UNIVERSIDAD RICARDO PALMA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

Desarrollo de la Técnica DOT ELISA para la detección

de anticuerpos anti-Bartonella bacilliformis (IgG) para

el estudio de Bartonelosis en el Perú.

Tesis para obtener el titulo profesional de Licenciado en Biología

Presentada por el Bachiller:

Julio Antonio Evangelista Villavicencio

Lima- Perú

2008

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RESUMEN

Bartonelosis o Enfermedad de Carrión es causada por la bacteria Bartonella bacilliformis en

humanos, y es trasmitida por la picadura de un insecto hembra del género Lutzomyia spp. Esta

enfermedad presenta dos fases importantes: fase aguda (Fiebre de la Oroya) caracterizada por

anemia hemolítica y la fase crónica (Verruga peruana) por la presencia de verrugas. Este trabajo

tiene como objetivo realizar una prueba rápida para detectar anticuerpos anti- Bartonella

bacilliformis y contribuir con los métodos de diagnósticos actuales que tienen una baja

sensibilidad de 36 % por lámina en sangre periférica y por hemocultivos con tiempos de

incubación de 7 a 56 días. Por ello se desarrolló la prueba de DOT - ELISA usando 51 sueros

positivos a Bartonelosis y 32 sueros controles negativos sin la enfermedad. Se preparó antígeno

mediante un proceso de sonicación de la bacteria para la obtención de proteínas que se usaron

como antígeno (antígeno crudo). Se colocó dicho antígeno en discos de membrana de

policarbonato en una placa de microtitulación de 96 pozos. Las membranas fueron bloqueadas

con albúmina sérica bovina para evitar uniones inespecíficas. Se adicionaron los sueros, luego un

conjugado IgG marcado con fosfatasa alcalina y por último se agregó un sustrato cromogénico

que ayudo a visualizar la presencia de puntos de color púrpura para el caso de positivos, y la

ausencia de puntos para los casos negativos a la enfermedad. La sensibilidad de la prueba fue

72.5 % y la especificidad 71.9 % y el valor predictivo positivo fue 80,3 % y el valor predictivo

negativo 52,1 %. Basados en los resultados obtenidos estos indicarían que la técnica de DOT-

ELISA puede ser utilizada como una herramienta para el diagnóstico de Bartonelosis en el Perú,

por ser una prueba rápida, económica, de fácil manejo, pues utiliza pequeños volúmenes de

antígeno y de reactivos.

Palabras claves:, Bartonelosis, Bartonella bacilliformis, DOT-ELISA, antígeno crudo.

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ABSTRACT

Bartonellosis or Carrion's disease is caused by the bacterium Bartonella bacilliformis in humans

and is transmitted by the bite of a female insect of genus Lutzomyia spp. This disease presents

two important phases: acute phase (Oroya fever) characterized by haemolytic anaemia, and the

chronic phase (Peruvian wart) characterized by the presence of warts. This work has an objective

to obtain a rapid test for detecting antibodies to Bartonella bacilliformis and to contribute with

the current diagnostic methods that have a low sensitivity of 36% per slide in peripheral blood

and blood cultures with incubation times of 7 to 56 days. In fact, DOT - ELISA was developed

used 51 sera positive with Bartonellosis and 32 negative controls without the disease. Antigen

was prepared by sonication of the bacteria to obtain proteins that were used as antigen (crude

antigen). The antigen was loaded on polycarbonate membrane discs in a microtitre plate of 96

wells. The membranes were blocked with bovine serum albumin to avoid unspecific bindings.

Sera were added, then an IgG conjugate labelled with alkaline phosphatase and finally a

chromogenic substrate that helped visualize the presence of purple points for positive cases, and

the absence of points for negative cases. The sensitivity of the test was 72,5 % and the specificity

71,9 % and the positive predictive value was 80.3% and negative predictive value 52.1%.These

results indicate that DOT - ELISA technique of can be used as a tool for the diagnosis of

Bartonellosis in Peru as a rapid, economical, easy to handle, because use small amounts of

antigen and reagents.

Keywords: Bartonellosis, Bartonella bacilliformis, DOT - ELISA, crude antigen.

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INDICE

Página

1. INTRODUCCIÓN 4

1.2 Marco Teórico 5

Historia 5

Etiología 6

Epidemiología 6

Transmisión 7

Manifestaciones Clínicas 8

2. ANTECEDENTES 9

2.1. Generalidades 11

DOT- ELISA 11

Sensibilización del Antígeno 12

Lavados 12

Reacción Antígeno - Anticuerpo 13

Reacción con conjugado 13

Acción del Sustrato 14

Determinación de Proteínas 14

Agente Bloqueante 15

3. MATERIALES Y MÉTODOS 15

3.1 Materiales 15

3.2 Métodos 17

Preparación de un antígeno crudo soluble 17

Cuantificación de Proteínas 17

Procedimiento del DOT-ELISA 18

Análisis Estadístico 20

4. RESULTADOS 23

Concentración del antígeno 23

Titulación 23

Estandarización 23

5. DISCUSIÓN 24

6. CONCLUSIONES 27

7. RECOMENDACIONES 28

8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 29

9. ANEXOS 34

1. INTRODUCCIÓN

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La Enfermedad de Carrión o Bartonelosis es una enfermedad causada por la bacteria Bartonella

bacilliformis que es transmitida por la picadura del insecto hembra del género Lutzomyia spp. En

el Perú la Bartonelosis esta presente en los valles interandinos y las vertientes occidental y

oriental de la cordillera de los Andes, incluyendo la zona de la selva, entre los 500 hasta los 3200

msnm; presentándose también en Ecuador y Colombia (Maguiña y Gotuzzo, 2000) (Tejada y col.,

2003). Los cambios climatológicos como el fenómeno “El Niño” tienen un gran impacto sobre

esta enfermedad, reportándose brotes en lugares no endémicos de nuestro país; en este año se ha

reportado últimos brotes en la provincia de Jaén del departamento de Cajamarca, y los

departamentos de Ancash, La Libertad y Amazonas. Debido a la expansión hacia nuevas áreas de

transmisión el incremento en el número de casos y de su letalidad es considerada como una

enfermedad re-emergente en el Perú y como uno de las enfermedades metaxénicas más

importantes en el país (DGE, 2007).

La enfermedad produce dos fases importantes: la fase aguda conocida también como fase

anémica, hemática o fiebre de la Oroya, que puede presentarse de diferentes formas clínicas:

asintomáticas, con síndrome febril, artritis, anemia aguda; y la fase eruptiva conocida también

como fase verrucosa, crónica o Verruga Peruana que se presenta con lesiones eruptivas de color

rojo, sin dolor, de bordes bien definidos, de tamaños variables y que pueden sangrar; de estas dos

fases es la aguda aparentemente la que causa muchas más muertes que la fase eruptiva (Maguiña,

1998).

El diagnóstico en nuestro país se realiza por frotis de sangre periférica que es un método sencillo

y de bajo costo, pero tiene el inconveniente que es poco sensible, debido principalmente a dos

factores: la toma de muestra y de un personal debidamente capacitado para la lectura de frotis.

Este método determina la presencia intraeritrocitaria de la bacteria con una sensibilidad de 36 %

en fase aguda y 10 % en fase eruptiva, además el hemocultivo tiene un largo período de

incubación (1 a 8 semanas) (Chamberlin y col., 2000) (DGE, 2007) (Maguiña, 2001) (Maguiña y

Gotuzzo, 2000).

La dificultad en el diagnóstico para confirmar la presencia de la bacteria por los métodos

tradicionales hace de la necesidad de implementar una nueva técnica de detección rápida como el

DOT – ELISA, que es una modificación de un ELISA convencional, que usa una matriz de

membrana, es rápida, específica, sensible y de fácil ejecución para ser utilizada en zonas

endémicas o no endémicas; así con el uso de esta prueba se podrá minimizar el tiempo y mejorar

la sensibilidad del diagnóstico. En la actualidad esta prueba se usa como inmunodiagnóstico de

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una variedad de infecciones bacterianas y parasitarias, como es el caso de Leptospira,

Brucellosis, Cisticercosis, Schistosomiasis, Amoebiasis, Dengue, etc. que dieron buenos

resultados de sensibilidad y especificidad para el diagnóstico (Carolina y col., 1986) (Da Silva y

col., 1997) (Hatam y col., 2007) (Montenegro y col., 1999) (Piedad y col., 2005) (Polanco y col.,

1997).

1. 2 MARCO TEORICO

Historia

La Enfermedad de Carrión es oriunda del Perú, se le conoce desde tiempos remotos con el

nombre de Sirki que significa verruga de sangre en idioma quechua e incluso las lesiones están

representadas en los huacos antropomórficos y monolitos pre incas; además recibe otras

denominaciones como Bartonelosis, Verruga Peruana, Fiebre de la Oroya, Verruga Andícola, etc.

Fue en 1870 durante la construcción del ferrocarril central Lima – La oroya a 3800 metros del

nivel del mar, que se produjo una gran epidemia de una enfermedad caracterizada por un cuadro

febril y anemia severa por la que se denominó “Fiebre de la Oroya”, que en realidad es la primera

fase febril anemizante de la Bartonelosis causando 7 mil muertes de los diez mil trabajadores que

construían dicha vía, algunos de los sobrevivientes desarrollaron un cuadro eruptivo angiomatoso

similar al que presentaban en alguna oportunidad muchos habitantes de la zona. Esto originó dos

opiniones entre los médicos peruanos sosteniendo que se trataba de dos enfermedades distintas,

es así que en 1885 el estudiante de medicina Daniel Alcides Carrión se inoculó sangre de la

lesión verrucosa (segunda fase crónica de la enfermedad) de un paciente y después de 21 días

hizo un cuadro febril anémico grave y mortal; conociéndose desde ahí que se trataba de la misma

enfermedad tal como la había sostenido Carrión. Por tanto, también se conoce con el nombre de

“Enfermedad de Carrión” (Maguiña, 1998) (Maguiña, 2001) (Maguiña y Gotuzzo, 2000)

(Patruco, 1983).

Es en 1905, que Alberto Barton identificó el agente causante de la enfermedad, después de la

observación de la sangre de varios enfermos en fase febril las cuales presentaban

microorganismos de forma abastonada en los glóbulos rojos y que después adoptaban morfología

cocobacilar al pasar a la etapa eruptiva, denominándose cuerpos endoglobulares; en 1909 publicó

estos hallazgos en la revista “Crónica Médica”, posteriormente estos agentes fueron denominados

7

Bartonella bacilliformis en su honor, por lo que la enfermedad recibe el nombre de Bartonelosis

(Saettone-León, 2004)(Tejada y col., 2003) (Xu y Chain, 2002). En 1913, Twosend identificó al

vector de la Enfermedad, se trataba de un mosquito que los lugareños lo llamaban “titira”, al que

se denominó Phlebotomus y actualmente Lutzomyia. Battistini en colaboración con Noguchi en

el laboratorio del Instituto Rockefeller fue el primero en cultivar con regularidad la bacteria en

1926. Pedro Weiss realizó estudios epidemiológicos entre 1926 y 1956 y que han sido

fundamentales para comprender la dinámica de propagación de esta afección (Saettone-León,

2004).

Etiología

Bartonella bacilliformis es una bacteria gramnegativo, intracelular, pleomórfica (bacilo,

cocobacilo, cocoide), aeróbica, no fermentativa, muy pequeña de 0.6 µm por 1.0 µm, tiene

flagelos unipolares (2 a 16) lo que le dan movilidad y el componente principal es una proteína de

42 kDa llamada flagelina (Mallqui y col., 2000). Está clasificada por técnicas moleculares

(secuencia de su ARNr 16s) de la siguiente manera (Maguiña, 1998):

Phylum BXII. Proteobacteria

Clase I: Alpha proteobacteria

Orden VI: Rhizobiales

Familia II: Bartonellaceae

Género: Bartonella

Epidemiología

La enfermedad de Carrión se encuentra distribuida en áreas localizadas del Perú, Ecuador y

Colombia. En Perú la enfermedad es endémica y predominante en ciertas regiones donde las

condiciones climáticas permiten la supervivencia del principal vector Lutzomyia spp., el nicho

ecológico se ubica entre los 2 º de latitud norte y 13º de latitud sur de la vertiente occidental de

los Andes entre los 500 a 3200 m.s.n.m. (DGE, 2007) (Maguiña y Gotuzzo, 2000) (Xu y Chain,

2002). Los departamentos afectados han sido: Ancash, Lima, Cajamarca, La Libertad, Cusco,

Huánuco, Amazonas, etc. Se han venido reportando nuevas áreas con el transcurrir del tiempo, en

1997 - 1998 se informó del mayor número de brotes de la Enfermedad de Carrión probablemente

8

debido al fenónemo “EL Niño” en los departamentos de Ancash, Amazonas, Cajamarca,

Huánuco y Cusco. Otros brotes se reportaron entre los años 2001 al 2005 en los departamentos de

Huánuco, La Libertad, Lima, Piura, Lambayeque, Ancash y Cajamarca. En el año 2006 se

reportaron en los departamentos de Lima, Ayacucho y Puno nuevas áreas de transmisión; en

Lima se notificaron brotes en los distritos de Santa Eulalia, Callahuanca, San Pedro de Casta y

Ricardo Palma, en la provincia de Huarochiri y otro en los distritos de Santa Rosa de Quives,

Canta y Arahuay en la provincia de Canta. En el presente año se reportaron en Santiago de Chuco

y Otuzco del departamento de La Libertad y en Lima en la provincia de Huara (DGE, 2007).

En el año 2007 se notificaron 3843 y 15 defunciones por esta enfermedad. El 92 % de los casos

se notificaron en los departamentos de Amazonas, Ancash, Ayacucho, Cajamarca, Cusco,

Huancavelica, Huanuco, Jaén, Junin, La Libertad, Lambayeque, Lima, Loreto, Madre de Dios,

Piura, Puno, San Martín (DGE, 2007).

Transmisión

La Enfermedad de Carrión se transmite por la picadura de un vector (mosquito) hembra

Lutzomyia spp., esta especie antropofílica pica en horas de la tarde y al anochecer especialmente

en el campo. Al parecer el único reservorio conocido es el humano, este insecto al picar a un ser

humano infectado adquiere la bacteria y al picar a otro ser humano sano lo infecta y le produce la

enfermedad. Estos insectos obedecen a las diferentes condiciones climáticas de las zonas,

aumentan en número a partir del mes de marzo a junio y luego a partir de julio a noviembre

disminuyen notablemente, viven a una temperatura que fluctúa entre 19 - 23 ºC, requieren de

condiciones húmedas y su tiempo de vida está en promedio de 50 a 60 días. Son holometabolos

(metamorfosis completa) y presentan 4 estadíos: huevo, larva, pupa y adulto. Las Lutzomyias se

alimentan del ser humano y de otros animales como el perro, caballo, roedores, chanchos, cuyes,

etc. No se conoce el lugar de cría exacto (Maguiña, 1998).

Estos mosquitos son llamados por los habitantes de la zona como “titira”, “manta blanca”. Según

la clasificación taxonómica, son artrópodos de la clase Insecta, orden díptera, grupo ortorrafos,

suborden Nematóceros, familia Psichocidae, género Lutzomyia. Son muy pequeños de 2 a 3 mm

de largo, con vellosidades y pelos erectos que les confiere un aspecto característico, son de color

oscuro y patas largas, delgadas y frágiles. Los principales vectores que producen bartonelosis son

las especies L. verrucarum presentes en casi toda la cordillera de los Andes, L. peruensis

9

reportada en Cuzco, además de otras especies reportadas como transmisores L. bicornus, L.

blancasqui, L. caballeroi, L. gorbitizi, L. serrana (Saettone-León, 2004).

Manifestaciones clínicas

Se desarrollan dos fases clínicas en esta infección: una fase aguda “Fiebre de la Oroya” y una

fase eruptiva conocida como “Verruga Peruana”, fase crónica o verrucosa, aunque muchos

autores consideran una tercera fase la intercalar en medio de las dos fases mencionadas

anteriormente, de duración variable, asintomática (Maguiña, 2001).

Después de la picadura del mosquito infectado con Bartonella bacilliformis, esta bacteria se va a

localizar en las células endoteliales (células de strong) y luego penetraran a los glóbulos rojos,

ello estimula al sistema reticuloendotelial haciendo que los histiocitos y macrófagos produzcan

una intensa eritrofagocitosis del complejo hematíe - bartonella, lo que muchas veces causa una

anemia severa. Todo esto toma un tiempo de 61 días de promedio que puede ser en un rango de

10 a 210 días donde aparecen los síntomas que conllevan a la fase aguda apareciendo síntomas

como fiebre, anemia severa hemolítica, cefaléa, dolores musculares, malestar general, asimismo

produce hiperplasia del sistema reticuloendotelial lo que produce linfoadenomegalia,

hepatomegalia y esplenomegalia, etc. ésta etapa dura de 2 a 4 semanas donde la mayoría de

eritrocitos pueden ser infectados, y alrededor del 30 % de los pacientes pueden presentar

infecciones oportunistas, como salmonella, brucelosis, fiebre tifoidea, malaria, tuberculosis,

debido a la disminución de la inmunidad. Esta fase podría resultar fatal en una proporción del 90

% en pacientes no tratados, pero con un adecuado tratamiento se puede reducir en un 9 %,

además la bacteria puede invadir al sistema nervioso central produciendo meningoencefalitis,

parálisis espástica y puede conducir a la muerte (Maguiña, 2001) (Maguiña y Gotuzzo, 2000)

(Mallqui y col., 2000)

Luego de unas semanas desarrollan la fase eruptiva que se manifiesta por la presencia de

erupciones rojas o púrpuras en la piel con bordes bien definidos (Foto No

1), de tamaño variable,

indoloras y pueden ser sangrantes; todo esto debido a una proliferación de células endoteliales.

Las lesiones eruptivas se presentan en miembros superiores, inferiores y en la cara, afectando

principalmente a niños y adolescentes, pueden durar sin tratamiento hasta 36 meses y no dejar

cicatriz; se reconocen tres tipos de lesiones: forma miliar, con pápulas de un diámetro inferior de

3 mm de forma globular y color rojo vivo; la segunda forma mular, con tumores nodulares de

10

diámetro de 5 mm, eritomatosas; y la tercera forma es nodular con nódulos profundos de color de

la piel normal y sin alteración de la superficie cutánea, algunas de estas erupciones pueden ser

confudidas con el sarcoma de kaposi, hemangioma, angiomatosis bacilar hasta varicela

(Maguiña, 1998).

No todos los pacientes con Bartonelosis desarrollan las dos fases sucesivamente, en la fase aguda

pueden llegar a recuperarse, algunos fallecen, y otros desarrollan la fase eruptiva, pero algunos

sin presentar el cuadro clínico de la fase aguda pasan a desarrollar la fase eruptiva (Maguiña,

2001).

2. ANTECEDENTES

La observación de la morfología de la bacteria se determina por la lámina periférica o frotis

sanguíneo, por coloraciones de derivados del Romanowski: Giemsa o Wright, observándose

bacterias bacilares y formas cocoides en la fase aguda, desde 1 al 100 % de bacteremia en

glóbulos rojos determinando la presencia de la bacteria en un 36 % en fase aguda y muy pocas

veces en un 10 % en fase eruptiva, teniendo por tal una sensibilidad baja (DGE, 2007). Se puede

también aislar la bacteria en medio de cultivo agar Columbia al 10 % con sangre desfibrinada de

carnero a 28 º C, este cultivo no requiere de medios especiales, de equipos altamente sofisticados

y no es técnicamente difícil, pero el crecimiento es lento aislando la bacteria en un promedio de 4

a 6 semanas de incubación, donde se observan colonias muy finas blanquecinas de 0,6 µm a 1,0

µm. Debido a que su crecimiento lento, los cultivos deben ser mantenidos hasta por 8 semanas

para ser considerado como negativo (Maguiña, 2001).

Se realizaron estudios de hemoaglutinación (Knobloch y col., 1985), inmunofluorescencia

indirecta (Chamberlin y col., 2000) (Knobloch y col., 1985), PCR (Henríquez y col., 2002)

(Minnick y Barbain, 1997) (Padilla y Ventura, 2003), Western Blot y ELISA (Knobloch y col.,

1985) (Knobloch, 1988)( Knobloch y col., 1988) (Mallqui y col., 2000), así como también la

respuesta humoral y celular en Bartonelosis (Solano, 1983). Los estudios de detección de

anticuerpos por inmunodiagnóstico contra Bartonella bacilliformis que se realizaron fueron a

partir de la obtención de antígeno crudo por lisis celular, por cromatografía líquida de alta

performancia (HPLC) y por proteína recombinante. Knobloch en 1985 a partir de antígeno crudo

de Bartonella bacilliformis determinó anticuerpos IgG en pruebas de enzima- inmunoensayo

(ELISA), ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y hemoaglutinación indirecta (HI),

11

obteniendo 54,6% de positividad para ELISA, 33,7 % para IFI y 27,8 % para HI. Asimismo en

otro estudio, Knobloch en 1988, reporta proteínas desde un rango de 16 a 160 KDa a partir de

antígeno crudo obtenido con triton X-100, por inmunoprecipitacion con antigeno crudo marcado

con 125

I reporta 6 proteinas (18, 26, 36, 48, 65 y 75 KDa) que detectan anticuerpos específicos en

sueros de pacientes con Bartonelosis. Mallqui en el 2000 tambien reportó por inmunoblot

proteínas antigenicas usando antígeno crudo sonicadas de Bartonella bacilliformis, obteniendo

94% de sensibilidad para fase eruptiva y 70% para fase aguda (Mallqui y col., 2000).

Por otro lado no se realizó estudios de inmunoensayo por DOT - ELISA en Bartonella

bacilliformis; pero se tiene referencia de esta técnica para detección de otras bacterias como

Neisseria meningitidis con una sensibilidad de la prueba de 99.1 % y una especificidad de 82.6

% (Adelino y col., 1997), Brucelosis porcina con una sensibilidad de 84 % y sensibilidad de 80

% (Polanco y Comach, 1996). Leptospirosis humana con una sensibilidad de 89.7 % y

sensibilidad de 46.2 % (Polanco y col., 1997)

Por tal motivo se tomó como base los estudios en otras bacterias y se desarrolló en el presente

estudio la prueba de DOT – ELISA usando antígeno crudo de la bacteria B. bacilliformis

obtenida por un proceso de sonicación.

2.1 GENERALIDADES

DOT ELISA

Las siglas provienen de las palabras en inglés: Dot Enzyme-Linked inmmunosorbent assay (DOT

-ELISA) y en castellano es conocido como el método de ELISA de punto. Esta prueba consiste

en fijar pequeñas cantidades de antígenos que colocadas sobre una superficie sólida (membrana

de policarbonato, membrana de nitrocelulosa o fluoruro de polivinilideno (PVDF)) para luego

incubarlos con una muestra biológica en condiciones que permitan la formación del complejo

antígeno – anticuerpo, el cual al añadir una inmunoglobulina específica marcada con una enzima

(conjugado) se unirá al complejo y estas reaccionarán con un sustrato cromogénico y la lectura se

hará visible en corto tiempo en un fondo blanco (Da Silva y col., 1997)(Pappas y col.,

1983)(Polanco y Comach, 1996).

12

DOT - ELISA, descrito por Towbin y col. en 1979 (Ribas y col., 1996) quienes utilizaron por

primera vez el método de inmunoblotting para transferir proteínas del ribosoma desde un gel de

poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa. Posteriormente las técnicas de inmunoblott han

sido usadas para la detección de antígenos y anticuerpos a diferentes microorganismos, se

emplean sistemas de amplificación como el marcaje del conjugado

con oro coloidal para aumentar la sensibilidad del método (Ribas y col., 1996). Inicialmente

emplearon una inmunoglobulina preparada en cabra contra la inmunoglobulina G humana

conjugada con la enzima peroxidasa, luego fue mejorada por el cambio de otra enzima, la

fosfatasa, que mostró ser más sensible y activa a temperaturas superiores a las del laboratorio.

Por la versatilidad de esta técnica mejorada, sin uso de equipos para interpretar los resultados, su

empleo en regiones rurales aisladas puede ser muy valiosa, además se requieren de pequeñas

cantidades de reactivos, por lo que es posible su utilización al ser una prueba de fácil manejo y

sin mucho costo (CONCYTEC, 1988).

Sensibilización del antígeno:

Esta prueba nos permite obtener información acerca de la identidad de las proteínas, al ser

transferidas a membranas de policarbonato o nitrocelulosa o PVDF, donde estarán accesibles para

interaccionar con otras moléculas que permitan su identificación. Las proteínas quedan unidas a

estas membranas de forma no covalente, mediante interacciones electroestáticas e hidrofóbicas,

de esta forma, se determina una proteína específica simultáneamente por su antigenicidad y su

masa molecular, en esta prueba se usó discos de membrana de policarbonato colocadas en

microplacas de 96 pocillos, estas microplacas son fabricadas desde el cloruro de polivinilo hasta

de poliestireno (Esser, 1988) (Filtros de membrana, 2007).

La concentración óptima de antígeno se determinó por titulación y va depender de la clase de

antígeno que se emplee (proteínas recombinantes, péptidos sintéticos, antígenos crudos, etc),

tomando en cuenta que concentraciones elevadas pueden provocar la pérdida de sensibilidad del

ensayo por la formación de sobrecapas las cuales causan interacciones menos estables con los

reactivos. La solución en la que se diluye el antígeno para el revestimiento es con soluciones

amortiguadoras o tampones de sensibilización, los principales son: solución bicarbonato

13

carbonato pH 9,6; tris HCl pH 8,5 y solución tamponada fosfato salino (PBS) pH 7,2; la elección

depende del tipo de proteínas que se van a adherir, para esta prueba elegimos solución tamponada

fosfato salino (PBS) pH 7,2 (Da Silva y col., 1997) (Piedad y col., 2005) (Polanco y Comach,

1996)(Polanco y col., 1997).

Lavados:

Los pasos de incubación permiten una alta afinidad por parte de los reactantes, y lavando los

pocillos de las microplacas entre cada incubación se elimina los componentes libres o unidos de

manera no específica al inmunoreactante inmovilizado en la placa. El proceso de lavado

involucra llenar y vaciar cada uno de los pocillos con un líquido de referencia que se hace por

tres veces con intervalos de 5 minutos y el líquido que se utiliza generalmente son soluciones

isotónicas (PBS) suplementadas muchas veces con detergentes no iónicos (Tween 20) para evitar

reacción entre anticuerpos o antígenos (Montoya y León, 1997) (Polanco y Comach, 1996). En la

actualidad muchos laboratorios equipados utilizan lavadores automatizados pero este

procedimiento se puede realizar manualmente como lo desarrollamos en el presente trabajo,

además será de fácil manejo para el personal que trabaje en áreas endémicas donde la

disponibilidad de equipos es limitada.

Reacción Antígeno – Anticuerpo:

La reacción antígeno - anticuerpo se inicia al agregar la muestra, para evitar reacciones

inespecíficas se debe de diluir la muestra en PBS. Esta reacción dependerá de las

concentraciones, diluciones de los reactantes, tiempo y temperatura de incubación. Generalmente

se incuba a temperatura ambiente por 30 minutos (CONCYTEC, 1988), algunos indican que la

muestra puede ser diluida también con agentes bloqueantes y/o detergente diluidos en PBS

(CONCYTEC, 1988) (Montoya y León, 1997). Todo esto dependerá de la disponibilidad de

reactivos y soluciones en el laboratorio, y de la forma empírica que se trabaje.

Reacción con conjugado:

Usualmente los conjugados son anticuerpos unidos a una enzima, conocidos también como

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anticuerpos secundarios que pueden ser adquiridos comercialmente o ser preparados en el

laboratorio. Se recomienda establecer la dilución apropiada del anticuerpo secundario y el tiempo

de incubación óptimo. Las enzimas comúnmente empleadas para marcar los anticuerpos son la

fosfatasa alcalina y la peroxidasa, estas están unidas por enlaces covalentes al anticuerpo que van

a detectar al complejo antígeno – anticuerpo (Montoya y León, 1997); hay una gran variedad de

conjugados con respecto a su afinidad, y su elección va depender del tipo de ensayo y de la

especificidad que se requiera. Están los conjugados IgG (H+L) que reconocen epítopes tanto de

cadena pesada como ligera y pueden reaccionar con otras clases de inmunoglobulinas que tienen

cadenas ligeras en común con la Ig G. Otros conjugados con cadena pesada específica (Anti-

heavy specific antibodies, IgG, IgM, IgA e IgE) son útiles solo para la cuantificación exacta de

cadenas pesadas de anticuerpos presentes en muestras que contienen otras inmunoglobulinas y

proteínas tales como en suero o en cultivos celulares. Escogimos para este trabajo antihumano

IgG (γ- cadena específica) fosfatasa alcalina producida en cabra.

Acción del sustrato:

En los ensayos se trabajaron con antihumano IgG (γ- cadena específica) fosfatasa alcalina

producida en cabra, ésta tiene como sustrato cromógeno BCIP/NBT (5-bromo-4-cloro-3-indolyl

fosfato/nitro azul tetrazolio) que al ser reducido produce oxígeno y éste a su vez oxida, al cual

degrada la enzima y produce la formación de un precipitado de color púrpura. Este proceso

sucede cuando la enzima del conjugado es detectada por el sustrato (Montoya y León, 1997).

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS

Se determinó por el método de Bradford que se basa en el acoplamiento del colorante con la

proteína y se determina colorimetricamente, existiendo una relación entre el color y la

concentración de proteínas. El principio de Bradford es principalmente por el colorante que lo

constituye: el azúl de Coomassie G-250 que al unirse a las proteínas desplaza su máxima

absorción de longitud de onda de 465 nm a 595 nm generando un color azúl. La concentración de

proteínas de una muestra se determina por la comparación de una serie de proteínas estándares

conocidas que presentan reproducibilidad en un rango de absorbancias lineales. Se usa

15

mayormente la proteína Albúmina Sérica Bovina (BSA), la cual a partir de esta solución se

prepara los estándares de referencia y se construye una curva de referencia o estándar con valores

conocidos las que se compara con las muestras experimentales para determinar en ella la

concentración de proteína total (Bradford, 1976).

En los ensayos se utilizaron un producto comercial del laboratorio Bio-Rad, que es una

modificación de Bradford que ocasiona un incremento en la concentración del colorante,

desarrollando una mayor sensibilidad y una marcada disminución en la variabilidad del color con

diferentes proteínas, lo cual es la principal ventaja del método; además por su simplicidad

(solamente un reactivo), su rapidez en cinco minutos, y la facilidad de trabajar también en

microplacas hace que sea un método fácil y efectivo de desarrollar.

AGENTE BLOQUEANTE

Al revestir antígeno a la microplaca de 96 pocillos con los discos de membrana de policarbonato

en el cual la unión no específica de antígeno puede ser reducida al bloquear los sitios no

ocupados de la membrana con una proteína inerte o un detergente no iónico, estos deben ser

bloqueados o tapados para prevenir reacciones de uniones inespecíficas, sino se realiza el

bloqueo, el ensayo puede producir señales de fondo que afecten la especificidad y sensibilidad.

Estos bloqueantes son escogidos de manera empírica y pueden ser proteínas inertes o detergentes

dependiendo del uso y disponibilidad, siendo los más usados la leche descremada, BSA y Tween-

20 (<0,05 %) v/v) (Carolina y col., 1986) (Eamsobhana y col., 2004) (Gonçalves y col., 2001).

En los ensayos se utilizo BSA como el agente bloqueante, el cual se disponían en el laboratorio,

el cual resulto óptimo para nuestra prueba.

3. MATERIALES Y METODOS

3.1 MATERIALES

Cepa

Bacteria Bartonella bacilliformis cepa ATCC 35685, subcultivo proveniente del Instituto

16

Nacional del Niño-Perú donado por el Dr. Rito Serpa.

Sueros

Titulación del antígeno, dilución de suero, dilución de conjugado

Grupo de 4 sueros: 2 de fase aguda y 2 de fase eruptiva, ambos con diagnóstico de

hemocultivo positivo (Prueba de oro) a Bartonelosis. (provenientes de Ancash de las

zonas de Caraz, Yuracoto, Parón).

Grupo de 4 sueros negativos provenientes de donantes voluntarios (que no proceden

de áreas endémicas y que no fueron contactos de personas que hayan tenido la

enfermedad).

Estandarización

51 sueros positivos con diagnóstico a Bartonelosis por hemocultivo, pertenecientes de

la seroteca del Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboltd de la

Universidad Peruana Cayetano Heredia (provenientes de Huaraz, Lima, Chimbote,

Canta, Santa Eulalia) y sueros donados por la Dirección General de Epidemiología

(provenientes de Ancash de las zonas de Caraz, Yuracoto, Parón) los cuales han sido

conservados a – 20 oC.

32 sueros controles negativos pertenecientes de la seroteca del Instituto de Medicina

Tropical Alexander von Humboltd de la Universidad Peruana Cayetano Heredia

(provenientes de los departamentos de Lima, Huaraz, Chimbote, Cuzco) los cuales

han sido conservados a - 20 oC.

Agente Bloqueante

BSA (Albúmina Sérica Bovina - SIGMA)

Conjugado

Antihumano IgG (γ- cadena específica) fosfatasa alcalina producida en cabra

(SIGMA)

Detergente

17

Tween 20 (HIMEDIA)

Solución BRADFORD

Kit de ensayo de Proteínas Bio-Rad Bradford.

Sustrato cromógeno

Solución insoluble de Fosfatasa Alcalina (5 – Bromo – 4 Cloro – 3 – Indolyl Fosfato)

(Nitro Azul Tetrazolium) (SIGMA-FAST)

3.2 MÉTODOS

PREPARACIÓN DE UN ANTÍGENO CRUDO SOLUBLE

La bacteria Bartonella bacilliformis cepa ATCC 35685 se cultivó en medio agar base

Columbia (HIMEDIA) con 10% de sangre desfibrinada de carnero y se incubó a 28º C

por 7 días.

Las colonias se recogieron con un asa de siembra en condiciones estériles y se

lavaron tres veces con solución tamponada fosfato salino (PBS) a pH de 7,2.

El sedimento se resuspendió en PBS y las células se lisaron por un proceso de

sonicación (SONICATOR 3000 - MISONIX) a 3 I (intensidad) con potencia de 21 W

en tubos suspendidos dentro de un recipiente de hielo durante un minuto por siete

veces con intervalos de un minuto de descanso entre cada proceso.

Los organismos sonicados se centrifugaron a 10,000 g por 20 minutos a 4ºC

(MICROCENTRIFUGA - SIGMA), y el sobrenadante se separó a nuevos tubos

alicuotándolos en tubos de 1,5 ml para ser mantenidos a - 20 ºC hasta antes de su uso

(Knobloch, 1988) (Knobloch y col., 1988).

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Las proteínas obtenidas se determinaron por el método de Bradford, el cual se desarrollo en

microplacas, utilizando como proteína estándar para la curva de calibración concentraciones de

BSA desde 0,05 mg/mL hasta 0,5 mg/mL de la siguiente manera:

El reactivo Bradford (Dye Reagent Concentrate) se preparó con agua destilada en una

proporción de 1:4 y se agregó 200 µL a los pocillos de una microplaca de 96 pozos de

fondo plano.

18

Luego se preparó las concentraciones del BSA (0,05; 0,0625; 0,1; 0,125; 0,2; 0,25;

0,4; 0,5 mg/mL) y se agregó 10 µL de cada una de ellas y como blanco del reactivo se

agregó a uno de los pocillos agua destilada en lugar de BSA.

Se agregó también 200 µL de solución diluida de Bradford más 10 µL del antígeno

para conocer la concentración de proteína, y para tener un blanco de reactivo en lugar

del antígeno se agregó PBS para antígeno.

Se realizó la lectura en un lector de ELISA Bio-Rad (MODEL 3550 – MICROPLATE

READER) a una longitud de onda de 595nm y las concentraciones se hallaron por la

curva estándar del BSA (concentraciones versus absorbancias). Todo este

procedimiento se hizo por duplicado y varias veces para confirmar la estabilidad de la

proteína antes de ser usada.

PROCEDIMIENTO DEL DOT – ELISA

Titulación de antígeno

Se hicieron diferentes concentraciones de antígeno diluidas en PBS a pH 7,2 para

hallar la concentración óptima desde 0.017 hasta 2 µg/µL (Knobloch y col., 1985).

(Tabla 1) (Foto No 2 y 3)

A cada pocillo de una microplaca (NUNC – Immuno Plate MaxiSorp Surface) se

colocó discos de membrana de policarbonato y se dispensó 1 μL de las diluciones del

antígeno por duplicado é incubo por 30 minutos a temperatura de 56° C (La placa se

guardó a -20ºC hasta antes de uso) (CONCYTEC, 1987).

Bloqueo

Se bloqueó con 3 % de BSA diluido en 0.3 % de Tween 20 – PBS (TPBS) y se agregó

75 μL.

Se incubó por 1 hora a temperatura ambiente (21-24ºC).

Se lavó con 100 µl de TPBS por tres veces con intervalos de 5 minutos (CONCYTEC,

1987) (Pappas y col., 1983) (Piedad

y col., 2005) (Polanco y Comach, 1996) (Polanco

y col., 1997).

Nota:

19

Los lavados se hicieron con TPBS agregando 100 μL en cada pozo con un intervalo de 5 minutos

entre un lavado y otro por 3 veces, el lavado se hizo manualmente con ayuda de una pipeta

multicanal. Procedimiento que se realizó después de cada proceso de incubación.

Titulación del suero

Se agregó 75 µL de los sueros control positivo (fase aguda mas fase verrucosa) y

sueros negativos que fueron diluidos en PBS desde diluciones de 1:50, 1:100, 1:200 y

1:400. (Tabla 1)

Se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente. Se lavó con TPBS la microplaca.

Titulación del conjugado

Se agregó 75 µL del conjugado Antihumano IgG (γ- cadena específica) fosfatasa

alcalina producida en cabra a diferentes diluciones: 1:150, 1:300, 1:600, diluidas en

TPBS con BSA al 3 %.

Se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente. Luego con la micropipeta

multicanal se aspiró y se lavó con una solución de NaCl al 1,15M por 30 segundos.

Se realizó otro lavado con 100 µL de TPBS por tres veces con intervalos de 5

minutos.

Luego se agregó 75 µL del sustrato cromógeno que consta de: solución insoluble de

Fosfatasa Alcalina (5 – Bromo – 4 Cloro – 3 – Indolyl Fosfato) (Nitro Azul

Tetrazolium) (SIGMA FAST) diluido en agua desionizada.

Se incubó por 4 a 6 minutos en oscuridad a temperatura ambiente y se lavó con TPBS

(CONCYTEC, 1987) (Pappas y col., 1983) (Piedad

y col., 2005) (Polanco y Comach,

1996).

Estandarización de la técnica

Luego de que se determinó por titulación las concentraciones y diluciones adecuadas para

antígeno crudo, se realizó la estandarización (Grafico Nº 1):

20

Se fijó antígeno a la concentración de 0,5 μg/μL en los discos de membrana de

policarbonato que estuvieron dispuestos en la microplaca.

Los sueros se diluyeron en TPBS con BSA al 3%. y se dispensaron 75 μL en cada

pocillo de la microplaca (NUNC – Immuno Plate MaxiSorp Surface).

Se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron tres veces con 100

μL PBST.

Se agregó 75 μL de conjugado diluido en TPBS con BSA al 3 % y luego se aspiró y se

lavo con 75 μL de solución de NaCl al 1.15M por 30 segundos, y se continúo el

lavado con 100 μL de PBST por tres veces con intervalos de 5 minutos.

Luego se agregó 75 µL del sustrato cromógeno (el mismo que se usó para la

titulación) y se dejó incubar por 6 minutos en oscuridad a temperatura ambiente,

seguido de un último lavado con TPBS.

Se consideró una muestra positiva o negativa, según la siguiente lectura visual:

Positivo: puntos de color púrpura intenso en los discos de membrana de policarbonato.

Negativo: ausencia o color tenue púrpura en los discos de membrana de policarbonato.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Para determinar la capacidad discriminante del DOT - ELISA, se estimaron los parámetros de

exactitud diagnostica de sensibilidad y especificidad (Fernández, 2003) a partir de la tabla 2 entre

la prueba de referencia (cultivo) y DOT – ELISA. Los Valores predictivos positivos y negativos

se realizaron mediante el teorema de Bayes (Fegan, 2008) (Fernández, 2003) tomando una

prevalencia de 1,6 % para Bartonelosis de un estudio de 1039 casos febriles realizado en la

provincia de Jaén (Troyes y col., 2006).

Sensibilidad

Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo enfermo, es decir, la probabilidad

de que para un sujeto enfermo se obtenga en la prueba un resultado positivo (Fernández, 2003).

Especificidad

21

Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo sano, es decir, la probabilidad de

que para un sujeto sano se obtenga un resultado negativo (Fernández, 2003).

Valor Predictivo

Los conceptos de sensibilidad y especificidad permiten, por lo tanto, valorar la validez de una

prueba diagnóstica. Sin embargo, carecen de utilidad en la práctica clínica. Tanto la sensibilidad

como la especificidad proporcionan información acerca de la probabilidad de obtener un

resultado concreto (positivo o negativo) en función de la verdadera condición del enfermo con

respecto a la enfermedad. Pero, cuando a un paciente se le realiza alguna prueba, el médico

carece de información a priori acerca de su verdadero diagnóstico, y más bien la pregunta se

plantea en sentido contrario: ante un resultado positivo (negativo) en la prueba, ¿cuál es la

probabilidad de que el paciente esté realmente enfermo (sano)?.

El teorema de Bayes permite el cálculo de la probabilidad de que un paciente padezca una

determinada enfermedad una vez dados unos síntomas concretos. La capacidad predictiva de un

test o de una prueba diagnóstica suele venir dada en términos de su sensibilidad y especificidad

(Fernández, 2003).

Tanto la sensibilidad como la especificidad son propiedades intrínsecas a la prueba diagnóstica, y

definen su validez independientemente de cuál sea la prevalencia de la enfermedad en la

población a la cual se aplica. Sin embargo, carecen de utilidad en la práctica clínica, ya que sólo

proporcionan información acerca de la probabilidad de obtener un resultado concreto (positivo o

negativo) en función de si un paciente está realmente enfermo o no. Por el contrario, el concepto

de valores predictivos, a pesar de ser de enorme utilidad a la hora de tomar decisiones clínicas y

transmitir información sobre el diagnóstico, presenta la limitación de que dependen en gran

medida de lo frecuente que sea la enfermedad a diagnosticar en la población objeto de estudio. El

Teorema de Bayes permite obtener el valor predictivo asociado a un test al aplicarlo en

poblaciones con índices de prevalencia muy diferentes (Fernández, 2003).

22

Valor Predictivo Positivo (VPP) (Fegan, 2008)

Es la probabilidad de padecer la enfermedad si se obtiene un resultado positivo en el test.

Valor Predictivo Negativo (VPN) (Fegan, 2008)

Es la probabilidad de que un sujeto con un resultado negativo en la prueba esté realmente sano.

23

4. RESULTADOS

CONCENTRACIÓN DEL ANTÍGENO

La concentración de proteínas obtenida de la producción de antígeno fue de 1,7 µg/µL. Estas

proteínas provienen del lisado de la bacteria y su separación por un tiempo de centrifugación por

lo que se le denominó antígeno crudo o extracto crudo soluble.

TITULACIÓN

La concentración de antígeno óptima fue de 0,5 µg/µL (Foto Nº 5).

La dilución de suero: 1:50, tanto para fase aguda como eruptiva, inicialmente se

trabajó por separado ambos grupos de suero y no presentaron diferencias en la

intensidad de color, por tal motivo se estandarizó la prueba para las dos fases sin

diferencia alguna en los resultados.

La dilución del antihumano IgG (γ- cadena específica) fosfatasa alcalina producida en

cabra fue de: 1:300. (Foto No 3, 4, 5, 6 y 7)

ESTANDARIZACIÓN

Después de encontrar la dilución óptima del antígeno, del suero y del conjugado se procesaron

los sueros controles y los casos confirmados por hemocultivo.

Según la tabla 2, se realizó el análisis estadístico (Grafico N0

2), con una sensibilidad de 72.5 % y

especificidad de 71.9 %, para la prueba, como se muestra en tabla 3.

Los resultados se hallaron con respecto a la tabla 2 para comparar los obtenidos por DOT -

ELISA y la prueba de referencia, además para hallaron los valores predictivos positivos y

negativos (Grafico N0

2) estos valores fueron de 80.3 % y 52.1 % respectivamente (Tabla N0

3).

24

5. DISCUSION

La producción de antígeno crudo tuvo una concentración de proteínas solubles de 1,7 µg/µL,

provenientes de membrana, pared celular y citosol (Knobloch, 1988).

Por titulación se determinó las concentraciones óptimas para la prueba, se evaluaron diferentes

concentraciones de antígeno con diluciones de suero a una dilución fija de conjugado 1:300, y se

determinó la concentración óptima de antígeno de 0,5 µg/µL a una dilución de 1:50 (Foto Nº 5),

al observar un punto con una intensidad de color definido (Foto Nº 6) con respecto a las demás

diluciones con poca intensidad, como en el caso de los sueros negativos (Foto Nº 7). Para

establecer la dilución óptima del conjugado antihumano IgG fosfatasa alcalina (1:300) se

enfrentó diferentes diluciones de suero y conjugado además se corroboró la dilución de suero

obtenida con el antígeno.

La sensibilidad del DOT - ELISA para detectar inmunoglobulinas demuestran la capacidad

inmunogénica del antígeno de Bartonella bacilliformis para reconocer los anticuerpos específicos

presentes en los sueros. El uso de membranas de nitrocelulosa como soporte de los antígenos y

anticuerpos tiene varias ventajas sobre los procedimientos convencionales de inmunoensayo

(ELISA) (Hatam y col., 2007), en este estudio se utilizó como soporte discos de membrana de

policarbonato que remplazaron al de nitrocelulosa, teniendo como beneficio el costo y la

distribución uniforme de la muestra en un plano a través de la superficie completa de la

membrana, además de encontrarse accesible en el laboratorio; asimismo se usó pequeños

volúmenes de antígenos y anticuerpos específicos para la prueba (Da Silva y col., 1997), tiempos

de incubación cortos, con resultados visuales que evitaron el empleo de equipos costosos, como

las técnicas de ELISA.

La prueba se estandarizó con un panel de 83 sueros, distribuidos en dos grupos: 51 sueros

positivos a Bartonelosis y 32 sueros negativos a la enfermedad, se trabajaron por duplicado y

cada ensayo incluía sus respectivos controles de placa que no contenían los sueros, por tal no

reaccionaban con los reactantes y aseguraba una posible contaminación. El análisis estadístico

calculó una sensibilidad de 72.5 % y especificidad de 71.9 %, para la prueba; obteniendo una

mayor sensibilidad que la lámina periférica de 36% (Chamberlin y col., 2000) y a su vez estos

resultados discrepan con los obtenidos por Knobloch en 1985, quien reportó 54,6 % de

25

positividad para ELISA y a su vez obteniendo una mayor especificada que las técnicas de

inmunofluorescencia indirecta 33,7 % y hemoaglutinación indirecta 27,8 % (Knobloch y col.,

1985) y un resultado concordante a las que obtuvo Mallqui en el 2000 donde la sensibilidad fue

de 70% por inmunoblot en pacientes en fase crónica a Bartonelosis (Chamberlin y col., 2000), y

Padilla en el 2006 reporta una sensibilidad de 70,4 % en un ELISA IgG utilizando una proteína

recombínate (Padilla y col., 2006).

Los valores predictivos positivos (VPP) y negativos (VPN) al usar antígeno crudo en sueros,

muestra que la probabilidad de que los positivos por DOT - ELISA provengan de pacientes

enfermos son de 80,3 % y que la probabilidad de que los negativos sean de pacientes sanos es de

52,1 %. Los valores predictivos no fueron muy altos porque dependieron de la sensibilidad y

especificidad de la prueba.

En este estudio se estandarizó y se evaluó la prueba de DOT - ELISA utilizando parámetros

semejantes a los reportados por otros investigadores (Da Silva y col., 1997) (Eamsobhana y col.,

2004) (Hatam y col., 2007) (Montenegro y col., 1999) (Pappas y col., 1983) (Piedad y col., 2005)

(Polanco y Comach, 1996) (Polanco, 1997)(Ribas, 1996); algunas pruebas como en el caso

Brucelosis porcina presentaron una sensibilidad de 84% y especificidad de 80% y para

Leptospirosis humana IgG se observo un 70%. Comparando los resultados obtenidos con otras

pruebas de DOT – ELISA, en el caso de dilución de suero (1:50) coincide con el reportado por

Da Silva y col., 1997, mas no los datos de volúmenes de sueros, en el cual empleamos 75µL

mientras que para Leptospirosis humana se empleo 100 µL.

Los resultados obtenidos demuestran que el DOT - ELISA elaborado con antígeno crudo y

utilizando discos de membrana de policarbonato son una buena alternativa para el diagnóstico de

Bartonelosis, ya que permite obtener resultados de una forma rápida y fácil, tiene poca

complejidad técnica, es de fácil manipulación, emplea pocos reactivos y proporciona una

información diagnóstica rápida.

Las condiciones de ejecución de la prueba son aplicables a cualquier laboratorio de áreas

endémicas, proporcionando un instrumento útil de diagnóstico para los laboratorios que carezcan

de equipo, infraestructura necesaria o personal entrenado. Por su fácil implementación y la

estabilidad de los reactivos utilizados, constituye el método de elección para fines de vigilancia

26

epidemiológica que pueden servir de base a futuros estudios sobre control de la enfermedad, para

la evaluación de programas de vigilancia y el control de la Bartonelosis en zonas endémicas

(Hatam y col., 2007).

6. CONCLUSIONES

1. Se llegó a desarrollar la técnica del DOT-ELISA para la detección de anticuerpos anti-

27

Bartonella bacilliformis

2. Se llegó a producir antígeno de Bartonella bacilliformis, la que tenía una

concentración de 1,7 µg/µL de proteínas.

3. Las titulaciones obtenidas para el suero fue de 1:50, la dilución de conjugado

antihumano IgG (γ- cadena específica) fosfatasa alcalina producida en cabra fue de

1:300 y la concentración óptima del antígeno fue de 0,5 µg/µL,.

4. La prueba del DOT-ELISA tuvo una sensibilidad de 72,5 % y una especificidad de

71, 9 %., siendo una alternativa que complementa los estudios seroepidemiológicos y

el diagnostico de Bartonelosis.

5. Con los resultados de sensibilidad y especificidad se obtuvo un valor predictivo

positivo de 80.3 % y el valor predictivo negativo de 52.1 %

7. RECOMENDACIONES

1. Esta prueba puede ser utilizada como tamizaje en áreas endémicas febriles.

28

2. Innovar estudios que permitan evaluar la prueba con extractos antigénicos

semipurificados o purificados, recombinantes o sintéticos.

8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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39. Xu Y, Chain Y. Bartonella bacilliformis: Molecular Mechanics of Invasión. J Biol Med

2002; 19: 56-58.

9. ANEXOS

Flujograma

34

Grafico No 1. Flujograma (Esquema de Trabajo): Esquema detallado de la metodología de este

trabajo. La etapa de Análisis Estadístico se realizó luego de la obtención de los datos de los

ensayos utilizados en este trabajo y estos dieron paso a los resultados y posteriormente a las

conclusiones del trabajo.

Preparación del antígeno

Dispensar el antígeno en discos de papel nitrocelulosa

Incubar 30 min a 56ºC

Suero diluído del paciente

Agregar Bloqueante

Conjugado: antihumano IgG marcado con fosfatasa alcalina

Sustrato: 5 – Bromo – 4 Cloro – 3 – Indolyl Fosfato) (Nitro Azul Tetrazolium) (SIGMA FAST)

Lectura visual

Incubar 1h a TA y lavar tres veces

Incubar 30 min a TA y lavar tres veces

BSA al 3 % diluído en PBS con 0,3% de Tween 20

Cultivar B. bacilliformis a 29ºC x 7días

Incubar 30 min a TA y lavar tres veces

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Foto No 1.- Foto de niña que presenta lesión verrucosa. Laboratorio de Microbiología

Experimental del Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt.

Foto No 2.- Titulación de diferentes concentraciones de antígeno a una dilución de conjugado

1:200. Concentraciones de antígeno (filas) y sueros controles positivos (columnas): FA (fase

aguda), FV (fase eruptiva) y C (suero negativo. Se observa a la concentración de 0,5 µg/μL y a

una dilución de suero1:50 una mayor nitidez que en las otras concentraciones de antígeno.

Laboratorio de Microbiología Experimental, IMT (Julio-2007)

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Foto No 3.- Titulación de diferentes concentraciones antígeno a una dilución de conjugado a

1:300. Se observa en este ensayo la concentración 0,5 µg/μL (fila 2, columna 7 a la 12) la

concentración óptima con respecto a las demás concentraciones. Además tanto en sueros de fase

aguda (FA) y fase eruptiva (FV) no hay diferencia.de intensidad en los puntos. Laboratorio de

Microbiología Experimental, IMT (Agosto - 2007)

Foto No 4.- No se observa puntos definidos a estas concentraciones de la titulación de antígenos;

descartando las concentraciones 0,125; 1,06; 0,03; 0,017 µg/μL para los siguientes ensayos.

Laboratorio de Microbiología Experimental, IMT. (Agosto -2007)

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Foto No 5.- Panel de titulación de concentraciones de antígeno 0,5; 0,25; 0,125 µg/μL y

diluciones de suero 1:50; 1:100 con dilución del conjugado 1:300. Se observa con nitidez el

positivo (fila 4, columna 1 y 2) y el negativo (fila 4, columna 7 y 8) dando como resultado las

concentraciones óptimas de 0,5 µg/μL para antígeno, dilución de 1:50 para suero y una dilución

de 1:300 para conjugado. Laboratorio de Microbiología Experimental, IMT. (Agosto -2007)

Foto No 6.- En este grafico se visualiza el punto (DOT) de la concentración óptima de antígeno

(0,5µg/μL) a una dilución de suero 1:50 y conjugado 1:300 con respecto a las demás

concentraciones. Laboratorio de Microbiología Experimental, IMT. (Agosto -2007)

38

Foto No 7.- Se visualiza el control negativo a la concentración óptima de 0,5µg/μL de antígeno y

a una dilución de suero1:50 y conjugado 1:300. Laboratorio de Microbiología Experimental,

IMT. (Agosto - 2007)

TABLA 1.- PANEL DE LA PRUEBA DOT-ELISA PARA LA DETERMINACIÓN DE LA

CONCENTRACIÓN ÓPTIMA DEL ANTÍGENO Y SUERO.

Diluciones de Sueros

Positivos Negativos

1:50 1:100 1:200 1:400 1:50 1:100 1:200 1:400

A 2 µg/μL .................................................................................. Conjugado

B 1,5 µg/μL .................................................................................. Conjugado

C 1 µg/μL .................................................................................. Conjugado

D 0,5 µg/μL .................................................................................. Conjugado

Se titularon cuatro diluciones de los sueros positivos y negativos contra cuatro diferentes

concentraciones del antígeno a una dilución del conjugado 1:300.

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TABLA 2.- TABLA PARA LA COMPARACIÓN DE LA PRUEBA REFERENCIAL (CULTIVO

POSITIVO) Y LA PRUEBA A ESTANDARIZAR DOT - ELISA.

PRUEBA REFERENCIA (cultivo Positivo)

PRUEBA (DOT -

ELISA) POSITIVO NEGATIVO TOTAL

POSITIVO a b a+b

NEGATIVO c d c+d

TOTAL a+c b+d n

TABLA 3. CUADRO DE DOBLE ENTRADA ENTRE EL PRUEBA DE REFERENCIA (CULTIVO

POSITIVO) Y DOT- ELISA.

PRUEBA DE REFERENCIA

CULTIVO POSITIVO

POSITIVO NEGATIVO TOTAL

DO

T-E

LIS

A

POSITIVO 37

9

46

NEGATIVO 14

23

37

TOTAL 51 32

Mediante el cuadro de doble entrada se obtuvo la Sensibilidad de 72.5 % y

especificidad de 71.9 %. Los valores predictivos positivos y negativos fueron de

80.3 % y 52.1 % respectivamente.

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Grafico No 2.- Metodología estadística de sensibilidad, especificidad y el teorema de Bayes

(Valor predictivo positivo y negativo).

Valor Predictivo Positivo = Sensibilidad x Prevalencia

Sensib. x Prev. + (1-Especif.) (1-Prev.)

Valor Predictivo Negativo = (1-Sensibilidad) (Prevalencia)

(1-Sensib.) (Prev.) + (Especif.) (1-Prev.)

cnegativosfalsosapositivos

apositivosadSensibilid

bpositivosfalsosdnegativos

dnegativosdadEspecifici