UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE INGENIERIA...
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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA CARRERA DE INGENIERIA QUIMICA PROYECTO DE TITULACION PRESENTADO COMO REQUISITO PARA OPTAR POR EL TITULO DE INGENIERIA QUIMICA “OBTENCIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE Ag A PARTIR DEL ACEITE EXTRAÍDO DE LAS SEMILLAS DE ZANAHORIA (Daucus Carota) PARA POTENCIAR LA ACTIVIDAD FÚNGICA BACTERICIDA’’ AUTORES: RONQUILLO PILOZO RUTH ELIZABETH PAUCAR BANCHÓN CRISTHIAN JOHNNY TUTOR: ING. KATHERINE ZALAMEA CEDEÑO Mg. GUAYAQUIL, FEBRERO DEL 2019
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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA
CARRERA DE INGENIERIA QUIMICA
PROYECTO DE TITULACION PRESENTADO COMO REQUISITO PARA
OPTAR POR EL TITULO DE INGENIERIA QUIMICA
“OBTENCIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE Ag A PARTIR DEL ACEITE
EXTRAÍDO DE LAS SEMILLAS DE ZANAHORIA (Daucus Carota) PARA
POTENCIAR LA ACTIVIDAD FÚNGICA BACTERICIDA’’
AUTORES:
RONQUILLO PILOZO RUTH ELIZABETH
PAUCAR BANCHÓN CRISTHIAN JOHNNY
TUTOR:
ING. KATHERINE ZALAMEA CEDEÑO Mg.
GUAYAQUIL, FEBRERO DEL 2019
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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA
CARRERA DE INGENIERIA QUIMICA
PROYECTO DE TITULACION PRESENTADO COMO REQUISITO PARA
OPTAR POR EL TITULO DE INGENIERIA QUIMICA
“OBTENCIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE Ag A PARTIR DEL ACEITE
EXTRAÍDO DE LAS SEMILLAS DE ZANAHORIA (daucus carota) PARA
POTENCIAR LA ACTIVIDAD FÚNGICA BACTERICIDA’’
AUTORES:
RONQUILLO PILOZO RUTH ELIZABETH
PAUCAR BANCHÓN CRISTHIAN JOHNNY
TUTOR:
ING. KATHERINE ZALAMEA CEDEÑO Mg.
GUAYAQUIL, FEBRERO DEL 2019
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Certificado de porcentaje de similitud
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REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FICHA DE REGISTRO DE TESIS/TRABAJO DE GRADUACIÓN
TÍTULO Y SUBTÍTULO: OBTENCIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE Ag A PARTIR DEL ACEITE
EXTRAÍDO DE LAS SEMILLAS DE ZANAHORIA (Daucus Carota) PARA
POTENCIAR LA ACTIVIDAD FÚNGICA BACTERICIDA
AUTOR(ES) (apellidos/nombres): PAUCAR BANCHON CRISTHIAN JOHNNY
RONQUILLO PILOZO RUTH ELIZABETH
REVISOR(ES)/TUTOR(ES)
(apellidos/nombres):
ING. ZALAMEA CEDEÑO KATHERINE
ING. COLOMA COLOMA TONNY
INSTITUCIÓN: UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
UNIDAD/FACULTAD: INGENERIA QUIMICA
MAESTRÍA/ESPECIALIDAD:
GRADO OBTENIDO: INGENIEROS QUIMICOS
FECHA DE PUBLICACIÓN: No. DE PÁGINAS: 68
ÁREAS TEMÁTICAS:
PALABRAS CLAVES/ KEYWORDS: Síntesis verde, nanopartículas de plata, semillas de Daucus Carota, Terpenoides.
RESUMEN/ABSTRACT: En este proyecto de titulación se obtiene nanoparticulas de plata utilizando el extracto de las semillas de zanahoria (Daucus Carota), para el
desarrollo del tema se utilizó cuatro libras de las semillas de zanahoria (Daucus Carota) estas fueron secadas en un tiempo de nueve a catorce
horas con una temperatura de 55°C para luego disminuir su tamaño esto hace que tenga mejor contacto con el solvente permitiendo que haya un
buen rendimiento en la extracción, el resultado de la extracción tuvo un rendimiento del 13% , se realizó el análisis de perfil de ácidos grasos al
extracto evidenciando la presencia del ácido laurico con un 3.36%, ácido mirístico 0.45%, acido palmítico 4.94%, ácido oleico 76.88%, ácido
linoleico 14%, ácido linolénico 0.37%, para determinar la composición química del extracto se realizó el tamizaje fitoquímico obteniendo positivo
saponinas, negativo en Fehling, positivo en Cloruro Férrico (Compuestos fenólicos), positivo en Shinoda y en Dragendorff-Mayer positivo en
turbidez y positivo en precipitado, el último análisis realizado al extracto fue el de antioxidantes (DPPH) en esta técnica se utilizó tres diferentes
medidas en microlitros del extracto obteniendo en 35 μl un porcentaje de inhibición del 65%, en 50 μl un porcentaje de inhibición del 67% y en el
de 75 μl un porcentaje de inhibición del 79%. Se realizó la síntesis utilizando una sal metálica (nitrato de plata) con dos tipos de concentraciones
0.1 M y 1 M observando el oscurecimiento de la muestra, para la caracterización de las nanoparticulas se utilizó la técnica de espectroscopia
electrónica de barrido en la que se pudo evidenciar la presencia de nanoparticulas con magnificación hasta de x1000 en la solución preparada con
la concentración de 0.1 M, otra técnica utilizada fue la espectroscopia UV-Vis en la que se obtuvo como onda máxima 480 nm indicando la
presencia de nanoparticulas. Para poder determinar el poder ante la inhibición bacteriana se realizó pruebas con dos tipos de bacterias la E. Coli y
la S. aureus utilizando diferentes tipos de microlitros (5 μl - 10 μl) obteniendo mejor resultado con el de 5 μl el cual dio un mejor halo de inhibición
frente a la bacteria Gran negativa E. coli.
ADJUNTO PDF: X SI NO
CONTACTO CON AUTOR/ES: Teléfono:
0997669566 PAUCAR CRISTHIAN
0980607277 RONQUILLO RUTH
E-mail:
CONTACTO CON LA INSTITUCIÓN: Nombre: UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
Teléfono: (04) 228-7072, 228-7258, 222-8695, 228-4505
E-mail: [email protected]
UNIDAD DE TITULACIÓN
v
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA
UNIDAD DE TITULACIÓN
LICENCIA GRATUITA INTRANSFERIBLE Y NO EXCLUSIVA PARA EL
USO NO COMERCIAL DE LA OBRA CON FINES NO ACADÉMICOS
Yo, Paucar Banchón Cristhian Johnny y Ronquillo Pilozo Ruth Elizabeth con C.I. No. 0952286797
-0952407310, certifico que los contenidos desarrollados en este trabajo de titulación, cuyo título es
“OBTENCIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE Ag A PARTIR DEL ACEITE EXTRAÍDO DE LAS SEMILLAS
DE ZANAHORIA (Daucus Carota) PARA POTENCIAR LA ACTIVIDAD FÚNGICA BACTERICIDA’’
son de mi absoluta propiedad y responsabilidad Y SEGÚN EL Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE
LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN*,
autorizo el uso de una licencia gratuita intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la
presente obra con fines no académicos, en favor de la Universidad de Guayaquil, para que haga uso
del mismo, como fuera pertinente
PAUCAR BANCHON CRISTHIAN JOHNNY RONQUILLO PILOZO RUTH
ELIZABETH
NOMBRE Y APELLIDO DEL ESTUDIANTE NOMBRE Y APELLIDO DEL
ESTUDIANTE
C.I. No. 0952286797 C.I. No. 0952407310
*CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN (Registro Oficial n. 899 -
Dic./2016) Artículo 114.- De los titulares de derechos de obras creadas en las instituciones de educación superior y centros
educativos.- En el caso de las obras creadas en centros educativos, universidades, escuelas politécnicas, institutos superiores
técnicos, tecnológicos, pedagógicos, de artes y los conservatorios superiores, e institutos públicos de investigación como resultado
de su actividad académica o de investigación tales como trabajos de titulación, proyectos de investigación o innovación, artículos
académicos, u otros análogos, sin perjuicio de que pueda existir relación de dependencia, la titularidad de los derechos
patrimoniales corresponderá a los autores. Sin embargo, el establecimiento tendrá una licencia gratuita, intransferible y no
exclusiva para el uso no comercial de la obra con fines académicos.
1
AGRADECIMIENTO
A mi padre celestial por siempre estar con migo ayudándome en todo momento,
guiándome en mis decisiones y en todo el trayecto de mi preparación profesional. A mi
mamá por su amor, consejos y esfuerzos que hizo para que yo siguiera adelante. A mi
novio por su compañía y ayuda incondicional. También a los papas de mi novio que
siempre estuvieron presentes en todas las necesidades tanto económicas y moral. A mi
papa por sus consejos en la parte estudiantil.
A los docentes que intervinieron en mi trayecto estudiantil y en mi proyecto de
titulación en especial al docente Q.F. Luis Felipe Zalamea y al Ing. Wilfrido Terán, que
estuvieron prestos para ayudar con sus conocimientos.
A mi tutora Ing. Katherine Zalamea Cedeño Mg. que estuvo para ayudarme en los
inconvenientes presentados en el trayecto de la elaboración del proyecto de titulación.
RONQUILLO PILOZO RUTH ELIZABETH
2
AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo de titulación ha requerido de dedicación, esfuerzo y constancia para
poder finalizar esta meta que nos propusimos hace un tiempo atrás.
En primer lugar agradezco a Dios por fortalecerme con su espíritu, siendo el refugio de
mis acciones ya que con su bendición me ha dado vida para lograr este propósito y así
encontrarme con este maravilloso momento.
Agradezco a mi querido padre Johnny Paucar Paredes y mi dulce madre María Banchón
Viracocha seres muy importantes en mi vida, quienes siempre han estado dispuestos con
su bondad de ayuda en mis necesidades, sin su apoyo no hubiera sido posible lograr mi
objetivo.
A mis queridos hermanos que estuvieron pendientes en mis actividades durante el
desarrollo de mi trabajo, con su apoyo indispensable, sus consejos me ayudaron a
superar los tropiezos y dificultades que salpicaban en la vía de mi objetivo.
A mis amigos, que me ayudaron cuando las dudas se presentaban, a los profesores por
sus conocimientos impartidos en las aulas y a mi querida facultad el cual nuestro pasado
queda en ella.
A mi novia que me alentó a no bajar los brazos y me alienta a superar mis límites.
PAUCAR BANCHON CRISTHIAN JOHNNY
3
DEDICATORIA
Dedico especialmente este trabajo a mis padres por todo su esfuerzo y sacrificio, por ser
siempre los pilares de mi vida, por enseñarme que sin esfuerzo y constancia no se logra
nada, por haberme enseñado a trabajar y a soñar, a valerme por mí mismo y saber
enfrentar la vida, haberme aconsejado y ayudado a tomar las decisiones acertadas, por
eso y más. A mis hermanos, mi novia, familia y mis amigos.
PAUCAR BANCHON CRISTHIAN JOHNNY
4
Tabla de contenido
Tabla de contenido .................................................................................................................. 4
Índice de tablas ....................................................................................................................... 7
Índice de figuras ...................................................................................................................... 7
Índice de apéndice o anexos .................................................................................................... 9
Resumen ................................................................................................................................ 10
Abstract ................................................................................................................................. 11
Introducción .......................................................................................................................... 12
Capítulo 1 .............................................................................................................................. 13
1.1. Planteamiento del problema .......................................................................................... 13
1.2. Formulación y sistematización del problema ................................................................ 13
1.2.1. Formulación del problema .......................................................................................... 13
1.2.2. Sistematización del problema...................................................................................... 13
1.3. Justificación de la investigación ..................................................................................... 14
1.3.1 Justificación Teórica .................................................................................................... 14
1.3.2. Justificación Metodológica .......................................................................................... 15
1.3.3. Justificación Práctica .................................................................................................. 15
1.4. Objetivo de la investigación ........................................................................................... 14
1.4.1. Objetivo general .......................................................................................................... 14
1.4.2. Objetivos Específicos ................................................................................................... 14
1.5. Delimitación de la investigación ..................................................................................... 15
1.5.1. Delimitación Espacial .................................................................................................. 15
1.5.2. Delimitación Temporal ................................................................................................ 16
1.5.3. Delimitación del contenido .......................................................................................... 16
1.6. Hipótesis ......................................................................................................................... 16
1.7. Variables de la investigación .......................................................................................... 16
1.7.1. Variable dependiente ................................................................................................... 16
1.7.2. Variable independiente ............................................................................................... 16
1.8. Operacionalización de las variables ............................................................................... 17
Capítulo 2. Marco Referencial .............................................................................................. 18
2.1 Marco Teórico ................................................................................................................. 18
2.1.1. Antecedentes ................................................................................................................ 18
2.1.1.1. La nanotecnología y las Nanopartículas de plata .................................................... 18
5
2.1.1.2. Nanopartículas de plata y su poder bactericida ...................................................... 19
2.1.1.3. Métodos para obtener las nanopartículas de plata ................................................. 19
2.1.1.4 Síntesis de nanopartículas de plata utilizando la química verde .............................. 21
2.1.1. Metabolitos vegetales reductores de iones metálicos presentes en plantas y frutos ... 22
2.1.1.6. Mecanismo de reacción de nanopartículas de plata ................................................ 22
2.1.1.7. Aplicaciones de las nanopartículas de plata............................................................. 23
2.1.1.8. Caracterización de las Nanopartículas de plata ...................................................... 24
2.1.1.8.1 Espectrofotometría Ultravioleta –Visible............................................................... 24
2.1.1.8.2 Microscopia electrónica de Transmisión ............................................................... 25
2.1.1.8.3. Dispersión de luz Dinámica (DLS) ........................................................................ 26
2.1.1.9. Resistencia de los microorganismos ......................................................................... 26
2.2 Marco conceptual ............................................................................................................ 27
2.2.1. Características de la Zanahoria (Daucus Carota) ....................................................... 27
2.2.2 Aceite de las semillas de zanahoria .............................................................................. 27
2.2.3. Betacaroteno ................................................................................................................ 27
2.2.4. Carotol ......................................................................................................................... 28
2.2.5. Composición de ácidos grasos de las semillas de zanahoria ....................................... 28
2.2.6. Ácido Petroselénico ..................................................................................................... 28
2.2.7 Ácido Linoleico ............................................................................................................. 28
2.2.8 Acido Palmítico ............................................................................................................ 29
2.2.9 Acido Esteárico ............................................................................................................. 29
2.2.10 Acido Laurico ............................................................................................................. 29
2.2.11 Compuestos fenólicos ................................................................................................. 29
2.2.12. Tamizaje fitoquímico ................................................................................................. 30
2.2.13. Extracción de metabolitos secundarios ..................................................................... 30
CAPÍTULO III.................................................................................................................... 31
MARCO METODOLOGICO .............................................................................................. 31
3. 1 Tipo de Investigación ..................................................................................................... 31
3.2 Métodos científicos empleados en la investigación ......................................................... 31
3.2.1 Métodos teóricos ........................................................................................................... 31
3.2.2 Método experimental.................................................................................................... 31
3.3 PARTE EXPERIMENTAL ............................................................................................ 31
3.3.1 MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS: ............................................................. 31
3.4 EXPERIMENTACIÓN ................................................................................................... 34
3.4.1 Metodología para la elaboración del extracto de semillas de zanahorias (Daucus
carota) ................................................................................................................................... 34
6
3.5. Tamizaje fitoquímicos en el extracto de semillas de zanahoria .................................... 35
3.5.1 Ensayo de Espumas ...................................................................................................... 36
3.5.2 Ensayo de Fehling......................................................................................................... 36
3.5.3 Ensayo de Cloruro férrico ............................................................................................ 36
3.5.4 Ensayo de Resinas ........................................................................................................ 37
3.5.5 Ensayo de Dragendorff- Mayer ................................................................................... 37
3.5.6 Ensayo de Shinoda ....................................................................................................... 37
3.6 Metodología para la síntesis de nanopartículas de plata ................................................ 37
3.7 Caracterización de nanopartículas de plata. .................................................................. 38
3.8 Ensayo y determinación de la actividad antioxidante del extracto vegetal y las
nanopartículas de plata por el método DPPH. ..................................................................... 39
3.9 Análisis por la técnica de HPLC (Cromatografía liquida de alta eficacia).................... 41
3.10 Inhibición de microorganismos. .................................................................................... 41
CAPÍTULO IV ...................................................................................................................... 42
RESULTADOS ..................................................................................................................... 42
4.1 Acondicionamiento de la materia prima ........................................................................ 42
4.1.2 Rendimiento obtenido en el extracto de semillas de zanahoria ................................... 44
4.2 Tamizaje – fitoquímico .............................................................................................. 45
4.3. HPLC .............................................................................................................................. 47
4.4. Determinación de la actividad antioxidante por decoloración del radical 1-1-Difenil-2-
Picrilhidrazilo (DPPH) .......................................................................................................... 48
4.5 Porcentaje de inhibición de la muestra de semillas de zanahoria @ 75 μl de DPPH .... 51
4.6. Caracterización de las nanopartículas de plata ............................................................. 53
4.7. Espectroscopia UV-Vis ................................................................................................... 53
4.8 Microscopía electrónica de barrido (SEM) .................................................................... 54
4.9. Determinación de la actividad microbiana .................................................................... 55
Conclusiones .......................................................................................................................... 58
Recomendaciones .................................................................................................................. 59
Referencias ............................................................................................................................ 60
Anexo 2 .................................................................................................................................. 63
7
Índice de tablas Tabla 1. Operación de variables……………………………………………………… 21
Tabla 2. Materiales…………………………………………………………………… 36
Tabla 3. Equipos…………………………………………………………………….... 37
Tabla 4. Parámetros en la extracción del aceite……………………………………… 39
Tabla 5. Curva estándar de calibración del espectrofotómetro………………………. 44
Tabla 6.- Resultado de pérdida de humedad contenido en las semillas de zanahoria
(daucus carota)………………………………………………………………………... 47
Tabla 7. Parámetros para la obtención de aceite de semillas de zanahoria…………... 48
Tabla 8. Resultados del tamizaje fitoquímico en el extracto de las semillas de zanahoria
(Daucus carota)……………………………………………………………………….. 49
Tabla 9. Análisis por espectroscopia UV-Vis de las nanopartículas sintetizadas……. 52
Tabla 10. Compuestos obtenidos por la cromatografía………………………………. 53
Tabla 11. Muestra de semillas @ 35 μl de DPPH……………………………………. 56
Tabla 12. Muestra de semillas @ 50 μl de DPPH……………………………………. 57
Tabla 13. Muestra de semillas @ 75 μl de DPPH…………………………………… 56
Tabla 14. Lectura de halo de inhibición de las sustancias presentes en cada
microorganismo……………………………………………………………………… 59
Índice de figuras Figura 1. Técnica de Botton-Up…………………………………………………… 23
Figura 2. Técnica top-down……………………………………………………….. 24
Figura 3. Proceso de síntesis verde de nanopartículas de plata……………………. 25
Figura 4. Estructura general de un espectrofotómetro UV-Vis……………………. 28
Figura 5. Relación forma-tamaño de las nanoparticulas de plata en base a la resonancia
de plasmones superficiales…………………………………………………………. 29
Figura 6. Comparación de formación de la imagen en un microscopio óptico, TEM,
SEM, CRT……………………………………….…………………………………. 30
Figura 7. Determinación de partículas mediante la técnica de dispersión de luz
dinámica…………………………………………………………………………….. 31
Figura 8. Estructura del 𝛽-Caroteno……………………………………………….... 32
Figura 9. Tratamiento de las semillas de zanahoria…………………………………. 38
Figura 10. Equipos para la preparación del extracto………………………………… 39
Figura 11. Síntesis de nanopartículas………………………………………………… 42
8
Figura 12. Ensayo y determinación de DPPH………………………………….……. 43
Figura 13. Ensayo DPPH…………………………………………………………….. 44
Figura 14.- Ensayo de inhibición bacteriana…………………………………………. 45
Figura 15. Extracción de los componentes de las semillas de zanahoria………..….... 48
Figura 16. Tamizaje fitoquímico saponinas………………………………………….. 49
Figura 17. Ensayo de Fehling………………………………………………………... 50
Figura 18. Compuestos fenólicos presentes en la muestra…………………………… 50
Figura 19. Flavonoides presentes en el extracto……………………………………... 50
Figura 20. Precipitado presente en la muestra……………………………………….. 51
Figura 21. Análisis de tamizaje fitoquímico…………………………………………. 51
Figura 22. Análisis de espectroscopia UV-Vis………………………………………. 58
Figura 23. Microscopia Electrónica de barrido con magnificación de x1000…….…. 58
Figura 24. Ensayos microbiológicos…………………………………………………. 60
Figura. 25 Ensayos fúngicos (Aspergillus)......................…………………………… 57
Figura. 26 Ensayos fúngicos (Aspergillus) después de una semana de reacción.....… 57
Figura. 27 Resultado del análisis de perfil de ácido graso…………………………… 63
Figura. 28 Imágenes del SEM realizadas a la solución de concentración 0.1M……... 65
Figura. 29 Imágenes del SEM realizadas a la solución de concentración 1 M...…….. 66
Índice de grafica
Grafica 1. Curva de secado de las semillas de zanahoria (Daucus carota)………….. 47
Grafica 2. Curva de la actividad antioxidante @ 35 𝜇l…………………………….. 55
Grafica 3. Curva de la actividad antioxidante @ 50 μl…………………………….. 56
Grafica 4. Curva de la actividad antioxidante @ 75 μl……………………………... 57
Grafica 5. Se encuentra un resumen del porcentaje de inhibición para cada ensayo del
extracto de semilla de zanahoria…………………………………………………… 58
Grafica 6. Determinación microbiana de sustancias en E. coli……………………. 59
Grafica 7. Determinación microbiana de sustancias en S. aureus…………………. 60
9
Índice de apéndice o anexos
AgNPs Nanoparticulas de plata.
DPPH radical 2,2- difenil-1-picril hidrazilo hidratado.
HEX Hexano.
SEM Microscopia electrónica de barrido.
TEM Microscopia electrónica de transmisión.
HPLC Cromatografía liquida de alta resolución.
ABS Absorbancia.
Tram Tramitancia.
Conc Concentración.
UV-vis Ultravioleta visible.
DLS Dispersión dinámica de luz
MeOH Metanol.
%H Porcentaje humedad
10
Resumen
En este proyecto de titulación se obtiene nanoparticulas de plata utilizando el extracto
de las semillas de zanahoria (Daucus Carota), para el desarrollo del tema se utilizó
cuatro libras de las semillas de zanahoria (Daucus Carota) estas fueron secadas en un
tiempo de nueve a catorce horas con una temperatura de 55°C para luego disminuir su
tamaño esto hace que tenga mejor contacto con el solvente permitiendo que haya un
buen rendimiento en la extracción, el resultado de la extracción tuvo un rendimiento del
13% , se realizó el análisis de perfil de ácidos grasos al extracto evidenciando la
presencia del ácido laurico con un 3.36%, ácido mirístico 0.45%, acido palmítico
4.94%, ácido oleico 76.88%, ácido linoleico 14%, ácido linolénico 0.37%, para
determinar la composición química del extracto se realizó el tamizaje fitoquímico
obteniendo positivo saponinas, negativo en Fehling, positivo en Cloruro Férrico
(Compuestos fenólicos), positivo en Shinoda y en Dragendorff-Mayer positivo en
turbidez y positivo en precipitado, el último análisis realizado al extracto fue el de
antioxidantes (DPPH) en esta técnica se utilizó tres diferentes medidas en microlitros
del extracto obteniendo en 35 μl un porcentaje de inhibición del 65%, en 50 μl un
porcentaje de inhibición del 67% y en el de 75 μl un porcentaje de inhibición del 79%.
Se realizó la síntesis utilizando una sal metálica (nitrato de plata) con dos tipos de
concentraciones 0.1 M y 1 M observando el oscurecimiento de la muestra, para la
caracterización de las nanoparticulas se utilizó la técnica de espectroscopia electrónica
de barrido en la que se pudo evidenciar la presencia de nanoparticulas con
magnificación hasta de x1000 en la solución preparada con la concentración de 0.1 M,
otra técnica utilizada fue la espectroscopia UV-Vis en la que se obtuvo como onda
máxima 480 nm indicando la presencia de nanoparticulas. Para poder determinar el
poder ante la inhibición bacteriana se realizó pruebas con dos tipos de bacterias la E.
Coli y la S. aureus utilizando diferentes tipos de microlitros (5 𝜇l - 10 𝜇l) obteniendo
mejor resultado con el de 5 𝜇l el cual dio un mejor halo de inhibición frente a la bacteria
Gran negativa E. coli.
Palabras clave
Síntesis verde, nanopartículas de plata, semillas de Daucus Carota, Terpenoides,
11
Abstract
In this titration project silver nanoparticles are obtained using the extract of the carrot
seeds (Daucus Carota), for the development of the subject four pounds of the carrot
seeds (Daucus Carota) were used, these were dried in a time of nine to fourteen hours
with a temperature of 55 ° C to then decrease its size this makes it have better contact
with the solvent allowing a good performance in the extraction, the result of the
extraction had a yield of 13%, the analysis of fatty acid profile to the extract evidencing
the presence of 3.36% lauric acid, 0.45% myristic acid, 4.94% palmitic acid, 76.88%
oleic acid, 14% linoleic acid, 0.37% linolenic acid, to determine the chemical
composition of the extract. performed the phytochemical screening obtaining positive
saponins, negative in Fehling, positive in Ferric Chloride (Phenolic compounds),
positive in Shinoda and in Dragendo rff-Mayer positive in turbidity and positive in
precipitate, the last analysis made to the extract was that of antioxidants (DPPH) in this
technique three different measurements were used in microliters of the extract obtaining
in 35 μl a percentage of inhibition of 65%, in 50 μl a percentage of inhibition of 67%
and in the 75 μl a percentage of inhibition of 79%. The synthesis was carried out using a
metal salt (silver nitrate) with two types of concentrations 0.1 M and 1 M, observing the
darkening of the sample. For the characterization of the nanoparticles, the scanning
electron spectroscopy technique and the UV-spectroscopy were used. Vis giving as a
maximum wave 480 nm indicating the presence of nanoparticles. In order to determine
the power before bacterial inhibition, tests were carried out with two types of bacteria,
E. coli and S. aureus, using different types of microlitres (5 μl - 10 μl) obtaining better
results with the 5 μl which gave a better halo of inhibition against E. coli bacteria.
Keywords
Green synthesis, silver nanoparticles, Daucus Carota seeds, Terpenoids,
12
Introducción La nanotecnología y la nanociencia son ramas bastante prometedoras para el futuro, por
medio de ellas se pretende mejorar la calidad de vida hasta solucionar problemas
relacionados con la salud.
La plata desde la antigüedad era conocida por sus propiedades bactericidas, fue también
utilizada para evitar contagios de enfermedades sin saber cuál era el mecanismo de
acción contra estos microorganismos.
Las nanopartículas de plata poseen un gran potencial como agente bactericida, fungicida
y como cicatrizante. (Vergara, 2017)
Como la ciencia avanza y realiza estudios investigativos han descubierto que los iones
de plata tienen potentes agentes antimicrobianos capaces de acabar con las bacterias,
hongos, virus y protozoos. Pero se busca la manera de potenciar esta acción hasta llegar
a inhibir microorganismos.
La reacción que tiene los iones de plata con las bacterias es que reaccionan con las
enzimas que se encuentran dentro interfiriendo como una forma de bloqueo haciendo
que pierdan la funcionalidad. [1]
En investigaciones desarrolladas para mejorar el funcionamiento de la plata han
buscado varias maneras de sintetizarla con compuestos químicos y orgánicos.
Llevándolas a una escala de nanopartículas.
Para analizar el avance de las nanopartículas sintetizadas con compuestos orgánicos se
utiliza diferentes equipos y técnicas que ayudan a determinar su forma y tamaño. Tales
como la espectroscopia ultravioleta visible y el método de TEM.
Las nanopartículas tienen amplias aplicaciones como en el área textil, tratamientos de
agua, en la medicina entre otras, haciendo de su existencia la mejor opción bactericida.
La síntesis que está resaltando más es la que se realiza con compuestos de plantas,
pueden ser frutos, hojas, raíz o semillas. Al utilizar los componentes orgánicos se busca
que logren la estabilización de las nanopartículas para de esta manera lograr que su
eficiencia sea buena. Los componentes del extracto de las semillas de zanahoria
contienen propiedades antioxidantes que lograran reducir y estabilizar las
nanopartículas para su mayor eficiencia.
13
Capítulo 1
1.1. Planteamiento del problema
En la actualidad se investigan varias formas y métodos que ayuden a inhibir la
reproducción bacteriana. Las bacterias están presentes en todas partes lo que conlleva a
que el método que se busque sea potente y no contaminante.
En la investigación realizada en el presente proyecto se toma en cuenta los nuevos
estudios realizados a las nanopartículas de plata en general como un potente inhibidor
de las bacterias con grandes resultados, esta es la razón por la que se toma este método.
Para que el proceso o el producto final en la obtención de nanopartículas de plata no
sean contaminantes para el medio, se pretende utilizar un compuesto orgánico el cual
actué como agente reductor y estabilizante de las nanopartículas, y de esta manera se
pueda obtener los mismos resultados o mejores en comparación con las nanopartículas
que son sintetizadas bajo compuestos químicos.
Para llevar a cabo este proceso se escoge las propiedades de las semillas de zanahoria el
cual es un componente orgánico que entre sus compuesto tiene al ácido láurico el cual
tiene propiedades antimicrobianas y antivirales según investigaciones realizadas. [2]
1.2. Formulación y sistematización del problema
1.2.1. Formulación del problema
¿Se logrará potenciar la actividad fúngica bactericida de las nanopartículas mediante la
síntesis de componentes orgánicos obtenidos de las semillas de Daucus carota como
agente reductor y estabilizador?
1.2.2. Sistematización del problema La elaboración de nanopartículas de plata vía síntesis de componentes orgánicos de
Daucus carota presentan algunas interrogantes.
¿Qué variables de operación son las más importantes en la producción de AgNPs?
¿Qué cantidad extracto de las semillas de zanahoria tendrá mejor resultado para la
síntesis en la producción de nanopartículas?
¿Potenciara la actividad fúngica bacteriana las nanopartículas de plata obtenidas de la
síntesis del compuesto orgánico?
14
1.3. Objetivo de la investigación
1.3.1. Objetivo general
Elaborar nanopartículas de plata vía síntesis biológica a partir de componentes
orgánicos como agentes reductores obtenidos de la Daucus carota para potenciar la
actividad fúngica bactericida.
1.3.2. Objetivos Específicos
Obtener las semillas deshidratadas de Daucus Carota para la extracción del
aceite que contiene los compuestos reductores y estabilizadores.
Analizar las características químicas mediante el análisis fito-quimico y su
composición mediante la técnica HPLC.
Realizar la síntesis de las nanopartículas de plata utilizando el extracto de las
semillas de la Daucus carota.
Caracterizar las nanopartículas de plata mediante espectroscopia UV-VIS.
Determinar la actividad fúngica bacteriana de las nanopartículas de plata
obtenidas.
1.4. Justificación de la investigación
1.4.1 Justificación Teórica
El aumento y la resistencia de microorganismos en diversas áreas han llevado a que se
realicen nuevas investigaciones, las cuales puedan combatir los microorganismos, y
que se pueda aplicar en diversas áreas como la industria médica, farmacéutica,
cosmética, textiles y también en el tratamiento de agua.
La zanahoria Daucus carota tiene grandes beneficios entre sus componentes uno de
ellos es el ácido laurico el cual es antimicrobiano y antiviral según investigaciones
realizadas. [2]
Diferentes investigaciones han demostrado que las nanopartículas de plata tienen
propiedades biomédicas ya que teniendo bajos niveles de plata se logra prevenir el
crecimiento bacteriano. [3]
15
Esta investigación aporta una nueva base para la obtención de las nanopartículas
utilizando componentes orgánicos que ayuden en su obtención y así potenciar de una
manera no contaminante el efecto que tengan las nanopartículas para la inhibición de las
bacterias.
1.4.2. Justificación Metodológica
El desarrollo de este trabajo se basa en un estudio de investigación exploratoria
experimental, el cual se piensa desarrollar bajo un método de extracción de
nanopartículas utilizando los componentes de las semillas de la Daucus Carota, el cual
sintetizara a las nanopartículas del nitrato de plata y de esta manera lograr potenciar su
actividad bactericida.
Para determinar los componentes orgánicos que contiene el extracto de estas semillas se
pretende realizar un análisis de cromatografía liquida de alta resolución HPLC, para
determinar la eficacia del método a desarrollar se realizara un barrido mediante la
espectroscopia UV-VIS.
1.4.3. Justificación Práctica
El siguiente proyecto se basa por medio de los resultados de un espectroscopio UV-VIS
el cual ayudara en la caracterización de las nanopartículas y por diferentes ensayos en
las que las nanopartículas se las pondrán en contacto con dos tipos (E. coli, S. aureus)
de bacterias las cuales son consideradas entre las más resistentes a diferentes tipos de
métodos para su inhibición y de esta manera comprobar su resultado bactericida.
1.5. Delimitación de la investigación
El propósito del desarrollo de este tema es obtener inhibidores bacterianos utilizando
nanopartículas de plata sintetizada con un extracto orgánico para potenciar su capacidad
bactericida de esta manera poder aplicarlo en diversas áreas.
1.5.1. Delimitación Espacial
El siguiente proyecto se realizó en el laboratorio de microbiología en la facultad de
Ingeniería Química de universidad de Guayaquil, en la ciudad de Guayaquil.
16
1.5.2. Delimitación Temporal
El siguiente proyecto se pretendió realizarlo en el lapso de seis meses es el tiempo
aproximado y estimado que llevó el desarrollo y culminación del trabajo investigativo.
1.5.3. Delimitación del contenido
En el proyecto se pretendió realizar el mecanismo de reducción de los iones de plata
utilizando los componentes de la Daucus carota los cuales tienen propiedades
reductoras, estos métodos serian la síntesis de nanopartículas o el método de ‘GREEN’.
Los métodos antes mencionados se fundamentan por estudios los cuales sus fuentes de
consulta fueron los repositorios de la Universidad de Guayaquil, también tomando
información de internet.
Campo: Ingeniería Química
Área: Ingeniería de materiales
Aspecto: Elaboración, implementación en catálisis Bacteriana de E. Coli y S. áureas.
1.6. Hipótesis
La investigación experimental que se desea desarrollar se pretende obtener un producto
que contenga nanopartículas de plata el cual sea potencial para inhibir bacterias de todo
tipo utilizando los componentes del extracto de las semillas de la Daucus Carota el cual
complementa la síntesis de las nanopartículas.
1.7. Variables de la investigación
1.7.1. Variable dependiente
Elaboración de nanopartículas de plata mediante la síntesis con nitrato de plata y el
extracto de las semillas de la Daucus Carota.
1.7.2. Variable independiente
Características principales de las nanopartículas como la forma, el tamaño y la longitud
de onda absorbida por la resonancia plasmónica de la superficie de las nanopartículas,
capacidad de inhibición microbiana determinada por el tamaño del halo en el cultivo
bacteriano.
17
1.8. Operacionalización de las variables
Tipo de
Variable
Variable Definición Indicador
Tiempo de secado Tiempo de ingreso en la estufa
para eliminar humedad Horas
Tiempo de triturado Tiempo en el que se reduce el
tamaño en la licuadora Minutos
Humedad Cantidad de agua que tiene las
semillas antes de ser trituradas %
Concentración
Solución de nitrato de plata para
la síntesis de nanopartículas m
Volumen del
extracto Cantidad de extracto utilizado
Tiempo de reacción
de síntesis
Tiempo en el cual se le da la
reacción para síntesis de NP Días
Tamaño y forma
Distribución de tamaño de
AgNPs nm
Longitud de onda Resonancia plasmón de
superficie nm
Volumen de AgNPs
coloidales
Cantidades de solución con
AgNPs que absorben los discos de
antibiograma
ul
Diámetro de los
discos de
antibiograma
Tamaño de los discos que
absorberán a la solución de NP mm
Concentración de
microorganismos
Cantidad de E. coli, S. aureus que
se utilizaran por cultivo en caja
Petri
Ul/g
Tamaño del halo de
inhibición
Área de inhibición de las AgNPs
contra los microorganismos
citados en la parte anterior
mm
Tabla 1. Operación de Variables
Fuente: (Paucar, Cristhian & Ronquillo, Ruth, 2019)
Eta
pa
1 (
Pre
par
ació
n d
el
Extr
acto
)
Ind
epen
die
nte
D
epen
die
nte
Eta
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2 (
Sín
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s)
Indep
end
iente
D
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die
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Eta
pa 3
(A
ctiv
idad
anti
mic
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iana)
Indep
end
iente
D
epen
die
nte
18
Capítulo 2. Marco Referencial
2.1 Marco Teórico
2.1.1. Antecedentes
2.1.1.1. La nanotecnología y las Nanopartículas de plata La nanotecnología es una puerta muy importante para obtener nuevos materiales unos
de estos son los materiales con propiedades bactericidas los cuales ayuden a prevenir
enfermedades causadas por diferentes tipos de bacterias hasta las que puedan ser
resistentes a los antibióticos.
La nanotecnología es conocida también como fabricación molecular este término se le
otorga por que se desarrollan métodos u objetos a escala nanométricas. Aplicando
nuevas investigaciones desarrolladas en escala nanométricas prometen ser buenas
soluciones y más eficientes sin perjudicar al medio ambiente, entre ellas esta las
aplicaciones médicas, modificación de materiales y también como tratamientos de agua.
La nanotecnología se describe por sus propiedades físicas y químicas de la materia que
cambian a escalas nanométricas entre estas están la conductividad eléctrica, el calor, la
resistencia, la elasticidad y la reactividad que aumentan si son producidas a mayor
escala. [4]
El estudio de los de los nanomateriales bactericidas resulta ser oportuno tomando en
cuenta el aumento de cepas de bacterias potentes. Las nanopartículas metálicas están
entre unas de las más prometedoras que tienen propiedades bactericidas debido a su
mayor actividad química en su relación de superficie a volumen y la estructura de
superficie cristalográfica, los tamaños de estas nanopartículas están al entre 1 a 100
nanómetros. [5]
Las nanopartículas se caracterizan por tener una buena proporción con la relación de
superficie volumen, la clasificación de las nanopartículas también dependen su
dimensión entre ellas están las carbonosas, metálicas, cerámicas, hibridas, coloidales y
poliméricas, las propiedades que tienen las nanopartículas está dada por su superficie y
el tamaño molecular. [6]
Dependiendo de las características que tenga el medio de contacto y la composición, las
nanopartículas reaccionan con el medio externo formando variedades de compuestos y
especies químicas de plata y de esta manera liberando el ion plata. [7]
19
2.1.1.2. Nanopartículas de plata y su poder bactericida La acción de las nanopartículas de plata como bactericida es debido a que cuando la
plata se encuentra en tamaños nanométricos las propiedades bactericidas aumentan
considerablemente emergiendo interesantes propiedades ópticas, electrónicas,
magnéticas y químicas, estas propiedades hacen que las nanopartículas tengan una gran
aplicación en las áreas tecnológicas. [6]
La manera en que trabaja las nanopartículas en las bacterias para su inhibición es que se
anclan en la pared celular de las bacterias para luego penetrarlas y causar cambios en la
estructura de la membrana celular, esto conlleva a cambiar la permeabilidad de la
bacteria lo cual promueve la muerte del organismo. [6]
2.1.1.3. Métodos para obtener las nanopartículas de plata Para la obtención de nanopartículas de plata se pueden llevar a cabo mediante dos
técnicas como la ‘bottom-up’ y ‘top-down’.
La técnica del bottom-up se basa en producir nanomateriales a partir del nivel atómico.
Es decir se comienza con una estructura nanométricas como la molécula y luego de
pasar un proceso se crea un mecanismo mayor que con el que se comenzó. [8]
Figura 1. Técnica de Bottom-Up
Fuente: [9]
20
En cambio la técnica del Top-down es la reducción de tamaño, el mecanismo y las
estructuras se miniaturizan a escalas manométricas. [8]
Figura 2. Técnica Top-down
Fuente: desconocida
En la actualidad el más utilizado para la obtención de nanopartículas es el Top-down.
Para aplicar esta técnica se utilizan varios métodos, uno de estos métodos que se está
utilizando y estudiando con mayor énfasis es el de la química verde, que consisten en la
síntesis utilizando compuestos vegetales, esta se basa en hacer reaccionar un compuesto
metálico con un orgánico. Otros métodos que también se utilizan para la obtención de
las nanopartículas de plata están la síntesis fitoquímico, ablación laser, síntesis por
microemulsión, síntesis asistida por microondas, la síntesis sonoquímica, la
electrosíntesis, la síntesis radiolítica gamma y los métodos de precipitación comunes.
[6]
21
2.1.1.4 Síntesis de nanopartículas de plata utilizando la química verde Para la síntesis de nanopartículas existen diferentes métodos los cuales pueden ser
dañinos y perjudiciales para el medioambiente o pueden significar un elevado costo de
fabricación ya que se requiere un alto consumo de reactivos químicos. Para poder
solucionar esta parte se implementa el uso de compuestos orgánicos o también llamado
biosíntesis, esto surge como una alternativa a los métodos clásicos de síntesis ya
existentes.La síntesis de nanopartículas de plata mediante química verde o también
conocida como biosíntesis de nanopartículas se basa en la implementación de extractos
de plantas los cuales contienen poder antioxidante como los polifenoles, azucares
reducidos, bases nitrogenadas y aminoácidos que actúen como agentes reductores
pudiendo reducir cationes en una disolución de sal metálica, esto se lo utiliza en lugar
de reductores químicos como es el borohidruro sódico. Unas de las ventajas más
destacadas de usar la síntesis de nanopartículas mediante química verde es que se puede
controlar el tamaño de las nanopartículas solo variando la concentración del extracto
vegetal sin que haya necesidad de usar agentes surfactantes o estabilizantes. El
mecanismo de formación que se emplea en disoluciones coloidales a partir de la
reducción de iones plata se dividen en dos etapas que son la nucleación y crecimiento.
[10]
Figura 3. Proceso de síntesis verde de nanopartículas de plata
Fuente: [11]
22
2.1.1. Metabolitos vegetales reductores de iones metálicos presentes en
plantas y frutos Las plantas poseen diferentes propiedades entre sus raíces, tallos, flores y frutos los
cuales le atribuyen características importantes, los metabolitos presentes en las plantas
incluyen a los terpenoides, polifenoles, azucares, alcaloides, ácidos fenólicos y
proteínas, todos estos tienen una función importante en la bioreducción de iones
metálicos produciendo nanoparticulas.
Terpenoides: Son metabolitos secundarios que constituyen la mayor parte del aceite
esencial producido por las plantas, pertenecen a una clase de polímeros orgánicos
diversos que muestran una fuerte actividad antioxidante, los terpenoides desempeñan un
papel importante en la reducción activa de los iones metálicos del AgNO3 seguida de la
formación de nanoparticulas. [12]
Polifenoles: Son micronutrientes con actividad oxidante presentes en los vegetales.
Azucares reductores: Poseen su grupo carbonilo intacto, los que principalmente se
acoplan a estas características son los monosacáridos ya que contienen al menos un –
OH hemiacetálico libre, entre estos monosacáridos están: Las Diosas, Triosas, Tetrosas,
pentosas, Hexosas Bases Nitrogenadas.
Antioxidantes: Los antioxidantes se los puede dividir en tres grupos principales:
Carotenoides, Alil sulfuro y polifenoles (Compuestos Fenólicos)
2.1.1.6. Mecanismo de reacción de nanopartículas de plata
Referente al mecanismo de reacción se realiza en el orden siguiente: primero se disocia
el AgNO3 en los respectivos iones, y luego el catión Ag+ reaccionan con el agente
reductor en este caso el carotol (Terpenoides) haciendo que pase Ag0
C15 H26 O + Ag+ NO3- Ag0 NPs + Subproductos
23
Figura 4. Síntesis de reacción carotol y nitrato de plata
Fuente: (Paucar Cristhian & Ronquillo Ruth 2019)
2.1.1.7. Aplicaciones de las nanopartículas de plata
Una de las varias aplicaciones de las nanopartículas de plata que se considera como
principal es la actividad bactericida y antimicrobiana, el uso de las nanopartículas se
vuelve cada vez más fuete ya que por su tamaño se vuelve adherible, en el área
medicinal existen apósitos para heridas, dispositivos anticonceptivos, instrumental
quirúrgico y prótesis ósea, todo esto contiene en su recubrimiento nanopartículas que
evitan el crecimiento bacteriano. También la podemos encontrar en la parte de las
industrias textiles en la fabricación de prendas de vestir, en fibras sintéticas o naturales
estas consiguen una potenciación de la actividad iónica gracias a la gran cantidad de
iones de plata los cuales son liberados. Estas también se las utiliza en la parte de la
agricultura para prolongar la conservación de frutos ya que aparte de su poder
antibacteriano tiene propiedades fúngicas las cuales retardan el crecimiento de hongos y
si se las usa en los recubrimientos biodegradables se obtiene buenos resultados en la
degradación de los frutos. [10]
24
2.1.1.8. Caracterización de las Nanopartículas de plata Para la caracterización de las nanopartículas de plata se tienen diferentes métodos:
Espectroscopia ultravioleta visible UV-VIS
Espectroscopia de infrarrojos FT-IR
Microscopia de barrido electrónico SEM
Dispersión de luz dinámica DLS
A continuación se detallan las más utilizadas:
2.1.1.8.1 Espectrofotometría Ultravioleta –Visible Esta técnica se basa en la emisión de fotones en la que se utiliza la radiación
electromagnética: visible ultravioleta e infrarroja del espectro electromagnético. [10]
La siguiente técnica ayuda en la determinación de la concentración de un compuesto
que se encuentra en estado de solución, se basa en la absorción UV-visible por ciertas
moléculas la radiación absorbida causa transiciones electrónicas a longitudes de onda
característica de la parte molecular del compuesto que se encuentra en solución. Este es
un instrumento óptico que puede resolver radiaciones de diferentes longitudes de onda
que están dentro del rango ultravioleta y visible estos rangos están en un valor
aproximado de 190-1.110nm [13]
Figura. 4 Estructura general de un espectrofotómetro UV-VIS
Fuente: [14]
La técnica de espectrofotometría UV-VIS ayuda a identificar algunos grupos
funcionales de moléculas hasta incluso ayuda en la determinación del contenido de
fuerza de una sustancia. Esto se basa a un fundamento el cual se debe a la capacidad de
las de las moléculas para absorber y emitir radiaciones, las longitudes de ondas de las
radiaciones que una molécula puede absorber y su eficiencia con la que absorba
depende de algunos parámetros como la estructura atómica, el pH, temperatura, Fuerza
25
Iónica, constante dieléctrica, y otras condiciones más las cuales convierten en una
técnica importante para la determinación y caracterización de biomoléculas. [10]
Figura 5. Relación forma-tamaño de las nanoparticulas de plata en base a la resonancia
de plasmones superficiales.
Fuente: [15]
2.1.1.8.2 Microscopia electrónica de Transmisión Esta técnica permite la caracterización de las nanopartículas tanto como el tamaño y
forma es la única capaz de producir imágenes de alta resolución, la muestra que se
analiza mediante este método interactúa la parte del electrón-materia. Se basa en la
observación de características de especímenes muy pequeños. La manera que trabaja
esta técnica es que utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz lo que permite
la proyección de la imagen ayudando a observar objetos mediante la ampliación de
hasta 200.00 veces más. La técnica sirve de mucho para observar partículas en un
aumento y en una resolución más alta en comparación con lo que se pueda ver en
microscopia convencional, esta lectura se basa en explorar la superficie de la imagen
punto por punto donde cada punto leído es un pixel en el monitor de la computadora, la
longitud de onda de un electrón es mucho más corta que la del fotón. [16]
26
Figura. 6 Comparación de formación de la imagen en un microscopio óptico, TEM,
SEM, CRT
Fuente: [17]
2.1.1.8.3. Dispersión de luz Dinámica (DLS)
Esta es una técnica físico-química que permite medir en partículas y moléculas el
tamaño y su distribución, esta técnica puede ser aplicada para medir el tamaño de
moléculas y de partículas en una región submicrométrica inferiores a 1 nm. Esta técnica
es más utilizada para la caracterización de partículas, emulsiones también en moléculas
que se encuentren diluidas en un líquido. Lo que permite la medición de las partículas o
moléculas es el movimiento browniano que hace que la luz láser se disperse en diversas
intensidades al analizar las fluctuaciones de intensidad se puede obtener la velocidad del
movimiento Browniano. Detalladamente la luz láser al alcanzar las partículas se
dispersa en todas las direcciones que estén posibles. [18]
Figura.7 Determinación de partículas mediante la técnica de dispersión de luz dinámica.
Fuente [19]
2.1.1.9. Resistencia de los microorganismos Una problemática presentada en la actualidad es la resistencia que tienen los
microorganismos a los antibióticos esto hace que cada vez se busque antibióticos más
potentes y esto ocasiona un incremento en los precios de estos medicamentos, la
probabilidad de mortalidad por parte de microorganismos se vuelve bastante serio y
peligroso. [20]
27
2.2 Marco conceptual
2.2.1. Características de la Zanahoria (Daucus Carota)
La zanahoria es una hortaliza que se consume con regularidad a nivel mundial, esta
hortaliza tiene entre sus componentes varios compuestos que pueden aportar de manera
favorable como antioxidantes. Por esta razón se han realizado varias investigaciones
científicas acerca de sus propiedades y beneficios. [21]
2.2.2 Aceite de las semillas de zanahoria
Las semillas de zanahoria contienen componentes que actúan en el organismo de
diversas maneras como betacaroteno el cual actúa como un compuesto antioxidante.
Según publicaciones realizadas por el Dr. Mercola dice que el aceite extraído de las
semillas de zanahoria contiene varios compuestos beneficiosos tales como el potasio,
Vitamina B6, cobre, ácido fólico, tiamina y magnesio. [22]
2.2.3. Betacaroteno Los betacarotenos que contiene la zanahoria actúan y se desarrollan como antioxidante
ayudando a combatir la acción de los radicales libres frente a los organismos vivos.
Estos radicales libres son moléculas que actúan de manera desfavorable en las células
de esta manera provocan el deterioro de las mismas por ende abre paso al
envejecimiento, los antioxidantes contenidos en la zanahoria combaten la acción de los
radicales libres. [21]
El betacaroteno pertenece a una parte de las familias del carotenoide el cual contiene
composiciones del isoprenoide que son polinsaturados con propiedades antioxidantes.
[23]
Figura 8. Estructura del 𝛽-Caroteno
Fuente: Desconocido
28
2.2.4. Carotol Este componente se lo encuentra en la Zanahoria (Daucus carota) es uno de los
principales compuesto del aceite extraído de las semillas de zanahoria y comprende un
aproximado del 40% del aceite, es un alcohol sesquiterpénico pertenece a los
terpenoides se cree que este compuesto se forma en las semillas de zanahoria (Daucus
carota) durante el periodo de vegetación, se ha realizado estudios que han demostrados
que el Carotol puede estar relacionado con interacciones alelopáticas que expresan
actividad como agente antifúngico, herbicida e insecticida. [24]
2.2.5. Composición de ácidos grasos de las semillas de zanahoria En la investigación realizada por Musa y Chalchat en Turquía, mencionan que los
ácidos grasos presentes en el extracto de las semillas de la Daucus carota son el
Petroselénico, Linoleico, Palmítico, y Esteárico. [25]
2.2.6. Ácido Petroselénico
Este acido es también conocido como ácido trans octadecenoico, ácido trans-6-
octadecenoico y ácido petroselaidico. Este ácido trans-Petroselínico es el isómero trans
del ácido Petroselínico y un isómero del ácido oleico. [26]
Su fórmula molecular C18 H34 O2, entre sus propiedades fisicoquímicas experimentales
tiene un punto de fusión de 33ºC, punto de ebullición de 44.15ºC a 1 atmosfera, y el
punto de inflamación de 28ºC. [27]
2.2.7 Ácido Linoleico
Este es un ácido graso poliinsaturado dado por la formula molecular C18 H32 O2, este
tipo de ácido el ser humano no lo puede producir por lo que es necesario obtenerlo de
fuentes alimenticias. [28]
Es un ácido graso esencial perteneciente a la familia del omega-6, este tipo de ácido
graso se lo encuentra de manera abundante en el reino vegetal y en el animal. Existen
diferentes tipos de aceites vegetales que contienen cantidades bastante significativas de
este acido, como el aceite de oliva, palma y el de coco. [29]
Este ácido graso suele presentarse con diferentes tipos de isomería. Estudios realizados
in vitro han podido demostrar que el ácido linoleico contiene grandes capacidades
atrapadoras de los radicales libres. [29]
29
2.2.8 Acido Palmítico
Este acido es también conocido como ácido hexadecanoico, ácido cetílico, palmitato y
acido N-hexadecanoico, su fórmula molecular C16 H32 O2
El ácido palmítico pertenece a los ácido graso saturados, estos ácidos grasos se los
puede encontrar en las grasas, ceras, aceite de oliva, aceite de palma y en los lípidos
corporales. Este es un ácido de cadena larga considerado como un componente
importante del aceite del futuro.
Este acido tiene varias aplicaciones entre ellas está la producción de jabones,
cosméticos y como agente desmoldeantes industriales [30]
2.2.9 Acido Esteárico
A este acido también se lo conoce como Acido esteárico, octadecanoico, ácido
estearofánico, ácido octadecanoico ácido cetylacetico. Su fórmula molecular está dada
por C18 H36 O2.
El ácido esteárico es un ácido graso saturado que contiene una cadena larga con 18
carbonos, se lo encuentra en la manteca de cacao y la manteca de karité siendo este un
componente importante. El aspecto que tiene este acido es de color ceroso con olor
suave el cual en contacto con el agua flota. [31]
2.2.10 Acido Laurico
Conocido como ácido Dodecanoico, acido N-Dodecanoico y ácido dodecilico. La
fórmula molecular perteneciente a este ácido graso es C12 H24 O2, es un ácido graso
saturado que contiene una cadena media de 12 carbonos y se lo puede encontrar común
mente en el aceite de coco y el aceite de semilla de palma.
A este acido se le atribuye propiedades antimicrobianas, su textura es sólida de color
blanco en polvo con un olor suave a aceite de laurel, este compuesto presenta una
toxicidad baja. [26]
2.2.11 Compuestos fenólicos
Los compuestos fenólicos son los que tienen un grupo hidroxilo unido a uno o más
anillos aromáticos en su estructura química, las estructuras de los fenoles pueden variar
desde una molécula simple hasta la de un polímero complejo que contenga un alto
poder molecular. Los compuestos fenólicos contienen actividad antioxidante esto
30
depende de su estructura, estos compuestos se los encuentra como fuentes principales en
las semillas, frutas y vegetales. [32]
2.2.12. Tamizaje fitoquímico
El tamizaje fitoquímico consiste en la extracción de la planta con solventes que sean
apropiados y la aplicación de reacción de color y precipitación. Permite determinar de
manera cualitativa los principales grupos químicos presentes en una planta. [33]
2.2.13. Extracción de metabolitos secundarios
En el proceso de extracción de metabolitos se aplica método de extracción solido-
líquido que ayuda en la obtención de los metabolitos presentes en el citoplasma de la
célula vegetal. En el desarrollo de esta parte se inicia con la trituración de la semilla
luego esto se lo lleva a un proceso de maceración donde el material vegetal extraído de
la molienda entra en contacto con un disolvente. [10]
31
CAPÍTULO III
MARCO METODOLOGICO
3. 1 Tipo de Investigación
En el presente trabajo de investigación tiene como objetivo realizar la obtención de
nanopartículas de plata utilizando como agente reductor el extracto vegetal obtenido de
las semillas de zanahoria (Daucus carota), correspondiente a un método científico
experimental, dichos procesos fueron realizados en laboratorio de la Facultad de
Ingeniería Química Universidad de Guayaquil.
3.2 Métodos científicos empleados en la investigación
El presente trabajo de titulación se centra principalmente en la parte empírica y práctica.
Este estudio experimental se caracteriza mediante los siguientes métodos:
3.2.1 Métodos teóricos
Inductivo-deductivo, este método es basado por medio de consultas bibliográficas las
que han sido recopiladas en libros, artículos científicos, tesis doctorales, revistas,
diferentes documentos encontrados en sitios web entre otros.
3.2.2 Método experimental El trabajo de investigación se requiere que sea evaluado mediante el método
experimental, aplicando técnicas estandarizadas con el fin de relacionar la formación de
nanopartículas de plata y la actividad fúngica bactericida controlando las variables de
Operacionalización del proyecto.
3.3 PARTE EXPERIMENTAL
3.3.1 MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:
Los materiales, equipos y reactivos que se utilizaron en las diferentes etapas de
experimentación del proyecto se detallan en las siguientes tablas:
32
Tabla 2. Materiales utilizados en la experimentación del proyecto
Materiales
Matraz Erlenmeyer
Vaso de precipitado
Tubos de ensayos
Frasco enroscable
Fiolas
Pipetas
Embudos
Balón de tres bocas
Probetas
Micropipetas
Papel filtro
Soporte universal
Discos estéril
Placas Petri
Espátula
Gradilla
Fuente: (Paucar, Cristhian & Ronquillo, Ruth, 2019)
33
Tabla 3. Equipos utilizados en la experimentación del proyecto
Equipos
Espectrofotometro UV – vis
Estufa
Incubadora
Hornilla eléctrica
Balanza analítica
Balanza digital
Autoclave
Refrigeradora
Fuente: (Paucar Cristhian & Ronquillo Ruth, 2019)
Tabla 3.1. Reactivos utilizados en la experimentación del proyecto
Fuente: (Paucar Cristhian & Ronquillo Ruth, 2019)
Tabla 3.2. Materia prima
Fuente: (Paucar, Cristhian & Ronquillo Ruth, 2019)
Reactivos y Sustancia
Metanol
DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidroxilo)
Alcohol amílico
Agua destilada
Hexano
Nitrato de plata
Fehling A
Fehling B
Ácido clorhídrico
Cloruro férrico
Hidróxido de Sodio
Descripción
Semillas de Zanahoria (daucus carota)
34
3.4 EXPERIMENTACIÓN
3.4.1 Metodología para la elaboración del extracto de semillas de
zanahorias (Daucus carota) Se utilizaron 4 libras de semillas de zanahoria (Daucus carota) con una pureza del 99%,
adquirida en un mercado de la ciudad de Cuenca, las semillas de zanahoria fueron
ingresadas en una estufa de secado durante un tiempo de 9-14 horas a una temperatura
de 55 ℃ hasta obtener un peso constante.
Fig. 9.- Tratamiento de las semillas de zanahoria: Semillas deshidratadas y
pulverizadas.
Una vez que están secas las semillas se trituran, hasta convertirlas en polvo ya que
mientras más pequeño sea el tamaño de las partículas aumentara la superficie de
contacto con el solvente, luego se procede a realizar cartuchos de papel filtro con una de
semillas molida colocándolos en la cámara de muestra una cantidad de 55 g con 1000
ml de Hexano como solvente para llevar a destilado en el equipo Soxhlet, teniendo
como resultado un excelente rendimiento de extracción de aceite de semillas de
zanahoria. A una temperatura de 75°C y una presión de 0.5 Bar, se utilizó 60 rpm para
la recuperación del solvente (Hexano). Luego de ver obtenido el extracto se procedió a
realizar los diferentes tipos de análisis: Tamizaje fitoquímico, DPPH (2,2-difenil-1-
picrilhidroxilo), HPLC (Cromatografía liquida de alta eficacia), Inhibición de
microorganismos.
35
Imagen 10.- Equipos para la preparación del extracto:1) Equipo Soxhlet para la
extracción de las semillas de zanahoria 2) Rotavapor donde se concentra el extracto de
las semillas de zanahoria (daucus carota) 3) Extracto de semillas de zanahoria.
Tabla 4. Parámetros en la extracción del aceite de semillas de zanahoria en el
equipo Soxhlet.
Parámetros Cantidad
Solvente (Hexano) 90 %
Tiempo 180 min
Temperatura 70°C
Fuente: (Paucar, Cristhian & Ronquillo Ruth, 2019)
3.5. Tamizaje fitoquímicos en el extracto de semillas de zanahoria
En el tamizaje fitoquímico se analiza experimentalmente la propiedad reductora que
contiene el extracto de semillas de zanahoria, para determinar la presencia de
metabolitos secundarios realizados según el método de trease y Evans (1).
36
3.5.1 Ensayo de Espumas
En este ensayo de formación de espumas se permite identificar la presencia de
saponinas en un extracto, tanto del tipo triterpénica como esteroidal. De manera que si
el extracto es alcohólico se diluye con cinco veces su volumen en agua destilada, se
agita rápidamente 1ml de muestra por un tiempo de cinco a diez minutos si este persiste
por más de 2 minutos en reposo apareciendo espuma en la parte superior del líquido a
una altura de 2mm el ensayo es considerado positivo. Se valorara con un signo (+) en
presencia y signo (-) en ausencia del metabolito.
3.5.2 Ensayo de Fehling
En la determinación del ensayo de Fehling se permite reconocer la presencia de
cantidad de azucares reductores en el extracto. Para ello se añade 1ml del reactivo
Fehling A y 1ml de Fehling B, a esto se le agrega 1ml de la muestra etanólica, esta
mezcla es sometida a calentamiento de cinco a siete minutos luego se deja enfriar. Si la
solución se colorea de rojo o si se observa un precipitado rojo se considera positiva para
la presencia de azucares reductores. Se le dará una valoración con el signo (+) en
presencia y signo (-) en ausencia del metabolito.
3.5.3 Ensayo de Cloruro férrico
Para la determinación de contenido de cloruro férrico se permite identificar la presencia
de taninos y/o compuestos fenólicos en un extracto vegetal. Se agrega 1ml de la muestra
se añadió 3 gotas de una solución de cloruro férrico al 5%. Se considera un ensayo
positivo si la solución se decolora de rojo a vino. Si en la solución se desarrolla una
coloración verde intensa hay taninos de tipo pirocatecolicos. Si se desarrolla una
coloración azul hay taninos del tipo pirogalotánicos.
37
3.5.4 Ensayo de Resinas
Para la determinación de resinas se considera como un ensayo positivo cuando hay un
precipitado. A 2ml de la muestra se le agrega 10 ml de agua destilada manteniéndola en
constante agitación durante un tiempo de 15 minutos dicha solución se deja reposar y se
observa si hay precipitado. Se le dará una valoración con el signo (+) en presencia y
signo (-) en ausencia del metabolito.
3.5.5 Ensayo de Dragendorff- Mayer
Mediante este ensayo se permiten identificar la presencia de alcaloides. Se agrega 1 ml
de la solución acuosa con 1 gota de HCl concentrado (se calentó lentamente y se dejó
enfriar) hasta obtener una solución acuosa acida. Se añade 3 gotas de la solución
reactiva de Mayer, se considerado un ensayo positivo en la presencia de metabolitos si
se observa un precipitado coposo (+++), opalescencia (+), turbidez definida (++).
3.5.6 Ensayo de Shinoda
En este ensayo de Shinoda se permite identificar la presencia de flavonoides en un
extracto vegetal. Para ello se calienta 2ml de la muestra etanólica con 1ml de HCL puro
a una temperatura de 70°C durante 15 minutos, se deja enfriar y luego se agrega 2ml de
alcohol amílico. Se agita la mezcla y se deja reposar hasta que se separen en dos fases.
Se considera un ensayo positivo cuando hay una aparición en la fase amílica de color
rojo-marrón.
3.6 Metodología para la síntesis de nanopartículas de plata
Para la síntesis de las nanoparticulas de plata se utilizó AgNO3 a la 0.1 M y 1 M el cual
es diluido en el extracto que se obtuvo de las semillas de la Daucus Carota, mediante
agitación durante un tiempo determinado se logra observar el oscurecimiento de la
solución el cual indica la reducción de los iones de plata para luego formarse en
nanoparticulas.
38
Figura.11 Otro método de Síntesis de nanopartículas
3.7 Caracterización de nanopartículas de plata.
Para la caracterización de la síntesis de nanopartículas de plata se realizaron diferentes
técnicas espectroscópicas y microscópicas:
3.7.1 Microscopía de barrido electrónico (SEM)
Se permite desarrollar imágenes de una superficie, con una resolución alta y
tridimensional, determinando el tamaño y la morfología de las nanopartículas de plata
obtenidas.
3.7.2 Espectroscopia ultravioleta visible (UV-Vis)
Las nanopartículas de plata se llevaron a cabo principalmente por el análisis de
espectroscopia (Uv-Vis) determinando el rango del tamaño reducido de nanopartículas
uniformes, con dicha técnica se puede presenciar la resonancia del plasmón superficial
(RPS) presentando alrededor de las bandas de absorción con longitudes de onda de 390-
430nm.
3.7.3 Técnica de dispersión de luz dinámica (DLS)
Esta técnica por difracción de laser es ampliamente utilizada para la medición de
tamaños de partículas a escalas nanométricas
39
3.8 Ensayo y determinación de la actividad antioxidante del extracto
vegetal y las nanopartículas de plata por el método DPPH.
En este análisis se determina la actividad de eliminación de radicales de los
antioxidantes con el propósito de comparar resultado en el extracto de semillas de
zanahoria y la obtención de nanopartículas de plata, si el porcentaje de actividad
antioxidante es mayor o igual a 25% en dichas concentraciones se consideran activas en
este ensayo.
Fuente: (Paucar Cristhian & Ronquillo Ruth, 2019)
Fig12. Ensayo y determinación para la evaluación de medición de capacidad
antioxidante por el método de DPPH.
Se incubo el patrón
DPPH (0.1Nm) con
metanol durante 24 horas
Adicionar 2ml del patrón
DPPH a cada uno de los
tubos que contengan las
soluciones a evaluar.
Pasado este tiempo se mide el
valor de absorbancia para cada
muestra en el espectrofotómetro
a una longitud de 517nm.
Se adiciona 35, 50, 75𝜇𝑙
de las soluciones a
evaluar (extracto vegetal
y nanopartículas de
plata).
Homogenizar y dejar
reaccionar durante 15
minutos.
40
El porcentaje de actividad de antioxidante en las soluciones se presenta empleando la
siguiente ecuación:
% Actividad antioxidante =[𝐴(𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙)−𝐴(𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙)
𝐴(𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙)] ∗100
Donde:
A (inicial) = Absorbancia inicial
A (final) = Absorbancia final
Tabla 15….Curva estándar de calibración del Espectrofotómetro UV/Vis
Curva estándar de calibración del
Espectrofotómetro
Concentración mg/l Absorbancia @ 517nm
0.1 0.01
0.2 0.054
0.4 0.112
0.5 0.145
1 1.182
Tabla 5. Curva estándar de calibración del espectrofotómetro
1 2 3
Figura 13. Ensayo de DPPH: a) Preparación del patrón DPPH, b) Alícuotas de DPPH
para calibrar el equipo, c) Cambio de coloración característico de violeta a amarillo.
41
3.9 Análisis por la técnica de HPLC (Cromatografía liquida de alta
eficacia) Se realizó la técnica de HPLC (cromatografía liquida de alta eficacia) para determinar
la cantidad de ácidos grasos presentes, los cuales arrojaron la composición química del
extracto de las semillas de zanahoria (Daucus carota) utilizando como agente reductor
del extracto vegetal el ácido Petroselénico.
Este análisis de cromatografía liquida de alta eficiencia se llevó a cabo en el Laboratorio
analítico UBA, ubicado en la ciudad de Guayaquil.
3.10 Inhibición de microorganismos. Las pruebas de actividad microbiana se realizaron con el fin de verificar la inhibición
bacteriana para cada etapa experimental, cultivando cepas de microorganismos
patógenos como Gram negativo (Escherichia coli) y Gram positivo (Staphyloccocus
aureus) mediante el método Kirby-Bauer (método de difusión en disco de agar) las
cuales se enfrentan con el producto inhibidor, dichos patógenos fueron proporcionadas
por el Laboratorio de Microbiología de la facultad de Ingeniería química, Universidad
de Guayaquil.
Se realizaron varios cultivos de cepas bacterianas en diferentes cajas Petri preparadas
con agar nutritivo, se coloca el producto inhibidor en los discos estériles a diferentes
concentraciones a evaluar, se incubaron por 24 horas a una temperatura 35°C. Luego del
periodo de incubación se observó el área de inhibición de crecimiento bacteriana
alrededor de los discos estériles.
Imagen 14.- Ensayo de inhibición bacteriana:1) Elaboración de Cepas bacterianas para
cada ensayo 2) Cajas Petri inoculadas 3) Incubación durante 24 horas. 4) Lectura de la
zona de inhibición.
42
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
4.1 Acondicionamiento de la materia prima
La materia prima utilizada fue solamente semillas de zanahoria, al inicio del pesado de
las semillas se logró obtener un total de 453 gramos. Puesto a la abundante cantidad de
masa, se ingresaron en la estufa a 55℃ en un tiempo total de 28 horas en un periodo de
1 día. El tiempo necesario que se llevó a cabo el control del secado fue de 1 hora, la
variación de masa seca, luego de un tiempo de 28 horas no hubo ninguna diferencia de
masa seca con respecto al control anterior, dando como resultado un total de 152
gramos de semillas secas.
Ecuación.1 Porcentaje de humedad perdida en las semillas de zanahoria
%𝑯 = (𝒎𝒉 − 𝒎𝒔
𝒎𝒉) ∗ 𝟏𝟎𝟎
%𝑯 = (𝟒𝟓𝟑 − 𝟏𝟓𝟐
𝟒𝟓𝟑) ∗ 𝟏𝟎𝟎 = 𝟔𝟔. 𝟒𝟒%
Elaborado por: (Paucar Cristhian & Ronquillo Ruth, 2019)
Donde:
𝒎𝒉; Masa húmeda de semillas
𝒎𝒔; Masa seca de semillas
%H = Porcentaje de humedad
43
Tabla 6.- Resultado de pérdida de humedad contenido en las semillas de zanahoria
(Daucus carota)
Grafica 1. Curva de secado de las semillas de zanahoria (Daucus carota)
Hora
Peso de las semillas ( g )
Pérdida de
humedad
(g agua/g M.s)
9:00 453 66.44
10:00 448.2 66.08
11:00 400.5 62.04
12:00 383.3 60.34
13:00 367.1 58.59
14:00 349 56.44
15:00 328 53.65
16:00 303.2 49.86
17:00 287.3 47.09
9:00 265.02 42.64
10:00 239.9 33.16
11:00 208.73 27.17
12:00 188.84 19.50
13:00 169.6 10.37
14:00 152 0
15:00 152 0
16:00 152 0
y = -1,855x + 66,368R² = 0,8838
0
10
20
30
40
50
60
70
0 5 10 15 20 25 30 35
Pér
did
a de
hum
edad
(g
agu
a/g
M.s
)
Tiempo (Horas)
Pérdida de humedad Vs Tiempo
44
4.1.2 Rendimiento obtenido en el extracto de semillas de zanahoria
% 𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 =𝑷𝒆𝒔𝒐 𝒅𝒆𝒍 𝒂𝒄𝒆𝒊𝒕𝒆 𝒐𝒃𝒕𝒆𝒏𝒊𝒅𝒐
𝒑𝒆𝒔𝒐 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂∗ 𝟏𝟎𝟎
% 𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 =𝟐𝟎𝒈
𝟏𝟓𝟐𝒈∗ 𝟏𝟎𝟎
𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 = 𝟏𝟑 %
Tabla 7. Parámetros para la obtención de aceite de semillas de
zanahoria
Descripción Método
Solvente
Temperatura
de
destilación
Tiempo de
destilación
(min)
Aceite
obtenido
(g)
Porcentaje
de
rendimiento
del
aceite
Cantidad
recuperada
del
solvente
(ml)
Semillas de
zanahoria
Rota
vapor
Hexano
(1000ml)
75℃
180
20
13%
600
Elaborado por: (Paucar Cristhian & Ronquillo Ruth, 2019)
Figura. 15 Extracción de los componentes de las semillas de zanahoria
45
4.2 Tamizaje – fitoquímico
Tabla 8. Resultados del tamizaje fitoquímico en el extracto de las semillas de zanahoria
(Daucus carota)
Extracto de semillas
N-Hexano
Espuma (saponinas) +
Fehling (azucares reductores) -
Cloruro Férrico(Compuestos
fenólicos)
+
Shinoda (flavonoides) +
Dragendorff- Mayer (alcaloides) Turbidez (++), Precipitado(+++)
Leyenda: (+) Presencia, (-) Ausencia
Elaborado por: (Paucar Cristhian & Ronquillo Ruth 2019)
Para el ensayo de saponinas se observa la presencia de espumas en la superficie del
líquido, debido a la intervención de saponinas para la mezcla del extracto vegetal y agua
destilada.
Figura. 16 Tamizaje fitoquímico saponinas
46
En el ensayo de Fehling dio un resultado negativo a la presencia de azucares
reductores.
Figura17. Ensayo de Fehling
La presencia de compuestos fenólicos dio como resultado positivo, ya que se desarrolló
una coloración amarillo verdoso es considerado como taninos piracotecolicos.
Figura 18. Resultado de compuestos fenólicos presentes en la muestra
La presencia de flavonoides dio como un resultado positivo, esto debe a la coloración
rojo/marrón en la fase amílica.
Figura.19 Flavonoides presentes en el extracto.
47
En el ensayo de alcaloides se obtuvo como resultado un precipitado y presencia de
turbidez.
Figura. 20 Precipitado presente en la muestra
Figura. 21 Análisis de tamizaje fitoquímico
4.3. HPLC En la tabla 1.23 se muestran los resultados de los compuestos presentes en el extracto de
semillas de zanahoria (Daucus carota) obtenida del análisis del perfil de ácidos grasos.
Tabla 10. Compuestos obtenidos por la cromatografía
Perfil de Ácidos grasos Resultados en mg/g
Ácido laurico 33,63
Ácido mirísico 4,48
Ácido palmítico 49.37
Ácido oleico (cis-9) 768,72
Ácido linoleico (cis, cis) 140,03
Ácido linoleico 3,68
Fuente: (Paucar Cristhian & Ronquillo Ruth 2019)
48
4.4. Determinación de la actividad antioxidante por decoloración del
radical 1-1-Difenil-2-Picrilhidrazilo (DPPH)
Para determinar de la capacidad de antioxidante del extracto se utilizó la técnica de
DPPH, usando el Espectrofotometro UV-Vis, obteniendo buenos porcentajes de
actividad de antioxidantes para cada muestra del extracto vegetal.
Tabla 11. Muestra de semillas @ 35 𝝁l de DPPH
Fuente: (Paucar Cristhian & Ronquillo Ruth 2019)
Muestra: Semillas de zanahoria
Volumen: 35 μl
Serie t/s ABS
1 0,063 0,814
2 30,002 0,768
3 60,006 0,693
4 90,007 0,667
5 120,01 0,616
6 150,011 0,585
7 180,013 0,563
8 210,015 0,538
9 240,017 0,518
10 270,019 0,496
11 300,021 0,476
12 330,023 0,459
13 360,028 0,444
14 390,032 0,431
15 420,047 0,413
16 450,048 0,4
17 480,054 0,385
18 510,028 0,379
19 540,029 0,366
20 570,034 0,358
21 600,04 0,348
22 630,044 0,34
23 660,049 0,328
24 690,053 0,322
25 720,058 0,312
26 750,012 0,305
27 780,019 0,298
28 810,021 0,29
29 840,023 0,283
30 870,025 0,278
49
%Inhibición de la muestra de semillas zanahoria @ 35 𝝁l de DPPH
%𝑰𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 =𝑨𝒃𝒔 𝒊𝒏𝒊𝒄𝒊𝒂𝒍 − 𝑨𝒃𝒔 𝒇𝒊𝒏𝒂𝒍
𝑨𝒃𝒔 𝒊𝒏𝒊𝒄𝒊𝒂𝒍∗ 𝟏𝟎𝟎
%𝑰𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 =𝟎. 𝟖𝟏𝟒 − 𝟎. 𝟐𝟕𝟖
𝟎. 𝟖𝟏𝟒∗ 𝟏𝟎𝟎
%𝑰𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 = 𝟔𝟓, 𝟖𝟒𝟕𝟔
Grafico 2. Curva de la actividad antioxidante @ 35 𝝁l
Se utilizó 35 𝜇l del extracto metanolico de las semillas de zanahoria durante un tiempo
de 15 minutos, dando como resultado un porcentaje de actividad de antioxidante de
65.8476 lo que indica contenido de flavonoides.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 200 400 600 800 1000
AB
SO
RB
AN
CIA
TIEMPO
50
Porcentaje de inhibición de la muestra de semillas de zanahoria @ 50 μl de DPPH
%𝑰𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 =𝑨𝒃𝒔 𝒊𝒏𝒊𝒄𝒊𝒂𝒍 − 𝑨𝒃𝒔 𝒇𝒊𝒏𝒂𝒍
𝑨𝒃𝒔 𝒊𝒏𝒊𝒄𝒊𝒂𝒍∗ 𝟏𝟎𝟎
%𝑰𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 =𝟎. 𝟗𝟖𝟗 − 𝟎. 𝟑𝟐
𝟎. 𝟗𝟖𝟗∗ 𝟏𝟎𝟎
%𝑰𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 = 𝟔𝟕, 𝟔𝟒𝟒𝟎
Tabla 12. Muestra de semillas @ 50 𝝁l de DPPH
Grafico 3. Curva de la actividad antioxidante @ 50 μl
Fuente: (Paucar Cristhian & Ronquillo Ruth 2019)
Muestras Semillas de zanahoria
Volumen 50 μl
Serie t/s ABS
16 450,04 0,537
17 480,059 0,52
18 510,001 0,509
19 540,004 0,498
20 570,009 0,479
21 600,015 0,471
22 630,017 0,462
23 660,019 0,446
24 690,024 0,434
25 720,026 0,421
26 750,044 0,41
27 780,047 0,402
28 810,051 0,393
29 840,055 0,384
30 870,043 0,32
Muestra semillas de zanahoria
Volumen 50 μl
Serie t/s ABS
1 0,063 0,989
2 30,011 0,958
3 60,021 0,88
4 90,016 0,853
5 120,012 0,814
6 150,018 0,769
7 180,039 0,747
8 210,034 0,711
9 240,038 0,678
10 270,032 0,656
11 300,041 0,628
12 330,032 0,606
13 360,038 0,585
14 390,029 0,573
15 420,034 0,557
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 200 400 600 800 1000
AB
SO
RB
AN
CIA
TIEMPO
Curva de la Actividad Antioxidante @50µl
51
Se utilizó 50 𝜇l del extracto metanolico de las semillas de zanahoria durante un tiempo
de 15 minutos, dando como resultado un porcentaje de actividad de antioxidante de
67.6440 lo que indica contenido de flavonoides.
Tabla 13. Muestra de semillas @ 75 𝝁l de DPPH
4.5 Porcentaje de inhibición de la muestra de semillas de zanahoria @
75 μl de DPPH
%𝑰𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 =𝑨𝒃𝒔 𝒊𝒏𝒊𝒄𝒊𝒂𝒍 − 𝑨𝒃𝒔 𝒇𝒊𝒏𝒂𝒍
𝑨𝒃𝒔 𝒊𝒏𝒊𝒄𝒊𝒂𝒍∗ 𝟏𝟎𝟎
%𝑰𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 =𝟎. 𝟖𝟏𝟔 − 𝟎. 𝟏𝟔𝟗
𝟎. 𝟖𝟏𝟔∗ 𝟏𝟎𝟎
%𝑰𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 = 𝟕𝟗. 𝟐𝟖𝟗
Muestra Semillas de
zanahoria
Volumen 75 μl
Serie t/s ABS
16 450,03 0,349
17 480,052 0,324
18 510,05 0,315
19 540,048 0,303
20 570,056 0,284
21 600,018 0,27
22 630,032 0,256
23 660,03 0,245
24 690,035 0,232
25 720,029 0,222
26 750,011 0,21
27 780,017 0,2
28 810,012 0,19
29 840,018 0,18
30 870,029 0,169
Muestra semillas de zanahoria
volumen
75 μl
Serie t/s ABS
1 0,063 0,816
2 30,003 0,774
3 60,019 0,736
4 90,022 0,711
5 120,018 0,653
6 150,024 0,588
7 180,015 0,569
8 210,024 0,534
9 240,012 0,504
10 270,024 0,47
11 300,033 0,446
12 330,049 0,425
13 360,049 0,406
14 390,014 0,387
15 420,017 0,366
52
Grafico 4. Curva de la actividad antioxidante @ 75 μl
Fuente: (Paucar Cristhian & Ronquillo Ruth 2019)
Se utilizó 75 𝜇l del extracto metanolico de las semillas de zanahoria durante un tiempo
de 15 minutos, dando como resultado un porcentaje de actividad de antioxidante de
79.289 lo que indica un alto contenido de flavonoides.
Grafico 5. Se encuentra un resumen del porcentaje de inhibición para cada ensayo
del extracto de semilla de zanahoria.
Fuente: (Paucar Cristhian & Ronquillo Ruth 2019)
1 2 3
% Inhibicion 65,8476 67,644 79,289
Cantidad de muestra 35 50 75
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
PORCENTAJE DE ACTIVIDAD
ANTIOXIDANTE
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 200 400 600 800 1000
AB
SO
RB
AN
CIA
TIEMPO
Curva de la Actividad Antioxidante @75µl
53
4.6. Caracterización de las nanopartículas de plata Para la caracterización de nanopartículas de plata existen diversos métodos y técnicas
las cuales ayudan a determinar tanto la presencia de las mismas, su tamaño y forma.
Para determinar la presencia de nanopartículas en la síntesis realizada se utilizó la
técnica de espectroscopia UV-Visible, la técnica de dispersión dinámica de luz mediante
luz láser y la técnica de microscopia electrónica de barrido. Todas estas técnicas
ayudaron a determinar las nanopartículas obtenidas mediante la síntesis verde realizada
con una compuesto vegetal y una sal metálica.
4.7. Espectroscopia UV-Vis
Mediante el análisis de espectroscopia UV-Vis se permitió determinar la estabilidad y
formación de nanopartículas de plata sintetizadas, obteniendo una banda de pico de
absorción de longitud de onda máxima de 480 nm. En la tabla 2.2 se muestra el análisis
por espectroscopia de las nanopartículas sintetizadas.
Tabla 9. Análisis por espectroscopia UV-Vis de las nanopartículas sintetizadas.
Día
Pico de
absorción
máximo (nm)
Absorbancia
(nm)
Tramitancia (%)
Concentración
(ppm)
1 480 2.974 45 0.769
2 290 2.990 38.6 0.885
3 435 2.932 89.9 0.1
4 290 2.762 51.4 0.293
5 245 2.13 37.3 0.487
6 200 2.885 52.1 0.438
7 280 2.700 38.3 0.222
8 240 2.671 44.6 0.446
9 280 2.355 40.6 0.539
10 250 2.056 67.6 0.866
11 235 2.386 78.6 0.110
12 235 2.439 62.1 0.051
Fuente: (Paucar Cristhian & Ronquillo Ruth 2019)
54
Figura.22 Análisis de espectroscopia UV-Visible
4.8 Microscopía electrónica de barrido (SEM) La técnica SEM se la implementa para analizar la morfología y el tamaño de las
nanopartículas de plata.
Se puede observar en la imagen A y C varios aglomerados con tamaño de 10 μm, en
cambio en la figura B se pueden apreciar las nanoparticulas dispersas obtenidas de la
solución 0.1 M.
A B C
Figura 23. Microscopía electrónica de barrido con magnificación de x1000.
55
4.9. Determinación de la actividad microbiana
Los resultados microbiológicos desarrollados por el método Kirby-Bauer (método de
difusión en discos de agar) se demuestran que los ensayos de inhibición en el extracto
de semillas de zanahoria y las AgNPs al 0.1nM poseen una excelente inhibición
bacteriana por separado. No obstante la actividad bacteriana para los patógenos E. Coli
y Staphyloccocus aureus fue superior con las nanopartículas de plata a 0.1nM que con el
extracto de semillas de zanahoria. Esto se debe a que el extracto de las semillas de
zanahoria (Daucus Carota) actué como un agente reductor natural para darle fijeza a las
nanopartículas de plata sin que se produzca ningún crecimiento y posterior acumulación
atribuyendo mayores partículas a la escala manométrica, lo que reduce las propiedades
antimicrobianas de la plata hasta dejarla en un tamaño estable.
En los resultados se muestran que las AgNPs son efectivos para la actividad microbiana
de crecimiento de hongos ya que se arrojaron resultados de inhibición mayores para
Gram negativo.
En la tabla 22. Se demuestran los diámetros de inhibición de cada halo presentes en los
microorganismos E. coli y Staphyloccocus aureus.
Tabla 14. Lectura de halo de inhibición de las sustancias presentes en cada
microorganismo
Zona de inhibición (cm)
Microorganismo Extracto de las
semillas de
zanahoria (5 𝝁l)
Extracto de las
semillas de
zanahoria (10𝝁l )
AgNPs
(5𝝁l)
AgNPs
(10 𝝁l)
Escherichia coli
(100 𝝁l)
2.2
1.9
3.0
2.44
Staphyloccocus
aureus (100 𝝁l)
2.3
1.4
2.6
2.1
Aspergillus 0 0 0 0
Fuente: (Paucar Cristhian & Ronquillo Ruth 2019).
56
Fig. 24 Ensayos microbiologicos: 1) Inhibición bacteriana de muestras para la bacteria
Escherichia coli con 5 y 10 𝜇l de extracto de semillas de zanahoria. 2) Inhibición
bacteriana de muestras para la bacteria Staphyloccocus aureus con 5 y 10 𝜇l de extracto
de semillas. 3) Inhibición bacteriana de muestras para la bacteria Escherichia coli con 5
y 10 𝜇l de AgNPs. 4) Inhibición bacteriana de muestras para la bacteria Staphyloccocus
aureus con 5 y 10 𝜇l.
Grafico 6. Determinación microbiana de sustancias en S. aureus
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Extracto de las semillas de
zanahoria (5 μl)
Extracto de las semillas de
zanahoria (10 μl )
AgNPs(5μl)
AgNPs(10 μl)
Po
rcen
taje
de
inhib
ició
n
bac
teri
ana
en (
cm)
S.aureus
1
)
4
)
3
) 2
)
57
Grafica 7. Determinación microbiana de sustancias en E. coli
Fig. 25 Ensayos fúngicos (Aspergillus)
Fig. 26 Ensayos fúngicos (Aspergillus) después de una semana de reacción
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Extracto de las semillas de
zanahoria (5 μl)
Extracto de las semillas de zanahoria
(10μl )
AgNPs(5μl)
AgNPs(10 μl)
Po
rcen
taje
de
inhib
ició
n
bac
teri
ana
en (
cm)
E. coli
58
Conclusiones
La extracción del aceite de las semillas de zanahoria se tuvo un rendimiento del
13%.
Los análisis realizados para la caracterización de los componentes del extracto
de las semillas de zanahoria fueron el análisis de perfil de ácidos grasos
utilizando la técnica del HPLC en este se determinó la presencia del ácido
oleico, ácido linoleico, ácido laurico, acido palmítico y ácido mirístico, en la
determinación de componentes químico mediante el tamizaje fitoquímico se
obtuvo positivo en saponinas, compuestos fenólicos y flavonoides.
En la síntesis de las nanopartículas se utilizó una cantidad de 5ml del extracto
más la sal metálica a la 0.1 M y 1. M.
Para la caracterización de las nanopartículas se utilizó las técnicas del SEM y la
de espectrofotometría UV-Visible en la primera que se pudo presenciar más
nanopartículas en la solución de 0.1 M y menos en la de 1 M en las dos se pudo
observar imágenes de nanoparticulas aglomeradas y dispersas con forma
irregular con magnificación de x1000 permitiendo determinar que hubieron
nanoparticulas que no lograron separarse por completo esa sería la razón de las
formas obtenidas, En la técnica de espectrofotometría UV-Visible realizada a la
concentración de 0.1m dio una longitud de onda de 480 nm en menor tiempo.
Para verificar el poder bactericida de las nanopartículas de plata se realizó
pruebas con dos tipos de bacterias (E. coli y S. aureus) dando buen resultado las
nanopartículas con menor cantidad (5 𝜇l ) presentando un mayor halo de
inhibición en la bacteria E. coli, los resultados de las nanopartículas en la parte
fúngica se obtuvo negativo no presenta inhibición.
59
Recomendaciones
Para la síntesis de las nanopartículas de plata tomar en cuenta utilizar
componentes adecuados ya que se obtiene mejores resultados con extractos
acuosos que con extractos en forma de aceites.
Para comprobar las cantidades adecuadas tanto de la sal metálica y el extracto
orgánico se tiene que realizar cálculos y muestras con diferentes tipos de
concentraciones.
Para determinar la potencialización de las nanopartículas como bactericida se
tiene que utilizar la menor cantidad posible para inhibir el crecimiento
bacteriano, de esta manera se puede sustentar la eficacia de las nanopartículas
obtenidas y su poder bactericida.
60
Referencias Bibliográficas
[1] P. Rodriguez, «IBEC,» 29 Noviembre 2017. [En línea]. Available:
http://divulga.ibecbarcelona.eu/nanoparticulas-de-plata-el-terror-de-las-bacterias/.
[2] O. L. M. Gil, «Nanotec,» 13 Junio 2016. [En línea]. Available:
http://www.nanotec.es/ventajas-del-uso-del-acido-laurico-cuerpo/.
[3] M. Flores, «tesis,» Junio 2017. [En línea]. Available:
http://ri.uaemex.mx/bitstream/handle/20.500.11799/67954/Tesis%20Marisa.pdf?s
equence=3&isAllowed=y.
[4] M. Loor, «Nanotecnologia,» SCRIB, p. 5, 24 AGOSTO 2015.
[5] J. E. A. c. K. H. Jose Morones, «The bactericidal effect of silver,» Scielo, 2005.
[6] G. A. C. H. G. F. Juan Arroyo, «Nanopartículas core-shell de Cobre-Plata
(Cu@Ag),» JA Cuyubamba, p. 8, 2014.
[7] U. d. zaragoza, «Nanoparticulas con accion bactericida,» 13 Julio 2017. [En
línea]. Available:
http://www.unizar.es/actualidad/vernoticia_ng.php?id=36836&idh=8034.
[8] F. Holguin, «Nanotecnologia,» 2013. [En línea]. Available:
http://nanodinamica.blogspot.com/2013/10/nanotecnologia-top-down-y-bottom-
up.html.
[9] Guille, «Nanotecnologia,» 13 Noviembre 2014. [En línea]. Available:
http://naotecnologi.blogspot.com/2014/11/tipos-de-nanotecnologia-la-forma-
de.html.
[10] S. Madrid, «Síntesis y caracterización de nanopartículas de plata a partir de varios
extractos pigmentados de dos plantas para su aplicación en celdas solares
híbridas,» Sangolqui, 2017.
[11] M. G. Garzon, «Nanomateriales, nanoparticulas y sintesis verde,» p. 6, 13 Abril
2018.
61
[12] NCBI, «“Green” Nanotechnologies: Synthesis of Metal Nanoparticles Using
Plants,» NCBI, marzo 2014.
[13] I. Garcia, «Espectofotometro UV-VIS,» 03 Mayo 2015. [En línea]. Available:
https://elespectrofotometro.com/espectrofotometria-uv-visible/.
[14] R. C. I. M. M. Juan Maldonado, «La espectroscopia UV-Vis en la evaluación de
la,» Ciencia aplicada y Tecnologia, p. 7, 23 mayo 2018.
[15] A. Torres, «Repositorio de la escuela politecnica nacional,» Noviembre 2016. [En
línea].
[16] D. F. Sc., «¿Cuál es microscopia electrónica de transmisión?,» News Medical Life
Sciences , p. 8, 25 Junio 2019.
[17] Enciclopedia, 2010. [En línea].
[18] C. P. S. M. M. Y. F. Cuadros Moreno, «Dispercion de luz dinamica en la
determinacion de tamaño de nanoparticulas polimericas,» EDVCATIO
PHYSICOR, p. 5, 2014.
[19] Freepng, «Freepng,» 2017. [En línea].
[20] M. Serra, «la resistencia microbiana en el contexto actual y la importancia del
conocimiento y aplicacion en la politica antimicrobiana,» Scielo, 2017.
[21] Y. Pinto, «PROPIEDADES Y BENEFICIOS DE LA ZANAHORIA,» 10
NOVIEMBRE 2015. [En línea]. Available:
https://mejorconsalud.com/propiedades-beneficios-la-zanahoria/.
[22] D. Mercola, «Via organica,» 28 Noviembre 2015. [En línea]. Available:
https://viaorganica.org/cuales-son-los-beneficios-de-las-zanahorias-para-la-salud/.
[23] A. Mandal, «News Medical life sciences,» 23 Agosto 2018. [En línea]. Available:
https://www.news-medical.net/health/What-is-Beta-Carotene-(Spanish).aspx.
[24] NCBI, «Centro Nacional de Informacion Biotecnologica,» 26 03 2005. [En línea].
[25] M. M. Özcan y J. C. Chalchat, «COMPOSICION QUIMICA DEL ACEITE DE
62
LA SEMILLA DE ZANAHORIA,» DIALNET, p. 7, octubre 2007.
[26] C. Chemical, «Cayman Chemical,» 18 Diciembre 2017. [En línea]. Available:
https://www.caymanchem.com/product/20026.
[27] «Chemspider,» 2015. [En línea]. Available:
http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.4444569.html#.
[28] T. MESTROVIC, «CUAL ES EL ACIDO LINOLEICO,» p. 8, 23 AGOSTO
2018.
[29] S. N. A. V. Julio Sanhueza, «ACIDO LINOLEICO CONJUGADO,» SCIELO, p.
29, 22 JULIO 2002.
[30] C. N. d. I. Biotecnologica, «Acido Palmitico,» p.
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/palmitic_acid#section=Top, 16
Septiembre 2004.
[31] NCLT, 16 Septiembre 2004. [En línea]. Available:
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/stearic_acid#section=Top.
[32] K. S. S. S. Nagendran Balasundram, «Compuestos fenolicos en plantas y
subproductos agroindustriales: actividad antioxidante, ocurrencia y usos
potenciales,» ELSEVIER, 2006.
[33] R. G. C. C. E. R. L. G. D. A. Pedro Medrano, «Tamisaje Fitoquimico,» 2016.
[34] A. Vergara, «Accion bactericida de nanoparticulas de plata utilizando aloe vera,
para una posterior aplicacion en vendajes y parches,» p. 6, 24 Marzo 2017.
63
Anexo 2 Figura. 27 Resultado del análisis de perfil de ácido graso realizado al extracto obtenido
de la semilla de zanahoria (Daucus Carota).
Fuente: (Paucar Cristhian & Ronquillo Ruth 2019)
64
Fuente: (Paucar Cristhian & Ronquillo Ruth 2019)
65
Figura. 28 Imágenes del SEM realizadas a la solución de concentración 0.1M
Fuente: (Paucar Cristhian & Ronquillo Ruth 2019)
66
Figura. 29 Imágenes del SEM realizadas a la solución de concentración 1 M
Fuente: (Paucar Cristhian & Ronquillo Ruth 2019)
![MODELO DE CONTRATO DE OBRA 1366 - ypf.com · YPF Exploración & Producción de Hidrocarburos de Bolivia S.A., ... [___], según Poder Notarial No[___] de fecha [___], otorgado ante](https://static.fdocuments.ec/doc/165x107/5bb15f7a09d3f281368d126b/modelo-de-contrato-de-obra-1366-ypfcom-ypf-exploracion-produccion-de.jpg)
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