UNIVERSIDAD DE COSTA RICA ESCUELA DE AGRONOMÍA

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UNIVERSIDAD DE COSTA RICA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROALIMENTARIAS

ESCUELA DE AGRONOMÍA

Determinación de la respuesta de cultivares de arroz criollo (Oryza sativa L.)

costarricense a linajes de Pyricularia oryzae Cavara mediante pruebas de

virulencia en condiciones de invernadero

Jose Pablo Barrantes Rojas

TESIS PARA OPTAR AL TÍTULO PROFESIONAL DE INGENIERO

AGRÓNOMO CON EL GRADO DE LICENCIADO EN AGRONOMÍA

2019

Determinación de la respuesta de cultivares de arroz criollo ( Oryza sativa L.) costarricense a linajes de Pyricularia oryzae Cavara mediante pruebas de virulencia en condiciones de

invernadero

Jose Pablo Barrantes Rojas

TESIS PARA OPTAR AL TÍTULO PROFESIONAL DE INGENIERO AGRÓNOMO CON EL GRADO DE LICENCIADO EN AGRONOMÍA

DIRECTORA DE TESIS

MIEMBRO DEL TRIBUNAL Ph.D.

MIEMBRO DEL TRIBUNAL Ph. D. Lms arboza Barquero

MIEMBRO DEL TRIBUNAL M. Se. Alvaro Azofeifa Delgado

DIRECTOR DE ESCUELA Ph. D. Luis Gómez Alpízar

JosePab~ SUSTENTANTE

2019

¡¡

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DEDICATORIA

A mis dos abuelas, Eliza Alfaro Hidalgo y Eresvinda Jiménez Meléndez,

que me cuidaron y apoyaron desde el cielo.

iv

AGRADECIMIENTOS

A mi directora de Tesis, M. Sc. Griselda Arrieta Espinoza, por el apoyo, la confianza, la

paciencia y todo el aprendizaje durante la realización de este estudio. Gracias por

demostrarme que puedo superar mis límites.

A la Dra. María del Milagro Granados, por aconsejarme y estar siempre dispuesta a

brindarme su apoyo.

Al Dr. Luis Barboza, por compartir su conocimiento y su constante cooperación.

Al personal del CIBCM que de una u otra forma siempre estuvieron con la disposición de

ayudarme a realizar este trabajo.

A mis compañeros de laboratorio: Cindy Aguilar, Allan Meneses, Sofía Carvajal, William

Watson, Steven Quirós, Randall Rojas, Dyan Morales, Keylin Castro, Marcela Turcios, Roy

Sibaja, Genuar Nuñez por su gran ayuda, consejo y motivación cuando lo necesité.

A mis padres Marvin Barrantes y Maritza Rojas, mis hermanas María Fernanda y Gloriana

Barrantes y mi novia Mónica Villalobos, por su apoyo incondicional, confianza y por ser los

que me motivan a ser mejor cada día.

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ÍNDICE GENERAL

RESUMEN ........................................................................................................... viii

1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1

2. ANTECEDENTES .............................................................................................. 4

2.1 Importancia económica de P. oryzae ............................................................ 4

2.2 Caracterización de P. oryzae en Costa Rica ................................................. 4

2.3 Pruebas de virulencia ................................................................................... 4

2.3.1 Pruebas de virulencia realizadas en Costa Rica ..................................... 5

2.4 Arroz criollo en Costa Rica ............................................................................ 7

3. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................ 8

4. OBJETIVOS ....................................................................................................... 9

4.1 Objetivo general ............................................................................................ 9

4.2 Objetivos específicos .................................................................................... 9

5. METODOLOGÍA ................................................................................................ 9

5.1 Selección de los linajes para las pruebas de virulencia en función de su eficiencia en producción de conidios ................................................................... 9

5.1.1 Cultivos monospóricos de cada linaje ..................................................... 9

5.1.2 Conteo de conidios ............................................................................... 10

5.1.3 Análisis estadístico ............................................................................... 11 5.2 Prueba de virulencia de P. oryzae .............................................................. 12

5.2.1 Preparación del material vegetal........................................................... 12

5.2.2 Preparación del inóculo ........................................................................ 13 5.2.3 Inoculación de P. oryzae....................................................................... 14

5.2.4 Evaluación de la respuesta del hospedero ........................................... 16

5.2.5 Análisis de los datos ............................................................................. 18

6. RESULTADOS ................................................................................................. 19

6.1 Selección de 3 linajes para las pruebas de virulencia según la producción de conidios. ........................................................................................................... 19 6.2 Pruebas de virulencia de P. oryzae. ............................................................ 20

6.2.1 Severidad ............................................................................................. 20

6.2.2 Frecuencia de resistencia ..................................................................... 24

7. DISCUSIÓN ..................................................................................................... 27

8. CONCLUSIONES ............................................................................................ 32

9. RECOMENDACIONES .................................................................................... 33

10. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................. 34

11. ANEXOS ........................................................................................................ 39

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ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Criterios de selección utilizados por el INTA en la escogencia de los

materiales de arroz criollo para autoconsumo recolectados en Puriscal, Pérez

Zeledón, Upala, Turrialba, La Cruz y Los Chiles (Tinoco 2014) ............................. 7

Cuadro 2. Linajes, cultivos monospóricos y localidades de colecta de los

aislamientos seleccionados por su agresividad según los resultados obtenidos por

Muñoz (2003) y Arroyo (2004) ............................................................................. 10

Cuadro 3. Variedades criollas, costarricenses, dispersor internacional, diferenciales

internacionales y controles resistentes utilizados en las pruebas de virulencia .... 12

Cuadro 4. Escala de evaluación para P. oryzae según el grado y el porcentaje de

área foliar afectada (AFA) (Ghazanfar et al. 2009, IRRI 2005) ............................. 18

Cuadro 5. Respuesta de las variedades según la escala de evaluación para P.

oryzae, de acuerdo al grado y el porcentaje de área foliar afectada (AFA) (Ghazanfar

et al. 2009, IRRI 2005) ......................................................................................... 23

vii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Rejilla de una cámara de Neubauer (Fuente: www.celeromics.com). ... 11

Figura 2. Preparación de las plantas. A. Siembra de semillas de arroz (O. sativa) en

potes con suelo y fibra de coco (3:1). B. Plantas de arroz con 21 días después de

realizada la siembra. ............................................................................................ 13

Figura 3. Solución de conidios de P. oryzae de los linajes CRL-2 y CRL-9A ajustada

a 1x105 conidios/ml. ............................................................................................. 14

Figura 4.Condiciones de las pruebas de virulencia de P. oryzae en invernadero. A.

Distribución de las tres cámaras húmedas correspondientes a una repetición. B.

Compresor. C. Aerógrafo. .................................................................................... 15

Figura 5. Variedades de arroz (Arroces criollos, O. Llanos 5, Palmar 18, Fanny,

IRBLk-ka, Irat 13, IRBLi-F5 y CR-5272) dentro de cada cámara húmeda y los linajes

utilizados de P. oryzae. ........................................................................................ 16

Figura 6. Concentración (conidios/ml) producida por 5 linajes de P. oryzae según

su respectivo cultivo monospórico. La línea punteada representa la concentración

requerida para realizar las pruebas de virulencia. Se muestran promedios y las

barras de error indican el error estándar. Letras iguales indican que no hay

diferencias significativas (p>0.05) de acuerdo a la prueba de Tukey.................... 19

Figura 7. Porcentaje de área foliar afectada en diferentes variedades de arroz (O.

sativa) expuestas a los linajes CRL-2, CRL-3 y CRL-9A de P. oryzae en las pruebas

de virulencia en condiciones de invernadero. Las letras iguales indican que no hay

diferencias significativas (p>0,05) según la prueba de Tukey. ............................. 21

Figura 8. Frecuencia de resistencia de diferentes variedades de arroz (O. sativa) a

los linajes CRL-2, CRL-3 y CRL-9A de P. oryzae en las pruebas de virulencia en

condiciones de invernadero. Frecuencias superiores a 85% se considera como

resistencia alta, entre 50% y 85% como resistencia media e inferiores a 50% como

resistencia baja. ................................................................................................... 25

viii

RESUMEN

El hongo Pyricularia oryzae Cavara es un ascomicete conocido como el

agente causal del tizón del arroz. Esta enfermedad se localiza en cualquier país

donde se cultive arroz y puede generar pérdidas de hasta el 100% si no se controla

a tiempo. Una de las principales formas de combate es mediante el desarrollo de

variedades resistentes, para esto se deben encontrar materiales que sirvan como

donadores de genes, tales como el arroz criollo. Estas plantas representan un

reservorio genético de gran importancia, ya que las condiciones de producción las

obliga a generar tolerancia a factores, tanto, bióticos como abióticos.

En este trabajo se seleccionaron los linajes CRL-2, CRL-3 y CRL-9A

pertenecientes a la colección de P. oryzae del Centro de Investigación en Biología

Celular y Molecular (CIBCM). Con estos aislamientos se realizaron pruebas de

virulencia a 18 cultivares de arroz criollo costarricense (Beto Bolas, Chento Buril,

Chin-chin, Chombo, Fortuna negro, Lagunero, Mexicano del incendio, Nira Blanco,

Nira Colorado, Pai Caracol, Picaporte, Punta Morada, Rexorito, Rosita, Texas, Tres

Mesinos, Tres Mesinos Blanco y Tres Mesinos Colorado), y como testigos, dos

variedades costarricenses (CR-5272 y Palmar 18), dos diferenciales internacionales

(IRBLi-F5 e IRBLk-ka), dos controles resistentes (Irat 13 y Oryzica Llanos 5) y un

dispersor universal (Fanny). Estas pruebas fueron realizadas en condiciones de

invernadero, aplicando soluciones de conidios a una concentración de 1×105

conidios/ml. Se realizaron tres réplicas del ensayo, donde se evaluó la severidad

(porcentaje de área foliar afectada) a los 21 días después de la inoculación y

finalmente se calculó la frecuencia de resistencia (FR) de cada variedad. Los 18

materiales de arroz criollo fueron altamente resistentes a los tres linajes evaluados

y nueve de estos mostraron valores de FR del 100% De las variedades testigo,

únicamente IRBLk-ka y Fanny mostraron resistencia intermedia (a dos y tres linajes

respectivamente), mientras que IRBLi-F5, Irat 13, Oryzica Llanos 5, Palmar 18 y

CR-5272 fueron altamente resistes a los tres linajes.

ix

Esta es una de las primeras evaluaciones realizadas para determinar la

resistencia de distintos materiales de arroz al hongo P. oryzae en condiciones

controladas de invernadero. En este trabajo se indica que en los materiales criollos

se observó alta resistencia a los linajes CRL-2, CRL-3 y CRL-9A provenientes del

Pacífico Norte y Pacífico Sur del país. Esto demuestra que estas variedades

presentan características de alto interés agronómico como la resistencia a P. oryzae

y podrían ser utilizadas en futuros programas de mejoramiento como parentales.

1

1. INTRODUCCIÓN

El arroz es uno de los principales cultivos a nivel mundial, según datos de la

FAO (2017), durante la campaña 2016/2017, el consumo mundial fue de 498

millones de toneladas, mientras que, el consumo per capita fue de 53,7 kg, y se

esperan aumentos de hasta 1% en el consumo en los años siguientes,

convirtiéndolo en el segundo cultivo más importante después del trigo (Sukanya

et al. 2011). Costa Rica no es la excepción, el consumo nacional es de 239.707

toneladas métricas, mientras que el consumo per capita es de 48,45kg,

convirtiéndolo en un producto que forma parte de la canasta básica del

costarricense (CONARROZ 2018).

Pyricularia es un género de hongo ascomicete, que posee individuos capaces

de parasitar más de 50 gramíneas, incluyendo cultivos de importancia económica

como trigo, cebada, arroz, maíz, avena, centeno, mijo africano y pastos

ornamentales (Skamnioti y Gurr 2009). Dentro de este grupo se encuentra

Pyricularia oryzae, agente causal de la enfermedad conocida como tizón del arroz

(Chadha y Gopalakrishna 2005), este puede generar pérdidas de hasta el 100% de

la producción en países como Japón, China, India y Vietnam, los cuales, son

algunos de los principales productores de arroz a nivel mundial (Chuwa et al. 2015).

En Costa Rica, este hongo es una de las limitantes bióticas más importante en el

cultivo, generando pérdidas importantes en cosecha al igual que en el resto del

mundo (Guzmán 2006).

El combate de la enfermedad puede ser de varios tipos, existen medidas de

bajo costo para prevenirla, tales como: quema de residuos de cosecha para eliminar

el inóculo, evitar el exceso de nitrógeno en la fertilización o establecer una

plantación bajo condiciones de anegamiento. Sin embargo, estas prácticas podrían

ser ineficientes cuando se presentan las condiciones favorables para la

enfermedad, tales como humedad relativa mayor a 90%, temperatura entre 26 y

28°C, periodos de más de 12 horas de mojadura foliar y fertilización nitrogenada

elevada ( Mew et al. 2016, Skamnioti y Gurr 2009, Tinoco y Acuña 2009). Otro

2

método utilizado es el combate químico, su efectividad depende del ingrediente

activo; tiempo y método de aplicación; estado de la enfermedad y/o de la eficiencia

de los sistemas de predicción; y de la tasa de emergencia de estructuras de

resistencia (Skamnioti y Gurr 2009). No obstante, la contaminación ambiental y los

efectos tóxicos de los químicos sintéticos sobre los organismos a los que no va

dirigida la aplicación, incluyendo humanos, hace que se esté realizando

investigación sobre pesticidas a base de extractos naturales (Sukanya et al. 2011).

Después de la revolución verde, en la década de los 60, el desarrollo de la

resistencia en plantas contra enfermedades fue promovida y se convirtió en un

componente importante en muchos países para el mejoramiento en la producción.

Gracias a esto, se considera el mejoramiento genético y la creación de variedades

resistentes como una eficaz vía para el control del tizón del arroz (Fiallos et al. 2012).

Se han identificado más de 73 genes de resistencia a esta enfermedad, en especies

como O. minuta, O. rufipogon, O. australiensis y O. sativa (subespecie Indica y

Japónica), sin embargo, la resistencia basada en locus simples (resistencia vertical)

suele funcionar durante periodos cortos de tiempo (entre 2 y 4 años), esto es más

evidente en los cultivares de arroz con alta uniformidad genética, los cuales generan

una alta presión adaptativa sobre P. oryzae (Skamnioti y Gurr 2009).

Por lo tanto, crear variedades que tengan una resistencia más duradera en

países productores de arroz es un reto, ya que se requiere de manejo y

entendimiento biológico para implementar un combate factible del patógeno,

además de la gran variabilidad de razas del hongo que genera una dificultad

adicional para el investigador (Mew et al. 2016). Por lo anterior, es importante

determinar la resistencia en cultivares, para así, mediante mejoramiento

convencional, realizar combinaciones de alelos resistentes que generen plantas con

una resistencia más durable al tizón de arroz en campo (Skamnioti y Gurr 2009).

Los cultivares criollos son plantas que a través del tiempo y manejo

campesino, han sido seleccionadas de acuerdo al interés productivo y alimentario

de las comunidades, y a las condiciones bióticas y abióticas de cada localidad. Estas

3

al cultivarse en diversos ambientes y bajo diferentes manejos, se encuentran en

constante adaptación y evolución, existiendo una amplia diversidad de variedades

(Mejía et al. 2014). El uso de variedades criollas es determinante para el manejo de

ecosistemas sanos y sostenibles, ya que permite el uso de genotipos adaptados a

las condiciones locales, con alta variabilidad genética y características biológicas

que proporcionan mayor plasticidad ecológica (Peterson et al. 2013).

En el caso de Costa Rica, los arroces criollos son variedades antiguas que el

Instituto Nacional de Innovación y Transferencia en Tecnología Agropecuaria (INTA)

del Ministerio de Agricultura ha recolectado y caracterizado con el objetivo de

aumentar el material genético de su banco de germoplasma y purificar dichas

variedades para, así, ofrecer al productor un material más estable y homogéneo

(Tinoco 2013, 2014). Actualmente, los materiales criollos de arroz son utilizados en

sistemas de labranza mínima y pocos insumos, además, con frecuencia son

sembrados en laderas y son dependientes de la lluvia, con suelos poco fértiles y

altos en acidez, estos materiales son utilizados principalmente para autoconsumo

(Cordero 2016).

En el contexto de la importancia de generar nuevos materiales resistentes a

P. oryzae, es importante evaluar si las variedades criollas costarricenses presentan

resistencia al patógeno, ya que, debido a sus características y adaptación podrían

funcionar como donadores de genes para futuros programas de mejoramiento

genético de arroz.

4

2. ANTECEDENTES

2.1 Importancia económica de P. oryzae

El tizón del arroz es considerado una de las enfermedades de mayor impacto

económico a nivel mundial, puede provocar reducciones en la cosecha entre 40% y

70%, pérdidas que supondrían alimento para 60 millones de personas por año

(Skamnioti y Gurr 2009, Challagulla et al. 2015). Esta presenta una amplia

distribución a nivel mundial, ha sido reportado en países como China, Japón, India,

Australia, Filipinas, Kenia, Corea y en América, incluye a Costa Rica, ya que es casi

norma natural que donde haya arroz, habrá P. oryzae (Guzmán 2006, Kihoro et al.

2013, Challagulla et al. 2015).

2.2 Caracterización de P. oryzae en Costa Rica

En Costa Rica, se caracterizó molecularmente una colección de P. oryzae

recolectada de diferentes zonas arroceras del país (Huetar Norte, Pacífico Norte y

Pacífico Sur) mediante el elemento repetido Pot-2, que corresponde a una

secuencia de ADN repetido con aproximadamente 100 copias en el genoma de P.

oryzae que permite identificar linajes dentro y entre patotipos. Por medio de la

utilización de cultivos del hongo procedentes de un solo conidio (conocido como

monospórico) y un PCR largo, se identificaron 20 linajes, denominados como CRL-

1 al CRL-20, el CRL-9 dividido en A y B debido a su alta similitud genética. Estos

linajes se encuentran distribuidos de forma heterogénea por el país (Muñoz 2003).

2.3 Pruebas de virulencia

La forma más eficaz de reducir la incidencia de la enfermedad es con el

desarrollo de cultivares resistentes, esto se puede lograr mediante la determinación

de la reacción de la planta frente a diferentes linajes de P. oryzae (Jia et al. 2003).

Las pruebas de virulencia bajo condiciones controladas funcionan como una medida

objetiva de evaluación de la resistencia de los materiales, ya que proporcionan las

condiciones óptimas para que se dé la infección del patógeno, las cuales no siempre

ocurren en campo (Muñoz 2003). Estas pruebas se siguen utilizando en la

5

actualidad, como en el caso de Turcios (2016), que estudió la respuesta de la

especie silvestre O. glumaepatula a P. oryzae mediante pruebas de virulencia.

Para realizar las pruebas de virulencia se recomienda utilizar una suspensión

de conidios a una concentración entre 1105 y 2105 conidios/mL, suspendidos en

una solución de gelatina a 0,5% v/v. La inoculación de 1 mL de la suspensión de

conidios por cada diez plantas permite observar resultados confiables en la prueba

de virulencia, y con esto, identificar el nivel de resistencia de las variedades

evaluadas (Muñoz 2003, Turcios 2016).

Para determinar el tipo de respuesta de la planta al patógeno se pueden

utilizar escalas visuales, las cuales de acuerdo al tipo de lesión clasifican al

hospedero en las siguientes categorías: altamente resistente, resistente,

susceptible y altamente susceptible (Muñoz 2003, Berruyer et al. 2006, Takahashi

et al. 2009, Ghazanfar et al. 2009, Turcios 2016).

2.3.1 Pruebas de virulencia realizadas en Costa Rica

Arroyo (2004) evaluó el ámbito de virulencia de los linajes costarricenses de

P. oryzae CRL-1, CRL-2, CRL-3, CRL-4, CRL-5, CRL-7 y CRL-11 (correspondiente

a 25 monospóricos) frente a diferentes germoplasmas de arroz (O. sativa)

correspondientes a variedades promisorias, dispersores internacionales, controles

resistentes, diferenciales internacionales latinoamericanos, variedades

costarricenses y diferenciales asiáticos y africanos. Encontró que la variedad

costarricense CR-4102; las variedades promisorias Sen-04, Sen-06 y Sen-074 y los

diferenciales Carreón, K-1 y K-8 mostraron reacciones incompatibles con los

monospóricos evaluados y podrían ser utilizadas para programas de mejoramiento.

Por su parte, el dispersor M-201 fue susceptible a todos los linajes inoculados.

También, observó que los monospóricos 13-2-3 (CRL-2), 256-3-2 (CRL-7) y 222-5-

1 (CRL-3) fueron los más agresivos; mientras que, los aislamientos con menor

capacidad de infección fueron 118-64-4 y 124-8-1, ambos pertenecientes al linaje

CRL-4.

6

Muñoz (2003) realizó una evaluación de virulencia a 13 de los 20 linajes de

P. oryzae descritos en Costa Rica (CRL-1, CRL-2, CRL-3, CRL-4, CRL-5, CRL-6,

CRL-7, CRL-9A, CRL-9B, CRL-10, CRL-11, CRL-12, CRL-13 y CRL-14, para un

total de 27 monospóricos). Este autor utilizó 22 variedades de arroz que incluye

diferenciales latinoamericanos, dispersores internacionales, controles resistentes,

variedades promisorias y variedades comerciales costarricenses. De los patotipos

evaluados se determinó que los monospóricos 139-5-3 (CRL-5), 222-2-2 y 222-2-5

(CRL-9A) fueron los más agresivos, mientras que 218-4-3 (CRL-10) fue el menos

agresivo; también se encontró que las variedades promisorias Fedearroz-50, SEN-

04, SEN-06 y SEN-074, los controles resistentes IRAT 13 y Oryzica Llanos 5, las

variedades costarricenses CR-4338 y Setesa 9, y los diferenciales internacionales

Dular y NP-125 presentaron reacciones incompatibles con todos los monospóricos

evaluados; mientras que, los dispersores internacionales Fanny y M-201 fueron los

que mostraron mayor compatibilidad con los patotipos utilizados, con esto se

confirmó que la utilización Fanny y M-201 como dispersores de P. oryzae es

apropiada en Costa Rica.

Turcios (2016) realizó una determinación de la resistencia del arroz silvestre

Oryza glumaepatula proveniente del Refugio del Humedal del río Medio Queso (Los

Chiles de Alajuela, Costa Rica) al linaje CRL-9A de P. oryzae (monospórico 222-2-

5), las pruebas de virulencia determinaron que la especie silvestre presentó

resistencia al patógeno en las condiciones experimentales del estudio.

Tinoco (2013, 2014) realizó investigaciones en arroz criollo en Costa Rica,

evaluó 42 variedades, las cuales cultivó en la zona de Upala en condiciones de

secano, determinó que únicamente el material Curime superó el 6% de área foliar

afectada, y por ende, las restantes 41 fueron resistentes al inóculo de P. oryzae

presente en la zona, entre estas variedades se encontraban Chin-chin, Tres

Mesinos, Nira Colorado y Texas.

Sin embargo, a pesar de la adaptación que presentan estos materiales a su

ámbito local y de los resultados obtenidos por Tinoco (2013, 2014), aún no se han

7

realizado estudios con pruebas de virulencia que determinen la respuesta de estas

variedades a los diferentes linajes de P. oryzae presentes en el país y en la

colección del CIBCM.

2.4 Arroz criollo en Costa Rica

En Costa Rica, el arroz criollo se encuentra en manos de pequeños

agricultores, los cuales lo siembran para autoconsumo, como una forma de asegurar

este alimento en su dieta. Dichas variedades fueron recolectadas y caracterizadas

por el Instituto Nacional de Innovación y Transferencia en Tecnología Agropecuaria

(INTA) en el año 2011, siguiendo los criterios para considerar un material como

criollo descrito en el Cuadro 1, estos criterios son importantes para este tipo de

sistemas, donde se busca aumentar la eficiencia del trabajo humano, alta

producción para consumo y facilidad para el trillado y limpieza (Tinoco 2014).

Cuadro 1. Criterios de selección utilizados por el INTA en la escogencia de los

materiales de arroz criollo para autoconsumo recolectados en Puriscal, Pérez

Zeledón, Upala, Turrialba, La Cruz y Los Chiles (Tinoco 2014)

Criterio de selección Características

Arquitectura de la planta

- Hábito de crecimiento: semierecto

- Macollamiento: de intermedio a bajo

- Altura de planta: 120cm o más

Longitud de panícula 25cm o más

Grosor de raquis 2mm o más

Tipo de grano en granza Largo (6,6 – 7,0mm)

Pubescencia Baja

Trilla de panícula Desprendimiento intermedio del grano

Vigor de la planta Alta tasa de crecimiento y cobertura

Longitud de la hoja bandera 50cm o más

8

Estos materiales se multiplicaron en la Estación Enrique Jiménez Núñez en

Cañas, Guanacaste (Tinoco 2014).

3. JUSTIFICACIÓN

El tizón del arroz es una de las enfermedades más importantes a nivel

mundial, por lo que buscar métodos para controlarla se ha convertido en una

prioridad mediante la identificación de cultivares resistentes; sin embargo, esta

resistencia es funcional por periodos cortos de tiempo (2-4 años), debido a la alta

diversidad genética del hongo.

Una opción para conseguir genes de resistencia puede ser mediante el

estudio de variedades criollas, debido a su adaptación a las condiciones locales,

podrían presentar rasgos importantes para ser agregados a variedades de arroz

mediante mejoramiento genético para combatir a P. oryzae.

Sin embargo, existen pocos antecedentes sobre variedades criollas, por lo

que, este proyecto busca generar información sobre la resistencia de estos

cultivares a P. oryzae en condiciones de invernadero.

9

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general

Determinar la respuesta de 18 variedades de arroz criollo de Costa Rica

(Oryza sativa) a la inoculación de linajes de Pyricularia oryzae en condiciones de

invernadero.

4.2 Objetivos específicos

1- Seleccionar tres linajes para las pruebas de virulencia en función de su eficiencia

en producción de conidios.

2- Determinar la respuesta de 18 variedades de arroz criollo costarricense (Oryza

sativa) a tres linajes de Pyricularia oryzae mediante pruebas de virulencia en

condiciones de invernadero.

5. METODOLOGÍA

La investigación se llevó a cabo en el laboratorio y el invernadero del Centro

de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM) de la Universidad de

Costa Rica, ubicado en la Ciudad de la Investigación de la Sede Rodrigo Facio, en

San Pedro de Montes de Oca, San José, Costa Rica.

5.1 Selección de los linajes para las pruebas de virulencia en función de su

eficiencia en producción de conidios

5.1.1 Cultivos monospóricos de cada linaje

Los cuatro linajes de la colección de P. oryzae del CIBCM compuestos por

nueve aislamientos monospóricos más agresivos según Muñoz (2003) y Arroyo

(2004) se seleccionaron de la colección del Laboratorio de Biotecnología Aplicada

al Mejoramiento Genético de Cultivos del CIBCM para la prueba de producción de

conidios (Cuadro 2). Dicho material fue recolectado en el año 2000 y almacenado a

-20 °C. Para la reactivación de los monospóricos, se cortaron trozos de papel filtro

10

inoculado con el hongo (33 mm) y se colocaron dos trozos de papel por placa Petri

(9010 mm) con medio de cultivo agar – salvado de arroz (10 g de agar, 16 g de

salvado de arroz y 0,8 mL de tetraciclina en 800 mL de agua destilada). Las placas

Petri con el hongo se incubaron a 28 °C en oscuridad durante siete días.

Cuadro 2. Linajes, cultivos monospóricos y localidades de colecta de los

aislamientos seleccionados por su agresividad según los resultados obtenidos por

Muñoz (2003) y Arroyo (2004)

Linaje Monospórico Localidad de colecta

CRL-2 13-2-3 Pacifico Norte

CRL-3 222-5-1 Pacífico Sur

CRL-4

260-1-2 Pacífico Norte

118-93-6 Pacífico Norte

218-1-1 Pacífico Sur

CRL-7 256-3-2 Pacífico Norte

CRL-9A 222-2-5 Pacífico Sur

Al finalizar el proceso de incubación, se colocaron dos segmentos de micelio

de 55 mm en placas Petri (14020 mm) con medio ASA (Agar + Salvado de arroz),

estas se mantuvieron en condiciones de fotoperiodo de 16 h luz y 8 h oscuridad

durante 21 días. Se realizaron tres repeticiones por linaje y cada repetición estuvo

compuesta por 15 placas. Se realizó una distribución aleatoria de las placas en las

condiciones de fotoperiodo.

5.1.2 Conteo de conidios

Para realizar el conteo de conidios al cabo de 21 días, se realizó un raspado

del micelio utilizando una espátula. La masa de conidios se colocó en un beaker con

4 ml de una solución de gelatina (0,5% v/v) y se filtró a través de una malla fina de

tela. Se colocó 10 µl del filtrado en la cámara de Neubauer o hematocitrómetro y se

11

cuantificó el número de conidios en cada uno de los cuadrantes de la cámara

marcados con un 1 en la Figura 1. Finalmente, se calculó la concentración utilizando

la siguiente fórmula establecida por el fabricante:

𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠

𝑚𝑙=

Ʃ 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 𝑒𝑛 𝑙𝑜𝑠 4 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠

4 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠𝑥 10000

*Cuadrantes de 1mm cada uno

Figura 1. Rejilla de una cámara de Neubauer (Fuente: www.celeromics.com).

5.1.3 Análisis estadístico

El número de conidios obtenidos para cada linaje se analizó mediante

ANDEVA para determinar si existen diferencias en la producción de conidios entre

los linajes y para determinar los monospóricos más eficientes en la producción de

conidios utilizando la prueba de Tukey a un 5% de significancia (α=0,05).

12

5.2 Prueba de virulencia de P. oryzae

5.2.1 Preparación del material vegetal

Se utilizaron semillas de arroz criollo recolectadas por el INTA en distintas

zonas del país, multiplicadas en la Estación Experimental Enrique Jiménez Núñez

en Cañas y donadas al CIBCM, así como, un dispersor internacional de P. oryzae,

controles resistentes, diferenciales internacionales (donados por el CIAT) y

variedades costarricenses (Cuadro 3).

Cuadro 3. Variedades criollas, costarricenses, dispersor internacional, diferenciales

internacionales y controles resistentes utilizados en las pruebas de virulencia

Variedades criollas

(18)

Beto Bolas Chento Buril Chin-Chin Chombo

Fortuna negro Lagunero Mexicano del

incendio Nira Blanco

Nira Colorado Pai Caracol Picaporte Punta Morada

Rexorito Rosita Texas Tres Mesinos

Tres Mesinos Blanco

Tres Mesinos Colorado

Variedades

costarricenses (2) CR-5272 Palmar 18

Dispersor

internacional (1) Fanny

Diferenciales

internacionales (2) IRBLi-F5 (gen Pii) IRBLk-ka (gen Pik)

Controles

resistentes (2) Irat 13 Oryzica Llanos 5

13

Se colocaron 20 semillas por pote (13×13 cm) con aproximadamente 0,5 kg

de una mezcla de suelo y fibra de coco (3:1) esterilizado con caldera (Figura 2A).

La semilla de cada variedad se sembró en tres macetas y se realizó una fertilización

de 0,0375 g de nitrógeno (0,081 g de urea) semanal por pote durante el periodo

entre la germinación de las semillas y la inoculación, la cual se realizó cuando la

planta alcanzó los 21 días de edad (tercer hoja completamente expandida, etapa

fenológica V3) (Figura 2B). Antes de realizar la inoculación, se realizó un raleo de

plantas, de manera que se conservaron 10 plantas por pote.

Figura 2. Preparación de las plantas. A. Siembra de semillas de arroz (O. sativa) en

potes con suelo y fibra de coco (3:1). B. Plantas de arroz con 21 días después de

realizada la siembra.

5.2.2 Preparación del inóculo

Para la inoculación de las plantas, se seleccionaron los tres linajes

costarricenses (un monospórico por linaje) con mayor producción de conidios

obtenidos en la parte 5.1 de la metodología.

14

La reproducción del hongo y conteo de conidios se realizó utilizando la misma

metodología descrita en las secciónes 5.1.1 y 5.1.2, una vez obtenida la

concentración de conidios, se realizó una dilución con solución de gelatina (0,5%

v/v) para obtener la concentración de 1x105 conidios/ml (Figura 3).

Figura 3. Solución de conidios de P. oryzae de los linajes CRL-2 y CRL-9A ajustada

a 1x105 conidios/ml.

5.2.3 Inoculación de P. oryzae

Los potes con las plantas se colocaron en cámaras húmedas (dimensiones

45×70×50 cm) con una base de espuma y envueltas en plástico transparente

(Figura 4A). Se asperjó 1 ml de la solución de conidios por cada pote utilizando un

compresor (Voylet V-777 de 200/230W) (Figura 4B) y un aerógrafo (byp PAP0000

de 15 a 50 psi) (Figura 4C). Se hizo un riego cada 2 días para mantener las

condiciones de alta humedad dentro de las cámaras.

15

Figura 4.Condiciones de las pruebas de virulencia de P. oryzae en invernadero. A.

Distribución de las tres cámaras húmedas correspondientes a una repetición. B.

Compresor. C. Aerógrafo.

Para el diseño experimental se realizó una distribución aleatoria de los potes

dentro las cámaras húmedas con 3 repeticiones a través del tiempo. Cada repetición

estuvo compuesta por un pote de cada variedad con 10 plantas cada uno, estos

estuvieron distribuidos aleatoriamente dentro de la jaula. Se evaluaron

simultáneamente los tres linajes, un linaje por jaula, como se muestra en la Figura

5.

16

Figura 5. Variedades de arroz (Arroces criollos, O. Llanos 5, Palmar 18, Fanny,

IRBLk-ka, Irat 13, IRBLi-F5 y CR-5272) dentro de cada cámara húmeda y los linajes

utilizados de P. oryzae.

5.2.4 Evaluación de la respuesta del hospedero

La evaluación se realizó 15 días después de la inoculación (36 días DDG)

cuando las plantas presentan la quinta hoja desarrollada (V5), Se examinaron las

primeras tres hojas de cada planta (de la más joven completamente expandida

hasta la tercera), si alguna de estas presentó infección se cortó, se pegó en hojas

de papel blanco tamaño carta (8,5 11 pulgadas) y se escaneó a resolución de 600

ppi para determinar la severidad. En caso de que ninguna de las hojas presentara

síntomas de la enfermedad se asignó un valor de 0% al área foliar afectada (AFA)

a ese individuo.

La determinación del área foliar afectada se realizó utilizando el programa

ImageJ (versión 1.5i), ajustando la escala a 239,36 pixeles/cm. El AFA se determinó

por medio de la segmentación de colores, donde se separó el tejido sano (color

verde) del tejido afectado (lesiones de P. oryzae) utilizando el parámetro “yuv” (Y:

0.0; 200.0, U: 0.0; 255.0; V: 132.0; 255.0)

17

El porcentaje de AFA en cada hoja se determinó a partir de los valores

medidos por el programa ImageJ de área foliar total y área foliar afectada, lo que

representó la severidad

El nivel de resistencia se determinó comparando los valores de AFA dados

por la aplicación con la escala mostrada por Ghazanfar et al. (2009) e IRRI (2005)

(Cuadro 4), esto indicó el grado de respuesta de cada individuo a la enfermedad.

El valor de área foliar afectada de cada individuo se clasificó en grados de 0

a 9 según la escala desarrollada por Ghazanfar et al. (2009) e IRRI (2005) (cuadro

4), donde las plantas con grados de 0 a 3 se consideraron resistentes (R), mientras

que grados de 4 a 9 se consideraron susceptibles (S). La evaluación de la

resistencia se representó mediante frecuencias de resistencia (FR), la cual se

determinó calculando el número de individuos resistentes de una variedad entre el

número total de individuos de dicha variedad para cada linaje. A cada variedad se

le asignó un valor de resistencia alto (>85%), medio (entre 50% y 85%) o bajo

(˂50%) de acuerdo al valor de FR obtenido (Wu et al. 2017).

18

Cuadro 4. Escala de evaluación para P. oryzae según el grado y el porcentaje de

área foliar afectada (AFA) (Ghazanfar et al. 2009, IRRI 2005)

Grado Sintomatología Respuesta del hospedero

0 No se observa lesión Altamente resistente

1 Pequeñas manchas color café del tamaño

de puntas de alfiler. AFA ˂1%

Resistente 2

Pequeñas manchas redondeadas o

ligeramente alargadas, puntos grisáceos y

necróticos, alrededor de 1-2 mm de

diámetro, con un margen café. AFA 1%

3 Tipo de lesión similar al grado 2.

AFA 2-3%

4 Lesiones típicas de Pyricularia de 3 mm o

mayor. AFA 4%

Susceptible


mayor. AFA 5-10%


mayor. AFA 11-25%


mayor. AFA 26-50%


mayor. AFA 51-75% Altamente susceptible


mayor. AFA > 75%. Hojas muertas

5.2.5 Análisis de los datos

Con los resultados obtenidos de severidad (AFA) de la enfermedad se realizó

un diagrama de cajas y bigotes para cada linaje evaluado. La comparación de

medias se realizó mediante la prueba de Tukey a un 5% de significancia (α=0,05).

19

6. RESULTADOS

6.1 Selección de 3 linajes para las pruebas de virulencia según la producción

de conidios.

Al analizar la producción de conidios se encontraron diferencias entre los

distintos monospóricos evaluados (p<0,0001). El monospórico 222-2-5 (CRL-9A)

fue el que presentó mayor concentración (4,6105 conidios/ml), seguido por el 13-

2-3 (CRL-2) (2,3105 conidios/ml) y 222-5-1 (CRL-3) (1,2105 conidios/ml).

Finalmente, el monospórico 256-3-2 (CRL-7) y los correspondientes al linaje CRL-4

(118-93-6, 260-1-2 y 218-1-1) no alcanzaron la concentración mínima necesaria

para poder realizar las pruebas de virulencia (1105 conidios/ml) y no mostraron

diferencias significativas entre sí (Figura 6).

Por lo tanto, se seleccionaron los monospóricos 13-2-3 (CRL-2), 222-5-

1(CRL-3) y 222-2-5 (CRL-9A), debido a que fueron los aislamientos que obtuvieron

la mayor producción promedio de conidios.

Figura 6. Concentración (conidios/ml) producida por 5 linajes de P. oryzae según

su respectivo cultivo monospórico. La línea punteada representa la concentración

20

requerida para realizar las pruebas de virulencia. Se muestran promedios y las

barras de error indican el error estándar. Letras iguales indican que no hay

diferencias significativas (p>0.05) de acuerdo a la prueba de Tukey.

6.2 Pruebas de virulencia de P. oryzae.

6.2.1 Severidad

Las variedades más afectadas por los tres linajes utilizados fueron Fanny y

el diferencial IRBLk-ka, los cuales mostraron valores muy similares entre sí.

Únicamente Palmar 18 no presentó reacción a los tres linajes.

En las pruebas con el linaje CRL-2 se encontraron diferencias significativas

(p<0,0001), en las respuestas de los materiales, el dispersor Fanny (1,43%), la

variedad CR-5272 y el diferencial IRBLk-ka (0,76% y 0,61% respectivamente)

fueron los más afectados, el resto de variedades no presentaron diferencias entre

sí, mostrando valores de AFA inferiores a 0,5%. Para el linaje CRL-3 Fanny e IRBLk-

ka (3,81% y 3,68% respectivamente) presentaron severidades significativamente

mayores (p<0,0001), el resto de las variedades presentaron valores de entre 0% y

0,96% de AFA. De igual forma, las variedades Fanny (5,64%) e IRBLk-ka (4,50%)

fueron las más afectadas por el linaje CRL-9A, el resto de variedades presentaron

valores inferiores a 1,28%. Las variedades criollas no presentaron diferencias

significativas entre sí para ninguno de los linajes evaluados, con valores promedio

de AFA entre 0% y 1,28% (Figura 7).

Los linajes CRL-9A y CRL-3 fueron significativamente más agresivos

(p=0,0017) con valores promedio de severidad de 0,56% y 0,54% respectivamente,

mientras que CRL-2 presentó un valor de 0,21% de AFA (Anexo 3).

21

Figura 7. Porcentaje de área foliar afectada en diferentes variedades de arroz (O.

sativa) expuestas a los linajes CRL-2, CRL-3 y CRL-9A de P. oryzae en las pruebas

de virulencia en condiciones de invernadero. Las letras iguales indican que no hay

diferencias significativas (p>0,05) según la prueba de Tukey.

22

En términos generales, basados en el valor promedio de área foliar afectada,

todas las variedades fueron resistentes a al menos uno de los linajes evaluados. De

igual forma, para los tres linajes Fanny fue el que presento el valor más alto de AFA,

y fue, junto a IRBLk-ka, los únicos en mostrar respuesta susceptible a los linajes

CRL-3 y CRL-9A. La variedad costarricense Palmar 18 fue la única que presentó

valores de 0% de AFA a los tres linajes evaluados (Cuadro 5).

Todos los criollos fueron resistentes a los tres linajes evaluados, siendo los

más destacados Texas, Pai Caracol, Nira Blanco y Lagunero, debido a que

presentaron, en promedio, los valores de AFA más bajos con respecto al resto de

materiales criollos (Cuadro 5).

23

Cuadro 5. Respuesta de las variedades según la escala de evaluación para P. oryzae, de acuerdo al grado y el porcentaje

de área foliar afectada (AFA) (Ghazanfar et al. 2009, IRRI 2005)

Grado Severidad CRL-2 CRL-3 CRL-9A Respuesta del hospedero

0 AFA 0% Lagunero

Texas O. Llanos 5

Picaporte Palmar 18

Rexorito Palmar 18

Rosita C. Buril Palmar 18

O. Llanos 5

P. Caracol IRBLi-F5

Altamente

resistente

1 AFA ˂1%

F. negro

(0,003%)

T. Mesinos

T. Mesinos B.

T. Mesinos C.

P. Caracol

Chombo

Chin-chin

IRBLi-F5

C. Buril

Irat 13

Rosita

M. incendio

Nira B

Nira C.

P. Morada

B. bolas

Rexorito

IRBLk-ka

CR-5272

(0,75%)

Texas

(0,003%)

P. Caracol

O. Llanos 5

Chin-chin

B. bolas

Picaporte

IRBLi-F5

M. incendio

T. Mesinos

B.

Lagunero

N. Blanco

Irat 13

P. Morada

T. Mesinos

T. Mesinos C.

C. Buril

F. negro.

Nira C.

Chombo

(0,88%)

F. negro

(0,003%)

Rexorito

P. Morada

Texas

T. Mesinos

Rosita

Lagunero

T. Mesinos

B (0,6%)

N. Colorado

T. Mesinos C.

B. bolas

Irat 13

N. Blanco

Picaporte

M. incendio

Chombo

Resistente

2 AFA 1% Fanny CR-5272 CR-5272 Chin-chin

3 AFA 2-3%

4 AFA 4% IRBLk-ka Fanny IRBLk-ka Susceptible

5 AFA 5-10% Fanny

24

6.2.2 Frecuencia de resistencia

Los materiales mostraron en su mayoría resistencia alta al linaje CRL-2,

únicamente la variedad Fanny tuvo resistencia media (83,3% de frecuencia de

resistencia). En cuanto a las variedades criollas, Chento Buril y Rexorito fueron las

más afectadas (96,7% y 96,4% de FR respectivamente), mientras que Beto Bolas,

Chin-chin, Chombo, Fortuna negro, Lagunero, Mexicano del incendio, Nira Blanco,

Nira Colorado, Pai Caracol, Picaporte, Punta Morada, Rosita, Texas, Tres Mesinos,

Tres Mesinos Blanco y Tres Mesinos Colorado obtuvieron valores de FR del 100%,

al igual que la variedad costarricense Palmar 18, el diferencial IRBLi-F5 y los

controles resistentes (Figura 8).

Para el linaje CRL-3, únicamente las variedades Fanny e IRBLk-ka

presentaron resistencia media (66,7% y 76,7% de frecuencia de resistencia

respectivamente), las restantes 23 mostraron resistencia alta a este. De los criollos,

Chombo y Tres Mesinos Blanco obtuvieron el valor de FR más bajos (92% y 90%

respectivamente); Beto Bolas, Chento Buril, Chin-chin, Lagunero, Nira Blanco, Pai

Caracol, Picaporte, Punta Morada, Rexorito, Rosita, Texas, Tres Mesinos y Tres

Mesinos Colorado obtuvieron un FR del 100%, al igual que la variedad costarricense

Palmar 18, y los controles resistentes Irat 13 y Oryzica Llanos 5 (Figura 8).

En el caso del linaje CRL-9A, Fanny e IRBLk-ka fueron las únicas variedades

que presentaron resistencia media (56,7% y 63,3% de frecuencia de resistencia

respectivamente), las restantes 23 mostraron resistencia alta. En el caso de los

criollos, Chin-chin obtuvo el valor de FR más bajo (87,7%); Beto Bolas, Chento Buril,

Fortuna negro, Mexicano del incendio, Nira Blanco, Nira Colorado, Pai Caracol,

Picaporte, Punta Morada, Rexorito, Rosita, Texas, Tres Mesinos, Tres Mesinos

Blanco y Tres Mesinos Colorado obtuvieron un FR del 100%, al igual que Palmar

18, IRBLi-F5 y los controles resistentes (Figura 8).

25

Figura 8. Frecuencia de resistencia de diferentes variedades de arroz (O. sativa) a

los linajes CRL-2, CRL-3 y CRL-9A de P. oryzae en las pruebas de virulencia en

condiciones de invernadero. Frecuencias superiores a 85% se considera como

resistencia alta, entre 50% y 85% como resistencia media e inferiores a 50% como

resistencia baja.

26

En términos generales, todas las variedades mostraron resistencia alta a al

menos uno de los linajes evaluados, excepto el dispersor universal Fanny con

resistencia media a los tres patógenos evaluados. La variedad costarricense Palmar

18 y los controles resistentes Oryzica Llanos 5 e Irat 13 obtuvieron valores de FR

del 100% en todas las evaluaciones.

Todos los criollos fueron altamente resistentes a los tres linajes evaluados,

siendo los más destacados Beto Bolas, Nira Blanco, Pai Caracol, Picaporte, Punta

Morada, Rosita, Texas, Tres Mesinos y Tres Mesinos Colorado, los cuales

presentaron valores de FR del 100% en todas las evaluaciones.

27

7. DISCUSIÓN

En los resultados obtenidos durante la prueba de producción de conidios se

observó que cuatro de los cultivos monospóricos presentaron una concentración

inferior a la requerida para realizar las pruebas de virulencia, este comportamiento

pudo deberse a que las condiciones de crecimiento requeridas para cada

aislamiento puede variar de uno a otro.

Turcios (2016) evaluó el comportamiento de la adición de sacarosa al medio

de cultivo y al fotoperiodo de dos monospóricos, correspondientes a los linajes CRL-

9A y CRL-12, encontrando que el medio de crecimiento con sacarosa afectaba

negativamente la producción de conidios de CRL-9A y favorecía a CRL-12, mientras

que el crecimiento de ambos fue mejor en condiciones de fotoperiodo (12h luz/12h

oscuridad), de igual forma, Sibaja (2017) determinó que el periodo de incubación

puede ser diferente entre los aislamientos, siendo para CRL-12 suficiente con 8

días, mientras que CRL-9A requirió de 21 días para alcanzar la producción de

conidios óptima.

Otro factor que puede afectar el crecimiento y la producción de conidios de

un aislamiento de P. oryzae son las condiciones y el período de almacenamiento,

en el caso de los monospóricos utilizados en este trabajo, se encontraban

almacenados en papel filtro a -20°C, según Prado (2016), esta técnica de

almacenamiento asegura la conservación de las colonias por aproximadamente 5

años, sin embargo, la colección del CIBCM utilizada en este trabajo se encuentra

almacenada desde el año 2000, lo que podría estar afectando la calidad de los

aislamientos.

Las pruebas de virulencia realizadas con los linajes CRL-2 (13-2-3), CRL-3

(222-5-1) y CRL-9A (222-2-5) permitieron identificar el comportamiento de las

variedades de arroz criollo costarricense evaluadas para la variable de severidad,

así como relacionar los valores de área foliar afectada con la escala de evaluación

de P. oryzae (Ghazanfar et al. 2009, IRRI 2005) para determinar el grado de

28

respuesta del hospedero al patógeno y la frecuencia de resistencia de cada

variedad.

Los controles resistentes fueron altamente resistentes, obteniendo valores de

FR de 100% y AFA menor a 0,06% con los tres linajes evaluados. Resultados

similares fueron obtenidos por Arroyo (2004) y Muñoz (2003), excepto por Irat 13,

el cual presentó resistencia intermedia a CRL-3 en las pruebas de Arroyo. Según

estos estudios, estas variedades fueron resistentes al 98% de los linajes y

monospóricos pertenecientes a la colección costarricense de P. oryzae del CIBCM,

la misma utilizada en este trabajo.

El material que presentó mayor afectación fue Fanny, obteniendo una

frecuencia de resistencia media y obteniendo los valores de AFA más altos con los

tres linajes evaluados. Esta variedad de origen Francés es considerada como

dispersor universal de P. oryzae, no se le han identificado genes de resistencia, y

ha sido utilizado como testigo susceptible en diferentes ensayos, principalmente en

Latinoamérica (Rodríguez 1971, Cuevas Pérez 1992, Guimarães 1997, Pieters et al.

2011). En Costa Rica, Muñoz (2003) y Arroyo (2004) demostraron que Fanny es

susceptible al 82% de los aislamientos de P. oryzae colectados, siendo

medianamente resistente a CRL-9A y altamente susceptible a CRL-2 y CRL-3. La

respuesta a los linajes CRL-2 y CRL-3 no concuerda con los obtenidos en el

presente trabajo, ya que Fanny fue medianamente resistente a estos linajes.

Las variedades costarricenses tuvieron comportamientos similares, siendo

ambas altamente resistentes a los linajes evaluados, resultados que concuerdan

con los obtenidos por Turcios (2016), donde Palmar 18 y CR-5272 fueron

resistentes al linaje CRL-9A. Esto comprueba que tal y como se indica en sus

características varietales, Palmar 18 es tolerante a la enfermedad (ONS 2014). Sin

embargo, CR-5272 es susceptible a este hongo según dichas características (ONS

2014) y lo confirman Muñoz (2003) y Arroyo (2004), las cuales encontraron

comportamiento susceptible de CR-5272 al 75% de los linajes evaluados,

incluyendo a CRL-2, CRL-3 y CRL-9A.

29

El comportamiento de las variedades Fanny y CR-5272 no concuerda con

sus características varietales y estudios previos, los cuales indican que son

altamente susceptibles a los linajes evaluados. Según Rodríguez (1971), para que

se desarrolle la lesión de tipo susceptible, los tejidos foliares deben estar expuestos

al menos entre 8 y 10 horas a 100% de humedad relativa y con temperaturas

alrededor de 25°C, por lo que se debería de monitorear las condiciones del

invernadero y dentro de la cámara para verificar que las condiciones se den.

Los diferenciales internacionales presentaron comportamientos distintos,

siendo IRBLi-F5 altamente resistente a los tres linajes, mientras que IRBLk-ka fue

altamente resistente a CRL-2 y posee resistencia media a CRL-3 y CRL-9A, con

valores de AFA similares a los obtenidos por Fanny. Los cultivares diferenciales son

un grupo de variedades desarrolladas a partir de una variedad sin genes de

resistencia, a la cual se le adiciona un gen de resistencia identificado (Telebanco-

Yanoria et al. 2010, Silva et al. 2011). Estas variedades se utilizan para identificar

el espectro de virulencia de los monospóricos, permitiendo clasificarlos en razas o

patotipos (Zeigler et al. 1995). Los resultados obtenidos por los diferenciales

permiten identificar comportamientos hospedero-patógeno, tales como,

interacciones incompatibles entre IRBLi-F5 y CRL-2, CRL-3 y CRL-9A, e IRBLk-ka

y CRL-2, lo que indica que los tres linajes son avirulentos al gen Pii, y CRL-2 también

lo es al gen Pik presentes en los diferenciales, lo que daría pie a la posibilidad de

que los materiales criollos presenten los genes Pii y Pik dentro de su genoma.

En cuanto a las variedades criollas, todas fueron altamente resistentes a los

tres linajes evaluados, obteniendo valores de área foliar afectada cercana a 0% en

todos los casos. El comportamiento más destacado lo presentaron Beto Bolas, Nira

Blanco, Pai Caracol, Picaporte, Punta Morada, Rosita, Texas, Tres Mesinos y Tres

Mesinos Colorado, las cuales presentaron valores de FR de 100%. Resultados

similares, pero en condiciones de campo, obtuvo Tinoco (2013, 2014), donde se

evaluaron un total de 42 variedades criollas, entre las que se incluyeron Nira

Colorado, Texas y Tres Mesinos, las cuales no presentaron lesiones visibles, y en

términos generales, únicamente la variedad Curime superó el 6% de área foliar

30

afectada, siendo los restantes, incluyendo a Chin-chin, altamente resistentes al

inóculo presente en la región de Upala. Cabe destacar que en pruebas de virulencia

paralelas a este ensayo, utilizando un aislamiento de P. oryzae colectado en campo

en el 2018 se obtuvieron resultados similares en cuanto a la resistencia de los

materiales criollos, donde todos los materiales presentaron frecuencias de

resistencia superiores al 96,6% y valores de severidad entre 0% (Nira Blanco y

Rosita) y 0,62% (Tres Mesinos Blanco).

Los resultados obtenidos en esta investigación reflejan el hecho de que las

variedades de arroz criollo se adaptadan a los entornos locales y son seleccionadas

por los agricultores para obtener buenos rendimientos con poco o ningún insumo,

lo que hace de estos materiales muy eficientes en el uso de nutrientes como el

nitrógeno (Rao et al. 2018), resistentes a plagas, enfermedades y condiciones

climáticas y de suelo propios de la zona de cultivo (Nascimento et al. 2016). Estas

características son ideales para el desarrollo de nuevas variedades para sistemas

de producción que requieran menor uso de insumos (Rao et al. 2018).

Se ha encontrado que las variedades criollas presentan una gran diversidad

genética que les permite adaptarse a las condiciones de producción de la zona en

que se cultiva (Zhang et al. 2013).

Asimismo, esta investigación apoya el potencial de los materiales criollos o

“acriollados” de arroz, tanto como donadores de genes para el desarrollo de nuevas

variedades, como fuente de alimento y progreso para los pequeños productores,

permitiéndoles obtener rendimientos aceptables (aproximadamente 3 tm/ha) con

pocos insumos (Tinoco 2013), lo que, además, reduce el impacto ambiental de estos

sistemas de producción.

Estos resultados sustentan nuevos objetivos de investigación a futuro, ya

sea, la realización de pruebas de virulencia con los restantes linajes pertenecientes

a la colección de P. oryzae y el analizado del genoma de los materiales en búsqueda

de los genes que permite combatir este y otros patógenos como parte de futuros

planes de mejoramiento. Asimismo, sería importante exponer las variedades criollas

31

al inóculo de P. oryzae aislado recientemente de campo y de distintas zonas del

país y realizar evaluaciones de virulencia en fases más tardías del desarrollo de la

planta, tales como, floración y emergencia de la panícula, dado que son clave para

la producción del arroz, en las cuales, un ataque de P. oryzae sería muy perjudicial.

Ello complementaría los resultados generados por la presente investigación.

32

8. CONCLUSIONES

1. Se determinó que los linajes CRL-2, CRL-3 y CRL-9A fueron los más aptos para

realizar pruebas de virulencia en el presente estudio, debido a que alcanzaron la

concentración de 1×105 conidios/ml.

2. Los 18 cultivares de arroz criollo costarricense evaluados fueron altamente

resistentes a los linajes CRL-2, CRL-3 y CRL-9A de P. oryzae en las pruebas de

virulencia realizadas en condiciones experimentales de invernadero, con los

materiales en etapa de 21 a 30 días de edad y una concentración del inóculo de

1×105 conidios/ml.

3. Los materiales criollos que presentaron el mejor comportamiento frente a los

linajes CRL-2, CRL-3 y CRL-9A de P. oryzae en las pruebas de virulencia realizadas

en condiciones experimentales de invernadero fueron Texas, Pai Caracol y Nira

Blanco.

4. La variedad costarricense Palmar 18 y los controles resistentes Irat 13 y Oryzica

Llanos 5 fueron altamente resistentes a los tres linajes de P. oryzae en las pruebas

de virulencia realizadas en condiciones experimentales de invernadero.

33

9. RECOMENDACIONES

1. Actualizar la colección de linajes del CIBCM con nuevos aislamientos obtenidos

de lesiones presentes en el campo que permitiría generar resultados basados en

las nuevas combinaciones genéticas de P. oryzae.

2. Evaluar el comportamiento del arroz criollo frente a nuevos aislamientos

provenientes de campo en condiciones de invernadero, así como evaluarlos en

condiciones de campo, para, de esta forma, tener un panorama más amplio de las

cualidades presentes en estos materiales.

3. Monitorear las condiciones climáticas (temperatura y humedad relativa

principalmente) presentes, tanto, en el invernadero como en la cámara durante las

pruebas de virulencia, para poder relacionarlas con el comportamiento de la

enfermedad en futuras investigaciones.

34

10. BIBLIOGRAFÍA

Arroyo, AG. 2004. Evaluación del ámbito de virulencia de 25 cultivares

monospóricos del hongo Pyricularia grisea (Cooke) Sacc., mediante ensayos

de patogenicidad en invernadero. Tesis de grado. Instituto Tecnológico de

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Bastidas, O. sf. Conteo celular con Hematocitómetro: Uso elemental del

Hematocitómetro. Technical Note - Neubauer Chamber Cell Counting.

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Chadha, S; Gopalakrishna, T. 2005. Genetic diversity of Indian isolates of rice blast

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11. ANEXOS

Anexo 1. Análisis de varianza y prueba Tukey para la prueba de producción de

conidios de los linajes de P. oryzae

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)

F.V. SC gl CM F p-valor

Modelo. 1015681476190,48 6 169280246031,75 72,78 <0,0001

Monospórico 1015681476190,48 6 169280246031,75 72,78 <0,0001

Error 81406041666,67 35 2325886904,76

Total 1097087517857,14 41

Test:Tukey Alfa=0,05 DMS=87038,95846

Error: 2325886904,7619 gl: 35

Monospórico Medias n E.E.

118-93-6 1250,00 6 19688,77 A

260-1-2 5750,00 6 19688,77 A

218-1-1 7083,33 6 19688,77 A

256-3-2 70000,00 6 19688,77 A B

222-5-1 122750,00 6 19688,77 B

13-2-3 228166,67 6 19688,77 C

222-2-5 460000,00 6 19688,77 D

Anexo 2. Análisis de varianza y prueba Tukey para la severidad en los linajes

evaluados en las pruebas de virulencia

CRL-2



Modelo. 75,28 24 3,14 4,33 <0,0001

Variedad 75,28 24 3,14 4,33 <0,0001

Error 498,04 687 0,72

Total 573,32 711


Error: 0,7249 gl: 687

Variedad Medias n E.E.

Palmar 18 0,00 22 0,18 A

Texas 0,00 29 0,16 A

Lagunero 0,00 21 0,19 A

Picaporte 0,00 30 0,16 A

Orizyca Llanos 5 0,00 30 0,16 A

Fortuna negro 3,2E-03 30 0,16 A

Irat 13 0,02 30 0,16 A

Tres Mesinos 0,02 29 0,16 A

Rosita 0,04 24 0,17 A

Tres Mesinos Blanco 0,04 28 0,16 A

Mexicano del incendio 0,05 29 0,16 A

Tres Mesinos Colorado 0,05 26 0,17 A

Nira Blanco 0,06 29 0,16 A

40

Pai Caracol 0,06 30 0,16 A

Nira Colorado 0,07 30 0,16 A

Chombo 0,08 29 0,16 A

Punta Morada 0,16 30 0,16 A

Chin-chin 0,25 29 0,16 A

Beto Bolas 0,26 29 0,16 A

IRBLi-F5 0,27 30 0,16 A

Rexorito 0,39 28 0,16 A

Chento Buril 0,40 30 0,16 A

IRBLk-ka 0,61 30 0,16 A B

CR5272 0,76 30 0,16 A B

Fanny 1,43 30 0,16 B

CRL-3



Modelo. 724,73 24 30,20 5,40 <0,0001

Variedad 724,73 24 30,20 5,40 <0,0001

Error 3797,73 679 5,59

Total 4522,46 703


Error: 5,5931 gl: 679


Rosita 0,00 24 0,48 A

Palmar 18 0,00 18 0,56 A

Rexorito 0,00 21 0,52 A

Texas 3,3E-03 30 0,43 A

Lagunero 0,01 24 0,48 A



Oryzica Llanos 5 0,05 30 0,43 A

Irat 13 0,06 30 0,43 A


Chin-chin 0,07 29 0,44 A






IRBLi-F5 0,39 30 0,43 A

Fortuna negro 0,43 30 0,43 A


Nira Colorado 0,51 30 0,43 A


Chombo 0,88 25 0,47 A

CR5272 0,96 30 0,43 A

IRBLk-ka 3,68 30 0,43 B

Fanny 3,81 30 0,43 B

41

CRL-9A



Modelo. 1417,78 24 59,07 16,00 <0,0001

Variedad 1417,78 24 59,07 16,00 <0,0001

Error 2573,66 697 3,69

Total 3991,44 721


Error: 3,6925 gl: 697


Palmar 18 0,00 30 0,35 A


Oryzica Llanos 5 0,00 30 0,35 A

IRBLi-F5 0,00 30 0,35 A


Fortuna negro 3,0E-03 30 0,35 A

Nira Colorado 4,7E-03 28 0,36 A


Rexorito 0,01 30 0,35 A



Irat 13 0,02 30 0,35 A

Texas 0,02 25 0,38 A




Rosita 0,13 30 0,35 A


Lagunero 0,15 30 0,35 A

Chombo 0,29 30 0,35 A


CR5272 0,95 30 0,35 A

Chin-chin 1,28 30 0,35 A

IRBLk-ka 4,50 30 0,35 B

Fanny 5,64 30 0,35 B

Anexo 3. Análisis de varianza y prueba Tukey para la comparativa de severidad

entre los linajes CRL-2, CRL-3 y CRL-9A



Modelo. 54,84 2 27,42 6,37 0,0017

Linaje 54,84 2 27,42 6,37 0,0017

Error 9187,70 2135 4,30

Total 9242,54 2137


Error: 4,3034 gl: 2135

Linaje Medias n E.E.

CRL-2 0,21 712 0,08 A

CRL-3 0,54 704 0,08 B

CRL-9A 0,56 722 0,08 B

UNIVERSIDAD DE COSTA RICA ESCUELA DE AGRONOMÍA

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