UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS - ESPE DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA...
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UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS - ESPEDEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA
CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y BIOQUÍMICA DE CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y BIOQUÍMICA DE CEPAS DE RIZOBIOS ASOCIADOS A CULTIVOS DE ARVEJA CEPAS DE RIZOBIOS ASOCIADOS A CULTIVOS DE ARVEJA ((Pisum sativum Pisum sativum L.), CHOCHO (L.), CHOCHO (Lupinus mutabilisLupinus mutabilis S.), S.), FRÉJOL (FRÉJOL (Phaseolus vulgaris Phaseolus vulgaris L.), HABA (L.), HABA (Vicia fabaVicia faba L.) Y L.) Y VICIA (VICIA (Vicia Vicia sp.) EN SUELOS DE LA PROVINCIA DE sp.) EN SUELOS DE LA PROVINCIA DE IMBABURA Y OBTENCIÓN DE UN BANCO DE CEPAS.IMBABURA Y OBTENCIÓN DE UN BANCO DE CEPAS.
PREVIA A LA OBTENCIÓN DE GRADO ACADÉMICO O TÍTULO DE:
INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA
María José Carpio Espinosa
Febrero, 2014
PROYECTOPROYECTO
PIC 12 INIAP 009código: 2153902800021703
“Manejo adecuado de abonos verdes y microorganismos fijadores de nitrógeno dentro de sistemas de producción agroecológicos”
Soraya Alvarado, Ph.D
Fertilizantes nitrogenados
Uso de rizobios
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
Inoculación exitosa: identificación y selección de
cepas
Cepas foráneas
Último estudio rizobios 2004
Caracterización fenotípica rizobios
Preservación bacteriana
Evaluación de FBN en invernadero y
campo
Producción inoculantes a nivel
nacional
Arveja = 185 kg N/ha
Chocho = 400-900 kg N/ha.
Haba = 150-500 kg N/ha.
Fréjol = 60 kg N/ha
Vicia = 125-300 kg N/ha.
Recolectar cepas de rizobios a partir de nódulos de arveja, chocho, fréjol, haba y vicia en suelos de Imbabura.
Caracterizar morfológica y bioquímicamente las cepas de rizobios.
Formar un cepario de rizobios a partir de las cepas de INIAP y las recolectadas.
OBJETIVOSOBJETIVOS
Recolección de nódulos
A. Selección de mejor planta en
floración
B. Excavación de raíces y
verificación del color del nódulo
C. Nódulos en tubos con sílica-gel
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS
Desinfección de nódulos
A. Hidratación de nódulos en agua estéril
A. Nódulos en etanol (95%) e
hipoclorito (3%)
C. Lavado de nódulos en
agua estéril.
Aislamiento de rizobios recolectados de Imbabura
A. Aislamiento a partir de nódulos
B. Purificación por agotamiento
C. Multiplicación
Reactivación de rizobios banco INIAP
A. Cepa liofilizad
a
B. Siembra de cepa con solución
peptona 0,1%
C. Crecimiento bacteriano
D. Purificación por
agotamiento
Cepas medio LMA
refrescamiento
Nistatina + PCNB
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS
Pruebas de autentificación
GPA + PBC (púrpura)
LLA + RB (blanco)
LMA + PBC (café) LMA + ABT (verde)
Tinción de Gram Liofilización
A. Peptona(10%)+ sacarosa(20%)
B. Tubos eppendorf con solución y cepa
C. Liofilización de cepas
Caracterización morfológica (Prescott, 2004)
CARACTERISTICAS
ESPECIFICACIONES
textura elástica cremosa acuosa gomosa
gomosidad abundante mediana escasa nula
elevación pulvinada convexa elevada plana
apariencia opaca brillante translúcida
margen entero ondulado erosionado
color Rosado intenso Rosado coral Rosado palo
tamaño pequeña (<2mm)
mediana (2-5mm)
grande (>5mm)
forma circular elongada irregular
Caracterización bioquímica
A. Escala de McFarland
B. Suspenciones bacterianas
C. Relación McF [4] y
suspensión 109 cel/mL
109 cel/mL 105 cel/mL Dilución agua estéril
PRUEBAS BIQUÍMICAS
- Fuentes de carbono
- Fuentes de nitrógeno
- Metales pesados
- Antibióticos
- Urea
- NaCl
- pH
RESULTADOS Y DISCUSIÓNRESULTADOS Y DISCUSIÓN
Áreas de muestreo
Nódulos de arveja, fréjol, haba y vicia
Nódulos
chocho
Sherman et al. (1991)
Aislamiento de rizobios
Todos los rizobios
Crecimiento rápido
Crecimiento lento
cepa “C8 B”
3 días
7 días
105 cepas rizobios
Imbabura
Dieciséis cepas INIAP
Diecinueve no viables
Grisales y Fuentes (2005), CIAT (1988).
Dos cepas colonias
rojas
Kuykendall et al. (2005)
Pruebas de autentificación
A. GPA+PBC: no cambio de color
B. LLA+RB: no cambio
de color
D. LMA+ABT:Reacción
ácida
Rhizobium etli
A. GPA+PBC: no cambio de color
B. LLA+RB: no cambio
de color
C. LMA+PBC:
reacción ácida
C. LMA+PBC:
reacción alcalina
D. LMA+ABT:Reacción alcalina
Bradyrhizobium
Rhizobium leguminosar
um
A. GPA+PBC: no cambio de color
B. LLA+RB: Cambio
parcial de color
C. LMA+PBC:
reacción ácida
D. LMA+ABT:Reacción
ácida
A. Acidifica
el medio a los dos
días
B. Retorno parcial de color a los tres días
C. Retorno total de
color a los cinco días
Medio GPA+PBC
Tres cepas :
TAL 1236FB 481
FR 1063
Norris (1965): cepas suelos
alcalinos
A. GPA+PBC: cambio de
color
B. LLA+RB: Cambio de
color
C. LMA+PBC:
Reacción ácida
D. LMA+ABT:Reacción
ácida
Agrobacterium
Tinción de Gram
Bacilos Gram -
C. R. leguminosarum
B. R. etli
A. R. tropici
Se autentificaron100 cepas como rizobios
Dos cepas : R-FR-PE-2b / R-HA-PE-3
Caracterización morfológica
elástica
Abundante goma
rosado coral
Mediano (2-5 mm)
opaca
Rhizobium etli
Rhizobium tropici
translúcida
acuosa
rosado pálido
Sin goma
convexaCrecimient
o rápido
Rizobios de arveja, fréjol, haba y vicia:
entero circular
Kuykendall et al. (2005), CIAT (1988)
elástica
Mediano(2-3 mm)
opaca
gomosa
Pequeño (1 mm)
Rosado coral
Bradyrhizobium
Crecimiento lento
pulvinada
Abundante goma
Ochrobactrum
Rizobios de chocho:
Crecimiento rápido
Martínez (2007): Bradyrhizobium
Trujillo et al. (2005): Ochrobactrum,
ARVEJA: 7 gruposCS: 0.86
CHOCHO: 6 gruposCS: 0.86
FRÉJOL: 6 gruposCS: 0.88
HABA: 5 gruposCS: 0.89
VICIA: 4 gruposCS: 0.86
Caracterización bioquímicaMayoría de cepas
sensibles: - pH 4.5 y 8.5
- NaCl 1% y 2%- zinc
- kanamicina y cloranfenicol- citrato y glicina (Romero, 2009)
Rizobios tolerantes a condiciones hostiles
Cepas INIAP y chocho
Fuentes carbonoA. xylosa
B. fructosaC. glucosa
D. galactosaE. maltosaF. sacarosaG. dulcitolH. eritritolI. tartratoJ. lactato
K. sorbosaM. citrato
R-CH-MO-78b
Cepa muy resistente
AntibióticosA. ácido nalidíxico
B. cloranfenicolC. kanamicina
D. estreptomicinaMetales pesados
A. zincB. plomoC. cobre
D. aluminio UreaA. 20 ppm C. 100
ppm B. 50 ppm D. 500
ppm
Fuentes nitrógenoA. triptófano
B. tirosinaC. glicina
NaClA. 0.5%
B. 1% (NC)C. 2% (NC)
pHA. 4.5B. 5
C. 8.5
Diversidad genética rizobiosContreras et al. (2007), Cuadrado et al.
(2009), Marquina et al. (2011), Martínez (2003)
Resultados en laboratorio
Matos y Zuñiga (2002)
Cepa “C8 B”Bradyrhizobiu
m
No resistente Odee et al. (1997) y Cuadrado et al. (2009),
Shamseldin & Werner (2005), Matos et al. (2001)
ARVEJA: 11 gruposCS: 0.89
CHOCHO: 6 gruposCS: 0.89
FRÉJOL: 13 gruposCS: 0.86
HABA: 11 gruposCS: 0.89
VICIA: 8 grupos
CS: 0.92
mediana y abundante nodulación en raíz secundaria
crecimiento rápido productoras de ácido
morfología característica
Capacidad resistencia condiciones de estrés
CEPASDE
ARVEJAFRÉJOLHABAVICIA
CEPAS DE
CHOCHO
escasa nodulación en raíz primariamorfología característica
crecimiento rápidoproductoras de ácido
Gran capacidad resistencia condiciones de estrés
CEPA“C8B”
DECHOCHO
crecimiento lento
productora de alcalinidad
Baja capacidad adaptación condiciones de estrés
morfología característica
Rhizobium
Ochrobactrum
Bradyrhizobium
CONCLUSIONESCONCLUSIONESLas cepas de rizobios de fréjol, arveja, haba y vicia pertenecen al género Rhizobium.
Las cepas de rizobios de chocho pertenecen al género Ochrobactrum.
La cepa C8 B, del banco del INIAP, pertenece al género Bradyrhizobium.
Catorce cepas de rizobios fueron las más resistentes a condiciones de estrés y fuentes nutricionales.
Las pruebas bioquímicas sirven para esbozar la diversidad genética de los rizobios y su papel ecológico.
Existe una alta diversidad morfológica y bioquímica de los rizobios aislados de suelos de Imbabura.
El banco germoplásmico de rizobios servirá como una colección de referencia para futuras investigaciones.
RECOMENDACIONESRECOMENDACIONES
Caracterizar molecularmente las cepas.
Estudiar los suelos de las localidades donde se recolectaron los nódulos.
Evaluar a nivel de invernadero y campo la fijación de nitrógeno de las cepas.
RECOMENDACIONESRECOMENDACIONES
Desarrollar pruebas de biofertilización con rizobios más resistentes.
Recolectar nódulos en otras regiones del país.
Sincronizar la fecha de recolección con la época de floración.
AGRADECIMIENTOSAGRADECIMIENTOSA la ESPE, Departamento de Ciencias de la Vida, Facultad de Ingeniería en Biotecnología, por mi formación académica profesional.
Al INIAP, DMSA, por haberme permitido la ejecución e instrumentación para realizar este trabajo.
A la SENESCYT por haber financiado este proyecto.