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UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas Relación entre el metabolismo y los cambios electrofisiológicos producidos por la glucosa en neuronas secretoras de acocil TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN LA ESPECIALIDAD DE FISIOLOGIA PRESENTA MAURICIO ROMICAMPERO ASESOR: CARLOS G. ONE-TTI PERCELLO colima, col., agosto de 1995
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UNIVERSIDAD DE COLIMAFACULTAD DE MEDICINA
Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas
Relación entre el metabolismo y los cambioselectrofisiológicos producidos por la glucosa en
neuronas secretoras de acocil
TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS
EN LA ESPECIALIDAD DE
FISIOLOGIA
PRESENTA
MAURICIO ROMICAMPERO
ASESOR: CARLOS G. ONE-TTI PERCELLO
colima, col., agosto de 1995
INTRODUCCION
El sistema neurosecretor órgano X-glándula sinusal
(OX-G.51 tiene muchas características en común al sistema
hipotálamo-neurohipófisis de vertebrados por las siguientes
razones:
Primero, los d o s sitemas estan morfológicamente
definidos, núcleo supraóptico y paraventricular -órgano X;
tracto hipotálamo neurohipófisis - tracto de la glándula
sinusal; neurohipófisis - glándula sinusal. Segundo, todos
los factores activos que secretan parecen ser péptidos; de
hecho, algunos se han aislado y secuenciado; y debido a las
características morfológicas de ambos sistemas ha sido
posible estudiar en ambos los mecanismos de producción,
transporte y liberación de los péptidos que producen.
Tercero, existe información comparable acerca de la
modulación sináptica y/o hormonal, pero esta lejos aún de
ser completa. Cuarto, las neuronas que constituyen estos
sistemas son comparables desde el punto de vista
electrofisiológico.
Además el OX ofrece algunas ventajas metodológicas:
1 . La localización superficial del principal cúmulo
neurona1 que constituye el OX, permite su visualización ín
sítu por microscopía de luz, lo que representa una ventaja
importante para efectuar fijación de voltaje en célula
completa.
2. No se requiere tratamiento enzimático para remover
el tejido que rodea la región.
3. Por tratarse de una preparación de invertebrados no
se requieren condiciones especiales para mantener su
viabilidad como control de humedad, oxigenación de la
solución de perfusión adición de nutrientes al medio.
4. El tracto OX-GS es perfectamente visible al
microscopio estereoscópico, lo que permite efectuar
maniobras experimentales como la axotomía.
2
El sistema neurosecretor órgano X-glándula sinusal.
Con la descripción del tejido nervioso con apariencia
glandular en el tallo ocular de los crustáceos, nace la
fisiología de la neurosecreción en este grupo zoológico.
Hanström (1935) y luego Welsh (1941) localizaron un
acúmulo neurona1 en la porción ventromedial de la médula
terminal al que denominaron como el Organo X. Luego se
conoció que las neuronas de este órgano proyectan sus
axones a un órgano neurohemal, la glándula sinusal.
En los acociles, este órgano está constituído por 100
a 150 cuerpos neuronales, algunas veces reconocido en el
material fresco por su iridiscencia, en la periferia del
ganglio dimetralmente opuesto a la glándula sinusal.
Cada soma contribuye con un axón para formar el tracto
OX-GS, son axones amielínicos con diámetro entre 2 y 8 pm
(Andrew y Saleuddin, 1977). La microscopía electrónica ha
mostrado la presencia de gránulos de neurosecreción
asociados al sistema microtubular (Andrew y col. 1978).
La glándula sinusal es una verdadera estructura
neurohemal ya que esta compuesta de dilataciones de la
terminal axónica, células gliales y células de soporte
yuxtapuestas con senos hemolinfáticos. Como se revela por
la inyección intracelular del colorante amarillo lucifer
(Nagano, 1986) cada axón se divide dentro de la glándula
sinusal para formar una extensa arborización de
varicosidades y terminales.
3
Las terminales han sido clasificadas de acuerdo a la
forma, tamaño y características de tinción de sus gránulos.
Se han encontrado cinco tipos en Procambarus clarkii (Bunt
y Ashby, 1976).
El axón proximal de cada célula del OX emite
arborizaciones colaterales que entran al neuropilo del
ganglio (Andrew y cols., 1978; Jaros, 1978; Nagano, 1986).
Iwasaki y Satow (1971) sugieren que este puede ser el sitio
de regulación por medio de sinapsis química.
Estudios de ablación y reinyección de extractos han
mostrado que el OX esta implicado en el control de un gran
número de respuestas hormonales. Estas incluyen:
movimiento de pigmentos epidérmicos, la entrada de luz ha
las células fotoreceptoras, la actividad locomotora,
inhibición de la muda, elevación de los niveles de glucosa
y regulación de la actividad de órganos reproductores.
Los péptidos de cierto número de especies de crustáceos
han sido analizados por elecroforesis en gel,
inmunocitoquímica Y cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) y han mostrado variación en el contenido
de péptidos entre diferentes especies de crustáceos.
La hormona hiperglucemiante de los crustáceos.
La hormona hiperglucemiante de los crustáceos (CHH)
que fue descubierta por Abromowitz y cols. (1944), es
liberada en la glándula sinusal.
4
Las CHHs de diferentes especies han sido aisladas y se
ha determinado su estructura primaria por secuenciación de
Edman (Kegel y cols., 1991), también como la estructura de
la prohormona por clonación de cDNA (Tensen y cols., 1991).
Todas las moléculas de CHH secuenciadas muestran un
alto grado de homología de secuencia, por ejemplo 81% entre
Orconectes limosus y Homarus americanus y 61% entre 0.
limosus y las CHHs de Carcinus maenas. Estos péptidos junto
con la hormona inhibidora de la muda (MIH) y la hormona
inhibidora de las gonadas (GIH) constituyen una familia de
péptidos.
Tiene un peso molecular aproximado de 6000 a 9000
daltons. Es la primera de las neurohormonas en la que se
pone de manifiesto la existencia de puentes disulfuro, es
específica de cada especie y reconocible porque es el
único neuropéptido de crustáceos sin actividad cruzada
entre diversas especies (Keller y cols., 1985). Esta
hormona regula los niveles plasmáticos de azúcares, aunque
su mecanismo de acción sea poco conocido, se sabe que
provoca un aumento en el contenido de AMPc y GMPc en
hepatopáncreas y músculos abdominales tanto in vivo como in
vitro, el incremento en los nucleótidos cíclicos al parecer
produce una inhibición de la sintetasa de glucógeno
(Seldmeier, 1985).
Es probable que CHH tenga un papel dual al activar
también el sistema de fosforilasas pero la evidencia
disponible hasta el presente acerca de los efectos de CHH
5
sobre el sistema de fosforilasas es inconsistente (ver
Santos y Keller, 199333).
Con el uso de radioinmunoensayo se ha mostrado en
Orconectes limosus que cambios en la glucosa sanguinea son
precedidos por alteraciones significativas en el título de
CHH en el hemolinfa y hay también una ritmicidad circádica
en los niveles de CHH y de glucosa en el hemolinfa (Kallen
y cols., 1990). Santos y Keller (1993a) encontraron que
inyecciones de glucosa provocaron una caída tanto de CHH y
lactato, mientras que lactato produjo un efecto opuesto,
éste elevó tanto CHH y los niveles de glucosa. Así parece
que la glucosa y lactato son metabolitos importantes
implicados en la regulación de CHH, al menos en Carcinus
maenas (Santos y Keller, 1993a). CHH puede tener un papel
adicional en modular la glucólisis directamente ya que su
decremento en el hemolinfa causa un decremento en la
producción de lactato aún en la presencia de altos niveles
de glucosa (Santos y Keller, 1993a). Estos autores
sugieren que un aumento en el lactato sanguineo, resultante
de una glucólisis aumentada, sirve como un mecanismo de
retroalimentación positiva para la liberación de CHH. La
liberación de CHH estimularía la glucogenólisis para elevar
la disponibilidad de glucosa. Si más glucosa es mobilizada
de la que puede utilizarse esta puede fugarse de las
células y esta elevación en la glucosa sanguinea puede
inhibir la liberación de CHH del sistema OX-GS por
retroalimentación negativa (Santos y Keller, 1993a).
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Caracteristicas electrofisiológicas de las neuronas del
sistema OX-GS.
En el estudio intracelular, Iwasaki y Satow (1971)
encontrarón que la mayoría de las células son silentes,
pero generan actividad repetitiva en respuesta a la
inyección de corriente despolarizante; además tienen baja
resistencia de entrada y presentan potenciales de reposo de
aproximadamente -70mV. Cierto número de neuronas presentan
actividad espontánea rítmica; estas tienen resistencia de
membrana mayores y potenciales de reposo más positivos
(aproximadamente -60mV). Otro grupo de ellas producen
potenciales de acción espontáneos en forma de ráfaga.
Iwasaki y Satow (1969) registran ráfagas espontáneas
rítmicas en somas del OX de acocil. Ellos encontraron que
el intervalo inter ráfagas puede ser alterado; la fase
preinicializada, o la ráfaga terminada por pasar
corriente, sugiriendo la generación endógena de el patrón
de disparo (ver Nagano y Cooke, 1987).
Los potenciales de acción generados durante la
inyección de corriente despolarizante se bloquean por
efecto de tetrodotoxina (TTX), quedando sólo una espiga
pequeña y de mayor duración, cuya amplitud depende de la
concentración extacelular de calcio (Iwasaki y Satow,
1971). Estos resultados sugieren que los potenciales de
acción registrados en el soma se deben principalmente a
corrientes portadas por iones de sodio y calcio.
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Los potenciales de acción registrados en el soma se
generan en un sitio electrotónicamente alejado del cuerpo
celular (cono axónico) ya que los pulsos de corriente
despolarizante de magnitud creciente provocan acortamiento
de la latencia para la aparición de la primera espiga
(Iwasaki y Satow, 1971).
Iwasaki y Satow (1971) observaron también que los
potenciales de acción propagados en el tracto OX-GS se
bloquean al perfundir con una solución sin sodio o con TTX,
y que la espiga debida a calcio no propaga, lo que sugiere
que los potenciales de acción registrados en los axones se
deben principalmente al ión sodio. Estos autores
calcularon'la velocidad de propagación en lm/seg.
La fase de repolarización del potencial de acción en
las neuronas del OX se debe fundamentalmente a una
corriente acarreada por iones de potasio, ya que el
tetraetilamonio (TEA) prolonga la duración del potencial de
acción registrado tanto en el axón como en las terminales
(Nagano y Cooke, 1987).
Las células que disparan potenciales de acción
agrupados en ráfaga poseen una alta resistencia de entrada
y una región con pendiente negativa (NSR) en la curva I-V,
ocacionando que la neurona presente un potencial de
membrana inestable entre -50 y -30 mV (valores que caen en
la NSR). Esta región se atribuye a la activación de una
corriente iónica denominada I(NSR). La I(NSR) es una
corriente despolarizante continua que lleva el potencial de
8
membrana arriba del umbral para la generación de
potenciales de acción. Es acarreada por sodio y es
insensible a tetrodotoxina (Onetti,1989).
Onetti y cols. (1990) encontraron en neuronas
axotomizadas que la principal corriente entrante en el soma
celular fue una corriente de Ca2+. No se encontraron
corrientes de sodio, sensibles a TTX. También se
encontraron dos tipos de corrientes salientes de potasio,
cuya dependencia al voltaje y sensibilidad a bloqueadores
de canales de potasio son semejantes a las que se han
descrito en otras preparaciones para el rectificador tardío
(Ik) y para la corriente transitoria de salida (IA). Se ha
reportado que estas corrientes de potasio participan en la
duración y frecuencia de los potenciales de acción de
células que descargan en ráfagas (Martínez y cols., 1991).
Modulación de la actividad eléctrofisológica del OX-GS.
La presencia de colaterales que se extienden dentro de
regiones del neuropilo central dan las bases anatómicas
para sugerir u n control sináptico d e neuronas
peptidérgicas.
Ya que diferentes situaciones fisiológicas demandaran
la liberación de diferentes péptidos, se puede anticipar
u n control central específico sobre neuronas liberando
distintos péptidos y diferentes transmisores pueden estar
implicados en la sinapsis.
9
En vista de la presencia consistente de actividad
espontánea. En el OX-GS hay tanto modulación excitatoria
como inhibitoria.
La evidencia directa de la modulación sináptica de OX-
GS proviene de observaciones de potenciales sinápticos en
el registro intracelular de somas del OX después de
estimular el pedúnculo óptico (Iwasaki y Satow, 1971).
Glantz y cols. (1983) utilizando acociles intactos
mostraron que la iluminación ipsilateral de la superficie
cornea1 produce potenciales postsinápticos excitatorios en
las neuronas del OX, que incrementan la frecuencia de
descarga espontánea o provocan la aparición de actividad
en células silentes.
Nagano (1986b) simultaneamente registró
intracelularmente de tanto somas como terminales y
extracelularmente del tracto axónico del cangrejo,
Cardisoma carnifex, durante la aplicación al baño de
neurotransmisores putativos. Una barrera de vaselina a
través de la cual el tracto axónico pasaba a compartimentos
separados, permitió la aplicación independiente de
sustancias al soma y colaterales o a las terminales del
sistema aislado OX-GS. Se registraron respuestas
inhibitorias consistentes para serotonina (5-HT) e n
preparaciones de Cardisoma y al ácido gammaaminobutírico
(GABA) en registro de Podopthalmus. Las sustancias fueron
efectivas sólo si las colaterales eran expuestas a estas
sustancias. Se encontró en los registros del soma un
10
incremento del potencial de reposo con una disminución en
la frecuencia de disparo. Los registros en las terminales
muestran un decremento en la frecuencia de disparo y no se
observaron cambios en el potencial de membrana. L a
aplicación de estas sustancias en las terminales produjo
pocos cambios: estas observaciones son consistentes con la
sugerencia de que los receptores se encuentran en las
colaterales.
Con el uso de una variedad de técnicas, entre las que
destacan el empleo de técnicas inmunocitoquímicas, se han
identificado, 0 al menos sugiere su presencia, una amplia
gama de neurotransmisores y neuropéptidos en el sistema
nervioso de los crustáceos. Estos incluyen
neurotransmisores clásicos de bajo peso molecular como son:
acetilcolina, glutamato, acido gammaaminobutírico (--BA),
dopamina, histamina, serotonina (5-HT), norepinefrina y
octopamina; compuestos peptidérgicos, incluyendo varios
neuropéptidos ya identificados en vertebrados (revisión
Fingerman y Nagabhushanam, 1992).
Por otra parte, se ha detectado la presencia de aminas
biogénicas en el tallo ocular y éstas a su vez se han
relacionado de manera indirecta con la liberación o
inhibición de la liberación de los péptidos que el sistema
OX-GS produce (Fingerman y Nagabhushanam, 1992). A
continuación se mencionan algunos ejemplos:
En el tallo ocular estudios fisiológicos han
demostrado que la secreción de varias de las hormonas
11
peptídicas producidas por el OX y liberadas en la glándula
sinusal estan bajo la influencia de 5-HT. Se ha mostrado
que la hormona inhibidora de la muda, la hormona
hiperglucemiante de los crustáceos Y la hormona
dispersadora de pigmento rojo son controladas por 5-HT in
vivo 0 in vitro (Rudolph y Spaziani, 1990; Fingerman y
Nagabhushanam, 1992).
GABA ha sido implicado como un posible transmisor en
el OX (Aréchiga y cols., 1990). Estas células responden
con potenciales postsinápticos a la aplicación de luz a la
retina (Glantz y cols., 1983). La estimulación de el
nervio óptico y la iluminación de la retina en el acocil se
ha mostrado que induce la liberación de GABA lo que
suguiere su papel como neurotransmisor de respuestas
inducidas por la luz en células neurosecretoras (Aréchiga y
cols., 1990). El GABA actua como neurotransmisor
excitatorio en células del OX abriendo canales de cloro
(García U., y cols. 1994).
Se encontró que 5-HT tiene acción hiperglucemiante en
Carcinus maenas (Fingerman y Nagabhushanam, 1992).
Roth y cols. (1991) dieron evidencia que una leucina
encefalina sintética y una sustancia parecida a leucina -
encefalina aislada de la GS de Carcinus maenas inhiben la
liberación de CHH.
En resumen, la evidencia disponible sugiere que la
secreción de el OX-GS es controlada o al menos modulada por
entradas del sistema nervioso central (SNC) por medio de
12
sinapsis en las colaterales de la célula neurosecretora.
La evidencia es inadecuada para establecer que transmisores
estan implicados. La inconsistencia en la respuesta puede
reflejar heterogeneidad de las células neurosecretoras y
especificidad en sus relaciones sinápticas con el SNC.
La modulación de la actividad del OX-GS por péptidos
del propio sistema parece no ocurrir. Sin embargo el
tiempo de observación dado en el registro intracelular
puede ser demasiado corto para observar tal modulación.
Compartamentalización intracelular de ATP y enzimas
glucolíticas.
Las principales vías de producción de ATP en los
organismos eucariontes son la glucólisis y la fosforilación
oxidativa. Estos procesos estan compartamentalizados
dentro de la célula; la glucolisis se lleva a cabo en el
citoplasma y la fosforilación oxidativa en la membrana
interna mitocondrial.
El oxígeno Y el ATP estan distribuidos
heterogeneamente dentro de la célula. Uno de los factores
principales que contribuye a esta distribución heterogénea
intracelular de O2 y ATP es la distribución heterogénea de
mitocondrias (Jones, 1986).
Se ha encontrado una mayor densidad de mitocondrias en
regiones próximas a los sitios de utilización de ATP, las
cuales pueden ser observadas en micrografías electrónicas
de varios tipos celulares (Jones, 1986).
13
Miller y Horowitz (1986) estudiaron la distribución
intracelular y difusibilidad de ATP por cromodisección de
oocitos de Rana pipiens. Se midió la concentración de ATP
en el núcleo, en el citoplasma vegetal y animal, y una fase
intracelular de referencia (iRP, gelatina microinyectada)
donde el ATP puede difundir. Las concentraciones
regionales no fueron iguales: en el núcleo la concentración
de ATP es mucho mayor que en el citoplasma animal y este, a
su vez, es mayor que el ooplasma vegetal. También
demostraron que el nucleoplasma parece la fase iRP (y en
consecuencia es una solución acuosa simple en sus
propiedades de solvente) y demostraron la presencia de
mecanismos que son capaces de excluir y unir ATP. Estos
mecanismos son los responsables para la no homogenenidad en
la distribución de ATP intracelular.
La heterogeneidad en el suministro de ATP debido a la
distribución heterogénea de mitocondrias Y enzimas
glucolíticas puede ser un determinante en la estructura y
función de muchos tipos celulares. Asi por ejemplo:
Mc. Donald y cols. (1971) proponen que el metabolismo
anaeróbico, utilizando ya sea glucógeno o glucosa exógena
es capaz de mantener la actividad eléctrica transmembranal
en músculo cardíaco y sólo una muy limitada porción del ATP
producido aeróbicamente esta disponible para funciones
similares. Con respecto al mantenimiento de la fuerza
de contracción, la situación es la inversa: la energía
14
producida aeróbicamente mantiene la fuerza de la
contracción.
Weiss y Lamp (1987) en un estudio de fijación de
voltaje en microáreas de membrana en miocitos ventriculares
aislados, permeabilizados con saponina, sugiere que existe
una proximidad entre enzimas glucolíticas y canales de
potasio sensibles ATP ya que el ATP glucolítico es
preferencialmente utilizado que el mitocondrial.
De manera similar Paul y cols. (1983) mostraron que en
músculo liso vascular la glucólisis esta acoplada a
procesos de transporte de sodio y potasio, mientras que el
metabolismo oxidativo esta acoplado a requerimientos de
energía para la contracción.
Células glucosensibles.
Una célula que responde a cambios en su patrón de
actividad eléctrica como respuesta a cambios en la
concentración extracelular de glucosa es la célula B del
pancreas.
La actividad eléctrica de la membrana de la célula B
tiene un papel central en el acoplamiento estímulo-
secreción. La mayor parte de esta evidencia ha sido
obtenida por medio del registro con microelectrodos del
potencial de membrana de células B en islotes intactos de
Langerhans (revisado por Henquin y Meissner, 1984). Estos
estudios han mostrado que cuando la concentración de
glucosa esta abajo de la requerida para inducir la
15
secreción de insulina, la célula B es eléctricamente
silente; el potencial de membrana es estable y generalmente
entre -60 y -70mV. Elevando la concentración extracelular
de glucosa de 3 a 15 mM provoca una despolarización inicial
de lo-15 mV, elevando el potencial de membrana al umbral,
con lo cual empieza la actividad eléctrica. Esta última
exhibe un patrón bifásico; una primera fase de producción
continua de espigas seguida por una repolarización parcial
sin espigas y finalmente el desarrollo de ondas lentas.
Cada onda lenta es caracterizada por una rápida
despolarización de un potencial umbral a un potencial de
plato en el cual la actividad de espigas queda
superimpuesta. En el fin de la ráfaga de espigas, la
membrana se repolariza a un nivel ligeramente más negativo
que el potencial umbral. Durante el intervalo, la membrana
lentamente se despolariza hasta que se alcanza el umbral
nuevamente. Si la concentración de el azúcar se incrementa
aún más, los valores absolutos del potencial de membrana
son poco afectados, pero la onda lenta con actividad se
alarga, mientras que los intervalos se acortan. Finalmente
cuando el nivel de glucosa se aproxima a 18 mM la membrana
de la célula B permanece despolarizada en el potencial de
plato y exhibe una continua actividad de espigas.
Hay una buena correlación entre el tiempo que dura el
plato donde se observa potenciales de acción y la secreción
de insulina, a diferentes concentraciones de glucosa
(Meissner y Preissler, 1979).
16
Esta correlación sugiere que la actividad eléctrica
juega un importante papel en regular la liberación de
insulina y es corroborada por los siguientes hallazgos:
1) L o s bloqueadores de los canales de calcio, o
eliminación del calcio extracelular, inhibe tanto la
actividad eléctrica como la liberación de insulina.
2) Otros iniciadores de la liberación de insulina,
tales como la sulfonilureas, también despolarizan la célula
B y estimulan la actividad eléctrica.
De los estudios de "patch-clamp" ha surgido un modelo
de acoplamiento estímulo-secreción, el cual da un papel
clave a los canales de potasio sensibles a ATP. Este canal
constituye la unión entre los eventos metabólicos y la
actividad eléctrica de la célula B. El potencial de
membrana de la célula 13 esta modulado por la actividad de
canales de potasio sensibles a ATP. El cierre de estos
canales, ya sea por el metabolismo de la glucosa (Ashcroft
y cols., 1984, 1988) ; 0 por sulfonilureas (Sturgess y
cols., 1985) reducen la permeabilidad de la membrana al
potasio lo que provoca la despolarización. La
despolarización abre canales de voltaje dependientes de
Ca2+ (Rorsman, 1985) que también provoca la actividad
eléctrica. El incremento en el influjo de Ca2+ que tiene
lugar a través de los canales de Ca2+ abiertos produce una
elevación en el calcio intracelular, que estimula la
liberación de insulina. La actividad eléctrica en la
17
célula B es un mecanismo para unir el metabolismo de la
glucosa a la elevación del calcio intracelular.
El área del hipotálamo lateral y el núcleo
ventromedial del hipotálamo son dos centros importantes en
la regulación de la alimentación. Estas dos regiones son
referidas como el centro de la alimentación y el centro de
la saciedad respectivamente. Cerca del 25% de las neuronas
en esos centros son quimiosensitivas y su actividad es
influenciada por la glucosa. Dependiendo de su respuesta a
glucosa, estas son llamadas glucosensitivas (GS) 0
glucorreceptoras (GR) . Las neuronas GS decrementan su
actividad y las neuronas GR incrementan su actividad cuando
la glucosa es aplicada electroforéticamente (Mizuno y
Oomura, 1984). El incremento en la actividad de las
neuronas (GR) es probablemente debido a la interacción
entre la glucosa y el sitio glucorreceptor en la membrana.
Ono y cols. (1982) encontraron neuronas en el núcleo
ventromedial del hipotálamo sensibles a cambios en la
concentración extracelular de glucosa, un incremento
produce despolarización celular e incremento en la
frecuencia de potenciales de acción. Ashford y cols.
(1990) encontraron que al igual que en la célula B, el
canal de K+ sensible a ATP contribuye a la permeabilidad
de K+ en reposo y por tanto al control del potencial de
membrana y que el cierre de canales de potasio sensitivos a
ATP, fundamenta el incremento en la actividad hipotalámica
18
que se observa después de un incremento en la concentración
de glucosa.
Es conocido que la hormona hiperglucemiante de los
crustáceos es sintetizada en el OX y parece estar
relacionada con el mantenimiento de los niveles de azúcares
en condiciones basales y bajo estress fisiológico. Y
también, ya que la actividad eléctrica de las células
neurosecretoras generan los patrones de liberación
hormonal necesarios para cumplir las demandas fisiológicas;
en particular el comportamiento en forma de ráfagas
observado en células neurosecretoras es una forma ideal de
potenciar la secreción (Nordmann y Raji, 1990; Poulain y
Theodosis, 1988).
García E., Benítez y Onetti (1993) plantearon la
hipótesis de que una elevación en los niveles de glucosa
podrían actuar como una señal de retroalimentación para la
regulación de la neurosecreción en las células del OX.
Ellos encontraron que:
1 . La glucosa despolariza el potencial de membrana de
las células del OX de una forma dependiente de
concentración.
2 . Que la despolarización producida por la glucosa
inicia un cambio en el patrón de actividad eléctrica. Las
células silentes llegan a descargar potenciales de acción.
Cuando las células que disparan en ráfagas son
despolarizadas por la glucosa sus potenciales de acción ya
no estan agrupados en ráfagas o desaparecen completamente.
19
3. Aunque el potencial de membrana regresa a su valor
inicial despues de eliminar la glucosa de el baño, el
patrón de descarga puede no regresar a su condición
inicial. Esto sugiere que aparte de la despolarización, el
azúcar activa procesos que son mantenido por largo tiempo.
4. En experimentos de canales unitarios en la
configurción d e "cell-attached", bajo condiciones
simétricas en la concentración de potasio, al finalizar la
aplicación de glucosa, se produce el cierre de canales de
K+; la actividad de los canales se recupera durante el
lavado.
En el mecanísmo de acción de la glucosa puede estar
involucrado un glucorreceptor en la membrana plasmática de
la célula que sea activado directamente por la glucosa. En
el laboratoria se han obtenido las siguientes evidencias en
contra de este mecanismo de acción, entre estas tenemos:
Ya que en los experimentos realizados con la técnica
de fijación de voltaje en microáreas de membrana (cell-
attached), los canales contenidos en la superficie que
abarca la pipeta estan aislados de la solución externa
donde se aplicó la glucosa, en estas condiciones la glucosa
tiene que atravesar la membrana para ejercer su acción.
También en el laboratorio se realizaron experimentos los
cuales mostraron que análogos estructurales cercanos a la
glucosa como son la L-glucosa y 0-metil glucosa (resultados
sin publicar) mostraron una falta completa de capacidad
20
para actuar como agonistas parciales y producir alguna
modifición en la actividad eléctrica de las células del OX.
Estos hallazgos obtenidos sugieren que la glucosa
necesita permear al interior celular y que probablemente se
requiera de la transformación metabólica como parte del
mecanismo de acción por el cual esta hexosa regula la
actividad eléctrica de las células del OX.
21
OBJETIVOS
1) Estudiar el efecto de un inhibidor de las primeras
etapas de la glucólisis como es la manoheptulosa sobre el
potencial de membrana y actividad eléctrica de las neuronas
del OX.
2) Investigar el efecto de la manoheptulosa sobre las
acciones producidas por la glucosa en el potencial de
membrana y la actividad eléctrica de las neuronas del OX.
3) Estudiar el efecto de inhibidores del metabolismo
oxidativo, específicamente por medio de desacoplantes de
la fosforilación oxidativa como el 2,4 dinitrofenol (2,4
DNP) Y carbonil cian0 p-trifluorometoxi fenilhidrazona
(FCCP) sobre el potencial de membrana y actividad eléctrica
de las células del OX.
4) Investigar los efecos del 2,4 DNP y FCCP sobre las
acciones producidas por la glucosa en el potencial de
membrana y la actividad eléctrica de las neuronas
secretoras del OX.
22
MATERIAL Y METODOS
Los experimentos se realizaron en acociles
(Procambarus clarkii) adultos (hembras o machos), fuera de
la epoca de muda.
Los acociles para los experimentos se adquirieron a
través de un proveedor, quién los obtiene de riachuelos y
canales en el Estado de Chihuahua. Los animales se
pusieron en recipientes con agua de la llave, a una
temperatura de 20 a 25C, la profundidad del agua fue de 4
cm.
La alimentación consistió en trozos de zanahoria y
pescado, este último una vez por semana. El régimen de luz
y oscuridad se mantuvo al fotoperiodo natural.
Obtención de la preparación
Para obtener la preparación se practicó la ablación
del tallo ocular del acocil que se colocó en una caja de
Petri con una solución salina para crustáceos modificada de
Van Harreveld (1936; VHN) cuya composición se muestra en la
Tabla 1. Se eliminó el exoesqueleto, el músculo y el tejido
conectivo. De esta manera quedaron expuestos y visibles al
microscopio los cuerpos neuronales del OX. La preparación
se colocó en la porción central de una cámara de acrílico
transparente con tres compartimientos interconectados entre
si con una capacidad total de 1 ml. Se utilizó un sistema
de perfusión que permitió recambiar continuamente las
23
soluciones control (VHN) y de prueba, a un flujo constante
de 700ul/min.
L a región donde se localiza el OX se identificó
visualmente, utilizando un microscopio compuesto Leitz
Laborlux II y para colocar los microelectrodos en la
superficie de las células se usó un micromanipulador
Narinshigue MK2.
Tanto la disección como los registros se llevaron a
cabo a temperatura entre 20 y 22C; las preparaciones se
lavaron con la solución VHN durante 20 minutos antes de
iniciar los registros.
Sistema de registro.
La figura 1 muestra un esquema del sistema de registro
utilizado durante los experimentos. Se realizaron
registros del potencial de membrana con la técnica
covencional de microelectrodos utilizando un amplificador
(R) de alta impedancia de entrada (DAGAN 8100), que permite
además la aplicación de pulsos de corriente a tráves del
mismo electrodo. El amplificador tenía un sistema
electrónico para compensar las caídas de voltaje
ocacionadas por el paso de corriente a través del
microelectrodo.
Se utilizó como electrodo de referencia un alambre de
plata clorurada, colocado en un compartimiento lateral de
la cámara de acrílico y conectado a la tierra del
amplificador.
24
L a s señales de voltaje así obtenidas podían
visualizarse en un osciloscopio (ORC) (HITACHI V-212),
registradas en un graficador de plumillas de dos canales
(Gould 220) o adquiridas en una computadora (IBM AT),
utilizando un convertidor analógico-digital de 12 bits
(TECFEN ISC-16).
Para la inyección de pulsos de corriente se utilizó un
estimulador (Grass S48) que permitió variar tanto la
intensidad, la duración, así como la frecuencia de los
pulsos.
Microelectrodos.
Para registrar el potencial de membrana se usaron
microelectrodos con resistencia entre 20 y 40 MR fabricados
con tubos capilares de 1.2 mm de diámetro, con filamento
interior (AM SYSTEM). Se llenaron con una solución salina
de KCl 3M.
Soluciones.
L a composición de la solución con la cual se
perfundieron las preparaciones control consistió en
solución de VHN, cuya composición se muestra en la tabla 1.
25
TABLA 1:
Composición de las soluciones de VHN utilizada
para registro intracelular (en mM):
NaCl 2 0 0
KCl 5 . 4
CaCl 1 3 . 5
W-C12 2
HEPES-NaOH
PH
10
7 . 4
La solución de glucosa y manoheptulosa consistió en
solución de VHN suplementada a las concentraciones
requeridas en el momento de ser utilizadas con las
respectivas sustancias.
Las solución de 2,4 dinitrofenol (2,4 DNP) y carbonil
ciano p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP) se preparó a
partir de una solución "madre" de las respectivas
sustancias.
La concentración de la solución "madre" de 2,4 DNP fue
de 1 mM, 10.5 mg del compuesto se disolvió en 50 ml de VHN
hirviendo. La concentración de la solución "madre" de FCCP
fue de 0.1 mM, 1.25 mg del compuesto se disolvió en 50 ml
de solución de VHN hirviendo. Se tomaron alicuotas de la
solución madre que se diluyeron en solución de VHN, para
obtener las concentraciones deseadas de estos compuestos.
Todas las soluciones fueron ajustadas a un pH de 7.4.
2 6
Metodología General.
E n todas las neuronas estudiadas se registró el
potencial de membrana en solución salina normal durante 30
minutos. A continuación se perfundió la preparación con la
solución de prueba.
Se evaluó el efecto de las sustancias probadas sobre
los siguientes parámetros:
1) Para la glucosa y manoheptulosa:
1) Potencial de membrana.
2) Frecuencia de los potenciales de acción
espontáneos.
II) Para el 2,4 DNP y FCCP:
1) Potencial de membrana.
2) Amplitud y duración de los potenciales de acción
evocados por estimulación eléctrica.
3 ) Frecuencia de los potenciales de acción
espontáneos.
4) Amplitud y duración de los potenciales de acción
espontáneos.
27
FIGURA 1.
Esquema del dispositivo experimental utilizado en el
registro intracelular. SV, seguidor de voltaje; AR,
amplificador de retroalimentación; Vm, potencial de
membrana observado en el osciloscopio.
28
RESULTADOS
Las células registradas se clasificaron en tres grupos
en base a sus patrones de descarga. La figura. 2 muestra
registros característicos obtenidos en tres neuronas
diferentes perfundidas con solución salina normal. El
primer grupo se formó con neuronas que descargaban
potenciales de acción espontáneos en forma regular 0
irregular. El segundo se formó con células que descargaban
espontáneamente potenciales de acción agrupados en ráfaga
separados por una hiperpolarización durante la cual la
célula no descarga potenciales de acción. El tercer grupo
se formó c o n las neuronas silentes; es decir que no
descargaban potenciales de acción espontáneos, únicamente
al aplicar un estímulo.
29
1). . .
1 mnin
1 mín
FIGURA 2.
Registro intracelular del potencial de membrana en
neuronas con diferente patrón de actividad eléctrica. 1.
Neurona que dispara en forma tónica; II. neurona que
dispara en forma de ráfagas; III. neurona silente que
dispara un potencial de acción al ser estimulada.
30
Efecto de la glucosa sobre la actividad eléctrica de las
neuronas del OX.
Se estudiaron diez neuronas, cinco fueron silentes y
cinco presentaron descargas espontáneas. En las neuronas
silentes el potencial de reposo promedio fue de 60.5k2.2.
En las células que tienen descargas espontáneas no existe,
como tal, un potencial de reposo ya que descargan
potenciales de acción constantemente; en este caso, se tomó
el valor máximo del potencial de membrana como potencial de
reposo. En las neuronas con descarga espontánea el
potencial de reposo promedio fue de 58.8k4.5.
La glucosa a una concentración de 5.0 mM aplicada al
medio extracelular provocó en las neuronas del OX una
despolarización de 7.20 _+ 2.43 mV, promedio de nueve de las
neuronas estudiadas, sólo una neurona no respondió a la
aplicación de glucosa. En la tabla 2 se muestran los
resultados obtenidos sobre el potencial de reposo en las
células estudiadas. Cabe mencionar que el potencial de
reposo regresa a valores cercanos al control en un tiempo
de 12 a 20 minutos después de lavar la preparación con la
solución de VHN.
31
CFECTO DE LA GLUCOSA 5 mM SOBRE EL POTENCIAL DE REPOSO
:EL. # AE (mV) PATRON DEACTIVIDAD
1 6 III2 6 III3 8 14 5 15 12.5 II6 6 17 5 II8 6 III9 10 III
iE, despolarización desde un potencial de membrana cercano a -60 mV; el AE promedió 7.2 +2.4IV.
En la figura 3 se muestra el registro intracelular en
una neurona del OX del grupo III se observa que la célula
se empieza a despolarizar a los 5 minutos de perfundir
glucosa 5 mM, llegando a un máximo durante el lavado; el
potencial de membrana regresa a su valor control a los 20
minutos de lavado.
32
_,_ Glucosa 5 mM
FIGURA 3.
Registro intacelular del .potencial de membrana en una
neurona del OX que permanecía silente, antes, durante ydespués de la perfusión con glucosa 5.0 mM durante el
tiempo indicado por la barra. La aplicación de glucosa
produjo una despolarización reversible.
33
En neuronas con potenciales de acción espontáneos
agrupados en ráfagas (grupo II); la despolarización
provocada por la glucosa (figura 4) produjo un aumento en
la frecuencia de descarga acompañada en una disminución en
la amplitud de los potenciales de acción. Además del
aumento de la frecuencia, se observó un cambio en el patrón
de descarga de potenciales de acción; durante la
despolarización las células descargaron en forma tónica.
Al lavar la glucosa los potenciales de acción se fueron
agrupando nuevamente hasta formar ráfagas similares al
control .
34
Glucosa 5mM
FIGURA 4.
Registro intacelular del potencial de membrana en una
neurona del OX que disparaba en ráfagas, antes, durante y
después de la perfusión con glucosa 5.0 mM durante el
tiempo indicado por la barra. La aplicación de glucosa
produjo una despolarización modificando el patrón de
descarga.
35
E n neuronas tónicas (grupo 1) las descargas
espontáneas cesan durante la despolarización, como se
observa en la figura 5; este efecto es reversible ya que al
lavar la preparación durante 20 minutos con solución VHN
las descargas reaparecen de manera similar al control.
36
Glucosa 5mM
-fi2 min
FIGURA 5.
Registro intacelular del potencial de membrana en una
neurona del OX que disparaba en forma ó tónica, antes,
durante y después de la perfusión con glucosa 5.0 ml!4
durante el tiempo indicado por la barra. La. aplicación de
glucosa produjo una .despolarización modificando el patrón
de descarga.
37
Efecto de la manoheptulosa sobre la actividad eléctrica de
las neuronas del OX.
Se estudiaron 7 células a las cuales se les aplicó
manoheptulosa 10 mM durante 7 minutos, 4 células disparaban
potenciales de acción espontáneamente y tres células fueron
silentes. Los resultados sobre el potencial de membrana se
muestran en la tabla 3. E n ninguna de las células
estudiadas la manoheptulosa 10 mM provocó cambios en el
potencial de reposo, ni en el patrón de actividad
eléctrica.
TABLA 3:EFECTO DE LA MANOHEPTULOSA 10 mM SOBRE EL POTENCIAL DEREPOSOCEL. # CAMBIO DEL PATRON DE
POTENCIAL (mV) ACTIVIDAD10 0 II11 0 III1213
000-30
IIIIIIIII
III
La figura 6 es un registro típico de los resultados
obtenidos para este grupo de células.
38
Manoheptulosa 10 mM
1 min
FIGURA 6.
Registro intacelular del potencial de membrana en una
neurona del OX antes, durante y después de la perfusión
manoheptulosa 10 mM durante el tiempo indicado por la
barra. La aplicación de manoheptulosa 10 rd4 no provocó
modificaciones ni en el potencial de reposo ni en el patrón
de disparo.
39
Efecto de la glucosa 5 ITM en presencia de manoheptulosa 10
mM sobre la actividad eléctrica en las neuronas del OX.
Se utilizaron tres procedimientos distintos. El
primer procedimiento consistió en aplicar manoheptulosa 10
mM a la solución extracelular durante cinco a siete minutos
y luego cambiar a una solución con glucosa 5 mM durante 7
minutos. Con este tratamiento se estudiaron 9 células.
Los resultados sobre el potencial de membrana se muestran
en la tabla 4.
XBLA 4::FECTO DE LA GLUCOSA 5 mM DESPUES DE LA PREINCUBACION CONWNOHEPTULOSA 10 mM.
:EL. # AE (mV) PATRON DEACTIVIDAD
25 7.5 a III26 6 II27 7.5 a III28 12.5 II29 15 II30 10 III31 5 III32 15 III33 12.5 III
LE, despolarización desde un potencial de membrana cercano a -60 mV; el AE promedió 10.1*3.6 mV. a SE
Iresentó fase de hiperpolarización antes de los efectos típicos de la glucosa, promedió para los dos casos 4 *l,nV.
Con este procedimiento, las células que disparan en
forma de ráfaga (grupo II), se presentó un efecto notable.
Este consistió en una hiperpolarización de 4 mV, n=2 I
durante este tiempo la célula se alejó del umbral para
potenciales de acción Y por tanto dejo de disparar,
posteriormente se observa el cambio en el
40
potencial de membrana provocado por la glucosa cuya media
no es diferente al grupo unicamente tratado con glucosa. La
figura 7 es un ejemplo representativo donde se observan
estos efectos.
41
Man. 10 mM Glucosa 5 mM
5 min
FIGURA 7.,
I Registro intacelular del potencial de membrana en una
nkurona del OX antes, durante y después de la perfusión de
- . manoheptulosa 10 mM y luego glucosa 5 mM durante los
tiempos indicados por las barras. Se observa una fase. de
hiperpolarización de -4 mV seguido de los efectos típicos
de la glucosa.
42
El segundo procedimiento consistió en aplicar glucosa
5 mM en presencia de manoheptulosa 5 mM. Se estudiaron 8
células. Los resultado sobre el potencial de membrana se
muestran en la tabla 5. En las células que disparan en
ráfagas (Grupo 11) se presentó también una
hiperpolarización de 4 mV, n=3 que provocó una disminución
en la frecuencia de disparo, posteriormente se observan los
efectos típicos de la glucosa. La figura 8 es un registro
representativo de una neurona que presentó este tipo de
respuesta.
l!ziBLA 5:ZFECTO DE LA GLUCOSA 5 mM EN PRESENCIA DE MANOHEPTULOSA 5nM SOBRE EL POTENCIAL DE REPOSO
ZEL. # m (mV) PATRON DEACTIVIDAD
17 9 II18 8 119 7.5a II20 12.5a III21 12.5 III22 12.0 III23 .7.5a III24 7.5 1
\E, despolarización desde un potencial de membrana cercano a -60 mV; el AE promedió 9.6k2.2 mV. a SS
resentó fase de hiperpolarkación antes de los efectos típicos de la glucosa, promedió para los tres casos 4 *lnV.
43
Glucosa 5mM
Manohep+~osa 5 mM
-ti2 min
FIGURA 8.
Registro intacelular del potencial de membrana en una
neurona del OX antes, durante y después de la perfusión
glucosa 5 mM en presencia de manoheptulosa 5mM durante los
tiempos indicados por las barras. Se observa una fase de
hiperpolarización de -4 mV seguido de los efectos típicos
de la glucosa.
44
El tercer procedimiento consistió en aplicar
manoheptulosa 10 mM durante 5 a 7 minutos y luego glucosa 5
mM en presencia de manoheptulosa 5 mM durante 7 minutos.
Se estudiaron tres células. Los resultados sobre el
potencial de membrana se muestran en la tabla 6. La figura
9 es un ejemplo representativo de este grupo de células.
Ninguna de las células mostró la fase de hiperpolarización
observada en las células que disparan en forma de ráfaga de
los dos grupos anteriores; también se observa el desarrollo
típico de los efectos de la glucosa.
TABLA 6:EFECTO DE LA GLUCOSA 5 mM EN PRESENCIA DE MANOHEPTULOSA 51rnM DESPUES DE LA PREINCUBACION CON MANOHEPTULOSA 10 mM.
l CEL. # A.E 0-W PATRON DEACTIVIDAD l
34 8 III35 5 II36 12.5 1
AE, despolarización desde un potencial de membrana cercano a 80 mV: el AE oromedió 8Lk3.1 mV.
En resumen, con los tres distintos procedimientos en
donde se empleo manoheptulosa 5 y 10 mM no se logró
antagonizar la acción de la glucosa.
45
Glucosa 5 mMNarLwepnm.% 10 mM
lhro%ptuL 10 mM
1%5 min
FIGURA 9.
Registro intacelular del potencial de membrana en una
neurona del OX antes, y durante la perfusión de
manoheptulosa 10 mM, luego glucosa 5 mM en presencia de
manoheptulosa 5 mM durante los tiempos indicados por las
barras. Se observan los efectos típicos de la glucosa.
46
Efecto del 2,4 DNP sobre la actividad eléctrica de las
células del OX.
Efecto en células silentes (grupo III).
Se estudiaron 5 células. Las concentraciones de 2,4
DNP que se usaron fueron 0.05 m.M y 0.1 mM. El 2,4 DNP
aplicada al medio extracelular en neuronas del OX que
permanecían silentes (grupo III) produce una
despolarización lenta y reversible cuya magnitud se muestra
en la tabla 7. Las células se recuperan a un potencial de
membrana muy cercano al control en un tiempo de 10 a 15
minutos después de lavar la preparación con la solución de
VHN.
TABLA 7:EFECTO DEL 2,4 DNP SOBRE EL POTENCIAL DE MEMBRANA
ICEL # (wmol/l) AE (mV) T (min)
37 100 12.5 1838 100 12.0 2039 100 12.0 2040 50 10.0 2241 50 8.0 18
AE, despolarización desde un potencial de membrana cercano a -60 mV; el AE promedii10.9i1.7 mV: T. tierno0 de duración de la desoolarización.
47
La figura 10 es el registro intracelular del potencial
de membrana de una célula silente (grupo III) a la cual se
perfundió con 2,4 DNP 0.1 y 0.2 rnJ4 durante 6 minutos. El
2,4 DNP produjo una despolarización lenta que provoca que
la célula a'lcance el umbral para potenciales de acción.
También se observa que esta despolarización es reversible.
Se dejo recuperar a la célula por 30 minutos y se volvió a
aplicar 2,4 DNP al doble de la concentración (trazo
inferior); se observa que la despolarización es mayor y
tarda más tiempo en regresar al potencial de reposo del
control.
48
2.4 DNP 0.1 mM
2.4 DNP 0.2 mM
--J>E::
2 min
FIGURA 10.
Registro intracelular del potencial de membrana en una
neurona del OX que permancecía silente (grupo III) antes,
durante y después de la perfusión de 2,4 DNP 0.1 mM,
c+urante el tiempo indicado por 1.~ barra (trazo superior).
Después de dejar recuperar a la célula por 30 minutos se
expuso al doble de concentración de 2,4 DNP (trazo
inferior) se observa una mayor despolarización y se
requiere de más tiempo para que la célula regrese a la
situación control.
49
Las neuronas silentes se estimularon aplicando pulsos
de corriente a través del microelectrodo Se aplicaron
pulsos supraumbrales de corriente despolarizante de 40 ms
de duración de manera que la célula disparara potenciales
de acción. Con este método se registraron los potenciales
de acción evocados por pulsos de corriente de amplitud
variable para hacer coincidir la latencia. Los cambios en
el potencial de membrana evocados por la aplicación del 2,4
DNP puede ser suficiente para modificar corrientes iónicas
dependientes de voltaje que determinan el potencial de
acción. Para evitar este problema, las células fueron
hiperpolarizadas, por inyección de corriente, al potencial
de membrana que presenta la célula en situación control.
La amplitud de los potenciales de acción se midió desde el
potencial de reposo de la célula hasta el pico de la espiga
y la duración del potencial de acción se midió a nivel de
la amplitud media. Bajo esas condiciones, en 3 neuronas
exploradas en presencia de 2,4 DNP (0.1 mM), se observó
una disminución en la amplitud del potencial de acción y un
aumento en la duración con respecto al control. La figura
11 muestra los registros de los potenciales de acción
obtenidos en una neurona silente a) solución normal; b)
cambio máximo en la amplitud y duración a los 2 minutos de
lavado después de 6 minutos de incubación con 2,4 DNP (0.1
J@J) ; c) a los 5 minutos de lavado la amplitud y duración
50
L a tabla 8 muestra los valores de los cambios
observados en la figura 11.
TABLA 8:EFECTO DEL 2,4 DNP SOBRE EL POTENCIAL DE MEMBRANA,AMPLITUD Y DURACION DEL POTENCIAL DE ACCION EN UNACELULA SILENTE (GRUPO III).
Vr(mV) Amp (mV) Dur(ms)
Control 50.3f0.5 67.1k0.7 2.0fO.O
2,4 DNP 6 min 50.3f0.5 65.4k0.0 2.5kO.2
Lavado 2 min 48.0fl.O 58.6tO.O 3.31TO.l
Lavado 5 min 52.2k1.5 67.4kl.O 1.9kO.l
Los valores dados son la media aritmética f desviación estandard de 3 potenciales de acción; Vrpotencial de reposo; Amp, amplitud; Dur, duración. .
51
iOms 1Oms
1Oms
FIGURA 11.Potenciales de acción evocados con pulsos
despolarizantes en una neurona que permanecía silente(grupo' III); la magnitud del pulso se varió para hacercoincidir la latencia; el potencial de membrana se mantuvoal potencial de reposo control mediante la inyección decorriente hiperpolarizante a través del electrodo deregistro. Se observan cambios reversibles en la amplitud yduración del potencial de acción. a) solución normal; b)cambio máximo en la amplitud y duración a los 2 minutos delavado después de 6 minutos de incubación con 2,4 DNP (0.1mM) ; c) a los 5 minutos de lavado.
52
Efecto sobre neuronas tónicas (grupo 1)
El 2,4 DNP a una concentración de 0.05 mM aplicada a
neuronas del OX (n=3) que descargaban en forma tónica
(grupo 1) provocó aumento la frecuencia de disparo; al
lavar la preparación la frecuencia fue disminuyendo
llegando esta a disminuir más alla de la frecuencia que
presentaba en la situación control. La figura 12 ilustra
los efectos del 2,4 DNP anteriormente descritos. Se dejó
recuperar la célula durante 30 minutos luego se dobló la
concentración de 2,4 DNP usada. Se observó que estos
efectos son dependientes de la concentración, ya que al
doblar la concentración la magnitud de los cambios fueron
mayores, en comparación a los efectos observados en la
figura 12. En la figura 13 se muestran los resultados
obtenidos; hay una ligera despolarización acompañada de un
aumento en la frecuencia de disparo; durante el lavado la
frecuencia disminuye llegando a un estado estable donde la
frecuencia es menor con respecto a la frecuencia control.
53
2,4 DNP 0.05 mM
control
lavado 4 min 9 min 14 min 22 min
1:1 min
FIGURA 12.
Registro intracelular del potencial de membrana en una
neurona del OX del grupo 1, antes durante y después de la
perfusión de 2,4 DNP 0.05 mM, durante el tiempo indicado
por la barra. Se observa incremento en la frecuencia de
disparo; durante el lavado la célula disminuye la
frecuencia de disparo llegando a disminuirse aún más que en
la situación control.
54
2,4 DNP 0.1 mM
control
lavado 3 min lavado 7 min lavado ll min
FIGURA 13.
Después de dejar recuperar a la célula por 30 minutos
se expuso al doble de concentración de 2,4 DNP. La figura
muestra el registro intracelular del potencial de membrana
en una neurona del OX que disparaba en forma tónica ( grupo
1) antes, durante y después de la perfusión de 2,4 DNP 0.1
mM, durante el tiempo indicado por la barra. Se observa una
ligera despolarización acompañada de un aumento en la
frecuencia de disparo que paulatinamente va disminuyendo
durante al lavado llegando a ser menor que la frecuencia
que presentaba en situación control.
55
En 3 neuronas exploradas en presencia de 2,4 DNP (0.05
mM o 0.1 mM) se observó una disminución en la amplitud del
potencial de acción Y un aumento en la duración del
potencial de acción respecto al control.
La figura 14 es un ejemplo representativo de los
cambios observados en la duración y amplitud' de los
potenciales de acción. Se aplicó una corriente
hiperpolarizante a través del electrodo de registro para
llevar el potencial de membrana al valor control a)
control; b) a los 6 minutos, de incubación con 2,4 DNP 0.05
mM; c) cambio máximo observado en la amplitud y duración
del potencial de acción a los 4 minutos de lavado; d) a los
10 minutos de lavado la amplitud y duración del potencial
de acción regresan a valores cercanos al control.
La tabla 9 muestra los valores de los cambios'
mostrados en la figura 14.
TABLA 9:EFECTO DEL 2,4 DNP SOBRE EL POTENCIAL DE MEMBRANA,AMPLITUD Y DURACION DEL POTENCIAL DE ACCION EN UNACELULA QUE DISPARA EN FORMA TONICA (GRUPO 1).
Vr(mV) Amp (mV) Dur(ms)
Control 48.5kO.5 49.5kO.7 2.9_+0.1
2,4 DNP 6 min 50.3kO.3 36.7k1.7 3.9kO.2
Lavado 4 min 50.2kO.O 34.06f2.2 5.620.7
Lavado 10 min 50.2kO.3 49.7kO.4 3.2?0.'2
Los valores dados son la media aritmética f desviación estandard de 3 potenciales de acción; Vr, potencial dereposo; Amp, amplitud; Dur, duración.
56
b)
I
J
>eE:
Sm3
J>Est
Sms
J>Est
5ms
d)
J>Ezi
Sms
FIGURA 14.Potenciales de acción evocados con pulsos
despolarizantes en una neurona que dispara en forma tónica;el potencial de membrana se mantuvo al potencial de reposocontrol mediante la inyeción de corriente hiperpolarizantea través del electrodo de registro. a) Control; b) a los 6minutos de incubación con 2,4 DNP 0.05 m?Y; c) cambio máximoobservado a los 4 minutos de lavado; d) a los 10 miutos delavado, la amplitud y duración del potencial de acciónregresan a valores cercanos al control.
57
Efecto en neuronas que descargan en ráfaga (grupo II).
El 2,4 DNP a una concentración de 0.05 mM aplicada a
neuronas del OX (n=Z) cuyos potenciales de acción se
agrupaban en ráfaga provocó una despolarización kostenida
donde se superimponen ráfagas más frecuentemente, al
terminar la perfusión con el tóxico y empezar el lavado,
rápidamente la célula se repolarizó y la actividad
eléctrica de la célula regreso a la situación control. La
figura 15 ilustra los efectos del 2,4 DNP anteriormente
descritos para una célula que dispara en ráfagas.
58
2.4 DNP 0.1 mM
FIGURA 15.
Registro intacelular del potencial de membrana en una
neurona del OX que disparaba en forma de ráfagas antes,
durante y después de la perfusión de 2,4 DNP 0.1 mM durante
el tiempo indicado por las barra. Se observa la aparición
59
Efecto del carbonil ciano p-trifluorometoxifenilhidrazona
(PCCP) sobre la actividad eléctrica de las células 'del OX.
Se estudiaron 5 células. Las concentraciones de FCCP
que se usaron fueron 1 @4 y 2 @l
El FCCP aplicada al medio extracelular en neuronas del
ox produjo una despolarización lenta e irreversible cuya
magnitud se muestra en la tabla 10.
Se encontraron cambios irreversibles en la amplitud y
duración del potencial de acción. En la figura 16 se
muestra una célula que disparaba en forma tónica a la cual
se le aplicó FCCP 2 uM durante 6 minutos, en donde se
observa una despolarización e inhibición de su actividad
espontánea; situación que no se revirtió durante el lavado.
TABLA 10:EFECTO DEL CIAN0 P-TRIFLUOROMETOXIFENILHIDRAZONA (FCCP)SOBRE EL POTENCIAL DE MEMBRANA EN CELULAS DEL OX.
CEL. # CONC. (JIMI AE (mV) PATRON DEACTIVIDAD
42 2 10 III43 2 12.0 III44 2 6 145 1 6 III46 1 18 II
AE, despolarización desde un potencial de membrana cercano a -60 mV; el AE promedió 10.4*4.45 mV.
60
FCCP 2 ,uM
FIGURA 16.
Registro intracelular del potencial de membrana en una
neurona del OX antes, durante y después de la perfusión de
FCCP 2 @4 durante el tiempo indicado por las barra. El FCCP
provocó despolarización e inhibición de la actividad
eléctrica espontánea irreversiblemente.
61
La figura 17 muestra potenciales de acción evocados
con pulsos despolarizantes de 0.3 nA en una neurona de
intensidad obtenido en la que dispara en forma tónica
(grupo 0, al en solución normal; b) 5 minutos después de
perfundir FCCP 2 ~.IM; c) a los 5 min de lavado y d) a los
22 minutos de lavado.
El FCCP provocó un aumento en la duración del potencial de
acción y una disminución en su amplitud situación que no
se revirtió durante el lavado.
IIBLIA l l :3FECTO DEL CIAN0 P-TRIFLUOROMETOXIFENILHIDRAZONA (FCCP) 234 SOBRE EL POTENCIAL DE MEMBRANA,AMPLITUD Y DURACION DELPOTENCIAL DE ACCION EN UNA CELULA TONICA (GRUPO 1).
Vr(mV) Amp(mV) Dur(ms)
Zontrol 48.81T0.0 57.6kl.O 5.1kO.3
FCCP 5min 48.8kO.O 60.8f0.2 4.6k0.0
Lavado 5min 43.0~1.00 43.4kO.5 7.2kO.5
Lavado 22min 41.0+2.00 31.7k2.4 13.0f0.4
-os valores dados son la media aritmética f desviación estandard de 3 potenciales de acción; Vr, potencial dceposo; Amp, amplitud; Dur, duración.
Los efectos del FCCP aplicado a concentraciones de 1 1-1
m&I y 2 @Y provocan cambios en el mismo sentido que los
mostrados con la aplicación de 2,4 DNP 0.05 y 0.1 mM sólo
que los cambios fueron irreversibles.
62
b)
,I >ESI -l >E5:13.5ms 13.5ms
d)
A>Es; ~
>Es:
13.5ms 13.5ms
FIGURA 17.Potencial de acción evocados con
despolarizantespulsos
de 0.3 nA de intensidad obtenido en unaneurona que dispara en forma tónica (grupo 1). a) Ensolución normal b); a los 5 minutos. de perfundir FCCP 2 @XTc);a los 5 min de lavado. d); a los 22 minutos de lavado.El FCCP provocó un aumento en la duración del potencial deacción y una disminución en su amplitud situación que nose revirtió durante el lavado.
63
DISCUSION
En el sistema OX-GS de los crustáceos se han estudiado
los mecanismos iónicos relacionados con los distintos
patrones de generación de potenciales de acción, pero aún
se desconocen cuales serían los estímulos que podrían
regular en condiciones fisiológicas la actividad
eléctrica.
En el laboratorio se ha venido estudiando la respuesta
a la glucosa debido a que el OX-GS participa en la
homeostasis de la glucosa en el acocil y por lo tanto los
niveles de esta hexosa en el hemolinfa pueden servir como
señal de retroalimentación para regularla actividad
eléctrica de las células del OX.
Según los datos experimentales obtenidos por Martínez,
Benitez y Onetti (1993) y corroborados en este trabajo
todas las neuronas del OX estudiadas respondieron a la
glucosa despolarizandose, a pesar del hecho que su patrón
de actividad era diferente. Sin embargo, la actividad
eléctrica evocada por la glucosa es dependiente de su
patrón previo.
Con el fin de conocer si el efecto de la glucosa en el
potencial de membrana y en el patrón de actividad de las
células del OX dependen de su metabolismo previo y dado que
en la mayoría de las células el transporte de la glucosa
desde el exterior y su fosforilación por la hexocinasa son
etapas determinantes en la velocidad de utilización
6 4
(Whitesell y cols., 1993) se decidió utilizar el azúcar
manoheptulosa que actua como inhibidor competitivo de la
enzima hexocinasa (Sols y Crane, 1954).
En las células neurosecretoras del OX la manoheptulosa
usada a concentraciones de 10 mM no antagonizó la acción de
la glucosa. Las células que se perfundieron con
manoheptulosa 10 mM unicamente no se hiperpolarizaron ni
esta hexosa modificó su actividad eléctrica. Sin embargo
cuando se utilizó manoheptulosa junto con glucosa algunas
células se hiperpolarizaron, como una primera fase,
presentandose después los efectos típicos de la glucosa.
Se ha encontrado que la manoheptulosa antagoniza la
acción de la glucosa en otras células glucosencibles como
son la célula B del páncreas y ciertas neuronas en el
núcleo ventromedial del hipotálamo.
En la célula B, Dean y cols. (1974) mostraron que un
pretratamiento con manoheptulosa 20 mT~4 hiperpolarizó y
previno completamente la aparición de la actividad
eléctrica en subsecuente exposición a la glucosa (28 m) Y
e n algunos experimentos todavía se observó el bloqueo
cuando la concentración de manoheptulosa se disminuyó a 10
mM. En neuronas del nucleo ventromedial del hipotálamo la
eliminación de glucosa (10 mM) del medio de perfusión
hiperpolariza las células, lo que trae como resultado el
cese d e l las descargas espontáneas. El efecto fue
revertido después de retornar a una solución de perfusion
locon concentración de glucosa norma1 . Si el mismo Protoco
65
fue seguido pero con 10 mM de manoheptulosa presente en el
momento de la readición de glucosa la célula no se
repolariza y no hay recuperación del potencial de acción.
Un incremento en la concentración de manoheptulosa de 10 a
20 rtM resultó en una hiperpolarización adicional que llevó
el potencial de membrana cerca del potencial de equilibrio
para el potasio (Ashford y cols. 1990).
El hecho de que la manoheptulosa a las concentraciones
usadas no antagonice la acción de la glucosa en las nuronas
del OX puede no invalidar el argumento que un metabolito de
la glucosa es responsable de iniciar los cambios en la
actividad electrofisiológica ya que el flujo glucolítico
pudo no haberse reducido lo necesario con las
concentraciones del inhibidor metabólico usadas.
La acción de la glucosa sobre las propiedades
eléctricas de las neuronas del OX como resultado del
metabolismo celular, podría explicarse por un aumento de la
producción de ATP lo cuál incrementaría la disponibilidad
de grupos fosfato que pueden utilizarse para fosforilar
canales iónicos, o bien, que el ATP se uniera directamente
a algun canal de membrana (Benítez, 1993). La demostración
de alguna de estas alternativas queda fuera de los
objetivos planteados para el presente trabajo, lo cual deja
abiertas ambas posibilidades.
El 2,4 DNP y el FCCP son agentes químicos que tienen
la capacidad de desacoplar la fosforilación oxidativa.
66
Esto es, por dañar la unión cinética y termodinámica entre
transporte de electrones y fosforilación de ADP. En la
presencia de desacoplantes, la síntesis de ATP mitocondrial
es reemplazada por una actividad de ATPasa, el control
respiratorio es suprimido y la energía libre de oxidación
de sustratos es disipada en forma- de calor (Hanstein,
1976).
Decidimos estudiar el efecto de inhibidores del
metabolismo sobre el potencial de membrana y el patrón de
actividad eléctrica de las células del OX como una
estrategia experimental para conocer la participación de la
fosforilación oxidativa en el mantenimiento del potencial
de membrana y la actividad eléctrica en las neuronas del
ox. Y también, estudiar si se requiere de la integridad de
las últimas etapas del metabolismo de la glucosa,
fosforilación oxidativa, para que esta hexosa regule la
actividad eléctrica en las células del OX.
Con base en los resultados obtenidos el 2,4 DNP
despolariza lenta y reversiblemente las células del OX, sin
importar el patrón de actividad eléctrica que presente la
célula. E l cambio en el potencial de membrana es
concentración dependiente. Esta despolarización puede
resultar en actividad de espigas en células previamente
silentes o en un aumento en la actividad previa. Una vez
que el 2,4 DNP es retirado y el potencial de ,membrana
regresa a su valor control, permanecen cambios en el patrón
de descarga de potenciales de acción, específicamente hay
67
una disminución en la frecuencia de disparo con respecto al
control. Al parecer el 2,4 DNP produce efectos de larga
duración independientes del cambio en el potencial de
membrana.
El FCCP a las concentraciones usadas despolarizó
irreversiblemente el potencial de membrana y bloqueo,
también irreversiblemente la generación de potenciales de
acción.
En la literatura se describen los efectos de la
exposición a inhibidores metabólicos sobre el potencial de
membrana en otras células del sistema nervioso. Por
ejemplo:
Células gliales humanas cultivadas fueron rápida y
reversiblemente despolarizadas por 1 uM de FCCP y 1 mM de
2,4 DNP (Brismar y Collins, 1991). En contraste, en
neuronas sensoriales aisladas los inhibidores metabólicos
FCCP y 2,4 DNP usados a concentraciones de 1 uM y 0.1 mM
respectivamente, provocan hiperpolariación de la célula que
puede ser suficiente para bloquear la generación de
potenciales de acción (Duchen, 1990a). Duchen y cols.
(1990b) identificaron alteraciones tempranas en la función
membrana1 después de producir alteraciones metabólicas.
Encontraron que la exposición a cianuro o al desacoplante
metabólico FCCP provocó una elevación en la concentración
de calcio intracelular por arriba del 220% (Duchen y
Valdeomillos, 1990b) que provocaron hiperpolariación de la
célula a través de canales de K+ activados por calcio
68
(Duchen, 1990a). Ellos sugieren que la elevación en la
concentración intracelular de calcio procede
independientemente de una disminución en la razón ATP/ADP
sino más bien por dañar la acumulación de calcio
mitocondrial, el mecanismo por el cuál la concentración de
calcio intracelular se mantiene normalmente a niveles
bajos. Los desacoplantes y posiblemente otros inhibidores
metabólicos producirían una caída en el potencial de
membrana mitocondrial y en consecuencia una elevación en la
concentración de calcio intracelular que tendría efecto
sobre la población de canales expresados por la célula.
Los cambios en el potencial de membrana se deben a
cambios en la magnitud o en la cinética de una o más
corrientes iónicas. Por lo anterior, resultaría
interesante realizar experimentos de fijación de voltaje
para determinar cuál o cuáles de esas corrientes iónicas
son afectadas por la acción del 2,4 DNP, y también esudiar
si cambios en la concentración intracelular de calcio
median la despolarización. Alternativamente el 2,4 DNP y
el FCCP pueden tener un efecto directo en la membrana
plasmática que puede despolarizar la célula.
El 2,4 DNP provocó una despolzarización y efectos
excitatorios en el mismo sentido que la glucosa y por lo
tanto esto impidió realizar experimentos donde se utilizara
2,4 DNP en presencia de glucosa como medio para conocer si
el metabolismo de la glucosa tiene que llegar hasta SUS
69
ultimas etapas, fosforilación oxidativa, para regular la
excitabilidad de las neuronas del OX.
70
CONCLUSIONES
1. Se registró la actividad électrica de las células del OX
de acocil, usando la técnica electrofisiológica de
microelectrodos, en condiciones control y durante la
aplicación de los inhibidores metabólicos, manoheptulosa,
2,4 DNI? y FCCP.
2. La manoheptulosa no antagonizó la acción de la glucosa.
Se observó hiperpolarización en algunas células cuando fue
usado en presencia de glucosa y por si sola no provocó
cambios significativos en el potencial de membrana.
3 . El 2,4 DNE? despolariza reversiblemente las células del
ox.
4. El 2,4 DNP disminuyó la amplitud y aumentó la.duración
de potenciales de acción espontáneos y de los evocados por
un estímulo eléctrico.
5. El FCCP provocó efctos en el mismo sentido que el 2,4
DNP, pero estos fueron irreversibles.
6 . Mediante experimentos electrofisiológicos de este tipo
no podemos concocer si la glucosa tiene que llegar hasta
sus ultimas etapas de metabolismo, fosforilación oxidativa,
para regular la excitabilidad de las neuronas del OX.
71
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