El mtodo para realizar una tincin simple es bien sencillo:

1) hacer un frotis sobre un porta, secar y fijar,

2) cubrir la preparacin con el colorante elegido, durante el tiempo especificado,

3) lavar con agua, arrastrando todo el exceso de colorante,

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4) secar al aire o al calor suave,

5) observar al microscopio a 1000x con objetivo de inmersin (y aceite)

Las bacterias se vern teidas del mismo color que el colorante que se utiliz.

Tinciones diferenciales Se utilizan para poner de manifiesto diferencias estructurales entre bacterias

Tincin de Gram:

Es la coloracin diferencial ms utilizada en Microbiologa, ya que diferencia a

las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas, segn retengan o

no el cristal violeta utilizado en la tincin.

Prcticamente todos los autores estn de acuerdo en utilizar esta tincin como

primer paso en la identificacin bacteriana. Su importancia reside en que una incorrecta

interpretacin puede hacer variar el nmero de pruebas subsiguientes destinadas a

efectuar la identificacin, alejndonos considerablemente del gnero y especie

verdaderos.

El fundamento de esta tincin se basa en la incapacidad de las bacterias Gram

negativas para retener el cristal violeta cuando son decoloradas por una mezcla de

alcohol y acetona. Las bacterias Gram positivas, que no son decoloradas por el alcohol

acetona, retienen el colorante inicial (cristal violeta) y mostrarn esa coloracin al final

de la tcnica. Las bacterias Gram negativas cogern el segundo colorante (safranina) y

se mostrarn como bacterias de color rojo.

Resultados:

Bacterias Gram positivas: se vern de color violeta o azul intenso.

Bacterias Gram negativas: se observarn de color rojo.

Observaciones:

El lugol se utiliza como mordiente (no como colorante), para favorecer la

retencin del cristal violeta por parte de las bacterias Gram positivas.

Los cultivos viejos (ms de 24 horas) pueden hacerse ms sensibles a la

decoloracin, pudiendo aparecer como Gram negativas bacterias que no lo son.

Tincin de Ziehl Neelsen

Se utiliza para objetivar la presencia de bacilos cido-alcohol resistentes en una

muestra o preparacin.

El mtodo utiliza un procedimiento similar al de la tincin de Gram, es decir:

coloracin inicial, decoloracin y adicin de un contracolorante o colorante de

contraste.

Tras la preparacin del frotis, secado y fijacin se procede como sigue:

1. Cubrir la preparacin totalmente con carbol-fucsina o fucsina fenicada

2. Calentar la preparacin hasta la emisin de vapores tres veces, dejando que se enfre.

3. Lavar y decolorar con alcohol clorhdrico al 3% hasta que no suelte ms colorante

rojo.

4. Lavar y cubrir con azul de metileno durante unos minutos.

5. Lavar, secar y observar con objetivo de inmersin.

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Las bacterias cido alcohol resistentes quedan teidas de rojo y las que no lo

son, de azul.

Tincin de Tan-Thiam-Hok

Esta coloracin permite una tincin ms rpida que el clsico procedimiento de

Ziehl-Neelsen y evita la necesidad de calentamiento.

El resultado es el mismo que en la tincin anterior, observndose los

microorganismos cido alcohol resistentes de color rojo.

Los reactivos son: solucin de Kinyoun (fucsina fenicada en etanol) y solucin de

Gabett (azul de metileno)

Tinciones estructurales

Tincin de esporas

Se realizan para poner de manifiesto las formas de resistencia de las bacterias

(esporas) y su localizacin en la clula.

Suelen utilizarse colorantes muy concentrados y tincin forzada por

calentamiento hasta emisin de vapores.

Uno de los mtodos ms utilizados es el mtodo de Wirtz o del verde de

malaquita, que consiste en la utilizacin de este colorante en caliente hasta emisin de

vapores durante unos 8 minutos, lavar con agua destilada, y posterior utilizacin de

fucsina diluida (o solucin acuosa de safranina) como contracolorante durante 30

segundos.

Tras la tincin las esporas, si existen, se observan de color verde, mientras que

las formas vegetativas aparecen de color rojo.

Tincin de flagelos

La observacin de flagelos en preparaciones teidas es muy difcil, debido a que

se retraen con mucha facilidad y se adhieren a la pared celular.

Se deben utilizar cultivos jvenes (de menos de 24 horas), sembrados en agar

semislido, emplendose tcnicas que engruesan los flagelos para facilitar su

observacin.

Tras la realizacin de la delicada tcnica (extensin por inclinacin -sin asa-,

secado sin calor, fijacin con vapores de xido de osmio, y se cubre con solucin de

nitrato de plata amoniacal) los flagelos aparecen visibles al microscopio debido al

precipitado de plata formado a su alrededor.

Tincin de cpsulas

La cpsula es una capa gelatinosa, de espesor variable, situada alrededor de la

pared celular bacteriana. Como es difcil teirlas, se consiguen mejores resultados

utilizando mtodos que, coloreando el fondo de la preparacin y el microorganismo,

hacen resaltar las cpsulas sin teir.

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El mtodo ms utilizado es el de Burri o de la tinta china, en el que se tien

primero los microorganismos con fucsina diluida y posteriormente se cubre la

preparacin con tinta china.

Tras el procedimiento de tincin, se observan sobre un fondo negro los

microorganismos teidos de rojo y la cpsula como un halo blanco que los rodea.

Tincin de corpsculos metacromticos:

Los corpsculos metacromticos son grnulos de reserva de fosfato del

microorganismo, que al teirlos dan el color complementario al colorante utilizado.

Solo aparecen en el gnero Corynebacterium.

Se utilizan varios mtodos para su visualizacin (Neisser, Loeffler y Albert),

dependiendo el resultado final del mtodo utilizado.

Tinciones especiales

Tincin negativa:

Es una tcnica intermedia entre las tinciones propiamente dichas y la

observacin en fresco, ya que carece de las etapas de fijacin y coloracin. Se utiliza,

sobre todo, para estudios de tipo morfolgico.

Tras la tincin con nigrosina, los microorganismos aparecen incoloros sobre un

fondo negro.

Tincin de auramina -rodamina

Estos dos fluorocromos se fijan selectivamente sobre el cido miclico de la

pared celular de las micobacterias, por lo que la investigacin de stas es su principal

aplicacin.

Tras la tincin, los microorganismos aparecen como puntos amarillos o amarillo-

verdosos brillantes sobre fondo negro.

Es una tincin equivalente a la de Ziehl-Neelsen, aunque mucho ms sensible y

especfica.

Tincin de naranja de acridina:

Se basa en la tincin selectiva y diferencial de los cidos nucleicos por parte del

fluorocromo naranja de acridina. Se utiliza en la investigacin de muestras con escaso

nmero de microorganismos.

Tras la tincin, los microorganismos se observan con un color rojo-anaranjado,

mientras que otras clulas o restos de tejidos presentes en la muestra aparecen con una

fluorescencia amarillo-verdosa.

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C. Estudio de la movilidad bacteriana.

Las bacterias pueden tener la capacidad de desplazarse en suspensiones lquidas

gracias a los flagelos.

La observacin de esta caracterstica puede ser muy importante en el proceso de

identificacin bacteriana.

El estudio de la movilidad realizado mediante la observacin entre porta y cubre

de una gota de caldo de cultivo de varias horas de crecimiento puede inducir a error al

confundir el movimiento bacteriano con el "arrastre" de bacterias que se produce por las

corrientes lquidas que se generan hasta que se equilibra el componente lquido entre

porta y cubre.

Tcnica de la gota pendiente: La tcnica de la gota pendiente consiste en la observacin de una pequea

cantidad de suspensin de microorganismos en fase de crecimiento exponencial en

medio lquido, pero exenta de las fluctuaciones provocadas por las corrientes lquidas

que se generan entre porta y cubre.

Para la realizacin de la tcnica de observacin mediante el mtodo de la gota

pendiente, se utilizan unos portas especiales con una o dos excavaciones que permiten

colocar un cubreobjetos invertido del que pende una pequea gota de la suspensin

bacteriana que vamos a observar.

El tamao de la gota debe ser lo suficientemente pequeo como para evitar su

contacto con el porta y lo suficientemente grande para evitar una rpida desecacin

durante el tiempo de observacin.

Es importante saber diferenciar el movimiento browniano de partculas en

suspensin con el movimiento real producido por los microorganismos.

Las repetidas observaciones prcticas de diferentes microorganismos os

permitirn distinguir perfectamente estos movimientos.