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UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS

“FAS-L PROMUEVE MUERTE CELULAR EN CELULAS LINFOIDES VÍA LIBERACIÓN DE ATP Y ACTIVACIÓN DE RECEPTORES

P2X7”.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Bioquímica por:

ADAM AGUIRRE DUCLER

Directores de Tesis:

Dr. Andrew Quest

Dr. Mauricio Henríquez

SANTIAGO- CHILE 2011

UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

INFORME DE APROBACIÓN

TESIS DE DOCTORADO

Se informa a la Dirección de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas que la Tesis de Doctorado presentada por el candidato:

ADAM AGUIRRE DUCLER

Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para optar al grado de Doctor en Bioquímica, en el examen de defensa de Tesis rendido el día 6 de Junio de 2011 Directores de Tesis: Dr. Andrew Quest. ___________________________ Dr. Mauricio Henríquez. ___________________________ Comisión Informante de Tesis: Dr. Jorge Martínez (Presidente). ___________________________ Dr. Juan Carlos Sáez. ___________________________ Dr. Sergio Lavanderos. ___________________________ Dr. Claudio Acuña. ___________________________

A mis hijas, Natalia y Catalina

A mi esposa Irene

A mis padres

Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Comunicaciones Celulares. Centro de

Estudios Moleculares de la Célula (CEMC). Facultad de Medicina. Universidad de

Chile. Con el financiamiento de los Proyectos FONDAP 1510006 y FONDECYT

1090071.

Agradecimientos

A mi Director de Tesis, el Dr. Andrew Quest, por darme la oportunidad de realizar

mi Tesis en su laboratorio, por la disposición para aclarar dudas y discutir

experimentos y sobre todo por contribuir en gran medida a mi formación científica

durante estos años.

A mi co-director de tesis, el Dr. Mauricio Henríquez por su buena disposición para

revisar y discutir resultados, a la Dra Lisette Leyton por contribuir en la discusión de

los resultados.

A la comisión revisora integrada por el Dr. Juan Carlos Saéz, Dr. Jorge Martínez, Dr

Sergio Lavanderos y el Dr. Claudio Acuña, por sus críticas y sugerencias que

ayudaron a mejorar mi trabajo.

A todos mis compañeros de laboratorio, especialmente a Carlos, Sergio y Álvaro. Por

la amistad y el compañerismo durante mi estadía en el laboratorio. A Lilian Corona,

por su buena disposición para ayudarme cuando lo necesité.

A mi esposa Irene, por su apoyo y paciencia durante estos años.

Los resultados y conocimientos generados de la presente Tesis dieron origen total o

parcialmente a las siguientes publicaciones y presentaciones a congresos.

Publicaciones:

Aguirre A, Henríquez M, Shoji K, Saez JC, Quest AFG. 2011. “FasL-induced death

of Jurkat cells requires caspase 8- mediated cross-talk between the two receptors Fas

and P2X7”. (En Preparación para Cell Death and Differentiation).

Marcelain K, Armisen R, Aguirre A, Ueki N, Toro J, Colmenares C, Hayman M.

2011. Chromosomal instability in mouse embryonic fibroblasts null for the

transcriptional co-repressor Ski. J Cell Physiol. 2011 Mar 16. doi:

10.1002/jcp.22733.

Presentaciones a congresos nacionales:

Aguirre A, Henríquez M, Leyton L, Quest AFG. Cross-talk between death receptors:

FasL-induced death of Jurkat T cells requires caspase-dependent liberation of ATP

and subsequent engagement of P2X7 receptors. XXIV Reunión Anual de la Sociedad

de Biología Celular de Chile. Pucón, Chile. 01 al 05 de Noviembre de 2010.

i

ÍNDICE GENERAL

ÍNDICE GENERAL i

ÍNDICE DE FIGURAS iii

ÍNDICE DE TABLAS vii

ABREVIATURAS viii

RESUMEN ix

SUMMARY xi

1. INTRODUCCIÓN 1

1.1 Receptores de muerte celular 2

1.2 El receptor Fas (CD95) 6

1.3 Apoptosis y ROS 9

1.4 ATP y el receptor P2X7 como mediador de muerte celular 10

1.5 Moduladores farmacológicos de P2X7 14

1.6 Liberación de ATP y panexinas 18

2. OBJETIVOS E HIPÓTESIS 24

2.1 Hipótesis 24

2.2 Objetivo general 24

2.3 Objetivos específicos 25

3. MATERIALES Y MÉTODOS 26

3.0.1 Reactivos 26

3.0.2 Expresión del receptor Fas (CD95) en la superficie celular 27

3.0.3 Extracción de RNA y RT-PCR para P2X7 humano y ratón 27

3.0.4 Análisis de western blot para panexina-1 y conexina-43 28

3.1 Determinar si caspasa-8 juega un rol en la muerte celular por apoptosis

en células Jurkat a través de su participación en la salida de ATP inducida

por FasL 29

3.1.1 Cultivos celulares 29

3.1.2 Ensayos de muerte celular 29

3.1.3 Medición de ATP extracelular en células tratadas con inhibidores de

caspasas 30

3.1.4 Ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) 30

3.2 Evaluar si los hemicanales formados por panexina-1 participan en la

salida de ATP mediada por la activación del receptor Fas en células

Jurkat 31

3.2.1 Ensayo de captación de bromuro de etidio 31

3.2.2 Medición de ATP extracelular 32


3.2.4 Análisis de western blot para panexina-1 y conexina-43 a distintos tiempos

ii

de estimulación con FasL 32

3.2.5 Microscopía confocal para panexina-1 y receptor Fas 32

3.2.6 Identificación de balsas lipídicas y proteínas asociadas 33

3.3 Evaluar si los receptores P2X7 participan en la ejecución del programa

apoptótico en las células Jurkat o necrótico en las células A20 34


3.3.2 Determinación de especies reactivas de oxígeno (ROS) mediante

citometría de flujo. 35

3.3.3 Análisis estadístico 35

4. RESULTADOS 37

4.1 Determinar si caspasa-8 juega un rol en la muerte celular por apoptosis

en células Jurkat a través de su participación en la salida de ATP inducida

por FasL 45

4.2 Evaluar si los hemicanales formados por panexina-1 participan en

la salida de ATP mediada por la activación del receptor Fas en células

Jurkat 57

4.3 Evaluar si los receptores P2X7 participan en la ejecución del programa

apoptótico en las células Jurkat o necrótico en las células A20 70

5 DISCUSIÓN 102

6 CONCLUSIONES 119

7 BIBLIOGRAFÍA 121

iii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Esquema de las vías apoptóticas intrínseca y extrínseca 5

Figura 2. Estructura de las caspasas 8

Figura 3. Niveles de expresión del receptor Fas en la superficie de células

Jurkat, Raji, Ramos, A20 y A20R 40

Figura 4. Expresión del receptor P2X7 en células linfoides analizadas

mediante PCR 42

Figura 5. Detección de panexina-1 y conexina-43 en células linfoides

analizadas mediante análisis de western blot 43

Figura 6. Viabilidad y muerte celular en las células Jurkat y A20

estimuladas con FasL 49

Figura 7. Muerte inducida por FasL en las células Ramos, Raji y A20R 51

Figura 8. Curso temporal de los cambios de viabilidad y muerte celular en

células Jurkat tratadas con FasL 52

Figura 9. Curso temporal de la viabilidad y muerte celular en células A20

tratadas con FasL 53

Figura 10. Cambios en los niveles de ATP extracelular inducido por FasL

en células linfoides 54

Figura 11. Cambios en los niveles de ATP extracelular inducido por

FasL en células Jurkat. 55

Figura 12. Efecto de los inhibidores de caspasas zVAD, zIETD y zDEVD

en los niveles extracelulares de ATP y viabilidad celular 56

Figura 13. Ensayo de incorporación de bromuro de etidio 61

Figura 14. Carbenoxolona (Cbx), un inhibidor de hemicanales formados por

panexina reduce los niveles de ATP extracelular. 63

Figura 15. Efecto de los inhibidores de panexina (probenecid) y

conexinas (heptanol y lantano) sobre los niveles extracelulares de ATP

iv

y viabilidad celular 64

Figura 16. Detección y colocalización de la panexina-1 y el receptor Fas

a distintos tiempos de estimulación con FasL 65

Figura 17. Detección de panexina-1 en células Jurkat a distintos tiempos


Figura 18. Detección de la conexina-43 en células Jurkat a distintos tiempos


Figura 19. Ensayos de fraccionamiento subcelular de células Jurkat

tratadas con beta-metilciclodestrina ( MCD) 68

Figura 20. Ensayos de muerte celular en presencia de -metilciclodextrina 69

Figura 21. Efecto de oATP, un inhibidor de receptores P2X7 en la viabilidad

y muerte celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat 78

Figura 22. Efecto de Brillant Blue G (BBG), un inhibidor del receptor P2X7

en la viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat 79

Figura 23. Efecto de Miriocina, un inhibidor de la vía de novo de la

producción de ceramidas, en la muerte celular por apoptosis y necrosis 80

Figura 24. Efecto de Imipramina, un inhibidor de la esfingomielinasa ácida,

en la viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat

estimuladas con FasL. 81

Figura 25. Efecto de GW4869, un inhibidor específico de la esfingomielinasa

neutra, en la viabilidad y la muerte celular por apoptosis y necrosis en las

células Jurkat estimuladas con FasL 82

Figura 26. Efecto de N-acetilcisteína (NAC) en la muerte celular por

apoptosis y necrosis en células Jurkat estimuladas con FasL 83

Figura 27. Cuantificación de ROS en células Jurkat estimuladas con FasL 84

Figura 28. Efecto de NAD+, un agonista de P2X7, en la viabilidad y muerte

celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat 85

Figura 29. Efecto de BzATP, un agonista de P2X7, en la viabilidad y

muerte celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat 86

v

Figura 30. Efecto de concentraciones altas de BzATP, un agonista de P2X7,

y FasL en la viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células

Jurkat 87

Figura 31. Efecto de concentraciones bajas BzATP, un agonista de P2X7,

y FasL en la viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en

células Jurkat 88

Figura 32. Efecto del inhibidor de P2X7, Cu2+, en la viabilidad y muerte

celular por apoptosis y necrosis 89

Figura 33. Efecto del inhibidor de caspasa 9, z-LEHD, en la viabilidad y muerte

celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat 90

Figura 34. Ensayos de muerte celular en linfocitos T CD3+ tratados con FasL 91

Figura 35. Efecto de oATP, un inhibidor de receptores P2X7 en la viabilidad

y muerte celular por apoptosis y necrosis en células A20 92

Figura 36. Efecto de Brillant Blue G (BBG), un inhibidor del receptor

P2X7 en la viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en

células A20 93

Figura 37. Efecto de suramina, un inhibidor de receptores P2, en las

células A20 estimuladas con FasL 94

Figura 38. Curso temporal del efecto de suramina en la viabilidad y muerte

celular por apoptosis y necrosis en las células A20 estimuladas con FasL 95

Figura 39. Efecto de los inhibidores de la vía de novo de la producción de

ceramidas en la viabilidad y en la muerte celular por apoptosis y necrosis 96

Figura 40. Efecto de Imipramina, un inhibidor de la esfingomielinasa ácida,

en la viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células A20



neutra, en la muerte celular por apoptosis y necrosis en las células A20


Figura 42. Curso temporal de GW4869, un inhibidor de la esfingomielinasa

neutra en la muerte celular por apoptosis y necrosis en células A20

vi


Figura 43. Efecto de N-acetilcisteína (NAC) en la muerte celular por

apoptosis y necrosis en células A20 estimuladas con FasL 100

Figura 44. Efecto de concentraciones altas de BzATP, un agonista de P2X7 y

FasL en la viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células A20 101

Figura 45. Modelo de la interacción de los receptores Fas y P2X7 en las

células Jurkat 117

Figura 46. Modelo de la interacción de los receptores Fas y P2X7 en las

células A20 118

vii

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Subtipos de receptores P2X 13

Tabla 2. La familia de las panexinas humanas 19

Tabla 3. Análisis de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del receptor

P2X7 de ratón y humano 41

Tabla 4. Resumen de la expresión de Fas, P2X7, panexina-1 y conexina-43 44

viii

ABREVIATURAS

ASM Esfingomielinasa ácida.

BBG Brilliant Blue G.

BzATP 4-benzoilbenzoil-ATP.

Cbx Carbenoxolona.

CARD Dominio de reclutamiento de caspasas.

Caspasa Proteasa cisteína-aspartato.

cFLIP Proteína celular inhibitoria FLICE.

CFTR Regulador de conductancia de transmembrana en

fibrosis quística.

Cx43 Conexina-43.

DD Dominio de muerte.

DED Dominio efector de muerte.

DISCs Complejos de señalización intracelular inductores

de muerte.

FADD Dominio de muerte asociado a el receptor Fas.

FasL Ligando de receptor Fas.

FITC Isotiocianato de Flurosceína.

GSH Glutatión reducido.

IL- Interleuquina (ej. IL-2).

LDH Láctato deshidrogenasa.

LPS Lipopolisacárido bacteriano.

NAC N-acetil cisteína.

oATP oxidado-ATP

PARP Poli ADP ribosa polimerasa.

PBS Phosphate Buffered Saline.

PE Ficoeritrina.

PI Ioduro de propidio.

Pnx Panexina.

ROS Especies reactivas del oxígeno.

TCR Receptor de células T.

TNF Factor de Necrosis Tumoral.

VRAC Canal aniónico regulado por volumen.

XIAP Proteína inhibitoria de la apoptosis ligada a X.

z-DEVD Inhibidor de caspasa-3.

z-IETD Inhibidor de caspasa-8.

z-LEHD Inhibidor de caspasa-9

z-VAD Inhibidor general de caspasas.

ix

RESUMEN

Entre los receptores de muerte celular, se describe al receptor Fas en células

linfoides como un receptor que activa tanto apoptosis como necrosis. Recientemente se

ha asociado la inducción de apoptosis con la salida de ATP vía hemicanales formados

por panexina-1 en linfocitos. Por otra parte, muchas evidencias señalan al ATP

extracelular como mediador de muerte celular, tanto por necrosis como por apoptosis,

identificándose al receptor purinérgico P2X7 como receptor de muerte, el que tiene como

único ligando biológico al ATP. En este contexto, en esta Tesis, se determinó que las

células A20 (derivadas de linfocitos B de ratón) y Jurkat (derivadas de linfocitos T

humanos), pero no Ramos, Raji (derivadas de linfocitos B humanos) y A20R (derivadas

de linfocitos B de ratón) son sensibles a FasL. En células Jurkat el tipo de muerte celular

que predominó fue la apoptosis, en cambio en A20 fue la necrosis. Solo las células

Jurkat liberaron ATP en forma significativa de manera tiempo dependiente en respuesta

a estimulación con FasL y no se obtuvo evidencia de daño en la membrana plasmática.

En estas células la liberación de ATP fue inhibida por zVAD (inhibidor general de

caspasas) y z-IETD (inhibidor de caspasa 8), pero no por zDEVD (inhibidor de caspasa

3). Además, la pre-incubación con inhibidores de hemicanales formados por panexinas

(carbenoxolona y probenecid), pero no de hemicanales formados por conexinas

(heptanol) también inhibió la liberación de ATP en respuesta a FasL. Por otra parte, en

las células Jurkat los inhibidores de los receptores P2X7, oATP y BBG, inhibieron la

muerte celular por apoptosis, en cambio los inhibidores de esfingomielinasas (miriocina,

imipramina y GW4869) no protegieron a estas células al estimularlas con FasL. En

células A20, oATP y el inhibidor de esfingomielinasa neutra (GW4869) mostraron un

efecto protector al inhibir la muerte por necrosis inducida por FasL. Además, se apreció

un efecto protector en la muerte por apoptosis al pre-tratar estas células con suramina.

En ambos tipos celulares el tratamiento con N-acetilcisteína bloqueó la generación de

especies reactivas de oxígeno (ROS) inducidas por FasL. Estos resultados representan la

primera evidencia de que se produce una cooperación entre dos receptores de muerte

x

celular, Fas y P2X7, en la ejecución de la muerte celular en células linfoides. Frente al

mismo estímulo en células A20 y Jurkat, el tipo de muerte celular y los mecanismos

involucrados son en parte distintos. En células A20, FasL gatilla muerte celular por

necrosis, que podría involucrar la participación de otros receptores P2X distintos a

P2X7. En cambio, en las células Jurkat la activación del receptor Fas por FasL lleva,

por una parte a la activación de caspasa-8 y posteriormente, a la activación de la

caspasa-3. Por otro lado, la liberación de ATP activada por caspasa-8 sería mediada por

hemicanales formados por panexina-1. Esto a su vez llevaría a la activación del receptor

P2X7, que gatillaría la muerte celular por apoptosis en un mecanismo que podría

involucrar la participación de ROS. Esto es un hallazgo importante, ya que en las células

Jurkat, que son células tipo II, además de tBID, liberan ATP vía hemicanales formados

por panexina-1 lo que también contribuiría a la amplificación de la vía intrínseca de la

apoptosis mediante la activación del receptor P2X7.

xi

SUMMARY

Fas has been described in lymphoid cells as a death receptor capable of inducing

both apoptosis and necrosis. More recently, the induction of lymphocyte apoptosis has

been associated with the release of ATP via pannexin-1. Additionally, ATP is implicated

as a mediator of cell death by both necrosis and apoptosis, via the purinergic receptor

P2X7 whose only know biological ligand is ATP. To date no evidence is available

indicating that FasL-induced cell death requires activation of P2X7 via liberation of

ATP. In this Thesis, we determined that A20 and Jurkat but not Ramos, Raji and A20R

cells were sensitive to FasL. In Jurkat cells death by apoptosis predominated, whereas in

A20 necrosis was more prevalent. Only for Jurkat cells did we observe ATP release in a

time-dependent manner in response to FasL without any evidence of damage to the

plasma membrane as assessed by measuring LDH release. In these cells, ATP release

was inhibited by zVAD (general caspase inhibitor) and z-IETD (inhibitor of caspase 8),

but not zDEVD (inhibitor of caspase 3). Furthermore, pre-incubation with inhibitors of

pannexin (carbenoxolone and probenecid), but not connexin (heptanol), also inhibited

ATP release in response to FasL. Moreover, in Jurkat cells the P2X7 inhibitors oATP

and BBG inhibited cell death by apoptosis, whereas inhibitors of sphingomyelinases

(miriocina, imipramine and GW4869) did not protect these cells. In A20 cells, oATP

and to a lesser extent the neutral sphingomyelinase inhibitor (GW4869) protected

against FasL-induced necrosis. Pre-treating these cells with suramin also reduced death

in both cell types (Jurkat, A20). Also, N-acetylcysteine protected efficiently against

FasL-induced death by blocking the generation of reactive oxygen species (ROS). These

results represent the first evidence indicating that the two death receptors, Fas and P2X7,

collaborate to promote cell death in lymphoid cells. In A20 and Jurkat cells, the type of

cell death and the mechanisms involved were somewhat different.

In A20 cells, FasL triggers cell death mainly by necrosis, which may involve the

participation of P2X receptors other than P2X7.

xii

In contrast, in Jurkat cells the activation of Fas by FasL leads to the activation of

caspase-8 and subsequently caspase-3. Additionally, caspase-8 promotes release of

ATP- through pannexin-1 channels. This in turn is suggested to lead to the activation of

P2X7, which triggers cell death by apoptosis via a mechanism that may involve ROS.

Jurkat cells are type II cells where caspase-8 dependent cleavage of BID to tBID and

activation of the intrinsic mitochondrial branch is required for successful execution of

apoptotic cell death. Thus the relevance of our finding resides in uncovering a new

connection downstream of caspase-8 to the intrinsic pathway involving pannexin-1

mediated ATP release and P2X7 activation.

1

1. INTRODUCCIÓN.

Los tres tipos de muerte celular programada (PCD) descritos son: apoptosis

(PCD I), autofagia (PCD II) y necrosis (PCD III), siendo la autofagia un proceso

descrito más recientemente que se relaciona con el fenómeno de sobrevivencia celular

frente a situaciones de estrés (Mizushima, 2007). Sin embargo, la diferencia entre los

tres tipos de muerte celular no es absoluta y se ha afirmado que existe un espectro de

formas de muerte celular que están interconectadas entre ellas. Los estudios en nuestro

laboratorio se enfocan en el análisis de las conexiones existentes entre dos de estas

formas, la apoptosis y necrosis. La apoptosis se caracteriza por la condensación de la

cromatina, fragmentación del DNA, dependencia de caspasas, exposición de

fosfatidilserina (PS), el “blebbing” (formaciones tipo ampollas en la membrana

plasmática) y la formación de cuerpos apoptóticos. En el otro extremo del espectro se

encuentra la necrosis que es caspasa-independiente, carece de condensación de la

cromatina y exposición de PS antes de la ruptura de la membrana. Por otro lado,

cambios en el volumen celular en las dos vías fundamentales son opuestos, la muerte

celular por apoptosis y en las formas parecidas a la apoptosis se asocian con disminución

del tamaño celular, mientras la necrosis se caracteriza por el hinchamiento de la célula

(Zong y Thompson, 2006).

La apoptosis puede ser ejecutada por dos vías diferentes, la vía extrínseca

(mediada por receptores de muerte) y a la vía intrínseca (endógena). En el primer caso,

la activación es dependiente de ligandos de los receptores de muerte, por ejemplo

CD95/Fas, y ocurre en la superficie de la célula. Por otra parte, la vía intrínseca es

activada en respuesta al daño que ocurre en los compartimientos intracelulares. Se

produce una señal que se transmite a la mitocondria generando cambios en el potencial

eléctrico y la permeabilidad de la membrana mitocondrial que culminan en la liberación

de moléculas al citosol. Como consecuencia se produce el ensamblaje de un complejo

multiproteíco llamado apoptosoma, el cual es necesario para la activación de las

caspasas, que finalmente llevarán a la muerte de la célula por apoptosis. En cuanto a la

2

necrosis, en el pasado fue considerada principalmente como un tipo de muerte

accidental, pero recientemente un gran número de reportes se refieren a la necrosis como

un proceso que la célula puede controlar, siendo por lo tanto un proceso activo. Es así,

como la inhibición de otras vías de muerte celular pueden llevar a la necrosis (Henríquez

et al., 2008).

En condiciones fisiológicas y patológicas las células muestran un alto grado de

flexibilidad en cuanto al tipo de muerte celular que pueden presentar, lo que da cuenta

de la existencia de una variedad de mecanismos, entre los que se incluyen la muerte

celular de tipo apoptótico, la necrosis accidental, la autofagia, o la muerte celular con

características similares a una necrosis. El tipo de muerte celular es importante en el

desencadenamiento de la respuesta inmune, ya que va a determinar el tipo de respuesta

frente a diversos antígenos, es así como la muerte celular por apoptosis participa en la

generación de mecanismos de tolerancia periférica frente, por ejemplo, antígenos

propios por lo cual este es un mecanismo activo que mantiene la homeostasis

inmunológica evitando el desarrollo de respuesta inmune activa a autoantígenos que

podría gatillar finalmente una enfermedad autoinmune. En cambio, la muerte celular por

necrosis, debido a su naturaleza inflamatoria gatilla una respuesta inmune efectora,

principalmente dada para antígenos extraños y que es la base de la repuesta inmune

adaptativa.

1.1. Receptores de muerte celular.

Los receptores de muerte son una familia de proteínas de transmembrana tipo I

caracterizada por la presencia de múltiples repeticiones ricas en cisteína en el dominio

extracelular y el módulo de interacción proteína–proteína conocido como dominio de

muerte (DD) en las colas citoplasmáticas. La función de los receptores de muerte como

sensores de superficie celular es detectar señales de peligro extracelular mediante la

unión a ligandos. Los miembros de la familia de receptores de muerte incluyen al

receptor tipo 1 del factor de necrosis tumoral (TNFR1; también conocido como DR1,

CD120a, p55 y p60), receptor Fas (DR2, APO-1 y CD95), DR3 (APO-3, LARD,

3

TRAMP y WSL1), receptor de TNF1 relacionado con el ligando inductor de apoptosis

(TRAILR1; DR4 y APO-2), TRAILR2 (DR5, KILLER y TRICK2), DR6, receptor de

ectodisplasina A (EDAR) y el receptor del factor de crecimiento nervioso de baja

afinidad (NGFp75) (Lavrik et al., 2005). Es así como la interacción con sus respectivos

ligandos, conduce a la formación de complejos de señalización intracelular inductores de

muerte (DISCs), que pueden incluir múltiples moléculas adaptadoras. Para receptores

Fas y TRAIL, el dominio de muerte asociado a Fas (FADD) es reclutado por DISC a

través de su DD C-terminal, el que interactúa a través de su dominio efector de muerte

(DED) N- terminal con el dominio efector de muerte de la pro-caspasa-8. El

reclutamiento y oligomerización de pro-caspasa-8 en el DISC resulta en su activación

autocatalítica y es crítico para la iniciación de la muerte celular (Juo et al., 1998). En

ciertos tipos celulares, conocidos como células tipo I, la activación de caspasa-8 por el

DISC puede ser suficiente para inducir la activación de caspasas efectoras río abajo,

como la caspasa-3 y la caspasa-7, y de esta manera completar la ejecución de la

apoptosis (Scaffidi et al., 1998).

En contraste, las células tipo II requieren la liberación de citocromo c

mitocondrial y la activación de la caspasa-9 para inducir apoptosis (Curtin y Cotter,

2003; Li y Yuan, 2008). En esas células la caspasa-8 y la caspasa-3 son principalmente

activadas rio abajo de la mitocondria, y la formación de DISC lleva solo a una limitada

activación de la caspasa-8 (Scaffidi et al., 1998). La caspasa-8 corta la proteína pro-

apoptótica Bid, lo que da origen a un fragmento (Bid truncado-tBid), que en la

mitocondria fomenta la liberación de citocromo c (Li et al., 1998; Luo et al., 1998; Gross

et al., 1999). Entonces, se piensa que la cantidad de caspasa-8 activa generada en el

DISC determina si la apoptosis procede por una vía que es en gran medida

independiente de alteraciones en la mitocondria (extrínseca en células tipo I) o por una

vía que es dependiente de la mitocondria (vía intrínseca en células tipo II) (Scaffidi et

al., 1998). Al evitar el daño mitochondrial en células tipo II se bloquea la activación de

las caspasas rio abajo y por lo tanto se previene la apoptosis (Scaffidi et al., 1998). Las

células tipo I evitan la mitochondria, ya que activan suficiente caspasa-8 en el DISC, por

4

lo que activan a la caspasa-3 en forma independiente de cualquier alteración

mitocondrial (Scaffidi et al., 1998). La definición original de vía intrínseca y extrínseca

de la vía apoptótica está basada en el análisis de la señalización del receptor Fas en

cuatro diferentes líneas celulares, dos tipo I (H9 y SKW6.4) y dos tipo II (Jurkat y CEM)

(Scaffidi et al., 1998). Sólo en las células tipo II, la sobreexpresión de Bcl-2 o Bcl-xL

previene la activación de caspasa-8 y caspasa-3, como también el fenotipo apoptótico

(Scaffidi et al., 1998). En las células Jurkat, que son tipo II, se ha demostrado que la

activación del receptor Fas produce la liberación del citocromo c como resultado de la

inducción de la transición de la permeabilidad mitocondrial (MPT) (Tafani et al., 2002).

Por otra parte, la apoptosis puede ser bloqueada a distintos niveles por diversos

mecanismos. Es así como la activacion de caspasa 8 por DISC puede ser bloqueada por

c-FLIP. A nivel de mRNA, existen en múltiples variantes de splicing de c-FLIP,

mientras que a nivel de proteínas solo se han descrito 3 isoformas, c-FLIPL (L = Largo),

c-FLIPS (S = corto), y c-FLIPR, (R = Raji) (Krueger et al., 2001; Golks et al., 2005).

Otro grupo de inhibidores de caspasas, corresponde a la proteína inhibitoria de la

apoptosis ligada al cromosoma X (XIAPs) las que bloquean la activación de caspasas

por unión directa a caspasas-3, -7 y -9. Además existen inhibidores de XIAP, como

SMAC, que inhiben la acción de XIAPs y de esta forma promueven la apoptosis. A nivel

mitocondrial, la proporción entre miembros de la familia Bcl-2 pro-apoptóticos y anti-

apoptóticos definen la muerte o no de las células. La sobreexpresión de miembros anti-

apoptotic de la familia Bcl-2, como Bcl-2 y Bcl-xL bloquean la liberación de citocromo

c desde la mitocondria y, por lo tanto, la formación del apoptosoma y la activación de la

caspasa-9, lo que es requerido para la inducción de la apoptosis (Lavrik, 2010).

La Figura 1 corresponde a un esquema de la vía extrínseca e intrínseca de la

apoptosis, se muestran también en que puntos estas vías pueden ser inhibida ya sea por

cFLIP (proteína celular inhibitoria FLICE) o XIAP (proteína inhibitoria de la apoptosis

ligada al cromosoma X) (Lavrik, 2010).

5

Activadores de la vía

extrínseca: ligandos de muerteLigandos de muerte

Receptores de muerte

Procaspasa-8/10

Caspasa-8/10

Procaspasa-3/6/7

Caspasa-3/6/7

Sustratos de Apoptosis

Apoptosoma

Caspasa-9

Activadores de la vía

intrínseca: radiación,

daño al DNA y otros factores

Apoptosis

Figura 1: Esquema de las vías apoptóticas intrínseca y extrínseca. En la vía

extrínseca, la estimulación con un ligando de muerte (como FasL) sobre su receptor

correspondiente (Fas), conduce a la formación de complejos de señalización intracelular

inductores de muerte (DISCs), donde se lleva a cabo la activación de pro-caspasa-8 y

pro-caspasa-10. El corte de caspasa-8/10 lleva por lo tanto a la activación de las caspasas

efectoras. La activación de procaspasa-8 en el DISC puede ser bloqueado por proteínas

c-FLIP. La activación de las caspasas-3, -7, y -9 en el citosol puede ser bloqueada por

XIAPs. A su vez, la acción XIAP puede ser bloqueada por Smac/DIABLO. La vía

intrínseca se inicia con la liberación del citocromo c de la mitocondria, seguido por la

formación del apoptosoma, activación de caspasa, y corte de los sustratos de caspasas,

que conduce a la destrucción de la célula (Tomado de Lavrik, 2010).

Adicionalmente, en los últimos años, se ha acumulado evidencias que apoyan la

existencia de una vía de muerte celular programada que es independiente de caspasas

(CI-PCD). Esa vía es probable que esté actuando como un sistema de “copia de

seguridad” de muerte celular que asegura la eliminación efectiva de células defectuosas

6

desde el organismo. En forma muy similar a la apoptosis, es decir; muerte celular

programada dependiente de caspasas (CD-PCD), la mitocondria es el principal organelo

que organizan una serie de eventos que son requeridos para la inducción de la CI-PCD.

Además, las proteínas pro-apoptóticas Bax y Bid son participantes claves en la CI-PCD.

Sin embargo, a diferencia de CD-PCD, CI-PCD involucra la participación de ejecutantes

distintos a las caspasas, entre los que se incluyen a las catepsinas, las calpainas y las

serina proteasas. El factor inductor de apoptosis (AIF) puede también jugar un rol

importante en la inducción de CI-PCD (Constantinou et al., 2009). AIF fue descubierto

como la primera proteína que media la muerte celular independiente de caspasas.

Inicialmente se describió como una proteína soluble que reside en el espacio

intermembranoso de la mitocondria, en presencia de un estímulo apoptótico, AIF sufre

proteólisis y transloca al núcleo donde, participar en la fragmentación del DNA y la

condensación de la cromatina en una forma independiente de caspasas. Posteriormente,

se demostró que AIF está anclado por su extremo N-terminal a la membrana interna

mitocondrial desde donde es liberada al citosol. Además de jugar un papel clave en la

ejecución de la muerte celular independiente de caspasas, AIF ha emergido como una

proteína crítica para la sobrevida celular. De hecho, se ha propuesto que la proteína

regula la cadena respiratoria indirectamente a través del ensamblaje y/o estabilización de

los complejos I y III (Norberg et al., 2010).

1.2. El receptor Fas (CD95).

Fas es el miembro mejor caracterizado de la superfamilia de receptores del

factor de necrosis tumoral (TNF). Su principal función y a la vez la mejor entendida es

la inducción de la apoptosis. El receptor Fas se expresa en la superficie de las células

como un homotrímero pre-asociado, que es la estructura también de varios miembros de

superfamilia del receptor de TNF. Esas interacciones son mediadas por un dominio rico

en cisteína en el extremo amino terminal (Kischkel et al, 1995; Peter y Krammer, 2003).

La activación del receptor Fas por el ligando de Fas (FasL) inicia una cascada de

caspasas que culminan en la apoptosis de las células sensibles. Las caspasas son cisteinil

7

aspartato proteinasas (cisteína proteasas que cortan sus sustratos después de un residuo

de Asp), son sintetizadas como zimógenos inactivos que contienen un prodominio, una

región grande, y una región pequeña. La activación de los zimógenos, por corte

proteolítico separa la región grande y pequeña, generando las subunidades p20 y p10,

respectivamente, y remueve el prodominio. Las caspasas reconocen al menos cuatro

aminoácidos contiguos en sus sustratos, P4–P3–P2–P1, y cortan después del residuo C-

terminal (P1), usualmente en un residuo de Asp (Li y Yuan, 2008). La Figura 2

corresponde al esquema de las caspasas donde se muestra su clasificación y estructura

(Lavrik et al., 2005).

Al menos cuatro pasos individuales se han identificado en las células sensibles a

Fas posterior a la activación del receptor de Fas con FasL: (1) Inmediatamente a la

ligación del receptor de Fas con Fas ligando, micro agregados del receptor de Fas se

forman en la superficie celular independiente de la actividad de caspasas. (2)

Posteriormente, ocurre el ensamblaje de DISC en las células tipo I y esto es dependiente

de la reorganización de los filamentos de actina del citoesqueleto. La activación de

caspasa-8 ocurre a continuación de la formación de DISC y regula directamente la

formación de grandes agregados del receptor de Fas en la membrana plasmática de las

células e incrementa la actividad de DISC. (3) El ensamblaje de los componentes del

DISC-Fas es un evento altamente organizado e involucra la agrupación secuencial de

proteínas adaptadoras y efectoras en los agregados del receptor Fas. FADD es reclutado

y se une a los DD intracelulares del receptor Fas en respuesta a la oligomerización del

receptor. (4) Finalmente, esos grandes agregados del receptor de Fas son endocitados y

reciclados. En cambio, en las células tipo II se activa menos caspasa-8 en DISC y la

producción de ceramida es un paso necesario para la generación de grandes agregados

de receptores en los rafts lipídicos (Gloire et al., 2008).

8

Figura 2: Estructura de las caspasas. (A) Existen tres grupos principales de caspasas.

Grupo I: caspasas inflamatorias, grupo II: caspasas iniciadoras de apoptosis; grupo III:

caspasas efectoras de la apoptosis. Se indican el dominio de reclutamiento de caspasas

(CARD), el dominio efector de muerte (DED), la subunidade grande (p20) y pequeña

catalítica (p10). (B) Esquema de la activación de la pro-caspasa. El corte de la pro-

caspasa en las uniones específicas Asp-X conduce a la formación de la caspasa madura,

que comprende los heterotetrámero p202-p102, y la liberación del prodominio. Los

residuos aminoacídicos implicados en la formación del sitio activo se indican con

flechas (Tomado de Lavrik et al., 2005).

9

1.3. Apoptosis y ROS.

La homeostasis de las células T se logra por un equilibrio entre la producción y

proliferación de las células T con la muerte celular por apoptosis. Varios mecanismos

inductores de muerte y señales, como el estrés oxidativo, daño en el DNA, TNF-

alteraciones hormonales (por ejemplo, de los glucocorticoides y), y el aumento en la

expresión de los receptores y ligandos de muerte se han propuesto como implicados en

la apoptosis de linfocitos (Krüger et al., 2009). La activación de células T naive por el

antígeno, en el contexto de las moléculas del complejo mayor de histocompatibildad

(MHC), resulta en la expansión masiva de las células T antígeno-específica y la

producción de especies reactivas del oxígeno (ROS), siendo las mitocondrias una

importante fuente de ROS. Después de la expansión, la mayoría de las células T mueren

por apoptosis, mientras que un porcentaje bajo de ellos sobreviven y se diferencian en

células T de memoria. Es cada vez más claro que los ROS puede afectar esta decisión

sensibilizando a las células T a la apoptosis. Curiosamente, los ROS afectan tanto la vía

apoptótica intrínseca como la extrínseca, a través de la modulación de la expresión de las

moléculas más importantes de estas vías, Bcl-2 y FasL (Tripathi y Hildeman, 2004).

ROS pueden influir en la apoptosis de los linfocitos en ciertas etapas y en diferentes vías

(Tripathi y Hildeman, 2004) reduciendo el contenido de Bcl-2 celular y directamente

despolarizando la membrana mitocondrial externa (Denning et al., 2002). También se ha

demostrado el entrecruzamiento de ROS con la vía extrínseca de apoptosis por

modulación de la expresión de FasL (Krüger et al., 2009). Altos niveles de ROS

promueven peroxidación lipídica, daño macromolecular y muerte celular por necrosis.

Por otra parte, niveles bajos de ROS promueven cambios en la señalización celular que

conducen a la apoptosis. Así, los niveles intracelulares de ROS pueden dictar el tipo de

muerte que sufrirá la célula, que puede variar entre la necrosis y la apoptosis (Kannan y

Jain, 2000).

Experimentos con N-acetil cisteína (NAC) sugieren la relevancia de la formación

de ROS asociada con la apoptosis de los linfocitos T en tejidos. NAC rápidamente entra

en los linfocitos donde se hidroliza liberando cisteína, el sustrato limitante de la

10

velocidad en la síntesis de glutatión (GSH). El mantenimiento de la concentración de

GSH afecta a la apoptosis inducida por ROS porque GSH es el principal determinante

del potencial redox intracelular (Sen, 1999). Por lo tanto, los antioxidantes pueden

funcionar revirtiendo la disminución en la expresión de Bcl-2 inducida por ROS y de

esta manera evitan la apoptosis. Estos efectos parecen ser consistentes en neuronas

primarias expuestos a los antioxidantes, así como las células T primarias, lo que sugiere

un mecanismo potencialmente conservado (Tripathi y Hildeman, 2004).

En nuestro laboratorio se ha evaluado el efecto protector de NAC en células

Jurkat y A20 tratadas con 100 M de ceramida por 6 h utilizando dihidrorodamina como

indicador de ROS, los que son rápidamente detectados dentro de 30 minutos en

respuesta al tratamiento con ceramida. Este incremento de ROS se reduce

significativamente con los antioxidantes que protegen contra la muerte celular inducida

por la ceramida, como NAC y Tirón, pero no Trolox (Villena et al., 2008).

1.4. ATP y el receptor P2X7 como mediador de muerte celular.

El ATP extracelular (ATPe) es utilizado por las células para la comunicación

célula-célula, como se ha demostrado, por ejemplo, en el sistema inmune donde es

liberado por las células T y juega un papel clave en la señalización del receptor de

células T (TCR) (Schenk et al., 2008). Además, otros estudios demuestran que el ATP

liberado por bacterias comensales dirige la diferenciación de linfocitos T intestinales

hacia un fenotipo conocido como T helper 17 (Th17) (Atarashi et al., 2008).

La concentración intracelulare de ATP en las células en reposo varía entre 3 a 10 mM,

mientras que el ATPe es ~10 nM, que es mantenidó como resultado de la actividad de

ecto-apirasas y ectoadenosina trifosfatasas (ecto-ATPasas), las cuales metabolizan el

ATP en ADP, AMP, y adenosina (Trautmann, 2009). En el caso de la muerte celular, el

ATP sería el mediador tanto de necrosis como apoptosis, identificándose como receptor

de muerte al receptor purinérgico P2X7, cuyo único ligando biológico es ATP (North,

2002).

11

El receptor P2X7 pertenece a una familia de los cuales se han clonado y

caracterizado siete diferentes receptores (P2X1–7). Estos receptores inotrópicos son

estructuralmente relacionados con la familia de ENaC/degenerinas, que son una familia

de genes que codifican para canales de sodio involucrados en varias funciones celulares

en metazoos, incluyendo la necrosis programada (Driscoll y Gerstbrein, 2003).

Predicciones estructurales revelan que contienen dos regiones de transmembrana,

presentan el extremo amino y carboxilo en el lado intracelular de la membrana; poseen

un gran asa extracelular (que comprende cerca de dos tercios de la masa molecular) que

contiene 10 cisteínas conservadas, que son responsables de la formación de los puentes

disúlfuros, sitios putativos de glicosilación y un motivo de unión a ATP. Después de la

unión del agonista, estos receptores oligomerizan formando un canal catiónico no

selectivo. Este canal es permeable a cationes monovalentes como K+, Na

+ o H

+, como

también a cationes divalentes como Ca2+

. El proceso de oligomerización es pobremente

entendido, pero se cree que participarían tres subunidades que forman un canal

funcional. Se pueden formar homo-oligómeros o hetero-oligómeros y, en el último caso,

sólo algunas combinaciones son posibles. Los receptores P2X comparten un 30–50% de

identidad en su secuencia de aminoácidos y el receptor P2X7 es el menos relacionado

con el resto de los receptores (Chow et al., 1997; Virginio et al., 1999). De hecho, el

receptor P2X7, debido a sus propiedades únicas, fue originalmente descrito como subtipo

(P2Z) independiente del resto de los receptores purinérgicos. P2Z se identificó

inicialmente como un receptor expresado en células del sistema immune con la

capacidad de formar un poro permeable a moléculas relativamente grandes (mayores a ∼

900 Da) que media la muerte celular por apoptosis y/o necrosis (Di Virgilio et al., 1998).

Este receptor tiene baja afinidad para ATP y no se desensibiliza rápidamente, lo que no

se relaciona con las características de los receptores de la familia P2X. Entre los

agonistas sintéticos, se describe el análogo de ATP 2´,3´-O-(4-benzoyl-benzoyl) ATP

(BzATP) que es considerablemente más potente que el ATP mismo sobre el receptor

P2X7 (Young et al., 2007), y entre los bloqueadores, se encuentra el ATP oxidado

(oATP) y KN-62 (North, 2002).

12

Sin embargo, el clonamiento posterior de este receptor llevó a su inclusión en la

familia P2X y se le denominó como el receptor P2X7. El receptor P2X7 se expresa en

células hematopoiéticas como los eritrocitos, macrófagos, linfocitos, neutrófilos o

timocitos, pero también es abundante en otros tejidos o tipos celulares, como las

neuronas, fibroblastos, músculo liso, endotelio y células epiteliales (Tabla 1). Como se

mencionó anteriormente, los receptores P2X7 tienen bajo grado de homología estructural

entre los receptores P2X y es muy poco probable que formen heterómeros con otras

subunidades P2X. Este receptor tiene un extremo -COOH considerablemente más grande

que otros miembros de la familia P2X. Esta característica estructural está relacionada

estrechamente con su capacidad de formar un poro e inducir la muerte celular: los

receptores P2X7 expresados heterologamente y que carecen del gran extremo -COOH

retienen la función de canal pero no forman el poro ni gatillan la apoptosis y/o necrosis o

el “blebbing” de membrana (Garcia-Marcos et al, 2006).

13

Subtipo de Ligando Fisiológico Distribución en células

receptor P2 inmunes

P2X1 ATP (EC50: 0.05–1 μM) neutrófilos, monocitos,

macrófagos, células

dendríticas,

linfocitos T, células NK.

P2X2 ATP (EC50: 1–30 μM)

P2X3 ATP (EC50: 0.3–1 μM)

P2X4 ATP (EC50: 1–10 μM) neutrófilos, monocitos


dendríticas,

linfocitos T, células NK.



dendríticas,

linfocitos T.

P2X6 ATP (EC50: 1–12 μM)



dendríticas,

linfocitos T, linfocitos B,

células NK.

Tabla 1. Subtipos de receptores P2X. Se indica la afinidad estimada para sus ligandos

fisiológicos y su distribución en células del sistema immune (Modificado de Bours et

al., 2006).

Se ha identificado, en la membrana plasmática de glándula submandibular de

rata, la existencia de dos poblaciones de receptores purinérgicos P2X7. Una población

que migra en gradientes de sacarosa junto con dominios de membrana ricos en colesterol

denominados balsas lipídicas (“rafts”); la segunda población migra con la mayoría de las

proteínas de las fracciones más densas, además esta distribución de los receptores P2X7

se afecta claramente por la ruptura de los “rafts” con -metilciclodextrina ( MCD), que

remueve el colesterol de la membrana. Esto es consistente con los reportes de otros

14

autores, que sugieren que los receptores P2X7 se distribuyen entre los dominios “raft” y

no “raft” de la membrana plasmática. En relación a ésto, al estimular los receptores

P2X7 con ATP, se observa un incremento en el contenido celular de ceramida, pero solo

ocurre en las fracciones “raft”, y no en las fracciones no “raft”. De hecho, el ATP

incrementa selectivamente la actividad de la esfingomielinasa neutra (N-SMasa), una

enzima localizada en “rafts” (Veldman et al., 2001). Por lo tanto, en la glándula salival

de rata, los receptores presentes en los microdominios no “raft” estarían involucrados en

la formación de un canal catiónico no selectivo que es independiente de la hidrólisis de

esfingomielina y la activación de fosfolipasa A2 (PLA2). Los receptores presentes en

“rafts” regulan la actividad de N-SMasa, iniciando una cascada que lleva a la activación

de PLA2 (Garcia-Marcos et al., 2006).

Dependiendo del tipo celular, la activación del receptor P2X7 media procesos

biológicos como la liberación de citoquinas y la muerte de bacterias patogénas. También

se ha propuesto que el receptor P2X7 juega un rol relevante en la muerte celular gatillada

por ATP, ya sea por necrosis y/o apoptosis en varios tipos celulares, incluyendo células

mieloides, células dendríticas, timocitos, y macrófagos. La estimulación de los

receptores P2X7 por ATP extracelular desencadena varios eventos de señalización

intracelular, entre los cuales se encuentra la activación de proteínas kinasas activadas por

estrés, kinasas reguladas extracelularmente 1/2 (ERK 1,2), caspasas y fosfolipasa D. Sin

embargo, las vías de señalización que llevan a la muerte celular necrótica inducida por

ATP no son del todo entendidas (Raymond y Le Stunff, 2006).

1.5. Moduladores fisiológicos y farmacológicos del receptor P2X7.

Los receptores P2X7 son distintos de otros receptores P2X, ya que son

potentemente inhibidos por concentraciones micromolares de Zn2+

y Cu2+

. Las bases

moleculares de esta inhibición no son claras, y se ha propuesto que ocurre una

interacción directa con Zn2+

y Cu2+

en algunos residuos de ectodominio del receptor

P2X7 (Virginio et al., 1999). Se describen catorce posibles residuos de interacción en

todos los receptores P2X7 de mamíferos, ninguno de los cuales es homólogo a los sitios

15

previamente identificados en otros receptores P2X. Las sustituciones de alanina en His62

o Asp197

disminuyen el efecto inhibitorio de Zn2+

y Cu2+

y el doble mutante

[H62A/D197A] es prácticamente insensible al efecto inhibitorio del Zn2+

y Cu2+

. Por lo

tanto, esta se debe a una interacción directa de estos cationes divalentes con los residuos

del ectodominio del receptor P2X7 (Acuña-Castillo, 2007; Liu et al., 2008).

La inhibición de los receptores P2X7 por Zn2+

y Cu2+

tiene una importancia

fisiológica significativa. Por ejemplo, los receptores P2X7 se expresan en los astrocitos y

células gliales de cerebro en el que son cada vez más conocidos en participar en

procesos de señalización, tales como la liberación de neurotransmisores (Duan y Neary,

2006). Las concentraciones locales de Zn2+

y Cu2+

que se libera desde las terminaciones

nerviosas se encuentran en el rango de 10 a 100 M (Kardos et al, 1989; Li et al., 2001)

y pueden llegar a los astrocitos y células gliales, localizados en las cercanías y por lo

tanto pueden inhibir los receptores P2X7. Los receptores P2X7 se expresan también en

las células inmunes y son importantes para la fisiología y la patología de estas células.

En condiciones de infección y/o inflamación, el Cu2+

se encuentra en concentraciones

micromolares y es esencial para la proliferación de células T y para que neutrófilos

generen superóxido para poder eliminar los microorganismos ingeridos (Percival, 1998).

En resumen, existen pruebas directas que demuestran que el efecto inhibitorio de

Zn2+

y Cu2+

se debe a una interacción directa con los residuos en el ectodominio del

receptor P2X7, principalmente relativa a la interacción combinada con His62

y Asp197

, y

que este mecanismo de regulación podría ser fisiológicamente relevante.

Por otra parte, el control eficaz de la población y la función de las células Treg,

es necesario para garantizar un equilibrio entre la tolerancia y la respuesta inmune.

Nucleótidos extracelulares pueden desempeñar un papel central en este proceso. En

particular, el ATP y la nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) liberado por lisis

celular o bien por mecanismos no líticos (Bruzzone et al., 2001; Contreras et al., 2002)

pueden activar los receptores P2X7 e inducir la muerte de las células T (Seman et al.,

2003; Scheuplein et al., 2009). La mono-ADP-ribosiltransferasa (ART) ART2.2 cataliza

la transferencia covalente del grupo ADP-ribosa del NAD+ a los residuos de arginina

125

16

de P2X7 y otras proteínas de superficie en las células T (Seman et al., 2003; Adriouch et

al., 2005).

En consecuencia, el NAD+ liberado durante la inflamación participa en la

regulación de la homeostasis de las células T in vivo a través de un mecanismo

dependiente de ART2.2 y mediado por el receptor P2X7 en un proceso que ahora se

conoce como muerte celular inducida por NAD+ (NICD) (Seman et al., 2003; Adriouch

et al., 2005). NICD es controlada en parte por la NAD-CD38 glicohidrolasa, lo que

limita la disponibilidad de sustrato para ART2.2 debido a la hidrólisis extracelular de

NAD+ (Krebs et al., 2005). Se ha demostrado que el NAD

+ endógeno controla el pool de

células T Foxp3+ por un proceso dependiente de ART2/P2X7 ya que el NAD

+ liberado

durante la preparación de linfocitos primarios afecta profundamente el fenotipo y

función de las células Treg. Además, esto sugiere que es posible manipular las células

Treg in vivo a través de la vía ART2- P2X7: es así como el anticuerpo ART2.2, que

bloquea el dominio único (SDAB), se puede utilizar para proteger a las células Treg de

la muerte celular inducida por NAD+, mientras que por el contrario, el NAD

+ se puede

utilizar para disminuir la función de las células Treg y promover respuestas

antitumorales (Hubert et al., 2010)

En cuanto a los inhibidores farmacológicos, la breve activación con agonistas

(<10 s) de receptores P2X7 resulta en la apertura rápida y reversible del canal que es

permeable a Na+, K

+ y Ca

2+. La activación aguda de P2X7 también gatilla una serie de

respuestas celulares, como la activación de caspasas, liberación de citoquinas,

proliferación celular y apoptosis (North, 2002; Kahlenberg y Dubyak; 2004). A

diferencia de otros miembros de superfamilia de receptores P2, los receptores P2X7

homoméricos son activados por altas concentraciones de ATP and 2´,3´-O-(4-

benzoilbenzoil)-ATP (BzATP), el cual tiene significativamente más potencia (EC50=20

M) que ATP (EC50>100 M) (Jacobson et al., 2002). Aunque BzATP es el más potente

agonista del receptor P2X7, no es un agonista selectivo para este receptor. BzATP es

100–1000 veces más potente como agonista para P2X1 y P2X3 que para P2X7 (Bianchi

et al., 1999).

17

Dentro de los antagonistas no selectivos de los receptores P2X se encuentra la

suramina y el piridoxalfosfato-6-azofeni-2´,4´-disulfonato (PPADS), ambos bloquean

receptores P2X7 con baja afinidad y muestran típicamente un antagonismo no

competitivo (Jacobson et al., 2002). Por otra parte, ATP 2´,3´-dialdehido (oxidized-ATP,

oATP) es un inhibidor irreversible de receptores P2X7 que requiere entre 1 a 2 h de

incubación para inhibir activación funcional de receptores P2X7 (Di Virgilio, 2003), sin

embargo, es importante destacar que oATP tiene muchas otras acciones farmacológicas

que incluyen el bloqueo de P2X1 y P2X2 como también la inhibición del factor nuclear

B (NF- B) y la liberación de citoquinas (Ferrari et al., 2006).

Otro inhibidor de los receptores P2X7 es Brilliant Blue G (BBG), el cual es un

potente y selectivo antagonista. Su selectividad es 30 a 50 veces más por el receptor

P2X7 de rata que de humano (Jiang et al., 2000). La baja toxicidad y la alta selectividad

hacen de este compuesto sea un candidato ideal para bloquear los efectos adversos de la

activación de los receptores P2X7 en las regiones peritraumáticas después de daño

espinal agudo (Peng et al., 2009). La perspectiva de la administración de una droga

neuroprotectiva que no tiene efectos adversos conocidos es particularmente atractiva en

la terapia de daño agudo por trauma, considerando que no hay tratamientos efectivos

para el daño medular agudo, además del uso de esteroides. En el modelo de rata de daño

espinal agudo, el tratamiento temprano con BBG significativamente mejora la

recuperación funcional y reduce la respuesta inflamatoria post-traumática y la pérdida de

tejido. La administración endovenosa (EV) de BBG significativamente reduce la

severidad del daño de la médula espinal sin evidencia de toxicidad, es importante

remarcar que BBG deriva de un aditivo ampliamente utilizado en comidas y presenta

ventajas con respecto a oATP, además de ser más específico atraviesa la barrera

hematoencefálica (Peng et al., 2009).

Entre los mecanismos de modulación de la inflamación e inmunidad in vivo está

la expresión de CD39 en diversos tipos celulares. CD39 es una ecto-nucleotidasa con

actividad ADPasa y ATPasa, que se encuentra en la superficie de células endoteliales,

linfocitos normales, células de Langerhans, entre otros tipos celulares (Marcus et al.,

18

2003). CD39 se expresa en linfocitos B periféricos y débilmente en linfocitos B de la

zona marginal, pero no en linfocitos B de los centros germinales (Ingvarsson et al.,

1999). Su principal función en la superficie de las células endoteliales es disminuir la

activación de plaquetas y el reclutamiento celular. En leucocitos, la enzima tiene una

variedad de otros efectos, incluyendo la modulación de expresión de citoquinas y la

respuesta inflamatoria como también la adhesión célula-célula (Langston et al., 2003).

CD39 rápidamente metaboliza el ADP producido por el metabolismo de ATP. La

enzima es usualmente más eficiente en metabolizar ADP que ATP (Gayle et al., 1998).

1.6. Liberación de ATP y panexinas.

Los mecanismos descritos de liberación de ATP al espacio extracelular son

variados. Entre ellos, diferentes canales han sido implicados en este proceso, incluyendo

CFTR (regulador de conductancia de transmembrana en fibrosis quística), hemicanales

formados por conexina-43 (Cx43), un canal aniónico regulado por volumen (VRAC) y

el receptor purinérgico P2X7. Recientemente se ha documentado, en base a sus

propiedades biofísicas y su patrón de expresión, la participación de las panexinas en este

proceso (Maroto y Hamill, 2001; Bal-Price et al., 2002; Parpura et al., 2004). Las

panexinas (panx) son una familia de glicoproteínas compuestas por tres miembros

(panx1, panx2, panx3) que tienen baja homología en secuencia pero estructuralmente

son muy similares con una familia de glicoproteínas de invertebrados, las inexinas, las

cuales forman uniones en hendidura (“gap junctions”) en tejidos de invertebrados

(Locovei et al., 2006a; Scemes et al., 2009) (Tabla 2). La panexina-1 se expresa en la

mayoría de las células y tejidos examinados, en cambio la panexina-2 se expresa solo en

cerebro y panexina-3 se expresa en forma predominante en piel y tejido conectivo

(Pelegrin y Surprenant, 2006).

19

Gen Panexina peso molecular (kDa) Cromosoma

de la glicoproteína

PNX1 Pnx1 48 11q21

PNX2 Pnx2 73 22q13

PNX3 Pnx3 45 11q24

Tabla 2. La familia de las panexinas humanas (Modificado de Scemes et al., 2009).

El patrón de expresión de la panexina-1 en la mayoría de los tejidos y tipos

celulares sugiere que los hemicanales formados por panexina-1 pueden corresponder a

una de las vías más ampliamente usadas para la salida de ATP en respuesta a

señalización paracrina y autocrina (Dubyak, 2009). Varios estímulos intra y

extracelulares inducen la liberación de ATP. Sin embargo, el estrés mecánico es un

estímulo primario para la liberación de ATP en muchos tipos celulares, incluyendo a los

eritrocitos y células epiteliales alveolares (Shestopalova y Panchinc, 2008). Un

mecanismo eficiente de liberación debe involucrar un canal que sea mecano sensible y

permeable a ATP y los hemicanales formados por panexina-1 cumplen con esas

especificaciones. También se ha demostrado que panexina-1 forma un complejo con el

receptor purinérgico P2X7 (Pelegrin y Surprenant, 2006). Además, la salida de ATP en

eritrocitos puede ser inhibida por carbenoxolona (un inhibidor de panexinas

ampliamente utilizado). Además carbenoxolona inhibe el ingreso de moléculas

fluorescentes trazadoras de permeabilidad, como la carboxifluoresceina, se da bajo

condiciones de liberación de ATP. Otro inhibidor conocido de hemicanales formados

por la panexina-1 es el probenecid, un compuesto usado por mucho tiempo para el

tratamiento de la gota y que se piensa que actúa inhibiendo transportadores aniónicos de

la membrana plasmática, se ha demostrado recientemente que bloquea hemicanales

formados por panexina-1 sin inhibir a los hemicanales formados por conexinas

(Silverman et al., 2008). Por el contrario, los hemicanales formados por panexina-1 son

insensibles a variaciones en las concentraciones de Ca2+

extracelular (Bruzzone et al.

20

2005; Pelegrin y Surprenant, 2006) y son relativamentes insensibles a La3+

, heptanol y

ácido flufenámico (Bruzzone et al., 2005; Pelegrin y Suprenant, 2006).

Se ha descrito la participación de los hemicanales formados por panexinas en la

liberación de ATP en linfocitos activados. Esta liberación de ATP es a través de

hemicanales formados por panexina-1, que actuaría como una señal coestimuladora

autocrina esencial a través de receptores purinérgicos P2X. Por PCR tiempo real e

inmunohistoquímica se ha descrito que las células Jurkat y los linfocitos T CD4+

humanos expresan receptores P2X7 y su estimulación en células T (TCR) gatilla la

liberación rápida de ATP (<100 M). Esta liberación de ATP se requiere para la entrada

de Ca2+

, activación de NFAT y producción de IL-2 (Yip et al., 2009). La inhibición de

esta vía de señalización in vitro resulta en disminución en la secreción de interleukina-2

(IL-2) y también en disminución de la proliferación de los linfocitos, lo que lleva a

anergia. Debido a que los hemicanales formados por panexina-1 se asocian directamente

con el receptor P2X7, se ha planteado que la liberación de ATP a través de esta vía

puede alcanzar una concentración suficientemente alta en la proximidad del receptor

P2X7, para inducir su activación (Schenk et al, 2008). En relación a ésto, estudios

previos demuestran que la estimulación prolongada del receptor P2X7 con altas

concentraciones de ATP induce apoptosis (Tsukimoto et al., 2006; Yoon et al., 2007),

estimulaciones transitorias de células T con bajas concentraciones de ATP, como las

secretadas en forma autocrina o paracrina, pueden estimular la proliferación de células T

(Adinolfi et al., 2002). En contraste, la apoptosis inducida por activación del receptor

P2X7 en células T CD4+ y CD8+ ocurre solo cuando el ATP extracelular excede los 100

M (Aswad y Dennert, 2006).

Otro mecanismo identificado en linfocitos que está involucrado en la liberación

de ATP corresponde al dependiente de vesículas. Para estudiar dicho fenómeno, se

analizó el efecto de brefeldina A y bafilomicina, encontrándose que la liberación de ATP

durante la activación de linfocitos murinos fue significativamente disminuida por

bafilomycina A y brefeldina A. El tratamiento con esos inhibidores también bloquea la

liberación de ATP en células Jurkat, como también en las células murinas, sugiriendo

21

que la exocitosis vesicular está involucrada en la liberación de ATP tanto en células T

murinas y en células T de linfoma humano (Tokunaga et al., 2010).

Además, en linfocitos la liberación de ATP sería dependiente de la actividad de

caspasas, es así como se ha descrito que la remoción por fagocitosis de células

apoptóticas ocurre eficientemente in vivo en tejidos en los cuales se presenta apoptosis

significativa, como es el caso del timo, pero que a pesar de ésto muy pocas células

apoptóticas son detectadas. Esto se pensó que se debería a la liberación de señales por

parte de las células apoptóticas y que reclutarían células fagocíticas tales como

monocitos, macrófagos y células dendríticas, que removerían rápidamente las células

muertas. Recientemente se han identificado nucleótidos extracelulares como señales

críticas de identificación de células apoptóticas, demostrándose la liberación de ATP y

UTP dependiente de caspasas durante las etapas tempranas de la apoptosis en timocitos

primarios y líneas celulares, como es el caso de células Jurkat en las cuales se induce

apoptosis mediante el receptor Fas y radiación ultravioleta. Además, no se producen

aumentos en la permeabilidad de la membrana plasmática o salida de marcadores

citoplasmáticos cuando se recuperan los sobrenadantes. Por otra parte, sobrenadantes de

células pre-tratadas con el inhibitor general de caspasas zVAD antes de la inducción de

apoptosis no inducen la migración de monocitos, lo que sugiere que la liberación de

quemoatractantes es un proceso regulado y dependiente de caspasas. En un estudio del

curso temporal, la liberación de factores quemoatractantes se correlaciona con el inicio y

la progresión de la apoptosis, evaluado por la unión de anexina-V a la fosfatidilserina

expuesta al exterior en las células apoptóticas, y la actividad caspasa-3/7 (Elliot et al.,

2009).

En nuestro laboratorio se ha demostrando que linfocitos neoplásicos estimulados

con ligando de Fas, también mueren por necrosis lo que involucra la activación de

caspasa-8, sin mediar activación de caspasas efectoras como caspasa-3, asociando a las

ceramidas como mediadoras del proceso. En células Jurkat y A20 (linfocitos B

derivados de linfoma B de ratón) Fas induce muerte celular por apoptosis y necrosis

dependiente de caspasa-8 con externalización de fosfatidilserina y producción retardada

22

de ceramida, respectivamente (Hetz et al., 2002). Sin embargo, las células Raji

(linfocitos B derivados de linfoma B de humanos) carecen de la actividad escramblasa

para lípidos en la membrana plasmática. Por lo tanto, los niveles de ceramida no se

incrementan en respuesta a la activación por Fas y como consecuencia no habría

disponibilidad de sustrato para la producción de ceramidas por las esfingomielinasas

neutras (Tepper et al., 2000). Las células Raji, a diferencia de las células A20 y Jurkat

no presentan necrosis inducida por Fas, lo cual apoya el concepto que la producción

tardía de ceramidas sería la responsable de la necrosis. Consistente con esta

interpretación, el tratamiento con ceramidas permeables y esfingomielinasas bacterianas

gatilla la necrosis en las células Raji (Hetz el al., 2002). Además, se ha identificado a la

mitocondria como uno de los principales blancos de las ceramidas permeables, las que

promueven disfunción mitocondrial, formación de ROS, y muerte celular por necrosis.

Que las ceramidas induzcan muerte celular por apoptosis, vías no apoptóticas o ambas

está determinado por factores complejos, incluyendo el tipo celular y el medio ambiente

que rodea a la célula. Por lo tanto, la depleción de ATP, que sigue a la producción

mitocondrial de ROS inducida por ceramida es la principal causa que induce necrosis

mediada por ceramida en células linfoides. Entonces, mientras la formación de ceramida

se ha asociado frecuentemente con apoptosis, es posible que la producción regulada de

ceramida en o cerca de la mitocondria represente a un mecanismo fisiológico relevante

que promueve la ejecución de formas alternativas de muerte celular, como la necrosis

(Villena et al., 2008).

Basándonos en la discusión bibliográfica presentada y los resultados previos

publicados por nuestro laboratorio, en los que se demuestra que en los linfocitos

neoplásicos estimulados con ligando de Fas se induce muerte celular programada, por

necrosis o por apoptosis; postulamos que esta última forma de muerte celular ocurre en

forma dependiente de la salida de ATP, que sería dependiente de caspasa-8 y que podría

involucrar a hemicanales formados por panexinas, y como consecuencia de esto se

produciría la liberación de ATP, lo que llevaría a la activación del receptor P2X7 y

posteriormente la activación de caspasa-9, que finalmente llevar a la muerte celular por

23

apoptosis. En conjunto, los antecedentes sugieren que existiría una interacción entre los

dos receptores de muerte descritos, Fas y receptores P2X7, lo cual constituye una

descripción novedosa de un mecanismo que lleva a la muerte en células tipo II.

24

2. OBJETIVOS E HIPÓTESIS.

2.1. Hipótesis.

“La activación de caspasa-8 por FasL induce liberación de ATP vía hemicanales

formados por panexinas, lo que activa al receptor P2X7 promoviendo la muerte celular

en linfocitos neoplásicos humanos”.

2.2. Objetivo General.

Caracterizar la relación de receptores P2X7 con el tipo de muerte celular inducida por el

ligando de Fas en linfocitos T (Jurkat) y B neoplásicos (A20).

25

2.3. Objetivos Específicos.

2.3.1. Determinar si caspasa-8 juega un rol en la muerte celular por apoptosis en células

Jurkat a través de su participación en la salida de ATP inducida por FasL.

2.3.2. Evaluar si los hemicanales formados por panexina-1 participan en la salida de

ATP mediada por la activación del receptor Fas en células Jurkat.

2.3.3. Evaluar si los receptores P2X7 participan en la ejecución del programa apoptótico

en las células Jurkat o necrótico en las células A20.

26

3. MATERIALES Y METODOS.

3.0.1. Reactivos.

Los anticuerpos policlonales de conejo anti- -actina (A5060) se obtuvieron de

R&D System (Minneapolis, USA), el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Fas humano

(11-0959-71) marcado con FITC de eBioscience (San Diego, CA, USA), el anticuerpo

monoclonal de hamster anti-Fas de ratón (554257) marcado con FITC de BD

Pharmingen (USA). El kit de quimioluminiscencia EZ-ECL (20-500-120) se obtuvo de

Biological Industries (Kibbutz Beit Haemek, Israel). El reactivo Trizol (15596-026) se

obtuvo de Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). Los antibióticos

penicilina/streptomicina (15140) y los medios de cultivo RPMI 1640 (31800-022) y

DMEM High (12800-017) se obtuvieron de Gibco-BRL (Paisley, Scotland, UK). El

suero feral bovino (04-001-1A) era de Biological Industries (Kibbutz Beit Haemek,

Israel). El FasL recombinante humano (522-020-C005) se obtuvo de Apotech SA

(Geneva, Switzerland). Los inhibidores de caspasa-3 zDEVD (FMK004), caspasa-8

zIETD (FMK007), caspasa-9 z-LEHD (FMK008) y general de caspasas zVAD

(FMK001) se obtuvieron de R&D System (Minneapolis, USA).

Respecto a los inhibidores, N-acetil-L-cisteína (112422) se obtuvo de Merck, el

inhibidor de la esfingomielinasa neutra GW4869 (567715) de Calbiochem, Ebselen

(A4744) de AppliChem (Germany). Carbenoxolona (C4790), probenecid (P8761), La3+

(694908), heptanol (72954), suramina (S2671), y los inhibidores de esfingomielinasas

imipramina (I-7379), fumonisina B1 (F1147) y miriocina (M1177) de Sigma (Saint

Louis, Missouri, USA). Brillant Blue G (AB00325) de American Bioanalytical (Natick,

MA, USA). El CuCl2 (C6641), NAD+ (N7004) y Bz-ATP (B6396) de Sigma (Saint

Louis, Missouri, USA). Los kits Cell Titer Glo (G5421) y CytoTox-ONE (G7890) se

obtuvieron de Promega (Woods Hollow Road, Madison, USA).

Considerando que hay diferencias en la expresión de estos receptores en las distintas

líneas celulares y que explicarían diferencias también en la sensibilidad a FasL. Previo al

27

desarrollo de los Objetivos Específicos, las distintas líneas celulares (Jurkat, Ramos,

Raji, A20 y A20R) fueron caracterizadas en cuanto a la expresión de los receptores Fas,

además del receptor P2X7, panexina 1 y conexina-43.

3.0.2. Expresión del receptor Fas (CD95) en la superficie celular.

Mediante citometría de flujo las distintas líneas celulares fueron caracterizadas

fenotípicamente en cuanto a la expresión de Fas en la superficie celular, para ello se

utilizaron anticuerpos monoclonales (mAb) anti-Fas humano (eBioscience, San Diego,

CA, USA) y de ratón (BD Pharmingen, USA) conjugado con isotiocianato de

fluoresceina (FITC). Brevemente, 2x105 células fueron centrifugadas a 150g por 5 min a

4ºC, lavadas con PBS e incubadas con el anticuerpo anti-Fas-FITC por 30 min a 4ºC.

Finalmente, las células fueron lavadas 3 veces con PBS y fijadas con 1,0 % (v/v)

paraformaldehido en PBS y analizadas en el citómetro de flujo FACScanto

(FACSCalibur, Becton Dickinson, USA). El análisis de los datos se realizó mediante el

programa FCS express.

3.0.3. Extracción de RNA y RT-PCR para P2X7 humano y ratón.

En primer lugar se realizó un análisis de secuencias de nucleótidos y

aminoácidos del receptor P2X7 de ratón y humano utilizando el programa Clustalw2.

El RNA de las células (A20, A20R, Jurkat, Raji y Ramos) se extrajo utilizando el

reactivo comercial Trizol (Invitrogen, USA) de acuerdo a las instrucciones del

fabricante. Se utilizó 1 ml de reactivo para cada placa de 6 cm de diámetro. La

concentración de RNA se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm y se confirmó su

integridad mediante su migración electroforética en geles de agarosa al 2% con bromuro

de etidio. Posteriormente, se realizó la reacción de transcriptasa reversa en un volumen

total de 20 l: RNA total 1 g, 2 l de partidores al azar (50 ng/ml) y agua nanopura

hasta completar un volumen de 11 l. Luego se incubó a 70ºC durante 5 min y

posteriormente en hielo por 10 min. Después se agregó la siguiente mezcla: dNTPs 10

28

mM, tampón (Tris HCl 50 mM pH 8,3, KCl 75 mM, MgCl2 3 mM, DTT 10 mM) y 10

U/ml de transcriptasa inversa AMV (Promega, USA).

Los cDNA de las distintas líneas celulares fueron amplificados usando los

partidores específicos para el receptor P2X7 de humano (sense:

TCCGAGAAACAGGCGATAA; y antisense: ACTCGCACTTCTTCCTGTA) y ratón

(sense: GCTTTGCTTTGGTGAGCGAT; y antisense:

TGCACTTGGCCTTCTGACTT), con productos de amplificado de 456 y 223 pb,

respectivamente. Todos los productos de reacción fueron analizados después de 25-30

ciclos de amplificación. Cada ciclo estuvo dado por pasos consecutivos de 1 min a 94ºC,

56ºC (Tm) y 72ºC. Los productos de PCR fueron analizados en geles de agarosa al 2%.

3.0.4. Análisis de western blot para panexina-1 y conexina-43.

Las distintas líneas celulares (Jurkat, Raji, Ramos, A20 y A20R) fueron

resuspendidas en una solución que contenía una mezcla de M-PER y el coctel de

inhibidores de proteasa Halt (Thermo Scientific). La cuantificación de proteínas se

realizó mediante el método Bradford (Bio-Rad, USA). Un total 100 µg de proteínas de

cada muestra se resuspendió en tampón Laemmli y se almacenó -80°C. Posteriormente,

las alicuotas de 100 g de las distintas líneas celulares fueron analizadas mediante un gel

de SDS-polyacrilamida al 10%. Solo las muestras para conexinas se hierven por 3 min.

Para inmunoblots, las proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa

(Immobilon-P; Millipore, Bedford, MA), la unión proteíca no específica se bloqueó por

3 h en PBS/5% leche. Posteriormente, se incubó con anticuerpos policlonales anti-

panexina 1 (Pnx1) o anti conexina-43 toda la noche a 4 ºC. Después, las membranas se

lavaron 4 veces con PBS por 15 min cada vez y se incubaron por 1 h a temperatura

ambiente con el anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado con HRP

(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, U.K.). La detección se realizó mediante el

kit SuperSignal, de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Pierce, Rockford, IL).

29

3.1. Determinar si caspasa-8 juega un rol en la muerte celular por apoptosis en

células Jurkat a través de su participación en la salida de ATP inducida por FasL.

3.1.1. Cultivos celulares.

Las células A20 (linfocitos B derivados de linfoma B de ratón) y A20R

(linfocitos B derivados de linfoma B de ratón) se cultivaron en DMEM (4,5 g glucosa/lt)

suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB), 10.000 U/ml de penicilina, 10

μg/ml de estreptomicina y 50 μM de -mercaptoetanol a 37°C y 5% CO2. Las células

Jurkat (linfocitos T derivados de leucemia aguda de humano), Raji (linfocitos B

derivados de linfoma B de humano) y Ramos (linfocitos B derivados de linfoma B de

humano) se cultivaron en RPMI (1,8 g/lt de glucosa) suplementado con 10% de suero

fetal bovino (SFB), 10.000 U/ml penicilina y 10 μg/ml de estreptomicina.

3.1.2. Ensayos de muerte celular.

Para los ensayos de muerte celular, las células A20, A20R, Jurkat, Raji y Ramos

se cultivaron en placas de 96 pocillos fondo plano a una concentración de 50.000

células/pocillo en 100 l de medio suplementado con 10% SFB. Las células fueron

estimuladas con FasL (0-80 ng/ml) (Alexis Biochemicals, Switzerland) por 16 h a 37°C.

Se incluyó también células Jurkat tratadas con el inhibidor genérico de caspasas (z-

VAD) (20 M) y los inhibidores específicos de caspasa-8 (z-IETD) (20 y 50 M),

caspasa-3 (z-DEVD) (20 y 50 M) y caspasa-9 z-LEHD (20 y 50 M) (R&D System,

USA), y posteriormente fueron estimuladas con FasL. Además, en el caso de las células

Jurkat y A20 se realizó una cinética cada 3 h hasta 12 h con 20 y 40 ng/ml de FasL,

respectivamente. Se incluyó la cuantificación de fosfatidilserina mediante detección con

Anexina V (Becton Dickinson, USA) mediante citometría de flujo en las células Jurkat.

Las células se recuperaron y lavaron con 200 l de tampón FACS Flow (Becton

Dickinson, USA), se centrifugaron a 150g por 5 min y posteriormente se agregó yoduro

de propidio (PI) (10 g/ml) (Sigma, USA). Las células se analizaron en el citómetro de

flujo (FACScanto, Becton Dickinson, USA). Las células impermeables a PI (PI

30

negativo) fueron consideradas viables y las dos poblaciones de células muertas

permeables a PI (PI positiva) fueron diferenciadas en base a la intensidad de

fluorescencia, correspondiendo a células apoptóticas o necróticas (Hetz et al., 2002). Los

resultados se analizaron mediante el programa FCS Express.

3.1.3. Medición de ATP extracelular en células tratadas con inhibidores de caspasas.

El contenido extracelular de ATP se cuantificó utilizando un ensayo de

luminescencia (Cell-Titer Glo Kit, Promega). Para estos ensayos, las células A20, A20R,

Jurkat, Raji y Ramos se cultivaron en una placa de 96 pocillos fondo plano a una

concentración de 50.000 células/pocillo en 100 l de medio sin suero fetal bovino para

evitar la acción de ectonucleotidasas que degradan el ATP. Además, se agregó el

inhibidor de nucleotidasas Epselen (30 M) (AppliChem, USA) 10 min antes del

estímulo. Las células se trataron con los inhibidores de caspasas zVAD (20 M), zIETD

(20 M) y zDEVD (20 M) (R&D System, USA), y posteriormente fueron estimuladas

con FasL (80 ng/ml) por 5 h (a intervalos de 1 h) a 37°C. Posterior a la incubación de las

células, se recuperó el sobrenadante al cual se agregó a tubos eppendorf, se

centrifugaron a 150g por 5 min a 4ºC. Posteriormente, se recuperó el sobrenadante el

cual se colocó en una placa opaca de 96 pocillos y se diluyeron con igual volumen de

CellTiter-Glo. La luminescencia final fue cuantificada en un contador de microplacas

(Biotek, Instrument, Inc) y los resultados se expresaron como nM de ATP, debido a que

se utilizó una curva estándar con concentraciones conocidas de ATP. Se comprobó la

viabilidad mediante ensayos descritos en 3.1.2, bajo las condiciones de inhibición

mencionadas anteriormente.

3.1.4. Ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH).

La liberación de LDH se cuantificó en el sobrenadante de cultivo mediante el kit

CytoTox-OneTM

. Las células A20 y Jurkat fueron incubadas con FasL (80 ng/ml) por 5 h

(a intervalos de 1 h) a 37°C. Después de los tiempos de incubación, se agregó un

volumen igual del reactivo CytoTox-ONE™ al volumen presente en cada pocillo.

31

Además, como control de liberación de máxima de LDH se agregó en algunos pocillos

la solución de lisis (Tritón 9%), para generar un máximo de liberación de LDH

(expresado como 100%), de tal forma de presentar los resultados como porcentaje de

liberación de LDH (%).

3.2. Evaluar si los hemicanales formados por panexina-1 participan en la salida de


3.2.1. Ensayo de captación de bromuro de etidio.

La primera aproximación para determinar la participación de hemicanales

formados por panexina-1 o conexinas en la liberación de ATP fue mediante el ensayo de

captación de etidio. Para ello las células Jurkat y A20 se cultivaron en cubre objetos de

vidrio tratados con poli-L-lisina (0,01%) por 1 h, posteriormente se lavaron con solución

de registro (HANKS-HEPES: 140 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM

MgCl2, 5 mM D-glucosa y 10 mM HEPES, pH 7,4). Las células fueron incubadas en

solución de registro con 5 µM de etidio y la fluorescencia fue registrada con un

microscopio de inmersión Olympus BX51WI (Melville, NY). Las imagenes fueron

capturadas con una cámara digital monocromática modelo Q Imaging Retiga 13001 (12-

bit; Qimaging, BC, Canada) cada 5 min (tiempo de exposición = 30 ms, ganancia =

0,5). El software Metafluor (versión 6.2R5; Universal Imaging, Downingtown, PA) fue

utilizado para el análisis de las imágenes y la cuantificación de fluorescencia. Se midió 3

intensidades de fluorescencia basales cada vez (BF, expresadas como unidades

arbitrarias o AU) las cuales fueron promediadas y restadas a la intensidades de

fluorescencia de cada células a cada uno de los intervalos de tiempo (CF). Resultados de

este cálculo (CF-BF) en cada intervalo de tiempo de las células analizadas (20 como

mínimo) durante 3 h. La entrada de etidio se calculó utilizando el software Microsoft

Excel (Redmond, WA) y expresado como unidades arbitrarias. Células que presentaban

altas intensidades de fluorescencia antes de la estimulación fueron excluidas del análisis.

Las células Jurkat fueron tratadas con FasL (80 ng/ml), o pre-tratadas con probenecid (1

32

mM) o La3+

(200 M) 10 min antes de estimular las células con FasL, como control se

utilizó células tratadas con PBS. Las células A20 fueron tratadas con FasL (80 ng/ml) y

PBS también por 3 h.

3.2.2. Medición de ATP extracelular.

El contenido extracelular de ATP se cuantificó utilizando un ensayo de

luminescencia descrito en 3.1.3, en las células pre-tratadas con carbenoxolona (10 μM),

probenecid (1 mM), La3+

(200 M) o heptanol (500 M) 10 min antes de ser

estimuladas con FasL (80 ng/ml), por 5 h (a intervalos de 1 h) a 37°C.


Para los ensayos de muerte celular se utilizó el método descrito en 3.1.2 en

células pre-tratadas con o sin carbenoxolona (10 μM), probenecid (1 mM) y La3+

(200

M) los cuales se agregaron 10 min antes de estimular las células con FasL (0-80 ng/ml)

por 16 h a 37°C.

3.2.4. Análisis de western blot para panexina-1 y conexina-43 a distintos tiempos de

estimulación con FasL.

Como parte de la caracterización de los hemicanales responsables de la salida de

ATP se realizó una cinética en células Jurkat estimuladas por 0, 1, 3 y 5 h.

Posteriormente se recuperaron las células y se realizó un western blot para panexina-1 y

conexina-43 como el descrito en Materiales y Métodos.

3.2.5. Microscopía confocal para panexina-1 y receptor Fas.

Las células Jurkat se cultivaron en cubre objetos de vidrio y se fijaron con

formaldehido al 4% por 30 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se

permeabilizaron y bloquearon los sitios reactivos inespecíficos con una solución de

PBS/BSA 1% (libre de IgG)/50 mM de NH4Cl/ 0,05% Triton X-100. Además, para

bloquear los receptores Fc se utilizó una solución Fc-Block (1:100) por 45 min a

33

temperatura ambiente. Después, las muestras fueron lavadas 2 veces con PBS y se

incubaron con fragmentos F(ab´)2 anti-panexina 1 (Px1) por 12 h en solución bloqueante

a 4°C. Posteriormente, las muestras se lavaron 3 veces con solución bloqueante y se

incubaron con fragmentos F(ab´)2 de cabra anti- IgG de conejo conjugado con Cy2

(1:300) por 30 min a temperatura ambiente y se montaron con fluoromount G (Electron

Microscopy Sciences, Washington, PA), también se realizó una tinción con anticuerpos

monoclonales anti-hFas marcados con FITC (hFas-FITC). Se realizó estudios de curso

temporal en las células Jurkat estimulándolas con FasL (80 ng/ml) por 1, 3 y 5 h. Las

imágenes fueron obtenidas con un microscopio confocal (Olympus, Fluoview FV1000,

Tokio, Japan). El análisis de co-localizaciones se realizó con los programas ImageJ

(NIMH, Bethesda, MD, USA) e ImageJ JACop plugin (Bolte y Cordelieres, 2006).

3.2.6. Identificación de balsas lipídicas y proteínas asociadas.

Debido a la composición lipídica del microdominio “raft”, el colesterol se utiliza

como marcador de dichos dominios. Por lo tanto, las células Jurkat fueron marcadas con

14C-Colesterol de acuerdo a protocolos previamente descritos con algunas

modificaciones (Oram, 1986). Brevemente, 0,4 µCi de 14

C-Colesterol fue resuspendido

en RPMI 10% SFB e incubado entre 6-12 h a 37ºC. El medio marcado fue añadido a las

células que están en un 20-25% de confluencia y cultivadas durante 48 h. Pasado ese

tiempo se cambió el medio por uno fresco sin marca radioactiva por 12 h (para eliminar

el 14

C-Colesterol que no es incorporado). A fin de determinar una asociación entre los

receptores Fas y P2X7 se procedió a tratar las células Jurkat con distintas

concentraciones de beta-metilciclodextrina ( MCD) (0, 5 10 y 20 mM) por 30 min y

luego se dejaron por 16 h a fin de extrar colesterol desde la membrana plasmática.

Además se evaluó la viabilidad celular mediante ensayos de MTS. Posteriormente, las

células se someten a la purificación de las fracciones livianas de membrana mediante

extracción con Tritón X-100 en gradiente de sacarosa. Para ello, se siguió un protocolo

previamente desarrollado en nuestro laboratorio, con algunas modificaciones (Bender et

al., 2002) para aislar glicoesfingolípidos insolubles en detergente (DIGs). Todos los

34

pasos fueron hechos a 4ºC en hielo, las células Jurkat se recuperaron y se lavaron dos

veces con PBS frío. Luego se añadió 2 ml de Tampón de lisis y se procedió a remover

las células a un tubo eppendorf de 1,5 ml a 4ºC por 20 min. El lisado de células fue

transferido a un homogenizador Dounce tipo B de 15 ml, previamente enfriado, y se

homogenizó cuidadosamente 10 veces por 10 segundos (cuidando de no formar

espuma). En los tubos de propileno se agregó 0,75 ml de una solución de sacarosa 90%

en MNE pH 6,5 (MNE: 25 mM MES, 150 mM de NaCl, 2 mM EDTA). A continuación

se agregó el mismo volumen de homogenizado y se mezcló con un vortex suavemente

hasta que la solución quedó homogénea. Luego se agregó cuidadosamente, sin mezclar

fases, 1,5 ml de una solución de sacarosa 35% en MNE pH 6,5 y después 1,5 ml de una

solución de sacarosa 5% en MNE pH 6,5, formando así un gradiente discontinuo. A

continuación se colocaron los tubos dentro de los capachos de la centrífuga y se

procedió a la centrifugación en el rotor de swinging bucket (H650) por 20 h a 200.000x

g a 4ºC. Al cabo de ese tiempo se recolectaron 13 fracciones en total, 12 fracciones

(0,375 ml/tubo) y la fracción 13 correspondiente al pellet el cual fue disuelto en tampón

de lisis y sonicado. La medición del 14

C-Colesterol se realizó en viales de centelleo, a los

cuales se agregó 3 ml de solución de centelleo y 250 l de cada fracción. La

radioactividad se midió en el contador de centelleo.

3.3. Evaluar si los receptores P2X7 participan en la ejecución del programa

apoptótico en las células Jurkat o necrótico en las células A20.


Previo al estímulo con FasL se trató las células con distintos inhibidores,

incluyendo inhibidores de la via de novo de la síntesis de ceramida (Fumonisina B1 y

Miriocina), el inhibidor de la esfingomielinasa ácida (Imipramina) o el inhibidor de la

esfingomielinasa neutra (GW4869). También se realizaron ensayos de muerte celular

pre-tratando las células por 1 h con los inhibidores de receptores P2X7 oATP (600 M)

ó BBG (50 M) o el inhibidor de receptores P2 (P2X y P2Y) suramina (200 M) 30 min

35

antes de estimular con FasL. Además, las células se pre-trataron con N-acetil cisteína 45

min antes de estimularlas; células A20 (20 mM) y Jurkat (10 mM). Posteriormente, las

células fueron estimuladas con FasL (0-80 ng/ml) y las células se incubaron por 16 h a

37°C. Se realizaron cursos temporales en el caso de células A20 tratadas con GW4869 o

suramina por 12 h estimulando cada 3 h con FasL (40 ng/ml). Adicionalmente, se

trataron las células con agonistas de receptores P2X7, NAD+ (0-200 M) por 16 y 24 h,

y BzATP (0-600 M) por 16 h ya sea en ausencia o en presencia de FasL (0-80 ng/ml).

Además se utilizó como antagonista CuCl2 (0, 5 y 10 M), el cual se agregó 10 min

antes de agregar FasL (0-80 ng/ml) por 16 h. La muerte celular fue evaluada de acuerdo

a la metodología descrita en el punto 3.1.2.

3.3.2. Determinación de especies reactivas de oxígeno (ROS) mediante citometría de

flujo.

Para determinar cambios en la producción de ROS en las células Jurkat, estas se

sembraron (50.000 células/ pocillo) en placas de 96 pocillos fondo plano. Fueron

estimuladas con FasL (20 ng/ml) por 6 h (a intervalos de 1 h). Posteriormente, las

células se recuperaron y se centrifugaron a 150g por por 5 min, luego se lavaron 2 veces

con PBS y posteriormente se cargaron con la sonda Dihidrorodamina 123 (DHR,

Invitrogen) (1,4 μg/ml) en 100 l de medio RPMI 1640 sin suero. Esta sonda es

excitable a 488 nm y emite a 515 nm. Las células se incubaron con la sonda por 30 min

a 37ºC. Luego del tiempo de incubación, las células se colocaron en hielo para detener la

reacción, se lavaron 2 veces con PBS y fueron resuspendidas en 250 μl de solución

isotónica para citómetro de flujo. Las células se analizaron mediante citometría de flujo

en un FACSCanto (Becton Dickinson, USA).

3.3.3. Análisis Estadístico.

Los datos obtenidos se analizaron utilizando el test no paramétrico de Kruskall-

Wallis, análisis de t-Student y un análisis de ANOVA con un post test de Dunns. Las

36

diferencias entre los valores experimentales obtenidos se considerarán significativas con

un valor de p ≤ 0,05.

37

4. RESULTADOS.

Las distintas líneas celulares con las cuales se trabajó muestran una sensibilidad

distinta al ser estimuladas con FasL, es así como hay líneas celulares sensibles (células

A20 y Jurkat) y resistentes a dicho estímulo (Raji, Ramos y A20R). Por lo tanto, la

primera aproximación fue caracterizar en estas líneas la expresión del receptor Fas. Para

ello se utilizó anticuerpos monoclonales anti-Fas humano y de ratón marcados con FITC

(anti-hFas y anti-mFas-FITC) y mediante citometría de flujo se determinó el porcentaje

de las células que expresan dicho receptor. En la Figura 3, se muestran histogramas

representativos de cada una de las líneas celulares, Jurkat (A), Raji (B), Ramos (C), A20

(D) y A20R (E), en los cuales el color negro representa células en ausencia del

anticuerpo anti-Fas, y el color gris representa células incubadas en presencia del

anticuerpo. En las células Jurtat cerca del 80% de las células expresaron el receptor, en

las células Raji cerca del 100% de las células lo expresaron y en las células Ramos cerca

del 66% de las células expresa este receptor (Figura 3F). Las diferencias en el porcentaje

de expresión de Fas son estadísticamente significativas entre las células Raji y Ramos (p

< 0,001), no así entre Jurkat y Raji . En las células de ratón, se observa una diferencia en

cuanto a la expresión de Fas, un mayor porcentaje de las células A20 (99%) expresan

Fas en la superficie celular en comparación con las células A20R donde solo el 29% de

las células lo expresan.

Posteriormente, a partir de la secuencia de RNA mensajero, se realizó un análisis

de secuencias de nucleótidos que codifican el receptor P2X7 de ratón y humano, que

corresponde al origen de las distintas líneas celulares que utilizamos en los experimentos

que se describen (Tabla 3). Para el receptor P2X7 de ratón se describen 4 isoformas (a-d)

que difieren en el número de nucleótidos, siendo la isoforma (a) la que posee mayor

número de bases (4931 pb) y la isoforma (d) la más pequeña (824 pb) (Tabla 3A).

Mediante el programa ClustalW2 se analizó la homología a nivel de nucleótidos de la

secuencia que codifica para el receptor P2X7 de ratón y humano. Se consideró esto para

el diseño de los partidores que posteriormente se ocupó, ya que la secuencia amplificada

38

corresponde a un segmento de 223 pb que se obtiene en las 4 isoformas. Cabe destacar

que la mayor homología se da en el extremo 5´ en el caso de la secuencia nucleotídica.

También se analizó la secuencia de aminoácidos entre los receptores P2X7, encontrando

que la mayor homología es entre las distintas isoformas del receptor P2X7 de ratón. Al

comparar la secuencia del receptor P2X7 de ratón con el de humano, esta alcanza un

80% (Tabla 3B).

A partir del análisis anterior se diseñó los partidores para el receptor P2X7 de

ratón y humano. Para caracterizar las líneas celulares en cuanto a la expresión del

receptor P2X7 se realizó una reacción de PCR con partidores específicos para el receptor

P2X7 humano (Jurkat, Raji, Ramos) y de ratón (A20, A20R). La Figura 4A corresponde

a un gel de agarosa con productos de PCR generados con partidores para el receptor

P2X7 humano. Se observa la presencia de un fragmento de aproximadamente 456 pb,

que corresponde al tamaño de fragmento esperado, en las células Jurkat y Raji, no así en

las células Ramos y en las células de origen murino (A20 y A20R). La corresponde a un

gel de agarosa con productos de PCR generados con partidores para P2X7 de ratón. Se

obtuvo un producto de PCR de aproximadamente 223 pb, que corresponde al tamaño de

fragmento esperado, en las células A20 y A20R, no así en las células Jurkat, Raji,

Ramos (Figura 4B).

En cuanto a la expresión de panexina-1 y conexina-43 en los extractos celulares,

mediante análisis de western blot se detectó la presencia de estas proteínas. En el caso de

panexina-1 se detectaron distintas formas de 90, 70, 45 y 39 kDa que corresponden a

dímeros, monómeros y proteínas glicosiladas en todas las líneas celulares analizadas.

Además se incluyó un control positivo que corresponde a estracto de cerebro de rata

(Figura 5A). En cambio para conexina-43 solo se detectó una banda de 43 kDa en las

células A20 y A20R, la que no se detectó en la células Jurkat, Raji y Ramos (Figura 5B).

En resumen, se aprecian diferencias en cuanto a la expresión de Fas, receptor

P2X7 y panexina-1 en las distintas líneas celulares estudiadas. Es así como en las células

de ratón existe una mayor diferencia en cuanto a la expresión del receptor Fas en la

superficie celular siendo las células A20 las que lo expresan en mayor proporción en

39

comparación a las células A20R, lo cual no es tan marcado entre las células linfoides de

origen humano (Jurkat, Raji y Ramos). En cuanto a los receptores P2X7, solo en las

células Ramos no se detectó la presencia del mRNA del receptor P2X7. Con respecto a

la expresión de panexina-1, todas las células analizadas expresan esta proteína no

observándose una diferencia marcada entre las distintas líneas celulares. Por último, se

observó diferencias significativas en la expresión de conexina-43, ya que solo se detectó

en células B de ratón (A20, A20R) y no en células Jurkat, Ramos y Raji (Tabla 4).

40

A. B. C. D. E.

100

101

102

103

104

0

13

25

38

50

100

101

102

103

104

0

13

25

38

50

100

101

102

103

104

0

13

25

38

50

(-) anti-FasR

(+) anti-FasR

100

101

102

103

104

0

13

25

38

50

100

101

102

103

104

0

13

25

38

50

F.

Figura 3: Niveles de expresión del receptor Fas en la superficie de células Jurkat,

Raji, Ramos, A20 y A20R. Mediante citometría de flujo se detectó la expresión de Fas

en la superficie celular. Para ello las células fueron incubada con el anticuerpo

monoclonal anti-Fas humano (hFas) (Jurkat, Raji, Ramos) y anti-Fas de ratón (mFas)

(A20, A20R). Se muestran histogramas representativos para las distintas líneas celulares

(A-E), donde el color negro representa células en ausencia del anticuerpo anti-Fas y el

de color gris representa a las células incubadas en presencia del anticuerpo. La Figura

(F) corresponde al resumen de los datos donde se muestra el porcentaje de células que

expresa Fas en la superficie celular. Los resultados corresponden a tres experimentos

realizados en forma independiente (n=3). Las diferencias se consideraron

estadísticamente significativas con un p < 0,001 (***).

Jurkat Raji Ramos A20 A20R0

25

50

75

100

*** ***

Exp

resió

n d

e F

as (

%)

Count

anti-FasR

41

A.

Sec Especie Largo (nt) Sec Nombre Largo (nt) Homología(%)

============================================================================

1 m (a) 4931 2 m (b) 1633 89

1 m (a) 4931 3 m (c 2563 56

1 m (a) 4931 4 m (d) 824 64

1 m (a) 4931 6 h 3155 48

2 m (b) 1633 3 m (c) 2563 88

2 m (b) 1633 4 m (d) 824 64

2 m (b) 1633 6 h 3155 69

3 m (c) 2563 4 m (d) 824 64

3 m (c) 2563 6 h 3155 44

4 m (d) 824 6 h 3155 46

============================================================================

B.

Sec Especie Largo(aa) Sec Nombre Largo(aa) Homología(%)

============================================================================

1 m (a) 595 2 m (b) 442 97

1 m (a) 595 3 m (c) 431 99

1 m (a) 595 4 m (d) 153 79

1 m (a) 595 6 h 595 80

2 m (b) 442 3 m (c) 431 99

2 m (b) 442 4 m (d) 153 79

2 m (b) 442 6 h 595 79

3 m (c) 431 4 m (d) 153 79

3 m (c) 431 6 h 595 81

4 m (d) 153 6 h 595 67

============================================================================

Tabla 3. Análisis de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del receptor

P2X7 de ratón y humano. Mediante el programa ClustalW2 se analizó la homología a

nivel de nucleótidos (nt) (A) y secuencia de aminoácidos (aa) (B) entre los P2X7 de

ratón (m), y humano (h). Para ratón se describen 4 isoformas (a-d) que difieren entre sí

en el largo y en sus secuencias.

42

A.

A20 A20R Jurkat Raji Ramos

hP2X7

actina

B.

mP2X7

actina

A20 A20R Jurkat Raji Ramos

Figura 4. Expresión del receptor P2X7 en células linfoides analizadas mediante

PCR. Se analizó el cDNA obtenido a partir de células de origen humano (Jurkat, Raji,

Ramos) y de ratón (A20 y A20R). La Figura (A) corresponde a un gel de agarosa con

productos de PCR generados con partidores para P2X7 humano (hP2X7) donde se

observa la presencia de un fragmento de aproximadamente 456 pb, que corresponde al

tamaño de fragmento esperado, en las células Jurkat, Raji, no así en las células Ramos y

en las células de origen murino (A20 y A20R). (B) corresponde a un gel de agarosa con

productos de PCR generados con partidores para P2X7 de ratón (mP2X7), se observa la

presencia de un fragmento de aproximadamente 223 pb en las células A20, A20R, no así

en las células Jurkat, Raji y Ramos. En ambos geles se incluye el control de carga con la

detección de -actina en las distintas líneas celulares.

500 pb

300 pb

-actina

-actina

43

A.

A20 A20R Jurkat Raji Ramos C+

Tubulina

90 kDa

45 kDa

70 kDa

39 kDa

B.

A20 A20 R Jurkat Raji Ramos

43 kDa

Tubulina

Figura 5: Detección de panexina-1 y conexina-43 en células linfoides analizadas

mediante análisis de western blot. Se analizaron las proteínas obtenidas a partir de

células de origen humano (Jurkat, Raji, Ramos) y de ratón (A20 y A20R). La Figura (A)

corresponde a un inmunoblot de proteínas en el cual se detecta panexina-1, se observa la

presencia de dímeros (70 kDa), monómeros (39 kDa) y proteínas glicosiladas (45 y 90

kDa), como control positivo (C+) se uso extracto de cerebro de rata. La Figura (B)

corresponde a un inmunoblot de proteínas en el cual se detecta conexina-43 (Cx43),

observándose la presencia de una banda de aproximadamente 43 kDa. En ambos blots se

incluye el control de carga con la detección de tubulina en las distintas líneas celulares.

►

►

►

►

►

►

►

44

Línea celular Origen Tipo Celular Fas P2X7 Panexina-1 Conexina-43

Jurkat Humano LT + + + -

Raji Humano LB + + + -

Ramos Humano LB + - + -

A20 Ratón LB + + + +

A20R Ratón LB + + + +

Tabla 4. Resumen de la expresión de Fas, P2X7, panexina-1 y conexina-43. En las

líneas celulares estudiadas se analizó la presencia de cada una de las moléculas de

interés. LT (linfocito T) y LB (linfocito B).

45

4.1. Determinar si caspasa-8 juega un rol en la muerte celular por apoptosis en

células Jurkat a través de su participación en la salida de ATP inducida por FasL.

En primer lugar se realizaron ensayos de muerte celular con FasL a fin de

determinar la sensibilidad de cada una de las líneas celulares y el tipo de muerte que

predomina en las células sensibles. Para ello se cuantificó la incorporación de yoduro de

propidio (PI) mediante citometría de flujo. Las distintas líneas celulares se estimularon

por 16 h con distintas concentraciones de FasL (0-80 ng/ml). En la Figura 6A se muestra

un dot plot del análisis realizado en el cual se grafican las tres poblaciones celulares,

viables (V) apoptóticas (A) y necróticas (N). Al analizar las poblaciones celulares,

células Jurkat, Raji, Ramos, A20 y A20R (Figura 6B), se observa que existen células

resistentes al efecto de FasL a las distintas concentraciones utilizadas, estas células

corresponden a las células Raji, Ramos y A20R. En cambio las células Jurkat y A20

mostraron sensibilidad al efecto de FasL, observándose en ambos casos una disminución

de la viabilidad en forma concentración dependiente, especialmente a concentraciones

menores a 20 ng/ml, ya que a concentraciones mayores si bien se aprecia una pequeña

disminución de la viabilidad esta no fue significativa. Al analizar las distintas curvas de

viabilidad, se aprecian diferencias estadísticamente significativas (p < 0,001) entre las

células Jurkat y A20 al compararlas con las curvas de viabilidad obtenidas con las

células A20R, Raji y Ramos.

Para caracterizar las células sensibles a FasL, se usó también el ensayo de

incorporación de PI con el cual se puede discriminar si la muerte celular fue por necrosis

o apoptosis. En la Figura 6C, se observa que en las células Jurkat el principal tipo de

muerte corresponde a la apoptosis alcanzando aproximadamente un 75%, y en menor

porcentaje la necrosis (20%). Existen diferencias estadísticamente significativas entre

estos dos tipos de muerte celular al analizar las distintas concentraciones de FasL (80,

40, 20 y 5 ng/ml), p < 0,05 (*), p < 0,01 (**) y p <0,001 (***), como se describe en el

gráfico. En cambio en las células A20 (Figura 6D) esta proporción se invierte,

alcanzando la necrosis de aproximadamente un 75% y la apoptosis un 20%. En este

mismo ensayo también se caracterizó el tipo de muerte celular (Figura 7) en las células

46

Ramos (Figura 7A), Raji (Figura 7B) y A20R (Figura 7C). Estas líneas fueron

resistentes al efecto de FasL, ya que no se observó un incremento significativo (p > 0,05)

en alguno de los tipos de muerte celular a medida que aumenta la concentración de FasL

(p > 0,05).

En las células Jurkat, sensibles a FasL, se realizó un curso temporal con una

concentración fija de FasL (20 ng/ml). Se observa que a partir de las 6 h disminuye la

viabilidad (Figura 8A) y aumenta la apoptosis alcanzando el máximo a las 9 h. Además

este ensayo se comparó con la exposición de fosfatidilserina, detectada mediante

Anexina V, que es un evento característico de la apoptosis. También se observó un

incremento a partir de las 6 h alcanzando un máximo a las 9 h (Figura 8B). Por otra

parte, y tal como se demostró en la Figura 6B, en las células Jurkat la necrosis representa

un porcentaje bajo, aproximadamente un 20% (Figura 8C). El mismo curso temporal se

realizó en las células A20 (Figura 9), observándose que la viabilidad disminuyó a partir

de las 9 h, alcanzando aproximadamente a un 25% (Figura 9A). La apoptosis aumentó

sobre un 25% a las 9 h (Figura 9B) y la necrosis, que es el tipo de muerte que predomina

en estas células alcanzó a cerca del 50% a las 12 h (Figura 9C).

Según nuestra hipótesis, los linfocitos al ser estimulados con FasL liberan ATP al

medio extracelular a través de un mecanismo que podría involucrar a caspasa-8. Para

demostrar la liberación de ATP inducida por FasL se realizó ensayos de luminiscencia

de alta sensibilidad (Figura 10). Es así como en las células A20 (Figura 10A), A20R

(Figura 10B), Raji (Figura 10C) y Ramos (Figura 10D) no se observan diferencia entre

las células tratadas con FasL y PBS. En cambio, en las células Jurkat en el medio

extracelular la concentración de ATP se incrementó con el tiempo de estimulación con

FasL, alcanzando un máximo a las 5 h que fue estadísticamente significativa con

respecto a las células tratadas con PBS a las 3, 4 y 5 h (Figura 11A). Esta correlación

entre la concentración de ATP extracelular y el tiempo de estímulo con FasL no es

producto de pérdida de viabilidad y por lo tanto pérdida de la integridad de la membrana

plasmática que podría explicar la salida de ATP. Esto se demostró mediante un ensayo

de liberación de LDH, en el cual se observó que no existen diferencias entre las células

47

tratadas con PBS y las células tratadas con FasL a los distintos tiempos estudiados (0-5

h) (Figura 11B).

A continuación, teniendo en cuenta que postulamos que la caspasa-8 participaría

en la liberación de ATP en respuesta al estímulo con FasL, realizamos el mismo ensayo

para determinar niveles de ATP en el sobrenadante de células Jurkat, pero en este caso

en presencia del inhibidor general de caspasas (zVAD) (20 M), el inhibidor de caspasa-

8 (zIETD) (20 M) y el inhibidor de caspasa-3 (zDEVD) (20 M), los cuales se

agregaron en forma simultánea al estímulo con FasL (80 ng/ml). La concentración de

ATP extracelular se midió a intervalos de 1 h hasta un máximo de 5 h (Figura 12A). En

el medio de las células tratadas con FasL y zVAD o zIETD prácticamente no se detectó

cambios con el de las células no tratadas con FasL. Esto fue más evidente a las 3, 4 y 5 h

de cultivo. Además se observó que el inhibidor de caspasa 3 (zDEVD) no afectó la

concentración de ATP extracelular en células tratadas con FasL.

En paralelo se realizó un ensayo de muerte celular (Figura 12B) tratando las

células con FasL (0-80 ng/ml) solo o junto a zVAD (20 M), o zIETD (20 y 50 M) o

zDEVD (20 y 50 M) por 16 h. Posteriormente, mediante citometría de flujo se evaluó

la viabilidad celular, observándose que esta disminuyó cuando las células fueron

tratadas con FasL. Sin embargo, cuando las células fueron tratadas en forma simultánea

con zVAD (20 M) prácticamente no ocurrió pérdida de viabilidad. Además, se observó

mayor viabilidad en las células tratadas con zIETD y zDEVD (20 M), lo cual es

estadísticamente significativo a concentraciones de 20, 10 y 5 ng/ml de FasL. A

concentraciones mayores (50 M), tanto zIETD como zDEVD evitan la pérdida de

viabilidad inducida por FasL siendo estas diferencias estadísticamente significativas en

todas las concentraciones de FasL.

Por lo tanto, en los ensayos de muerte celular inducido por FasL en las distintas

líneas estudiadas hubieron células sensibles (Jurkat y A20) y resistentes (A20R, Raji y

Ramos). De las líneas sensibles, solo en las células Jurkat se detectó aumento en la

concentración extracelular de ATP dependiente de FasL en forma tiempo dependiente y

que no correspondería a pérdida de la integridad de la membrana, como se demostró en

48

el ensayo de liberación de LDH. Además, la liberación de ATP fue dependiente de la

actividad de caspasa-8, ya que al agregar un inhibidor específico (zIETD) la salida de

ATP fue comparable a la obtenida en las células tratadas con PBS. En cambio al tratar

las células con un inhibidor de caspasa 3 (zDEVD) no se observó ese efecto ya que la

concentración de ATP extracelular fue comparable a la obtenida en las células

estimuladas solo con FasL.

49

A.

PE-H

FS

C-H

100

101

102

103

104

0

256

512

768

1024

NAV

PI

B.

C. (Jurkat)

D.

(A20)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100Ramos

Raji

A20R

A20

Jurkat

*** *** *** *** ***

FasL (ng/ml)

Via

bil

idad

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100 Apoptosis

Necrosis* **

FasL (ng/ml)

Mu

ert

e c

elu

lar

(%)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100 Apoptosis

Necrosis *** *** *** **

FasL (ng/ml)

Mu

ert

e c

elu

lar

(%)

50

Figura 6. Viabilidad y muerte celular en las células Jurkat y A20 estimuladas con

FasL. En (A) se muestra un dot plot representativo del análisis de las células teñidas con

yoduro de propidio (PI). Se distingue una población negativa a PI que corresponde a las

células vivas (V) y dos poblaciones de células positivas a PI, una población hipodiploide

que corresponde a las células apoptóticas (A) y una población normoploide que

corresponde a las células necróticas (N). Las células fueron estimuladas por 16 h con

concentraciones crecientes de FasL (0-80 ng/ml). Posteriormente, las células se

marcaron con yoduro de propidio y mediante citometría de flujo se cuantifico la

viabilidad celular (B) y la muerte celular por apoptosis (■) o necrosis (○) (C y D). Esto

se realizó en las células Jurkat (▲), A20 (◊), Ramos (♦), Raji (▼) y A20R (■). Los

resultados corresponden a tres experimentos realizados en forma independiente (n=3).

Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*), p <

0,01 (**) o p < 0,001 (***).

51

A.

(Ramos)

B.

(Raji)

C.

(A20R)

Figura 7. Muerte inducida por FasL en las células Ramos, Raji y A20R. Las células

fueron tratadas por 16 h con concentraciones crecientes de FasL (0-80 ng/ml). Posterior

al estímulo, las células se tiñeron con yoduro de propidio y la cuantificación del tipo de

muerte celular se realizó mediante citometría de flujo, distinguiendo muerte celular por

apoptosis (○) y necrosis (●). Los resultados corresponden a tres experimentos realizados

en forma independiente (n=3), no observándose diferencias estadísticamente

significativas entre los dos tipos de muerte celular a las distintas concentraciones de

FasL (p > 0,05).

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100Apoptosis

Necrosis

FasL (ng/ml)

Mu

ert

e c

elu

lar

(%)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100Apoptosis

Necrosis

FasL (ng/ml)

Mu

ert

e c

elu

lar

(%)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

Apoptosis

Necrosis

FasL (ng/ml)

Mu

ert

e c

elu

lar

(%)

52

A.

B.

C.

Figura 8. Curso temporal de los cambios de viabilidad y muerte celular en células

Jurkat tratadas con FasL. Células Jurkat se trataron con FasL (20 ng/ml) por 12 h a

distintos tiempos (0, 3, 6, 9, 12 h). Posteriormente, las células se tiñeron con yoduro de

propidio y mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad (A) y la muerte celular

por apoptosis (B) y necrosis (C). En el caso de la apoptosis esta se correlacionó con la

tinción con yoduro de propidio (PI+) con la detección de fosfatidilserina mediante

anexina V (AV). Los resultados corresponden a tres experimentos realizados en forma

independiente (n=3).

0 3 6 9 120

25

50

75

100

Tiempo (h)

Via

bil

idad

(%

)

0 3 6 9 120

25

50

75

100

Tiempo (h)

AV+

PI+

Ap

op

tosis

(%

)

0 3 6 9 120

25

50

75

100

Tiempo (h)

FasL (20 ng/ml)

Necro

sis

(%

)

53

A.

B.

C.

Figura 9. Curso temporal de la viabilidad y muerte celular en células A20 tratadas

con FasL. Células A20 se trataron con FasL (40 ng/ml) por 12 h a distintos tiempos (0,

3, 6, 9, 12 h). Posteriormente, las células se tiñeron con yoduro de propidio y mediante

citometría de flujo se cuantificó la viabilidad (A) y la muerte celular por apoptosis (B) y

necrosis (C). Los resultados corresponden a tres experimentos realizados en forma

independiente (n=3).

0 3 6 9 120

25

50

75

100

Tiempo (h)

Via

bil

idad

(%

)

0 3 6 9 120

25

50

75

100

Tiempo (h)

Ap

op

tosis

(%

)

0 3 6 9 120

25

50

75

100

Tiempo (h)

FasL (40 ng/ml)

Necro

sis

(%

)

54

A. (A20) B. (A20R)

C. (Raji) D. (Ramos)

Figura 10. Cambios en los niveles de ATP extracelular inducido por FasL en

células linfoides. Mediante ensayos de luminiscencia, se cuantificó los niveles de ATP

extracelular en las células (A), A20 (B), A20R (C), Raji (D) y Ramos (E) tratadas con

FasL (80 ng/ml) (■) y PBS (□) a distintos tiempos (0-5 h). Todas las células se pre-

trataron con Ebselen (30 M) 10 min antes de estimularlas. Los resultados corresponden

a tres experimentos realizados en forma independiente (n=3).

0 1 2 3 4 50

40

80

120

160

Tiempo (h)

AT

P (

nM

)

0 1 2 3 4 5

0

40

80

120

160

Tiempo (h)

AT

P (

nM

)

0 1 2 3 4 5

0

40

80

120

160

Tiempo (h)

AT

P (

nM

)

0 1 2 3 4 5

0

40

80

120

160

Tiempo (h)

PBS

FasL (80ng/ml)

AT

P (

nM

)

55

B.

Figura 11. Cambios en los niveles de ATP extracelular inducido por FasL en

células Jurkat. Mediante ensayos de luminiscencia, se cuantificó los niveles de ATP

extracelular en las células Jurkat (A), tratadas con FasL (80 ng/ml) (■) y PBS (□) a

distintos tiempos (0-5 h). Las células se pre-trataron con Ebselen (30 M) 10 min antes

de estimularlas. Mediante un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) (F),

se analizó la integridad de la membrana plasmática entre las 0-5 h de tratamiento con

FasL, como control se utilizó células tratadas con PBS. Los resultados corresponden a

tres experimentos realizados en forma independiente (n=3). Las diferencias se

consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*).

0 1 2 3 4 50

40

80

120

160

*

**

Tiempo (h)

AT

P (

nM

)

0 1 2 3 4 5 PBS0

25

50

75

100

Tiempo (h)

Lib

era

ció

n d

e L

DH

(%

)

56

A.

B.

Figura 12. Efecto de los inhibidores de caspasas zVAD, zIETD y zDEVD en los

niveles extracelulares de ATP y viabilidad celular. Mediante ensayos de

luminiscencia (A), se cuantificó el ATP extracelular en células Jurkat tratadas a

intervalos de 1 h hasta un máximo de 5 h ya sea con FasL (80 ng/ml) (■), o con los

inhibidores de caspasas zVAD (20 M) (▲), zIETD (20 M) (▼) y zDEVD (20 M)

(○), en forma simultánea con FasL. Como control se utilizó células tratadas con PBS

(□) a los mismos tiempos. También se midió por citometría de flujo la viabilidad celular

en ausencia (◊) o presencia de zVAD (20 M) (▲), zIETD (20 M) (▼), zIETD (50

M) (Δ), zDEVD (20 M) (○) y zDEVD (50 M) (●) (B). Los resultados corresponden

a tres experimentos realizados en forma independiente (n=3). Las diferencias se

consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,05.

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100sin inhibidores

zIETD (20 M)

zVAD (20 M)

zDEVD (20 M)

zIETD (50 M)

zDEVD (50 M)

* * ** *

FasL (ng/ml)

Via

bil

idad

(%

)

0 1 2 3 4 50

50

100

150

200FasL (80 ng/ml)

zVAD (20 M) + FasL

zIETD (20 M) + FasL

zDEVD (20 M) + FasL

PBS

*

*

*

Tiempo (h)

AT

P (

nM

)

57

4.2. Evaluar si los hemicanales formados por panexina-1 participan en la salida de


En este objetivo se pretende determinar la vía de salida de ATP en linfocitos T,

en este caso en células Jurkat, las posibles vías de salida son a través de hemicanales

formados por panexina-1 o conexinas. Evidencias recientes involucran a las panexinas

en los mecanismos de liberación de ATP en linfocitos, por lo tanto al ser estimulados

con FasL podrían liberar ATP al medio extracelular (Schenk et al., 2008). La primera

aproximación fue realizar ensayos de incorporación de etidio en células Jurkat, de

manera de discriminar si la salida de ATP en respuesta a FasL es por panexina-1 o

conexinas (Figura 13). Para ello, las células fueron sembradas en cubre objetos pre-

tratados con polilisina en presencia de solución de registro HANKS con 5 M de etidio.

El registro de la fluorescencia asociada a la incorporación de etidio se realizó durante 3

h. Para ello las células Jurkat se pretrataron con 1 mM de Probenecid (inhibidor de

hemicanales formados por panexina-1) o con 200 M de La3+

(inhibidor de hemicanales

formados por conexinas) 10 minutos antes de estimular las células con FasL (80 ng/ml).

Se muestran imágenes representativas de las distintas condiciones: (A) corresponde a las

células Jurkat no tratadas a tiempo 0 y a los 180 min de incubación (B), (C) corresponde

a las células Jurkat tratadas con FasL (80 ng/ml) al tiempo 0 y a los 180 min (D).

En las células Jurkat no tratadas con FasL se observó una incorporación basal

similar al de las células pre-tratadas con probenecid y posteriormente con FasL. Por otra

parte, la mayor incorporación ocurrió en las células tratadas con FasL y las pre-tratadas

con La3+

(Figura 13E). Existen diferencias estadísticamente significativas desde los 120

min entre las células tratadas con FasL y las células tratadas con Probenecid y PBS. Lo

mismo se observó para las células pre-tratadas con La3+

y las células tratadas con

probenecid y PBS. No existen diferencias estadísticamente significativas entre las

células tratadas con FasL y pre-tratadas con lantano y posteriormente con FasL. Como

control se utilizaron células A20 que son sensibles a FasL pero en las cuales no fue

posible detectar aumentos en la concentración de ATP extracelular en respuesta a FasL

58

(Figura 10A), no observándose diferencias en la incorporación de etidio entre las células

no tratadas y tratadas con FasL (Figura 13B).

Posteriormente, se cuantificó concentración de ATP extracelular en el medio de

células tratadas con carbenoxolona (10 μM), un inhibidor de hemicanales formados por

panexinas (Figura 14). Se observó que en el medio de las células Jurkat pre-tratadas con

carbenoloxona 10 min antes de agregar FasL, la concentración de ATP fue menor que en

el sobrenadante de cultivo de las células tratadas solo con FasL. Esto fue más evidente a

las 4 y 5 h de cultivo, siendo esto estadísticamente significativo (p < 0,05) (Figura 14A).

Además, se realizaron ensayos de muerte celular, con distintas concentraciones de FasL

(0-80 ng/ml) en presencia de carbenoxolona (10 M) por 16 h, mediante citometría de

flujo se evaluó la viabilidad, no observándose protección por carbenoloxona en relación

a la muerte celular inducida con FasL (Figura 14B).

Se realizaron nuevamente ensayos de luminiscencia para detectar cambios en la

concentración extracelular de ATP en forma similar a lo realizado para cuantificar la

incorporación de etidio (Figura 13). Para ello las células Jurkat se pretrataron con

probenecid (1 mM), La3+

(200 M) o heptanol (500 M) 10 min antes de estimular las

células con FasL. Como control se utilizó células tratadas con PBS. Se observó que la

concentración de ATP extracelular en cultivos de células Jurkat pre-tratadas con

probenecid 10 min antes de agregar FasL, fue menor que en el de las células tratadas

solo con FasL. Esto fue más evidente a las 2, 3, 4 y 5 h de cultivo, siendo

estadísticamente significativo (p < 0,05). En las células pre-tratadas con La3+

se detectó

una concentración de ATP levemente superior a la detectada en el medio de células

tratadas con probenecid o PBS, lo cual podría deberse a un problema en la detección de

ATP y no por un efecto sobre los hemicanales formados por conexinas. Por esta razón,

se incluyó el heptanol como inhibidor de hemicanales formados por conexinas,

observándose que la concentración extracelular de ATP permaneció similar a la

detectada en células tratadas solo con FasL y la concentración de ATP en estas células es

mayor que el detectado en las células pre-tratadas con probenecid y PBS, lo cual fue

estadísticamente significativo (Figura 15A). Además se realizaron ensayos de muerte

59

celular en cultivos tratados con distintas concentraciones de FasL (0-80 ng/ml) en

presencia de probenecid (1 mM) y La3+

(200 M) por 16 h. Mediante citometría de flujo

se evaluó la viabilidad, no observándose protección por parte de La3+

y probenecid en

relación a la muerte celular inducida con FasL (Figura 15B).

Mediante microscopía confocal se detectó Fas y panexina-1 en células Jurkat

tratadas con FasL (80 ng/ml) por 1, 3 y 5 h (Figura 16). En el caso de panexina-1 se

detectó un aumento a las 3 h de estímulo respecto a las células no tratadas (Control).

Mediante un análisis de fluorescencia se determinó que este aumento es estadísticamente

significativo. Por el contrario, no se observaron cambios en el caso de Fas a los distintos

tiempos estudiados.

A partir del resultado anterior se realizó un curso temporal para evaluar mediante

análisis de western blot cambios en los niveles de panexina-1 y conexina-43 en las

células Jurkat no tratadas (control) y las tratadas por 0, 1, 3 y 5 h con FasL (80 ng/ml).

Se observó un aumento marcado a partir de la primera hora en la expresión de panexina-

1 en las células tratadas con FasL (80 ng/ml), llegando a una mayor expresión a las 5 h

de tratamiento (Figura 17), en cambio no se observaron diferencias en los niveles de

conexina-43 en los tiempos de tratamiento descritos con FasL para panexina-1 (Figura

18).

Los resultados microscopía confocal (Figura 16) y de análisis de western blot

(Figura 17) sugieren que existe una asociación entre los receptores Fas y P2X7 posterior

al estímulo con FasL, lo que podría ocurrir en los dominios raft de la membrana

plasmática. La siguiente aproximación experimental entonces fue tratar las células con

un agente que remueve colesterol y que por lo tanto afecta los dominios raft, en este caso

se utilizó -metilciclodextrina ( MCD). La aproximación fue tratar las células con

distintas concentraciones de MCD (0, 5, 10 y 20 mM) por 30 min, y mediante ensayos

de MTS se determinó que la viabilidad se afecta notoriamente cuando se utilizan 20 mM

de MCD (Figura 19A). Luego se determinó la distribución del colesterol en las

distintas fracciones de la membrana plasmática. Para ello, las células se marcaron con

colesterol radiactivo (C14

) por 48 h y posteriormente se realizó fraccionamiento

60

subcelular y mediante un contador de centelleo se determinó que la mayor proporción se

encuentra entre las fracciones 4 a la 6, donde se encuentran las balsas lipídicas (Figura

19B).

A partir de los resultados anteriores, el siguiente experimento fue realizar

ensayos de muerte celular en células Jurkat pre-tratadas con 5 mM de MCD por 30

min. Posteriormente, las célula se estimularon con FasL (0-10 ng/ml) por 16 h y la

viabilidad y muerte celular se determinó mediante citometría de flujo. Al igual que lo

descrito anteriormente, la viabilidad celular disminuyó cuando las células se trataron con

concentraciones crecientes de FasL, predominando la apoptosis como tipo de muerte

celular, en cambio las células pre-tratatadas con MCD tienen un mayor porcentaje de

células vivas con una disminución marcada de la apoptosis (Figura 20).

61

A. B.

C. D.

E.

(Jurkat)

F.

(A20)

0 30 60 90 120 150 1800

30

60

90

120

150

180

FasL (0 ng/ml)

FasL (80 ng/ml)

Tiempo (min)

Inte

nsid

ad

de f

luo

rescen

cia

cap

tació

n d

e E

tid

io (

UA

)

0 30 60 90 120 150 1800

30

60

90

120

150

180

FasL (0 ng/ml)

FasL (80 ng/ml)

Probenecid (1 mM) + FasL

La3+

(200 M) + FasL

* *

**

**

***

***

Tiempo (min)

Inte

nsid

ad

de f

luo

rescen

cia

cap

tació

n d

e E

tid

io (

UA

)

62

Figura 13. Ensayo de incorporación de bromuro de etidio. Mediante microscopía de

inmersión se cuantifico la intensidad de fluorescencia asociada a la incorporación de

etidio en células Jurkat y A20. Se muestran imágenes representativas de las distintas

condiciones (A-D). (A) Corresponde a las células Jurkat no tratadas a tiempo 0 y a los

180 min (B), (C) células Jurkat tratadas con FasL (80 ng/ml) al tiempo 0 y a los 180 m

(D). (E) Incorporación de etidio en las células Jurkat no tratadas (□), tratadas con FasL

(●), y pretratadas con probenecid (1 mM) (♦) o La3+

(200 M) (○) 10 min antes de tratar

las células con FasL por 180 min. También se analizaron células A20 tratadas con (●) y

sin (□) FasL (80 ng/ml) por 180 min (F). Los resultados corresponden a tres

experimentos realizados en forma independiente (n=3), donde se analizaron un mínimo

de 20 células en cada una de los ensayos. Las diferencias se consideraron

estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*).

63

A.

B.

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100 Cbx (0 M)

Cbx (10 M)

FasL (ng/ml)

Via

bli

lid

ad

(%

)

Figura 14. Carbenoxolona (Cbx), un inhibidor de hemicanales formados por

panexina reduce los niveles de ATP extracelular. Mediante ensayos de luminiscencia

(A), se cuantificó el ATP extracelular en células Jurkat tratadas a intervalos de 1 h hasta

un máximo de 5 h ya sea con FasL (80 ng/ml) (■), o carbenoloxona (Cbx) (10 M) (♦)

el cual se agregó 10 min antes de estimular las células con FasL. Como control se utilizó

células tratadas con PBS (●) a los mismos tiempos. Además, se realizaron ensayos de

muerte celular (B) tratando las células con FasL (□) y Cbx 10 minutos antes de tratar las

células con FasL (○) por 16 h. Posterior al estímulo, las células se marcaron con yoduro

de propidio y la viabilidad se cuantificó mediante citometría de flujo. Los resultados

corresponden a tres experimentos realizados en forma independiente (n=3). Las

diferencias se consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*).

0 1 2 3 4 50

50

100

150FasL (80 ng/ml)

Cbx (10 M) + FasL

PBS

**

Tiempo (h)

AT

P (

nM

)

64

A.

B.

Figura 15. Efecto de los inhibidores de panexina (probenecid) y conexinas

(heptanol y lantano) sobre los niveles extracelulares de ATP y viabilidad celular.

Mediante ensayos de luminiscencia (A), se cuantificó niveles de ATP en el sobrenadante

de células Jurkat tratadas a intervalos de 1 h hasta un máximo de 5 h ya sea con FasL (80

ng/ml) (■), La3+

(200 M) (○), heptanol (500 M) (●), probenecid (1 mM) (▼), los

cuales se agregaron 10 min antes de estimular las células con FasL. Como control se

utilizó células tratadas con PBS (□) a los mismos tiempos. Además, se realizaron

ensayos de muerte celular (B) tratando las células con FasL (♦) y probenecid (1 mM) (*)

o La3+

(200 M) (◊) 10 minutos antes de tratar las células con FasL (□) por 16 h.

Posterior al estímulo, las células se marcaron con yoduro de propidio y la viabilidad se

cuantificó mediante citometría de flujo. Los resultados corresponden a tres experimentos

realizados en forma independiente (n=3). Las diferencias se consideraron


0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100sin inhibidor

La3+

(200 M) + FasL


FasL (ng/ml)

Via

bil

idad

(%

)

0 1 2 3 4 50

50

100

150

200

250FasL (80 ng/ml)

La3+

(200 M) + FasL


PBS

Heptanol (500 M) + FasL

*

*

*

*

Tiempo (h)

AT

P (

nM

)

65

1 3

5

Control 1 3 50

50

100

150

200

250

Tiempo (h)

Px1

***

Inte

nsid

ad

de f

luo

rescen

cia

(U

A)

Basal 1 3 50

50

100

150

Tiempo (h)

Fas

Inte

nsid

ad

de f

luo

rescen

cia

(U

A)

Figura 16: Detección y colocalización de la panexina-1 y el receptor Fas a distintos

tiempos de estimulación con FasL. En células Jurkat se realizó un curso temporal de

los cambios de inmunoreactividad para cuantificar la expresión de panexina-1 (rojo) y

Fas (verde) frente al estímulo con FasL (80 ng/ml) por 1, 3 y 5 h, el control corresponde

a células no estimuladas. Se muestran las tinciones específicas para cada molécula y las

tinciones dobles en cada condición. Los gráficos representan el análisis fluorescencia del

promedio de la fluorescencia relativa de 120 células en cada condición. Las diferencias

se consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,001 (***).

66

90

70

45 39

55

FasL

kDa Ctrl 1 3 5 (h)

-actina

0 1 3 50

1

2

3

*

Tiempo (h)

Den

sid

ad

rela

tiva

Figura 17. Detección de panexina-1 en células Jurkat a distintos tiempos de

estimulación con FasL. En células Jurkat se realizó un curso temporal de los niveles de

expresión de panexina-1 luego del estímulo con FasL (80 ng/ml) a 0 (Ctlr-no

estimuladas), 1, 3 y 5 h. En (B) se muestra la cuantificación de todas las bandas con

respecto a -actina expresada en densidad relativa con respecto a las células no

estimuladas (Ctlr). Los resultados corresponden a tres experimentos realizados en forma

independiente (n=3). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a un

p < 0,05 (*).

►

►

►

►

►

67

43

FasL

kDa Ctrl 1 3 5 (h) +

Ponceau

0 1 3 50.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Tiempo (h)

Den

sid

ad

Rela

tiva

Figura 18. Detección de la conexina-43 en células Jurkat a distintos tiempos de

estimulación con FasL. En células Jurkat se realizó una cinética para cuantificar la

expresión de conexina-43 frente al estímulo con FasL (80 ng/ml) a 0 (Ctlr-no

estimuladas), 1, 3 y 5 h, como control positivo (+) se utilizó extractos de corazón de rata

(A). En (B) se muestra la cuantificación con respecto a las proteínas teñidas con rojo

Ponceau expresada en densidad relativa con respecto a las células no estimuladas (Ctlr).

Los resultados corresponden a tres experimentos realizados en forma independiente

(n=3).

►

68

A.

B.

Figura 19. Ensayos de fraccionamiento subcelular de células Jurkat tratadas con

beta-metilciclodestrina ( MCD). Las células Jurkat fueron tratadas con diferentes

concentraciones de MCD (0-20 mM) por 30 min y después de 16 h se determinó la

viabilidad mediante ensayos de MTS (A). Además, previo al tratamiento con MCD, las

células se marcaron con colesterol radiactivo (C14

) y se determinó la presencia en las

distintas fracciones (B).

0 1 5 10 200.00

0.25

0.50

0.75

1.00

-metilciclodextrina (mM)

OD

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

1000

2000

3000

4000

Tritón (1%)

Fracción de membrana

cp

m

69

Figura 20. Ensayos de muerte celular en presencia de -metilciclodextrina. Células

Jurkat fueron pre-tratadas con -metilciclodextrina (5 mM) por 30 min. Posteriormente

se trataron con FasL (0-10 ng/ml) por 16 h. Después, las células se marcaron con

yoduro de propidio y mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad celular (V)

y la muerte celular por apoptosis (A) o necrosis (N). Los resultados corresponden a dos

experimentos realizados en forma independiente (n=2).

0 1,25 2,5 5 10 0 1,25 2,5 5 100

20

40

60

80

100

V

A

N

FasL (ng/ml) 5mM MCD + FasL (ng/ml)

célu

las (

%)

70

4.3. Evaluar si los receptores P2X7 participan en la ejecución del programa

apoptótico en las células Jurkat o necrótico en las células A20.

FasL aumenta la concentración extracelular de ATP en el medio de las células

Jurkat (Figura 11) y según nuestra hipótesis este ATP podría activar a P2X7 potenciando

la respuesta de muerte celular apoptótica. Por lo tanto, las células Jurkat se trataron con

distintas concentraciones de FasL durante 16 h, con o sin pre-incubación por 1 h con

oATP (un inhibidor de receptores P2X7). Después del tiempo de estímulo, las células se

tiñeron con yoduro de propidio y la viabilidad y el tipo de muerte celular se cuantificó

mediante citometría de flujo. Después de las 16 h de incubación, las células Jurkat

mostraron una disminución de la viabilidad dependiente de la concentración de FasL.

Sin embargo, hubo reducción de la muerte celular cuando estas células fueron pre-

incubadas con oATP, observándose una mayor viabilidad que fue estadísticamente

significativa (p<0,001 y p<0,05) (Figura 21A). Paralelo a esto, determinamos el efecto

de oATP sobre la muerte celular apoptótica y necrótica. Las células Jurkat estimuladas

con FasL murieron principalmente por apoptosis, lo que aumentó en forma

concentración dependiente. Ahora, esta respuesta fue prevenida al pre-tratar las células

con oATP (Figura 21B), observándose diferencias estadísticamente significativas entre

las células estimuladas con FasL y las pre-tratadas con oATP (p < 0,05 y p < 0,01).

Además, un porcentaje bajo de células murió por necrosis que aumentó levemente a

medida que aumentó la concentración de FasL, pero al pre-tratarlas con oATP este

porcentaje de células necróticas se mantuvo constante (Figura 21C). Otro inhibidor

descrito recientemente para los receptores P2X7 es el Brillant Blue G (BBG). Por lo

tanto, se realizó en células Jurkat ensayos de muerte celular tratando las células también

por 16 h con FasL (0-80 ng/ml), o bien se pre-trató con BBG (50 M) 1 h antes de

estimularlas con FasL. Después del tiempo de estímulo, las células se tiñeron con yoduro

de propidio y la viabilidad y el tipo de muerte celular se cuantificó mediante citometría

de flujo (Figura 22). El pre-tratamiento con BBG aumentó la viabilidad en las células

Jurkat que se trataron posteriormente con FasL (Figura 22A), observándose además una

disminución marcada de la apoptosis (Figura 22B), que en ambos casos es

71

estadísticamente significativo. En cuanto a la necrosis, no se observó diferencias entre

las células tratadas con FasL y las pre-tratadas con BBG (Figura 22C).

Existen evidencias que apoyan el concepto que al estimular el receptor P2X7 se

produce formación de ceramidas mediante un incremento en la actividad de la

esfingomielinasa neutra, lo que gatillaría la muerte celular por apoptosis o necrosis

(Veldman at al., 2001; Garcia-Marcos et al., 2006). Por lo tanto, la siguiente

aproximación fue realizar los mismos ensayos de muerte celular pre-incubando 45 min

antes con los inhibidores de las distintas vías de producción de ceramidas: Miriocina (via

de novo), Imipramina (esfingomielinasa ácida) y GW4869 (esfingomielinasa neutra). En

las células Jurkat, la viabilidad celular disminuyó en forma dosis dependiente al tratar

las células con FasL y no es revertida por Miriocina (Figura 23A). Derivado de los

anterior, el tipo de muerte celular, ya sea la apoptosis (Figura 23B) o la necrosis (Figura

23C) no disminuye al pre-tratar las células con estos inhibidores. Un comportamiento

similar se observa al pre-tratar las células con el inhibidor de esfingomielinasa ácida

(Imipramina) (Figura 24), observándose disminución de la viabilidad celular que no es

revertido por el inhibidor (Figura 24A). Además se ve que el pre-tratamiento no tiene

efecto protectivo sobre la apoptosis (Figura 24B) ni la necrosis (Figura 24C). Al utilizar

GW4869 (Figura 25), se observa que al pre-tratar las células con este inhibidor no hay

mayor viabilidad (Figura 25A), ni hay efecto protectivo sobre la apoptosis (Figura 25B)

y sobre la necrosis (Figura 25C).

Por otra parte, se evaluó la capacidad protectora del antioxidante N-acetilcisteína

(NAC), ya que existen antecedentes previos del laboratorio en los cuales NAC tiene un

efecto protector en células Jurkat tratadas con ceramida (Villena et al., 2008). Por lo

tanto, las células Jurkat, fueron pre-tratadas 45 min con NAC (10 mM) antes de

agregarles FasL (0-80 ng/ml), despúes del tiempo de incubación se observó una mayor

viabilidad celular (Figura 26A) y una menor apoptosis que es estadísticamente

significativa (Figura 26B), pero no sobre la necrosis (Figura 26C).

Derivado de lo anterior es que se realizó un curso temporal para cuantificar

especies reactivas de oxígeno (ROS). Para ello, mediante citometría de flujo, se

72

cuantificó la generación de ROS mediante la sonda DHR123. Las células Jurkat se

trataron por hasta 6 h (a intervalos de 1h) con FasL (20 ng/ml) y posteriormente se

cargaron con la sonda Dihidrorodamina123 (1.4 μg/ml). Se analizó mediante citometría

de flujo, observándose un aumento en la razón células sin estímulo/células estimuladas

con FasL. A las 6 h la diferencia era estadísticamente significativa (Figura 27).

La siguiente aproximación experimental fue tratar las células Jurkat con

agonistas de P2X7, para ello se utilizó NAD+ y BzATP. En el caso de NAD

+ se ha

descrito que puede activar los receptores P2X7 e inducir la muerte de las células T

mediante un mecanismo dependiente de ART2.2. Por lo tanto, se trató las células Jurkat

con concentraciones crecientes de NAD+ (Figura 28). Se realizó ensayos de muerte

celular por 16 h con distintas concentraciones de NAD (0-20 M) y mediante citometria

de flujo se evaluó la viabilidad (V) y la muerte celular por apoptosis (A) y necrosis (N)

(Figura 28A). Se observa que no existe efecto de NAD+ sobre la viabilidad celular y

derivado de esto sobre el tipo de muerte celular. Se realizó otro experimento similar pero

utilizando mayores concentraciones de NAD+ (0-200 M) esta vez por 24 h. Pero

tampoco se ve efecto de NAD+ sobre las células Jurkat, ya que no se observó efecto

sobre la viabilidad ni el tipo de muerte celular (Figura 28B).

El siguiente experimento fue realizar ensayos de muerte celular con otro agonista

de P2X7, para ello células Jurkat y A20 se incubaron con concentraciones crecientes de

BzATP (0-600 M) por 16 h y mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad

(V) y la muerte celular ya sea por apoptosis (A) o necrosis (N). No se observó inducción

de muerte celular en las células Jurkat (Figura 29), por lo que a continuación se utilizó

las mismas concentraciones de BzATP (100, 300 y 600 M) pero en presencia de FasL

(0-80 ng/ml) en células Jurkat (Figura 30). Se observa que estas concentraciones altas de

BzATP tienen un efecto protector aumentando la viabilidad (Figura 30A) y

disminuyendo la apoptosis cuando es incubado en presencia de 20 y 40 ng/ml de FasL

(Figura 30B), pero sin efecto sobre la necrosis (Figura 30C).

A fin de clarificar el efecto observado en el experimento anterior, realizamos

nuevamente ensayos de muerte celular con FasL (0-80 ng/ml) pero en presencia de

73

concentraciones más bajas de BzATP (25 y 50 M) por 16 h. Después del tiempo de

incubación cuantificamos la viabilidad y muerte celular mediante citometria de flujo

(Figura 31). En este caso no observamos efecto protector de BzATP ya que no se

aprecian cambios en la viabilidad (Figura 31A), ni en la muerte celular por apoptosis

(Figura 31B) y necrosis (Figura 31C)

Considerando que obtuvimos efecto protector sobre la muerte celular inducida

por FasL en células Jurkat, solo con los antagonistas de P2X7 (oATP y BBG) pero no

con los agonistas (BzATP y NAD+), cabe pensar que podrían estar participando otros

receptores P2X distintos a P2X7. Por lo tanto, para descartar esto la siguiente

aproximación fue utilizar otro antagonista del receptor P2X7. Se ha descrito que los

receptores P2X7 son potentemente inhibidos por concentraciones micromolares de Cu2+

,

caracterizándose sitios de unión en el dominio extracelular del receptor P2X7. Por lo

tanto, se realizó ensayos de muerte celular utilizando citometría de flujo en células

Jurkat pre-tratadas por 10 min con Cu2+

(5 y 10 M) antes de incubarlas con

concentraciones crecientes de FasL (0-80 ng/ml) (Figura 32). Se observa un efecto

protector del Cu2+

, ya que existe una mayor viabilidad de las células Jurkat pre-tratadas

en comparación con las células tratadas solo con FasL (Figura 32A), lo que se traduce en

una menor apoptosis (Figura 32B) sin afectar la necrosis (Figura 32C).

Derivado de los resultados obtenidos con los inhibidores del receptor P2X7,

observamos que en las células Jurkat BBG, oATP y Cu2+

tienen efecto protector ya que

estas células presentan una menor apoptosis cuando se estimulan en conjunto con FasL.

Es importante señalar que en las células Jurkat predomina la apoptosis tipo II, por lo

tanto un componente importante que podría amplificar la apoptosis es la activación de

caspasa-9 como consecuencia de la salida de ATP por panexina-1 y la activación del

receptor P2X7 por el ATP. Por lo tanto, realizamos ensayos de muerte celular en células

Jurkat tratadas con el inhibidor de caspasa-9 (z-LEHD) (20 y 50 M) y con

concentraciones crecientes de FasL (0-80 ng/ml). Mediante citometría de flujo se

determinó la viabilidad y el tipo de muerte celular (Figura 33). Se aprecia que en las

células tratadas con z-LEHD existe una mayor viabilidad (Figura 33A) y una menor

74

apoptosis (Figura 33B) en comparación con las células tratadas solo con FasL, y como

era de esperar no se observó cambios en la muerte celular por necrosis (Figura 33C).

Por último, quisimos reproducir los resultados obtenidos en células Jurkat en

linfocitos T normales. Para ello mediante microbeads acopladas a anticuerpos anti-CD3

humano realizamos la purificación de estas células a partir de concentrados leucocitarios

obtenidos de individuos sanos. La purificación se evaluó mediante citometría de flujo

obteniéndose un 99% de células CD3+ (Figura 34A). Estas células se estimularon por 48

hrs con IL-2 (50 U/ml) de acuerdo a protocolos descritos previamente (Alderson et al.,

1995; Holler et al., 2000; Paulsen et al., 2009; Fang et al., 2010). Sin embargo, no se

pudo inducir muerte en los linfocitos normales al estimularlos con FasL (Figura 34B).

En resumen, en las células Jurkat la muerte celular por apoptosis depende en

parte de la salida de ATP, el cual estimularía a P2X7 generando ROS y de esta manera

gatillaría apoptosis. Esto se demuestra al inhibir la apoptosis ya sea con los inhibidores

de P2X7 oATP y BBG, y la generación de ROS con NAC. En este caso no habría

participación de ceramidas ya que ninguno de los inhibidores de las distintas vías de

generación de ceramidas protege a las células cuando se estimulan con FasL.

Lo siguiente, fue realizar los ensayos descritos en células Jurkat en la otra línea

celular sensible a FasL, que corresponde a las células A20, en las cuales el principal tipo

de muerte en respuesta a FasL es la necrosis. Para ello la primera aproximación fue

utilizar el inhibidor de P2X7 oATP. Las células A20 se incubaron con distintas

concentraciones de FasL durante 16 h, con o sin incubación previa por 1 h con oATP

(600 M). Es así como después de 16 h de incubación con FasL, se observó una

disminución de la viabilidad dependiente de la concentración de FasL, que se revierte

cuando las células son pre-incubadas por 1 h con oATP (Figura 35A), siendo este efecto

estadísticamente significativo (p > 0,05). En cambio, en las células A20 se observó un

porcentaje bajo de células que mueren por apoptosis (Figura 35B), que al pre-tratarlas

con oATP, se mantiene constante. El tipo de muerte celular que predomina al

estimularlas con FasL es la necrosis, que aumenta en forma dosis dependiente, y que a

75

su vez es revertido al pre-tratar las células con oATP (Figura 35C). En este caso, las

diferencias eran estadísticamente significativas y alcanzan un valor de p < 0,05.

A continuación, se utilizó el otro inhibidor de P2X7, para ello las células A20

fueron pre-tratadas con BBG (50 M) 1 h antes de estimularlas con FasL (0-80 ng/ml).

Después del tiempo de estímulo, las células se tiñeron con yoduro de propidio y la

viabilidad y el tipo de muerte celular se cuantificó mediante citometría de flujo. El pre-

tratamiento con BBG no tiene efecto en la viabilidad celular observándose el mismo

efecto en las células tratadas con FasL y las pre-tratadas con BBG (Figura 36A), además

no se observó efecto sobre la apoptosis (Figura 36B). En cuanto a la necrosis, no se

observó efecto protectivo ya que se observó el mismo efecto de FasL en células con y

sin pre-tratamiento con BBG (Figura 36C).

Derivado de lo anterior, se utilizó suramina, un inhibidor de varios receptores

P2Y (1, 2, 6 y 11) y P2X (1, 2, 3, 5). Se realizó ensayos de muerte celular por 16 h

tratando las células con FasL (0-80 ng/ml) o pre-tratandolas por 30 min con suramina

(200 M), y posteriormente estimuladas con FasL (Figura 37). El pre-tratamiento induce

protección ya que la viabilidad fue mayor con 10, 20 y 40 ng/ml de FasL, lo cual fue

estadísticamente significativo (Figura 37A). Además, se observó una reducción en la

apoptosis en células pre-tratadas con suramina y posteriormente tratadas con FasL, lo

cual fue estadísticamente significativo con 10, 20 y 40 ng/ml de FasL (Figura 37B). En

cambio no se observó cambios en la muerte por necrosis (Figura 37C).

Adicionalmente, se realizó un curso temporal por 12 h (cada 3 h) con 200 M de

suramina agregándolo 30 min antes de la adición de FasL (40 ng/ml) (Figura 38). Se

observó una mayor viabilidad de las A20 entre las 9 y 12 h, lo cual fue estadísticamente

significativo (Figura 38A) y se observó nuevamente un efecto reductor de la apoptosis

entre las 9 y 12 h que también fue estadísticamente significativo (Figura 38B), no

observándose este efecto sobre la necrosis (Figura 38C).

Según el objetivo propuesto, la activación de P2X7 gatillaria la muerte celular por

necrosis en las células A20, lo que podría estar dado por la producción de ceramidas que

sería un componente importante en la muerte celular por necrosis inducida por FasL.

76

Para ello realizamos ensayos de muerte celular, descritos en el Objetivo 1, tratando las

células A20 con distintas concentraciones de FasL por 16 h, pero pre-incubando 45 min

antes con los inhibidores de las distintas vías de producción de ceramidas: Miriocina y

Fumonisina B1 (via de novo), Imipramina (esfingomielinasa ácida) y GW4869

(esfingomielinasa neutra). En las células A20 (Figura 39), la viabilidad celular

disminuyó en forma dosis dependiente al tratar las células con FasL y no aumentó con

ninguno de los 2 inhibidores de la síntesis de novo de ceramidas (Miriocina y

Fumonisina B1) (Figura 39A yB). Estos mismos inhibidores tienen efectos significativos

en células MIN6 al tratarlas con palmitato (resultados no mostrados). Pero en las células

A20 el tipo de muerte celular, ya sea la apoptosis (Figura 39C y D) o necrosis (Figura

39E y F) no disminuyó al pre-tratar las células con estos inhibidores. Un

comportamiento similar se observó al pre-tratar las células con el inhibidor de

esfingomielinasa ácida (Imipramina) (Figura 40), se observó disminución de la

viabilidad celular que no es revertido por el inhibidor (Figura 40A), y no hay efecto

protectivo sobre la apoptosis (Figura 40B) y necrosis (Figura 40C). En el caso de

GW4869 (Figura 41), se observó que al pre-tratar las células con este inhibidor hay una

viabilidad mayor con 10 y 20 ng/ml de FasL (Figura 41A), lo cual es estadísticamente

significativo. No se observó efecto sobre la apoptosis (Figura 41B) y en el caso de la

necrosis solo se observó una tendencia con 20 ng/ml de FasL (Figura 41C).

A fin de clarificar esta observación, realizamos un curso temporal por 12 h

(medido cada 3 h) con este inhibidor, se utilizó 5 y 10 M de GW4869 y se agregó 30

min antes de agregar FasL (40 ng/ml) (Figura 42). La viabilidad es mayor al pre-tratar

con GW4869 (10 M) a las 9 h, y se observó un aumento leve (Figura 42A), lo cual fue

estadísticamente significativo. No se observó efecto sobre la apoptosis a ninguno de los

tiempos (Figura 42B) y sobre la necrosis se ve solo un leve efecto a las 9 h (Figura 42C).

Al igual que en las células Jurkat, se evaluó la capacidad protectora del

antioxidante N-acetilcisteína (NAC), en base a los antecedentes previos del laboratorio

en los cuales NAC tiene un efecto protector en células A20 tratadas con ceramida

(Villena et al., 2008). Por lo tanto, se pre-trató las células con N-acetilcisteína (NAC)

77

(20 mM) antes de inducir muerte celular con FasL (0-80 ng/ml), se observó mayor

viabilidad celular que cuando las células son tratadas con diferentes concentraciones de

FasL (Figura 43A) y se observó una disminución marcada en la necrosis, que es

estadísticamente significativa (Figura 43C), pero no sobre la apoptosis (Figura 43B).

El siguiente experimento fue realizar ensayos de muerte celular con el agonista

de P2X7, para ello células A20 fueron incubadas con concentraciones creciente de

BzATP (0-600 M) por 16 h y mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad

(V) y la muerte celular ya sea por apoptosis (A) o necrosis (N). No se observó inducción

de muerte celular en las células A20 (Figura 44).

En resumen, las células A20 al ser estimuladas con FasL mueren por necrosis y

este tipo de muerte celular depende en parte de receptores P2 distintos a P2X7, los cuales

generarían ceramidas y ROS, lo cual se demuestró al utilizar el inhibidor específico de

esfingomielinasa neutra (GW4869) y NAC. Además, la muerte por apoptosis, si bien no

es el principal tipo de muerte celular en estas células, podría depender tanto de

receptores P2Y (1, 2, 6 y 11) como de receptores P2X (1, 2, 3, 5), lo cual se demuestró

al pretratar las células con suramina.

78

A.

B.

C.

Figura 21. Efecto de oATP, un inhibidor de receptores P2X7 en la viabilidad y

muerte celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat. En ensayos de muerte

cellular, las células A20 se estimularon por 16 h con distintas concentraciones de FasL

(0 a 80 ng/ml) (○). Además, en paralelo se preincubaron estas células con oATP (600

M) (●) por 1 h y posteriormente se estimularon con FasL. Después las células se

tiñeron con yoduro de propidio y la viabilidad (A) y muerte celular por apoptosis (B) y

necrosis (C) se cuantificó mediante citometría de flujo. Los resultados corresponden a


consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*) o p < 0,01 (**).

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

oATP (0 M)

oATP (600 M)

Necro

sis

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

*

*

***

Ap

op

tosis

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

*** *

*

FasL (ng/ml)

Via

bil

idad

(%

)

79

A.

B.

C.

Figura 22. Efecto de Brillant Blue G (BBG), un inhibidor del receptor P2X7 en la

viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat. En ensayos

de muerte celular, las células Jurkat se estimularon por 16 h con distintas

concentraciones de FasL (0 a 80 ng/ml) (○). Además, en paralelo, se pre-incubaron estas

células con BBG (50 M) (●) por 1 h y posteriormente se estimularon con FasL.

Después del tiempo de incubación, las células se tiñeron con yoduro de propidio y

mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad (A), apoptosis (B) y necrosis (C).

Los resultados corresponden a tres experimentos realizados en forma independiente

(n=3). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*).

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

**

*

**

FasL (ng/ml)

Via

bil

idad

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

* * ***

FasL (ng/ml)

Ap

op

tosis

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

BBG (0 M)

BBG (50 M)

FasL (ng/ml)

Necro

sis

(%

)

80

A.

B.

C.

Figura 23. Efecto de Miriocina, un inhibidor de la vía de novo de la producción de

ceramidas, en la muerte celular por apoptosis y necrosis. Células Jurkat se pre-

trataron con el inhibidor de la vía de novo de la producción de ceramidas, Miriocina

(100 nM) (□) 45 minutos antes de estimularlas por 16 h con distintas concentraciones de

FasL (0 a 80 ng/ml) (■). Posteriormente, se tiñeron las células con yoduro de propidio y

mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad (A), apoptosis (B) y necrosis (C).

Los resultados corresponden dos experimentos en duplicado.

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Via

bil

idad

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Ap

op

tosis

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

Miriocina (0 mM)

Miriocina (100 mM)

FasL (ng/ml)

Necro

sis

(%

)

81

A.

B.

C.

Figura 24. Efecto de Imipramina, un inhibidor de la esfingomielinasa ácida, en la

viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat estimuladas

con FasL. Células Jurkat se pre-trataron con el inhibidor de la esfingomielinasa ácida

(Imipramina) (20 M) (□), 45 minutos antes de estimularlas por 16 h con distintas

concentraciones de FasL (0-80 ng/ml) (■). Posteriormente, las células se tiñeron con

yoduro de propidio y mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad (A) y la

muerte celular por apoptosis (B). Los resultados corresponden a tres experimentos

realizados en forma independiente (n=3).

0 20 40 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Via

bil

idad

(%

)

0 20 40 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Imipramina 0 M)

Imipramina 20 M)

Necro

sis

(%

)

0 20 40 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Ap

op

tosis

(%

)

82

A.

B.

C.


neutra, en la viabilidad y la muerte celular por apoptosis y necrosis en las células

Jurkat estimuladas con FasL. Células Jurkat se pre-trataron con GW4869 (5 M) (□),

30 minutos antes de estimularlas por 16 h con distintas concentraciones de FasL (0-80

ng/ml) (■). Posteriormente, las células se tiñeron con yoduro de propidio y mediante

citometría de flujo se cuantificó la viabilidad (A), la apoptosis (B) y la necrosis (N). Los


0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Via

bil

idad

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Ap

op

tosis

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

GW4869 0 ( M)

GW4869 (5 M)

FasL (ng/ml)

Necro

sis

(%

)

83

A.

B.

C.

Figura 26. Efecto de N-acetilcisteína (NAC) en la muerte celular por apoptosis y

necrosis en células Jurkat estimuladas con FasL. Células Jurkat se pre-trataron con

N-acetil cisteína (NAC) (10 mM) (□), 45 min antes de estimularlas por 16 h con

distintas concentraciones de FasL (0- 80 ng/ml) (■). Posteriormente, las células se

tiñeron con yoduro de propidio y mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad

(A) y la muerte celular por apoptosis (B) y necrosis (C). Los resultados corresponden a


consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*) y p < 0,01 (**).

0 20 40 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Via

bil

idad

(%

)

0 20 40 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

*

* **

Ap

op

tosis

(%

)

0 20 40 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

NAC (0 mM)

NAC (10 mM)

Necro

sis

(%

)

84

Figura 27. Cuantificación de ROS en células Jurkat estimuladas con FasL. Células

Jurkat se trataron con FasL (20 ng/ml) (■) por 6 h. Posteriormente, las células se

marcaron con DHR123 por 30 min y luego mediante citometría de flujo se cuantificó la

producción de ROS en relación a las células no estimuladas. Los resultados


diferencias se consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,05.

0 1 2 3 4 5 60.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

FasL (20 ng/ml)

*

Tiempo (h)

DH

R 1

23 (

UA

)

85

A.

B.

Figura 28: Efecto de NAD+, un agonista de P2X7, en la viabilidad y muerte celular

por apoptosis y necrosis en células Jurkat. Células Jurkat se trataron con NAD por 16

(A) y 24 h (B). Posteriormente, las células se marcaron con yoduro de propidio y

mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad celular (V) y la muerte celular

por apoptosis (A) y necrosis (N). Los resultados corresponden a tres experimentos


0 1,25 2,5 5 10 200

20

40

60

80

100

V

A

N

NAD ( M)

célu

las (

%)

0 6,25 12,5 25 50 100 2000

20

40

60

80

100

V

A

N

NAD ( M)

célu

las (

%)

86

Figura 29: Efecto de BzATP, un agonista de P2X7, en la viabilidad y muerte celular

por apoptosis y necrosis en células Jurkat. Células Jurkat (A) y A20 (B) fueron

tratadas con Bz ATP (0-600 M) por 16 h. Posteriormente, las células se marcaron con

yoduro de propidio y mediante citometría de flujo se cuantifico la viabilidad celular (V)

y la muerte celular por apoptosis (A) y necrosis (N). Los resultados corresponden a tres


0 3,12 6,25 12,5 25 50 100 6000

20

40

60

80

100

V

A

N

Bz-ATP ( M)

célu

las (

%)

87

A.

B.

C.

Figura 30. Efecto de concentraciones altas de BzATP, un agonista de P2X7, y FasL

en la viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat. Células

Jurkat fueron pre-tratadas con BzATP (0-600 M) antes de agregarles FasL (0-80 ng/ml)

por 16 h. Posteriormente, las células se marcaron con yoduro de propidio y mediante

citometría de flujo se cuantificó la viabilidad celular (A) y la muerte celular por

apoptosis (B) o necrosis (C). Los resultados corresponden a dos experimentos realizados

en forma independiente (n=2).

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Via

bil

idad

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Ap

op

tosis

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

BzATP (0 M)

BzATP (100 M)

BzATP (300 M)

BzATP (600 M)

FasL (ng/ml)

Necro

sis

(%

)

88

A.

B.

C.

Figura 31. Efecto de concentraciones bajas BzATP, un agonista de P2X7, y FasL en

la viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat. Células

Jurkat fueron pre-tratadas con concentraciones bajas de BzATP (50 y 25 M) antes de

agregarles FasL (0-80 ng/ml) por 16 h. Posteriormente, las células se marcaron con

yoduro de propidio y mediante citometría de flujo se cuantifico la viabilidad celular (A)

y la muerte celular por apoptosis (B) o necrosis (C). Los resultados corresponden a dos


0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Via

bil

idad

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Ap

op

tosis

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

BzATP ( )

BzATP (50 )

BzATP (25 )

FasL (ng/ml)

Necro

sis

(%

)

89

A.

B.

C.

Figura 32. Efecto del inhibidor de P2X7, Cu2+

, en la viabilidad y muerte celular por

apoptosis y necrosis. En ensayos de muerte celular, las células Jurkat se estimularon por

16 h con distintas concentraciones de FasL (0 a 80 ng/ml) (□). Además, en paralelo, se

pre-incubaron estas células con 10 (●) y 5 M (○) de Cobre (Cu+2

) por 10 min y

posteriormente se estimularon con FasL. Después del tiempo de incubación, las células

se tiñeron con yoduro de propidio y mediante citometría de flujo se cuantificó la

viabilidad (A), apoptosis (B) y necrosis (C). Los resultados corresponden a tres

experimentos realizados en forma independiente (n=3). Las diferencias se consideraron


0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

*

**

* * * *

FasL (ng/ml)

Via

bil

idad

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100* * * *

FasL (ng/ml)

Ap

op

tosis

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

Cu+2

(0 M)

Cu+2

(10 M)

Cu+2

(5 M)

FasL (ng/ml)

Necro

sis

(%

)

90

A.

B.

C.

Figura 33. Efecto del inhibidor de caspasa 9, z-LEHD, en la viabilidad y muerte

celular por apoptosis y necrosis en células Jurkat. Las células se trataron con

concentraciones crecientes de FasL (□) o bien se trataron en forma conjunta con 50 M

(●) o 20 M (○) de z-LEHD. La viabilidad (A) y la muerte celular por apoptosis (B) y

necrosis (C) se cuantifico 16 h después del estímulo con FasL mediante citometría de

flujo, marcando las células con yoduro de propidio. Los resultados corresponden a tres



0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

*

* * * *

FasL (ng/ml)

Via

bil

idad

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

* * * *

FasL (ng/ml)

Ap

op

tosis

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

z-LEHD 0 M)

z-LEHD (50 M)

z-LEHD (20 M)

FasL (ng/ml)

Necro

sis

(%

)

91

A.

CD3_Tube_003.fcs

CD3-PE

FIT

C-H

100

101

102

103

104

100

101

102

103

104

0,55%

0,00%

99,33%0,55%

0,12%0,00%

B.

Figura 34. Ensayos de muerte celular en linfocitos T CD3+ tratados con FasL.

Linfocitos T CD3+ se purificaron a partir de concentrados leucocitarios mediante

microbeads acopladas a anticuerpos anti-CD3 humano. Se muestra un dot plot

representativo de la purificación (A). Las células se cultivaron en presencia de IL-2 (50

U/ml) por 2 días y se estimularon con FasL (0-160 ng/ml) por 16 h. Posteriormente, las

células se marcaron con ioduro de propidio y mediante citometría de flujo se cuantificó

la viabilidad celular (V) y la muerte celular por apoptosis (A) o necrosis (N) (B). Los

resultados corresponden a dos experimentos realizados en forma independiente (n=2).

0 1,25 2,5 5 10 20 40 80 160 0 1,25 2,5 5 10 20 40 80 1600

20

40

60

80

100

V

A

N

0 U/ml IL-2 50 U/ml IL-2

FasL (ng/ml)

célu

las (

%)

92

A.

B.

C.

Figura 35. Efecto de oATP, un inhibidor de receptores P2X7 en la viabilidad y

muerte celular por apoptosis y necrosis en células A20. En ensayos de muerte

cellular, las células A20 (C, D) se estimularon por 16 h con distintas concentraciones de

FasL (0 a 80 ng/ml) (■), además en paralelo se preincubaron estas células con oATP

(600 M) (□) por 1 h y posteriormente se estimularon con FasL. Después del tiempo de

estímulo, las células se tiñeron con yoduro de propidio y la muerte celular por apoptosis

(A y C) y necrosis (B y D) se cuantificó mediante citometría de flujo. Los resultados


diferencias se consideraron estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*) o p < 0,01

(**).

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Ap

op

tosis

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

*

Necro

sis

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

*

*

FasL (ng/ml)

Via

bil

idad

(%

)

93

A.

B.

C.

Figura 36. Efecto de Brillant Blue G (BBG), un inhibidor del receptor P2X7 en la

viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células A20. En ensayos de

muerte celular, las células A20 se estimularon por 16 h con distintas concentraciones de

FasL (0 a 80 ng/ml) (○). Además, en paralelo, se pre-incubaron estas células con BBG

(50 M) (●) por 1 h y posteriormente se estimularon con FasL. Después del tiempo de

incubación, las células se tiñeron con yoduro de propidio y mediante citometría de flujo

se cuantificó la viabilidad (A), apoptosis (B) y necrosis (C). Los resultados corresponden

a tres experimentos realizados en forma independiente (n=3).

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Via

bil

idad

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Ap

op

tosis

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

BBG (0 M)

BBG (50 M)

FasL (ng/ml)

Necro

sis

(%

)

94

A.

B.

C.

Figura 37. Efecto de suramina, un inhibidor de receptores P2, en las células A20

estimuladas con FasL. Células A20 se pre-trataron con suramina (200 M) (□), 30 min

antes de estimularlas por 16 h con distintas concentraciones de FasL (0-80 ng/ml) (■).

Posteriormente, las células se tiñeron con yoduro de propidio y mediante citometría de

flujo se cuantificó la viabilidad (A), la apoptosis (B) y la necrosis (N). Los resultados



0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

*

*

*

FasL (ng/ml)

Via

bil

idad

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

* **

FasL (ng/ml)

Ap

op

tosis

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

Suramina (0 M)

Suramina (200 M)

FasL (ng/ml)

Necro

sis

(%

)

95

A.

B.

C.

Figura 38. Curso temporal del efecto de suramina en la viabilidad y muerte celular

por apoptosis y necrosis en las células A20 estimuladas con FasL. Células A20 se

pre-trataron con suramina (200 M) (□), 30 minutos antes de estimularlas por 12 h con

FasL (40 ng/ml). Posteriormente, las células se tiñeron con yoduro de propidio y

mediante citometría de flujo se cuantificó la viabilidad (A) y la muerte celular por

apoptosis (B) y necrosis (C). Los resultados corresponden a tres experimentos realizados

en forma independiente (n=3). Las diferencias se consideraron estadísticamente

significativas a un p < 0,05 (*).

0 3 6 9 120

25

50

75

100

Tiempo (h)

*

*

Via

bil

idad

(%

)

0 3 6 9 120

25

50

75

100

Tiempo (h)

* *

Ap

op

tosis

(%

)

0 3 6 9 120

25

50

75

100

Tiempo (h)

Suramina (0 M)

Suramina (200 M)

Necro

sis

(%

)

96

A. B.

C. D.

E. F.

Figura 39. Efecto de los inhibidores de la vía de novo de la producción de ceramidas

en la viabilidad y en la muerte celular por apoptosis y necrosis. Células A20 se pre-

trataron con inhibidores de la vía de novo de la producción de ceramidas, Miriocina (100

nM) (▼) y 200 nM (●) y Fumonisina B1 (50 M) (▲) y 100 M (○) 45 minutos antes

de estimularlas por 16 h con distintas concentraciones de FasL (0 a 80 ng/ml) (■).


flujo se cuantificó la viabilidad (A y B), apoptosis (C y D) y necrosis (E y F). Los

resultados corresponden a un experimento en duplicado para cada una de las

condiciones.

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Ap

op

tosis

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Necro

sis

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100sin inhibidores

FB1 (50 M)

Myr (100 nM)

FasL (ng/ml)

Via

bil

idad

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100 sin inhibidores

FB1 (100 M)

Myr (200 nM)

FasL (ng/ml)

Via

bil

idad

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Ap

op

tosis

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Necro

sis

(%

)

97

A.

B.

C.

Figura 40. Efecto de Imipramina, un inhibidor de la esfingomielinasa ácida, en la

viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células A20 estimuladas con

FasL. Células A20 se pre-trataron con el inhibidor de la esfingomielinasa ácida

(Imipramina) (20 M) (□), 45 minutos antes de estimularlas por 16 h con distintas

concentraciones de FasL (0- 80 ng/ml) (■). Posteriormente, las células se tiñeron con


muerte celular por necrosis (B). Los resultados corresponden a tres experimentos


0 20 40 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Via

bil

idad

(%

)

0 20 40 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Imipramina (0 M)

Imipramina (20 M)

Necro

sis

(%

)

0 20 40 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Ap

op

tosis

(%

)

98

A.

B.

C.


neutra, en la muerte celular por apoptosis y necrosis en las células A20 estimuladas

con FasL. Células A20 se pre-trataron con GW4869 (5 M) (□), 30 minutos antes de

estimularlas por 16 h con distintas concentraciones de FasL (0- 80 ng/ml) (■).


flujo se cuantificó la viabilidad (A), la apoptosis (B) y la necrosis (N). Los resultados



0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

*

*

FasL (ng/ml)

Via

bil

idad

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Ap

op

tosis

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 800

25

50

75

100

GW4869 (0 uM)

GW4869 (5 uM)

FasL (ng/ml)

Necro

sis

(%

)

99

A.

B.

C.

Figura 42. Curso temporal de GW4869, un inhibidor de la esfingomielinasa neutra

en la muerte celular por apoptosis y necrosis en células A20 estimuladas con FasL.

Células A20 se pre-trataron con el inhibidor de la esfingomielinasa neutra (GW4869) (5

y 10 M), 30 min antes de estimular las células por 12 h (a intervalos de 3 h) con FasL

(40 ng/ml). Posteriormente, las células se tiñeron con yoduro de propidio y mediante

citometría de flujo se cuantificó la viabilidad (A) y la muerte celular por apoptosis (B) y

necrosis (C). Los resultados corresponden a tres experimentos realizados en forma

independiente (n=3). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a un

p < 0,05 (*).

0 3 6 9 120

25

50

75

100

Tiempo (h)

*

Via

bil

idad

(%

)

0 3 6 9 120

25

50

75

100

Tiempo (h)

Ap

op

tosis

(%

)

0 3 6 9 120

25

50

75

100

Tiempo (h)

GW4869 (0 M)

GW4869 (5 M)

GW4869 (10 M)

*

Necro

sis

(%

)

100

A.

B.

C.

Figura 43. Efecto de N-acetilcisteína (NAC) en la muerte celular por apoptosis y

necrosis en células A20 estimuladas con FasL. Células A20 se pre-trataron con N-

acetil cisteína (NAC) (20 mM) (□), 45 min antes de estimularlas por 16 h con distintas

concentraciones de FasL (0-80 ng/ml) (■). Posteriormente, las células se tiñeron con


muerte celular por apoptosis (B) y necrosis (C). Los resultados corresponden a tres


estadísticamente significativas a un p < 0,05 (*), p < 0,01 (**) y p < 0,001 (***).

0 20 40 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

*

Via

bil

idad

(%

)

0 20 40 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

Ap

op

tosis

(%

)

0 20 40 800

25

50

75

100

FasL (ng/ml)

*** ** *

NAC (0 mM)

NAC (20 mM)

Necro

sis

(%

)

101

Figura 44: Efecto de concentraciones altas de BzATP, un agonista de P2X7 y FasL

en la viabilidad y muerte celular por apoptosis y necrosis en células A20. Células

A20 fueron tratadas con Bz ATP (0-600 M) por 16 h. Posteriormente, las células se

marcaron con yoduro de propidio y mediante citometría de flujo se cuantifico la

viabilidad celular (V) y la muerte celular por apoptosis (A) y necrosis (N). Los


0 3,12 6,25 12,5 25 50 100 6000

20

40

60

80

100

V

A

N

Bz-ATP ( M)

célu

las (

%)

102

5. DISCUSIÓN.

Los resultados obtenidos en linfocitos T derivados de leucemia aguda (células

Jurkat) apoyan el modelo propuesto en el que dos receptores de muerte celular, Fas y

P2X7, se comunican entre sí de tal forma que al estimular las células con FasL se induce

muerte de los linfocitos T neoplásicos principalmente por apoptosis. Se conoce que la

interacción Fas-FasL induce la activación de caspasa-8, lo que posteriormente conduce a

la activación de la caspasa-3 efectora. Un hallazgo importante de esta Tesis, es que la

activación de caspasa-8 conlleva a la liberación de ATP extracelular mediada por

hemicanales formados por panexina-1. La salida de ATP desde la célula a su vez activa

al receptor P2X7, siendo este responsable de potenciar la muerte celular por apoptosis,

en un evento que probablemente involucra la participación de especies reactivas de

oxígeno y en el cual se produciría también activación de caspasa-9 la que finalmente

llevaría a activación de caspasa-3. Esto refuerza el concepto de que las células Jurkat son

células tipo II, y añade un nuevo mecanismo en el cual se necesitaría una señal

dependiente de la activación del receptor P2X7 para completar el proceso apoptótico.

Considerando que las células Jurkat son sensibles a FasL, la primera

aproximación fue determinar, por citometría de flujo, los niveles de expresión del

receptor Fas en la superficie celular (Figura 3). Si bien, presenta niveles inferiores a las

otras líneas celulares humanas esto no explica las diferencias en la sensibilidad a FasL,

como si podría ocurrir con las células Raji que a pesar de que casi el 100% de la

población celular expresa el receptor Fas estás células no son sensibles a FasL lo que

podría deberse a que carecen de actividad escramblasa para lípidos en la membrana

plasmática (Tepper et al., 2001), por lo tanto los niveles de ceramida no se incrementan

en respuesta a la activación por Fas. El otro componente importante es la presencia del

receptor P2X7, que en el caso de las células Jurkat se expresa al igual que la mayoría de

las líneas celulares analizadas (Figura 4).

Al realizar ensayos de muerte celular utilizando FasL, las células Jurkat mueren

principalmente por apoptosis (Figura 6). Esto difiere de lo publicado en nuestro

103

laboratorio, en el sentido que las célula Jurkat presentaba un mayor porcentaje de células

que morían por necrosis (Hetz el al., 2002) frente el estímulo con FasL. Esto podría

deberse a la naturaleza del FasL y la concentración utilizada. En los primeros

experimentos (Hetz el al., 2002) se utilizaban concentraciones que alcanzaban a los 400

ng/ml en cambio en los ensayos descritos en esta Tesis la máxima concentración

utilizada era 80 ng/ml. Otro aspecto no menos importante es el origen de las células

utilizadas. Las células Jurkat son distintas a las utilizadas en esas publicaciones (a

diferencia de las células A20), ya que provienen de laboratorios distintos (Suiza,

España) lo cual junto a la naturaleza del FasL podrían explicar las diferencias

observadas.

En cuanto al origen del ATP, se ha determinado mediante fluorescencia

utilizando un compuesto que se une a nucleótidos llamado quinacrina, que en

poblaciones purificadas de linfocitos CD4+ vírgenes, el ATP se encuentra distribuido en

forma homogénea en el citosol sin evidencias de tinción vesicular ni de gránulos

secretorios. Además una confirmación de la distribución citosólica del ATP viene del

hecho que al realizar fraccionamiento subcelular y determinar la localización del ATP

este se encuentra exclusivamente en el citosol y no en las fracciones que contienen

membranas. Por otra parte, se describe que la estimulación de células T con anticuerpos

anti-CD3 antes del fraccionamiento resultó en una mayor recuperación de ATP en las

fracciones citosólica en comparación a las fracciones citosólica de las células sin tratar.

Estos resultados excluyen un mecanismo en el que la liberación de ATP a partir de las

células T activadas sea vesicular y sugieren que el ATP puede ser liberado a través de

hemicanales de panexina (Schenk et al., 2008).

En relación a la generación de ATP extracelular, hasta la fecha, solo se ha

demostrado recientemente la presencia de la ecto-ATP sintetasa funcional en la

superficie neuronal. Mediante inmunoblot e inmunofluorescencia se ha demostrado la

distribución superficial de las subunidades α, β de la ATP sintetasa F1. Por otra parte,

estas subunidades se encontraron también en fracciones de membrana plasmática y en

las balsas lipídicas aisladas de cerebro de rata. El análisis mediante citometría de flujo

104

demuestra la presencia de subunidades α en la superficie de las células cerebrales. En

ensayos de actividad se ha demostrado la generación de ATP extracelular de cultivos de

neuronas. Por lo tanto, la ATP sintetasa en la superficie de las neuronas pueden estar

implicados en los mecanismos de generación de ATP extracelular (Xing, 2011). Sin

embargo, no se estudió esta posibilidad en ese trabajo.

Por otro lado, los mecanismos de liberación de ATP son variados, según el tipo

celular participan hemicanales de conexina-43 (Cnx-43), el canal aniónico regulado por

volumen (VRAC), el receptor purinérgico P2X7 (Maroto y Hamill, 2001; Bal-Price et

al., 2002; Parpura et al., 2004) e incluso por exocitosis en linfocitos T de ratón activados

mediante con anticuerpos anti-CD28 y anti-CD3 (Tokunaga et el., 2010). Existían

evidencias que daban cuenta de la participación de conexinas en los mecanismos de

liberación de ATP (Anselmi et al., 2008) y otros trabajos más recientes describen la

participación de panexina-1 en la liberación de ATP en linfocitos T, que en este caso

constituiría una señal co-estimuladora que lleva a una activación más eficiente de estas

células (Schenk et al., 2008; Yip et al., 2009). Por lo tanto, otra caracterización fue en

cuanto a los niveles de panexina-1 y conexina-43. Al analizar mediante western blot las

distintas líneas celulares se observa que en todas hay expresión de las distintas isoformas

de panexina-1 (Figura 5A), pero conexina-43 solamente se expresa en células B de ratón

(A20 y A20R) (Figura 5B), aunque al realizar un curso temporal estimulando las células

Jurkat con FasL a distintos tiempos (1-5 h), mediante western blot se aprecia expresión

de conexina-43. La posible explicación de esto es que en el western blot de

caracterización de la expresión de conexina-43 en las distintas líneas utilizadas la

expresión mayor es en los linfocitos B de ratón (A20 y A20R), por lo que la señal más

tenue asociado a una menor expresión de conexina-43 en los linfocitos humanos no haya

sido captada (Figura 18). Además al estimular las células con FasL por 1, 3 y 5 h es

posible apreciar tanto por microscopia confocal (Figura 16) como por western blot

(Figura 17) aumentos en la expresión de panexina-1, no así de conexina-43 (Figura 18).

Este último hallazgo, difiere de lo publicado recientemente, ya que en ensayos de

estimulación con anticuerpos anti-hFas por 4h en células Jurkat se describe degradación

105

de panexina-1 a partir de la segunda hora de estímulo (Chekeni et al., 2010). Todos estos

resultados a su vez refuerzan el concepto que en células Jurkat, panexina-1 es la

responsable de la salida de ATP y que coincide con lo descrito en la literatura para

linfocitos T humanos (Schenk et al, 2008; Chekeni et al., 2010).

Relacionado con esto, postulamos que mediante ATP extracelular habría una

comunicación entre Fas y P2X7. Parte de nuestra hipótesis es que la activación de

caspasa-8 por FasL induciría liberación de ATP por un mecanismo que podría involucrar

a panexina-1. Para demostrar esto, en primer lugar estimulamos a las células Jurkat con

80 ng/ml de FasL por 0-5h, y realizamos ensayos de luminiscencia de alta sensibilidad

para detectar ATP en los sobrenadantes de cultivo (Figura 10). Observamos que solo en

las células Jurkat (Figura 11A) hay liberación de ATP a medida que aumenta el tiempo

de estímulo con FasL, lo que no ocurre en las demás células (Figura 10A-D).

Comprobamos que esta liberación no es por pérdida de integridad de la membrana como

se demuestra en los ensayos de liberación de LDH (Figura 11F), en donde a las 5 h de

estímulo con FasL no se aprecia mayor liberación de LDH al compararlas con células

tratadas con PBS. Además, como se aprecia en los cursos temporales de muerte por

apoptosis (Figura 8B), en los cuales después de las 6 h aumenta la muerte celular en

cambio las mediciones de ATP extracelular son hasta las 5 h, lo cual apoya nuestra

hipótesis de que la liberación de ATP en las primeras horas de estímulo con FasL

dependería de la activación de caspasas y no de la muerte celular. Como se discute más

adelante, al utilizar el inhibidor de caspasa-8 (zIETD) junto con FasL, la liberación de

ATP es similar al valor basal.

Recientemente se ha descrito la participación de caspasas en los mecanismos de

liberación de ATP en células Jurkat (Chekeni et al., 2010). Nosotros también realizamos

los mismos ensayos de liberación de ATP en células Jurkat pero en presencia de un

inhibidor general de caspasas (zVAD), un inhibidor de caspasa-8 (zIETD), o un

inhibidor de caspasa-3 (zDEVD), (Figura 12A), observándose que la liberación de ATP

disminuye en respuesta a FasL cuando las células se tratan con zVAD y zIETD pero no

con zDEVD. Evidencias que apoyan este resultado vienen de trabajos recientes que

106

involucran la liberación de nucleótidos desde las células apoptóticas dependiente de la

actividad de caspasas y que ocurre después de inducir apoptosis de distintas maneras

(daño de DNA, inducción por receptor y esteroides) tanto en timocitos primarios, células

Jurkat y epiteliales (Elliot et al., 2009). Además en ensayos de viabilidad se observa que

zVAD tiene un efecto protector sobre las células tratadas con FasL (Figura 12B) y por el

contrario los inhibidores de caspasa 8 (zIETD) y caspasa 3 (zDEVD) a una

concentración de 20 M no son capaces de evitar la apoptosis inducida por FasL y sólo

se logra a concentraciones mayores (50 M). Por lo tanto, a diferencia de los estudios

mencionados, nuestros experimentos indican que el ATP liberado en las células

apoptóticas constituye una señal que vía P2X7 amplifica la apoptosis en células Jurkat.

En cuanto a las vías involucradas en la liberación de ATP, evidencias más

recientes involucran la participación de las panexinas en la liberación de ATP en

linfocitos activados. Esta liberación de ATP es a través de hemicanales formados por

panexina-1 lo que actuaría como una señal co-estimuladora autocrina esencial a través

de receptores purinergicos P2X (Schenk et al, 2008). Por lo tanto, en base a estos

antecedentes, la primera aproximación fue realizar ensayos de incorporación de etidio en

células Jurkat, de manera de discriminar si la salida de ATP en respuesta a FasL es por

panexina-1 o conexinas (Figura 13). Para ello, las células fueron pre-tratadas con

probenecid (inhibidor de panexina-1) o La3+

(inhibidor de conexinas) antes de

estimularlas con FasL. Se observa en el caso de las células Jurkat que probenecid

disminuye drásticamente la incorporación de etidio logrando que el registro sea similar

al de las células no tratadas, en cambio al tratar las células con La3+

el registro es muy

similar al obtenido solo con FasL (Figura 13E). A pesar de que estos resultados sugieren

que en células Jurkat habría participación de conexinas entre los mecanismos de

liberación de ATP, no se puede descartar del todo ya que en la curva de incorporación de

etidio se aprecia diferencias entre las curvas de probenecid y La3+

, pero que en nuestro

análisis no son estadísticamente significativas.

A partir de este resultado se realizaron ensayos de liberación de ATP, siendo la

primera aproximación el uso de carbenoxolona que es un inhibidor descrito para

107

panexina-1 en la concentraciones que aquí utilizamos (10 M) (Locovei et al., 2006b)

observándose que disminuye la liberación de ATP en forma significativa (Figura 14A),

pero no protege cuando se realizan ensayos de muerte celular con FasL (Figura 14B).

Posteriormente, realizamos ensayos de liberación de ATP con los inhibidores utilizados

en los ensayos de captación de etidio (Figura 15). Observamos, que probenecid es capaz

de evitar la salida de ATP al estimular las células Jurkat con FasL, logrando niveles

similares a los obtenidos en células tratadas solo con PBS (Figura 15A), lo cual

concuerda con la descripción que se ha hecho en cuanto a que probenecid bloquea

eficientemente los hemicanales de panexina-1 pero no los de conexinas (Silverman et

al., 2008). Al pre-tratar con La3+

se observa una baja liberación de ATP, lo cual podría

deberse a un artefacto que impediría la cuantificación de ATP, por lo que utilizamos otro

inhibidor de conexinas (heptanol), donde esta vez si se observa que liberación de ATP

no se afecta por el bloqueo de conexinas lo que a su vez se correlaciona con los descrito

en los western blot para conexina-43, la cual no se detectan en la células Jurkat (Figura

5B). Se ha descrito que los hemicanales de panexina-1 son relativamente insensibles a

La3+

y heptanol, mientras que los hemicanales de conexinas son efectivamente

bloqueados por esos agentes (Bruzzone et al. 2005; Pelegrin y Suprenant, 2006).

Además, el uso de La3+

requiere la ausencia de aniones extracelulares tales como

fosfatos o sulfatos, debido a que precipitan (Schalper et al., 2008). En los ensayos de

muerte celular con FasL, La3+

ni probenecid impiden las disminución de la viabilidad en

células tratadas con FasL (Figura 15B), tampoco carbenoxolona (Figura 14B) tiene un

efecto protector, lo cual concuerda con lo descrito recientemente en la literatura

(Chekeni et al., 2010).

Evidencias más recientes que apoyan nuestro modelo, caracterizan la

participación de panexinas en el mecanismo de salida de ATP en las células apoptóticas.

Esta caracterización se realizó tanto en forma farmacológica como de inhibición

utilizando siRNA específico para panexina-1, y mediante “patch-clamp” muestran que

panexina-1 es basalmente inactivo, y que la inducción de corrientes de panexina ocurre

sólo durante la apoptosis. Estas observaciones coinciden con nuestros resultados, ya que

108

sin estímulo las células Jurkat no incorporan etidio (Figura 13A) ni liberan ATP (Figura

11), pero sí cuando se tratan con FasL (Figura 11, 14 y 15). Además describen que

panexina-1 presenta sitios de corte específico para caspasa-3 que llevan a la activación

de panexina-1. Nuestros resultados muestran que la estimulación de las células Jurkat

con FasL lleva a un aumento en la expresión de panexina-1, esto lo visualizamos tanto

por microscopia confocal (Figura 16) como por western blot (Figura 17). Por lo tanto, la

liberación de ATP es regulada con una permeabilidad selectiva de la membrana

plasmática durante la apoptosis (Chekeni et al., 2010). Como se mencionó

anteriormente, estos hallazgos coinciden con nuestros resultados, pero nosotros

asociamos la salida de ATP con activación de P2X7 que a su vez llevaría a la muerte

celular por apoptosis.

Los experimentos de colocalización con Fas y panexina-1 (Figura 16) y lo

descrito en la literatura (Veldman et al., 2001; Gloire et al., 2008) sugieren un

acoplamiento funcional en los rafts entre los distintos receptores, Fas, panexinas y P2X7.

La aproximación experimental en células Jurkat fue remover el colesterol de la

membrana plasmática mediante -metilciclodextrina (Figuras 19) y posteriormente

realizar ensayos de muerte celular agregando FasL (0-10 ng/ml) por 16 h (Figura 20).

Observamos un aumento en la viabilidad celular y una disminución de la muerte celular

por apoptosis con un aumento de la necrosis. Una posible explicación es que ocurra

activación de caspasa-8 y salida de ATP independiente de su acoplamiento a “rafts”, no

activándose los receptores P2X7 que estaban en los dominios raft y que estarían

involucrados en la muerte celular por apoptosis. Este ATP activaría al receptor P2X7 que

no está en los dominios raft y que se han asociado a una función más bien de canal no

selectivo (Garcia-Marcos et al., 2006) y que podría ser la explicación por que aumenta la

muerte celular por necrosis.

La siguiente aproximación fue determinar la participación de P2X7 en la muerte

celular, para ello se utilizizaron los inhibidores de P2X7 oATP, Brillant Blue G (BBG) y

Cu2+

. Mediante ensayos de muerte celular con FasL las células Jurkat se pre-incubaron

con oATP 1 h antes de estimularlas con FasL. Observamos un aumento de la viabilidad

109

celular (Figura 21A). Esto se corrobora al analizar el efecto de oATP sobre la muerte

celular, observando que ocurre una clara inhibición de la apoptosis en las células Jurkat

(Figura 21B). A fin de determinar si solamente P2X7 está involucrado en la inducción

de muerte celular, realizamos otros ensayos pero en presencia de un inhibidor más

específico de P2X7 recientemente descrito y que corresponde a Brillant Blue G (BBG) el

cual ya se ha utilizado como antagonista de P2X7 en modelos animales de trauma

medular (Peng et al., 2009). Para comprobar la eficacia de este inhibidor, realizamos los

ensayos de muerte celular en células Jurkat con FasL pre-tratadas con BBG (Figura 22).

En el caso de las células Jurkat se observó un efecto marcado, aumentando la viabilidad

celular (Figura 22A) e inhibiendo la apoptosis (Figura 22B).

Otro bloqueador de P2X7 descrito es el Cu2+

, siendo un potente inhibidor a

concentraciones micromolares, relacionándose esto a una interacción directa con

algunos residuos del ectodominio del receptor P2X7 (Acuña-Castillo et al., 2007; Liu et

al., 2008). Tomando en cuenta que nuestra hipótesis considera a las células Jurkat como

células tipo II, postulamos que caspasa-8 induce liberación de ATP y activación de P2X7

potenciando de esta manera la muerte por apoptosis. Por lo tanto la siguiente

aproximación experimental fue pre-tratar las células Jurkat con Cu2+

(5 y 10 M) y

después estimular las células con FasL (0-80 ng/ml por 16 h y posteriormente mediante

citometría de flujo evaluar la viabilidad y muerte celular (Figura 32). Observamos un

claro efecto inhibitorio, ya que se observa una mayor viabilidad celular (Figura 32A)

con una marcada inhibición de la apoptosis (Figura 32B) sin afectar la necrosis (Figura

32C).

A fin de determinar la participación de P2X7 en la muerte celular por apoptosis,

se utilizan agonistas de P2X7. El primero fue NAD+, que ha sido descrito como un

activador de receptores P2X7 y por lo tanto capaz de inducir la muerte de linfocitos T

por un mecanismo dependiente de ART2.2 (Seman et al., 2003; Scheuplein et al., 2009).

Para ello realizamos ensayos de muerte celular en células Jurkat tratándolas con NAD+

(0-200 M) por 16 (Figura 28A) y 24 h (Figura 28B). No observamos inducción de

muerte en las células Jurkat, a pesar de las altas concentraciones utilizadas (200 M) a

110

tiempos largos. Probablemente esto se deba a que las células Jurkat no expresan

ART2.2, además dentro de los linfocitos normales se aprecia una diferencia en cuanto a

la sensibilidad a NAD+, es así como la subpoblación más sensible corresponde a la de

linfoctos T regulatorios Foxp3+ (Hubert et al., 2010).

El otro agonista utilizado fue BzATP, la primera aproximación fue estimular a

las células Jurkat (Figura 29) con concentraciones crecientes de BzATP (0-600 M) por

16 h y evaluar mediante citometría de flujo la inducción de muerte celular. No

observamos inducción de muerte en las líneas celulares utilizadas. El siguiente paso fue

realizar ensayos de muerte celular coestimulando las células Jurkat con concentraciones

altas de BzATP (100, 300 y 600 M) y posteriormente con FasL (0-80 ng/ml) por 16 h,

se observa una mayor sobrevida de las células (Figura 30A) cuando se co-estimulan con

BzATP y FasL (20 y 40 ng/ml), con una disminución de la apoptosis (Figura 30B). Una

posible explicación viene de experimentos en los cuales análogos de ATP, incluyendo al

BzATP, han funcionado como inhibidores altamente efectivos de los hemicanales de

panexina-1 (Qiu y Dahl, 2009), posiblemente a concentraciones de 100 M se comporte

de esa manera. Derivado del resultado anterior, realizamos nuevamente ensayos de

muerte celular co-estimulando células Jurkat ahora con concentraciones bajas de BzATP

(25 y 50 M) y FasL (0-80 ng/ml) (Figura 31). En este caso no observamos efecto

protector de BzATP sobre la muerte celular (Figura 31B), pero tampoco un efecto

sinérgico.

Finalmente se evaluó la capacidad protectora del antioxidante N-acetilcisteína

(NAC) en las células Jurkat dado por su capacidad de bloquear la generación de especies

reactivas de oxígeno (ROS). Antecedentes previos del laboratorio dan cuenta del efecto

protector de NAC cuando se agrega ceramida a células Jurkat (100 M por 6 h) (Villena

et al., 2008), con un aumento en la viabilidad (Figura 26A) de las células Jurkat y una

disminución de la apoptosis (Figura 26B). Tomando en cuenta este resultado, se

cuantificó en las células Jurkat estimuladas con FasL la generación de ROS,

observándose un aumento en forma significativa a las 6 h (Figura 27), que es también

el tiempo al cual se empieza a gatillar la apoptosis en las célula Jurkat (Figura 8B).

111

El resultado anterior nos llevó a evaluar la actividad de caspasa-9, para ello

utilizamos un inhibidor específico (z-LEHD) (Figura 33). En estos experimentos

tratamos las células Jurkat con z-LEHD (20 y 50 M) y con FasL (0-80 ng/ml) por 16 h.

Al evaluar la viabilidad (Figura 33A) y el tipo de muerte celular observamos un marcado

efecto protector, las células muestran una mayor viabilidad y una menor apoptosis

(Figura 33B), sin afectarse la muerte celular por necrosis (Figura 33C).

La última aproximación fue inducir muerte celular con FasL en linfocitos

humanos CD3+ normales. Para ello se trabajó con una población celular de alta pureza

(99%) (Figura 34A) y se realizaron varias aproximaciones experimentales de acuerdo a

lo publicado (Alderson et al., 1995; Holler et al., 2000; Paulsen et al., 2009; Fang et al.,

2010). Sin embargo, no se pudo inducir muerte de los linfocitos normales, a pesar que

los linfocitos purificados se cultivaron en presencia de IL-2 (50 U/ml) por 2 días (Figura

34B), e incluso cuando se estimularon con FasL se hizo en presencia de IL-2 (no

mostrado). Además se cuantificó mediante citometría de flujo la expresión del receptor

Fas en la superficie celular, no observándose diferencias entre las células estimuladas y

no estimuladas con IL-2 (no mostrado). Se utilizaron concentraciones de FasL

equivalentes al doble de lo utilizado en células Jurkat, pero en las publicaciones citadas

anteriormente se utilizaban concentraciones de FasL por sobre los microgramos junto

con anticuerpos anti-Flag (que va unido a FasL). Por lo tanto, con las condiciones

experimentales utilizadas no pudimos lograr inducir muerte celular en linfocitos

normales.

En cuanto a las células A20, resultados de nuestro laboratorio han demostrado

que FasL induce en estas células principalmente muerte celular por necrosis,

proponiéndose que la elevación retardada de ceramidas endógenas promueve la necrosis

ya que la activación de caspasa-8 no es suficiente para inducir apoptosis (Hetz et al.,

2002). A estos resultados se suman otras observaciones que sugieren que ROS liberado

desde las mitocondrias de células tratadas con ceramidas sería un factor crítico que

conduciría a las células hacia la necrosis (Villena et al., 2008). En estos trabajos, las

ceramidas de cadena corta (C6-ceramida) inducen muerte celular por necrosis de manera

112

específica, pero al pre-tratar las células con un secuestrador de anión superóxido (como

Tiron), la necrosis de las células se reduce a pesar de estar en presencia de ceramida.

Adicionalmente, la transfección de células A20 con un adenovirus para la expresión de

catalasa, protege parcialmente de la muerte por necrosis, inducido por ceramida (Villena

et al., 2008). Las líneas celulares murinas analizadas (A20 y A20R) presentan

diferencias en cuanto a la sensibilidad a FasL. Siendo las células A20 sensibles a FasL

(Figura 6B), y en las cuales el principal mecanismo de muerte celular es la necrosis

(Figura 6D). Se determinó por citometría de flujo, los niveles de expresión de Fas,

observándose diferencias en la expresión de Fas, es así como en las células A20 es

posible detectar aproximadamente un 100% de células positivas a Fas en cambio en las

células A20R solo cerca de un 25% de células expresan Fas en su superficie, lo cual

podría explicar las diferencias de sensibilidad entre las células A20 y A20R (Figura 3).

Al analizar la expresión de P2X7, observamos que tanto las células A20 como

A20R expresan P2X7 (Figura 4). Además, a fin de determinar el posible mecanismo de

salida de ATP, se analizó mediante western blot en estas células la expresión de

panexina-1 y conexina-43 observándose que en las células A20 y A20R expresan las

distintas isoformas de panexina-1 (Figura 5A) y altos niveles de conexina-43 (Figura

5B). Al tratar las células con FasL, y cuantificar los niveles de ATP en el sobrenadante

de cultivo tanto en las A20 como A20R no se observan diferencias entre las células

tratadas o no con FasL (Figura 10), lo que de todas maneras no descarta del todo que en

estas células FasL induzca liberación de ATP. Esto podría sugerir que estas células

liberan ATP por una vía distinta y este ATP se degradaría por ectonucleotidasas y de

esta forma ADP, AMP podrían estimular a sus receptores específicos. En este caso la

liberación de ATP sería por mecanismos que no involucrarían la participación de

hemicanales de panexinas o conexinas, esto queda en evidencia al realizar ensayos de

capatacion de etidio en los cuales al estimular las células con FasL no se produce

incorporación de etidio (Figura 13F)

Otra posibilidad es que en las células A20 el no detectar salida de ATP podría

deberse a la actividad de ectonucleotidasas de superficie (CD39). Se ha descrito en

113

linfocitos B humanos mediante citometría de flujo la expresión de CD39 en más del

90% de los linfocitos B normales y neoplásicos y aproximadamente solo un 8% de los

linfocitos T normales (Pulte et al., 2007). Además, en estas células, si bien el ATP

extracelular en si misma es una molécula de señalización, también puede ser hidrolizado

en adenosina. Estas dos moléculas pueden actuar sobre receptores específicos

purinérgicos (P2 y P1, respectivamente) y funcionar como moléculas de señalización

que controlan la respuesta inmune. Es así como el ATP liberado de la célula B es la

principal fuente de la adenosina periférica, mediado esto por la actividad de ectoenzimas

y la eficiente absorción de adenosina, a través de transportadores de nucleósidos

(Sakowicz-Burkiewicz et al., 2010). Por lo tanto, la activación de los linfocitos B puede

ser mediada además de ATP, por ADP, AMP o adenosina por lo que, el hecho de no

detectar ATP con la metodología que usamos en esta Tesis (Figura 10) no significa que

no ocurra activación de otros receptores purinérgicos.

La siguiente aproximación fue determinar la participación de P2X7 en la muerte

celular, para ello se utilizó los inhibidores oATP y BBG. Mediante ensayos de muerte

celular, las células A20, se pre-incubaron con oATP 1 h antes de estimularlas con FasL.

Observamos un aumento de la viabilidad celular (Figura 35A) que se corrobora al

analizar el efecto de oATP sobre la muerte celular, observamos inhibición de la necrosis

en las células A20 (Figura 35B) no tan evidente como en las células Jurkat (Figura 22B),

por lo que se podría suponer la participación de otros P2X o P2Y. A fin de determinar si

solamente P2X7 está involucrado en la inducción de muerte celular, realizamos otros

ensayos pero en presencia de un inhibidor más específico de P2X7 recientemente

descrito y que corresponde a BBG. Para ello pre-tratamos las células A20 con BBG

(Figura 36A), no observándose modulación de la viabilidad ni de la muerte celular por

necrosis (Figura 36C). Esto nos sugiere que en células A20 podrían participar otros

receptores purinérgicos, por lo cual se utilizó suramina como inhibidor de P2Y (1, 2, 6 y

11) y de otros P2X (1, 2, 3, 5). En ensayos de muerte celular, suramina aumenta la

viabilidad (Figura 37A) y produce disminución de la muerte celular por apoptosis

(Figura 37B) no afectando la necrosis (Figura 37C). Esto se demuestra también en un

114

curso temporal con concentraciones fijas de FasL (40 ng/ml) donde se aprecia el mismo

efecto descrito anteriormente a partir de las 9 h (Figura 38B).

En nuestro modelo la activación de P2X7 sería responsable de la producción de

ceramidas y por lo tanto de la muerte celular por necrosis. Para demostrar esto,

utilizamos inhibidores de las distintas vías de la producción de ceramidas: miriocina y

fumonisina B1 (via de novo), imipramina (esfingomielinasa ácida) y GW4869

(esfingomielinasa neutra). Estos inhibidores se evaluaron en células A20 tratadas con

FasL, observándose que solo hay efecto del inhibidor específico de la esfingomielinasa

neutra (GW4869) con un aumento en la viabilidad, que es estadísticamente significativo

(Figura 41A), y disminución de la necrosis (Figura 41C.) Esto podría dar cuenta de la

participación de ceramidas en la necrosis inducida por FasL en células A20.

Finalmente se evaluó la capacidad protectora del antioxidante N-acetilcisteína

(NAC) en las células A20 dado por su capacidad de bloquear la generación de especies

reactivas de oxígeno (ROS). Antecedentes previos del laboratorio dan cuenta del efecto

protector de NAC, al igual que en las células Jurkat, cuando se agrega ceramida (100

M por 6 h) a las células A20 (Villena et al., 2008). Por lo tanto, células A20 se pre-

trataron con NAC (20 mM) 30 min antes de agregar distintas concentraciones de FasL

(0-80 ng/ml) por 16 h. Al evaluar la viabilidad esta aumenta significativamente (Figura

43A), observándose además una disminución de la necrosis (Figura 43C) que es

estadísticamente significativa, y no afectando la apoptosis (Figura 43B).

Al igual que en células Jurkat, se utilizó BzATP como agonista de P2X7, al

estimular las células A20 (Figura 44) con concentraciones crecientes de BzATP (0-600

M) por 16 h y evaluar mediante citometría de flujo la inducción de muerte celular. No

observamos inducción de muerte

En resumen, frente al mismo estímulo en células Jurkat y A20, el tipo de muerte

celular y los mecanismos involucrados son en parte distintos. En células Jurkat la

activación de Fas por FasL lleva por una parte a la activación de caspasa-8 y

posteriormente a la activación de la caspasa-3. Por otro lado se induce también la

liberación de ATP mediada por caspasa-8 a través de canales de panexina-1, esto a su

115

vez llevaría a la activación de P2X7, que gatillaría la muerte celular por apoptosis en un

mecanismo que podría involucrar la participación de ROS. El rol de P2X7 en la

apoptosis queda demostrado al utilizar inhibidores de P2X7 (oATP y BBG) que

disminuyen este tipo de muerte. Esto es un hallazgo importante, ya que en células Jurkat,

que son principalmente células tipo II, además de tBID, el ATP liberado vía panexina-1

también contribuiría a la amplificación de la vía intrínseca de la apoptosis mediante la

activación de P2X7 (Figura 45).

En cambio en células A20 la muerte celular gatillada por FasL es la necrosis, en

este caso no somos capaces de detectar ATP en respuesta a FasL, lo cual podía deberse a

la expresión de CD39 en la superficie de estas células y que llevaría a una rápida

degradación del ATP, pero la muerte por necrosis podría involucrar la participación de

otros P2, ya que oATP si bien disminuye la muerte por necrosis, un inhibidor más

específico como el BBG no logra revertir el efecto de FasL. Lo interesante es que en

estas células al utilizar otro inhibidor, suramina que afecta a varios P2Y y P2X, se

produce una disminución en la muerte por apoptosis (Figura 46), por lo tanto habría

participación de receptores distintos a P2X7 en la muerte celular por apoptosis y necrosis

en los linfocitos B, que podrían involucrar a adenosina a través receptores P1.

116

Limitaciones del Estudio:

En cuanto a la expresión de los receptores P2, no se evaluó otros receptores en

las células Jurkat ni A20. Se sabe que los linfocitos B humanos expresan P2X7, además

de P2X1, P2X2 y P2X4; pero no P2X3, P2X5 y P2X6 (Sluyter et al., 2001), y en los

linfocitos T se expresa P2X1, P2X2, P2X3, P2X4, P2X5 y P2X6 (Lo Bours et al., 2006).

Otra limitación fue que los agonistas de P2X7 (BzATP y NAD+) no tenemos

efecto en cuanto a gatillar la apoptosis en las células jurkat ni la necrosis en las céluals

A20.

Por lo tanto nuestro modelo coincide con lo decrito en la literatura en cuanto a

que vía panexina saldría ATP, pero debido a que los agonistas (BzATP, NAD+) no

logran activar a P2X7 no podemos descartar que en las células Jurkat el ATP pueda

actuar sobre otros recetores P2.

117

Fas-L

Fas

P2X7

ATP

Caspasa-8

APOPTOSIS

Caspasa-3

Panexinas

?

Caspasa-9

tBidROS

ROSROS

??

?

= raft

Figura 45. Modelo de la interacción de los receptores Fas y P2X7 en las células

Jurkat. En este modelo se propone que la unión de FasL a Fas gatilla por una parte la

activación de caspasa-8 y -3 y por otro lado la salida de ATP, vía hemicanales de

panexina-1, en forma dependiente de la actividad de caspasa-8. Este ATP llevaría a la

activación de P2X7 que a su vez por mecanismos no muy claros, que podrían involucrar

a la generación de especies reactivas, que llevaría a la activación de caspasa-9 que

finalmente conduciría a la muerte celular por apoptosis, siendo este el principal

mecanismo de muerte celular en estas células. Cabe destacar que la distribución de Fas,

panexina-1 y P2X7 estaría en dominios raft, lo cual podría explicar la asociación

existente entre Fas y P2X7, vía salida de ATP por los hemicanales de panexina-1,

118

P2X7

ROS

↑ Ceramidas

NECROSISROS

ROS

ATP ?Fas-L

Fas

FADD

Caspasa 8ATP

APOPTOSIS

P2X ó

P2Y

ADP ?

?

?

Figura 46. Modelo de la interacción de los receptores Fas y P2X7 en las células A20.

En este modelo se propone que la unión de FasL a Fas gatilla por una parte la activación

de receptores P2X7 u otros receptores P2, en un mecanismo que podría involucrar la

salida de ATP en forma independiente de hemicanales de panexina-1 o conexina-43.

Este ATP llevará a la activación de receptores P2X7 o podría degradarse por acción de

ectonucleotidasas en ADP o AMP y activar otros receptores P2X e incluso P2Y. La

activación de estos receptores llevaría por una parte al gatillamiento de la muerte celular

por apoptosis y por otra necrosis que podría involucrar la participación de ceramidas,

siendo este el principal tipo de muerte en células A20.

119

6. CONCLUSIONES.

1. El ligando de Fas (FasL) usado en estos estudios induce en células Jurkat

principalmente muerte celular por apoptosis en cambio en células A20 induce necrosis.

2. La salida de ATP es dependiente de la actividad de Fas en células Jurkat.

3. La salida de ATP es dependiente de la actividad de caspasa 8 y no es por daño en la

membrana celular en células Jurkat.

4. La salida de ATP es mediante panexina-1 en células Jurkat.

5. Los inhibidores de P2X7 (oATP, BBG y Cu2+)

inhiben la muerte celular por apoptosis

en células Jurkat tratadas con FasL.

6. En células Jurkat la activación de P2X7 lleva a la muerte celular por apoptosis,

posiblemente por generación de ROS y posteriormente activación de caspasa-9.

7. En células A20 tratadas con FasL, oATP inhibe la muerte celular por necrosis.

8. En células A20 tratadas con FasL, suramina inhibe la muerte celular por apoptosis.

120

PROYECCIONES.

Estudios en células Jurkat de los mecanismos que podrían estar involucrados en

la activación de caspasa-9 por efecto de la activación del receptor P2X7. En las células

A20 se podrían caracterizar los mecanismos que involucran la activación de los

receptores P2X7, P2X u P2Y. Considerando la alta expresión de ectonucleotidasa que

podrían llevar a generación de AMP y ADP los cuales activarían algunos de los

receptores ya mencionados.

Nuestros hallazgos nos hacen pensar en que estos receptores podrían ser blancos

importantes en patologías como enfermedades autoinmunes y enfermedades

inflamatorias del sistema nervioso central.

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