USO DE VIRUS RECOMBINANTES PARA LA SALUD E INVESTIGACIÓN

BIOPROCESOS?

Horario: Martes 9h30 a 11h30 Teoría Algún día Práctica

Mayo 27 y Junio 3, 2008

Prueba

1. Qué entiene por “Helper virus”?2. Según los artículos, Qué se entiende por tag

genético?3. Qué tipo de promotor se utiliza para producir el

ARN viral y por qué?4. Qué es una ribozima y para qué se utiliza?5. Además del ARN viral, qué se necesita producir

para qué el rescate de influenza sea posible?

Receptor

vARN (-)

cARN (+)

mARN

mARN

Citoplasma

Núcleo

Ciclo de replicación del virus de Influenza

Polymerase Genes transcribed

RNA polymerase I 28S, 5.8S and 18S ribosomal RNA (rRNA) genes

RNA polymerase II Protein-coding genes; most small nuclear RNA (snRNA) genes

RNA polymerase III Genes for transfer RNAs (tRNA), 5S rRNA, U6-snRNA, small nucleolar (sno) RNAs, small cytoplasmic (sc) RNA

Funciones de las polimerasas de ARN eucarióticas

UCGUUUUCGUCCNNN UUUUUNNNGGAACAAAGAUGA3’ 5’

SECUENCIAS NO-CODIFICADORAS CONSERVADAS DE INFLUENZA A

A

UG

AG A

AAC

A AGGNNN UU

U U U

UCCNNNGCU

UUUGC

U

5’

3’

MODELO DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE LOS GENES DE INFLUENZA A

1 agcaaaagca ggggtataat ctgtcaaaat ggagaaaaca gtgcttcttc ttgcaatagt 61 cagccttgtt aaaagtgatc agatttgcat tggttaccat gcaaacaact cgacagagca 121 ggttgacaca ataatggaaa agaacgttac tgttacacat gcccaagaca tcctggaaaa 181 gacacacaac gggaagctct gcgatctaga tggagtgaag cctctgattt taagagattg 241 tagtgtagct ggatggctcc tcggaaaccc aatgtgtgac gaattcatca atgtgccgga 301 atggtcttac atagtggaga aagccaatcc agccaatgac ctctgttacc cagggaattt 361 caacgactat gaagaactga aacacctatt gagcagaata aaccattttg agaaaattca 421 gatcatcccc aaaagttctt ggtccgatca tgaagcctca tcaggggtga gctcagcatg 481 tccataccag ggaagttcct cctttttcag gaatgtggta tggcttatca aaaagaacga 541 tgcataccca acaataaaga gaagctacaa taataccaac caagaagatc ttttggtact 601 gtgggggatt caccatccta atgatgcggc agagcagaca aggctctatc aaaacccaac 661 cacctatatt tccgttggga catcaacact aaaccagaga ttggtaccaa aaatagctac 721 tagatccaaa gtaaacgggc aaagtggaag gatggatttc ttctggacaa ttttaaaacc 781 gaatgatgca atcaacttcg agagtaatgg aaatttcatt gctccagaat atgcatacaa 841 aattgtcaag aaaggagact cagcaattat gaaaagtgaa gtggaatatg gtaactgcaa 901 caccaagtgt caaactccaa tgggggcgat aaactctagt atgccattcc acaacataca 961 ccctctcacc atcggggaat gtcccaaata tgtgaagtca aacaaattag tccttgcgac 1021 tgggctcaga aatagccctc aaagagagag aagaagaaaa agaggactat ttggagctat 1081 agcaggtttt atagagggag gatggcaggg aatggtagat ggttggtatg ggtaccacca 1141 tagcaatgag caggggagtg ggtacgctgc agacaaagaa tccactcaaa aggcaataga 1201 tggagtcacc aataaggtca actcgatcat tgacaaaatg aacactcagt ttgaggccgt 1261 tggaagggaa tttaataact tagaaaggag aatagagaat ttaaacaaga agatggaaga 1321 cggattccta gatgtctgga cttataatgc tgaacttctg gttctcatgg aaaatgagag 1381 aactctagac ttccatgact caaatgtcaa gaacctttac gacaaggtcc gactacagct 1441 tagggataat gcaaaggagc tgggtaacgg ttgtttcgag ttctatcaca aatgtgataa 1501 tgaatgtatg gaaagtgtaa gaaacggaac gtatgactac ccgcagtatt cagaagaagc 1561 aagattaaaa agagaagaaa taagtggagt aaaattggaa tcaataggaa cttaccaaat 1621 actgtcaatt tattcaacag tggcgagttc cctagcactg gcaatcatgg tggctggtct 1681 atctttatgg atgtgctcca atgggtcgtt acaatgcaga atttgcattt aaatttgtga 1741 gttcagattg tagttaaaaa cacccttgtt tctact

Hemaglutinina de influenza A H5N1

Gen: 1..1776CDS: 29..1732

A

UG

AG A

AAC

AAGGNNN U

UU U U

UCCNNNGCU

UUU

GC

U

5’

3’

1 caaaagcagg gtagataatc actcactgag tgacatcaaa gtcatggcgt cccaaggcac 61 caaacggtct tacgaacaga tggagactga tggggaacgc cagaatgcaa ctgaaatcag 121 agcatccgtt ggaaaaatga ttggtggaat tgggcgattc tacatccaaa tgtgcaccga 181 gcttaaactc aacgatcatg agggaagact gatccagaac agcttaacaa tagagagaat 241 ggtgctctct gcttttgacg agaggaggaa taaatatctg gaagaacatc ccagcgcagg 301 gaaagatcct aagaaaactg gaggacccat ctacaggaga gtagatggaa agtgggtgag 361 ggaactcgtc ctttatgaca aagaagaagt aaggcgaatt tggcgccaag ccaacaatgg 421 tgatgatgca acggctggtt tgactcacat tatgatctgg cattccaatt tgaatgatac 481 aacttatcag aggacaagag ctcttgtccg caccgggttg gatcccagga tgtgctcttt 541 gatgcagggt tcaacccttc ctaggagatc tggagcagca ggcgctgcag tcaaaggagt 601 tggaacaatg gtgctggagt tgatcaggat gatcaaacgt gggatcaatg atcgaaattt 661 ctggaggggt gagaatggaa gaaaaaccag gattgcttat gagagaatgt gcaatatcct 721 caaagggaaa tttcaaacag ctgcacaaag agctatgatg gatcaagtga gagaaagccg 781 aaacccaggg aatgctgaga tcgaagatct cacctttctg gcacggtctg cactcatatt 841 gagaggatca gttgctcaca agtcttgtct gcctgcctgt gtgtatggac ctgccgtagc 901 cagtgggtac gacttcgaaa aagagggata ctctttggta gggatagacc ctttcaaact 961 gcttcaaacc agccaagtat atagcctaat cagaccaaac gagaatcccg cacacaagag 1021 tcagttggtg tggatggcat gcaattctgc tgcatttgaa gacctaagag tgtcgagctt 1081 catcagaggg acaagagtgc ttccaagggg gaagctctct actagaggag tacaaattgc 1141 ttcaaatgaa aacatggatt ctattgtatc aagtactctt gaactgagaa gcaggtactg 1201 ggccataaga accagaagtg gaggaaacac taatcaacaa aaagcctctg cgggccaaat 1261 cagtatacaa cctacgtttt ctgtgcagag aaacctccca tttgacaaaa caaccatcat 1321 ggcagcattc actgggaatg cggagggaag aacatcagac atgagggcag aaatcataaa 1381 aatgatggaa agtgcaagac cagaagaagt gtccttccag gggaggggag tcttcgagct 1441 ctcggacgaa agggcaacga acccgatcgt gccctccttt gacatgagta atgaaggatc 1501 ttatttcttc ggagacaatg cagaggagta cgacaattaa tgaaaaatac ccttgtttct 1561 act

CDS: 44..1540

Nucleoproteína de influenza A humana H1H1

A

UG

AG A

AAC

AAGGNNN U

UU U U

UCCNNNGCU

UUU

GC

U

5’

3’

Recognition Site BsmBI:

5’…CGTCTC (N)1…3’3’ GCAGAG (N)5…5’

Acumulación de aminoácidos básicos en el sitio de corte de la HA en el brote epidémico de IA en Méjico 1994-1995

Horimoto et al., Virology (1995) 213: 223-230

Azul: HA1Rojo: HA2

1 agcaaaagca ggggtataat ctgtcaaaAT Ggagaaaaca gtgcttcttc ttgcaatagt 61 cagccttgtt aaaagtgatc agatttgcat tggttaccat gcaaacaact cgacagagca 121 ggttgacaca ataatggaaa agaacgttac tgttacacat gcccaagaca tcctggaaaa 181 gacacacaac gggaagctct gcgatctaga tggagtgaag cctctgattt taagagattg 241 tagtgtagct ggatggctcc tcggaaaccc aatgtgtgac gaattcatca atgtgccgga 301 atggtcttac atagtggaga aagccaatcc agccaatgac ctctgttacc cagggaattt 361 caacgactat gaagaactga aacacctatt gagcagaata aaccattttg agaaaattca 421 gatcatcccc aaaagttctt ggtccgatca tgaagcctca tcaggggtga gctcagcatg 481 tccataccag ggaagttcct cctttttcag gaatgtggta tggcttatca aaaagaacga 541 tgcataccca acaataaaga gaagctacaa taataccaac caagaagatc ttttggtact 601 gtgggggatt caccatccta atgatgcggc agagcagaca aggctctatc aaaacccaac 661 cacctatatt tccgttggga catcaacact aaaccagaga ttggtaccaa aaatagctac 721 tagatccaaa gtaaacgggc aaagtggaag gatggatttc ttctggacaa ttttaaaacc 781 gaatgatgca atcaacttcg agagtaatgg aaatttcatt gctccagaat atgcatacaa 841 aattgtcaag aaaggagact cagcaattat gaaaagtgaa gtggaatatg gtaactgcaa 901 caccaagtgt caaactccaa tgggggcgat aaactctagt atgccattcc acaacataca 961 ccctctcacc atcggggaat gtcccaaata tgtgaagtca aacaaattag tccttgcgac

P Q R E R R R K R G 1021 tgggctcaga aatagcCCTC AAAGAGAGAG AAGAAGAAAA AGAGGActat ttggagctat 1081 agcaggtttt atagagggag gatggcaggg aatggtagat ggttggtatg ggtaccacca 1141 tagcaatgag caggggagtg ggtacgctgc agacaaagaa tccactcaaa aggcaataga 1201 tggagtcacc aataaggtca actcgatcat tgacaaaatg aacactcagt ttgaggccgt 1261 tggaagggaa tttaataact tagaaaggag aatagagaat ttaaacaaga agatggaaga 1321 cggattccta gatgtctgga cttataatgc tgaacttctg gttctcatgg aaaatgagag 1381 aactctagac ttccatgact caaatgtcaa gaacctttac gacaaggtcc gactacagct 1441 tagggataat gcaaaggagc tgggtaacgg ttgtttcgag ttctatcaca aatgtgataa 1501 tgaatgtatg gaaagtgtaa gaaacggaac gtatgactac ccgcagtatt cagaagaagc 1561 aagattaaaa agagaagaaa taagtggagt aaaattggaa tcaataggaa cttaccaaat 1621 actgtcaatt tattcaacag tggcgagttc cctagcactg gcaatcatgg tggctggtct 1681 atctttatgg atgtgctcca atgggtcgtt acaatgcaga atttgcattT AAatttgtga 1741 gttcagattg tagttaaaaa cacccttgtt tctact

Secuencia del gen hemaglutinina de influenza A H5N1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html

P Q R E R R R K R GNNNNCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAGAGGANNNNNNNNNGGAGTTTCTCTCTCTTCTTCTTTTTCTCCTNNNNN

Cambio de aminoácidos básicos del gen HA de influenza A de alta patogenia (H5N1 )

P Q A E A A A A A GNNNNCCTCAAGCTGAGGCCGCAGCAGCTGCTGGANNNNNNNNNGGAGTTCGACTCCGGCGTCGTCGACGACCTNNNNN

P Q R E T R GNNNNCCTCAA AGAGAGACCAGAGGANNNNNNNNNGGAGTT TCTCTCTGGTCTCCTNNNNN

Mutación usando “overlapping primers”

P Q R E R R R K R GGCTCAGAAATAGC CCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAGAGGA CTATTTGGAGCTAT

P Q R E T R GGCTCAGAAATAGC CCTCAA--------------------AGAGAGAAAAGAGGA CTATTTGGAGCTAT

Recognition Site Sap I:

5’…GCTC TTC (N)1…3’3’ CGAGAAG (N)4…5’

5’…TCCGAAGTTGGGGGGGA AGGCTTCAACCCCCCCT

AGCAAAAGCA…TGT TTC TACTT CGTTT TCGT… ACAAAGATGA

AATAACCCGGCGGCC…3’ TTATTGGGCCGCCGG

tI PIHA

Cómo debió estar incorporado el sitio Sap I entre entre el terminador y promotor Pol I, así como en el gene HA para que la clonación en el plásmido ambisense luzca como se indica abajo