Inhibidor enzimtico

Modelo estructural de la proteasa del virus del SIDA unida a un inhibidor de la proteasa, el ritonavir. La estructura de la proteasa se muestra mediante cintas de color rojo, azul y amarillo, mientras que el inhibidor es representado por una estructura de esferas y varillas cerca del centro de la proteasa. Modelo creado a partir del PDB 1HXW.Los inhibidores enzimticos son molculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad. Puesto que el bloqueo de una enzima puede matar a un organismo patgeno o corregir un desequilibrio metablico, muchos medicamentos actan como inhibidores enzimticos. Tambin son usados como herbicidas y pesticidas. Sin embargo, no todas las molculas que se unen a las enzimas son inhibidores; los activadores enzimticos se unen a las enzimas e incrementan su actividad.La unin de un inhibidor puede impedir la entrada del sustrato al sitio activo de la enzima y/u obstaculizar que la enzima catalice su reaccin correspondiente. La unin del inhibidor puede ser reversible o irreversible. Normalmente, los inhibidores irreversibles reaccionan con la enzima de forma covalente y modifican su estructura qumica a nivel de residuos esenciales de los aminocidos necesarios para la actividad enzimtica. En cambio, los inhibidores reversibles se unen a la enzima de forma no covalente, dando lugar a diferentes tipos de inhibiciones, dependiendo de si el inhibidor se une a la enzima, al complejo enzima-sustrato o a ambos.Muchos medicamentos son inhibidores enzimticos, por lo que su descubrimiento y mejora es un campo de investigacin activo en la bioqumica y la farmacologa. La validez de un inhibidor enzimtico medicinal suele venir determinada por su especificidad (su incapacidad de unirse a otras protenas) y su potencia (su constante de disociacin, la cual indica la concentracin necesaria para inhibir a una enzima). Una alta especificidad y potencia asegura que el medicamento va a tener pocos efectos secundarios y por tanto una baja toxicidad.Los inhibidores enzimticos tambin son usados en la naturaleza y estn implicados en la regulacin del metabolismo. Por ejemplo, las enzimas en una ruta metablica pueden ser inhibidas por los productos resultantes de sus respectivas rutas. Este tipo de retroalimentacin negativa retarda el flujo a travs de la ruta cuando los productos comienzan a acumularse y es una manera importante de mantener la homeostasis en una clula. Otros inhibidores enzimticos celulares son protenas que se unen especficamente e inhiben una diana enzimtica. Esto puede ayudar a controlar enzimas que pueden ser dainas para la clula, como las proteasas o nucleasas. Un buen ejemplo es el inhibidor de la ribonucleasa, que se une a esta enzima en una de las interacciones protenaprotena ms fuertes conocidas.1 Como inhibidores enzimticos naturales tambin cabe destacar los venenos, que son usados como defensa contra los depredadores o como forma de matar a una presa.Inhibidores o sustratos reversiblesLos inhibidores reversibles se unen a las enzimas mediante interacciones no covalentes tales como los puentes de hidrgeno, las interacciones hidrofbicas y los enlaces inicos. Los enlaces dbiles mltiples entre el inhibidor y el sitio activo se combinan para producir una unin fuerte y especfica. Al contrario de lo que ocurre con el sustrato y los inhibidores irreversibles, los inhibidores reversibles generalmente no experimentan reacciones qumicas cuando se unen a la enzima y pueden ser eliminados fcilmente por dilucin o por dilisis.Tipos de inhibidores reversibles

Inhibicin competitiva: el sustrato (S) y el inhibidor (I) compiten por el sitio activo (cavidad de la enzima).Existen tres tipos de inhibidores reversibles. Se clasifican en base al efecto producido por la variacin de la concentracin del sustrato de la enzima en el inhibidor.2 En la inhibicin competitiva, el sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma enzima al mismo tiempo, como se muestra en la figura de la derecha. Esto generalmente ocurre cuando el inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de una enzima en el que tambin se une el sustrato; el sustrato y el inhibidor compiten para el acceso al sitio activo de la enzima. Este tipo de inhibicin se puede superar con concentraciones suficientemente altas del sustrato, es decir, dejando fuera de competicin al inhibidor. Los inhibidores competitivos son a menudo similares en estructura al sustrato verdadero (ver ejemplos expuestos ms abajo). En la inhibicin mixta, el inhibidor se puede unir a la enzima al mismo tiempo que el sustrato. Sin embargo, la unin del inhibidor afecta la unin del sustrato, y viceversa. Este tipo de inhibicin se puede reducir, pero no superar al aumentar las concentraciones del sustrato. Aunque es posible que los inhibidores de tipo mixto se unan en el sitio activo, este tipo de inhibicin resulta generalmente de un efecto alostrico donde el inhibidor se une a otro sitio que no es el sitio activo de la enzima. La unin del inhibidor con el sitio alostrico cambia la conformacin (es decir, la estructura terciaria o la forma tridimensional) de la enzima de modo que la afinidad del sustrato por el sitio activo se reduce. La inhibicin no competitiva es una forma de inhibicin mixta donde la unin del inhibidor con la enzima reduce su actividad pero no afecta la unin con el sustrato. Como resultado, el grado de inhibicin depende solamente de la concentracin de inhibidor.Descripcin cuantitativa de la inhibicin reversibleLa inhibicin reversible puede ser descrita cuantitativamente en trminos de la unin del inhibidor a la enzima y al complejo enzima-sustrato, y sus efectos en las constantes cinticas de la enzima. En el esquema clsico de Michaelis-Menten mostrado abajo, una enzima (E) se une a su sustrato (S) para formar el complejo enzima-sustrato (ES). En la catlisis, este complejo se rompe para liberar el producto (P) y la enzima (E). El inhibidor (I) puede unirse tanto a (E) como a (ES) con las constantes de disociacin Ki o Ki', respectivamente. Los inhibidores competitivos se pueden unir a (E), pero no a (ES). La inhibicin competitiva aumenta el valor de Km (es decir, el inhibidor interfiere con la unin del sustrato), pero no afecta a la Vmax (el inhibidor no obstaculiza la catlisis en (ES) porque no se puede unir a (ES)).3 Los inhibidores no competitivos tienen afinidades idnticas por (E) y (ES) (Ki = Ki'). La inhibicin no competitiva no cambia la Km (es decir, no afecta a la unin del sustrato) pero disminuye la Vmax (es decir, la unin del inhibidor obstaculiza la catlisis).3 Los inhibidores de tipo mixto se unen tanto a (E) como a (ES), pero sus afinidades por estas dos formas de enzimas son distintas (Ki Ki'). Por lo tanto, los inhibidores de tipo mixto interfieren con la unin del sustrato (incremento de Km) y dificulta la catlisis en el complejo (ES) (disminucin de la Vmax).3

Esquema cintico aplicable a los inhibidores enzimticos reversibles.

Cuando una enzima tiene mltiples sustratos, los inhibidores pueden mostrar distintos tipos de inhibiciones dependiendo del sustrato que se considere, ya que el sitio activo posee dos diferentes lugares para la unin con el sustrato en el mismo sitio activo, uno para cada sustrato. Por ejemplo, un inhibidor puede competir con el sustrato A por el primer sitio de unin, pero ser un inhibidor no competitivo con respecto al sustrato B en el segundo sitio de unin.3Medicin de las constantes de disociacin en un inhibidor reversible

Diagramas de Lineweaver-Burke de los diferentes tipos de inhibidores enzimticos reversibles. La flecha muestra el efecto producido por el incremento de las concentraciones de inhibidor.Segn lo observado arriba, un inhibidor enzimtico est caracterizado por sus dos constantes de disociacin, Ki y Ki', de la enzima y del complejo enzima-sustrato, respectivamente. La constante del complejo enzima-inhibidor Ki puede ser medida directamente por varios mtodos. Un mtodo extremadamente exacto es la calorimetra isoterma de titulacin, en donde el inhibidor es titulado en una solucin de enzimas y el calor liberado o absorbido es medido.4 Sin embargo, la otra constante de disociacin Ki' es difcil de medir directamente, ya que el complejo enzima-sustrato tiene un periodo de vida muy corto y est dando lugar a la reaccin qumica para formar el producto. Por lo tanto, Ki' suele medirse de forma indirecta, observando la actividad enzimtica bajo varias concentraciones de sustrato e inhibidor, y ajustando los datos 5 a una ecuacin de MichaelisMenten modificada:

donde los factores de modificacin y ' son definidos por la concentracin del inhibidor y sus dos constantes de disociacin

As, en presencia del inhibidor, la efectividad de la enzima Km y Vmax es ahora (/')Km y (1/')Vmax, respectivamente. Sin embargo, la ecuacin de Michaelis-Menten modificada asume que la unin del inhibidor a la enzima alcanza el equilibrio, el cual puede ser un proceso muy lento para los inhibidores con constantes secundarias nanomolares de disociacin. En estos casos, es usualmente ms prctico tratar al inhibidor de unin fuerte como un inhibidor irreversible (ver abajo). Sin embargo, todava puede ser posible estimar Ki' cinticamente si Ki es medido independientemente.5Los efectos de diferentes tipos de inhibidores enzimticos reversibles en la actividad enzimtica pueden ser visualizados usando la representacin grfica de la ecuacin de MichaelisMenten, mediante los diagramas de Lineweaver-Burke o de Eadie-Hofstee. Por ejemplo, en los diagramas de Lineweaver-Burk a la derecha, las lneas de la inhibicin competitiva intersecan el eje-y, ilustrando que tales inhibidores no afectan a la Vmax. De igual manera, las lneas de la inhibicin no competitiva intersecan el eje-x, mostrando que estos inhibidores no afectan a la Km. Sin embargo, puede ser complicado estimar Ki y Ki' con precisin en estos diagramas, por lo que es recomendable estimar estas constantes usando mtodos ms fiables de regresin no lineal,6 segn lo descrito arriba.Casos especiales El mecanismo de la inhibicin parcialmente competitiva es similar al de la inhibicin no competitiva, excepto que el complejo EIS tiene actividad cataltica, la cual decrece o incluso aumenta (activacin parcialmente competitiva) en comparacin al complejo enzima-sustrato (ES). Esta inhibicin suele exhibir un valor ms bajo de Vmax, pero un valor de Km inalterado.3 La inhibicin no competitiva se produce cuando el inhibidor se une slo al complejo enzima-sustrato, no a la enzima libre. El complejo EIS es catalticamente inactivo. Esta forma de inhibicin es rara y causa una disminucin tanto en el valor de Vmax como en el de Km.3 La inhibicin por sustrato y por producto es donde el sustrato o el producto de una reaccin enzimtica inhiben la actividad enzimtica. Este tipo de inhibicin puede seguir los patrones competitivos, no competitivos o mixtos. En la inhibicin por sustrato hay una disminucin progresiva de la actividad a altas concentraciones de sustrato. Esto puede indicar la existencia de dos sitios de unin entre sustrato y enzima. Cuando hay poco sustrato, se ocupa el sitio de alta afinidad y sigue la cintica normal. Sin embargo, a altas concentraciones, el segundo sitio de inhibicin se ocupa, inhibiendo a la enzima.7 La inhibicin por parte del producto es a menudo una caracterstica reguladora en el metabolismo y puede ser una forma de retroalimentacin negativa. La inhibicin lenta y fuerte se produce cuando el complejo enzima-inhibidor EI inicial experimenta una isomerizacin a un segundo complejo ms fuertemente unido, EI*, pero el proceso total de la inhibicin es reversible. Esto se manifiesta como un lento aumento en la inhibicin enzimtica. En estas condiciones, la tradicional cintica de MichaelisMenten da un valor falso para Ki, el cual depende del tiempo. El verdadero valor de Ki puede ser obtenido a travs de un anlisis ms complejo de las constantes de rango de encendido (kon) y apagado (koff) para la asociacin del inhibidor (vase la inhibicin irreversible para ms informacin).3 7Ejemplos de inhibidores reversibles

Estructura molecular del ritonavir, un inhibidor de proteasa de carcter peptdico.Puesto que las enzimas han evolucionado para unirse a sus sustratos fuertemente, y la mayora de los inhibidores reversibles se unen al sitio activo de las enzimas, es poco sorprendente que algunos de estos inhibidores sean muy similares en estructura a los sustratos de sus dianas. Como ejemplo de estos imitadores de sustratos caben destacar los inhibidores de la proteasa, una clase muy efectiva de frmacos antirretrovirales usados para tratar el VIH. La estructura del ritonavir (figura de la derecha), un inhibidor de la proteasa, consiste en un pptido con tres enlaces peptdicos. Dicha estructura se asemeja a la protena que es el sustrato de la proteasa del VIH, por lo que ambos compiten por la unin al sitio activo de la enzima.8Los inhibidores enzimticos son a menudo diseados para imitar el estado de transicin o intermedio de una reaccin catalizada por una enzima. Esto asegura que el inhibidor cambie el estado de transicin estableciendo un efecto en la enzima, lo que resulta en una afinidad de unin mejor (baja Ki) que los diseos basados en sustratos. Un ejemplo de un inhibidor en ese estado de transicin es el frmaco antiviral oseltamivir, que imita la naturaleza plana del anillo del ion oxonio en la reaccin de la neuraminidasa, una enzima del virus.9

Estructura molecular del tipranavir, un inhibidor de proteasa de carcter no peptdico.Sin embargo, no todos los inhibidores estn basados en la estructura del sustrato. Por ejemplo, la estructura de otro inhibidor de la proteasa del VIH, el tipranavir, (representada a la derecha), no est basada en un pptido y no tiene similitudes estructurales obvias con la protena sustrato. Estos inhibidores no peptdicos pueden ser ms estables que los inhibidores que contienen enlaces peptdicos porque estos no son sustratos para las peptidasas, con lo que son menos propensas a ser degradadas en la clula.10En el diseo de frmacos es importante considerar las concentraciones de sustrato a las cuales se expondr la enzima en cuestin. Por ejemplo, algunos inhibidores de protenas quinasas tienen estructuras qumicas que son similares al adenosn trifosfato, uno de los sustratos de esta enzima. Sin embargo, ciertos frmacos que son simplemente inhibidores competitivos tendrn que competir con altas concentraciones de ATP en la clula. Las protenas quinasas tambin pueden ser inhibidas por competencia en el sitio de unin donde la quinasa interacta con sus protenas sustrato, y la mayora de las protenas presentes en el interior de una clula se encuentran a concentraciones mucho menores que las concentraciones de ATP. En consecuencia, si dos inhibidores de protenas quinasas se unen en sus sitios activos con afinidad similar, pero solo uno tiene que competir con el ATP, entonces el inhibidor competitivo en el sitio de unin de la protena inhibir a la enzima ms eficientemente.11Inhibidores irreversibles

Reaccin del inhibidor irreversible diisopropilfluorofosfato (DFP) con una sern-proteasa.Los inhibidores irreversibles normalmente modifican una enzima covalentemente, con lo que la inhibicin no puede ser invertida. Los inhibidores irreversibles suelen contener grupos funcionales reactivos como mostazas nitrogenadas, aldehdos, haloalcanos o alquenos. Estos grupos electroflicos reaccionan con las cadenas de aminocidos para formar uniones covalentes. Los residuos modificados son aquellos que contienen en sus cadenas laterales nuclefilos como por ejemplo un grupo hidroxilo o un grupo sulfhidrilo. Esto incluye a los aminocidos serina (como en el DFP, a la derecha), cistena, treonina o tirosina.12Tipos de inhibiciones irreversiblesLa inhibicin irreversible es diferente de la inactivacin enzimtica reversible. Los inhibidores irreversibles son generalmente especficos para un tipo de enzima y no inactivan a todas las protenas. No funcionan destruyendo la estructura protenica, sino alterando especficamente la estructura tridimensional del sitio activo inhabilitndolo. Por ejemplo, el pH y las temperaturas extremas causan la desnaturalizacin de casi todas las protenas, pero este no es un efecto especfico. De forma similar, algunos tratamientos qumicos no especficos destruyen la estructura de la protena: por ejemplo, si son sometidas a una elevada concentracin de cido clorhdrico, el cual hidrolizar los enlaces peptdicos que mantienen unidos los aminocidos de las protenas.13Los inhibidores irreversibles dan lugar a una inhibicin dependiente del tiempo y, por ello, su potencia no puede ser caracterizada mediante la determinacin del valor IC50. Esto se debe a que la cantidad de enzima activa a una concentracin dada de inhibidor irreversible ser diferente dependiendo del tiempo de pre-incubacin del inhibidor con la enzima. Por ello, en lugar del valor IC50, se utiliza el parmetro kobs/[I],14 donde kobs es el primer valor observado de la tasa de inactivacin (obtenido al representar en una grfica log (actividad) VS. tiempo) e [I] es la concentracin de inhibidor. El parmetro kobs/[I] es vlido siempre y cuando el inhibidor no se encuentre a concentraciones saturantes (en cuyo caso tendramos que kobs = kinact).14Anlisis de la inhibicin irreversible

Esquema de la cintica enzimtica de los inhibidores irreversibles.Como se muestra en la figura de la izquierda, los inhibidores irreversibles forman inicialmente un complejo reversible y no covalente con la enzima (EI o ESI), que reaccionar posteriormente para producir una modificacin covalente en lo que se denomina el "complejo del punto muerto" EI*. La tasa a la cual se forma EI* es llamada tasa de inactivacin o kinact. Puesto que la formacin de EI puede competir con ES, la unin de los inhibidores irreversibles puede ser prevenida por competencia tanto con el sustrato como con un segundo inhibidor reversible. Este efecto de proteccin es una buena evidencia de una reaccin especfica del inhibidor irreversible con el sitio activo.15Los pasos de unin e inactivacin de esta reaccin son analizados incubando la enzima con el inhibidor y midiendo la actividad que va quedando a lo largo del tiempo. La actividad ir disminuyendo de forma paulatina con tiempo, generalmente siguiendo una dinmica de decaimiento exponencial. Ajustando estos datos a una ecuacin de rango podemos obtener la tasa de inactivacin a esta concentracin de inhibidor. Esto se hace a diferentes concentraciones de inhibidor. Si un complejo EI reversible est involucrado el rango de inactivacin ser saturable y al ajustarla a esta curva obtendremos los valores de kinact y Ki.15Otro mtodo que es ampliamente utilizado en estos anlisis es la espectrometra de masas. En este caso, la medida exacta de la masa de la enzima nativa sin modificar y de la enzima inactivada, nos da el aumento en la masa causado por la reaccin con el inhibidor, con lo que obtenemos la estequiometra de la reaccin. Para llevar a cabo esta tcnica suele ser necesario el uso de un espectrmetro de masas MALDI-TOF. Una tcnica complementaria a esta es la huella peptdica, que implica la digestin de protenas nativas o modificadas con una peptidasa como la tripsina. Esto genera una serie de pptidos que pueden ser analizados usando un espectrmetro de masas. El pptido que cambie su masa despus de llevar a cabo la reaccin con el inhibidor ser aquel que contenga el sitio de la modificacin.16Casos especiales

Mecanismo qumico para inhibicin irreversible de la ornitina descarboxilasa por medio de DFMO. El piridoxal 5'-fosfato (Py) y la enzima (E) no se muestran.17 (Adaptado del artculo que figura en la referencia).No todos los inhibidores irreversibles forman uniones covalentes con la enzima que tienen como diana. Algunos inhibidores reversibles se unen tan fuertemente a su objetivo que son prcticamente irreversibles. Estos inhibidores de unin fuerte suelen mostrar una cintica similar a la de los inhibidores irreversibles que forman enlaces covalentes. En estos casos, algunos de estos inhibidores se unen rpidamente a la enzima formando un complejo EI de baja afinidad, que despus experimenta una reaccin ms lenta hacia un complejo EI* muy fuertemente unido (ver la imagen arriba). Este comportamiento cintico es denominado unin lenta.18 Este lento reajuste posterior normalmente implica un cambio conformacional cuando la enzima se pliega alrededor de la molcula inhibidora. Como ejemplos de inhibidores de unin lenta cabe destacar algn frmaco importante como el metotrexato,19 el alopurinol20 y la forma activada del aciclovir.21Ejemplos de inhibidores irreversibles

Tripanotin reductasa donde se muestran dos molculas unidas al centro activo: la inferior es un inhibidor unido de forma irreversible y la superior un inhibidor unido de forma reversible. Creado mediante PDB 1GXF.El diisopropilfluorofosfato (DFP) se muestra como un ejemplo de inhibidor irreversible de la proteasa en el apartado "Inhibidores irreversibles" arriba a la derecha. La enzima hidroliza el enlace entre el fsforo y el flor, pero el residuo de fosfato se mantiene unido a una serina en el centro activo, inactivndolo.22 Adems, el DFP tambin reacciona con el centro activo de la acetilcolinesterasa en la sinapsis de las neuronas, lo que lo convierte en una potente neurotoxina, con una dosis letal a partir de cantidades inferiores a 100 mg.23La inhibicin suicida es un tipo comn de inhibicin irreversible donde la enzima convierte al inhibidor en una sustancia reactiva en su centro activo. Un ejemplo de esto es el inhibidor de biosintetizadores de poliaminas -difluorometilornitina o DFMO, que es un anlogo del aminocido ornitina, y es usado para tratar la Tripanosomiasis Africana (enfermedad del sueo). La ornitina decarboxilasa puede catalizar la descarboxilacin del DFMO sustituyendo a la ornitina, como se muestra en la figura del apartado anterior. Sin embargo, esta reaccin de descarboxilacin es seguida por la eliminacin del tomo de flor, lo que convierte a este intermediario en una imina, una especie altamente electroflica. Esta forma reactiva del DFMO reacciona posteriormente con un residuo de cistena o lisina en el centro activo para inactivar la enzima irreversiblemente.17Puesto que la inhibicin irreversible implica a menudo la formacin inicial de un complejo EI no covalente, a veces es posible que un inhibidor pueda unirse a una enzima de diversas formas. Como ejemplo cabe destacar el caso de la enzima tripanotin reductasa perteneciente al protozoo y parsito humano Trypanosoma cruzi, donde dos molculas de un inhibidor llamado mostaza quinacrina, presentan la capacidad de unirse a su centro activo. La molcula superior se une de forma reversible, pero la de abajo se une de forma covalente al reaccionar con un residuo de aminocido a travs de su grupo de mostaza nitrogenada.24

Descubrimiento y diseo de inhibidoresLa investigacin y desarrollo de nuevos frmacos es un largo proceso en el cual el primer paso casi siempre es el descubrimiento de un nuevo inhibidor enzimtico. En el pasado, la nica forma de descubrir estos nuevos inhibidores era mediante el sistema de prueba y error: probando un elevado nmero de compuestos contra la enzima a la cual se quiere inhibir y esperando conseguir alguno que sea efectivo. Esta aproximacin, si bien se basa en la fuerza bruta, sigue logrando actualmente un gran xito gracias a nuevos sistemas de barrido, como la qumica combinatoria, que rpidamente producen un gran nmero de compuestos novedosos, y a la tecnologa basada en la investigacin de procesamiento de alto-rendimiento, mediante la cual se pueden revisar rpidamente estas enormes bibliotecas qumicas de inhibidores tiles.25Ms recientemente, se ha comenzado a aplicar un nuevo tipo de investigacin alternativa: el diseo racional de frmacos que usa la estructura tridimensional del sitio activo de una enzima para predecir qu molculas podran ser inhibidores.26 Una vez realizada la prediccin, se prueban y se selecciona el mejor. Este nuevo inhibidor es usado despus para tratar de obtener una estructura de la enzima en un complejo enzima-sutrato para mostrar cmo se une la molcula al sitio activo. Esta estructura es despus inspeccionada y se llevan a cabo ciertos cambios en la estructura del inhibidor con el fin de optimizar la unin con la enzima. Este ciclo de prueba y optimizacin se repite de forma sucesiva hasta obtener un inhibidor lo suficientemente potente, es decir, cuando se alcanza un valor de la constante de disociacin que est en torno a