UNIVERSIDAD TÉCNICA ESTATAL DE QUEVEDO FACULTAD...
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i UNIVERSIDAD TÉCNICA ESTATAL DE QUEVEDO FACULTAD CIENCIAS AGRARIAS CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA Proyecto de investigación previo a la obtención del título de Ingeniera Agrónoma TÍTULO DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN: Sobrevivencia del agente causal de la moniliasis (Moniliophthora roreri) en almendras de cacao durante el proceso de postcosecha AUTORA Jenniffer Alexandra Tigselema Ramírez DIRECTOR DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Ing. Agron. Freddy Amores Puyutaxi. Quevedo - Los Ríos - Ecuador 2019
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i
UNIVERSIDAD TÉCNICA ESTATAL DE QUEVEDO
FACULTAD CIENCIAS AGRARIAS CARRERA DE
INGENIERÍA AGRONÓMICA
Proyecto de investigación previo a
la obtención del título de Ingeniera
Agrónoma
TÍTULO DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN:
Sobrevivencia del agente causal de la moniliasis (Moniliophthora roreri) en
almendras de cacao durante el proceso de postcosecha
AUTORA
Jenniffer Alexandra Tigselema Ramírez
DIRECTOR DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
Ing. Agron. Freddy Amores Puyutaxi.
Quevedo - Los Ríos - Ecuador
2019
ii
DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS
Yo, Jenniffer Alexandra Tigselema Ramírez, declaro que el trabajo de investigación
aquí descrito es de mi autoría; que no ha sido previamente presentado para ningún grado o
calificación profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas que se
incluyen en este documento.
La Universidad Técnica Estatal de Quevedo, puede hacer uso de los derechos
correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de Propiedad Intelectual,
por su Reglamento y por la normativa institucional vigente.
Atentamente,
____________________________________
Jenniffer Alexandra Tigselema Ramírez
C.I.: 1205647116
iii
CERTIFICACIÓN DE CULMINACIÓN DEL PROYECTO
DE INVESTIGACIÓN
El suscrito Ing. Agr. Freddy Amores Puyutaxi MSc., Docente de la Universidad Técnica
Estatal de Quevedo, certifica que la estudiante Jenniffer Alexandra Tigselema Ramírez,
realizó el Proyecto de Investigación titulado “Sobrevivencia del agente causal de la
moniliasis (Moniliophthora roreri) en almendras de cacao durante el proceso de
postcosecha”, previo a la obtención del título de Ingeniera Agrónoma, bajo mi dirección,
habiendo cumplido con las disposiciones reglamentarias establecidas para el efecto.
Atentamente,
________________________________________
Ing. Agr. Freddy Amores Puyutaxi MSc.
Director del Proyecto de Investigación
iv
CERTIFICADO DEL REPORTE DE LA HERRRAMIENTA
DE PREVENCIÓN DE COINCIDENCIA Y/O PLAGIO
ACADÉMICO
_____________________________________
Ing. Agr. Freddy Amores Puyutaxi MSc.
Director del Proyecto de Investigación
v
CERTIFICADO DE APROBACIÓN
UNIVERSIDAD TÉCNICA ESTATAL DE QUEVEDO
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA DE
INGENIERÍA AGRONÓMICADE
INVESTIGACIÓN
TÍTULO DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
¨Sobrevivencia del agente causal de la moniliasis (Moniliophthora roreri) en almendras de
cacao durante el proceso de postcosecha¨
Presentado a la Comisión Académica como requisito previo a la obtención del título de
Ingeniera Agrónoma.
Aprobado por:
______________________________________
PRESIDENTE DEL TRIBUNAL
Dra. Silvia Saucedo Aguiar
Quevedo – Los Ríos – Ecuador
2019
____________________________
MIEMBRO DEL TRIBUNAL
Dr. Fernando Abasolo Pacheco
____________________________
MIEMBRO DEL TRIBUNAL
Dr. Favio Herrera Eguez
L TRIBUNAL
Dr. Favio Herrera Eguez
vi
AGRADECIMIENTO
Al terminar mi investigación quiero expresar mi más sentido agradecimiento a Dios quien
con sabiduría y amor ha guiado mis pasos en este largo camino.
Gracias a mis padres por ser los principales promotores de mis sueños, gracias a ellos por
cada día confiar y creer en mí y en mis expectativas. Gracias, porque en todo momento han
apoyado y respetado mis decisiones, por sacrificarse para hacer de mí una mujer de
provecho a la sociedad, por el impulso que me brindaron en los momentos más difíciles
de mi carrera, por ayudarme a vencer obstáculos, porque hoy recibo una de sus más
valiosas herencias que es mi profesión. Por ustedes la obtuve y a ustedes se las brindo.
Además quiero dejar en constancia mi gratitud a la institución y personas que me apoyaron:
A la Universidad Técnica Estatal de Quevedo por las oportunidades y facilidades brindadas
en el transcurso de mis estudios para optar con el título de Ingeniera Agrónoma.
Al Ing. Agro. Rafael Zambrano quien prestó las instalaciones de su lugar de trabajo en
Exportadora de cacao Ecuatoriano ¨CASACAO¨ donde se desarrolló parte de la
investigación.
A mi director de tesis el Ing Agro. Freddy Amores Puyutaxi MSc, por su apoyo y
estimulación en el transcurso de este trabajo de investigación.
A la PhD. Carmita Suarez Capello por cada detalle y momento dedicado para aclarar
cualquier tipo de duda, por brindarme sus consejos, compromiso y apoyo, que con sus
sabias enseñanzas y sugerencias, fortaleció mis conocimientos para la culminación de este
proyecto de investigación.
A los docentes Ing. Agro. Ignacio Sotomayor, Dr. Daniel Vera y Econ. Flavio Ramos
gracias por sus valiosos aportes, paciencia, orientación y por la invalorable dirección
técnica durante el proceso de esta investigación.
vii
DEDICATORIA
La presente investigación se la dedico con todo
mi amor y cariño a Dios y a mis Padres. A Dios
por sostenerme siempre en mis luchas diarias.
A mis padres por su sacrificio y esfuerzo, que
aunque hemos pasado momentos difíciles
siempre han estado brindándome su
comprensión, cariño y amor, han sido mi
instrumento de fortaleza y sabiduría para lograr
este triunfo.
Jenniffer Tigselema
viii
RESUMEN
La moniliasis causada por el hongo M. roreri es una de las enfermedades que presenta
mayor impacto económico y que causa grandes pérdidas, ocasionando daños únicamente a
los frutos de cacao. Existe el temor que el movimiento de material con o sin procesos
postcosecha pueda transmitir M. roreri. Si bien existen muchos estudios de procesos de
postcosecha de cacao no se encuentran referencias específicas en cuanto al riesgo que
pudiera existir en mover estas masas de cacao a sitios libres de esta enfermedad. Este
estudio tiene como objetivo establecer el crecimiento y sobrevivencia del agente causal de
la moniliasis en almendras de cacao. Para la presente investigación se aplicó el diseño
completamente al azar (DCA), y se realizó en dos fases, la primera consistió en un estado
de laboratorio para evaluar el comportamiento de M. roreri en condiciones diferentes de
temperaturas y se llevó a cabo en el laboratorio de Microbiología y Biología Molecular de
la Universidad Técnica Estatal de Quevedo (UTEQ), localizado en el Campo Universitario
¨Manuel Haz Álvarez¨ ubicado en el km 1.5 vía Quevedo- Santo Domingo. La segunda
fase tuvo lugar en las instalaciones La Nueva Casa Del Cacao S.A, Exportadora de cacao
Ecuatoriano ¨CASACAO¨ ubicado en Km 2 ½ Vía Valencia, para evaluar el
comportamiento del organismo durante el proceso de fermentación y secado. Se realizó un
análisis descriptivo debido a los resultados obtenidos de los tres experimentos donde M.
roreri no creció ni se desarrolló en temperaturas altas ni durante el proceso de postcosecha,
concluyendo que M. roreri no sobrevive a temperaturas superiores a 30 °C en condiciones
de laboratorio. M. roreri no sobrevivió al proceso de fermentación, aplicando el
método de incorporar colonias del hongo a un proceso de micro fermentación. No se
consiguió aislar M. roreri de almendras en proceso de secado natural (en tendal de
cemento) o artificial, con niveles de humedad inferiores al 55%.
Palabras claves: Moniliasis, micro fermentación, temperaturas
ix
ABSTRACT
The moniliasis caused by the fungus M. roreri is one of the diseases that has the greatest
economic impact and causes great losses, causing damage to the fruits of cocoa. There is
the fear that the movement of material with or without post-harvest processes may transmit
M. roreri. Although there are many studies on cocoa postharvest processes, no specific
references are found regarding the risk that could exist in moving these cocoa masses to
sites free of this disease. The objective of this study is to establish the growth and survival
of the causal agent of moniliasis in cocoa almonds. For the present investigation the
completely randomized design (CRD) was applied, and it was carried out in two phases,
the first consisted of a laboratory state to evaluate the behavior of M. roreri in different
temperature conditions and was carried out in the laboratory of Microbiology and
Molecular Biology of the State Technical University of Quevedo (UTEQ), located in the
"Manuel Haz Álvarez" University Campus located at km 1.5 via Quevedo-Santo Domingo.
The second phase took place at the facilities of La Nueva Casa Del Cacao SA, Ecuadorian
cocoa exporter ¨CASACAO¨ located at Km 2 ½ Vía Valencia, to evaluate the behavior of
the organism during fermentation and the drying process. A descriptive analysis was made
due to the results obtained from the three experiments in which M. roreri did not grow or
develop at high temperatures or during the postharvest process, concluding that M. roreri
does not survive at temperatures above 30 ° C in laboratory conditions. M. roreri did not
survive the fermentation process, applying the method of incorporating colonies of the
fungus into a micro fermentation process. It was not possible to isolate M. roreri from
almonds in the process of natural (cement-based) drying or artificial drying, with humidity
levels below 55%.
Keywords: Moniliasis, micro Fermentation, temperatures.
x
ÍNDICE GENERAL
DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS ......................................... ii
CERTIFICACIÓN DE CULMINACIÓN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN ....... iii
CERTIFICADO DEL REPORTE DE LA HERRRAMIENTA DE PREVENCIÓN
DE COINCIDENCIA Y/O PLAGIO ACADÉMICO .......................................................... iv
CERTIFICADO DE APROBACIÓN ................................................................................... v
AGRADECIMIENTO .......................................................................................................... vi
DEDICATORIA .................................................................................................................. vii
RESUMEN ......................................................................................................................... viii
ABSTRACT ......................................................................................................................... ix
ÍNDICE DE FIGURAS ...................................................................................................... xiii
ÍNDICE DE ANEXOS ....................................................................................................... xiv
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 1
CAPÍTULO I. CONTEXTUALIZACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN
1.1. Problema de investigación ........................................................................................ 4
1.1.1. Planteamiento del problema ...................................................................................... 4
1.1.2. Formulación del problema ......................................................................................... 4
1.1.3. Sistematización del Problema ................................................................................... 4
1.2. Objetivos ................................................................................................................... 4
1.2.1. Objetivo general ........................................................................................................ 4
1.2.2. Objetivos específicos ................................................................................................. 5
1.3. Justificación .............................................................................................................. 6
CAPÍTULO II. FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA DE LA INVESTIGACIÓN
2.1. Marco Conceptual .................................................................................................... 8
2.1.1. Generalidades del cacao ........................................................................................... 8
2.1.2. Enfermedades del cultivo de cacao .......................................................................... 9
xi
2.1.3. Moniliasis ............................................................................................................ 9
2.1.3.1. Taxonomía ......................................................................................................... 10
2.1.3.2. Condiciones favorables...................................................................................... 10
2.1.3.3. Transmisión ....................................................................................................... 10
2.1.3.4. Morfología ......................................................................................................... 10
2.1.3.5. Sintomatología ................................................................................................... 11
2.1.3.6. Ciclo de vida ...................................................................................................... 12
2.1.4. Buenas prácticas de postcosecha ...................................................................... 13
2.1.4.1. Fermentación ..................................................................................................... 14
2.1.4.1.1. Tipos de fermentación ....................................................................................... 15
2.1.4.2. Secado ................................................................................................................ 17
2.1.4.2.1. Secado natural ................................................................................................... 17
2.1.4.2.2. Secado artificial ................................................................................................. 18
CAPÍTULO III. METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
3.1. Localización del experimento ............................................................................ 20
3.2. Tipo de investigación......................................................................................... 20
3.3. Métodos de la investigación .............................................................................. 20
3.3.1. Efecto de la temperatura sobre la sobrevivencia de M. roreri........................... 20
3.3.1.1. Desarrollo del experimento: .............................................................................. 21
3.3.1.2. Procedimiento del experimento: ........................................................................ 21
3.3.2. Sobrevivencia de M. roreri durante el proceso de fermentación. .................... 22
3.3.2.1. Desarrollo del experimento .............................................................................. 22
3.3.2.2. Procedimiento del experimento: ....................................................................... 23
3.3.3. Evaluación del porcentaje mínimo de humedad que soporta M. roreri en el
proceso de secado. ............................................................................................ 24
3.3.3.1. Desarrollo del experimento .............................................................................. 24
3.3.3.2. Procedimiento del experimento: ....................................................................... 25
3.4. Análisis de los datos ......................................................................................... 25
xii
3.5. Fuentes de información primaria y secundaria ................................................ 25
3.6. Materiales y equipos del laboratorio ........................................................... 26
3.6.1. Reactivos ......................................................................................................... 26
CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. Resultados ....................................................................................................... 28
4.1.1. Evaluación del crecimiento y sobrevivencia de M. roreri a diferentes
niveles de temperaturas .................................................................................. 28
4.1.1.1. Crecimiento radial de M. roreri a diferentes temperaturas ........................... 28
4.1.2. Sobrevivencia de M. roreri durante el proceso de fermentación ................... 29
4.1.2.1. Características que presentó el proceso de micro fermentación y
comportamiento de M. roreri ......................................................................... 29
4.1.3. Sobrevivencia de M. roreri en función del contenido de humedad de la
masa de almendras durante el proceso de secado. ......................................... 30
4.2. Discusión ........................................................................................................ 31
CAPÍTULO V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1. Conclusiones ................................................................................................... 34
5.2. Recomendaciones ........................................................................................... 35
CAPÍTULO VI. BIBLIOGRAFÍA
6.1. Bibliografía ..................................................................................................... 37
CAPITULO VII. ANEXOS
7.1. Anexos .......................................................................................................... 43
xiii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Crecimiento radial de Moniliophthora roreri. A, temperatura 27 °C; B,
temperatura 30 °C; C, temperatura 40 °C; D, temperatura 50 °C; E,
temperatura 55 °C. .............................................................................................. 28
Figura 2. Aspecto de las muestras sembradas en medio de cultivo recolectadas
durante el proceso de micro fermentación. A, 24 horas; B, 48 horas; C, 72
horas; D, 96 horas; E, 120 horas; F, 144 horas. .................................................. 29
Figura 3. Muestras de cacao con diferentes niveles de porcentajes de humedad. A,
muestras de cacao a 55 % de humedad; B, muestras de cacao a 27 % de
humedad; C, muestras de cacao a 24 % de humedad; D, muestras de cacao a
20 % de humedad E, muestras de cacao a 7 % de humedad………………
Figura 4. Preparación de cajas petri con medio y siembra de monilia ............................... ..43
Figura 5. Incubadora de laboratorio ..................................................................................... 43
Figura 6. crecimiento de M. roreri a temperatura ambiente ................................................. 43
Figura 7. M. roreri a diferentes niveles de temperatura ....................................................... 43
Figura 8. Medio de cultivo PDA ......................................................................................... 44
Figura 9. Preparación de la muestras de avena ..................................................................... 44
Figura 10. Inoculación de M. roreri.en semillas de avena ................................................... 44
Figura 11. 20 días de inoculación de M. roreri en semillas de avena .................................. 44
Figura 12. Cajones fermentadores cubiertos con hojas de bijao .......................................... 45
Figura 13. Moños de gasas con avena inoculada de M.roreri .............................................. 45
Figura 14. Muestras colocadas en la masa de cacao............................................................. 45
Figura 15. Toma de temperatura de la masa de cacao .......................................................... 45
Figura 16. Bandas de pH ..................................................................................................... 45
Figura 17. Muestra recolectadas del proceso de fermentación ............................................. 45
Figura 18. Siembra de las muestras ...................................................................................... 45
Figura 19. Resultados de las muestras a los 5 días .............................................................. 46
Figura 20. Preparación de PDA ............................................................................................ 46
Figura 21. Recolección de las muestras de almendras secas ................................................ 46
…...30
xiv
Figura 22. Humidímetro de humedad wile ........................................................................... 46
Figura 23. Siembra de las muestras ..................................................................................... 47
Figura 24. Resultado de las muestras/ 10 días ..................................................................... 47
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Proceso de incubación de M. roreri a diferentes rangos de temperaturas. ....... 46
Anexo 2. Proceso de inoculación de M. roreri en avena. ............................................... 47
Anexo 3. Preparación de muestras para el proceso de micro fermentación. ................... 47
Anexo 4. Recolección, siembra y resultados de las muestras en micro fermentación. .... 48
Anexo 5. Preparación de medio (PDA) y recolección de muestras de almendras
de cacao seco
Anexo 6. Siembra de las muestras de las almendras de cacao. ....................................... 49
49 …………………………………………………………………
xv
CÓDIGO DUBLÍN
Título: Sobrevivencia del agente causal de la moniliasis (Moniliophthora
roreri) en almendras de cacao durante el proceso de postcosecha.
Autora: Jenniffer Alexandra Tigselema Ramírez
Fecha de
publicación
Editorial Quevedo: UTEQ 2019
Palabras clave: Moniliasis Micro
fermentación Temperatura
Resumen:
La moniliasis causada por el hongo M. roreri es una de las
enfermedades que presenta mayor impacto económico y que causa
grandes pérdidas, ocasionando daños únicamente a los frutos de
cacao. Existe el temor que el movimiento de material con o sin
procesos postcosecha pueda transmitir M. roreri. Si bien existen
muchos estudios de procesos de postcosecha de cacao no se
encuentran referencias específicas en cuanto al riesgo que pudiera
existir en mover estas masas de cacao a sitios libres de esta
enfermedad. Este estudio tiene como objetivo establecer el
crecimiento y sobrevivencia del agente causal de la moniliasis en
almendras de cacao. Para la presente investigación se aplicó el diseño
completamente al azar (DCA), y se realizó en dos fases, la primera
consistió en un estado de laboratorio para evaluar el comportamiento
de M. roreri en condiciones diferentes de temperaturas y se llevó a
cabo en el laboratorio de Microbiología y Biología Molecular de la
Universidad Técnica Estatal de Quevedo (UTEQ), localizado en el
Campo Universitario ¨Manuel Haz Álvarez¨ ubicado en el km 1.5 vía
Quevedo- Santo Domingo. La segunda fase tuvo lugar en las
instalaciones La Nueva Casa Del Cacao S.A, Exportadora de cacao
Ecuatoriano ¨CASACAO¨ ubicado en Km 2 ½ Vía Valencia, para
evaluar el comportamiento del organismo durante el proceso de
fermentación y secado. Se realizó un análisis descriptivo debido a los
resultados obtenidos de los tres experimentos donde M. roreri no
creció ni se desarrolló en temperaturas altas ni durante el proceso de
postcosecha, concluyendo que M. roreri no sobrevive a temperaturas
superiores a 30 °C en condiciones de laboratorio. M. roreri no
sobrevivió al proceso de fermentación, aplicando el método de
incorporar colonias del hongo a un proceso de micro fermentación.
No se consiguió aislar M. roreri de almendras en proceso de secado
natural (en tendal de cemento) o artificial, con niveles de humedad
inferiores al 55%.
Descripción: Hojas: dimensiones, 29 x 21 cm + CD-ROM 6162
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1
INTRODUCCIÓN
El cacao se caracteriza por ser unos de los rubros más importantes cultivados en todo el
país, producto indispensable para la alimentación humana, y gran parte es utilizado en
procesos agroindustriales en casi todas las regiones. Ecuador es uno de los países donde se
cultivan el cacao CCN-51 y el Cacao Nacional que es conocido como cacao fino de aroma.
El cacao ecuatoriano, sin duda alguna, es uno de los productos más reconocidos y
apetecidos a escala mundial, pese a la caída de los productos de exportación, Ecuador sigue
siendo el principal proveedor de cacao, con una cobertura del 60% del mercado. El cultivo
de cacao tiene gran importancia dentro de la economía del Ecuador, por tratarse de un
producto de exportación y materia prima para industrias locales de fabricación de
chocolate y sus derivados. Esto se traduce además en fuentes de trabajo para un alto
porcentaje de personas del campo y la ciudad.
Son varias las enfermedades que atacan al cultivo de cacao (Theobroma cacao) y una de
las que presenta mayor impacto económico y que causa grandes pérdidas es la moniliasis,
causada por el hongo Moniliophthora roreri, siendo este patógeno ejecutor de lesionar
únicamente a los frutos de cacao. Además, el país produce cacao de calidad única en el
mundo, debido a sus características organolépticas, sin embargo en las últimas décadas
estas características han sido afectadas debido al mal manejo post-cosecha.
La calidad de los granos de cacao depende en otros factores de la variedad y del proceso de
fermentación, etapa necesaria para inducir los cambios bioquímicos en el grano donde se
elaboran los inicios del aroma y sabor a chocolate. La falta de un tratamiento postcosecha
apropiado reduce la calidad de las almendras y en consecuencia el precio, a pesar que el
cacao ecuatoriano reúne genéticamente las características necesarias para desarrollar un
buen producto. La calidad es determinada por el mercado al que se vende y que impone los
estándares del tamaño y peso del grano, el grueso de la cáscara del grano, el color, la
cantidad de grasa, el sabor y aroma de chocolate.
El proceso de secado es tan importante como el fermentado para garantizar una buena
calidad, ya que si este no se realiza de manera apropiada, puede afectar la apariencia física
del grano y el sabor. Durante la fase del secado, las almendras terminan de generar el sabor
a chocolate que comenzó en el proceso de fermentación. Si el secado no se hace en forma
técnicamente adecuada, de nada sirve que haya realizado una buena fermentación, porque
el material no llegará a tener el sabor deseado.
2
El secado facilita el manejo, almacenamiento, transporte y comercialización del cacao el
que requiere de un 7% de humedad para ser comercializado en el mercado internacional.
Actualmente los compradores demandan cada día mayor calidad, lo que implica cumplir
con ciertas normas regulatorias durante la cosecha, fermentado y secado, de esta manera
que el producto final esté libre de residuos de placenta, moho, malos olores o sabores
desagradables, con tamaño del grano uniforme y calidad en cuanto a sabor y aroma.
La presente investigación pretende brindar información y demostrar sí M. roreri es capaz
de sobrevivir ante los diferentes procesos de postcosecha de las almendras de cacao lo que
evitará restricciones al momento de exportar los granos de cacao a otros países.
3
CAPÍTULO I
CONTEXTUALIZACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN
4
1.1. Problema de investigación
1.1.1. Planteamiento del problema
M. roreri es un patógeno de los frutos de cacao que puede ocasionar descensos
significativos en producción además de bajar la calidad del producto final. La biología del
organismo indica que M. roreri puede vivir en el interior de los tejidos sin síntomas
aparentes, y por lo tanto el movimiento de masas de semillas de un lugar a otro puede
trasladar la enfermedad a sitios libres de ella porque el organismo conlleva su
viabilidad por lo menos en las semillas sin tratamientos específicos. Sin embargo se sabe
poco sobre la supervivencia del patógeno a través del proceso de postcosecha.
1.1.2. Formulación del problema
¿M . roreri es capaz de resistir el procesamiento de postcosecha y mantener su viabilidad?
1.1.3. Sistematización del Problema
• ¿Los cambios físicos, químicos y microbianos del proceso de postcosecha afectaran
negativamente la viabilidad de M. roreri?
• ¿Afectará el crecimiento de M. roreri las altas temperaturas que alcanza el proceso de
postcosecha?
• ¿El movimiento de masas de semillas de cacao sin un proceso de postcosecha podría
trasladar la enfermedad a sitios libres de ella?
1.2. Objetivos
1.2.1. Objetivo general
Establecer el crecimiento y sobrevivencia del agente causal de la moniliasis en almendras
de cacao.
5
1.2.2. Objetivos específicos
• Determinar la sobrevivencia de M. roreri agente causal de moniliasis en diferentes
rangos de temperatura.
• Establecer la reacción de M. roreri a varios periodos de fermentación.
• Determinar el porcentaje mínimo de humedad que puede soportar M. roreri.
6
1.3. Justificación
El Ecuador se caracteriza por ser uno de los países con mayor producción de cacao, ya que
este es un producto indispensable para la alimentación humana y gran parte es utilizado en
procesos agroindustriales en casi todas las regiones del país. La producción va
incrementándose debido a que existe una mayor demanda internacional, con el paso del
tiempo Ecuador se ha convertido en el tercer productor de este grano en el mundo. Sin
duda esta producción ha sido disminuida por la presencia de varias enfermedades entre ella
la moniliasis que es causada por el hongo M. roreri que ha ocasionado mayor daño
convirtiéndose en un factor de restricción para la producción.
Es por ello que las buenas prácticas de postcosecha juega un papel muy importante ya que
actualmente el consumidor cada día las exige más a través de su cadena de suministro, por
lo que todo centro de acopio y beneficiado tendrá que implementar su sistema de buenas
prácticas de postcosecha de las almendras de cacao, recomendaciones técnicas orientadas a
obtener productos inocuos, es decir que esté libre de contaminantes físicos, químicos y de
microorganismos patógenos, de esta forma el consumidor podrá gozar de los beneficios del
cacao y el chocolate sin que este represente un riesgo a su salud y obtendrá una buena
reputación en el mercado como proveedor de granos secos de cacao de alta calidad
Es por ello que la presente investigación pretende brindar información y demostrar sí M.
roreri sobrevive ante los diferentes procesos de postcosecha de las almendras de cacao lo
que evitará restricciones al momento de exportar los granos de cacao a otros países.
Beneficiario directo de esta información, en primer lugar, es el país (productores y
exportadores) ya que debido al temor de que esta enfermedad pueda transmitirse en la
masa exportable, se han presentado casos de restricciones y rechazo de exportaciones por
aquellos países libres de la enfermedad. También se benefician los productores que
comercializan el grano sin problema por este motivo y los centros de acopio en general ya
que tendrán una herramienta tecnológica (fermentación y secado) que les asegure
eliminarían problema por infecciones ocultas de M. roreri.
7
CAPITULO II
FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA DE LA INVESTIGACIÓN
8
2.1. Marco Conceptual
2.1.1. Generalidades del cacao
El cultivo de cacao en Ecuador es fuente de ingresos, se considera al sector cacaotero de
gran importancia ya que el rol que desempeña el agricultor como el comerciante es
esencial para el desarrollo socioeconómico del país (Cárdenas et al., 2016), por ser un
producto de exportación y que constituye una fuente de empleo para un alto porcentaje de
habitantes de los sectores rurales y urbanos (Mora y Fiallos, 2012).
Durante las últimas décadas en el contexto de la globalización económica surgen una serie
de reformas orientadas a una mayor apertura comercial y liberación de la economía, lo cual
exige mejorar la competitividad. En este sentido, se puede decir que una de las aristas de la
competitividad se vincula con una mejor calidad del producto (Quintero y Díaz, 2004).
Ecuador, país con alta productividad cacaotera siendo uno de los más importantes para los
negocios de exportación. Algunas empresas internacionales prefieren el cacao de nuestro
país por la calidad, como es el caso de la empresa Nestlé que exporta 8000 toneladas
anuales. Interesándose en el producto nacional a causa de sus propiedades nutricionales,
permitiendo cumplir con los requisitos para la elaboración de chocolate de primera calidad
(Teneda, 2016).
El cacao Nacional o pepa de oro, es procesado industrialmente para adquirir
semielaborados con las mismas virtudes de exquisitas tonalidades de aroma y sabor único
del cacao Ecuatoriano, y de alta calidad donde se obtienen: licor, manteca, torta y polvo de
cacao, logrando un producto final exquisito; comenzando de la chocolatería más fina y
gourmet, siendo una delectación los platos en artes culinarias, bebidas frías y calientes y
muchas otras delicias combinadas que son un agrado para el paladar, hasta productos de
primor e incluso son utilizados para la salud humana (Anecacao, 2018).
Cada una de las actividades siguientes es fundamental para alcanzar la calidad requerida
por los compradores y fabricantes de chocolates, en especial los mercados que están
dispuestos a pagar un mejor precio por la buena calidad. Por otro lado, es importante
destacar que el tratamiento postcosecha (fermentación, secado y tostado), especialmente el
proceso de fermentación desarrolla los llamados precursores del aroma y disminuye la
astringencia y la acidez de los granos de cacao. Por lo contrario, si no se lleva un adecuado
9
tratamiento postcosecha, el potencial aromático de los cacaos finos o de aroma no se
manifiesta (Quintero y Díaz, 2004).
2.1.2. Enfermedades del cultivo de cacao
La magnitud de pérdidas que causan las enfermedades, han sido el primer problema de la
caída en la producción de cacao y el descenso de la calidad del producto final. Entre ellos,
las enfermedades causadas por hongos fitopatógenos. Este problema se ha desarrollado
recientemente, siendo la causa el mal manejo adecuado en los cultivos y por los cambios
climáticos (Correa et al., 2014).
Las condiciones climáticas así como las enfermedades que atacan el cultivo de cacao son
los principales factores que afectan la producción. La mayoría de plantaciones cacaoteras
del país son manejadas de forma integral, incluyendo las labores sanitarias las que
realizadas a destiempo, pueden recortar la producción hasta un 90%. Entre las
enfermedades más importantes encontramos a la moniliasis (Moniliophthora roreri),
escoba de bruja (Moniliophthora perniciosa), mazorca negra (Phytophthora palmivora.)
(Mora & Fiallos, 2012).
2.1.3. Moniliasis
Enfermedad del cacao conocida con los nombres de monilia, Pudrición acuosa, Helada,
Mancha Ceniza o Enfermedad de Quevedo, el agente causal de este hongo fitopatógeno es
M. roreri, provoca una enfermedad que destruye la mazorca de cacao (T. cacao) y, por
tanto, reduce la producción del cultivo y los ingresos de los agricultores (Súarez,2015). Ha
sido reportada como dos veces más destructiva que la mazorca negra (P. palmivora,
Phytophthora capsici) y más dañina y de difícil control que la escoba de bruja (M.
perniciosa). Los daños ocasionados por la moniliasis varían por el manejo del cultivo, las
condiciones ambientales y la semilla de cacao utilizada. Por esto es importante tener en
cuenta que su impacto es muy variable dentro de los mismos clones o híbridos.
Según Phillips (2006) M. roreri está presente en 11 países. Es uno de los principales
factores limitantes causando pérdidas mayores al 30%, pero en muchas localidades
alcanzan el 100%. Sus efectos devastadores han causado el abandono de miles de hectáreas
durante un periodo de casi 200 años. La reciente aparición y agresividad mostrada por el
hongo en los dos extremos longitudinales de distribución (México y Perú) indica que está
10
en una intensa fase invasiva. Lo anterior conduce a la conclusión de que continuará
diseminándose poniendo en grave riesgo la actividad cacaotera mundial. La severidad del
ataque de la Monilia varía de lugar a lugar y de año a año, de acuerdo con las condiciones
del clima. El hecho de que en Ecuador la Monilia sea una de las enfermedades más severas
del cacao, mientras que la Phytophthora es relativamente de poca importancia, sugiere que
las condiciones de clima que favorecen a la una y a la otra son diferentes. Aparentemente
las temperaturas altas son más favorables para la diseminación de la Monilia.
2.1.3.1. Taxonomía
M. roreri es un organismo del dominio Eukaryota, reino fungi, filum Basidiomycota, clase
Basidiomycetes, subclase Agaricomycetidae, orden Agaricales, familia Tricholomataceae,
género Moniliophthora y especie M. roreri (Suárez & Hernández, 2010).
2.1.3.2. Condiciones favorables
Las condiciones favorables para el crecimiento del hongo son la temperatura y la humedad.
Los factores que intervienen en el daño que puede causar este patógeno son: tipo de
material genético utilizado y el mal manejo del cultivo; puede causar daños desde el 30%
hasta el 100% (INIAP, 2018).
2.1.3.3. Transmisión
Las esporas son trasladadas hasta los frutos sanos, principalmente por el viento. Otros
agentes de diseminación importantes son el salpique de la lluvia, los animales y los seres
humanos. Cuando la superficie del fruto está húmeda, las esporas germinan y lo infectan.
Los daños se observan varias semanas después. Los frutos jóvenes, de menos de 3 meses
de edad, son los más atacados. Un factor importante de distribución de la enfermedad ha
sido el movimiento de mazorcas infectadas entre países (Pérez, 2018).
2.1.3.4. Morfología
Las esporas provienen de un basidio modificado, con un seudoestroma denso y carnoso
sobre el cual el hongo produce los vestigios del píleo. Las esporas son multifuncionales,
sirven para el intercambio genético, dispersión, la infección y la supervivencia (Evans,
2007). Estas pueden ser esféricas u ovaladas y tienen dos formas de germinación a través
del poro germinativo o directamente a través de su pared (Uquillas, 2004). Las esporas
viejas desarrollan paredes gruesas y se tornan oscuras, las cuales pueden marcar el inicio
11
de la fase de dormancia (Evans, 2007). El tubo germinativo presenta en el extremo distal
una estructura similar a un apresorio y la hifa infectiva. Ésta es única y en raras ocasiones
doble (Uquillas,2004).
2.1.3.5. Sintomatología
Ésta enfermedad sólo ataca los frutos (llamados mazorcas), a los que les provoca necrosis
interna y externa, y finaliza con la pérdida de la mazorca. Su inóculo puede sobrevivir más
de siete meses en frutos momificados que permanezcan en el árbol de cacao después de la
cosecha, los cuales aportan niveles elevados de esporas durante todo el periodo de
fructificación (García et al., 2015).
El hongo ataca los frutos en todas las fases de su desarrollo. El daño externo es
caracterizado por una necrosis, deformación y pudrición en mazorcas, aunque algunos
frutos de 60 y 80 días pueden completar su desarrollo sin síntomas externos, pero con el
tejido interno necrosado. Esto conlleva a la muerte del fruto, con un color café oscuro, para
luego cubrirse de una ¨felpa¨ de color crema, que es la masa micelial del hongo o estroma‖
que se cubre de esporas. El daño interno causado por la enfermedad puede ser más grave
que el externo, pudiendo llegar a perderse casi todas las almendras, sin importar la edad del
fruto (Sánchez y Garcés, 2012).
Los tejidos centrales, pulpa, semillas y algunas veces la cáscara, forman una sola masa en
donde los tejidos son rodeados por una sustancia acuosa debido a la descomposición de
ellos, siendo también las almendras destruidas parcial o completamente, dependiendo del
tiempo de infestación de los frutos (Mora & Fiallos, 2012)..
Las mazorcas menores de dos meses, presenta pequeños abultamientos o gibas
(protuberancias) en la superficie del fruto, inclusive esa área se descolora (se vuelve más
clara); después que emerge esa giba se presenta una mancha café (chocolate) que se va
extiendo (el fruto muere poco después), comenzando a notarse una felpa blanca siendo
ese el micelio del organismo, transcurridos tres a siete días, encima del micelio
blanquecino nacen las esporas del tipo conidio con un aspecto color crema. Un síntoma
adicional es la madurez prematura, las mazorcas tornan de color aparentando la madurez
en frutos que aún están inmaduros (Sánchez y Garcés, 2012). Hasta 10 semanas de edad
los frutos pequeños son más susceptibles. En frutos en medio de su desarrollo, los primeros
síntomas de la enfermedad es la presencia de diminutos puntos aceitosos (translúcidos),
en muy corto tiempo esos puntos se unen formando una mancha café; el borde de la
12
mancha es irregular y a veces produce un color amarillento por donde va avanzando la
enfermedad, pasados algunos días encima de la mancha café se nota el micelio y después
las esporas que forman un grupo acumulado abundante de color crema (FHIA, 2012).
Cuando la infección ocurre en los frutos con más de tres meses de edad, en este caso el
hongo crece en el interior de la mazorca, sin síntomas externos, hacia el final del desarrollo
de aquella, la podrición puede limitarse a la cáscara y no alcanza a llegar a las almendras
que así pueden aprovecharse como parte de la cosecha (FHIA, 2003).
2.1.3.6. Ciclo de vida
Las condiciones climáticas y la cantidad de esporas libres son factores determinantes en el
ciclo de vida de M. roreri. El ciclo comienza con la estación seca, época en la que se
encuentran la mayor cantidad de esporas disponibles en el ambiente. Sin embargo, para
que inicie la infección es necesario que existan condiciones de humedad (Suárez y
Hernández, 2010).
Según menciona Phillips (2006), las condiciones secas, humedad relativa baja y
temperatura mayor a 26 °C favorecen la liberación y dispersión de las conidias y las lluvias
intensas y frecuentes favorecen la presencia de agua libre sobre los frutos, facilitando la
germinación y penetración de las conidias (Faytong, 2017).
La germinación de las conidias es favorecida temperaturas medias sobre 22 °C y humedad
relativa del 93 % (Albuquerque, 2006). Una humedad relativa superior 80 % y
temperaturas entre 25 y 27 °C son óptimas para el crecimiento del hongo y la infección de
los tejidos del fruto. Plantas mal formadas y con ramas entrecruzadas favorecen la
presencia de insectos, los cuales transportan esporas en su cuerpo y mediante su
alimentación causa heridas que sirven de entrada del hongo a los frutos (Orea, 2018).
Phillips (2003) descubrió que M. roreri puede crecer y desarrollarse entre 18 y 30°C,
mientras que las esporas pueden germinar entre 10 y 40 °C. Además, puede soportar
temperaturas de 55 °C. Estos rangos de temperatura exceden las condiciones normales de
crecimiento de T. cacao. La distribución observada de M. roreri, mucho más limitada que
lo que estas condiciones indican, pudiera deberse a lo limitado de la distribución de T.
cacao, y que cualquier ampliación en la distribución del cultivo iría acompañada por M.
roreri, perfectamente capaz de vivir en condiciones mucho más amplias que las que
ahora conocemos. La maduración del hongo ocurre bajo condiciones óptimas de calor y
13
humedad, más de 25 °C y 85% de humedad relativa (Vargas, 2010). Las esporas pasan de
fruto a fruto tanto dentro del mismo árbol como de los árboles vecinos, mayormente con la
acción del viento y con menor influencia por el agua de lluvia y algunos insectos (FHIA ,
2003).
Los conidios son las únicas estructuras, hasta ahora conocidas, capaces de causar infección
(Vargas, 2010). Las conidias se depositan sobre el fruto, germinan si hay agua o mueren
por la radiación/desecación (Faytong,2017); éstas al germinar pueden penetrar
directamente a la cáscara del fruto. El periodo de incubación del hongo (M. roreri), dura
aproximadamente de 3 a 8 semanas, dependiendo de las condiciones climáticas, la edad de
los frutos y la susceptibilidad de las variedades de cacao (FHIA, 2012).
La sobrevivencia del patógeno empieza en los residuos de cosecha (mazorcas
contaminadas) y en los frutos viejos que permanecen durante mucho tiempo adheridos a
las ramas y troncos, si no se los elimina. Luego, las esporas son diseminadas por el viento,
los insectos y la lluvia, contaminando los frutos sanos (Sánchez y Garcés, 2012).
2.1.4. Buenas prácticas de postcosecha
Las buenas prácticas de postcosecha del cacao son un conjunto de principios, normas y
recomendaciones técnicas orientadas a obtener productos inocuos, así como asegurar la
protección de los empleados y el medio ambiente. El producto inocuo es aquel que estará
libre de contaminantes físicos, químicos y de microorganismos patógenos, de esta forma el
consumidor podrá gozar de los beneficios del cacao y el chocolate sin que este represente
un riesgo a la salud (Aguilar, 2017).
El proceso postcosecha es un aspecto de máxima importancia para presentar al mercado un
producto de calidad, ya que esta labor ayuda a mejorar las características organolépticas
(color, sabor, textura y aroma) del cacao, garantiza que el grano sea apreciado por la
industria y asegura su comercialización tanto a nivel nacional como internacional
justificando un mejor precio. Este proceso se desarrolla en dos etapas: la fermentación y el
secado. Durante estos procesos se generan los precursores químicos (sustancias
indispensables para la generación de aroma y sabor en el cacao) y prepara el producto
para que cumpla con las condiciones de mercado, para hacer chocolates con sus
características especiales obteniendo los productos industrializados (Aguilar, 2017).
14
2.1.4.1. Fermentación
El proceso de fermentación del cacao es un periodo muy importante en el procesamiento
del grano, ya que se generan los cambios bioquímicos que dan origen a los precursores del
aroma y sabor, lo que determina su calidad tanto física como química (Contreras et al.,
2004). Muchas son las maneras de fermentar la masa de cacao (sacos, montones, cajas)
pero la duración de este proceso, es lo que hará que se obtenga un buen resultado, el
tiempo será de acuerdo al tipo de material genético que posea (Aguilar, 2017).
La fermentación consiste en una serie de cambios en la pigmentación interna, color
violeta a marrón claro, transformación del sabor astringente de los cotiledones,
transformación de los azúcares en alcoholes por las levaduras, los cuales son a su vez
convertidos en ácido acético por las bacterias acéticas (Coexca, 2011).
Durante este proceso, existe una relación ordenada entre microorganismos y las
variaciones de temperatura, pH, y humedad, con la formación de alcoholes, ácidos y
compuestos polifenólicos, que matan el embrión, disminuyen el sabor amargo y se
producen las reacciones bioquímicas que forman el chocolate. Esto ocurre durante las 24 o
36 horas (Teneda, 2016).
Existen varios factores que influyen dentro de este proceso, entre ellos están:
• Los microorganismos
• La temperatura
• La remoción
Microorganismos
Durante la primera fase de la fermentación actúan las levaduras, luego se desarrollan las
bacterias lácticas y las bacterias acéticas. Las primeras en desarrollarse son las levaduras,
gracias a las condiciones iniciales en la pulpa del grano de cacao como el ambiente
anaeróbico y el bajo nivel de pH (Teneda, 2016).
Temperatura
El proceso de fermentación preferiblemente se realiza en un sitio caliente que favorezca el
aumento de la temperatura, no le debe dar viento en exceso para evitar que la misma
15
descienda y que las partículas que puedan venir en el viento, no contaminen la
fermentación garantizando un proceso de fermentación completo y parejo para lo cual se
puede construir una estructura que proteja al contenedor; de la incidencia directa de los
rayos del sol, para evitar que la luz ultravioleta mate a los microorganismos beneficiosos
(Faytong, 2017).
Remoción o volteo
El proceso de volteo tiene el efecto inmediato de enfriamiento, liberación de y
aumento de la aireación y por consiguiente de la actividad de las bacterias acéticas. Con
este proceso se asegura el grado de fermentación uniforme. El volteo debe empezar a las
48 horas de iniciada la fermentación, luego se lo hará cada 24 horas, es decir, una vez al
día durante los 2 o 3 días restantes dependiendo de la variedad del cacao fermentado, pero
siempre a la misma hora (Coexca, 2011). Resulta fundamental distinguir entre el volteo de
la masa de fermentación y la remoción. Esta hace referencia a la utilización de palas o
remos de madera para agitar la masa de cacao fermentado.
La remoción se usa especialmente en los casos en que solo se dispone de un cajón
fermentador y no hay cómo trasvasar a otro. Sin embargo, esta técnica es limitada, ya que
requiere de mucho esfuerzo físico para lograr una buena aireación, con lo cual se corre el
riesgo de que los granos del fondo no cambien de posición dentro del cajón. El volteo se
emplea principalmente cuando se cuenta al menos con un cajón libre, de modo que se
traslada el cacao de un cajón a otro utilizando distintas herramientas o equipos, lo que
mejora la aireación y facilitar la Volatización del ácido acético producido (Coexca, 2011).
2.1.4.1.1. Tipos de fermentación
Los métodos más utilizados para la fermentación del cacao en el Ecuador son: por medio
de sacos, montón y cajones en escalera.
- Fermentación de cacao en sacos
La fermentación también se efectúa en costales de polietileno o yute, donde se ubican las
almendras, se cierran y se los deja fermentando en el piso. Se los puede colgar para que
tengan mejor aireación (Pava, 2016). Este método de fermentación no es muy aconsejable
ya que se dificulta las necesarias remociones, resultando un proceso fermentativo muy
heterogéneo con un bajo porcentaje de granos fermentado y con un elevado porcentaje de
16
granos en mal estado, en este tipo de tecnología existe gran dificultad con la retención del
calor debido a los poros que permiten la entrada de aire y la salida del calor (Riera, 2009).
- Fermentación de cacao en montón
Se ubican hojas de plátano en el piso o esteras construidas con materiales vegetales secos,
que sirve de base el cual proporciona mejor drenaje del exudado. Las almendras se ubican
sobre las hojas y en ocasiones con sacos de yute para evitar la fuga de calor. Los montones
no deben estar expuestos directamente al sol, por eso se construyen cobertizos cuya base
estará aproximadamente a 80 cm del suelo. Las remociones se efectuarán a intervalos de
48, 72 y 96 horas, para tener un cacao bien fermentado (por encima del 90 %) (Teneda,
2016).
- Fermentación de cacao en cajón
En relación con la madera utilizada para fabricar los cajones, hay que identificar
localmente las variedades de árboles que, dadas sus características, no transfieren olor ni
sabor. Las condiciones básicas para alojar los cajones de fermentación buscan mantener la
temperatura durante el proceso, controlar el acceso de animales, proporcionar buena
ventilación y evitar que el agua lluvia caiga directamente en el cacao fresco y este se dañe.
El método de fermentación en cajones es uno de los mejores para el proceso del cacao,
siempre y cuando se tenga los cuidados respectivos para así poder evitar la contaminación
y el crecimiento de hongos que malograrían el proceso y el producto. Los cajones se
construyen de madera, porque garantiza un cacao de buena calidad, con buen olor, sabor,
color y apariencia; se diferencian por su forma y tamaño (FAO, 2016).
Hay dos tipos de cajones que son los más usados:
- Cajones antiguos con divisiones
- Cajones en escalera
El propósito de estas disposiciones u ordenamientos es poder proporcionar el volteo o
remoción de los granos mientras estos se fermentan. El volteo consiste en movilizar los
granos en fermentación, de tal forma que los que inicialmente se encontraban arriba
terminen en la parte de abajo y los que se encontraban en el interior, salgan a la parte
superior del cajón. Esto sirve para que la temperatura se homogeneice, airear y voltear la
masa de cacao sin dejar que se enfríe, esto nos ayuda a uniformizar el proceso bioquímico,
17
es decir la fermentación. Una vez completado el volteo, se debe volver a cubrir los granos
para evitar pérdidas de temperatura (FAO, 2016).
2.1.4.2. Secado
Al alcanzar el porcentaje de granos fermentados óptimo de acuerdo a los requerimientos de
los clientes, inmediatamente se debe detener la fermentación, e iniciar con el proceso de
secado y acondicionamiento. Para ello se deben sacar los granos del cajón y extenderlos
en la superficie para secado donde se enfriará, perderá el agua y ácido acético y algunos
compuestos astringentes (provocan sensación de sequedad y amargura en la boca). Este
proceso es lento y puede tardar cinco o más días. La exposición de los granos al sol debe
ser cuidadosa y gradual (Aguilar, 2017).
Dependiendo del manejo que se le haya dado en la fermentación el cacao recién sacado
del cajón puede tener una humedad cercana del 65 % la cual debe ser disminuida a
contener alrededor de 7% de humedad para que su almacenamiento se prolongue durante
varios meses y se puedan prevenir los ataques causados por hongos y bacterias (Liendo,
2005). En el proceso de secado no es importante solo reducir la humedad que existe en las
almendras fermentadas, sino garantizar que los cambios químicos, que se venían dando en
la almendra, para que estos sigan su proceso hasta detenerse por falta de humedad o la
inactivación de las enzimas por otros medios (Torres y González, 2016).
Otro aspecto relevante del secado es que continúa la fase oxidativa iniciada en la
fermentación y se completa la formación de los compuestos del aroma y sabor. Además, en
esta etapa ocurre el desarrollo de los pigmentos de color marrón a partir de los compuestos
fenólicos Existen dos alternativas básicas para el proceso de secado de cacao. El secado
natural utilizando la energía solar térmica y el artificial que puede utilizar diferentes
tecnologías y fuentes de energía para el proceso (Ortiz et al., 2009; Rosero et a.l, 2012).
2.1.4.2.1. Secado natural
El secado natural por exposición al sol es comúnmente usado por los productores de las
diversas regiones cacaoteras del país, debido a que es un método simple, económico y que
permite el manejo de pequeñas cantidades. Entre las desventajas de este método destacan
el tiempo que tarda el proceso, la labor requerida, la necesidad de extensas superficies para
secar los granos, condiciones climáticas que pueden variar de una zona a otra y en una
18
misma zona durante el año, lo cual va a influir sobre las horas de exposición diaria al sol y
del tiempo necesario para el secado (Nogales et al., 2006).
El secado natural es el más común en los países productores que gozan de suficiente luz
solar y un régimen de lluvia no excesivo (Gaibor y Pachacama, 2017). Consiste en un
secado directo al sol donde se requiere de un clima de temperatura relativamente elevada y
baja humedad, es el más utilizado por los agricultores. La principal fuente de energía
natural empleada es el sol que calienta el ambiente. De modo que el aire se mueve
naturalmente sin la intervención del hombre (Liendo, 2005).
Durante el proceso de secado natural se recomienda eliminar los restos de cáscara, granos
partidos, así como cualquier material extraño. Naturalmente, el secado inapropiado de las
almendras de cacao conduce a la formación de hongos. Por lo contrario el secado
exagerado conlleva a que la cáscara se vuelva excesivamente quebradiza, colocando en
riesgo la integridad de los cotiledones, que es el material comestible del grano, durante su
transporte y almacenamiento. La desecación al sol será sólo posible, siempre y cuando
durante la época de recolección, las lluvias no sean excesivas y la insolación sea adecuada
(Liendo, 2005).
2.1.4.2.2. Secado artificial
Es de mencionar que las condiciones que se obtienen con el secado artificial no son las
mismas que proporciona el secado natural, lo único que garantiza es un rápido secado del
producto (Riera, 2009). Los sistemas de secado artificial, de uso básicamente industrial,
permiten efectuar el proceso de secado de forma independiente a los factores climáticos de
la época o temporada. Existen diferentes tipos de secadoras industriales, la mayoría de
ellos utilizan la circulación de aire caliente a través de una cámara para conseguir la
evaporación del agua contenida en el producto a secar (Rosero et al, 2012).
19
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
20
3.1. Localización del experimento
La presente investigación se realizó en dos fases, la primera consistió en un estado de
laboratorio para evaluar el comportamiento de M. roreri en condiciones diferentes de
temperaturas y se llevó a cabo en el laboratorio de Microbiología y Biología Molecular de
la Universidad Técnica Estatal de Quevedo (UTEQ), localizado en el Campo Universitario
¨Manuel Haz Álvarez¨ ubicado en el km 1.5 vía Quevedo- Santo Domingo.
La segunda fase tuvo lugar en las instalaciones La Nueva Casa Del Cacao S.A,
Exportadora de cacao Ecuatoriano ¨CASACAO¨ ubicado en Km 2 ½ Vía Valencia, para
evaluar el comportamiento del organismo durante el proceso de fermentación y secado.
3.2. Tipo de investigación
La investigación realizada fue de tipo Experimental
3.3. Métodos de la investigación
Se empleó el método inductivo. La investigación consistió de tres pruebas experimentales.
3.3.1. Experimento 1. Efecto de la temperatura sobre la sobrevivencia de M. roreri.
- Diseño experimental: Los tratamientos se distribuyeron según el diseño
completamente al azar DCA con 5 tratamientos y 3 repeticiones.
- Factor de estudio: Temperatura de crecimiento del hongo.
- Tratamientos : Cinco niveles de temperaturas:
T1 (testigo): 27 °C
T2: 30 °C
T3: 40 °C
T4: 50 °C
T5: 55 °C
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3.3.1.1. Desarrollo del experimento:
Para este experimento, se utilizaron colonias de M. roreri obtenidas a partir de mazorcas
enfermas; cuando la colonia tenía 15 días de edad, se transfirieron discos del borde de la
misma para colocarlos en las cajas del experimento.
Para la incubación de M. roreri se utilizaron 4 incubadoras reguladas a temperaturas de 30
°C, 40 °C, 50 °C y 55 °C en cada incubadora se colocó un tratamiento, constituido por 10
cajas petri. A diferencia del tratamiento testigo 27 °C que no se colocó en incubadora.
En cada caja petri se ubicó un disco de 3 mm x 3 mm del hongo y se sellaron totalmente
con cinta parafilm. El ensayo culminó cuando la colonia de monilia cubrió todas las cajas
del tratamiento de 27 °C. Para medir el crecimiento radial del hongo se utilizó una regla
de plástico de 20 cm, se registraron los datos en cuatro momentos: a los 5, 10, 15 y 20 días
después de la inoculación y colocación en la temperatura correspondiente.
3.3.1.2. Procedimiento del experimento:
- Se preparó 1000 ml de medio de cultivo PDA (Papa Dextrosa Agar), utilizando 39 g de
PDA y 1000 ml de agua destilada la mezcla se colocó en un erlenmeyer, se ubicó el medio
en la estufa a baño maria a temperatura media hasta que el agar se disuelva.
- Con la ayuda de una pipeta graduada se colocaron 20 ml de medio PDA en cada tubo
de ensayo (55 tubos), tapándolos con tapones de algodón y un trozo de papel de aluminio,
se esterilizaron los tubos en autoclave por 15 minutos a 110 °C
- Se colocaron los tubos en la estufa a baño maria para que el medio se disuelva. Una vez
disuelto el medio se vertió a las cajas petri y se dejó enfriar. Con la ayuda de una pipeta
pasteur se cortaron discos de 3 mm de la cepa de monilia de 15 días de edad, previamente
cultivada en medio artificial (PDA), que luego se ubicaron en el centro de la caja petri (un
disco/caja).
- Culminada la siembra del hongo se colocaron las cajas petri selladas con cinta
parafilm (10 cajas/incubadora) se las ubicó en las diferentes incubadoras reguladas a
temperaturas de 30 °C, 40 °C, 50 °C, 55 °C y 10 cajas a temperatura de 27 °C (testigo).
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- Se registró el crecimiento radial en milímetros en cuatro momentos (5, 10, 15, 20 días)
para cada tratamiento.
3.3.2. Experimento 2. Sobrevivencia de M. roreri durante el proceso de fermentación.
- Diseño experimental: Los tratamientos se distribuyen según el diseño completamente
al azar DCA con 6 tratamientos y 3 repeticiones. Cada tratamiento estuvo constituido por
6 ¨moños¨ de granos de avena con M. roreri.
- Factor de estudio: Crecimiento micelial de M. roreri durante el proceso de
fermentación
- Tratamientos: Horas de fermentación
3.3.2.1. Desarrollo del experimento
Para realizar esta prueba, se utilizaron cajones de madera de 44 x 30 x 21 cm (largo x alto
x ancho), donde se colocó masa de cacao en pulpa para realizar una micro fermentación
considerando que en el comercio local no permitían usar el proceso comercial ante el temor
de contaminación de la masa con M. roreri.
Para el efecto, el hongo se cultivó en pequeños paquetes (moños) formados por cuatro
dobleces de gasa rellenos con 30 g de granos de avena y atados con piola de algodón, para
evitar que la avena se salga; dichas muestras se ubicaron en cajones donde se colocó
pequeñas cantidades de masa fresca de cacao de variedad nacional distribuyendo las
muestras en la caja. El primer grupo de moños de semilla de avena conformado por 6
muestras se colocó encima de una capa de masa de almendras de cacao de 15 cm,
añadiendo enseguida el resto de masa hasta que se llene el cajón, cuando estuvo lleno se
cubrió con hojas de bijao y sacos de yute. Transcurridas las 24 horas de fermentación de
T 1: 24 horas
T2: 48 horas
T3: 72 horas
T4: 96 horas
T5: 120 horas
T6: 144 horas
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las almendras de cacao se volteó la masa y se registraron los datos de temperatura que
alcanzó la masa.
3.3.2.2. Procedimiento del experimento:
- Se preparó 1000 ml de medio de cultivo PDA (Papa Dextrosa Agar), utilizando 39 g de
PDA y 1000 ml de agua destilada se mezcló y se colocó en un erlenmeyer a baño maria a
temperatura media hasta que el agar se disuelva.
- Se esterilizó el medio de cultivo PDA en la autoclave a 110 °C por 15 minutos.
- Se pesó 30 g de avena en la balanza y se colocó en un erlenmeyer, se agregó 25 ml de
agua a la avena hasta que quede humectada y luego se esterilizó en la autoclave dos veces
por media hora a 110 °C.
- Se inoculó 5 discos de medio de cultivo de PDA con micelio de monilia dentro de los
erlenmeyer y se los dejó aproximadamente de 18 a 20 días hasta que el patógeno cubra
totalmente la avena.
- Transcurridos estos días se colocó las semillas de avena con colonia de M. roreri en
gasas formando moños y se ató con pequeños pedazos de piola para así poder ser llevados
al cajón fermentador.
- Los moños de avena se colocaron en diferentes lugares del cajón y se retiró un moño
cada 24 horas, 48 horas ,72 horas ,96 horas, 120 horas, 144 horas.
- Avanzando las horas mencionadas con anterioridad las muestras fueron llevadas al
laboratorio y se procedió a sembrar en medio PDA (Potato Dextrosa Agar) cuatro granos
de avena por caja petri (10 cajas/tratamiento).
- Las cajas fueron selladas con cinta de parafilm y se las colocó a temperatura ambiente,
transcurridos 5 días en adelante se observaron las cajas diariamente para determinar si se
obtenía o no crecimiento del patógeno.
24
3.3.3. Experimento 3. Evaluación del porcentaje mínimo de humedad que soporta M.
roreri en el proceso de secado.
- Diseño experimental: Los tratamientos se distribuyeron según un diseño
completamente al azar DCA con 5 tratamientos y 3 repeticiones.
- Factor de estudio: Crecimiento micelial de M. roreri a diferentes porcentajes de
humedad.
- Tratamientos : Contenido de humedad (%) en la masa después de días de secado
T 1: Masa fresca expuesta al sol de tres a cuatro horas (55 %).
T 2: Primer día de secado (27 %)
T 3: Segundo día secado (24 %)
T 4: Tercer día de secado (20 %)
T 5: Secado artificial (7 %)
3.3.3.1. Desarrollo del experimento
En este caso, se solicitó al Ing. Zambrano en CASACAO se permita colectar muestras de
un lote de cacao de los tendales de la empresa y otra muestra de la secadora que mantienen
para secar en días húmedos.
Para la recolección de las muestras de almendras de cacao secas a la luz solar y seca de
manera artificial, primero se identificaron los lotes, se midió el porcentaje de humedad del
cacao que presentaba cada lote con un medidor de humedad de cacao y se recolectó las
muestras identificándolas en cada funda. Las muestras se seleccionaban por días de secado,
midiendo el porcentaje de humedad que presentaban, luego fueron llevadas al laboratorio
para aislar pedazos del tejido en medio artificial. La primera muestra se recolectó de masa
fresca una vez concluido el proceso de fermentación, que había estado expuesto al sol por
tres a cuatro horas. Las muestras colectadas del secado artificial estuvieron expuestas en
secadoras redondas de 25 a 30 horas a una temperatura de 50 a 60 °C.
25
3.3.3.2. Procedimiento del experimento:
- Se preparó 1000 ml de medio de cultivo PDA (Papa Dextrosa Agar), utilizando 39 g de
PDA (Papa Dextrosa .Agar) y 1000 ml de agua destilada se mezcló y se colocó en un
erlenmeyer a baño maria a temperatura media hasta que el agar se disuelva. Se esterilizó en
la autoclave a 110 °C por 15 minutos.
- Se recolectaron las muestras de almendras de cacao seco en la exportadora
“CASACAO” midiendo el porcentaje de humedad con el Humidímetro portátil, se colocó
las muestras en fundas plásticas para ser llevadas al laboratorio.
- Se desinfectó la cámara de flujo laminar con alcohol al 70 % y se procedió a disolver el
medio en la estufa a baño maria a temperatura media una vez tibio se vertió el medio de
cultivo PDA en las cajas petri y se agregó dos gotas de ácido láctico por caja para evitar el
desarrollo de bacterias.
- Con la ayuda de un bisturí se cortaron las almendras de cacao por la mitad y con una
pinza de acero se colocaron cuatro pequeños trozos de tejido en la caja petri, dos obtenidos
de los extremos de la almendra y dos del centro.
- Se sellaron las cajas con cinta parafilm y se las dejo a temperatura ambiente,
transcurridos 5 días se observó el crecimiento del hongo.
3.4. Análisis de los datos
Se realizó un análisis descriptivo para evaluar los factores de los tres experimentos
planteados cabe mencionar, que dada la naturaleza y comportamiento de los datos
obtenidos no se pudo realizar un análisis de varianza.
3.5. Fuentes de información primaria y secundaria
Los resultados del experimento se convierten en la fuente primaria de información, para
respaldar la interpretación de los resultados y su significado, se utilizó experiencias previas
sobre el tema publicado en revistas, libros, artículos científicos, publicaciones e internet.
También se utilizó información proporcionada verbalmente por expertos en el tema como:
Dra. Carmen Suarez, Ing. Agr. Freddy Amores y el Ing. Agr. Rafael Zambrano.
26
3.6. Materiales y equipos del laboratorio - Tubos de ensayo
- Cajas petri
- Cinta parafilm
- Incubadora de laboratorio
- Autoclave
- Balanza de precisión
- Vasos de precipitación
- Varillas de vidrio
- Espátulas
- Algodón
- Gasas
- Frascos erlenmeyer
- Papel aluminio
- Cámara de flujo laminar
- Nevera
- Microondas
- Estufa (cocineta)
- Pipeta graduada
- Mechero de alcohol
- Pipetas pasteur de vidrio
- Jeringa de 10 ml
- Pinzas de acero
- Bisturí
- Papel toalla scott
- Probeta graduada
- Caja de fósforo
- Piola
- Fundas para muestras (plásticas)
- Frascos de vidrio
- Tijera
- Semillas de avena
- Regla de plástico de 20 cm
- Franela
- Cajas de madera (44 x 30 x 21 cm)
- Hojas de bijao
- Sacos de yute
- Termómetro
- Papel pH tiras reactivas
- Ajugas de acero
- Humidímetro portátil wile
3.6.1. Reactivos
- PDA (Papa Dextrosa Agar)
- Ácido láctico
- Agua destilada
- Alcohol etílico absoluto
27
CAPÍTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
28
4.1. Resultados
4.1.1. Experimento 1. Evaluación del crecimiento y sobrevivencia de M. roreri a
diferentes niveles de temperaturas
4.1.1.1. Crecimiento radial de M. roreri a diferentes temperaturas
Para cada una de las temperaturas evaluadas (27 °C, 30 °C, 40 °C, 50 °C y 55 °C), se
midió el desarrollo radial del crecimiento del hongo a los 5, 10, 15, y 20 días de
incubación. En el tratamiento control, con las cepas a temperatura ambiente, las colonias
de M. roreri presentando crecimiento de 12.83 mm, 31.27 mm, 57.33 mm, 86.48 mm a los
5, 10, 15, y 20 días, respectivamente. Por otra parte, el resto de los tratamientos no
mostraron crecimiento del hongo, presentando un nivel de crecimiento micelial igual a
cero. En la Fig. 1 se puede apreciar la ausencia de crecimiento de M. roreri en todos los
tratamientos con excepción del control (27 ºC) que llena la superficie de la caja. La
sobrevivencia de M. roreri fue nula a temperaturas superiores a la del ambiente.
Figura 1. Crecimiento radial de Moniliophthora roreri. A, temperatura 27 °C; B,
temperatura 30 °C; C, temperatura 40 °C; D, temperatura 50 °C; E, temperatura 55 °C.
E
B C
D
A
29
E
4.1.2. Experimento 2. Sobrevivencia de M. roreri durante el proceso de fermentación
4.1.2.1. Características que presentó el proceso de micro fermentación y
comportamiento de M. roreri
La temperatura de la masa en el cajón fermentador alcanzó 30 °C mientras que el pH llega
a 4 a las 24 h de iniciado el proceso de fermentación. A las 48 h la temperatura subió a 39
°C y el pH se mantuvo en 4. A las 72 h la temperatura ascendió a 45 °C manteniendo
pH de 4, la temperatura se mantuvo a las 96 h pero el pH de la masa subió a 5. A las 120
h la temperatura descendió a 40 °C y el pH se mantuvo en 5 La temperatura continuó
descendiendo hasta el fin del experimento a las 144 h, cuando alcanzo 35 °C sin cambios
en el pH. En ningún caso se logró recuperar colonias de M. roreri. Luego de la siembra en
medio de cultivo y su respectiva incubación, no se obtuvo crecimiento micelial de M roreri
en ninguno de los tratamientos. En este caso, también se observó crecimiento de otros
microorganismos posiblemente propios del proceso de fermentación como se ilustra en la
Fig. 2.
Figura 2. Aspecto de las muestras sembradas en medio de cultivo recolectadas durante el
proceso de micro fermentación. A, 24 horas; B, 48 horas; C, 72 horas; D, 96 horas; E, 120
horas; F, 144 horas.
B A C
F D
30
4.1.3. Experimento 3. Sobrevivencia de M. roreri en función del contenido de
humedad de la masa de almendras durante el proceso de secado.
En este caso, también se hizo evidente que M. roreri no estuvo presente en las muestras,
como se puede ver en la Fig. 3, no existió presencia de M. roreri en almendras expuestas al
sol pero si fue evidente la presencia de otros microorganismos, en los contenidos de
humedad estudiados (55%, 27%, 22%, 20%, 7%).
Figura 3. Muestras de cacao con diferentes niveles de porcentajes de humedad. A,
muestras de cacao a 55 % de humedad; B, muestras de cacao a 27 % de humedad; C,
muestras de cacao a 24 % de humedad; D, muestras de cacao a 20 % de humedad E,
muestras de cacao a 7 % de humedad.
A B C
D E
31
4.2. Discusión
La evaluación del crecimiento radial de Moniliophthora roreri evaluadas a diferentes
niveles de temperaturas (30 °C, 40 °C, 50 °C, 55 °C) no presentaron crecimiento micelial,
mientras que en la temperatura de 27 °C se observaron crecimientos a los 5, 10, 15, 20 días
creciendo a un rango de velocidad entre 12.83 mm hasta 86.48 mm, concordando con
Evans (2006) quien indica que la temperatura óptima para el crecimiento y esporulación de
M. roreri promedia entre 22 - 27 °C. De los resultados obtenidos se comprobó que el
hongo no crece ni se desarrolla en temperaturas de 30 °C, 40 °C, 50 °C y 55 °C debido a
que exceden las condiciones normales de crecimiento y reprime su desarrollo, discrepando
con Phillips- mora (2003), quien menciona que M. roreri puede crecer y desarrollarse a 30
°C y la espora puede germinar de 10 a 40 °C. Phillips et al., (2003), indican que M. roreri
puede soportar temperaturas de 55 °C, sin embargo como es de esperarse con organismos
tan delicados como M. roreri estos no son capaces de soportar altas temperaturas a menos
que esté acompañada de condiciones de humedad o de periodos cortos a los que el hongo
si pueda soportar.
Las muestras aisladas durante el proceso de micro fermentación mostraron temperaturas de
30 °C durante las primeras 24 horas presentando un pH de 4, de tal manera que a partir de
las 48 horas hasta las 96 horas la temperatura ascendió a 45 °C y su pH aumentó a 5; a
partir de las 120 y 144 horas su temperatura descendió y no hubieron cambios en su pH, de
tal manera no se pudo recuperar colonias de M. roreri en ninguno de los factores antes
mencionados. Coincidiendo con Herrera (2001) donde menciona que M. roreri presenta
un mejor crecimiento micelial cuando el pH varía entre 5.7 – 6.1, Según el mismo autor
menciona que la producción máxima de conidios se produce a pH 6.5, los rangos de pH
anteriormente señalados están fuera de las condiciones que se produjeron durante el
proceso de fermentación donde se alcanzó un pH de 4 – 5 donde las muestras no
presentaron crecimiento de M. roreri. Discrepando con Barros (2000), el cual indica que
entre pH de 3 – 8.5 se produce crecimiento micelial de M. roreri, además señala que a
niveles de pH más bajos, el micelio es abundante pero se forma atípico.
Los porcentajes de humedad evaluados fueron de 55 %, 27 %, 24 %, 20 % valores que se
alcanzaron en el proceso de secado que realizan normalmente los agricultores para la venta
de su producto, de igual manera las casas comerciales ejecutan este proceso hasta obtener
una humedad de 7% para su exportación, en ninguno de estos porcentajes antes
32
mencionado se observó crecimiento de M. roreri. Concordando con Meléndez (2002),
quién menciona que las esporas que no encuentran agua libre mueren por la radiación, el
mismo autor también indica que los hongos requieren un alto nivel de humedad ambiental;
muchos de ellos necesitan de películas de agua libres para sobrevivir, aunque monilia es un
basidiomiceto tolerante a la sequía, no sobrevive en mazorcas momificadas ni en
almendras expuestas al sol durante el proceso de secado (uno o varios días) para la
comercialización.
En base a los resultados de la investigación a nivel de laboratorio no se observó
crecimiento de M. roreri durante los procesos de postcosecha por lo que no hay riesgo de
diseminar el organismo causante de la moniliasis del fruto del cacao mediante la
comercialización de las almendras con distintos grados de fermentación y secado de
forma natural o artificial, este aspecto tiene importancia porque evita el riesgo de
restricciones en el comercio y exportación del cacao; sin embargo, se debe aclarar que esto
no significa que sea recomendable exportar lotes con granos enfermos para procesarlas
industrialmente. Según FHIA (2017), menciona que los granos enfermos malogran la
calidad del producto final particularmente el sabor, el cual se torna desagradable. Se
sugiere que esta investigación sea tomada en cuenta para futuros experimentos en donde se
realicen los experimentos establecidos en campo.
33
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
34
5.1. Conclusiones
- El crecimiento radial de Moniliophthora roreri a los 20 días en temperatura de 27 °C
fue de 86.48 mm y en temperaturas de 30, 40, 50 y 55 °C no se obtuvo crecimiento (cero
crecimiento) del hongo, en condiciones de laboratorio.
- El proceso de fermentación aún en periodos cortos de tiempo, parecen suficientes para
reprimir el crecimiento de Moniliophthora roreri, razón por la que el crecimiento micelial
in-vitro fué cero, en las muestras colectadas durante el proceso de fermentación que duró 6
días, y las temperaturas oscilaron de 30 °C a 45 °C.
- No se consiguió aislar (cero crecimiento) Moniliophthora roreri de almendras de cacao
en el proceso de secado natural (en tendal de cemento), con contenido de 55% de humedad
a las 4 horas de exposición al sol. Igual resultado se obtuvo a las 24 horas, 48 y 72 horas de
exposición con 27, 24 y 20 % de humedad de la masa de almendras, ni en el secado
artificial, donde la humedad se redujo hasta el 7 %.
35
5.2. Recomendaciones
- De acuerdo a los resultados obtenidos con el fin de minimizar la diseminación de M.
roreri se debe proceder a dar tratamiento de fermentación y secado al sol a la masa de
cacao para asegurar la inactivación del hongo, sobre todo en infecciones ocultas o cuando
se trata de aprovechar almendras con monilia que es una práctica corriente en el medio.
- Una parte de los resultados de esta investigación se obtuvieron bajo las condiciones de
laboratorio, (temperaturas de incubación y micro fermentación) e implican un tratamiento
bastante drástico para el hongo. Por tal razón, se recomienda confirmar la validez de estos
resultados utilizando los métodos de cajas y de montones con masas de almendras sanas
contaminadas con almendras que hayan sido colonizadas previamente con M. roreri
preferible si se consigue colaboración de un centro de acopio para disipar las dudas de los
acopiadores de cacao comercial.
36
CAPÍTULO VI
BIBLIOGRAFÍA
37
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42
CAPÍTULO VII
ANEXOS
43
7.1. Anexos
Anexo 1. Proceso de incubación de M. roreri a diferentes rangos de temperaturas.
Figura 4. Preparación de cajas petri con medio y siembra de monilia
Figura 5. Incubadora de
laboratorio
Figura 6. crecimiento de M.
roreri a temperatura ambiente
Figura 7. M. roreri a diferentes niveles de temperatura
44
Anexo 2. Proceso de inoculación de M. roreri en avena.
Figura 10. Inoculación de M. roreri.en semillas de avena
Figura 11. 20 días de inoculación de M. roreri en semillas de avena
Figura 8. Medio de cultivo PDA
Figura 9. Preparación de la muestras de avena
45
Anexo 3. Preparación de muestras para el proceso de micro fermentación.
Anexo 4. Recolección, siembra y resultados de las muestras en micro fermentación.
Figura 12. Cajones
fermentadores cubiertos
con hojas de bijao
Figura 13. Moños de gasas
con avena inoculada de
M.roreri
Figura 14. Muestras
colocadas en la masa de cacao
Figura 16. Bandas de pH Figura 15. Toma de
temperatura de la masa de
cacao
Figura 18. Siembra de las
muestras Figura 17. Muestra
recolectadas del proceso de
fermentación
46
Anexo 5. Preparación de medio (PDA) y recolección de muestras de almendras de
cacao seco.
Figura 19. Resultados de las muestras a los 5
días
Figura 20. Preparación de
PDA
Figura 21. Recolección de las muestras de
almendras secas
Figura 22. Humidímetro de humedad wile
47
Anexo 6. Siembra de las muestras de las almendras de cacao.
Figura 23. Siembra de las muestras
Figura 24. Resultado de las muestras/ 10 días
