UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA II

ANÁLISIS GENÉTICO Y BIOQUÍMICO DEL CATABOLISMO DEL COLESTEROL EN Mycobacterium smegmatis mc²155

TESIS DOCTORAL

IRIA UHÍA CASTRO Madrid, 2010

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA II

ANÁLISIS GENÉTICO Y BIOQUÍMICO DEL CATABOLISMO DEL COLESTEROL EN Mycobacterium smegmatis mc²155

TESIS DOCTORAL

IRIA UHÍA CASTRO

DIRECTORES:

Dra. BEATRIZ GALÁN SICILIA Dr. JOSÉ LUIS GARCÍA LÓPEZ

CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS

CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS

Madrid, 2010

La miro a V. en los ojos, y mis ojos le dicen que soy un pobre

buscador en el mundo, que no comprendo nada de mi destino ni

del de los demás, que he vivido, y pecado, y creado, y que un

día me iré sin haber comprendido nada, en la oscuridad que nos

ha parido a todos.

J. J.

En la Ciencia la única verdad sagrada, es que no hay verdades

sagradas.

Carl Sagan

A mis padres

AGRADECIMIENTOS

Por si cabe alguna duda, sabed que no se podría entender el trabajo acumulado en estas páginas sin este apartado. Una tesis no son sólo las miles de horas pasadas en el laboratorio intentando que salga ese experimento que no te deja dormir, una tesis es también todo el lado humano que está detrás y que te permite dar lo mejor de ti cada día con ilusión a pesar de los tropiezos. Una tesis es todas las experiencias, buenas y malas, dentro y fuera del laboratorio, acumuladas en estos años, más allá de las pipetas, las electroforesis y los microarrays. No se puede entender lo uno sin lo otro. Por todo eso me es obligatorio dedicar unas líneas a todos los que conformaron el escenario en el que se desarrolló este trabajo, y a todos los que estuvieron entre bastidores. Desde el director hasta el último apuntador, todos son importantes y sin ellos hubiera sido imposible que la obra hubiese empezado y terminado. Es tarea difícil agradecer tantas cosas a tantos en tan poco espacio. Se intentará. Todo sea dicho, os merecéis mucho más.

En primer lugar quiero agradecerle al Doctor José Luis García el haberme “engañado” para realizar la tesis doctoral. Ha sido un camino duro, pero ha merecido la pena. Gracias por tus brillantes ideas, por enseñarme a buscar las mías propias, por intentar que diese lo mejor de mi en todo momento, por saber contagiar esa pasión tan grande que tienes por la ciencia y por aparecer (afortunadamente) como por arte de magia cuando tu presencia es imprescindible y ya empezamos a temer que quizás estés en Vladivostock u otro lugar de nombre más impronunciable si cabe.

Gracias a la Doctora Beatriz Galán (Bea), mi primera compañera de batalla en el mundo nuevo de las micobacerias; empezamos solas ante el peligro rodeadas de Pseudomonas, Escherichia y Azoarcus, ¡pero al final hemos conseguido hacernos un hueco respetable!. Gracias por tus sabios consejos, por enseñarme a ser práctica cuando tiendo al enrevesamiento, por animarme en los momentos de pesimismo científico, por tu actitud siempre positiva y ante todo por ser, además de una gran codirectora de tesis, una estupenda compañera de laboratorio más.

Gracias a todos los miembros de plantilla del grupo de Biotecnología Medioambiental y del grupo de Genética Bacteriana. Creo que uno de los secretos para que un laboratorio funcione a la perfección es que haya entendimiento, cooperatividad y respeto entre los “jefes”; esto siempre influye positivamente en los que estamos más abajo y hace que el ambiente de trabajo sea inmejorable. Felicidades, porque lo habéis conseguido. Gracias al doctor Eduardo Díaz, que nunca deja un cabo suelto, al doctor Manuel Carmona, nuestro experto en evolución, a la doctora Auxiliadora Prieto, maestra de los plásticos, al doctor Rubén López, el patriarca, al doctor Ernesto García, el sentenciador, al doctor Pedro García, eres auténtico, no cambies nunca.

A mis compañeros del día a día: en general gracias a todos porque no creo que hubiese mejores personajes con los que compartir alegrías y penas científicas. Sois los mejores.

En primer lugar me gustaría recordar a Patricia, Cris F y Pepa; prácticamente nos cruzamos, yo entrando de novata y vosotras

saliendo hacia vuestra recién estrenada etapa de post doc. Espero que todo os vaya estupendamente. Gracias a los neumos, tan dispuestos a ayudar en temas científicos como a hacer vídeos al más puro estilo Dogma o a darlo todo

con unos abanicos al ritmo de Locomía: Miri, Elisa, José Yuste, Marta, Beatriz, Miriam, Violeta, Susana, Elo. Gracias María del Mar por esas habitaciones rurales compartidas y por tener siempre en la cara esa sonrisa encantadora que ilumina. Gracias Dani, (el más actor de todos los científicos, el más científico de todos los actores) por descubrirme el mundo de la improvisación teatral; aquí tienes una seguidora incondicional. Gracias María por tantas noches imborrables, por el estupendo viaje a Donosti, por todas las historias con un toootal (especialmente aquella de Koldo Matilla), ¡y felicidades por la peque en camino! Ana, Anitaaaaa!!! Muchas gracias por esa alegría y vitalidad que desprendes por cada poro de tu piel y que consigues contagiarnos; gracias por ser la primera en ir a visitarme al 344 cuando aún era territorio recién conquistado y nadie se atrevía a entrar, gracias por tantas y tantas charlas, algunas de camino a casa al borde de la congelación, pero no importa: siempre es un placer hablar contigo. Vales mucho, convéncete de ello.

Seguiré por los que me quedan más cerquita, los biodegradadores, y en primer lugar por el primer laboratorio en el que hice escala

recién llegada al grupo: el 342. Gracias Irene por ser tan maja y eficiente y ser un apoyo femenino en aquella primera etapa rodeada de testosterona. Gracias Niño; a ti te tocó ejercer de primer papá pato de una Iria totalmente novata; gracias por tu paciencia, por estar siempre dispuesto ayudar, por no quejarte por robarte espacio de poyata y mesa de ordenador, por intentar siempre hacerme reír y conseguirlo, esos primeros meses y los siguientes dos años. Gracias Gonn, el equilibrio perfecto hecho persona, gracias por ponerme bien el cuello de la bata, por estar siempre ahí para lo que haga falta, científico o no, por tomarte la confianza de vacilarme sin ningún pudor, por nonononono, por los conciertos, por tantas y tantas risas. A mis extremeños favoritos: Blas, Blasete, Bleis: gracias por las conversaciones en la campana y fuera de ella, por sorprenderme siempre con nuevas e insospechadas preguntas sobre lo humano y lo divino, por recomendarme buenas series, por tu cruzada pro-cañas los jueves, por tus ji ji ji, por ser tan maligno pero

a la vez tan pedazo de pan, por enseñarme tantos consejillos prácticos en el labo y por supuesto por el cloruro de calcio. Ánimo con el postdoc. ¿Para cuándo una quedada rubenil en Las Vegas? Juan: ha sido un privilegio tenerte sentado detrás gran parte de esta tesis. Gracias por tu paciencia infinita todas las veces (que no fueron pocas) que te asalté con dudas, desde cuánto tiempo se dejaba una ligación hasta cómo se hacía un modelo 3D de proteínas. Y sobre todo por los dibujos de colorines sin los que mi mente cuadriculada todavía no entendería la recombinación homóloga. Te debo más pulpos de los que puedas comer en esta vida. Gracias por los momentos grunge (voy a obviar los momentos Sínkope) y gracias sobre todo, ante todo y a pesar de todo por ser un grandísimo amigo. Aunque intentes esconderte detrás de un gruñón a mí no me engañas: eres de las mejores personas que he conocido.

Gracias al laboratorio de las niñas, el 343, adonde hacía escapadas cuando ya notaba que me estaba masculinizando en demasía.

Gracias Tere por ser el mejor ejemplo a seguir y por luchar contra el caos que nos caracteriza a los biodegradadores; gracias Laura, compañera del metal, por tu mente clara (contado por ti cualquier protocolo parece fácil) y por tu ironía y sarcasmo de los que soy fan número uno, gracias también por salvarme la vida (del ordenador) en un momento de crisis vírica de cuyo nombre no quiero acordarme…Gracias Isa Manso, por esa gracia cordobesa y por no perder tu dulzura e inocencia a pesar que tener que lidiar con los caballeros del 342 durante años. Gracias Merche, mi compañera en la conquista de nuevos territorios, por recordarme que lo más importante en la vida es precisamente eso: vivir y disfrutar de cada momento como si fuera el último; por los cotilleos compartidos y por esa naturalidad tan genial que te caracteriza.

A los que llegaron después de mí: Javier, gracias por tu bondad intrínseca e inseparable de tu persona, porque no importa lo

apurado que estés, siempre tienes un momento para preguntar ¿qué tal te va? o para ayudar en lo que sea; gracias también por aquel sirtaki sueco y por los momentos Tom Jones a última hora de la tarde. Te deseo toda la suerte del mundo. Gracias Isabel por intentar y lograr el milagro de organizar a los rubenes en tantas ocasiones; después de mi momento de coreógrafa sé lo difícil que es. Gracias junto a Javier por ser los mejores guías posibles en el viaje a León. Gracias Vir por ser un encanto de persona siempre dispuesta a escuchar y a dar cariño, por tus despistes con los que me siento tan identificada, por tus momentos de soprano y por las noches en las que lo dimos todo. Gracias Nina por tu vitalidad incombustible, por las tardes de garrapato y póker y por ser una rubena por derecho propio desde el primer día. Gracias Andrés por tus visitas al 344 que siempre acaban con risas, por las “servesitas en el sésped”, por la sincronización en las coreografías y por ser tan buena gente. Gracias Ana V. por ser la torrejonera más buenaza por dentro y por fuera y por saber mantenernos a raya, que ya sabes que si no nos subimos a la chepa…Espero que Esther ya te haya enseñado a preparar el colesterol. Gracias Esther, mi primera discípula en el complicado mundo de las micobacterias y el colesterol, por no desesperarte conmigo ante mi inexperiencia como profesora; espero haber conseguido transmitirte el legado; gracias por ser tan lista y aprender tan rápido, es genial tener a alguien hombro con hombro trabajando en lo mismo, y gracias por los experimentos de última hora. Millones de gracias Valle, porque sin ti seguiríamos sin creernos la existencia de la colestenona, y esta tesis hubiese sido muy triste; gracias por currarte el método de LC/MS y por ese buen rollo tan genial que te rodea siempre. Gracias José Ramos, el sucesor de Merche en el puesto (¡e outro galego por fin!) por las risas máximas, por predicar ese entusiasmo total por la ciencia y por los ánimos cuando a una lo único que le apetecía era tirar la toalla. ¡A ver si coincidimos en más congresos, calamidad! Por último gracias a aquellos que pasasteis más fugazmente por el laboratorio y a los que merece la pena recordar: Valeria (creo que ni tú ni yo olvidaremos nunca el Shingo mama); Dani (mi primer patito) y Julia (¡que parece que te has quedado con ganas de más y vuelves!).

Fuera ya del grupo, pero aun por los pasillos del CIB, tengo que agradecer a Luque sus visitas al 344 para saquear sin miramientos el cajón de las fuentes de carbono, no sin antes conseguir que perdiésemos completamente el hilo de lo que estábamos haciendo a base de charla. A pesar de ello tus historietas siempre son bien recibidas, creo que ya soy adicta. Gracias a los compañeros microbiólogos con los que compartí experiencias y risas en congresos: Juan, Eli, Fátima…Gracias en general a los becarios del CIB por esas terapias de grupo en el Lekumberri, fiestas y casas rurales que hacen que seamos la envidia de los demás centros; en especial gracias a los organizadores profesionales de eventos del CIB, Carlos y R.. Gracias Marta Fierro por ese cocido en Redilluera que nos salvó de la congelación. Gracias a toda la gente de los distintos servicios del CIB que me han ayudado durante estos años: Proteómica, Secuenciación, Servicio Técnico, Gerencia…Gracias Ana por las conversaciones mopa en mano.

Más allá del CIB me gustaría agradecerle al doctor Julián Perera y a su grupo (Oliver, María, Laura, Vicky, Julio) las “reuniones del colesterol”, que ayudan siempre a ver tu trabajo desde otra perspectiva, a resolver dudas y a plantear nuevas. Ha sido muy bueno poder contar con un apoyo tan cerca.

Muchísimas gracias al doctor Carlos Martín y a todo su grupo, en especial al doctor José Antonio Aínsa, por acogerme tan bien en Zaragoza y enseñarme prácticamente todo lo que sé sobre micobacterias, por cederme la cepa Mycobacterium smegmatis mc2155 con la que he trabajado en esta tesis y por su disposición desinteresada para ayudar a lo largo de todos estos años.

Gracias al doctor Neil G. Stoker y a la doctora Sharon L. Kendall por el excelente trato recibido durante mi estancia en su laboratorio y por los conocimientos transmitidos. Gracias también a los demás miembros del grupo: Annemmieke, Ricardo y Dunni, siempre dispuestos a ayudarme.

A todos los que me han acompañado a lo largo de estos años en este Madrid (donde también queda un agujero para mí): Isora, Bea, gracias por ese primer año compartido que tuvo mucho de telenovelesco pero también de experiencias compartidas y compañerismo predoctoral entre tres recién llegadas a Madrid y al mundo de la investigación. Iso, creo que aún sigues siendo mi pareja más estable. Bea, gracias por sentarte a mi lado aquel primer día que llegaste tarde. Gracias a las dos sobre todo por haber conseguido superar las piedras que nos encontramos por el camino y seguir ahí. Gracias Andrés, compartimos piso unos pocos meses, pero te quedaste para siempre con nosotras. Gracias por tu cariño, las cotufas, los marujeos, aquel estupendo viaje a Canarias post-DEA…¡Ánimo en la recta final! Gracias Aniña y Sergio, por hacer que me entendéis cuando os hablo de frustraciones científicas, por hacer tan llevadera la convivencia, por las charlas (en persona y vía Facebook) y por los buenos ratos vividos dentro y fuera del hogar. Gracias a Diana por esas cañitas inocentes que acababan en un metro a las 6 de la mañana, ¿cuándo vienes de visita con tu bólido?; gracias a Borja, que sin saberlo también me ha ayudado, gracias a Javi, al que le ha tocado aguantarme en esta recta final.

A los que compartieron conmigo esos años cruciales en los que decidimos nuestro futuro: gracias a las demás Despojos (Isora, Ro, Carol, Bea, Elena, Sara) por seguir haciendo realidad cada año el milagro de reunirnos, por las visitas a Madrid durante estos años, por supuesto por los años de alegrías y penas en la facultad y porque el milagro se siga repitiendo por muuuchos años. Gracias Mar (Mel!), nunca olvidaré esos años de estudios, siestas, gárgolas, Estela, confesiones, Teruel, Trujillo crest, Nessun dorma y risas; Sandriña, la supercampeona que puede con todo, ¡nos dejas a todos quedar mal! Gracias por tu enorme cariño que no sé como te cabe en ese cuerpecito y por todos los momentos sala rosa compartidos aquí con la anterior y con tantas otras personas y personajes que pasaron por Cadarso.

Gracias Sara por ¿23 años ya? (madre mía) de amistad ininterrumpida; qué te voy a decir a ti, sé que te tengo para lo que haga falta y no dudes que tú me tienes a mí también. Gracias Leti por las escapaditas a Madrid, y por tener siempre una sonrisa y una palabra de ánimo preparadas; gracias a los del “insti”, porque da igual cuánto haga que no nos vemos, cuando quedamos es como si hubiésemos hablado el día anterior, gracias por todos estos años y por tantos momentos inolvidables compartidos: Ana, Carmen, Antía, Héctor, Juan. No importa dónde acabemos cada uno, siempre nos quedará Vigo.

Gracias Edith y Carlos, por animarme a pedir la Beca de Introducción a la Investigación sin la que todo esto no hubiese sido posible; gracias también por el apoyo y los ánimos que me habéis dado a lo largo de estos años, ayuda mucho que crean en ti en los momentos en que una ya no sabe ni en qué creer. Gracias al sector “Villa” (Alfredo, Marisa, Quiqui, Marcos, Alicia, Celia, Víctor…) por ofrecerme gustosamente en repetidas ocasiones vuestro cuerpo para inyectaros bacterias comedoras de lorzas, por preguntarme siempre qué tal me va con mi tesis (e incluso intentar entender de qué va) o simplemente y ante todo por estar ahí para lo que haga falta, que es lo que realmente define a una familia, más que la sangre o los genes compartidos.

Gracias Papá y Mamá por quererme tanto, apoyarme siempre y animarme a que siga mis sueños, aunque eso signifique que esté lejos, que ya sé que preferiríais que estuviese más a mano…Gracias por estar tan orgullosos de mí aunque no merezca ni la mitad de tanto orgullo, gracias por aceptarme como soy y por tener la culpa en gran medida de que sea como soy; sin duda sois las dos personas más importantes de toda esta lista y de todo este libro.

Ha sido un placer.

Índice

ÍNDICE

ABREVIATURAS I. INTRODUCCIÓN 1. El colesterol y los compuestos esteroideos 1.1 Esteroides y esteroles

1.2 El colesterol y moléculas derivadas en animales

1.3 Impacto ambiental del colesterol y de las moléculas derivadas del

colesterol

2. Rutas microbianas de degradación de compuestos esteroideos 2.1 Degradación aeróbica de esteroides

2.1.1 Degradación aeróbica del colesterol

2.1.2 Enzimas responsables de la transformación de colesterol en 4-

colesten-3-ona

2.1.2.1 Enzimas con actividad colesterol oxidasa

2.1.2.2 Enzimas con actividad 3-β hidroxiesteroide deshidrogenasa

2.2 Degradación anaeróbica de esteroides

3. Regulación de las rutas de degradación de compuestos esteroideos 4. Mecanismos de transporte del colesterol 5. Degradación aeróbica del colesterol y compuestos esteroideos en el

género Mycobacterium

II. OBJETIVOS III. MATERIALES Y MÉTODOS 1. Cepas bacterianas, plasmidos y oligonucleótidos utilizados 2. Medios y condiciones de cultivo 2.1 Escherichia coli

2.2 Mycobacterium smegmatis

3. Transformación de las células

3.1 Transformación de Escherichia coli

3.2 Transformación de Mycobacterium smegmatis

3.2.1 Preparación de células electrocompetentes

3.2.2 Electroporación

vii

1334

9101214

202022232525

27

33

37394545454848484849

i

Índice

ii

4. Técnicas de DNA

4.1 Electroforesis de DNA en geles de agarosa

4.2 Extracción de DNA cromosómico de micobacterias

4.3 Aislamiento de DNA plasmídico

4.4 Reacción de amplificación en cadena con DNA polimerasa termorresistente

(PCR)

4.5 Secuenciación de DNA

4.6 Construcción de cepas mutantes de Mycobacterium smegmatis mc2155

mediante mutagénesis insercional

4.7 Construcción de cepas mutantes de Mycobacterium smegmatis mc2155

mediante deleción por recombinación homóloga

5. Técnicas de proteínas 5.1 Obtención de los extractos proteicos

5.1.1 Extractos de Escherichia coli

5.1.2 Extractos de Mycobacterium smegmatis

5.2 Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS

5.3 Purificación de la proteína KstR

5.4 Ensayos enzimáticos

5.4.1 Ensayos in vitro de actividad productora de 4-colesten-3-ona para

análisis mediante TLC y LC/MS

5.4.2 Ensayos in vivo de actividad productora de 4-colesten-3-ona para

análisis mediante TLC y LC/MS

6. Ensayos de unión DNA-Proteína 6.1 Marcaje de sondas con 32P

6.2 Ensayos de retardo en gel

6.3 Ensayos de protección frente a la digestión con DNasa I (footprinting)

7. Técnicas de RNA 7.1 Extracción de RNA de micobacterias

7.2 Retrotranscripción seguida de reacción de PCR (RT-PCR semicuantititiva)

7.3 Retrotranscripción para PCR en tiempo real

7.4 PCR en tiempo real (q-PCR)

7.5 Análisis genómico de M. smegmatis bajo diferentes condiciones de

cultivo mediante microarrays de RNA

49505051

5151

52

5558585858595960

60

62636363646565666667

67

Índice

iii

7.5.1 Síntesis y marcaje del cDNA

7.5.2 Hibridación de los microarrays

7.6 Técnica de primer extension o extensión con cebador

8. Cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS) 9. Cromatografía en capa fina (TLC) 10. Análisis de los datos de secuencia IV. RESULTADOS 1. Potencial catabólico de compuestos esteroideos y caracterización

genética in silico y mediante RT-PCR de la ruta de degradación del colesterol en M. smegmatis mc2155 1.1 Crecimiento de M. smegmatis mc2155 en distintos esteroides

1.2 Identificación y caracterización in silico de genes de M. smegmatis y M.

tuberculosis implicados en el metabolismo del colesterol

1.3 Validación de los genes identificados in silico mediante análisis de su

expresión por RT-PCR

1.4 Búsqueda de un indicador genético de degradación de esteroides en

bacterias

2. Estudio de enzimas que catalizan la transformación de colesterol en 4 colesten-3-ona

2.1 Análisis in silico de genes que codifican actividad colesterol oxidasa o

deshidrogenasa

2.1.1 MSMEG_1604

2.1.2 MSMEG_5228

2.2 Análisis mediante RTq-PCR de la expresión diferencial en colesterol de los

genes MSMEG_1604 y MSMEG_5228

2.3 Clonación y expresión heteróloga de los genes MSMEG_1604 y

MSMEG_5228

2.3.1 Clonación de los genes MSMEG_1604 y MSMEG_5228

2.3.2 Expresión heteróloga de MSMEG_1604

2.3.3 Expresión heteróloga de MSMEG_5228

2.4 Ensayos enzimáticos mediante TLC con colesterol marcado con 14C

2.4.1 Experimentos in vitro con ChoDMS y 3-β HSDMS. Cinética enzimática

2.4.2 Detección de la actividad de ChoDMS in vivo

686970727474

77

7979

82

89

95

97

9898

103

108

109109111112112113116

Índice

iv

2.5 Ensayo de ChoDMS y 3-β HSDMS mediante LC/MS

2.6 Ensayo de afinidad de ChoDMS por el colesterol

2.7 Mutagénesis de MSMEG_1604 y MSMEG_5228

2.7.1 Ensayos de crecimiento en colesterol de los distintos mutantes

2.7.2 Ensayos de sobrenadante de cultivo en colesterol de los distintos

mutantes mediante TLC

2.7.3 Ensayos de sobrenadante de cultivo en colesterol de los distintos

mutantes mediante LC/MS

2.8 Búsqueda de nuevas enzimas con actividad colesterol

oxidasa/deshidrogenasa: SDRMS

2.8.1 Análisis in silico de genes ortólogos a acmA

2.8.2 Análisis mediante RTq-PCR de la expresión diferencial en colesterol

del gen MSMEG_5233

2.8.3 Clonación y expresión heteróloga del gen MSMEG_5233

2.8.4 Cinética enzimática de SDRMS mediante TLC con colesterol marcado

con 14C

2.8.5 Ensayos mediante LC/MS de SDRMS

2.8.6 Mutagénesis del gen MSMEG_5233

2.8.6.1 Ensayos de crecimiento con el mutante M.

smegmatis::MSMEG_5233

2.8.6.2 Análisis de la composición del sobrenadante de cultivo en

colesterol del mutante M. smegmatis::MSMEG_5233

mediante TLC

2.8.6.3 Ensayos de sobrenadante de cultivo en colesterol del

mutante M. smegmatis::MSMEG_5233 mediante LC/MS

3. Análisis genómico mediante microarrays de la ruta de degradación del colesterol

3.1 Resultados de los análisis mediante microarrays del genoma de M.

smegmatis mc2155

3.2 Validación de los resultados de expresión obtenidos con los microarrays

mediante RTq-PCR

4. Estudio mediante mutagénesis insercional de diversos genes implicados en el metabolismo del colesterol

4.1 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_6036

117119121121

123

124

127128

132133

136137139

139

140

141

144

145

170

172

173

Índice

v

4.2 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_1366

4.3 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_5995

4.4 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_0217

4.5 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_1543

4.6 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_3519

5. Introducción al estudio de la regulación transcripcional del catabolismo del colesterol por las proteínas represoras KstR y KstR2

5.1 Ensayos de crecimiento con los mutantes de los reguladores KstR y KstR2

5.2 Introducción al estudio del represor transcripcional KstR

5.2.1 Caracterización del promotor P5228

5.2.1.1 Identificación del sitio de inicio de la transcripción del promotor

P5228

5.2.2 Regulación del promotor P5228 por KstR

5.2.2.1 Clonación, hiperexpresión y purificación de la proteína KstRMsm

5.2.2.2 Unión de KstR a la región intergénica 5228

5.2.2.3 Determinación de las regiones operadoras de KstR en la

región promotora de MSMEG_5228

5.3 Estudio de la regulación mediada por KstR2 mediante la técnica de

microarrays

5.3.1 Resultados de los análisis mediante microarrays de M.

smegmatisΔkstR2

V. DISCUSIÓN 1. Estudio del potencial catabólico de degradación de esteroides de M.

smegmatis mc2155 2. Análisis de las enzimas que catalizan la transformación de colesterol en 4-

colesten-3-ona en M. smegmatis mc2155 3. Análisis global de los genes inducidos diferencialmente en colesterol en

M. smegmatis mc2155 4. Estudio de los reguladores transcripcionales KstR y KstR2 VI. CONCLUSIONES VII. BIBLIOGRAFÍA

175177180181182

183184185186

187189190192

194

196

197

201

203

204

209220

227

231

vi

Abreviaturas

ABREVIATURAS A: Adenina

AD: 4-androstadien-3,17-diona

ADD: 1,4-androstadien-3,17-diona

Apr: Resistencia a ampicilina

APCI+: Ionización química a presión atmosférica

at: Atmósfera

ATP: Adenosina trifosfato

Bq: Bequerelio

BSA: Seroalbúmina bovina

C: Citosina

ºC: Grado centígrado

cDNA: DNA complementario

Ci: Curio

CO: Colesterol oxidasa

CoA: Coenzima A

C-terminal: Carboxilo terminal

Cy3: Cianina 3

Cy5: Cianina 5

Cy3-dCTP: Desoxicitosina trifosfato marcado con cianina 3

Cy5-dCTP: Desoxicitosina trifosfato marcado con cianina 5

Da: Dalton

dATP: Desoxiadenina trifosfato

dCTP: Desoxicitosina trifosfato

DEPC: Dietilpirocarbonato

dGTP: Desoxiguanina trifosfato

3,4-DHSA: 3,4-dihidroxi-9,10-secoandrosta-1,3,5(10)-trien-9,17-diona

DMSO: Dimetilsulfóxido

DNA: Ácido desoxirribonucleico

DNasa: Desoxirribonucleasa

DNP: 2,4-Dinitrofenol

vii

Abreviaturas

dNTP: Desoxinucleótido trifosfato

DO600: Densidad óptica medida a 600 nanómetros

DOHNAA: Ácido 9,17-dioxo-1,2,3,4,10,19-hexanorandrostan-5-oico

4,9-DSHA: Ácido 4,5,9,10-diseco-3-hidroxi-5,9,17-trioxoandrosta-1(10), 2-dien-4-

oico

DTT: Ditiotreitol

http: Desoxitimidina trifosfato

ε: Coeficiente de extinción molar

EDTA: Ácido etilendiaminotetracético

FAD: Dinucleótido de flavina y adenina oxidado

FDR: False Discovery Rate

G: Guanina

g: gramo

g: Unidades de fuerza G

Gmr: Resistencia a gentamicina

GTP: Guanosina trifosfato

h: Hora

HEPES: Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperacinetanosulfónico

3-HAS: 3-hidroxi-9,10-secoandrosta-1,3,5(10)-trien-9,17-diona

HTH: Dominio hélice-giro-hélice

IPTG: Isopropil-β-D-tiogalatopiranósido

Kb: 1000 pares de bases

kDa: 1000 dalton

Kmr: Resistencia a kanamicina

kV: Kilovoltio

L: Litro

LB: Medio de cultivo Luria-Bertani

LC/MS: Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas

μCi: 10−6 curios

μF: 10−6 faradios

μg: 10−6 gramos

μl: 10−6 litros

viii

Abreviaturas

μM: Micromolar M: Molar

MCS: Sitio de clonación múltiple

mg: miligramo

min: Minuto

ml: Mililitro

mM: Milimolar

MOPS: Ácido 3-(N-morfolin) propanosulfónico

mRNA: RNA mensajero

MS/MS: Espectrometría de masas tándem

m/z: Relación masa/carga

NAD: Nicotinamina-adenina-dinucleótido oxidado

NADH: Nicotinamina-adenina-dinucleótido reducido NADP: Fosfato de nicotinamina-adenina-dinucleótido oxidado

NADPH: Fosfato de Nicotinamina-adenina-dinucleótido reducido

ng: Nanogramo

nM: Nanomolar

nm: Nanómetro

N-terminal: Amino terminal

Ω: Ohmio

ORF: Marco abierto de lectura

P: p-valor

PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida

pb: Pares de bases

PCR: Reacción de amplificación en cadena con DNA polimerasa termorresistente

PDB: Protein Data Bank

PIPES: Sal disódica del ácido piperazina-N, N-bis2 etano sulfónico

pmol: Picomol

PMSF: fenil metanosulfonilfluoruro

p/v: relación peso/volumen

RBS: Sitio de unión al ribosoma

RNA: Ácido ribonucleico

ix

Abreviaturas

RNasa: Ribonucleasa

rpm: Revoluciones por minuto

RT-PCR: Reacción de retrotranscripción acoplada a PCR

RTq-PCR: Reacción de retrotranscripción acoplada a PCR en tiempo real

s: Segundo

SD: Secuencia Shine-Dalgarno de unión al ribosoma

SDR: Superfamilia de las deshidrogenasas/reductasas de cadena corta SDS: Dodecilsulfato sódico

SSC: Tampón citrato sódico salino T: Timina

TAE: Tampón Tris-Acetato-EDTA

TBE: Tampón Tris-Borato-EDTA

TE: Tampón Tris-EDTA

TLC: Cromatografía en capa fina

Tris: Trihidroximetilaminometano

tRNA: RNA de transferencia U: Unidad de actividad enzimática

V: Voltio

v/v: Relación volumen/volumen

X-gal: 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido

ABREVIATURAS PARA AMINOÁCIDOS: Ala (A): Alanina Gly (G): Glicina Pro (P): Prolina

Arg (R): Arginina His (H): Histidina Ser (S): Serina

Asn (N): Asparragina Ile (I): Isoleucina Thr (T): Treonina

Asp (D): Aspártico Leu (L): Leucina Trp (W): Triptófano

Cys (C): Cisteína Lys (K): Lisina Tyr (Y): Tirosina

Gln (Q): Glutamina Met (M): Metionina Val (V): Valina

Glu (E): Glutámico Phe (F): Fenilalanina

x

Introducción

I. INTRODUCCIÓN

1

Introducción

2

Introducción

I. INTRODUCCIÓN

1. El colesterol y los compuestos esteroideos 1.1 Esteroides y esteroles

Los esteroides son compuestos de gran importancia en biología, medicina y

química que se encuentran ampliamente distribuidos en el medio ambiente. Su

estructura contiene un esqueleto de ciclopentanoperhidrofenantreno o un

esqueleto derivado de éste por rotura de uno o más enlaces o contracción o

expansión de los anillos (Fig. 1 A). Este esqueleto consiste en cuatro anillos

fusionados, tres de seis carbonos y uno de cinco carbonos, que se nombran con

las letras A-D. Este núcleo esteroideo es prácticamente plano y relativamente

rígido de tal manera que los anillos fusionados no permiten la rotación en los

enlaces C-C. Normalmente aparecen grupos metilo en las posiciones C-10 y C-13

y en la posición C-17 puede aparecer una cadena lateral tipo alquilo (JCBN, 1989).

Los esteroles son compuestos esteroideos que poseen un grupo hidroxilo en

la posición C-3 y que conservan la mayor parte del esqueleto del colestano,

formado por el núcleo esteroideo y una cadena lateral de 8 átomos de carbono en

el carbono 17 (Fig. 1 B). En la cadena lateral suelen presentar más átomos de

carbono (JCBN, 1989). Entre los esteroles de origen natural destacan los

fitosteroles en plantas, el ergosterol en hongos y levaduras, y el colesterol en

células animales. Todos ellos desempeñan una importante función como agentes

estabilizantes de las membranas celulares de los organismos en los que se

encuentran y como precursores de una gran variedad de productos con

actividades biológicas específicas.

El colesterol (3-hidroxi-5,6-colesteno) (Fig. 2) es un esterol de 27 átomos de

carbono en el que el grupo hidroxilo adopta una configuración β. Este alcohol

policíclico ha sido una de las moléculas biológicas más estudiadas, ya que es un

componente esencial de todos los tejidos animales (Bloch, 1965). El colesterol es

3

Introducción

una de las moléculas más comunes en la naturaleza, donde se encuentra

formando parte de las membranas celulares de las células animales, aunque

también se encuentra en algunos organismos procariotas, como se comentará

más adelante.

1

2

3

45

10

67

89

1112

13

1415

16

17

18

19

2021

22

23

24

25

26

27

A B

C D1

7

910

12

14 15

1711

8

16

13

3

2

54 6

1

2

3

45

10

67

89

1112

13

1415

16

17

18

19

2021

22

23

24

25

26

27

A B

C D1

7

910

12

14 15

1711

8

16

13

3

2

54 6

A B

Figura 1. Estructura química del ciclopentanoperhidrofenantreno (A) y del colestano (B). La nomenclatura de los átomos de carbono y de los anillos está indicada en la figura.

1.2 El colesterol y moléculas derivadas en animales

1

2

3

45

10

67

89

1112

13

1415

16

17

18

19

2021

22

23

24

25

26

27

HO

A B

C D

Figura 2. Fórmula química del colesterol. La nomenclatura de los átomos de carbono y de los

anillos está indicada en la figura.

4

Introducción

Aunque es una molécula esencial para muchos animales, incluido el ser

humano, los mamíferos no requieren el colesterol en la dieta, ya que todas las

células pueden sintetizarlo a partir de precursores simples. Aunque la estructura

de los esteroles sugiere una ruta biosintética complicada, en los organismos

eucariotas se sintetizan a partir de subunidades simples de isopreno. La síntesis

de colesterol en animales tiene lugar en cuatro etapas, mostradas resumidamente

en la figura 3. Esta síntesis es particularmente activa en el hígado, corteza renal,

piel, intestino y en la aorta (Bloch, 1965). Dado que la cantidad total de colesterol

(absorbido más sintetizado) sobrepasa la cantidad requerida por el organismo

para atender al normal funcionamiento celular, parte de ese colesterol debe ser

eliminado. Debido a que los mamíferos carecen de las enzimas necesarias para

degradar el núcleo del colesterol, este se excreta tal cual, con pequeñas

modificaciones estructurales o bien transformado en otros compuestos esteroideos

(ácidos biliares u hormonas esteroideas) (Björkhem y Eggertsen, 2001).

5

Introducción

-OOC-CH2-C-CH2-OHCH3

OH

1

Mevalonato

Acetil-CoA

3 CH3-COS-CoA

CH

HO

2

CH3

C-CH2-CH2-O-P-O-P-O-

O

-O

O

-O

Escualeno Colesterol

2

3

4

Isopreno activado

Figura 3. Resumen de la ruta biosintética del colesterol en animales. 1) Condensación de tres

unidades de acetato para formar un intermediario de seis átomos de carbono, el mevalonato. Tres

moléculas de acetil-CoA se condensan para formar el compuesto ß-hidroxi-ß-metilglutaril-CoA

(HMG-CoA). La enzima HMG-CoA reductasa cataliza la reducción de HMG-CoA a mevalonato. 2)

Conversión del mevalonato a unidades activadas de isopreno; 3) polimerización de seis unidades

de isopreno para formar el escualeno, estructura lineal de 30 carbonos; y 4) ciclación del escualeno

para formar los cuatro anillos del núcleo esteroideo, con una serie de cambios más (oxidaciones,

eliminación o migración de grupos metilo) hasta la formación del colesterol (Nelson y Cox, 2004).

Como ya se ha comentado anteriormente, el colesterol tiene una gran

importancia metabólica, ya que es el precursor inmediato de un gran número de

sustancias tales como vitaminas, hormonas esteroideas y ácidos biliares (Fig. 4)

6

Introducción

(Björkhem y Eggertsen, 2001; Miller, 1988). Todas las hormonas esteroideas

derivan del colesterol (Fig. 4). En la corteza de la glándula adrenal se sintetizan

dos clases de hormonas esteroideas: los mineralocorticoides, que controlan la

reabsorción de iones inorgánicos (Na+, Cl-, y HCO3-) por el riñón, y los

glucocorticoides, que afectan al metabolismo de proteínas y carbohidratos

(participan en la regulación de la gluconeogénesis, por ejemplo), reducen la

respuesta inmune, la inflamación y las respuestas alérgicas. Las hormonas

sexuales se producen en las gónadas masculinas y femeninas y en la placenta.

Entre ellas se encuentran la progesterona, que regula el ciclo reproductivo

femenino, y los andrógenos (como la testosterona) y estrógenos (como el

estradiol), que influyen en el desarrollo de los caracteres sexuales secundarios

masculinos y femeninos, respectivamente. La síntesis de estas hormonas requiere

la eliminación de algunos o todos los carbonos de la cadena lateral situada en el

carbono 17 del anillo D del colesterol. Esta eliminación de la cadena lateral tiene

lugar en la mitocondria de los tejidos esteroidogénicos, e incluye la hidroxilación

de dos carbonos adyacentes en la cadena lateral (carbonos 20 y 22) seguida de la

rotura de la unión entre ellos. La formación de las diversas hormonas también

envuelve la introducción de átomos de oxígeno. Todas las reacciones de

hidroxilación y oxigenación están catalizadas por enzimas oxidasas de función

mixta que utilizan NADPH, O2 y el citocromo P-450 mitocondrial. Los ácidos y

sales biliares (Fig. 4) son derivados hidrofílicos del colesterol que tienen un papel

importante en la digestión, donde participan en la emulsión de las grasas de la

dieta. Por último, la vitamina D también deriva de la molécula de colesterol. La

vitamina D3 (Fig. 4), también llamada colecalciferol, se forma normalmente en la

piel a partir del 7-deshidrocolesterol en una reacción fotoquímica catalizada por el

componente ultravioleta de la luz solar. Posteriormente es convertida por enzimas

en el hígado y los riñones a 1,25-dihidroxicolecalciferol, la hormona activa, que

regula la absorción de calcio en el intestino y los niveles de calcio en riñones y

hueso (Nelson y Cox, 2004).

7

Introducción

HO

Cortisol (glucocorticoide)

OH

HO

HO

O

O

O

O

O

OH

OH

HO

O

O

OH

OH

HOO OH

O

Colesterol

Pregnenolona

Progesterona

Aldosterona (mineralocorticoide)

Testosterona (andrógeno)

Estradiol (estrógeno)

NH

HO OH

OH

O

SO3-

HORMONAS ESTEROIDEAS ÁCIDOS BILIARES VITAMINA D3 (colecalciferol)

HO

Figura 4. Estructura química de algunas de las moléculas derivadas del colesterol.

El colesterol es un compuesto popularmente conocido por los nocivos efectos

que causa su excesiva concentración en nuestro organismo y por las numerosas

estrategias que se han desarrollado para la prevención de dichos efectos a través

de la promoción y divulgación de las dietas bajas en colesterol (Denke, 1995).

Cuando la suma del colesterol sintetizado e ingerido en la dieta excede la cantidad

8

Introducción

requerida para la síntesis de membranas, sales biliares y esteroides, pueden

desarrollarse acumulaciones patológicas del mismo en los vasos sanguíneos

(placas arterioscleróticas) que resultan en su obstrucción (arteriosclerosis). El fallo

cardíaco debido a la obstrucción de arterias coronarias es una de las principales

causas de muerte en la sociedad industrializada. Por otro lado, muchos de los

derivados del colesterol o de los compuestos con él relacionados poseen un gran

valor como intermediarios en la síntesis de esteroles y esteroides de interés

farmacológico, por lo que durante décadas la industria químico-farmacéutica les

ha prestado gran atención (Demain, 1992; Sedlaczek y Smith, 1988).

1.3 Impacto ambiental del colesterol y de las moléculas derivadas del colesterol

Entre los miles de nuevos compuestos contaminantes vertidos al medio

ambiente como consecuencia de la actividad humana, se observa, cada vez con

más frecuencia, la aparición en diferentes ecosistemas de numerosas moléculas

que poseen estructura esteroídica o que son derivados directos de compuestos

que poseen dicha estructura. Muchos de esos compuestos poseen potentes

actividades metabólicas que afectan a un gran número de procesos celulares

(algunos de ellos tan esenciales como la proliferación celular, control de ciclo

celular, mecanismos básicos de reconocimiento intercelular, etc.) por lo que su

presencia y/o acumulación en determinados nichos ecológicos puede causar

efectos muy perjudiciales sobre la salud humana y alterar los ciclos biológicos de

las especies que forman parte de esos ecosistemas.

La contaminación procede en parte como resultado de diversas actividades

industriales, pero también de los efluentes municipales, que son hoy en día una de

las mayores fuentes de emisión de estos residuos, ya que esos vertidos no sólo

aportan hidrocarburos, pesticidas, surfactantes y distintos metales, sino que

también aportan esteroles y esteroides de origen natural y sintético. En este

sentido, recientemente los productos farmacéuticos y los denominados productos

para el cuidado personal (PPCPs) han sido clasificados como una clase

emergente de contaminantes de especial relevancia para los medios acuáticos

9

Introducción

(Gagné et al., 2006). Entre estos productos se encuentran muchos compuestos de

naturaleza esteroídica de origen farmacéutico. Así por ejemplo el anticonceptivo

sintético oral 17α-etinilestradiol es considerado responsable, junto con los

estrógenos 17β-estradiol y estrona de causar la producción de vitelogenina

(feminización) en peces macho (Daughton y Ternes, 1999). Este fenómeno de

feminización fue observado por vez primera en lagunas de tratamiento de aguas

residuales a mediados de los años 80 (Routledge et al., 1998). Además, hay que

señalar que el colesterol es el principal componente de la lanolina, y este y otros

esteroles relacionados son contaminantes naturales bastante resistentes al

tratamiento anaeróbico que se lleva a cabo sobre los efluentes procedentes del

lavado industrial de la lana (Poole y Cord-Ruwisch, 2004). Estos efluentes

derivados del lavado de la lana están expresamente reconocidos como altamente

contaminantes por la legislación española nacional y autonómica que regula el

impacto ambiental de los residuos industriales. La cantidad de estrógenos

procedentes de fuentes animales es de menor importancia que la procedente de

aguas residuales, pero los residuos de estiércol contribuyen de manera importante

a su entrada en el medio ambiente (Hanselman et al., 2003; Raman et al., 2004).

El estiércol procedente de ganado y aves de corral también es considerado una

fuente de testosterona ambiental (Lee et al., 2003).

2. Rutas microbianas de degradación de compuestos esteroideos

Aunque se trata de moléculas naturales muy abundantes en la biosfera, el

colesterol y sus derivados son relativamente resistentes a la degradación

microbiana. El hecho de que el colesterol sea una molécula recalcitrante es

atribuido al bajo número de grupos funcionales (un único doble enlace C-C y un

sólo grupo hidroxilo), a su baja solubilidad en agua (3 x 10-8 M) y a la complejidad

de su conformación espacial. Su hidrofobicidad y baja volatilidad hacen que sean

compuestos en los que su absorción a fases sólidas es significativa en cuanto a su

presencia en el medio natural. Así por ejemplo, estudios acerca de la absorción

del estradiol en sedimentos fluviales predicen que menos del 1% del esteroide

10

Introducción

presente puede ser movilizado por sedimentos resuspendidos (Holthaus et al.,

2002). Por su alto índice de persistencia, el colesterol y algunos de sus derivados

primarios, como el coprostanol, son ubicuos y se utilizan como biomarcadores de

referencia en algunos análisis de contaminación medioambiental (Veiga et al.,

2005).

Centrándonos en la degradación bacteriana del colesterol, hay que señalar

que, por su importancia, este compuesto no ha pasado desapercibido y así la

búsqueda de microorganismos capaces de degradar colesterol se inició hace más

de 70 años. Ya a principios del siglo XX se observó que varias especies de

Mycobacterium podían utilizar el colesterol como única fuente de carbono y

energía (Söhngen, 1913). Años más tarde se comprobó que microorganismos

pertenecientes al género Proactinomyces eran capaces de degradar parcialmente

el colesterol añadido al medio de cultivo y que algunos de ellos, en particular P.

erytrhopolis, posteriormente renombrado como Rhodococcus erythropolis,

acumulaba ciertos compuestos estructuralmente relacionados con el colesterol, lo

que ponía de manifiesto su capacidad para transformar esta molécula y su uso

potencial para obtener nuevos derivados esteroídicos (Turfitt, 1944; Turfitt, 1948).

Además se comprobó que ciertas especies de Azotobacter podían transformar el

colesterol en 4-colesten-3-ona o en 7-deshidrocolesterol y que muchas de ellas

hidrolizaban la cadena lateral generando metilheptanona que se acumulaba en el

medio de cultivo (Horvath y Kramli, 1947). Whitmarsh demostró que ciertas

especies de Nocardia aisladas del suelo eran capaces de hidrolizar la cadena

lateral del colesterol transformando esta molécula en diferentes derivados

esteroídicos, muchos de los cuales tenían características parecidas a ciertas

hormonas sexuales (Whitmarsh, 1964). Otros autores pusieron de manifiesto que

distintas bacterias pertenecientes a los géneros Nocardia, Arthrobacter, Bacillus,

Brevibacterium, Corynebacterium, Streptomyces, Microbacterium, Serratia,

Achromobacter, Pseudomonas o Protaminobacter, entre otras, eran capaces de

degradar total o parcialmente el colesterol y otros esteroles (Arima et al., 1969;

Brown y Peterson, 1966; Chipley et al., 1975; Ferreira y Tracey, 1984; Martin,

1977; Nagasawa et al., 1969; Tak, 1942), si bien hay que decir que muchas de

estas cepas hoy en día se clasifican de diferente manera. A este respecto hay que

11

Introducción

señalar que Owen y colaboradores describieron en 1983 una cepa de

Pseudomonas con capacidad para mineralizar el colesterol, Pseudomonas sp.

NCIB 10590, la única bacteria Gram-negativa con capacidad de utilizar el

colesterol como única fuente de carbono y energía en aerobiosis descrita por el

momento (Owen et al., 1983). Desgraciadamente, la capacidad de esta cepa para

degradar colesterol no ha podido ser reproducida en nuestro laboratorio, ya que el

único cultivo que actualmente se conserva de la misma en la colección inglesa

NCIB no es capaz de crecer en estas fuentes de carbono (comunicación

personal), por lo que su operatividad actual está cuestionada.

Hay que señalar que existe un conocimiento limitado de las bases genéticas

y bioquímicas de las rutas catabólicas de estos compuestos, si bien es evidente

que un conocimiento detallado de las mismas podría permitir un uso más racional

de estos procesos y aportar a la industria farmacéutica enzimas con nuevas

propiedades susceptibles de ser producidas, modificadas y mejoradas por técnicas

de ingeniería de proteínas. Por otro lado, la aplicación de elementos y sistemas

biológicos a la resolución racional del problema de la eliminación de esteroles

contaminantes, también requiere un profundo conocimiento de su metabolismo a

nivel genético y bioquímico. La definición y caracterización de las rutas

metabólicas de estos compuestos permitiría emplear los procedimientos de

ingeniería metabólica para la modificación, el control y la ampliación de las

capacidades degradativas de diversas cepas bacterianas, para su utilización como

agentes biológicos descontaminantes. Tampoco se puede olvidar que el colesterol

desempeña un papel importante en la dieta y que existe mucho interés por reducir

la cantidad de colesterol en los alimentos. La posibilidad de modificar y ensamblar

estas rutas en organismos probióticos capaces de reducir el nivel de colesterol en

los alimentos de la dieta y/o en el intestino puede ser un objetivo técnicamente

posible a medio plazo.

2.1 Degradación aeróbica de esteroides

En la actualidad, el catabolismo aeróbico de esteroides en bacterias Gram-

negativas se ha estudiado en profundidad en Comamonas testosteroni TA441

12

Introducción

(anteriormente denominada Pseudomonas testosteroni), una cepa que además de

testosterona es capaz de utilizar también los ácidos biliares como fuente de

carbono y energía, pero no el colesterol. Se ha estudiado exhaustivamente la ruta

de degradación de la testosterona en esta bacteria, y muchas de las etapas de la

misma se han caracterizado a nivel genético y bioquímico (Horinouchi et al., 2001;

Horinouchi et al., 2003a; Horinouchi et al., 2003b; Horinouchi et al., 2004a;

Horinouchi et al., 2004b; Horinouchi et al., 2005). Así, la mayoría de los genes de

la ruta de degradación de la testosterona, denominados genes tes, ya han sido

caracterizados, si bien aún existen algunas lagunas de conocimiento sobre su

funcionalidad. En esta bacteria se han caracterizado muy bien algunas enzimas

(así como sus respectivos genes) que intervienen en la metabolización de

esteroides. Entre ellas cabe destacar la 3α-hidroxisteroide

deshidrogenasa/carbonilreductasa (3α-HSD/CR codificada por el gen hsdA), que

cataliza la oxidorreducción en posición 3 de una gran variedad de esteroides C19-27

(Hwang et al., 2005); la 3-oxo-Δ5-Δ4-esteroide isomerasa (KSI), que transforma la

5-androsten-3,17-diona en 4-androsten-3,17-diona (4-AD) (Kuliopulos et al., 1987);

y las Δ4-deshidrogenasas (Δ4-DHs, 3-oxo-Δ4(5α)-esteroide y 3-oxo-Δ4(5β)-

esteroide deshidrogenasas), que catalizan la conversión del 1-androstene-3,17-

diona (1-AD) (anillos A:B trans o cis, respectivamente) en ADD (Florin et al., 1996).

Dentro de grupo de las bacterias Gram-positivas, el género Rhodococcus

tiene un gran potencial catabólico (Larkin et al., 2005; van der Geize y Dijkhuizen,

2004). En él se han descrito algunas cepas capaces de degradar colesterol y

recientemente se ha avanzado en el estudio de algunas enzimas implicadas en el

metabolismo de esteroides, tales como la colesterol oxidasa, la 3-cetoesteroide

Δ1-deshidrogenasa o la 3-cetoesteroide 9α-hidroxilasa (Ivshina et al., 2005; Knol et

al., 2008; Morii et al., 1998; Navas et al., 2001; van der Geize et al., 2000; van der

Geize et al., 2002b; van der Geize et al., 2008). El reciente análisis completo del

genoma de Rhodococcus jostii cepa RHA1 (McLeod et al., 2006) ha revelado la

existencia de un conjunto de genes que podrían estar implicados en el

catabolismo del colesterol (van der Geize et al., 2007), algunos de los cuales han

sido definidos funcionalmente.

13

Introducción

Recientemente también se han desarrollado diversos trabajos sobre el

metabolismo del colesterol y su regulación en micobacterias, dirigidos gran parte

de ellos a investigar el papel que esta molécula desempeña en la patogenicidad

de la especie Mycobacterium tuberculosis; de ello se hablará específicamente en

el apartado 4.

2.1.1 Degradación aeróbica del colesterol

Aunque el catabolismo bacteriano del colesterol no se ha dilucidado

completamente en ninguna de las bacterias capaces de metabolizarlo, y por lo

tanto no se conoce su ruta de degradación completa, a partir de la combinación de

diferentes estudios bioquímicos realizados con varias cepas degradadoras de

esteroles (Kieslich, 1985; Martin, 1977; Owen et al., 1983; Schoemer y Martin,

1980; Sedlaczek y Smith, 1988; Szentirmai, 1990) se ha postulado una ruta para la

degradación aeróbica del mismo como se muestra en la figura 5. A continuación

se detallarán las diferentes etapas de esta ruta en tres apartados:

a) Transformación del colesterol en 4-colesten-3-ona. En esta ruta aeróbica

parece que el primer paso es la oxidación de colesterol a 4-colesten-3-ona a

través de dos reacciones secuenciales: la oxidación de colesterol a 5-colesten-3-

ona (Figura 5, (2)) seguida de su isomerización a 4-colesten-3-ona (Figura 5, (3)). La enzima que aporta esta primera actividad en el sistema degradativo es en

algunos microorganismos una colesterol oxidasa, mientras que en otros se trata

de una 3-β hidroxiesteroide deshidrogenasa/isomerasa. En ambos casos se trata

de enzimas bifuncionales que incluyen actividad 3β-hidroxiesteroide oxidasa o

deshidrogenasa y actividad Δ5-3-cetoesteroide isomerasa. Dado que una parte de

esta tesis doctoral se ha centrado en el estudio de este paso enzimático, se

detallarán las características de estas enzimas más adelante en el texto.

b) Eliminación de la cadena lateral del colesterol. Parece que, concomitante o

posteriormente al primer proceso oxidativo, la cadena alifática del colesterol se

elimina mediante varios procesos de oxidación, similares a una β-oxidación, aun

no bien precisados a nivel genético y bioquímico (van der Geize et al., 2007).

Estudios muy recientes han señalado a la proteína codificada por el gen ro04679

14

Introducción

de Rhodococcus jostii RHA1 (Rosłoniec et al., 2009), que codifica el citocromo

P450 125 (Cyp125) y tiene como ortóloga en M. tuberculosis a la proteína

codificada por el gen Rv3545c (Capyk et al., 2009a; Capyk et al., 2009b), como la

enzima responsable del primer paso de hidroxilación de la cadena lateral.

c) Rutas central y baja de degradación del colesterol. Una vez que la cadena

alifática se ha oxidado, el metabolismo del colesterol parece seguir para la

mayoría de bacterias aeróbicas una ruta catabólica común para esteroides de 19

átomos de carbono. Brevemente, 3-cetoesteroide- Δ1-deshidrogenasas de baja

especificidad, como KsdD en M. smegmatis (Brzostek et al., 2005), KstD en

Rhodococcus erythropolis (van der Geize et al., 2000; van der Geize et al., 2001;

van der Geize et al., 2002a) o TesH en Comamonas testosteroni (Horinouchi et al.,

2003b) transforman el compuesto 4-androstadien-3,17-diona (AD) (Figura 5, (9A)) en 1,4-androstadien-3,17-diona (ADD) (Figura 5, (9B)), que puede considerarse el

metabolito central de las distintas etapas degradativas, así como metabolito

central de la degradación de distintos esteroides, como la testosterona.

Posteriormente tiene lugar una 9α-hidroxilación catalizada por KstH en M.

smegmatis (Andor et al., 2006) y KshAB en R. erythropolis (van der Geize et al.,

2001; van der Geize et al., 2002b; van der Geize et al., 2008) y en M. tuberculosis

(Capyk et al., 2009a), seguida de la transformación no enzimática de la 9α-hidroxi-

1,4-androstadien-3,17-diona (Figura 5, (10B)) en 3-hidroxi-9,10-secoandrosta-

1,3,5(10)-trien-9,17-diona (3-HSA) (Figura 5, (11)). La hidroxilación subsecuente

de 3-HSA por enzimas como la oxigenasa de dos componentes TesA1A2 en C.

testosteroni (Horinouchi et al., 2004a) conduce a la obtención de la 3,4-dihidroxi-

9,10-secoandrosta-1,3,5(10)-trien-9,17-diona (3,4-DHSA) (Figura 5, (12)), un

derivado catecólico cuyo anillo A se abre por una extradiol dioxigenasa de tipo

meta (TesB en C. testosteroni (Horinouchi et al., 2001); HsaC en R. jostii RHA1

(van der Geize et al., 2007) y en M. tuberculosis (Yam et al., 2009)) originando el

ácido 4,5,9,10-diseco-3-hidroxi-5,9,17-trioxoandrosta-1(10), 2-dien-4-oico (4,9-

DSHA) (Figura 5, (13)). Este compuesto es hidrolizado por TesD en C. testosteroni

(Horinouchi et al., 2003a), y HsaD en M. tuberculosis (Lack et al., 2008; Lack et al.,

2009) o R. jostii RHA1 (van der Geize et al., 2007) originando los ácidos 2-hidroxi-

2,4-hexadienoico (Figura 5, (14)) y 9,17-dioxo-1,2,3,4,10,19-hexanorandrostan-5-

15

Introducción

oico (DOHNAA) (Figura 5, (15)). Los siguientes pasos, en los que muy

probablemente participan los genes catabólicos tesE, tesF, y tesG en C.

testosteroni (Horinouchi et al., 2005) conducirían a metabolitos que entrarían ya en

rutas generales de degradación (Kieslich, 1985). Sin embargo, las enzimas que

intervienen en esta ruta baja están aún por confirmar. Parece que el ácido 2-

hidroxi-2,4-hexadienoico se metaboliza a ácido 4-hidroxi-2-oxo-hexanoico (este

paso estaría catalizado por TesE) (Figura 5, (16)) que finalmente se rompería en

ácido pirúvico y propionaldehído (probablemente por la acción de TesG), que se

transformaría en propionil-CoA por acción de TesF. Por otra parte, se ha

propuesto que el DOHNAA se degradaría a ácido succínico. Se asume que el

primer paso en la degradación de este compuesto podría ser la eliminación de su

fracción propionil para producir ácido 9,17-dioxo-1,2,3,4,5,6,10,19-

octanorandrostan-7-oico (Figura 5, (17)) a través de una β-oxidación típica

(Kieslich, 1985).

16

Introducción

HO O O

COLESTEROL (1) 5-COLESTEN-3-ONA (2) 4-COLESTEN-3-ONA (3)

COL. OXIDASA COL. OXIDASA

COL. DESHIDROGENASA COL. DESHIDROGENASA

O

CH2OH

O

26-HIDROXI-1,4-COLESTADIEN-3-ONA (5B)

COOH

O

ÁCIDO 1,4-COLESTADIEN-3-ONA-26-OICO (6B)

COOH

O

ÁCIDO 1,4-COLADIEN-3-ONA-24-OICO (7B)

COOH

O

ÁCIDO1,4-PREGNADIEN-3-ONA-20-CARBOXÍLICO (8B)

1,4-COLESTADIEN-3-ONA (4)

CH2OH

O

26-HIDROXI-4-COLESTEN-3-ONA (5A)

COOH

O

ÁCIDO 4-COLESTEN-3-ONA-26-OICO (6A)

COOH

O

ÁCIDO 4-COLEN-3-ONA-24OICO (7A)

COOH

O

ÁCIDO 4-PREGNEN-3-ONA-20-CARBOXÍLICO (8A)

¿HIDROXILA- CIÓN MEDIADA POR CITO- CROMO P450?

DESHIDROGENACIÓN

DESHIDROGENACIÓN

DESHIDROGENACIÓN

DESHIDROGENACIÓN

DESHIDROGENACIÓN

OXIDACIÓN

OXIDACIÓN

OXIDACIÓN

OXIDACIÓN

OXIDACIÓN

OXIDACIÓN

17

Introducción

COOH

O

ÁCIDO 4-PREGNEN-3-ONA-20-CARBOXÍLICO (8A)

COOH

O

ÁCIDO 1,4-PREGNADIEN-3-ONA-20-CARBOXÍLICO (8B)

O O

O

4-ANDROSTEN-3,17 DIONA (AD) (9A)

O

OOH

9 ALFA-HIDROXI-4-ANDROSTEN-3,17DIONA (10A)

KstH

KsdD/KstD/Tes H

O

1,4-ANDROSTADIEN-3,17-DIONA (ADD) (9B)

OXIDACIÓN OXIDACIÓN

DESHIDROGENACIÓN

O

OOH

9 ALFA-HIDROXI-1,4-ANDROSTADIEN-3,17-DIONA (10B)

KsdD/KstD/Tes H

KshAB/KstH

¿APERTURA ESPONTÁNEA?

O

O

HO

3-HSA (11)

O

HO

O

OH

3,4-DHSA (12)

Tes A1A2

HsaC/Tes BHOOC

O

HOOC

O

O O

O

HOOC

O

OOH

OH

HsaD/Tes D

4,9-DSHA(13) O

O

HOOC

ÁCIDO 2-HIDROXI-2,4-HEXADIENOICO(14)

DOHNAA (15)

18

Introducción

O

OOHOH

HOOC OH

O

O

HOOC

ÁCIDO 2-HIDROXI-2,4-HEXADIENOICO (14)

DOHNAA (15)

Tes E

O COOH

ÁCIDO 4-HIDROXI-2-OXOHEXANOICO (16)ÁCIDO PIRÚVICO

O

PROPANAL

¿Tes G?

¿Tes F?O

PROPIONIL-CoACOOH

O

O

O

O

O

COOH

COOH

COOHOH

COOH

O

O

OHO

HO

SUCCINATO

ÁCIDO 9,17-DIOXO-1,2,3,4,5,6,10,19-OCTANORANDROSTAN-7-OICO (17)

Figura 5. Ruta postulada de degradación microbiana aeróbica del colesterol. Se indican las

distintas nomenclaturas de las enzimas implicadas en los pasos caracterizados. Es posible que la

4-colesten-3-ona (3) o alguno de los sucesivos metabolitos producto de la degradación de la

cadena lateral hasta (e incluida) la AD (9A) sufran una reacción de deshidrogenación que

introduzca un doble enlace en la posición 1, dando lugar al compuesto colesta-1,4-dien-3-ona (4) en el caso de la 4-colesten-3-ona, o a los correspondientes 1,2-deshidro derivados de las demás

19

Introducción

moléculas (nombrados con la letra B). Estos compuestos se han rodeado con línea discontinua en

la figura. Seguirían un proceso degradativo de la cadena lateral idéntico al que sufre la 4-colesten-

3-ona hasta el intermediario común 9α-hidroxi-1,4-androstadien-3,17-diona (10B).

2.1.2 Enzimas responsables de la transformación del colesterol en 4-colesten-3-ona

Como ya se ha comentado anteriormente, el primer paso en la degradación

aeróbica del colesterol es la oxidación de colesterol a 4-colesten-3-ona a través de

dos reacciones secuenciales: la oxidación de colesterol a 5-colesten-3-ona (Figura

5, (2)) seguida de su isomerización a 4-colesten-3-ona (Figura 5, (3)). Hasta la

fecha existen dos tipos de enzimas descritas que son capaces de realizar esta

reacción: las colesterol oxidasas y las 3-β hidroxiesteroide

deshidrogenasas/isomerasas. En ambos casos se trata de enzimas bifuncionales

que incluyen actividad 3β-hidroxiesteroide oxidasa o deshidrogenasa y actividad

Δ5-3-cetoesteroide isomerasa.

2.1.2.1 Enzimas con actividad colesterol oxidasa Las colesterol oxidasas (EC 1.1.3.6) (en lo sucesivo abreviadas como CO)

son enzimas flavin adenin dinucleótido (FAD)-dependientes bien caracterizadas y

de las que se conoce su estructura tridimensional. Se distinguen dos clases de

CO; la clase I está formada por aquellas CO en las que el FAD no está

covalentemente unido a la proteína, y la clase II por aquellas CO en las que el

FAD está unido covalentemente a un residuo de histidina. La actividad catalítica

de estas dos clases de CO es la misma, pero no comparten homología de

secuencia y pertenecen a diferentes familias (Aparicio y Martin, 2008). La clase I

pertenece a la familia de las GMC (glucosa/metanol/colina) oxidorreductasas, y se

han identificado enzimas de esta clase principalmente en actinomicetos (Doukyu,

2009). De esta clase se conocen las estructuras cristalinas de la CO de

Streptomyces sp. SA-COO (Lario et al., 2003; Yue et al., 1999) y de

20

Introducción

Brevibacterium sterolicum (Li et al., 1993; Vrielink et al., 1991). La clase II

pertenece a la familia de las VAO (vainillil/alcohol oxidasas). Se han identificado

enzimas de esta clase en B. sterolicum, R. erythropolis y bacterias Gram-

negativas (Doukyu, 2009). Además se ha determinado la estructura de una CO de

clase II de B. sterolicum (Coulombe et al., 2001). Las CO en la mayoría de los

casos requieren oxígeno molecular para formar 4-colesten-3-ona y peróxido de

hidrógeno (Smith y Brooks, 1974). Sin embargo, algunas CO de Burkholderia

cepacia ST-200, Pseudomonas spp., y Chromobacterium sp. DS-1 oxidan el

colesterol mayoritariamente a 6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona y peróxido de

hidrógeno, y no a 4-colesten-3-ona (Doukyu y Aono, 1999; Doukyu et al., 2008).

Este intermediario no se ha asociado hasta el momento a ninguna ruta de

degradación completa de colesterol; de hecho, la cepa Burkholderia cepacia ST-

200 (antes denominada Pseudomonas sp. ST-200) es incapaz de crecer en

colesterol o 6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona, lo que sugiere que el colesterol no es

el sustrato natural de esta enzima (Doukyu y Aono, 1999) o que la transformación

tiene otro fin distinto al de obtención de energía.

Hay que señalar que las CO mejor caracterizadas hasta la fecha, e. g., ChoA

y ChoM de Streptomyces sp SA-COO, ChoB de Bacillus sterolicum, ChoE de

Rhodoccocus equi y ChoD de M. tuberculosis (todas de clase I) son extracelulares

y parecen actuar más como factores de virulencia que como parte de un sistema

catabólico (Brzostek et al., 2007; Navas et al., 2001). De hecho, algunos estudios

(Av-Gay y Sobouti, 2000) postulaban que las micobacterias de crecimiento lento,

es decir, las patógenas como M. tuberculosis, M. bovis y M. leprae, poseían CO de

naturaleza extracelular, que aclaraban del medio el colesterol, y podían modificarlo

o almacenarlo, pero este no era utilizado como fuente de carbono, en

contraposición con las micobacterias de crecimiento rápido, como M. smegmatis,

que poseerían CO intracelulares y que sí utilizan el colesterol como fuente de

carbono y energía. De confirmarse esta hipótesis, se podría efectivamente

relacionar a las CO extracelulares micobacterianas con la patogenicidad y a las

intracelulares con el catabolismo del colesterol. Sin embargo, en estudios más

recientes se ha comprobado que el patógeno M. tuberculosis sí puede utilizar el

colesterol como fuente de carbono y energía (Brzostek et al., 2009; Pandey y

21

Introducción

Sassetti, 2008), con lo cual se especula que las CO extracelulares podrían formar

parte de la ruta catabólica del colesterol. Otra posible interpretación es que las CO

extracelulares se utilicen efectivamente en patogénesis y que otra enzima sea la

responsable de transformar el colesterol intracelularmente en 4-colesten-3-ona

para su metabolismo completo, como parece ser el caso en M. tuberculosis, donde

una hidroxiesteroide deshidrogenasa, además de ChoD, cataliza esta

transformación, e intracelularmente (Yang et al., 2007).

2.1.2.2 Enzimas con actividad 3-β hidroxiesteroide

deshidrogenasa/isomerasa

Las 3-β-hidroxi-Δ5-esteroide deshidrogenasas son una familia de enzimas

que catalizan la conversión de 3-β-hidroxi-5-eno-esteroides a 3-oxo-4-eno-

esteroides a través de una reacción de oxidación y una isomerización, utilizando

NAD+ o NADP+ como cofactores. El análisis de las bases de datos genéticas ha

puesto de manifiesto la existencia de una superfamilia de proteínas que además

de las esteroide deshidrogenasas bacterianas incluye a las 3-β-hidroxiesteroide

deshidrogenasas de mamíferos, las dihidroflavonol reductasas de plantas, las

UDP-galactosa-4-epimerasas bacterianas y las 3-β-hidroxiesteroide

deshidrogenasas víricas (Baker y Blasco, 1992). Las 3-β-hidroxiesteroide

deshidrogenasas bacterianas están filogenéticamente menos relacionadas con las

deshidrogenasas de mamíferos que las víricas. Sin embargo, su función podría ser

similar, esto es, la síntesis de hormonas esteroideas o de flavonoles bacterianos

(Yang et al., 2007). A esta familia pertenecen por ejemplo la enzima colesterol

deshidrogenasa NAD(P)-dependiente [NAD(P)-CDH] responsable del paso de

colesterol a 4-colesten-3-ona en el género Nocardia (Horinouchi et al., 1991) y la

3-β-hidroxiesteroide deshidrogenasa Rv1106c de M. tuberculosis (Yang et al.,

2007), implicada, además de en la transformación de colesterol a 4-colesten-3-

ona, en la oxidación e isomerización de la dehidroepiandrosterona y la

pregnenolona. El hecho de que la colesterol deshidrogenasa de Nocardia se active

a nivel transcripcional por la adición de colesterol al medio de cultivo (Horinouchi

et al., 1991) y de que la interrupción del gen Rv1106c reduzca la oxidación de

22

Introducción

colesterol en M. tuberculosis por lo menos 90 veces (Yang et al., 2007) sugiere

una implicación directa de estas enzimas en el catabolismo del colesterol en los

organismos donde están presentes.

2. 2 Degradación anaeróbica de esteroides

Las transformaciones de esteroides más estudiadas que suceden en

ambientes anóxicos tienen lugar durante la circulación enterohepática en

mamíferos y son producidas por bacterias intestinales anaeróbicas. Se ha

constatado la rotura de enlaces alquilaril éter, deshidroxilaciones y oxidaciones o

reducciones en el carbono 17, pero no se ha descrito la rotura del núcleo

esteroideo por estas bacterias para la obtención de energía (Groh et al., 1993). Un

ejemplo de estos microorganismos es Bacteroides sp. cepa D8, primera bacteria

encontrada en el colon humano capaz de convertir colesterol, 4-colesten-3-ona y

coprostanona a coprostanol (Gerard et al., 2007). En 1988 se demostró por vez

primera la existencia de bacterias capaces de crecer en colesterol bajo

condiciones desnitrificantes (Taylor et al., 1981). Recientemente se han descrito

bacterias desnitrificantes capaces de oxidar colesterol y otros esteroides

completamente. Ejemplos de estos microorganismos son Denitratisoma

oestradiolicum, capaz de degradar 17β-estradiol utilizando el nitrato como aceptor

de electrones (Fahrbach et al., 2006); Steroidobacter denitrificans, degradadora de

estradiol, estrona, testosterona y AD (Fahrbach et al., 2008) o las cepas 72Chol

(Harder y Probian, 1997) y Sterolibacterium denitrificans (Tarlera y Denner, 2003),

capaces de oxidar completamente el colesterol.

Aunque algunas de estas bacterias han sido caracterizadas

exhaustivamente, todavía no existe mucha información sobre las rutas de

degradación o las enzimas implicadas en las mismas. Los estudios más

avanzados hasta el momento se han realizado con S. denitrificans, en el que se

han propuesto los pasos iniciales de la ruta de degradación de colesterol anóxica

(Chiang et al., 2007). Según estos estudios, el primer paso de la ruta hasta el

metabolito 4-colesten-3-ona estaría catalizado por la enzima AcmA, una

deshidrogenasa/reductasa de cadena corta NAD(P) dependiente (Chiang et al.,

23

Introducción

2008b). El segundo paso de la ruta estaría catalizado por una 4-colesten-3-ona-Δ¹-

deshidrogenasa denominada AcmB (Chiang et al., 2008a; Chiang et al., 2008b).

Este paso implicaría la producción de 25-hidroxi-4-colesten-3-ona mediante la

hidroxilación del carbono terciario de la cadena lateral, paso que difiere de los

descritos hasta ahora para las rutas aeróbicas y que presuntamente estaría

catalizado por una enzima de la familia de las molibdeno-hidroxilasas, que utilizan

agua como fuente del átomo de oxígeno incorporado al sustrato (Chiang et al.,

2007). Alternativamente, estos intermediarios pueden originarse como las

correspondientes 1,2-deshidro estructuras, colesta-1,4-dien-3-ona y 25-

hidroxicolesta-1,4-dien-3-ona. Los pasos iniciales del catabolismo anóxico del

colesterol propuestos para S. denitrificans se muestran en la figura 6.

Figura 6. Pasos iniciales propuestos para el metabolismo anóxico del colesterol en Sterolibacterium

denitrificans (Chiang et al, 2008b).

HO O O

O

OH

O

OH

O

AcmA AcmA

AcmB

H2OAcmB

H2O

COLESTEROL 5-COLESTEN-3-ONA 4-COLESTEN-3-ONA

25-HIDROXI-4-COLESTEN-3-ONA

25-HIDROXI-1,4COLESTADIEN-3-ONA

1,4-COLESTADIEN-3-ONA

24

Introducción

3. Regulación de las rutas de degradación de compuestos esteroideos

Existen todavía muy pocos estudios sobre la regulación de los genes

implicados en la degradación microbiana de compuestos esteroideos. Como en el

caso de los genes catabólicos, los estudios más avanzados en regulación se han

llevado a cabo en la bacteria C. testosteroni. En este microorganismo se ha

descrito que la expresión del gen hsdA está regulada por dos genes denominados

repA y repB (Xiong et al., 2001; Xiong et al., 2003). RepA actúa como un represor

transcripcional uniéndose a dos secuencias operadoras situadas en la región 5’ de

hsdA, mientras que RepB actúa como un represor traduccional uniéndose al

mRNA de hsdA. En ambos casos se produce la desrepresión del sistema cuando

existe testosterona en el medio, que se une a las proteínas represoras evitando su

unión al DNA o mRNA. Otro regulador, denominado TeiR, y perteneciente a la

familia LuxR, regula la expresión de varios genes implicados en la degradación de

la testosterona (Linares et al., 2008; Pruneda-Paz et al., 2004). Esta proteína se

ha estudiado en mayor detalle muy recientemente y se ha demostrado que es una

kinasa que presenta tres dominios funcionales (anclaje, unión a esteroide,

regulador). Se localiza anclada en la membrana, responde a diferentes esteroides

y está implicada en quimiotaxis (Göhler et al., 2008). La regulación de la ruta de

degradación del colesterol en el género Mycobacterium se ha comenzado a

estudiar recientemente, lo que se comentará en el apartado 5.

4. Mecanismos de transporte del colesterol

Los mecanismos de transporte de colesterol y otros esteroides en bacterias

todavía no se conocen en detalle. Los estudios más avanzados en este sentido se

están llevando a cabo en las actinobacterias. El análisis de las bases de datos de

secuencias génicas indica que diversas actinobacterias, incluyendo miembros de

los géneros Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus y Streptomyces y tanto de

especies patógenas como de saprófitas, contienen loci mce (Casali y Riley, 2007;

25

Introducción

McLeod et al., 2006). Las proteínas Mce (de mammalian cell entry) presentes en

actinobacterias son componentes de sistemas de transporte ABC (ATP-binding

cassette) complejos, que incluyen más de 8 proteínas distintas (Casali y Riley,

2007). En M. tuberculosis hay hasta 4 loci (mce 1-4). Los genes mce de M.

tuberculosis se han asociado con patogénesis, aunque su función todavía no está

totalmente clarificada. Parece que, por ejemplo, el gen mce1A está implicado en

facilitar la fagocitosis de las bacterias por macrófagos (Arruda et al., 1993). Los

dos primeros genes de estos loci (llamados yrbE) codifican proteínas

transmembrana con similitud con los componentes permeasa de transportadores

ABC. El rasgo distintivo de este tipo de transportadores es una ATPasa con

características conservadas. Todas las actinobacterias con loci mce contienen

genes que codifican ATPasas de la familia Mkl, normalmente no próximos a los

loci mce (Casali y Riley, 2007). En M. tuberculosis esta ATPasa está codificada

por un gen denominado mceG. Recientemente, se ha comprobado que el locus

mce4 de R. jostii RHA1 se induce durante el crecimiento en colesterol (van der

Geize et al., 2007). En M. smegmatis se ha demostrado que el operón mce4 está

regulado por la proteína KstR, regulador de la familia TetR que actúa como

represor transcripcional de genes relacionados con el metabolismo del colesterol

(Kendall et al., 2007). Estos hallazgos implicaban que este locus podía estar

relacionado con el transporte de colesterol, hecho que se ha visto confirmado en

R. jostii RHA1, donde se ha comprobado que distintos mutantes en el locus mce4

son incapaces tanto de captar como de crecer en colesterol (Mohn et al., 2008).

Esta incapacidad de crecimiento se presenta así mismo en presencia de

moléculas con estructura similar como el β-sitosterol, el 5α-colestanol y la 5α-

colestanona, que poseen una cadena lateral en el carbono 17 de 8 o más átomos

de carbono, mientras que estos mutantes siguen creciendo en AD, ácido cólico y

progesterona, moléculas con cadenas laterales más cortas y más polares (Mohn

et al., 2008). En M. tuberculosis, mutantes en el gen yrbE4A así como en la

ATPasa mceG tienen un escaso crecimiento en colesterol, aunque este se ve

recuperado a tiempos largos, lo que sugiere que podría existir otro sistema de

transporte secundario (Pandey y Sassetti, 2008). Así mismo, los mutantes en

estos genes presentan una virulencia disminuida en modelos animales (Pandey y

26

Introducción

Sassetti, 2008). El hecho de que este locus esté presente en micobacterias

saprófitas indica que su función no se limita a la virulencia (Mohn et al., 2008), lo

que se explica fácilmente teniendo en cuenta que en la naturaleza los esteroides

son sustratos valiosos y abundantes; el locus mce4 habría adquirido

posteriormente su papel en patogénesis.

5. Degradación aeróbica del colesterol y compuestos esteroideos en el género Mycobacterium

El género Mycobacterium es el único de la familia Mycobacteriaceae, del

orden Actinomycetales. Las micobacterias son bacterias aerobias con forma de

bacilos rectos o ligeramente curvados y miden 0,2-0,6 µm de ancho por 1,0-10 µm

de largo. Poseen un contenido en G+C muy elevado (62-70%). Son bacterias

típicamente ácido-alcohol resistentes aunque suelen considerarse Gram-positivas.

Todas las especies de Mycobacterium comparten una característica pared celular,

más gruesa que la de muchas otras bacterias, hidrofóbica y rica en ácidos

micólicos y lípidos. Esta pared celular proporciona una contribución sustancial a la

resistencia de este género de bacterias. El género incluye patógenos que causan

graves enfermedades en los mamíferos, como M. tuberculosis, M. bovis o M.

leprae, y también saprófitos de vida libre, no patógenos u oportunistas, como M.

smegmatis, M. aurum, M. phlei o M. fortuitum.

27

Introducción

Figura 7. Mycobacterium smegmatis mc2155.

Aunque ya se sabía desde hacía mucho tiempo que estas bacterias

degradaban colesterol, sólo muy recientemente se han realizado estudios

moleculares sobre la degradación aeróbica del colesterol con cepas de

Mycobacterium. Como ya se ha comentado anteriormente, no hace mucho se

postuló que los Mycobacterium de crecimiento rápido, por lo general no

patógenos, eran capaces de crecer en colesterol como única fuente de carbono y

energía, en tanto que los de crecimiento lento, que incluyen a los Mycobacterium

patógenos, podían acumular y modificar el colesterol pero no utilizarlo como fuente

de carbono y energía (Av-Gay y Sobouti, 2000). Esta teoría ha sido recientemente

refutada al comprobarse que M. tuberculosis sí puede crecer en colesterol

(Brzostek et al., 2009; Pandey y Sassetti, 2008).

Gracias a que el genoma de M. smegmatis se ha secuenciado recientemente,

se describieron por primera vez dos genes, ksdD1 y ksdD2, que podrían estar

implicados en la ruta de degradación del colesterol (paso de AD a ADD) y que

codifican dos posibles 3-cetoesteroide-Δ1-deshidrogenasas (Brzostek et al., 2005).

Poco tiempo después, se describió un gen que codifica una enzima KstH (Andor et

al., 2006), y que podría estar implicado en el paso de ADD a 9α-hidroxi-1,4-

androstadien-3,17-diona. Sin duda el avance más importante en el conocimiento

global de los genes implicados en la degradación del colesterol a nivel genético en

este microorganismo se logró como consecuencia del descubrimiento del

28

Introducción

regulador transcripcional KstR (Kendall et al., 2007). Previamente, se había

observado que en M. tuberculosis se inducía un gen durante infección en

macrófagos y que era esencial para la infección en ratones: Rv3574, que codifica

un regulador represor tipo TetR (Kendall et al., 2004). El gen ortólogo en M.

smegmatis, MSMEG_6042, fue delecionado y se comprobó que esto conllevaba la

inducción de un elevado número de genes (83) relacionados con el metabolismo

lipídico y más concretamente, como se verá a lo largo de esta tesis doctoral, con

el metabolismo del colesterol. En cuanto a su mecanismo de acción, se identificó

un motivo conservado en su propio promotor (TnnAACnnGTTnnA), así como en

las secuencias intergénicas de los genes a los que reprime, al que se postula que

la proteína se une como un dímero (Kendall et al., 2007). La desrepresión podría

producirse mediante la unión de KstR a la molécula de colesterol; de hecho se ha

encontrado un sitio de unión para esta molécula en un modelo de KstR

(comunicación personal). Más recientemente se ha encontrado otro regulador,

denominado KstR2, también un represor tipo TetR, que regula la expresión de 15

genes adicionales relacionados con el metabolismo de colesterol (Kendall et al.,

2010). De estos dos reguladores se hablará más extensamente en el apartado 5

de resultados.

Profundizando en el papel del colesterol en la patogénesis causada por estas

bacterias, hay que señalar que desde hace tiempo se ha relacionado la entrada de

diversas bacterias patógenas en células del sistema inmune y su mantenimiento

dentro de las mismas con dominios de la membrana plasmática de estas células

ricos en colesterol. Este es el caso por ejemplo de M. tuberculosis o M. bovis

Calmette-Guérin en macrófagos; este proceso, que requiere de dominios ricos en

colesterol en la membrana del macrófago, a los que las micobacterias se unen

específicamente a través del colesterol, supone que las micobacterias que

penetran en el interior del macrófago queden ‘secuestradas’ en fagosomas

recubiertos de TACO (proteína de cubierta que contiene triptófano y aspartato)

que previene la fusión lisosomal y asegura la supervivencia intracelular del

patógeno (Gatfield y Pieters, 2000). Estos dominios ricos en colesterol también

son necesarios para la entrada de M. kansasii (Peyron et al., 2000) o Bordetella

pertussis (Lamberti et al., 2008) en neutrófilos. Se especula que la unión

29

Introducción

específica de las micobacterias al colesterol podría deberse al alto contenido en

glicolípidos de su pared celular (Gatfield y Pieters, 2000). Por otra parte, se ha

visto que el operón mce4 de M. tuberculosis, que está en general presente en los

Actinomycetales (Casali y Riley, 2007) y que codifica un sistema de importación de

colesterol, es esencial para la supervivencia del patógeno durante los tiempos

prolongados de infección (Joshi et al., 2006; Sassetti y Rubin, 2003). Este

hallazgo hizo que se investigase y que finalmente se verificase la capacidad del

patógeno de crecer en colesterol como única fuente de carbono y energía. Se

postula que esta capacidad para degradar el colesterol la hereda de sus ancestros

saprofíticos, y que puede permitir a la bacteria aprovechar este esteroide para

conseguir carbono y energía en un compartimento intracelular que de hecho causa

la inanición de otros patógenos potenciales (Pandey y Sassetti, 2008). Además se

ha comprobado que los mutantes de M. tuberculosis en el gen choD presentan

una patogenicidad atenuada (Brzostek et al., 2009).

Por otro lado, hay que destacar que desde hace tiempo se sabe que el

colesterol puede sintetizarse también en bacterias (Hayami et al., 1979; Weeks y

Francesconi, 1978). No hace mucho se ha descrito que M. smegmatis es capaz de

sintetizar de novo este compuesto y que M. tuberculosis y M. leprae poseen genes

homólogos a los genes responsables de la biosíntesis del colesterol en levaduras

(Lamb et al., 1998). Más aún, en M. tuberculosis se ha caracterizado una actividad

esterol 14α-demetilasa (CYP51) (Podust et al., 2001) correspondiente a un

citocromo P-450 homólogo al que está implicado en la biosíntesis de esteroles en

hongos y que se ha estudiado exhaustivamente, ya que podría constituir una

excelente diana para desarrollar fármacos antifúngicos. La coexistencia en

Mycobacterium de una ruta biosintética y otra degradativa para el colesterol,

resulta muy interesante a la vez que plantea interrogantes.

Tras todo lo anteriormente expuesto, parecía interesante caracterizar desde

el punto de vista genético y bioquímico la ruta de degradación aeróbica del

colesterol utilizando como sistema modelo de estudio la bacteria M. smegmatis

mc2155 (Snapper et al., 1990) (figura 7) ; se trata de una bacteria de crecimiento

rápido en medios ricos y medios sintéticos simples, que se ha desarrollado y

30

Introducción

utilizado internacionalmente como cepa tipo por su alta eficacia de transformación

para el estudio de las micobacterias. Su velocidad de crecimiento en colesterol, en

donde alcanza densidades ópticas a 600 nm próximas a 2 y donde llega a fase

estacionaria aproximadamente en 48 h, la convierten en un buen candidato para el

estudio de esta ruta de degradación. Su genoma completo ha sido además

secuenciando recientemente. El interés surge principalmente desde un punto de

vista medioambiental, pero teniendo también en cuenta que por tratarse de una

especie muy próxima a M. tuberculosis, los resultados que se obtuviesen podrían

extrapolarse fácilmente a este patógeno. Esta extrapolación resultaría muy

interesante dada la relación del colesterol con los mecanismos de patogenicidad

en M. tuberculosis.

Al inicio de esta tesis doctoral, la ruta de degradación del colesterol en este

organismo era prácticamente desconocida, aunque actualmente se han

caracterizado algunos de los pasos implicados, gracias en gran medida al

descubrimiento de la existencia de un gran catabolón de esteroides en

actinomicetos (Kendall et al., 2007; van der Geize et al., 2007) .

31

32

Objetivos

II. OBJETIVOS

33

Objetivos

34

Objetivos

II. OBJETIVOS

Como se ha comentado en la Introducción, al comienzo de esta tesis doctoral

se desconocían la mayor parte de los genes implicados en el catabolismo del

colesterol en Mycobacterium smegmatis mc2155, así como sus posibles

mecanismos de regulación.

Dado el interés que planteaba el conocimiento de esta ruta metabólica, tanto

desde un punto de vista medioambiental como por el posible papel del

metabolismo del colesterol como un mecanismo de patogenicidad en especies

próximas a M. smegmatis, en esta tesis se han abordado los siguientes objetivos:

1. Identificación in silico de los genes de la ruta de degradación del colesterol en M. smegmatis. Utilizando los bancos de datos de secuencias y la

información acumulada sobre el catabolismo del colesterol en distintos

microorganismos se planteó el análisis del genoma de M. smegmatis para

identificar in silico aquellos genes que pudieran estar implicados en dicho

catabolismo.

2. Caracterización de genes de la ruta de degradación del colesterol en M. smegmatis. Mediante este objetivo, una vez realizado el estudio in silico, se

confirmaría la verdadera implicación en el metabolismo del colesterol de los genes

hallados utilizando las técnicas de RT-PCR, microarrays y la construcción de

mutantes de inserción por recombinación homóloga sobre M. smegmatis. La

técnica de microarrays permitiría así mismo la caracterización de nuevos genes

implicados en esta ruta de degradación.

3. Identificación y caracterización de la proteína responsable de la transformación de colesterol en 4-colesten-3-ona. Con este objetivo se

pretende identificar la enzima o enzimas implicadas en la primera etapa esta ruta

catabólica. Los genes que codifican estas enzimas se clonarían y se expresarían

en Escherichia coli para caracterizarlas bioquímicamente.

35

Objetivos

4. Estudio de la regulación del catabolismo del colesterol. Mediante este

objetivo se pretende identificar y caracterizar los reguladores implicados en la

degradación del colesterol. Los genes que codifican estos reguladores se

clonarían y expresarían para estudiar su actividad in vitro e in vivo.

36

Materiales y Métodos

III. MATERIALES Y MÉTODOS

37

Materiales y Métodos

38

Materiales y Métodos

III. MATERIALES Y MÉTODOS

1. Cepas bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos utilizados

Las cepas bacterianas utilizadas en este trabajo se describen en la Tabla 1.

Los plásmidos empleados para la clonación, mutación y expresión génica se

muestran en la Tabla 2. Los oligonucleótidos sintéticos utilizados en este trabajo

para la amplificación de productos por PCR se presentan en la Tabla 3. Los

oligonucleótidos sintéticos empleados en los ensayos de RT-PCR de genes

posiblemente pertenecientes a agrupaciones génicas de degradación del

colesterol se muestran en la Tabla 4. Los oligonucleótidos sintéticos utilizados en

RTq-PCR se muestran en la Tabla 5. Todos los oligonucleótidos utilizados en este

trabajo se adquirieron en Sigma-Genosys.

Tabla 1. Cepas bacterianas ESTIRPE

CEPA

GENOTIPO/FENOTIPO RELEVANTE

REFERENCIA

E. coli

DH5α

F-, endA1, hsdR17 (rk

-mk+), supE44, thi-1, recA1, gyrA,

relA1, Δ(argF-lac)U169, deoRΦ80dlac, Δ (lacZ)M15

(Hanahan, 1983)

E. coli

DH10B

F-, mcrA, Δ (mrr hsdRMS-mcrBC), Φ80dlacZΔM15, ΔlacX74, deoR, recA1, araD139, Δ(ara-leu)7697, galU, galK, λ-, rpsL, endA1, nupG

Life Technologies

E. coli

BL21 (DE3)

F-, ompTgal[cdm] [lon] hsdSB con DE3 B

(Studier y Moffatt, 1986)

M. smegmatis

mc²155

ept-1 , mutante de mc²6 eficiente para electroporación

(Snapper et al., 1990)

M. smegmatis

::MSMEG_0217

Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_0217 interrumpido mediante recombinación homóloga

Este trabajo

M. smegmatis

::MSMEG_1366

Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_1366 interrumpido mediante recombinación homóloga

Este trabajo

M. smegmatis

::MSMEG_1543

Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_1543 interrumpido mediante recombinación homóloga

Este trabajo

M. smegmatis

::MSMEG_1604

Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_1604 interrumpido mediante recombinación homóloga

Este trabajo

M. smegmatis

::MSMEG_3519

Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_3519 interrumpido mediante recombinación homóloga

Este trabajo

M. smegmatis

::MSMEG_5228

Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_5228 interrumpido mediante recombinación homóloga

Este trabajo

39

Materiales y Métodos

M. smegmatis

::MSMEG_5233

Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_5233 interrumpido mediante recombinación homóloga

Este trabajo

M. smegmatis

::MSMEG_5995

Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_5996 interrumpido mediante recombinación homóloga

Este trabajo

M. smegmatis

::MSMEG_6036

Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_6036 interrumpido mediante recombinación homóloga

Este trabajo

M. smegmatis

ΔMSMEG_5228

Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_5228 delecionado mediante recombinación homóloga

Este trabajo

M. smegmatis

::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228

Doble mutante de mc²155 con el gen MSMEG_5228 delecionado y el gen MSMEG_1604 interrumpido mediante recombinación homóloga

Este trabajo

M. smegmatis

ΔkstR

Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_6042 delecionado

(Kendall et al., 2007)

M. smegmatis

ΔkstR2

Mutante de mc²155 con el gen MSMEG_6009 delecionado

(Kendall et al., 2010)

M. smegmatis

ΔkstR/ΔkstR2

Doble mutante de mc²155 con los genes MSMEG_6042 y MSMEG_6009 delecionados

(Kendall et al., 2010)

Tabla 2. Plásmidos

PLÁSMIDO DESCRIPCIÓN REFERENCIA

pUC19

Vector de clonación, Apr oriColE1, lacZα

(Sambrook y Russell, 2001)

pGEM-T easy

Vector de clonación de productos de PCR, Apr, oriColE1, lacZα

Promega

pET-29a(+)

Vector de clonación e hiperexpresión, Kmr, oriColE1

Novagen

pJQ200X

Vector de clonación suicida para micobacterias para la construcción de mutantes por recombinación homóloga. Gmr

(Jackson et al., 2001)

pSUM36

Vector de clonación, oriE, oriM, Kmr

(Aínsa et al., 1996)

pUC5228DR

Vector pUC19 que contiene los fragmentos up-5228 y down-5228. Apr

Este trabajo

pGEM1604

Vector pGEM-T que contiene el gen MSMEG_1604. Apr

Este trabajo

pGEM5228

Vector pGEM-T que contiene el gen MSMEG_5228. Apr

Este trabajo

pGEM5233

Vector pGEM-T que contiene el gen MSMEG_5233. Apr

Este trabajo

pGEM6042

Vector pGEM-T que contiene el gen MSMEG_6042. Apr

Este trabajo

40

Materiales y Métodos

pET1604

Vector pET29 que expresa el gen MSMEG_1604. Kmr

Este trabajo

pET5228

Vector pET29 que expresa el gen MSMEG_5228. Kmr

Este trabajo

pET5233

Vector pET29 que expresa el gen MSMEG_5233. Kmr

Este trabajo

pET6042

Vector pET29 que expresa el gen MSMEG_6042 . Kmr

Este trabajo

pJQ0217

Vector pJQ200X que contiene un fragmento interno del gen MSMEG_0217. Gmr

Este trabajo

pJQ1366

Vector pJQ200X que contiene un fragmento interno del gen MSMEG_1366. Gmr

Este trabajo

pJQ1543

Vector pJQ200X que contiene un fragmento interno del gen MSMEG_1543. Gmr

Este trabajo

pJQ1604

Vector pJQ200X que contiene un fragmento interno del gen MSMEG_1604. Gmr

Este trabajo

pJQ1604int

Vector pJQ200X que contiene un fragmento interno del gen MSMEG_1604. Gmr. Utilizado para la construcción de un mutante doble.

Este trabajo

pJQ3519

Vector pJQ200X que contiene un fragmento interno del gen MSMEG_3519. Gmr

Este trabajo

pJQ5228

Vector pJQ200X que contiene un fragmento interno del gen MSMEG_5228. Gmr

Este trabajo

pJQ5228DR

Vector pJQ200X que contiene los fragmentos up-5228 y down-5228. Gmr

Este trabajo

pJQ5233

Vector pJQ200X que contiene un fragmento interno del gen MSMEG_5233. Gmr

Este trabajo

pJQ5995

Vector pJQ200X que contiene un fragmento interno del gen MSMEG_5995. Gmr

Este trabajo

pJQ6036

Vector pJQ200X que contiene un fragmento interno del gen MSMEG_6036. Gmr

Este trabajo

pUJ9

Vector que contiene el gen lacZ sin promotor. Apr

(de Lorenzo et al., 1990)

pUJ9-5228 Derivado de pUJ9 que contiene la fusión P5228 :: lacZ Este trabajo

41

Materiales y Métodos

Tabla 3. Oligonucleótidos generales. Las secuencias marcadas en negrita en varios de ellos se

corresponden con dianas de restricción creadas.

OLIGONUCLEÓTIDO SECUENCIA 5’-3’ UTILIDAD

CO5 GGAACTCATATGAAGCCTGACTACGACGTC Amplificación de MSMEG_1604. NdeI

CO3 CAGAATTCCTACCCCGCCGACGACAC Amplificación de MSMEG_1604. EcoRI

5228-F CATATGGCTGACTCCACCACCGAC Amplificación de MSMEG_5228. NdeI

5228-R AAGCTTCGTGCTGCCCTGAACTAG Amplificación de MSMEG_5228. HindIII

5233 pET F GGAATTCCATATGTCCGACGCCTTGGTCAC Amplificación de MSMEG_5233. NdeI

5233 pET R CCGGATCCATCGCGACGCGTTGACTCA Amplificación de MSMEG_5233. BamHI

pET6042 F CATGCATATGGCCGGAAACTCACAGC Amplificación de MSMEG_6042. NdeI

pET6042 R CATGCTCGAGGATCTTAGGTTGCTCCTCGG Amplificación de MSMEG_6042. XhoI

MSMEG_1604 F int CTAGTCTAGAGGACACGTTCGTGCAGACG

Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_1604. XbaI

MSMEG_1604 R int CTAGGAGCTCCGTTTGGTGTAGGTGGTGATC Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_1604. SacI

MSMEG_5228 UP F CTAGGAATTCGGGCCCCGACGAGATCCACCGCGCC

Amplificación de un fragmento upstream de MSMEG_5228. EcoRI-ApaI

MSMEG_5228 UP R CTAGTCTAGAGATATCCCAGCAGTTCGGTGACCAG

Amplificación de un fragmento upstream de MSMEG_5228. XbaI-EcoRV

MSMEG_5228 DOWN F

CTCACTGCAGGATATCAGATGGAGGCGCAGGCCCG

Amplificación de un fragmento downstream de MSMEG_5228. PstI-EcoRV

MSMEG_5228 DOWN R

CTAGAAGCTTGGGCCCGGAACCGAACTGCTGAACTC

Amplificación de un fragmento downstream de MSMEG_5228. HindIII-ApaI

MSMEG_6036 Rec F GCTCTAGACAAGGTCCTCGGCATGGTC Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_6036. XbaI

MSMEG_6036 Rec R ATAAGAATGCGGCCGCCGGTGTCTTCATGTAGAACG

Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_6036. NotI

MSMEG_5233 F int CTAGTCTAGACCAACCGCAAATCAGCAACC Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_5233. XbaI

MSMEG_5233 R int CTAGACTAGTGATGAGCAGCACCTCGTGG Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_5233. SpeI

MSMEG_1366 F int CATCGTCGACCCAAGGAGCTCTACGAGATC Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_1366. SalI

MSMEG_1366 R int CATGCTCGAGGAGGGTGTGCAGGATCTCG

Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_1366. XhoI

42

Materiales y Métodos

MSMEG_5995 F int CTAGACTAGTGTGCTGCTCAACATGGACG Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_5995. SpeI

MSMEG_5995 R int CTAGTCTAGAGAGTTCGACGTCCTCCAGC Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_5995. XbaI

MSMEG_0217 F int CATGCTCGAGCGACTACCACATCACCACGG

Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_0217. XhoI

MSMEG_0217 R int CATGCTGCAGGGTCAGGATCAACGCCTCTTC Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_0217. PstI

MSMEG_1543 F int CATGCTGCAGATGGAGGAGAACCTCGAATCC Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_1543. PstI

MSMEG_1543 R int GATGGTCGACTCATGGTCTCGGTGTCCAGC Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_1543. SalI

MSMEG_3519 F int CATGTCTAGACACTCAACTCCCTCGTGCC Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_3519. XbaI

MSMEG_3519 R int GTAGGGGCCCCGACACCATGTACTGCAGCG Amplificación de un fragmento interno de MSMEG_3519. ApaI

pJQ200X dir xylE TTGATGTTACCCGAGAGCTTG Análisis de las interrupciones insercionales generadas mediante el plásmido pJQ200X

pJQ200X dir xylE int GGTCCAAGCCTTCAGATAGAC Análisis de las interrupciones insercionales generadas mediante el plásmido pJQ200X

pJQ200X inv xylE GAGTTAGCTCACTCATTAGGC Análisis de las interrupciones insercionales generadas mediante el plásmido pJQ200X

pJQ200X inv xylE int TCACTCACGGCAAGACCATC Análisis de las interrupciones insercionales generadas mediante el plásmido pJQ200X

F24 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC Análisis de las interrupciones insercionales generadas mediante el plásmido pUC19 o pGEM-T-Easy

R24 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA Análisis de las interrupciones insercionales generadas mediante el plásmido pUC19 o pGEM-T Easy

63f CAGGCCTAACACATGCAAGT Empleado para amplificar el gen 16S rDNA

1387r GGGCGGAGTGTACAAGGC Empleado para amplificar el gen 16S rDNA

5228 FP F TCAGCGCGTCGAGCAGGC Empleado para amplificar la sonda MSMEG_5228 FP

5228 FP R GCAGTTCGGTGACCAGGTTG Empleado para amplificar la sonda MSMEG_5228 FP

Lac57 CGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGG

Determinación del sitio +1 del promotor P5228

5228pUJ9 F CTGAGAATTCTTGGATGATTCGCTGCAGC Amplificación de P5228 y posterior clonaje en pUJ9. EcoRI

5228pUJ9 R CTGAGGATCCATGCCCGCAGCATAACTG Amplificación de P5228 y posterior clonaje en pUJ9. BamHI

43

Materiales y Métodos

Tabla 4. Oligonucleótidos empleados en RT-PCR semicuantitativa. Las secuencias en negrita

se corresponden con dianas de restricción creadas.

GEN SECUENCIA 5’-3’OLIGO INTERNO F(directo) SECUENCIA 5’-3’OLIGO INTERNO R(reverso) MSMEG_5935 CGAAACTTCTGCGCAATGCC CCAGTCCGATACGCAGTGC

MSMEG_5936 ATGAAGAAGATGTCCGCACG GAAGAACGTCCGGTACAGG MSMEG_5937 ACGCGTCGACAACTACGGCTTCTCCAAGAC CCGCTCGAGTCATCAAAAAGCCCACGGTC

MSMEG_5938 ACGCGTCGACATCTTCTGCAGATCCTGCG CCGCTCGAGTGTCCGTCGCTGCTTGTAC

MSMEG_5939 AAAACTGCAGTACGAGGAAGCGGGCATTC CCGCTCGAGCTCGTGGTCTTGGTGAACTC

MSMEG_5940 AAACTGCAGAACTGGCAGATCAAGCTGTG CCACTCGAGTTGAGCCGCACACCGAAAC

MSMEG_5941 AAAACTGCAGAGGTCTCGAACCGCCGTAC CCGCTCGAGGACGAGGTTCTTGCCGCTG

MSMEG_5943 AAAACTGCAGAGCTTCCACATGACCGAGC CCGCTCGAGAAGATGGACCGCTTGGTGG MSMEG_5994 TCAACGGAACCAAAATCGGTG CAGTGCGAGTTGGTTGACC

MSMEG_5995 GGGCCCATGTCGTCGTTCGAGCTGATC GGGCTCGAGTCTGCGCGAACGCGATCATG

MSMEG_5996 AAAACTGCAGGACATCGACATGCCCAACC CCGCTCGAGTGTGGTGTCACGCAGACCC

MSMEG_5997 TTCTCGGGAGATCACCTGC CTAACGTGTGATGAACGGAC

MSMEG_5998 CAGACGTTCCTGTTCAAGAC GCTTCTCGCTCCTGGTCTG

MSMEG_5999 AAAACTGCAGCGCCAACGGCTCCAACGTC CCGCTCGAGAACTCGTGTTGATGATGCGC MSMEG_6000 AAAACTGCAGTGCCGTACGAGTTCCACAGC CCGCTCGAGCCTGGTTCTGCATGACCGC

MSMEG_6001 AAAACTGCAGGACGCCAAATTCGGTCTGC CCGCTCGAGTGTCCTTGGTGGCGATGTC

MSMEG_6002 GCTCTAGAACGTGCGCAGCTTCTGGG ATAAGAATGCGGCCGCTCAGGAACAGGTCGTCGAAG

MSMEG_6003 CTAGTCTAGAAACCAGATCGATCGCTACGG CCGCTCGAGGGTAGATGTTGACGAACCGG

MSMEG_6004 CTAGTCTAGAACGCTCGACGAACTCAAGAC GGGCTCGAGGGACGGAATGACCACCACG

MSMEG_6005 CCGCTCGAGTATCACCTACCGCAGATCTTC ACGCGTCGACCTCCGAAAGATACTGCGAC MSMEG_6006 TGCAGTTGCTCGTCATCGC TGAGCTGCACGAGCATGAC

MSMEG_6007 AAAACTGCAGAAAGCTTTCTGACGGTGCTG CCGCTCGAGACCGTGAACAGACCGAACG

MSMEG_6008 CTAGTCTAGAAAGGAACTCGGATTCAGCAC GGAGCTCGGATCTCGTTGTCGAAGTGCC

MSMEG_6009 TCTCTCGGGCAGCCTGTAC ACATCTTGCGCTGCTCTTTTG

MSMEG_6010 GGTTACTGACGTGCGTTTCG ATACGGCACCAGTGCTGAG

MSMEG_6011 ACGTGGTGATCTCCGACTAC ACTCCTCGTCTGTCATGTCG MSMEG_6012 GCTCTAGAGACAAGGTCAACCACTTCGG CGAGCTCGCTGATTCCCCGTCGCTCC

MSMEG_6013 CGAGCTCGAAACGACGGCACCTGGGAC GCTCTAGATGATGCACAGGTAGCGGTC

MSMEG_6014 AACAGCTCGACCGTGTGTTG GAAGAAGATCTCGCCGAAC

MSMEG_6015 CGAGAAGTTCGACGGCATC CGGATTCGTGGCTTGCTCC

MSMEG_6016 CCGCTCGAGCACGCAGTGGGACACTTTCAC AAAACTGCAGTTGAGCGCCTGGAAGCTGC

MSMEG_6017 CTAGTCTAGATTCCTGGCGTGTTTCGACG GGAGCTCCAGTTCCTCGGGTGCGATCAC MSMEG_6033 CCTTCAGAACTGGTACAACG CCAGATTGGTGACGTTCTGC

MSMEG_6034 ATGGACGACCGGCGTCACGG TCAATTATCAGCTTCAGGG

MSMEG_6035 AAAACTGCAGCACGAGAACCAGCAGCACG CCGCTCGAGGGGTTTGGTCTTCGGCACC

MSMEG_6036 GCTCTAGATTCAAGGAGGGCACCTCGG ATAAGAATGCGGCCGCTCCTTGGTCAGCACGAC

MSMEG_6037 AAAACTGCAGAACGCTACAGCGCCAAG CCGCTCGAGGGTTCGACGTTGAACTTCGC

MSMEG_6038 GCTCTAGAACAACTGGCACCTCGCGC ATAAGAATGCGGCCGCCGTCGTCGATCGTGTACTC MSMEG_6039 GCTCTAGA

AGGACCTCGACACCGACTTC ATAAGAATGCGGCCGCAGCCAGTGCACCACGGTC

MSMEG_6040 AACCACGACAACGTGCTGTC TCAGCTGAACTTGGTCTGGG

44

Materiales y Métodos

Tabla 5. Oligonucleótidos empleados en RTq-PCR. Las secuencias en negrita se corresponden

con dianas de restricción creadas.

GEN SECUENCIA 5’-3’OLIGO INTERNO F (directo) SECUENCIA 5’-3’OLIGO INTERNO R (reverso) MSMEG_0217 CGACTACCACATCACCACGG TGACGTTCTTGCCGACCTTG MSMEG_1366 GTTCCTGAAGTCGCTGATCG GATCTCGTAGAGCTCCTTGG MSMEG_1604 TGCTGTTCAAGATGCGCGAC CCATCGCGTTGGAGCCCTTG

MSMEG_5906 TTCTGACCATCAACAGCGTCG CGATCGAGAAGTGCAGTTCAC MSMEG_5228 CGTACACCGAGCGTTTCAAC GGATCGAGCACGTCAGCATG MSMEG_5233 CTGCAGACCGTCGACGTG CTAGACTAGTGATGAGCAGCACCTCGTGG MSMEG_5895 GGTGTGGTGGCCAAGATGC GCACCAGGTCGATGTACTGC MSMEG_5920 TGGGTTTGCAACTCGGATATTG GGTGAACACGGTGTCGAAAC MSMEG_5925 CGACAACGTCACCGACATGG CGTTGTGCAGGTACTGGCTG MSMEG_6009 AGCAGATGGTCGAAGAGGTC CGTCAGCTTCTCCAGCGG MSMEG_6012 GCTCTAGAGACAAGGTCAACCACTTCGG CGAGCTCGCTGATTCCCCGTCGCTCC

MSMEG_6036 GCTCTAGATTCAAGGAGGGCACCTCGG ATAAGAATGCGGCCGCTCCTTGGTCAGCACGAC

MSMEG_6039 GCTCTAGAAGGACCTCGACACCGACTTC ATAAGAATGCGGCCGCAGCCAGTGCACCACGGTC

MSMEG_6041 TCGTCGACGGACGTGCTTC CGTCGAGCAGCAGCACATC

2. Medios y condiciones de cultivo 2.1. Escherichia coli

Todas las soluciones y medios de cultivo utilizados en este trabajo se

esterilizaron por calor húmedo en un autoclave a 121 ºC y 1 at de presión, o

mediante filtración utilizando filtros estériles Millipore de 0,2 micras de diámetro.

El medio complejo utilizado para cultivar las células de E. coli es el medio

Luria-Bertani (LB) (Sambrook y Russell, 2001). Los cultivos en medio sólido se

realizaron con medio LB al que se adicionó Bacto Agar (Pronadisa) al 1,5% (p/v).

Cuando fue necesario, se añadió 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido

(X-Gal) 0,08 mM, así como isopropil-1-tio-β-galactopiranósido (IPTG) de 1,00 a

0,01 mM.

2.2. Mycobacterium smegmatis

Para el cultivo de micobacterias se utilizan los medios complejos Bacto

Middlebrook 7H10 Agar (Difco) y LB con 1,5% de agar como medios sólidos, y

45

Materiales y Métodos

Middlebrook 7H9 Broth (Difco) y LB como medios líquidos. Al medio Bacto

Middlebrook 7H9 Broth y 7H10 Agar se le añade Middlebrook ADC Enrichment

(Difco) (fórmula aproximada por litro de agua: NaCl (8,5 g), albúmina bovina

(Fracción V) (50 g), dextrosa (20 g), catalasa (0,03 g)) (1/5 del volumen final).

El medio 457 es un medio basal (pH 6,9) cuya composición se detalla a

continuación: KH2PO4 (1,52 g), Na2HPO4 (2,44 g), (NH4)2SO4 (0,5 g),

MgSO4·7H2O (0, 2 g), CaCl2·2H2O (0,05 g), H2O destilada csp 1 L. A este medio

se adicionó glicerol 0,6 M o 18 mM o colesterol 1,8 mM como fuente de carbono

para su utilización como medio mínimo.

Para los cultivos en medio líquido con colesterol se utilizó medio mínimo 457

al que se adicionó colesterol acomplejado con β-ciclodextrina metilada al azar,

hasta conseguir una concentración final de colesterol 1,8 mM, que se corresponde

con una concentración final de ciclodextrina 18 mM. El protocolo de síntesis de

estos complejos se detalla más adelante.

A todos los cultivos en medio líquido de micobacterias se le adiciona siempre

Tween 80 al 0,05% para evitar la agregación de las células.

Síntesis de complejos colesterol-metil-β-ciclodextrina

Este protocolo se ha llevado a cabo para conseguir un medio en el que el

colesterol se disuelva perfectamente, ya que así está repartido homogéneamente

y además no produce turbidez, lo que permite que se pueda medir

espectrofotométricamente el crecimiento de los cultivos en medio líquido. Esta

disolución se lleva a cabo mediante la formación de complejos de colesterol con

metil-β-ciclodextrina (TRMB-T Randomly Methylated BCD, CTD Inc.) Para ello se

ha seguido un protocolo de disolución de esteroides en ciclodextrinas descrito

previamente (Klein et al., 1995). Brevemente, una solución de 30 mg de colesterol

en 400 µl de isopropanol-cloroformo (2:1 v/v) se añade en pequeñas alícuotas a 1

g de β-ciclodextrina metilada al azar disuelta en 11 ml de PBS y en agitación en un

baño de agua a 80 ºC. La solución final contiene colesterol 6,8 mM y ciclodextrina

70 mM (≈9% ciclodextrina), y es la base que se añadirá al medio mínimo para

cultivos con colesterol en medio líquido o en placa. Habitualmente se preparan las

46

Materiales y Métodos

placas de cultivo con colesterol 1,8 mM (0,08% colesterol), con 1,5% de agar y

medio mínimo 457. Los cultivos líquidos también contienen colesterol 1,8 mM, que

se corresponde con una concentración final de ciclodextrina de 18 mM. Este

protocolo también se llevó a cabo para disolver los otros esteroides utilizados en

este trabajo, ajustando en cada caso la cantidad de esteroide utilizada según las

necesidades. En el caso del ergosterol, la cantidad de ciclodextrina necesaria para

su completa disolución fue mayor, por lo que la concentración final de ciclodextrina

en los medios de crecimiento fue de 35 mM. Como se puede apreciar en la figura

8, la ciclodextrina apenas puede ser utilizada por M. smegmatis como fuente de

carbono y energía. Los cultivos en medio líquido con ciclodextrina como única

fuente de carbono a las concentraciones utilizadas llegan a una DO600 máxima de

0,3. Así, cuando la ciclodextrina se encuentra acomplejada con un esteroide, se

puede discernir perfectamente el crecimiento debido al esteroide solubilizado.

A B Figura 8. M. smegmatis mc2155 sembrado en A. Placa con ciclodextrina 18 mM. B. Placa con colesterol 1,8 mM-ciclodextrina 18 mM.

Las células de E. coli y M. smegmatis se cultivaron a 37 ºC. Los cultivos en

medio líquido se llevaron a cabo en un agitador orbital a 300 rpm. El crecimiento

en medio líquido fue seguido por turbidimetría a 600 nm (DO600) empleando un

espectrofotómetro UVmini-1240 (SHIMADZU).

Los antibióticos se prepararon en soluciones acuosas 1000x, a excepción de

la ampicilina, que se preparó 250x. Las soluciones preparadas se esterilizaron por

filtración y se conservaron a –20 ºC. Los antibióticos se utilizaron a las

47

Materiales y Métodos

concentraciones finales que se indican a continuación. Para E. coli: ampicilina

(Ap, 100 μg/ml), kanamicina (Km, 50 μg/ml), higromicina (Hyg, 150 μg/ml),

gentamicina (Gm, 10 μg/ml). Para M. smegmatis: kanamicina (Km, 20 μg/ml),

higromicina (Hyg, 50 μg/ml) y gentamicina (Gm, 5 μg/ml).

Durante periodos inferiores a un mes las cepas se conservaron a 4 ºC en

placas de LB, 7H10 o medio mínimo. Para la conservación a largo plazo, las

bacterias se congelaron en el medio de cultivo correspondiente con glicerol al 20%

(v/v) para E. coli y al 50% (v/v) para M. smegmatis y se mantuvieron a -80 ºC.

3. Transformación de las células 3.1 Transformación de Escherichia coli

Las células de E. coli fueron modificadas genéticamente por transformación

tras hacerlas competentes mediante el método de RbCl y choque térmico

(Sambrook y Rusell, 2001).

3.2 Transformación de Mycobacterium smegmatis

3.2.1 Preparación de células electrocompetentes

La preparación de células electrocompetentes de M. smegmatis se llevó a

cabo según un protocolo descrito previamente (Parish y Stoker, 1998).

Básicamente, se siembra una colonia de la cepa de micobacteria

correspondiente en 10 ml de medio 7H9-ADC conteniendo Tween 80 0,05% y se

incuba a 37 ºC hasta alcanzar la fase estacionaria (aproximadamente 30 horas en

M. smegmatis). Con 2 ml de este cultivo se inoculan 200 ml de medio 7H9-ADC

conteniendo Tween 0,05% y se incuba en agitación (80 rpm) a 37 ºC hasta una

DO600 de 0,8-1 (18 h de cultivo aproximadamente). A continuación el cultivo se

incuba 1,5 h en hielo y se centrifuga repartido en 4 tubos Falcon de 50 ml a 3000 g

a 4 ºC 10 min. Una vez decantado el sobrenadante, se resuspenden las células en

48

Materiales y Métodos

200 ml de glicerol 10% (enfriado en hielo, y con Tween 0,05%). Tanto en este

paso como en las etapas posteriores se resuspenden las células volteando el

recipiente, nunca con vórtex, ni pipeteando. Seguidamente se centrifuga la

suspensión a 3000 g a 4 ºC 10 min. Posteriormente se retira el sobrenadante y se

resuspenden las células en 100 ml de glicerol 10% frío. Seguidamente se

centrifugan las células a 3000 g 10 min a 4 ºC y se añaden 25 ml de glicerol 10%

frío. Las células se resuspenden volteando y se dejan reposar para sedimentar los

agregados que no se resuspenden. Posteriormente se toma la suspensión sin los

agregados con una pipeta estéril. La suspensión se lleva a un tubo Falcon limpio

enfriado en hielo y se centrifuga a 3000 g 10 min a 4 ºC. Finalmente se retira el

sobrenadante y se resuspenden las células en 1,5 ml de glicerol 10% frío, que se

reparten en alícuotas de 200 µl y se guardan a −80 ºC hasta su uso.

3.2.2 Electroporación

A una alícuota de las células competentes se añade el DNA con el que se va

a transformar. Esta mezcla se pasa a una cubeta de electroporación (Cell

Projects), la mezcla se incuba 10 min en hielo y se electropora en un

electroporador Gene Pulser (Biorad) a 2,5 Kv, 25 µF y 1000 Ω. Se incuba la

cubeta en hielo otros 10 min. Posteriormente se añade 1 ml de medio 7H9-Tween-

ADC a la cubeta y el líquido se pasa a un tubo Falcon de 15 ml. Las células se

incuban 4 h a 37 ºC en agitación (80 rpm) antes de sembrarlas en medio sólido

con los antibióticos necesarios.

4. Técnicas de DNA

Las enzimas de restricción se obtuvieron de Amersham, Takara y New

England Biolabs. La enzima T4 DNA ligasa fue proporcionada por USB

(Amersham), la DNA polimerasa I y la Pfu polimerasa fueron suministradas por

Biotools B. M. Labs. Todas las enzimas se emplearon atendiendo a las

49

Materiales y Métodos

especificaciones de las diferentes casas comerciales. Los fragmentos de DNA se

purificaron empleando geles de agarosa, mediante el kit GeneClean (BIO 101) o el

High Pure PCR Product Purication Kit (Roche).

4.1 Electroforesis de DNA en geles de agarosa

Se utilizaron geles de agarosa al 0,7% o al 1,5% en tampón TAE (Tris-HCl 40

mM, ácido acético 20 mM, EDTA 2 mM pH 8,1), utilizando el mismo tampón como

electrolito. A las muestras se les añadió ¼ de su volumen de una solución

compuesta por Ficoll 400 al 30% (p/v), azul de bromofenol al 0,2% (p/v),

xilencianol al 0,2% (p/v) y EDTA 40 mM pH 8,0. La electroforesis se realizó a 100

V durante 15-20 min y, una vez finalizada, los geles se tiñeron con bromuro de

etidio (5 µg/ml) y los fragmentos de DNA se visibilizaron con radiación ultravioleta

en un transiluminador. Como marcadores de tamaño se utilizaron el DNA del fago

λ digerido con la enzima de restricción BstEII (Amersham), y la forma replicativa

del fago ΦX174 digerida con HaeIII (New England Biolabs).

4.2 Extracción de DNA cromosómico de micobacterias

Para realizar la extracción de DNA se recogen las células de una placa, se

resuspenden en 400 µl de Tris-EDTA (TE) y se incuban a 80 ºC durante 20 min.

Se dejan enfriar a temperatura ambiente y se añaden 50 µl de lisozima (10 mg/ml),

se mezcla con vórtex y se deja 1-12 h a 37 ºC. A continuación se añaden 75 µl de

SDS al 10% conteniendo proteinasa K (10 mg/ml), se mezcla con vórtex y se

incuba 10 min a 65 ºC. Posteriormente se añaden 100 µl de NaCl 5 M y 100 µl de

CTAB/NaCl precalentados a 65 ºC y se incuba 10 min a 65 ºC. Seguidamente se

añaden 750 µl de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1), se mezcla con vórtex y se

centrifuga 5 min a 14000 g. La solución acuosa se toma con pipeta, se transfiere a

un tubo eppendorf y se añade un volumen equivalente de

fenol/cloroformo/isoamílico (25:24:1), se mezcla con vórtex y se centrifuga 5 min a

14000 g. La solución acuosa se toma con pipeta y se transfiere a un eppendorf

50

Materiales y Métodos

donde el DNA se precipita con 0,6 volúmenes de isopropanol y se mantiene 30

min a 20 ºC. Finalmente el DNA se centrifuga 15 min a 14000 g a 4 ºC, se lava con

etanol al 70%, se centrifuga 2 min a 14000 g y se seca al aire o en speed-vac el

precipitado que posteriormente se resuspende en 40-100 µl de TE.

4.3 Aislamiento de DNA plasmídico La extracción de DNA plasmídico de células E. coli se llevó a cabo empleando

el sistema High Pure Plasmid Purification Kit (Roche), de acuerdo con las

especificaciones del fabricante.

4.4 Reacción de amplificación en cadena con DNA polimerasa termorresistente (PCR)

La amplificación del DNA se realizó en un equipo Mastercycler Gradient de

Eppendorf y las enzimas que se emplearon fueron la DNA polimerasa I y la Pfu

polimerasa, ambas proporcionadas por Biotools B. M. Labs. Las mezclas de

reacción contenían MgCl2 1,5 mM y dNTPs 0,25 mM. Los productos amplificados

se purificaron con el sistema High Pure PCR Product Purification Kit (Roche).

4.5 Secuenciación de DNA

La secuenciación de DNA se llevó a cabo en el Servicio de Secuenciación

Automática de DNA (SSAD) del Centro de Investigaciones Biológicas (CIB)

(SECUGEN, SL) utilizando un secuenciador automático modelo ABI Prism 3730

(Applied Biosystems). Para la reacción de secuenciación se utilizó el “Dye

Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit” de Applied Biosystems, y la

DNA polimerasa AmpliTaq FS, de acuerdo con las recomendaciones del

proveedor. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo mediante la técnica

de PCR con un termociclador “Gene Amp PCR System 2400” de Perkin-Elmer. En el caso concreto de los experimentos de extensión por cebador (primer

51

Materiales y Métodos

extension), la secuenciación del DNA patrón se llevó a cabo según el método de

terminación de la polimerización por dideoxinucleótidos (Sanger et al., 1977)

utilizando el Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit (USB), y [α-32P]dATP

(14,8 × 1012 Bq/mmol, 3,7 × 105 Bq/μl) (Amersham Biosciences) como

deoxinucleósido trifosfato marcado radiactivamente, siguiendo las

recomendaciones del fabricante.

4.6 Construcción de cepas mutantes de Mycobacterium smegmatis mc²155 mediante mutagénesis insercional

Para la construcción de distintos mutantes de M. smegmatis se procedió a la

interrupción insercional de los genes por recombinación homóloga simple. Para

ello, se amplificaron fragmentos internos de al menos 600 pb de cada uno de los

genes, y se clonaron en uno de los polilinkers de pJQ200x (Jackson et al., 2001),

plásmido que no replica en Mycobacterium pero sí en E. coli (Figura 9).

MCS

MCS

MCS

MCS

Figura 9. Vector pJQ200x. Este vector incluye un gen de resistencia a gentamicina (Gm), el gen

de contraselección sacB, que permite distinguir aquellas colonias en las que el vector se ha

insertado en el cromosoma (y por tanto son sensibles a sacarosa) y el gen xylE, que permite

confirmar, mediante la adición de catecol a una colonia, si la construcción se insertó en el

cromosoma (se producirá una coloración amarilla intensa). Las flechas amarillas indican la

situación de los dos sitios de clonación múltiple (MCS) presentes en este vector.

52

Materiales y Métodos

Con las construcciones resultantes se transformó la cepa E. coli DH10B y se

seleccionaron clones en que se comprobó que dichas construcciones eran

correctas. De estos clones se extrajo DNA plasmídico para la electroporación de

M. smegmatis. Las bacterias recombinantes presentaban una interrupción génica

por inserción, mediante recombinación homóloga entre el gen nativo cromosómico

y el correspondiente fragmento interno clonado en el vector suicida, de los

respectivos derivados del plásmido suicida pJQ200x (figura 10), y fueron

seleccionadas en un primer paso en placas de 7H10 con gentamicina (5 μg/ml).

En un segundo paso, las colonias resistentes se crecieron en placas de 7H10 con

sacarosa 10% para selección negativa, ya que el plásmido pJQ200x incluye el gen

sacB (levansucrasa de Bacillus subtilis), cuya expresión es letal para la bacteria

cuando crece en sacarosa. Finalmente, a aquellas colonias sensibles a sacarosa

se adicionaron 10-15 µL de catecol. La aparición de coloración amarilla en las

mismas indica que portan el gen xylE que incluye el plásmido suicida. Los

mutantes así obtenidos fueron analizados por PCR, empleando un oligonucleótido

específico del vector pJQ200x (Tabla 3) y un oligonucleótido externo al fragmento

clonado, para confirmar la interrupción de los respectivos genes truncados.

También se analizó la ausencia de una copia del gen no mutado mediante

amplificación por PCR con un oligonucleótido de la región 5’ y otro de la región 3’

del gen mutado en cada caso.

53

Materiales y Métodos

Figura 10. Mecanismo de mutagénesis insercional en M. smegmatis utilizando el vector

pJQ200x. El fragmento interno amplificado del gen a mutar (en este ejemplo MSMEG_1604,

MSMEG_5228 y MSMEG_5233) se inserta en pJQ200x utilizando sitios de restricción presentes en

los MCS. Como resultado se obtiene un derivado del plásmido pJQ200x portando un fragmento

interno del gen (pJQ1604, pJQ5228 y pJQ5233 en este ejemplo). Este plásmido se electropora en

RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA SIMPLE (GmR, SacS)

M. smegmatis::MSMEG_1604

PstI XhoI

pJQ1604 (~7357pb)

PstI

XhoI

RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA SIMPLE (GmR, SacS)

M. smegmatis::MSMEG_5228

SalI BamHI

pJQ5228 (~7407 pb)

BamHI

SalI

ELECTROPORACIÓN (M. smegmatis mc²155)

SpeI XbaI RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA

SIMPLE (GmR, SacS) M. smegmatis::MSMEG_5233

SpeI XbaI

pJQ5233 (~7043 pb)

Inserción en pJQ200x

XhoI PstI MSMEG_1604

Amplificación mediante PCR de un fragmento interno del gen

sacB

Gmxyl E

ori

pJQ200X ( ~ 6407 pb)

MSMEG_5228 MSMEG_5233

BamHI SalI XbaI SpeI

54

Materiales y Métodos

M. smegmatis y tiene lugar la recombinación homóloga del mismo con el gen correspondiente en el

cromosoma, dando lugar a un mutante por interrupción del gen mediante inserción del plásmido

suicida.

4.7 Construcción de cepas mutantes de Mycobacterium smegmatis mc²155 mediante deleción por recombinación homóloga

Para la construcción de mutantes de M. smegmatis mediante deleción (M.

smegmatisΔMSMEG_5228 en este trabajo, figura 11) se clonaron primero en un

mismo vector pUC19 dos fragmentos de DNA de unos 600 pb cada uno, uno en

posición 5’ al gen a mutar (fragmento up-5228), utilizando los oligonucleótidos

MSMEG_5228 UP F/UP R (Tabla 3) y otro en posición 3’ al gen a mutar

(fragmento down-5228), utilizando los oligonucleótidos MSMEG_5228 DOWN

F/DOWN R (Tabla 3). Con la construcción resultante se transformó la cepa E. coli

DH10B y tras extraer DNA plasmídico se digirió la región conteniendo los

fragmentos up y down con la enzima de restricción ApaI y se insertó en el sitio

ApaI de pJQ200x. La nueva construcción se seleccionó tras transformar

nuevamente E. coli DH10B y se electroporó con ella M. smegmatis mc²155. Los

transformantes por electroporación se sembraron en placas de medio 7H10 con

gentamicina. Las colonias obtenidas con gentamicina se replicaron en placas de

7H10 con sacarosa 10%. Se seleccionaron colonias que fuesen resistentes a

gentamicina, sensibles a sacarosa y que portasen el gen xylE (lo que se comprobó

como se detalla en el apartado anterior). Estas colonias han sufrido una

recombinación simple, todo el vector está integrado en el cromosoma. Para forzar

una segunda recombinación, tras crecer una colonia en 10 ml de medio 7H9 con

gentamicina hasta una DO600 aproximada de 0,8-0,9, se sembraron 20 μL de una

dilución ½ del cultivo en una placa de 7H10 y otros 20 µl en una placa de 7H10

con sacarosa 10%. En la placa con sacarosa se deben obtener alrededor de 103 a

104 colonias menos, lo que indica que ha tenido lugar la recombinación doble. Las

colonias crecidas en presencia de sacarosa se replicaron en placas de 7H10 con

gentamicina o sacarosa 10%. Aquellas sensibles a gentamicina, que no portan el

55

Materiales y Métodos

gen xylE y resistentes a sacarosa eran mutantes por recombinación doble. Los

mutantes así obtenidos fueron analizados por PCR, empleando tres parejas

distintas de cebadores que dan lugar a amplicones de diferente tamaño según se

trate de una cepa mutada o no mutada: 1. un oligonucleótido situado a 566 pb del

inicio del gen MSMEG_5228 (MSMEG_5228 UP F) con un oligonucleótido reverso

situado al final del gen (5228-R); 2. Un nucleótido situado al inicio del gen (5228-F)

con un oligonucleótido situado a 604 pb del final del gen (MSMEG_5228 Down R);

3. se analizó la ausencia de una copia del gen no mutada mediante amplificación

por PCR con un oligonucleótido situado en el inicio del gen (5228-F) y otro reverso

situado al final del gen (5228-R). La secuencia de estos oligonucleótidos se

muestra en la Tabla 3.

Figura 11. Construcción del mutante mediante deleción M. smegmatisΔMSMEG_5228. Los

detalles de la construcción se indican en el texto.

pUC19 (2686 pb)

MCS lacZ

bla (ApR)

rep (pMB1)

pUC5228DR

EcoR I-ApaI

XbaIPstI

ApaI- HindIII

Inserción de los fragmentos up-5228 y down-5228 en pUC19

Digestión con ApaI e inserción del fragmento up-down en pJQ200x

Electroporación en M. smegmatismc²155

88 29

MSMEG_5226 MSMEG_5229 MSMEG_5230 MSMEG_5227

Amplificación mediante PCR de los fragmentos up-5228 y down-5228

88 29

MSMEG_5226 MSMEG_5229 MSMEG_5230 MSMEG_5228 MSMEG_5227

EcoRI- Pst ApaI- Xba

Zona up-5228 (654 pb)

Zona down-5228 (633 pb)

pJQ5228DR ApaI

ApaI

ΔMSMEG_5228 RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA DOBLE

M. smegmatisΔMSMEG_5228 (GmS, SacR)

56

Materiales y Métodos

La construcción del doble mutante M. smegmatis::MSMEG_1604-

ΔMSMEG_5228 se llevó a cabo a partir del mutante M. smegmatis

ΔMSMEG_5228. Se hicieron células competentes de esta cepa y se transformaron

con el plásmido pJQ1604int, que incluye un fragmento interno del gen

MSMEG_1604 y que al sufrir recombinación homóloga simple produjo un mutante

en el gen MSMEG_1604 mediante interrupción por el plásmido suicida (Fig. 12).

Así, el mutante doble M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228 presenta el

gen MSMEG_5228 delecionado y el gen MSMEG_1604 interrumpido por

pJQ200x.

sacB

Gm xyl E

ori

RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA SIMPLE (GmR, SacS)M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228

SacI XbaI

ELECTROPORACIÓN (M. smegmatis ΔMSMEG_5228)

INSERCIÓN

XbaI SacI

MSMEG_1604 pJQ200X

pJQ1604int

XbaISacI

SacI XbaI

Figura 12. Construcción del mutante doble M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228. Se

amplificó un fragmento interno de MSMEG_1604 y se clonó en el sitio SacI-XbaI de pJQ200x

dando lugar al plásmido pJQ1604int. Con esta construcción se electroporó el mutante por deleción

M. smegmatis ΔMSMEG_5228. Tras la recombinación homóloga simple que tiene lugar en

MSMEG_1604 se obtiene el mutante doble M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228.

57

Materiales y Métodos

5. Técnicas de proteínas

5.1 Obtención de los extractos proteicos

5.1.1 Extractos de Escherichia coli

La obtención de extractos crudos se llevó a cabo con las cepas de E. coli que

expresaban distintas proteínas de M. smegmatis en vectores de expresión. Para

ello se cultivaron las células a 37 ºC en 1 L de medio LB y se añadió la

concentración de IPTG requerida (50 µM) cuando los cultivos alcanzaron una

DO600 de 0,5-0,6. La inducción con IPTG se mantuvo durante 3 h a temperatura

ambiente (20 ºC) en agitación. Los cultivos se resuspendieron en 5 ml del tampón

adecuado tras centrifugar 30 min a 8000 g y 4 ºC, lavar con solución salina y

centrifugar de nuevo y se lisaron empleando la prensa de French (Aminco Corp.)

operada a una presión de 20000 psi. La suspensión obtenida se centrifugó a 4 ºC

a 16000 g durante 30 min, recogiéndose el sobrenadante (extracto crudo). La

determinación de la concentración de proteína se realizó empleando el método de

Bradford (Bradford, 1976), usando albúmina de suero bovino (BSA) como patrón.

5.1.2 Extractos de Mycobacterium smegmatis

Para obtener extractos de las micobacterias se utilizó un sonicador Branson

150. Un volumen de los cultivos correspondientes se centrifugó, se lavó 2-3 veces

con solución salina (NaCl 0,9% en H2O destilada) y se resuspendió en 500 µl del

tampón adecuado en tubos eppendorf de 2 ml. Las muestras se sonicaron

enfriadas en hielo aplicando 5-8 pulsos de 1 min a intensidad 9 del equipo. Entre

pulsos se incubaron los tubos 5 min en hielo. Después se centrifugaron a 4 ºC a

14000 g y se separó la fracción celular soluble de la insoluble.

Alternativamente, puede obtenerse el extracto proteico de las micobacterias

sometiéndolas a lisis en Fast-Prep (ver apartado 7.1 de Materiales y Métodos)

58

Materiales y Métodos

aumentando el número de ciclos hasta 6 y utilizando como medio de suspensión

celular el tampón adecuado en cada caso.

La determinación de la concentración de proteína en ambos casos se realizó

empleando el método de Bradford.

5.2 Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS

Las electroforesis analíticas de proteínas se realizaron en condiciones

desnaturalizantes en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS), en geles de

poliacrilammida (PAGE), a una concentración del 10% o del 12,5% según la

técnica descrita previamente (Laemmli, 1970). Las muestras se hirvieron durante

10 min en presencia del tampón de ruptura (Tris-HCl 250 mM a pH 6,8; SDS 2%;

β-mercaptoetanol 5%; glicerol 10% y azul de bromofenol 0,05%). Las

electroforesis se realizaron a temperatura ambiente, empleando un electrolito de

composición: Tris-HCl 25 mM pH 8,0, glicina 192 mM y SDS 0,1%. Las proteínas

fueron teñidas con Coomasie Brilliant Blue R250, según se describe previamente

(Swank y Munkres, 1971).

Las proteínas empleadas como marcadores de tamaño molecular (miosina,

200 kDa; β-galactosidasa, 116,2 kDa; fosforilasa B, 97,4 kDa; BSA, 66,2 kDa;

ovoalbúmina, 45,0 kDa; anhidrasa carbónica, 31,0 kDa; inhibidor de tripsina, 21,5

kDa; lisozima, 14,4 kDa; aprotinina, 6,5 kDa) fueron proporcionadas por Bio-Rad

(marcadores Broad-Range).

5.3 Purificación de la proteína KstR

El gen que codifica la proteína KstR, kstRMsm, (MSMEG_6042) se amplificó

por PCR y se subclonó en el vector de hiperexpresión pET-29a (+), fusionando en

su extremo 3’ 6 tripletes en fase que codifican un tag de 6His, resultando en el

plásmido pET6042. La cepa E. coli BL21 (DE3) transformada con el plásmido

pET6042, se creció en 50 ml de LB a 37 ºC hasta una DO600 de 0,6, momento en

que se indujo la expresión de KstR-His con IPTG 200 μM, y se mantuvo el cultivo

otras 3 h a 37 ºC. Tras centrifugar 30 min a 8000 g y 4 ºC, lavar con solución

59

Materiales y Métodos

salina y centrifugar de nuevo, los cultivos se resuspendieron en 5 ml del tampón

KST (HEPES 20 mM pH 8, KCl 150 mM, ß-mercaptoetanol 2 mM, glicerol 10%,

MgCl2 10 mM, PMSF 0,1 mM e imidazol 10 mM) y se lisaron empleando la prensa

de French (Aminco Corp.) operada a una presión de 20000 psi. A continuación, la

suspensión obtenida se centrifugó durante 30 min a 4 ºC a 16000 g y se purificó a

través de columnas de níquel-nitrilotriacetato en gel de sílice (columnas Ni-NTA

Spin, del kit Ni-NTA Spin, Qiagen). La columna se equilibró con 600 μl de tampón

KST sin imidazol (centrifugando durante 2 min a 300 g a 4 ºC), y seguidamente se

pasó el extracto proteico de 600 en 600 μl, quedando retenida en la columna la

proteína KstR-His. Seguidamente se lavó la columna con 3 volúmenes de tampón

KST con una concentración de imidazol 50 mM, y mediante interacción de afinidad

se procedió a la elución de la proteína unida a ésta con tampón KST con imidazol

1 M. La pureza de las muestras recogidas se analizó mediante SDS-PAGE. Las

fracciones recogidas se concentraron y se eliminó el imidazol de las mismas

utilizando las columnas VIVASPIN 500 (Sartorius); primero se pasó toda la

muestra a concentrar por la columna según las especificaciones del fabricante, y

posteriormente se realizaron 3 lavados con el mismo tampón KST sin imidazol,

obteniendo un volumen final de muestra de 50-75 μl. La concentración de proteína

pura KstR-His se calculó utilizando un Nanodrop 1000 (Nanodrop Technologies) o

espectrofotómetro UVmini-1240 (SHIMADZU). La proteína purificada se conservó

en tampón KST sin imidazol a 4 ºC por períodos no superiores a una semana.

5.4 Ensayos enzimáticos

5.4.1 Ensayos in vitro de actividad productora de 4-colesten-3-ona para análisis mediante TLC y LC/MS

Los extractos proteicos de E. coli BL21 (DE3) expresando los plásmidos

pET1604, pET5228 o pET5233 se ensayaron en un volumen final de 1 a 4 ml que

contenían 8 mg/ml de extracto proteico en el tampón adecuado (fosfato potásico

0,1 M pH 7,5 para extractos expresando el producto de MSMEG_1604 e

60

Materiales y Métodos

hidrocloruro de trietanolamina 0,1 M pH 8,5 para extractos expresando el producto

de MSMEG_5228 o MSMEG_5233). Una solución de colesterol 0,5% disuelto en

Triton X-100 al 10% se añadió a las soluciones de ensayo hasta una

concentración final de colesterol 0,44 mM. A los extractos proteicos que contenían

pET5228 y pET5233, se añadió NAD 1,35 mM. Cuando los ensayos se realizaron

para un análisis posterior mediante cromatografía en capa fina (TLC), se

añadieron 120.000 dpm de [4C-14C]colesterol por ml. Como control positivo se

llevaron también a cabo ensayos con colesterol oxidasa de Pseudomonas

fluorescens (Sigma). Se añadieron 2 µl de una solución de enzima de

concentración 5 mg/ml por ml de ensayo en tampón fosfato potásico 0,1 M pH 7,5.

Los ensayos se llevaron a cabo a 30 ºC en tubos de vidrio con agitación

continua.

En el caso de las muestras para TLC, se retiraron alícuotas de 900 µl a

distintos tiempos de reacción y tras precipitar las proteínas con ácido

tricloroacético al 4% se centrifugaron, se recuperaron los sobrenadantes y se

neutralizaron con NaOH 10 N. Posteriormente se extrajeron 2 veces con un

volumen equivalente de acetato de etilo. A continuación las dos extracciones se

concentraron bajo vacío. Los residuos así concentrados se analizaron

posteriormente mediante TLC como se describe en el apartado 9 de esta sección.

En el caso de las muestras para LC/MS, se retiraron alícuotas de 900 µl a

distintos tiempos de reacción y se extrajeron 2 veces con un volumen equivalente

de cloroformo. Como patrón interno se añadió a las alícuotas, antes de su

extracción, 50 μl de una solución de pregnenolona 20 mg/ml en cloroformo. A

continuación las dos extracciones se concentraron bajo vacío. Los residuos así

concentrados se analizaron posteriormente mediante LC/MS como se describe en

el apartado 8 de esta sección.

61

Materiales y Métodos

5.4.2 Ensayos in vivo de actividad productora de 4-colesten-3-ona para análisis mediante TLC y LC/MS

Diferentes cepas de M. smegmatis (mc2155, ::MSMEG_1604,

ΔMSMEG_5228, ::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228, ::MSMEG_5233) se cultivaron

en 15 ml (para un posterior análisis mediante TLC) o 25 ml (para un posterior

análisis mediante HPLC) de medio mínimo 457 con colesterol 1,8 mM en β-

ciclodextrina. Cuando los ensayos se realizaron para un análisis posterior

mediante cromatografía en capa fina (TLC), se añadieron 3 x 106 dpm de [4C-14C]

colesterol a los 15 ml. Los cultivos se crecieron a 37 ºC durante 24 h (para un

posterior análisis mediante TLC) o 72 h (para un posterior análisis mediante

LC/MS).

En el caso de las muestras para TLC, se recogieron alícuotas de 2 ml a las

24 h de cultivo y se centrifugaron durante 15 min a 14000 g. Los sobrenadantes se

filtraron con filtros de acetato de celulosa 0.20 μm (Iwaki) y se extrajeron 2 veces

con un volumen equivalente de acetato de etilo. Los dos extractos de acetato de

etilo se concentraron bajo vacío. Los residuos así concentrados se analizaron

posteriormente mediante TLC como se describe en el apartado 9 de esta sección.

En el caso de las muestras para LC/MS, se recogieron alícuotas de 2 ml a las

0, 24, 48 y 72 h de cultivo. Posteriormente se extrajeron 2 veces con un volumen

equivalente de cloroformo añadiendo antes de la extracción 50 μl de una solución

de pregnenolona 20 mg/ml en cloroformo. Los dos extractos de cloroformo se

concentraron bajo vacío. Los residuos así concentrados se analizaron

posteriormente mediante LC/MS como se describe en el apartado 8 de esta

sección.

62

Materiales y Métodos

6. Ensayos de unión DNA-proteína

6.1 Marcaje de sondas con 32P

Mediante este método se marcó el oligonucleótido 5228 FP F. Para la

reacción de marcaje se emplearon 2,5 µl del oligonucleótido (2 µM), 1,25 µl de

tampón kinasa 10x (Biolabs), 3 µl de [γ-32P]ATP (3000 Ci/mmol) (Amersham

Pharmacia Biotech) y 10 U de T4 polinucleótido kinasa 10 U/µl (Biolabs) en un

volumen total de 10 µl. La mezcla de reacción se incubó 30 min a 37 ºC. Al

término de la incubación se comprobó el nivel de incorporación del nucleótido

radiactivo al oligonucleótido mediante una cromatografía en capa fina (TLC). Para

ello se depositaron 0,5 µl de la sonda marcada sobre una membrana de sílica gel

60 (Merck) utilizando HCl 1 N como fase móvil. A continuación se realizó una

autorradiografía empleando una película Hyperfilm™ MP (Amersham Pharmacia

Biotech). Una vez marcado el oligonucleótido de interés se obtuvo mediante PCR

el fragmento 5228 FP (196 pb) utilizando como molde 100 ng de DNA de M.

smegmatis y los oligonucleótidos 5228 FP F y 5228 FP R (tabla 3 de

oligonucleótidos). En este caso la reacción de PCR difiere de la descrita en el

apartado 4.4 de esta sección. Se añadieron 10 µl del oligonucleótido marcado (5

pmoles), 7,5 µl del oligonucleótido frío a 1 µM (7,5 pmoles), 4 µl de dNTPs a 2,5

mM (0,2 mM final), 5 µl de tampón Taq polimerasa 10x, 1 µl de Taq polimerasa, 1

µl de DNA molde (100 ng/µl), en un volumen final de 50 µl. A continuación el

producto amplificado se purificó con el sistema High Pure PCR Product Purification

Kit (Roche) y se eluyó en un volumen final de 100 µl.

6.2 Ensayos de retardo en gel

Las mezclas de reacción contenían: tampón KST (HEPES 20 mM pH 8,0, KCl

150 mM, ß-mercaptoetanol 2 mM, glicerol 10%, MgCl2 10 mM, PMSF 0,1 mM),

0,1 nM de sonda de DNA (marcada mediante el método descrito en el apartado

anterior), BSA 50 μg/ml y la proteína purificada en este trabajo KstR-His (o

63

Materiales y Métodos

extracto proteico de la cepa E. coli BL21 (DE3) (pET6042) expresando KstR-His)

en un volumen final de 20 μl. Cuando se ensayó la unión DNA-proteína en

presencia de ligando, se añadió colesterol (0,25, 0,5, 1, 2 o 4 mM disuelto en

Triton X-100 al 10%) en un volumen final de 9 µl. Después de incubar las

diferentes mezclas de reacción durante 10 min a 25 ºC, las muestras se analizaron

por electroforesis en gel no desnaturalizante de poliacrilamida al 5%. Los geles se

corrieron en cubetas de electroforesis “Miniprotean II” (Bio-Rad) a 125 V en

tampón TBE (Tris-borato 45 mM pH 8,3 y EDTA 1 mM) a temperatura ambiente.

Los geles se secaron al vacío sobre papel Whatman 3MM y se expusieron en

películas Hyperfilm MP (Amersham Pharmacia Biotech).

6.3 Ensayos de protección frente a la digestión con DNasa I (footprinting)

Para los experimentos de footprinting con DNasa I se amplificó por PCR el

fragmento 5228 FP utilizando 5228 FP R (Tabla 3) como oligonucleótido frío y

5228 FP F (Tabla 3) como oligonucleótido marcado (procedimiento descrito en el

apartado 6.1 de esta sección) para marcar el extremo 5’ de dicho fragmento. Esta

sonda nos permitió realizar experimentos de footprinting con la región promotora

5228. Una vez purificada la sonda se formaron los complejos proteína-DNA

durante 20 min a 25 °C en 15 µl de tampón KST (HEPES 20 mM pH 8, KCl 150

mM, ß-mercaptoetanol 2 mM, glicerol 10%, MgCl2 10 mM, PMSF 0,1 mM) que

contenía: 1nM de la sonda 5228 FP, BSA 500 μg/ml, y distintas diluciones de la

proteína KstR-His purificada o de un extracto proteico de la cepa E. coli BL21

(DE3) (pET6042) expresando KstR-His. Transcurrida la incubación se añadieron 3

µl de solución DNasa I (1µg/ml (Amersham Biosciences)) en Tris-HCl 10 mM pH

7,0, MgCl2 10 mM, CaCl2 10 mM y KCl 125 mM y se incubó a 37 ºC durante 20 s.

La reacción se paró al añadir 180 µl de la solución DNasa STOP (acetato sódico

0,4 M, EDTA 2,5 mM, tRNA 50 µg/ml y 5 µg/ml de DNA de esperma de salmón) y

0,3 µl/ml de glicogen. Las muestras se trataron con fenol/cloroformo/alcohol

isoamílico y posteriormente fueron precipitadas y lavadas con etanol absoluto y

etanol 70%, respectivamente. Las muestras se secaron, se resuspendieron en

tampón de carga (formamida al 98%, EDTA 10 mM pH 8,0 y cantidades traza de

64

Materiales y Métodos

azul de bromofenol y azul de xilencianol) y se desnaturalizaron por incubación a

95 ºC durante varios min. Posteriormente se analizaron en un gel de poliacrilamida

desnaturalizante al 6% (v/v)-urea 8 M. Los geles se secaron al vacío sobre papel

Whatman 3MM y se expusieron en películas Hyperfilm™ MP (Amersham

Pharmacia Biotech). La secuenciación del fragmento 5228 FP se llevó a cabo

mediante el método A+G (Maxam y Gilbert, 1977).

7. Técnicas de RNA

7.1 Extracción de RNA de micobacterias

El RNA para el análisis genómico de expresión diferencial en colesterol de M.

smegmatis mc²155 mediante microarrays, retrotranscripción-PCR y PCR en

tiempo real se extrajo de cultivos de la cepa cultivada en medio mínimo 457 que

contenía colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina, glicerol 18 mM en β-ciclodextrina o

glicerol 0,6 M. El RNA que se utilizó para el análisis genómico de expresión

diferencial del mutante en el regulador transcripcional KstR2 mediante microarrays

se extrajo de cultivos de la cepa salvaje y mutante en medio 7H9 conteniendo

ADC. En ambos casos 15 ml de cultivo en fase logarítmica (DO600 0,5-0,6) se

añadieron a 35 ml de solución de tiocianato de guanidinio (tiocianato de guanidinio

5 M, sarkosyl 0,5%, citrato sódico 25 mM) para interrumpir la transcripción. El

cultivo se centrifugó 20 min a 4000 g a temperatura ambiente y las células se

resuspendieron en 200 µl de agua. Este volumen se transfirió a tubos del Kit

Precellys VK01 (Bertin Technologies) y se añadieron 700 µl de solución RLT

(Qiagen). Las bacterias se lisaron utilizando un MiniBeadBeaterTM (Biospec) o un

Fast-Prep FP129 (Savant) durante 40 segundos a intensidad 6.5 y los extractos

solubles se recuperaron mediante centrifugación durante 5 min a 13000 g a 4 ºC.

Este procedimiento se realizó por duplicado para cada cultivo, usando un total de

30 ml de cada uno. En este punto, los extractos solubles de los duplicados se

recogieron en un mismo tubo y el RNA se purificó utilizando el Rneasy kit (Qiagen)

según las especificaciones del fabricante. El RNA para análisis mediante

microarrays se trató adicionalmente con Dnasa (Qiagen). Finalmente, las muestras

65

Materiales y Métodos

se eluyeron en 30 µl de agua. La cantidad de RNA extraído se midió utilizando un

NanoDrop 1000 (NanoDrop Technologies).

7.2 Retrotranscripción seguida de reacción de PCR (RT-PCR semicuantitativa)

El RNA utilizado para PCR semicuantitativa se trató con el kit Dnase and

Removal treatment (Ambion) según las especificaciones del fabricante. La

obtención del cDNA se llevó a cabo en un volumen de 20 µl de reacción que

contenían 300 ng de RNA purificado, DTT 10 mM, dNTPs 0,5 mM, 200 unidades

de SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen) y 5 mM de hexámeros al

azar como cebadores (pd(N)6 random hexamer 5´phosphate (Amersham

Biosciences)). En primer lugar el RNA y los hexámeros la azar se calentaron a 65

ºC durante 5 min para la hibridación y tras enfriar en hielo se añadieron los

restantes componentes de la reacción y esta se incubó a 42 ºC durante 2 h

seguido de 15 min a 70 ºC. Se emplearon 1,5 µl del cDNA así obtenido como

molde para la PCR posterior. El cDNA se amplificó utilizando los oligonucleótidos

requeridos en cada caso a concentración final 0,5 μM y 1 U de la DNA polimerasa

I de Biotools. En cada una de las reacciones de PCR se incluyó un control con 1,5

µl de la reacción de RT en la que no se empleó la transcriptasa reversa. Con este

control no se debe obtener ninguna banda de amplificación, lo que indicaría que

las preparaciones de RNA no contienen DNA contaminante. El volumen total de

reacción de PCR fue de 50 µl. El número de ciclos de amplificación fue en todos

los casos de entre 27 y 30.

7.3 Retrotranscripción para PCR en tiempo real

El RNA utilizado para PCR en tiempo real se trató de la misma manera que el

RNA utilizado para PCR semicuantitativa (apartado 7.2) pero la retrotranscripción

se llevó a cabo con 1 µg de RNA purificado, y una vez obtenido el cDNA, se

añadieron 7 µl de NaOH 1 M y 7 µl de EDTA 0,5 M, y se incubó 15 min a 65 ºC

para hidrolizar el RNA tras la reacción de retrotranscripción. Para neutralizar se

66

Materiales y Métodos

añadieron 17 µl de HEPES 1 M pH 7,5. El cDNA obtenido fue purificado mediante

el kit Geneclean Turbo (MP Biomedicals) y su concentración se estimó utilizando

un NanoDrop 1000 (Nanodrop Technologies).

7.4 PCR en tiempo real (q-PCR)

Para analizar los niveles de transcripción de diferentes genes se realizaron

experimentos de PCR en tiempo real en un iQ5 Multicolor Real-Time PCR

Detection System (Bio-Rad). Se amplificaron fragmentos de alrededor de 100 pb

de cada uno de los genes de interés. Se utilizaron muestras por triplicado a las

distintas cantidades de 5, 0,5 y 0,05 ng de cDNA total, 0,2 mM final de cada

cebador y 12,5 µl de SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) en 25

µl de volumen. Las parejas de cebadores utilizadas se muestran en la tabla 5. Las

muestras fueron desnaturalizadas a 95 ºC 30 s; la temperatura de fusión fue 60 ºC

30 s y para la elongación y la adquisición de señal se mantuvieron a 72 ºC 30 s.

Se realizaron 40 ciclos. Para la cuantificación relativa de los valores de

fluorescencia se utilizaron diluciones seriadas de DNA genómico de M. smegmatis

mc²155 (entre 4x10-4 y 40 ng). Los datos que se muestran son la media de los

obtenidos al analizar la expresión de los genes en tres cultivos independientes con

tres concentraciones diferentes de cDNA (5, 0,5 y 0,05 ng) y por triplicado. La

obtención y el análisis de los datos se llevó a cabo utilizando el iQ5 Optical System

Software (Versión 2.0) (Bio-Rad).

7.5 Análisis genómico de M. smegmatis bajo diferentes condiciones de cultivo mediante microarrays de RNA

Los microarrays para el análisis de la expresión diferencial del genoma de M.

smegmatis mc²155 fueron facilitados por el Pathogen Functional Genomics

Resource Center de TIGR (http://pfgrc.tigr.org/). Éstos (Mycobacterium smegmatis

versión 4) consisten en 7736 oligonucleótidos diferentes de 70 pb, que

representan el genoma completo de M. smegmatis, impresos en una superficie de

67

Materiales y Métodos

aminosilano. Cada oligonucleótido está impreso 3 veces. Como control negativo

se incluyen 480 oligonucleótidos de 70 pb de Arabidopsis thaliana en cada

microarray.

Para los microarrays para el análisis de expresión diferencial en colesterol, el

cDNA procedente de cultivos crecidos en colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina se

hibridó competitivamente frente al cDNA correspondiente procedente de cultivos

crecidos en glicerol 18 mM en β-ciclodextrina. En los microarrays para el análisis

de expresión diferencial del mutante en el regulador KstR2, el cDNA procedente

de cultivos de este mutante se hibridó competitivamente frente al cDNA de la cepa

salvaje.

En ambos casos el experimento incluyó réplicas técnicas mediante marcaje

reverso (dye-swap). Esta técnica consiste en hibridar dos microarrays con las

mismas muestras biológicas, pero marcadas cada una de ellas con un fluorocromo

distinto en cada uno de ellos (si la muestra A está marcada con el fluorocromo Cy5

y la B con el fluorocromo Cy3 en un microarray, en su réplica técnica se marcará A

con Cy3 y B con Cy5). Mediante esta técnica se elimina el sesgo que se puede

producir por diferencias en la de eficiencia de marcaje de las muestras

dependiente de los fluorocromos.

7.5.1 Síntesis y marcaje del cDNA

Se marcaron 5 µg de RNA de M. smegmatis cultivado en colesterol/ glicerol

(o 5 µg de RNA de M. smegmatis con KstR2 delecionado/cepa salvaje) con el

fluorocromo Cy3-dCTP o Cy5-dCTP (GE Healthcare). En cada caso, 3 µg de

oligonucleótidos al azar (InvitrogenTM Life Technologies) se hibridaron al RNA

mediante una incubación a 95 ºC durante 5 min, seguida de enfriamiento en hielo.

La reacción de marcaje contenía dATP, dGTP y dTTP a una concentración 0,5

mM, dCTP 0,2 mM, DTT 10 mM, 60 µmoles de Cy3-dCTP (o Cy5-dCTP) y 500

unidades de Superscript II (InvitrogenTM Life Technologies) en 25 µl de volumen

final. Las muestras se incubaron en oscuridad a 25 ºC durante 10 minutos y

seguidamente a 42 ºC durante 90 minutos.

68

Materiales y Métodos

Los microarrays se sumergieron en solución de prehibridación (SSC 3,5X,

SDS 0,1%, BSA 10 mg/ml) a 55 ºC durante 20 minutos. Posteriormente se lavaron

en 400 ml de agua durante 1 min y después en 400 ml de propanol durante 1 min.

Finalmente se secaron mediante centrifugación en tubos Falcon de 50 ml a 1500 g

durante 5 minutos y se guardaron en cajas oscuras sin polvo hasta su hibridación

(< 1 h).

7.5.2 Hibridación de los microarrays

Las muestras de cDNA marcadas con Cy3/Cy5 procedentes de cultivos

crecidos en colesterol 1,8 mM se combinaron con las correspondientes muestras

marcadas de cDNA procedentes de cultivos crecidos en glicerol 18 mM (o las

muestras procedentes de cultivos del mutante en KstR2 se combinaron con las

correspondientes muestras procedentes del cultivo de la cepa salvaje) y se

purificaron utilizando el kit MinElute PCR Purification (Qiagen). Las muestras se

eluyeron en 25 µl de agua y la eficiencia del marcaje se midió utilizando un

NanoDrop 1000 (Nanodrop Technologies). 22,5 µl de cada muestra se mezclaron

con 67,5 µl de solución de hibridación (formamida 30%, solución Denhardt 3,75X,

SSC 6X, pirofosfato sódico 0,75 mM, Tris pH 7,4 37,5 mM, SDS 0,075%) y se

desnaturalizaron incubando 2 min a 95 ºC antes de añadirse al microarray. Las

hibridaciones tuvieron lugar en cada microarray bajo tres cubreobjetos LifterSlips

22x22 mm (VWR International) en cámaras de hibridación humidificadas

(Corning) sumergidas en un baño de agua a 55 ºC en oscuridad durante 16-20 h.

Los microarrays se sacaron entonces de las cámaras de hibridación y se lavaron

cuidadosamente en la solución de lavado A (SSC 1X, SDS 0,05%) a 55 ºC para

quitar los cubreobjetos. Después se lavaron secuencialmente en 400 ml de

solución A 2 min a 55 ºC seguido de 2 lavados en 400 ml de solución B (SSC

0,06X) a temperatura ambiente 2 min cada uno. Se secaron mediante

centrifugación en tubos Falcon de 50 ml a 1500 g durante 5 min a temperatura

ambiente y se escanearon utilizando un escáner Affimetrix 428 Array Scanner. Los

archivos de imagen se cuantificaron utilizando el programa TIGR Spotfinder 3.1.1

(Saeed et al., 2003). Para cada condición, el RNA se extrajo de tres cultivos

69

Materiales y Métodos

independientes, y se utilizaron dos microarrays por experimento (réplicas técnicas

mediante marcaje reverso). Los datos se promediaron y normalizaron utilizando el

algoritmo no paramétrico RANK product (Breitling et al., 2004), disponible como el

paquete "RankProd" en Bioconductor (http://www.bioconductor.org) (Hong et al.,

2006). Este método detecta genes que se expresan diferencialmente en un

número de experimentos replicados independientemente de su intensidad

numérica. Los resultados son proporcionados en forma de P-valores definidos

como la probabilidad de que un gen dado se catalogue en la posición observada

por azar. Los genes que estaban inducidos más de 3 veces en colesterol frente a

glicerol y con un valor de P<0,1 fueron seleccionados para posteriores análisis.

Tras la normalización, se disponía de tres valores de P y de número de veces

de inducción para cada marco abierto de lectura (ORF). El valor central de los tres,

que como cabía esperar eran similares, se seleccionó para incluirse en las tablas

que se presentan en este trabajo. La inducción de 12 de los genes fue validada

mediante PCR a tiempo real.

7.6 Técnica de primer extension o extensión con cebador

La técnica de primer extension permitió determinar el sitio de iniciación de la

transcripción de la región promotora P5228. Para ello, se cultivaron células de E.

coli DH10B (pUJ9-5228) a 37 ºC en 25 ml de medio LB. Cuando las células

alcanzaron una DO600 de 0,6, se recogieron 6 ml que se centrifugaron, lavaron y

resuspendieron para proceder a la extracción de su RNA utilizando el Rneasy kit

(Qiagen) según las especificaciones del fabricante. Una vez extraído el RNA, se

procedió al análisis del sitio de inicio de la transcripción mediante la técnica de

extensión por cebador. La extensión se realiza mediante un cebador que hibrida

con el mRNA en una posición más o menos cercana del supuesto sitio de

iniciación de la transcripción. Para la identificación de la posición +1 del promotor

P5228 se empleó el oligonucleótido Lac57 (Tabla 3), que hibrida entre los

nucleótidos 39 y 62 en posición 3’ respecto al residuo de adenina del codón de

inicio de la traducción del gen lacZ.

70

Materiales y Métodos

El oligonucleótido Lac57 fue marcado empleando 7 μl del oligonucleótido

(2,15 μM), 2 μl de tampón T4 polinucleótido kinasa 10x (Biolabs), 10 μl de [γ-

32P]ATP (3.000 Ci/mmol) (Amersham Pharmacia Biotech) y 10 U de T4

polinucleótido kinasa (Biolabs) en un volumen total de 20 μl. Esta mezcla se

incubó a 37 ºC durante 30 min y la reacción se paró añadiendo 0,5 μl de SDS 10%

(p/v) y 0,5 μl de EDTA 0,5 M pH 8,0. La mezcla de reacción se calentó a 65 ºC

durante 10 min y a continuación se añadió tampón TE hasta un volumen final de

100 μl. Finalmente el oligonucleótido marcado fue purificado mediante la utilización

de una columna de Sephadex G-25 previamente equilibrada en tampón TE.

Se tomaron 15 μg de RNA purificado, el oligonucleótido marcado en el paso

anterior (5 x 105 cpm), 10 μl de tampón acetato sódico 3 M pH 5,2 y agua destilada

hasta completar un volumen final de 100 μl. La mezcla resultante fue precipitada y

lavada con etanol absoluto y etanol 70%, respectivamente. Tras secar la muestra

a temperatura ambiente, el precipitado resultante se resuspendió en 30 μl de

tampón de hibridación (PIPES 40 mM pH 6,6, formamida 1 mM, EDTA 1 mM pH 8,

NaCl 0,4 M) y se calentó a 85 ºC durante 10 min. La muestra se incubó durante

toda la noche a 58 ºC. Después de ese tiempo, se añadieron otros 40 μl de

tampón de hibridación y la mezcla resultante fue precipitada con etanol absoluto y

lavada con etanol 70% secándose posteriormente a temperatura ambiente.

El precipitado se resuspendió en 10 μl de una mezcla de reacción compuesta

por 2 μl de tampón 5x de transcriptasa reversa AMV (Promega), 3,6 μl de dNTPs

2,5 mM, 3 U de transcriptasa reversa AMV (Promega) y agua destilada hasta 10

μl. Esta mezcla se incubó 1 h a 42 ºC y después de ese tiempo se detuvo la

reacción añadiendo 2 μl de NaOH 2 N. La muestra se mantuvo a temperatura

ambiente durante una noche y después fue precipitada añadiendo 1,5 μl de

acetato sódico 3 M y 30 μl de etanol absoluto. Finalmente se lavó con etanol 70%

y se secó obteniéndose un sedimento que fue resuspendido en 4 μl de solución

STOP (formamida 0,5% (v/v), EDTA 20 mM; azul de bromofenol 0,05% (p/v) y

xilencianol 0,05% (p/v)). El resultado de la reacción fue analizado por

electroforesis en gel de poliacrilamida 6%-urea 8 M (Sambrook y Russell, 2001),

detectándose los productos de la reacción por autorradiografía en películas

HyperfilmTM-MP (Amersham Pharmacia Biotech) utilizando pantallas

71

Materiales y Métodos

amplificadoras (Cronex Lightning Plus DuPont). La secuenciación del plásmido

pUJ9-5228 se realizó utilizando el oligonucleótido Lac57, como se describe en el

apartado 4.5 de esta sección.

8. Cromatografía líquida/ espectrometría de masas (LC/MS)

La cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC/MS) se

utilizó para analizar la transformación de colesterol en 4-colesten-3-ona en

extractos proteicos o en cultivos de diversas cepas de M. smegmatis en colesterol.

El equipo empleado consistió en un equipo de cromatografía líquida (Surveyor

Plus LC) equipada con inyector automático acoplado a una trampa iónica (LXQ)

equipada con una fuente de ionización química a presión atmosférica (APCI), todo

de Thermo Electron (San Jose, CA, EE. UU.). Los datos se procesaron con el

software Xcalibur (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, EE.UU.).

La separación cromatográfica se realizó en una columna Tracer Excel 120

ODSB C18, (150 mm × 4.6 mm de diámetro interno , 5 μm de tamaño de partícula)

(Teknokroma, Barcelona, Spain). La fase móvil estuvo constituida por

acetonitrilo/agua (90/10, v/v) y acetonitrilo/isopropanol (85/15, v/v) como fases A y

B respectivamente. El flujo empleado fue de 1mL/minuto y el gradiente lineal

utilizado fue el siguiente: 100% A durante 5 min, incrementado a 100% B en 35

min. Tras mantener 100% B durante 7 min se reestablecieron las condiciones

iniciales, reequilibrándose la columna en las mismas durante 8 min. Durante este

gradiente, el eluyente pasó al espectrómetro de masas desde el minuto 2 hasta el

45.

La optimización de los parámetros en el espectrómetro de masas se realizó a

partir de soluciones madre de patrones de colesterol (Sigma) y 4-colesten-3-ona

(Fluka) en ciclodextrina a una concentración inicial de 6,8 mM y 7 mM

respectivamente, inyectados en la trampa iónica mediante infusión directa con una

velocidad de flujo de 5 µL/min. Así, el valor de los distintos parámetros que

permiten una mayor sensibilidad de detección son los siguientes: temperatura del

capilar 275 ºC, temperatura de vaporización 425 ºC, voltaje del capilar 39 V,

voltaje de descarga de la corona 6.00 kV, corriente de la fuente 6.00 µA y 15 eV

72

Materiales y Métodos

para la energía de disociación por colisión. Como gas auxiliar y nebulizador se

utilizó nitrógeno de alta pureza.

El análisis cuantitativo se realizó por el método del patrón interno, a partir de

diluciones de la solución madre de colesterol y 4-colesten-3-ona en agua

destilada, en concentraciones comprendidas entre 34 µM y 1,52 mM para el

colesterol y 0,875 hasta 70 µM para la 4-colesten-3-ona, adicionadas con 50 µL de

5-pregnen-3β-ol-20-ona (patrón interno) en una concentración de 20 mg/mL. La

extracción de analitos se llevó a cabo de la misma manera que en las muestras a

analizar, tal y como se describe en los apartados 5.4.3 y 5.4.4 de esta sección.

Los residuos concentrados de las muestras se resuspendieron en 400 µL de

acetonitrilo (Scharlau) de los que se inyectaron 25 µL para su análisis

cromatográfico.

Las rectas de calibración obtenidas fueron y = 880,751 x + 128999 para el

colesterol y y = 8207,230 x + 22278,6 para la 4-colesten-3-ona, donde x es la

concentración inyectada e y las áreas. Los coeficientes de determinación fueron

de 0,9984 y 0,9999 respectivamente.

La cuantificación se llevó a cabo mediante la fragmentación de los iones

padre del colesterol y la 4-colesten-3-ona (m/z 369.4 and m/z 385.4,

respectivamente) y recogiendo todos los iones fragmentos en full scan, trabajando

en MS2 o MS/MS. El precursor de colesterol, a m/z 369.4, es debido a la

deshidratación de la molécula de colesterol.

La identificación de colesterol y 4-colesten-3-ona en las muestras analizadas

(extractos proteicos o cultivos de diversas cepas de M. smegmatis) se llevó a cabo

por las fragmentaciones específicas de ambos compuestos, obtenidas a partir de

sus standards. En el análisis de las muestras, además de las fragmentaciones de

los iones característicos de colesterol y 4-colesten-3-ona, se recogieron todos los

iones producidos (full scan) en modo positivo desde m/z 100 a m/z 1500.

73

Materiales y Métodos

9. Cromatografía en capa fina (TLC)

La cromatografía en capa fina (TLC) también se utilizó para visualizar la

transformación de colesterol en 4-colesten-3-ona en extractos proteicos o en

cultivos de diversas cepas de M. smegmatis en colesterol.

Los residuos concentrados de las muestras se resuspendieron en 40 µL de

acetato de etilo y se cargaron 5 µL en placas de cromatografía en capa fina de

silica gel (40 x 80 mm Polygram® SIL G/UV254, Macherey-Nagel). Las

cromatografías se llevaron acabo utilizando n-hexano-acetato de etilo (65:35,v/v)

como fase móvil. Los productos esteroideos se visualizaron en luz ultravioleta y/o

mediante tinción con una solución de ácido fosfomolíbdico en etanol (10%, p/v).

Los productos marcados con 14C se localizaron mediante autorradiografía

utilizando un escáner FLA300 (Fuji Photo Film Co., Ltd., Kanagawa, Japan).

10. Análisis de los datos de secuencia

Los análisis de secuencias de DNA y proteínas se realizaron utilizando el

paquete de programas DNASTAR y los programas y bases de datos detallados a

continuación. El análisis y búsqueda de secuencias nucleotídicas y proteicas de M.

smegmatis y M. tuberculosis fue realizado con el servidor Comprehensive

Microbial Resource (CMR) (Craig Venter’s Institute) (http://cmr.jcvi.org/tigr-

scripts/CMR/CmrHomePage.cgi) y el servidor Tuberculist

(http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/). Para la búsqueda de secuencias

nucleotídicas y proteicas de Rhodococcus jostii RHA1 se utilizaron las

herramientas disponibles en el sitio Rhodococus Genome Project (McLeod et al.,

2006; Warren et al., 2004) (http://www.rhodococcus.ca/). Las secuencias de

nucleótidos y las secuencias de aminoácidos fueron comparadas con las

existentes en las bases de datos mediante el uso de los algoritmos BLASTN y

BLASTP, respectivamente (Altschul et al., 1990) a través del servidor del National

Center for Biotechnology Information (NCBI),

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgibin/Entrez/genom_table_cgi), a través del servidor

74

Materiales y Métodos

CMR o el sitio Rhodococus Genome Project. Los alineamientos múltiples de

proteínas se llevaron a cabo con el programa CLUSTALW (Thompson et al., 1994)

alojado en el servidor EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/Tools/). Las masas

moleculares teóricas de las proteínas se calcularon con el programa Compute

pI/Mw del servidor ExPASy (http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html). Las

predicciones de estructura secundaria y tridimensional se realizaron con el

programa LOOPP alojado en el servidor BioHPC

(http://cbsuapps.tc.cornell.edu/loopp.aspx) y la visualización de los distintos

modelos y los análisis posteriores se realizaron con el programa PyMol (DeLano,

2002). La búsqueda de dominios conservados en secuencias proteicas se llevó a

cabo utilizando la base de datos PROSITE alojada en el servidor ExPASy

(http://www.expasy.ch/prosite/).

75

76

Resultados

IV. RESULTADOS

77

Resultados

78

Resultados

IV. RESULTADOS

1. Potencial catabólico de compuestos esteroideos y

caracterización genética in silico y mediante RT-PCR de la ruta de degradación del colesterol en M. smegmatis mc2155

Como una primera aproximación al conocimiento del potencial catabólico de

compuestos esteroideos de M. smegmatis mc2155, se analizó su capacidad de

degradar distintas moléculas esteroideas mediante ensayos de crecimiento.

Posteriormente, el primer gran objetivo de esta tesis doctoral ha sido localizar

regiones del genoma de Mycobacterium smegmatis mc2155 que pudiesen estar

directamente relacionadas con la degradación del colesterol sirviéndonos de

distintos análisis in silico y que posteriormente serían validados mediante RT-PCR.

1.1 Crecimiento de M. smegmatis mc2155 en distintos esteroides

Para estudiar el potencial catabólico para degradar compuestos esteroideos

de M. smegmatis mc2155 se cultivó la cepa en medio mínimo 457 utilizando como

fuente de carbono distintos esteroides. Estos esteroides fueron disueltos en β-

ciclodextrina (apartado 2.2 de Materiales y Métodos). En el caso del ergosterol,

debido a su baja solubilidad, se aumentó la concentración de ciclodextrina

utilizada hasta una concentración final 35 mM en lugar de utilizar 18 mM, como en

el resto de esteroides. La concentración de esteroides utilizada en los cultivos se

ajustó de tal forma que los medios de todos los cultivos contuviesen el mismo

número de átomos de carbono que un medio con colesterol a concentración 1,8

mM y poder así comparar el rendimiento que aportan las distintas fuentes de

carbono. Debido a las propiedades detergentes del desoxicolato este ajuste en el

número de átomos de carbono no se realizó con esta molécula y se utilizó una

concentración menor que permitiese la viabilidad del cultivo. La concentración de

ácido cólico se igualó a la de desoxicolato.

79

Resultados

Los resultados obtenidos a partir de estos ensayos de crecimiento indicaron

que M. smegmatis mc2155 crece hasta DO600 cercanas a 2 tanto en colesterol

como en el primer intermediario de su ruta de degradación, 4-colesten-3-ona,

alcanzando una DO600 de 1,8 para colesterol y 1,5 para la 4-colesten-3-ona (Fig.

13 A). Sin embargo, su crecimiento es bastante inferior en otros esteroides que no

poseen la cadena lateral del colesterol, como la androsterona, AD, ADD,

dehidroandrosterona (Fig. 13 B), β-estradiol, pregnenolona, progesterona y

testosterona (Fig. 13 C), donde se alcanzan DO600 próximas a 0,6. El crecimiento

fue nulo en ácido cólico o desoxicolato a las concentraciones utilizadas de estos

compuestos (0,25 mM, Fig. 13 D), ya que alcanza los mismos valores de DO600

que los cultivos control en β-ciclodextrina (DO600 de 0,3). En ergosterol alcanza

también DO600 próximas a 0,6 (Fig. 13 D), pero necesita para ello un intervalo

mayor de tiempo que para los demás esteroides. Cabe destacar sin embargo que

comparativamente al crecimiento en ciclodextrina 35 mM (concentración utilizada

para el crecimiento con ergosterol) la capacidad de crecimiento en este esteroide

es notable.

80

Resultados

alor

Figura 13. Crecim

iento de M. sm

egó el increm

ento de absorbancia a 600 nm(D

O600 ) de M

. smegm

atism

c²155 cultivado en medio m

ínimo 457 suplem

entado con distintos esteroides solubilizadosen β-ciclodextrina

metilada

al azar. Se siguieron también dos

cultivos con β-ciclodextrinacom

o única fuente de carbono a las dos concentraciones finales que se utilizaron para solubilizarlos distintos esteroides: 18 mM

(para todos ellos excepto el ergosterol) y 35 mM

(para el ergosterol).A.4-colesten-3-ona

y colesterol. B. Androsterona, dehidroandrosterona, AD

y ADD

. Cβ-

estradiol, pregnenolona, progesterona y testosterona. DÁcido cóloico, desoxicolato

(DO

C) y ergosterol.

matis

mc2155 en distintos esteroides.Se v

0,01

0,1 1

0100

200

Tiempo (h)

DO 600

Ciclodextrina 18mM

β-estradiol 2,7mM

Pregnenolona 2,34m

MProgesterona 2,34m

MTestosterona 2,52m

M0,01

0,1 1

0100

200

Tiempo (h)

DO 600

Ac. Cólico 0,25 m

MCiclodextrina 18m

MDO

C 0,25 mM

Ergosterol 1,73 mM

Ciclodextrina 35mM

0,01

0,1 1 10

0100

200

Tiempo (h)

DO 600

Colestenona 1,8 mM

Colesterol 1,8 mM

Ciclodextrina 18mM

0,01

0,1 1

0100

200

Tiempo (h)

DO 600

Androsterona 2,52

mM

AD 2,52 m

M

ADD 2,52 m

M

Ciclodextrina 18mM

Dehidroandrosterona2,52 m

M

AB

CD

0,01

0,1 1

0100

200

Tiempo (h)

DO 600

Ciclodextrina 18mM

β-estradiol 2,7mM

Pregnenolona 2,34m

MProgesterona 2,34m

MTestosterona 2,52m

M0,01

0,1 1

0100

200

Tiempo (h)

DO 600

Ac. Cólico 0,25 m

MCiclodextrina 18m

MDO

C 0,25 mM

Ergosterol 1,73 mM

Ciclodextrina 35mM

0,01

0,1 1 10

0100

200

Tiempo (h)

DO 600

Colestenona 1,8 mM

Colesterol 1,8 mM

Ciclodextrina 18mM

0,01

0,1 1

0100

200

Tiempo (h)

DO 600

Androsterona 2,52

mM

AD 2,52 m

M

ADD 2,52 m

M

Ciclodextrina 18mM

Dehidroandrosterona2,52 m

M

0,01

0,1 1

0100

200

Tiempo (h)

DO 600

Ciclodextrina 18mM

β-estradiol 2,7mM

Pregnenolona 2,34m

MProgesterona 2,34m

MTestosterona 2,52m

M0,01

0,1 1

0100

200

Tiempo (h)

DO 600

Ac. Cólico 0,25 m

MCiclodextrina 18m

MDO

C 0,25 mM

Ergosterol 1,73 mM

Ciclodextrina 35mM

0,01

0,1 1 10

0100

200

Tiempo (h)

DO 600

Colestenona 1,8 mM

Colesterol 1,8 mM

Ciclodextrina 18mM

0,01

0,1 1

0100

200

Tiempo (h)

DO 600

Androsterona 2,52

mM

AD 2,52 m

M

ADD 2,52 m

M

Ciclodextrina 18mM

Dehidroandrosterona2,52 m

M

81

AB

CD

Resultados

1.2. Identificación y caracterización in silico de genes de M. smegmatis y M.

tubeculosis implicados en el metabolismo del colesterol

Como ya se comentó en el apartado de Introducción, la mayoría de los genes

implicados en la degradación de la testosterona (denominados genes tes) se han

caracterizado en la bacteria Gram-negativa Comamonas testosteroni TA441

(Horinouchi et al., 2004b). Dado que la ruta de degradación de la testosterona

confluye con la de degradación del colesterol en el compuesto 4-androsten-3,17

diona (AD), y que al comienzo de esta tesis doctoral no se había descrito ningún

gen de M. smegmatis directamente relacionado con la ruta catabólica del

colesterol, decidimos realizar un análisis in silico del genoma de M. smegmatis

mc²155 utilizando como sondas las secuencias de las enzimas ya descritas para la

degradación de testosterona en C. testosteroni. Utilizando el programa BLASTP a

través del servidor CMR se pudieron localizar diversas proteínas en M. smegmatis

que presentaban similitud con la mayoría de las distintas sondas de C. testosteroni

(Tabla 6). Estas proteínas se encontraban codificadas por genes que forman

agrupaciones génicas (clusters), representadas en la figura 14, lo que sugería una

funcionalidad común de los genes situados dentro de estas regiones.

82

Resultados

Comamonas testosteroni Mycobacterium smegmatis mc²155

Función

Gen

Función

Gen (locus) %

Dominio similar a flavin reductasa

tesA1 Nitrilotriacetato monooxigenasa, componente B

MSMEG_6035 31

Naftociclinona hidroxilasa tesA2 Hidroxilasa de producción de pigmento MSMEG_6038 33 Enzima de meta-apertura tesB 2,3-dihidroxibifenil 1,2-dioxigenasa MSMEG_6036 42 Hidrolasa de plegamiento alfa/beta

tesD Hidrolasa, familia plegamiento alfa/beta

MSMEG_6037 34

Hidratasa/descarboxilasa tesE 2-ceto-4-pentenoato hidratasa MSMEG_5940 39 Acetaldehido deshidrogenasa

tesF Acetaldehido deshidrogenasa MSMEG_5939 55

Deshidrogenasa tesG Oxovalerato aldolasa MSMEG_5937 46 3-oxoesteroide-Δ-1-deshidrogenasa

tesH 3-cetosteroide-delta-1-deshidrogenasa MSMEG_5941 36

3-cetoesteroide-Δ4(5α)-deshidrogenasa

tesI

Coenzima A transferasa ORF1 3-oxoadipato:succinil-CoA transferasa, subunidad A

MSMEG_6002 42

Acil CoA:acetato/3-cetoácido CoA transferasa, subunidad β [metabolismo lipídico]

ORF2 3-oxoadipato:succinil-CoA transferasa, subunidad B

MSMEG_6003 34

Enoil-CoA hidratasa/isomerasa

ORF3

Enoil-ACP reductasa ORF4 Oxidorreductasa, familia 2-nitropropano dioxigenasas

MSMEG_6004 44

Enoil-CoA hidratasa ORF5 Enoil-CoA hidratasa MSMEG_6001 43 ORF17 ORF17 Oxidorreductasa, componente de

transferencia de electrones MSMEG_6039 44

ORF18 ORF18 Substrato--CoA ligasa (fadD3) MSMEG_6013 45 Acil-CoA deshidrogenasa ORF21 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa MSMEG_6014 49 Acil-CoA deshidrogenasa ORF22 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa MSMEG_6015 30 Tiolasa ORF23 Acetil-CoA acetil transferasa MSMEG_6008 60 ORF25, proteina hipotética ORF25 ORF26, proteina hipotética ORF26 Oxidorreductasa ORF27 Oxidorreductasa, familia

deshidrogenasas/reductasas de cadena corta

MSMEG_5999 53

Acil-CoA deshidrogenasa ORF28 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa MSMEG_6016 31 Acil-CoA deshidrogenasa ORF30 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa MSMEG_6012 52 Oxidorreductasa ORF31 Deshidrogenasa de cadena corta MSMEG_6011 62 ORF32, proteina hipotética ORF32 Acil-CoA tiolasa ORF33 acetil-CoA acetil transferasa MSMEG_5996 36 Factor de transcripción tipo LuxR

tesR Supuesta proteína reguladora LuxR MSMEG_6568 22

83

Resultados

Tabla 6. Comparación in silico de sondas de C. testosteroni TA441 frente a M. smegmatis mc2155. Se señala el porcentaje de identidad (%) hallado en cada caso entre las secuencias

proteicas con mayor similitud utilizando el programa ClustalW. Las secuencias de las sondas

utilizadas de C. testosteroni se encuentran depositadas en las bases de datos de secuencias

DDBJ, EMBL y GenBank con los números de acceso AB040808 (tesB, ORF1-3), AB063482 (tes

A1, tesA2, tesD, tesE, tesF y tesG), AB076368 (tesH, tesI, ORF17 y 18) y AB186487 (ORF4, 5, 21-

23, 25-28, 30-33 y tesR).

El análisis in silico también se llevó a cabo con el genoma de M. tuberculosis

H37Rv, ya que aunque hasta recientemente se pensaba que esta bacteria no era

capaz de utilizar el colesterol como única fuente de carbono y energía (Pandey y

Sassetti, 2008), si que se postulaba que el colesterol podía estar implicado en su

supervivencia dentro de los macrófagos (Gatfield y Pieters, 2000). Así se

comprobó que existían igualmente agrupaciones génicas que presentaban una

alta similitud con los genes de C. testosteroni y M. smegmatis (Tabla 7).

84

Resultados

Función

Gen

Función

Gen

%

Dominio similar a flavin reductasa

tesA1 Posible oxidorreductasa Rv3567c 30

Naftociclinona hidroxilasa tesA2 Posible oxidorreductasa Rv3570c 32 Enzima de meta-apertura tesB 2,3-dihidroxibifenil 1,2-dioxigenasa

(DHBD) Rv3568c 42

Hidrolasa de plegamiento α/β

tesD 2-hidroxi-6-oxo-6-fenilhexa-2,4-dienoato hidrolasa

Rv3569c 32

Hidratasa/descarboxilasa tesE 2-hidroxipenta-2,4-dienoato hidratasa Rv3536c 41 Acetaldehido deshidrogenasa

tesF Acetaldehido deshidrogenasa Rv3535c 56

Deshidrogenasa tesG 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa (HOA)

Rv3534c 47

3-oxoesteroide-Δ-1-deshidrogenasa

tesH 3-cetoesteroide 1-deshidrogenasa Rv3537 36

3-cetoesteroide-delta4(5α)-deshidrogenasa

tesI

Coenzima A transferasa ORF1 Posible CoA-Transferasa (subunidad alfa)

Rv3551 41

Acil CoA:acetato/3-cetoácido CoA transferasa, subunidad β [metabolismo lipídico]

ORF2 CoA transferasa, subunidad beta

Rv3552 37

Enoil-CoA hidratasa/isomerasa

ORF3

Enoil-ACP reductasa ORF4 Oxidorreductasa, familia 2-nitropropano dioxigenasas

Rv3553 45

Enoil-CoA hidratasa ORF5 EchA20 (fad) Rv3550 43 ORF17 ORF17 Oxigenasa reductasa KshB (PA5411) Rv3571 43 ORF18 ORF18 Substrato--CoA ligasa (ligasa) Rv3561 47 Acil-CoA deshidrogenasa ORF21 FadE31 (acd) Rv3562 50 Acil-CoA deshidrogenasa ORF22 FadE32 Rv3563 30 Tiolasa ORF23 FadA6_1 (fadA) Rv3556c 60 ORF25, proteina hipotética ORF25 ORF26, proteina hipotética ORF26 Oxidorreductasa ORF27 Oxidorreductasa, familia de

deshidrogenasas/reductasas de cadena corta

Rv3548c 53

Acil-CoA deshidrogenasa ORF28 Probable proteína fadE27 (acd) Rv3564 29 Acil-CoA deshidrogenasa ORF30 FadE30 (acd) Rv3560c 52 Oxidorreductasa ORF31 Oxidorreductasa, familia de

deshidrogenasas/reductasas de cadena corta

Rv3559c 60

ORF32, proteina hipotética ORF32 Acil-CoA tiolasa ORF33 FadA5 (PA1736) Rv3546 35 Factor de transcripción tipo LuxR

tesR Proteína hipotética Rv2488c 12

Comamonas testosteroni Mycobacterium tuberculosis H37Rv

85

Resultados

Tabla 7. Comparación in silico de sondas de C. testosteroni TA441 frente a M. tuberculosis H37Rv. Se señala el porcentaje de identidad (%) hallado en cada caso entre las secuencias

proteicas con mayor similitud utilizando el programa ClustalW. Las secuencias de las sondas

utilizadas de C. testosteroni se encuentran depositadas en las bases de datos de secuencias

DDBJ, EMBL y GenBank con los números de acceso AB040808 (tesB, ORF1- 3), AB063482 (tes

A1, tesA2, tesD, tesE, tesF y tesG), AB076368 (tesH, tesI, ORF17 y 18) y AB186487 (ORF4, 5, 21-

23, 25-28, 30-33 y tesR).

Las únicas sondas de C. testosteroni para las que no se encontraron genes

similares en ninguna de las dos especies de Mycobacterium fueron las

correspondientes al gen tesI y a las ORFs 25, 26 y 32. El producto del gen tesI no

afecta al crecimiento en testosterona en C. testosteroni, pero sí limita la

degradación de androsterona en esta cepa. El gen tesI codifica una 3-

cetoesteroide-Δ4(5α)-deshidrogenasa que cataliza el paso de androstan-3,17

diona a AD (Horinouchi et al., 2003b). La ruta postulada de degradación de

colesterol no alberga esta transformación (Kieslich, 1985; Martin, 1977; Owen et

al., 1983; Schoemer y Martin, 1980; Sedlaczek y Smith, 1988; Szentirmai, 1990).

Este hecho unido al bajo crecimiento que presenta M. smegmatis en androsterona

(ver apartado 1.1 de resultados) apoyarían el hecho de que esta enzima no esté

presente en su genoma. Para las ORFs 25, 26 y 32 todavía no se ha postulado

una posible función en la ruta de degradación de la testosterona u otros esteroides

(Horinouchi et al., 2004b).

Por otra parte, en las dos especies de Mycobacterium se encontraron

proteínas con similitud con tesR, la proteína reguladora del catabolismo de la

testosterona tipo LuxR, pero los porcentajes de identidad fueron bajos (ver tablas

6 y 7). La posición en el genoma de estos posibles genes reguladores, muy

alejada de los genes catabólicos, sugiere que no están relacionados con la

regulación del catabolismo de esteroides.

Curiosamente, los genes similares a las sondas de C. testosteroni se sitúan

de forma diferente en M. smegmatis y M. tuberculosis. En M. tuberculosis se

distribuyen más próximos entre sí en el genoma que en M. smegmatis, donde se

distinguen hasta tres agrupaciones génicas distintas (véase la figura 14). Estas

agrupaciones fueron delimitadas preliminarmente para su posterior análisis

86

Resultados

mediante RT-PCR, y comprenden en M. smegmatis las regiones del genoma

situadas entre:

1. La posición 5996 y la 6003 (en kb), donde se ubican los genes similares a

tesE, tesF, tesG y tesH;

2. La posición 6060 y la 6083, donde se sitúan los genes similares a las

ORFs 1, 2, 4, 5, 18, 17, 21, 22, 23, 27, 28, 30, 31 y 33;

3. La posición 6102 y 6108, que incluye los genes similares a tesA1, tesA2,

tesB, tesD y la ORF17.

En M. tuberculosis todos los genes similares a los genes tes y ORFs de C.

testosteroni se sitúan en una región de tan sólo 46 kb que comprende desde la

posición 3972 a la posición 4018. Dado que de manera común en los organismos

patógenos se produce la pérdida de genes prescindibles a medida que se

incrementa su adaptación al hospedador, estos datos obtenidos en M. tuberculosis

insinúan que se han conservado los genes imprescindibles para la degradación

del colesterol frente a otras regiones situadas entre ellos que se han ido

perdiendo, lo que sugiere la gran importancia que la degradación de esta molécula

tiene para el patógeno.

87

Resultados

5938

tesB

OR

F12

34

521

2223

2526

2728

3031

tesR

3332

tesD

tesA

1te

sEte

sGte

sFO

RF1

8O

RF1

7te

sIte

sHte

sA2

Com

amon

aste

stos

tero

niTA

441

5943

5937

5939

5941

5940

6.00

6

Myc

obac

teriu

msm

egm

atis

mc²

155

5942

5.99

6

5996

5999

6001

6004

6002

6003

6000

6007

6005

6006

6013

6009

6008

6011

6012

5997

5998

6010

5995

5994

6.06

0

6014

6015

6016

6017

6.08

3

6035

6036

6037

6038

6039

6.10

8

6033

6034

6040

6.10

2

Myc

obac

teriu

mtu

berc

ulos

isH

37R

v

3534

c35

3735

3835

3935

36c

3535

c35

40c

3541

c35

42c

3543

c35

44c

3545

c35

4635

4735

5035

5135

5235

5335

48c

3549

c35

56c

3557

c35

60c

3554

3555

c

3558

3561

3559

c35

6235

6335

6535

7135

7235

6435

67c

3568

c35

69c

3566

c35

70c

3573

c

4.01

8

5936

5938

tesB

OR

F12

34

521

2223

2526

2728

3031

tesR

3332

tesD

tesA

1te

sEte

sGte

sFO

RF1

8O

RF1

7te

sIte

sHte

sA2

Com

amon

aste

stos

tero

niTA

441

5943

5937

5939

5941

5940

6.00

6

Myc

obac

teriu

msm

egm

atis

mc²

155

5942

5.99

6

5996

5999

6001

6004

6002

6003

6000

6007

6005

6006

6013

6009

6008

6011

6012

5997

5998

6010

5995

5994

6.06

0

6014

6015

6016

6017

6.08

3

6035

6036

6037

6038

6039

6.10

8

6033

6034

6040

6.10

2

Myc

obac

teriu

mtu

berc

ulos

isH

37R

v

3534

c35

3735

3835

3935

36c

3535

c35

40c

3541

c35

42c

3543

c35

44c

3545

c35

4635

4735

5035

5135

5235

5335

48c

3549

c35

56c

3557

c35

60c

3554

3555

c

3558

3561

3559

c35

6235

6335

6535

7135

7235

6435

67c

3568

c35

69c

3566

c35

70c

3573

c

4.01

8

5936

Figu

ra14

88

Resultados

Figura 14. Representación esquemática de zonas relacionadas con la ruta baja de degradación del colesterol en C. testosteroni TA441, M. smegmatis mc2155 y M. tuberculosis H37Rv. En esta figura se representa esquemáticamente en primer lugar los genes de C.

testosteroni cuya participación en la degradación de la testosterona está estudiada o en proceso de

estudio (genes tes, mostrados como flechas coloreadas) y los marcos abiertos de lectura (ORFs)

de los que se postula su participación en este catabolismo (Genes numerados según la ORF que

representan. Se muestran como flechas blancas con el borde coloreado). La representación de

estos genes se ha adaptado de la propuesta por Horinouchi et al (2004). No se especifica su

posición en el genoma ya que C. testosteroni TA441 no está completamente secuenciada. A

continuación, se representan los genes de M. smegmatis mc2155 con elevada similitud con los de

C. testosteroni hallados mediante análisis in silico, así como algunos de los genes circundantes a

estos. Se han coloreado de manera idéntica al gen al que se asemejan de C. testosteroni, y el

número que los representa es su denominación en la base de datos Comprehensive Microbial

Resource (CMR). Por ejemplo, el gen representado como 5936 es el gen denominado

MSMEG_5936 en CMR. Por último, se representan los genes de M. tuberculosis H37Rv similares a

los de C. testosteroni. El número que incluye cada gen es su denominación. Por ejemplo, 3534c

representa el gen Rv3534c. Tanto en este caso como en el de M. smegmatis mc²155, los números

que aparecen sobre las líneas en diagonal indican las posiciones del genoma, en kb, entre las que

se encuentran las distintas agrupaciones génicas.

1.3. Validación de los genes identificados in silico mediante análisis de su expresión por RT-PCR

A partir de los análisis in silico realizados sobre el genoma de M. smegmatis

mc²155, se llevaron a cabo ensayos de RT-PCR para averiguar si los genes

identificados como responsables del catabolismo del colesterol se expresan

específicamente cuando la bacteria crece con colesterol como única fuente de

carbono y energía. Así mismo, se analizaron los genes circundantes a éstos que

probablemente podrían estar también relacionados con el catabolismo de

esteroides, lo que al mismo tiempo servía para delimitar con mayor precisión en el

genoma las regiones implicadas en el catabolismo del colesterol. Los ensayos de

RT-PCR se realizaron a partir de cultivos de M. smegmatis mc²155 cultivado en

colesterol 2 mM o glicerol 0,6 M, tal y como se expone en el apartado 7.1 de

Materiales y Métodos.

89

Resultados

Los resultados de las RT-PCR se muestran en las figuras 15. A, B y C junto

con la representación esquemática de los genes analizados y como cabía esperar

se observó que muchos de estos genes efectivamente se expresan cuando la

bacteria crece con colesterol como única fuente de carbono pero no cuando crece

en glicerol (véase tabla 8. A).

Por otra parte, algunos de los genes que no presentaron expresión diferencial

en colesterol como MSMEG_5994, MSMEG_6004, MSMEG_6007,

MSMEG_6014, MSMEG_6016 (Véase Tabla 8. B) parece que están formando

operones con genes que sí presentan inducción en colesterol. Esto sugiere que

los resultados negativos obtenidos mediante la técnica de RT-PCR hay que

tomarlos siempre como posibles falsos negativos, ya que podrían ser debidos a un

problema de ajuste de las condiciones de amplificación o a otros problemas

relacionados con la estabilidad de los mensajeros y necesitan ser comprobados

mediante otras técnicas de estudio cuantitativas. Como se verá en otros apartados

de resultados, la inducción con colesterol de algunos de estos genes se hizo

efectivamente evidente utilizando otros métodos de análisis.

90

Resultados

59965997

59985995

5994 [18][124]

[2][7]

6.060

1 2

3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

2 3 4 5 1

59385943

59375939

59415940

6.0035.995

(4)[38]

[73][1]

5936[86]

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5

59965997

59985995

5994 [18][124]

[2][7]

6.060

1 2 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 2 3 4 5

31

59385943

59375939

59415.995

(4)[38]

[73][1]

59406.003

5936[86]

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5

Figura 15 A

91

Resultados

92

5999

6001

6004

6002

6003

6000

6005

6006

[15]

[61]

(4)

(4)

(4)

[43]

(4)

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

6007

6013

6009

6008

6011

6012

6010

6014

6015

6016

6017

6.08

3[8

8](8

)[3

14]

[125

](4

)[1

05]

(1)

(4)

(4)

[17]

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

5999

6001

6004

6002

6003

6000

6005

6006

[15]

[61]

(4)

(4)

(4)

[43]

(4)

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

6007

6013

6009

6008

6011

6012

6010

6014

6015

6016

6017

6.08

3[8

8](8

)[3

14]

[125

](4

)[1

05]

(1)

(4)

(4)

[17]

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

1 2

3

4

5

Figu

ra 1

5 B

Resultados

60356036

60376038

60396.108

603360346040

6.102(133)

[142][7]

[2](0)

[159][42]

1 2 3 4 5 1 2

3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

60356036

60336037

60386039

6.1086034

60406.102

(133)[142]

[7][2]

(0)[159]

[42]

1 2 3 4 5 1 2

3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Figura 15 C

Figura 15. Resultados de los

ayos de inducción en colesterol de los genes de Mycobacterium

smegm

atism

c²155 similares

a las

sondasde C

. testosteroniy agunos

genes circudantesm

ediante RT-PC

R. Se m

uestran los productos de las RT-P

CR

cargados en geles

de agarosa 1,5% y el esquem

genes a los que corresponden. A.Se muestran los genes 5936-5943 y 5994-5998. B

. Se muestran los

genes 5999-6017. C.Se m

uesan los genes 6033-6040. En todos los casos se cargaron cinco m

uestras, señaladas con números : 1.

Amplificación del cD

NA proc

de cultivo en colesterol 1,8 mM

. 2. Amplificación del R

NA procedente del cultivo en colesterol (control de

DN

A contaminante). 3. Am

plifición del cD

NA procedente del cultivo en glicerol 0,6 M

. 4. Amplificación del R

NA procedente del cultivo en

glicerol (control de DN

A containante). 5. Am

plificación de DN

A (control positivo). Se han señalado con un círculo rojo aquellas muestras de

cDN

Aque presentaron am

plifición. Los núm

eros que se muestran por encim

a de los genes señalan el número de pares de bases entre los

genes adyacentes. Los númer

entre corchetes indican separación y los números entre paréntesis solapam

iento.

ens

l

a de los

tr

edente

ac

mac

os

93

Resultados

8.B

orf17MSMEG_6039

tesA2MSMEG_6038

tesDMSMEG_6037

tesBMSMEG_6036

tesA1MSMEG_6035

orf21MSMEG_6014

orf30MSMEG_6012

orf31MSMEG_6011

MSMEG_6010

MSMEG_6009

orf23MSMEG_6008

orf2MSMEG_6003

orf1MSMEG_6002

orf5MSMEG_6001

MSMEG_6000

orf27MSMEG_5999

MSMEG_5998

MSMEG_5997

orf33MSMEG_5996

MSMEG_5995

MSMEG_5943

tesHMSMEG_5941

tesEMSMEG_5940

tesFMSMEG_5939

tesGMSMEG_5937

Gen similar en C. testosteroni

TA441

Genes de M. smegmatis mc2155

con expresióndiferencial en

colesterol mediante RT-PCR

semicuantitativa

orf17MSMEG_6039

tesA2MSMEG_6038

tesDMSMEG_6037

tesBMSMEG_6036

tesA1MSMEG_6035

orf21MSMEG_6014

orf30MSMEG_6012

orf31MSMEG_6011

MSMEG_6010

MSMEG_6009

orf23MSMEG_6008

orf2MSMEG_6003

orf1MSMEG_6002

orf5MSMEG_6001

MSMEG_6000

orf27MSMEG_5999

MSMEG_5998

MSMEG_5997

orf33MSMEG_5996

MSMEG_5995

MSMEG_5943

tesHMSMEG_5941

tesEMSMEG_5940

tesFMSMEG_5939

tesGMSMEG_5937

Gen similar en C. testosteroni

TA441

Genes de M. smegmatis mc2155

con expresióndiferencial en

colesterol mediante RT-PCR

semicuantitativa

MSMEG_6040

MSMEG_6034

MSMEG_6033

MSMEG_6017

orf22MSMEG_6015

orf18MSMEG_6013

MSMEG_6007

orf33MSMEG_6006

MSMEG_6005

orf4MSMEG_6004

MSMEG_5994

MSMEG_5938

MSMEG_5936

Gen similar en C. testosteroni

TA441

Genes de M. smegmatis mc2155 que

no presentaron expresión diferencial

en colesterol mediante RT-PCR

semicuantitativa

MSMEG_6040

MSMEG_6034

MSMEG_6033

MSMEG_6017

orf22MSMEG_6015

orf18MSMEG_6013

MSMEG_6007

orf33MSMEG_6006

MSMEG_6005

orf4MSMEG_6004

MSMEG_5994

MSMEG_5938

MSMEG_5936

Gen similar en C. testosteroni

TA441

Genes de M. smegmatis mc2155 que

no presentaron expresión diferencial

en colesterol mediante RT-PCR

semicuantitativa

8.A

Tabla 8. Resumen de los genes con (A) y sin (B) expresión diferencial en colesterol mediante los ensayos de RT-PCR.

94

Resultados

1.4 Búsqueda de un indicador genético de degradación de esteroides en bacterias

Dada la conservación de genes ortólogos a los genes tes de Comamonas

testosteroni dentro de las principales bacterias degradadoras de esteroides

conocidas, muchas de ellas actiomicetos, nos propusimos investigar si estos

genes eran específicos de microorganismos catabolizadores de compuestos con

dicha estructura, pudiendo servir así como “indicador genético” de

microorganismos degradadores de esteroides. Para ello se llevaron a cabo

comparaciones de las secuencias de tres proteínas codificadas por los genes tes:

TesA2, TesB y TesH mediante el programa BLASTP, contra la base de datos de

secuencias de proteínas no redundantes (nr) y se seleccionaron aquellos

microorganismos que presentaban proteínas similares a estas tres (las tres

inclusive) dentro de las 100 primeras secuencias con homología. El porcentaje de

identidad que presentan las proteínas seleccionadas con las respectivas de C.

testosteroni es de 30% o mayor (cuantificado por ClustalW). Se escogieron estas

tres proteínas porque el conjunto de microorganismos que poseen ortólogas a las

mismas el bastante homogéneo. Otras como por ejemplo TesA1, componente de

la monooxigenasa TesA1TesA2, tiene similitud con componentes flavín reductasa

de proteínas pertenecientes a un mayor rango de microorganismos, para algunos

de los cuales el crecimiento en esteroides no ha sido constatado, como varias

especies pertenecientes al género Pseudomonas. Los resultados de este análisis

se muestran en la tabla 9 e incluyen β-proteobacterias como C. testosteroni y

distintas especies del género Burkholderia, ambas especies conocidos

degradadores de compuestos esteroideos y aromáticos, respectivamente

(Horinouchi et al., 2003b; Krumme et al., 1993). También aparecen otras β-

proteobacterias como Cupriavidus taiwanensis, un fijador de nitrógeno metal-

resistente simbionte de leguminosas (Amadou et al., 2008) y Ralstonia eutropha,

degradadora de compuestos aromáticos clorados (Trefault et al., 2004).

Como cabía esperar, la mayoría de bacterias que aparecen en esta

búsqueda pertenecen al grupo de los actinomicetos, conocidos degradadores de

esteroides. Nos encontramos así con numerosas especies de bacterias del género

95

Resultados

Mycobacterium, tanto patógenas como saprófitas. Cabe destacar la ausencia de

M. leprae, que un análisis más detallado ha confirmado que no posee genes

ortólogos a los relacionados con la degradación de colesterol. Hay representantes

de otros géneros como Gordonia, Rhodococcus, Nocardia, Nocardioides,

Streptomyces y otros menos conocidos como los actinomicetos marinos

Salinispora arenicola y S. tropica (Maldonado et al., 2005), el termófilo

Thermomonospora curvata (Stutzenberger, 1971) y Tsukamurella paurometabola

(Collins et al., 1988).

Fuera de las β-proteobacterias y los actinomicetos nos encontramos con

algunos representantes de otros grupos de bacterias, así por ejemplo presentan

proteínas similares a las Tes dos α-proteobacterias: Novosphingobium

aromaticivorans, degradadora de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) que

porta un plásmido catabólico que incluye genes responsables de la degradación

de bifenilo, m-xileno o p-cresol, entre otros compuestos (Romine et al., 1999) y

Sphingomonas wittichii, degradadora de dioxinas y herbicidas difenil éter (Keum et

al., 2008).

Por último, aparecen representantes del grupo de las γ-proteobacterias, todos

ellos de origen marino: Shewanella halifaxensis, un psicrófilo desnitrificante

degradador del compuesto explosivo hexahidro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina (RDX)

(Zhao et al., 2006), el mesófilo Shewanella pealeana (Leonardo et al., 1999), la

bacteria antártica Pseudoalteromonas haloplanktis, degradadora de compuestos

aromáticos dioxigenados como los catecoles (Papa et al., 2009) y otras dos γ-

proteobacterias marinas mesófilas todavía sin clasificar: HTCC2080 y HTCC2148.

Aunque no se ha descrito todavía la posible capacidad de degradación de

esteroides para las bacterias de los grupos α y γ encontradas en esta búsqueda,

nos aventuramos a decir que muy probablemente la poseen, y el hecho de que un

microorganismo posea tres genes ortólogos a tesA2, tesB y tesH puede ser un

“marcador genético” de su potencial catabólico de compuestos esteroideos. No

obstante, para definir la utilidad real de este análisis habrá que demostrar que

alguna de las bacterias detectadas crece en colesterol. Por otra parte es necesario

aclarar que el hecho de que un organismo no presente estas proteínas no

descarta su implicación en estas rutas de degradación, como le sucede por

96

Resultados

ejemplo al anaerobio facultativo Sterolibacterium denitrificans (Chiang et al.,

2008b).

Uncultured marine bacterium 442Mycobacterium sp. MCSTsukamurella paurometabola DSM 20162Mycobacterium sp. JLSThermomonospora curvata DSM 43183Mycobacterium smegmatis str. mc²155Streptomyces sp. AA4Mycobacterium kansasii ATCC 12478Sphingomonas wittichii RW1Mycobacterium intracellulare ATCC 13950Shewanella pealeana ATCC 700345Mycobacterium gilvum PYR-GCKShewanella halifaxensis HAW-EB4Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10Salinispora tropica CNB-440Mycobacterium avium subsp. avium ATCC 25291Salinispora arenicola CNS-205Mycobacterium avium 104Rhodococcus opacus B4Mycobacterium abscessus ATCC 19977Rhodococcus jostii RHA1marine gamma proteobacterium HTCC2148Rhodococcus erythropolismarine gamma proteobacterium HTCC2080Ralstonia eutrophaGordonia bronchialis DSM 43247]Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125Cupriavidus taiwanensisNovosphingobium aromaticivorans DSM 12444Comamonas testosteroni KF-1Nocardioides sp. JS614Comamonas testosteroni CNB-2Nocardia farcinica IFM 10152Burkholderia sp. H160Mycobacterium vanbaalenii PYR-1Burkholderia sp. 383Mycobacterium ulcerans Agy99Burkholderia cenocepacia J2315Mycobacterium tuberculosis H37RvBurkholderia ambifaria IOP40-10

Uncultured marine bacterium 442Mycobacterium sp. MCSTsukamurella paurometabola DSM 20162Mycobacterium sp. JLSThermomonospora curvata DSM 43183Mycobacterium smegmatis str. mc²155Streptomyces sp. AA4Mycobacterium kansasii ATCC 12478Sphingomonas wittichii RW1Mycobacterium intracellulare ATCC 13950Shewanella pealeana ATCC 700345Mycobacterium gilvum PYR-GCKShewanella halifaxensis HAW-EB4Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10Salinispora tropica CNB-440Mycobacterium avium subsp. avium ATCC 25291Salinispora arenicola CNS-205Mycobacterium avium 104Rhodococcus opacus B4Mycobacterium abscessus ATCC 19977Rhodococcus jostii RHA1marine gamma proteobacterium HTCC2148Rhodococcus erythropolismarine gamma proteobacterium HTCC2080Ralstonia eutrophaGordonia bronchialis DSM 43247]Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125Cupriavidus taiwanensisNovosphingobium aromaticivorans DSM 12444Comamonas testosteroni KF-1Nocardioides sp. JS614Comamonas testosteroni CNB-2Nocardia farcinica IFM 10152Burkholderia sp. H160Mycobacterium vanbaalenii PYR-1Burkholderia sp. 383Mycobacterium ulcerans Agy99Burkholderia cenocepacia J2315Mycobacterium tuberculosis H37RvBurkholderia ambifaria IOP40-10

Tabla 9. Microorganismos que presentan proteínas similares a TesA2, TesB y TesH utilizando el programa BlastP. Se escogieron todas las especies dentro de las 100 primeras que

contienen proteínas con similitud (identidad ≥30%) con las tres de C. testosteroni (TesA2, TesB y

TesH), las tres inclusive. Se señalan en naranja las bacterias del grupo de los actinomicetos, en

amarillo las α-proteobacterias, en azul las β-proteobacterias y en verde las γ-proteobacterias. La

prevalencia de actinomicetos es apreciable.

2. Estudio de enzimas que catalizan la transformación de colesterol en 4-colesten-3-ona

Como ya se ha comentado en la introducción, el primer paso de la ruta de

degradación del colesterol es, según las rutas postuladas hasta el momento, la

oxidación de colesterol a 5-colesten-3-ona (Figura 5 Introducción (2)) seguida de

su isomerización a 4-colesten-3-ona (Figura 5 Introducción (3)). En primer lugar

para dilucidar esta ruta catalítica en M. smegmatis, nos propusimos identificar

genes que por similitud de secuencia fueran claros candidatos para ser los

97

Resultados

responsables de esta transformación. Los productos de estos genes se

sometieron posteriormente a ensayos de actividad y a mutagénesis para confirmar

su posible función. Además la inducción de su expresión en presencia de

colesterol se estudió mediante RT-PCR a tiempo real.

2. 1 Análisis in silico de genes que codifican actividad colesterol oxidasa o deshidrogenasa

Mediante comparaciones in silico utilizando como sondas las secuencias de

dos proteínas diferentes responsables ambas de catalizar el paso de colesterol a

4-colesten-3-ona en otros microorganismos, se identificaron en el genoma de M.

smegmatis mc2155 dos genes que podrían codificar la actividad catalítica

buscada. A continuación se expone de manera detallada la determinación de los

mismos.

2.1.1 MSMEG_1604

La primera secuencia proteica que se comparó frente al genoma de M.

smegmatis fue la correspondiente a la colesterol oxidasa de M. tuberculosis

H37Rv, codificada por el gen Rv3409c y denominada ChoD, como nombre

genérico de las colesterol oxidasas de micobacterias patógenas y de

Streptomyces coelicolor (Navas et al., 2001). La hiperproducción de ChoD en M.

tuberculosis produce la acumulación temporal de 4-colesten-3-ona, y su

mutagénesis disminuye la virulencia de este patógeno (Brzostek et al., 2007), pero

su implicación directa en la ruta de degradación de colesterol todavía no ha sido

constatada.

En primer lugar se hizo una comparación de ChoD frente a la totalidad de las

secuencias proteicas de las bases de datos utilizando el programa BLASTP. Como

puede verse en la tabla 10, se conservan proteínas muy similares a ChoD en las

especies del género Mycobacterium, tanto en las de crecimiento lento (todas ellas

98

Resultados

patógenas) (M. ulcerans, M. kansasii, M. intracellulare, M. avium, M. leprae) como

en las de crecimiento rápido (M. vanbaalenii, M. smegmatis, M. gilvum, M. sp JLS,

M. sp MCS, M. abscessus), (no patógenas, excepto M. abscessus, que es

oportunista). ChoD es así mismo muy similar a las colesterol oxidasas de otros

actinomicetos como algunas de los géneros Rhodococcus o Nocardia; la mayoría

son saprófitos de vida libre aunque algunos de ellos pueden actuar como

patógenos oportunistas en pacientes inmunocomprometidos, como por ejemplo

Nocardia farcinica (Ishikawa et al., 2004) o Gordonia bronchialis (Richet et al.,

1991).

66

Colesterol oxidasa[Saccharopolyspora erythraea NRRL 2338]YP_001108796.1

83Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium vanbaalenii PYR-1]YP_952352.1

69Flavoproteína Colina deshidrogenasa-like[Saccharomonospora viridis DSM

43017]YP_003132378.1

88Posible colesterol oxidasa[Mycobacterium leprae TN]NP_301379.1

70Posible colesterol oxidasa[Nocardia farcinica IFM 10152]

YP_118824.187

ChoD[Mycobacterium leprae]AAC43233.1

68Posible oxidorreductasa[Rhodococcus opacus B4]YP_002783453.1

88Posible colesterol oxidasa[Mycobacterium leprae Br4923]YP_002503010.1

68Colesterol oxidasa[Rhodococcus jostii RHA1]

YP_706136.1 87

Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium avium subsp. AviumATCC 25291]ZP_05218299.1

70Colesterol oxidasa[Rhodococcus erythropolis SK121]

ZP_04383195.187

Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium avium 104]YP_883489.1

71Proteína hipotética RER_19350[Rhodococcus erythropolis PR4]YP_002765382.1

88Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium intracellulare ATCC13950]ZP_05226006.1

78Posible colesterol oxidasa ChoD[Mycobacterium abscessus ATCC19977]YP_001704447.1

90Precursor de colesterol oxidasa ChoD[Mycobacterium kansasii ATCC12478]ZP_04746501.1

79Oxidorreductasa FAD dependiente[Mycobacterium sp. MCS]YP_638338.1

90Precursor de colesterol oxidasa ChoD[Mycobacterium ulcerans Agy99]YP_905003.1

% ID conRv3409c(ChoD)

ClustalW

Proteína/microorganismo

% ID con Rv3409c (ChoD)

ClustalW

Proteína /microorganismo

66Colesterol oxidasa[Saccharopolyspora erythraea NRRL 2338]YP_001108796.1

83Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium vanbaalenii PYR-1]YP_952352.1

69Flavoproteína Colina deshidrogenasa-like[Saccharomonospora viridis DSM

43017]YP_003132378.1

88Posible colesterol oxidasa[Mycobacterium leprae TN]NP_301379.1

70Posible colesterol oxidasa[Nocardia farcinica IFM 10152]

YP_118824.187

ChoD[Mycobacterium leprae]AAC43233.1

68Posible oxidorreductasa[Rhodococcus opacus B4]YP_002783453.1

88Posible colesterol oxidasa[Mycobacterium leprae Br4923]YP_002503010.1

68Colesterol oxidasa[Rhodococcus jostii RHA1]

YP_706136.1 87

Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium avium subsp. AviumATCC 25291]ZP_05218299.1

70Colesterol oxidasa[Rhodococcus erythropolis SK121]

ZP_04383195.187

Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium avium 104]YP_883489.1

71Proteína hipotética RER_19350[Rhodococcus erythropolis PR4]YP_002765382.1

88Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium intracellulare ATCC13950]ZP_05226006.1

78Posible colesterol oxidasa ChoD[Mycobacterium abscessus ATCC19977]YP_001704447.1

90Precursor de colesterol oxidasa ChoD[Mycobacterium kansasii ATCC12478]ZP_04746501.1

79Oxidorreductasa FAD dependiente[Mycobacterium sp. MCS]YP_638338.1

90Precursor de colesterol oxidasa ChoD[Mycobacterium ulcerans Agy99]YP_905003.1

% ID conRv3409c(ChoD)

ClustalW

Proteína/microorganismo

% ID con Rv3409c (ChoD)

ClustalW

Proteína /microorganismo

99

Resultados

62Flavoproteína colina deshidrogenasa[Kribbella flavida DSM 17836]ZP_03859915.1

80Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium sp. JLS]YP_001069491.1

65Oxidorreductasa FAD dependiente[Gordonia bronchialis DSM 43247]YP_003272883.1

81Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium gilvum PYR-GCK]YP_001136160.1

65Colesterol oxidasa[Streptomyces sp. AA4]ZP_05476910.1

83Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium smegmatis mc2155]YP_885983.1

62Flavoproteína colina deshidrogenasa[Kribbella flavida DSM 17836]ZP_03859915.1

80Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium sp. JLS]YP_001069491.1

65Oxidorreductasa FAD dependiente[Gordonia bronchialis DSM 43247]YP_003272883.1

81Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium gilvum PYR-GCK]YP_001136160.1

65Colesterol oxidasa[Streptomyces sp. AA4]ZP_05476910.1

83Oxidorredictasa FAD dependiente[Mycobacterium smegmatis mc2155]YP_885983.1

Tabla 10. Resultados de la comparación de ChoD de M. tuberculosis H37Rv frente a las bases de datos de secuencias proteicas utilizando el programa BLASTP. Se muestran las 24

proteínas más similares, el microorganismo al que pertenecen, su código de acceso y su similitud

con ChoD indicada en porcentaje de identidad hallado con ClustalW. La proteína producto del gen

MSMEG_1604 de M. smegmatis mc2155 se ha señalado en color azul.

Centrándonos en el genoma de M. smegmatis, la proteína más similar a

Rv3409c (y la novena en una comparación frente al total de secuencias proteicas)

es la oxidorreductasa FAD-dependiente codificada por el gen MSMEG_1604 (1737

pb), con la que comparte un 83% de identidad (cuantificado por ClustalW, tabla

10). La siguiente secuencia proteica más similar a ChoD en el genoma de M.

smegmatis sería la correspondiente a la glucosa-metanol-colina oxidorreductasa

codificada por el gen MSMEG_5967, que sólo presenta una identidad del 17%

(cuantificado por ClustalW) con ChoD, (e igualmente un 17% con MSMEG_1604)

con lo que se puede concluir que ChoD no tiene más ortólogos en mc2155 que

MSMEG_1604. Tanto ChoD como el producto del gen MSMEG_1604 (al que a partir de

ahora nos referiremos como ChoDMS) presentan características propias de las

proteínas FAD-dependientes. Así, presentan un motivo Gly-X-Gly-(X)2-Gly-(X)10-

Gly (donde X representa cualquier aminoácido) en la región N-terminal, que es

común a proteinas de unión a FAD y NAD (Vrielink et al., 1991), como se verá más

adelante. Con respecto al sitio activo, se ha visto que las colesterol oxidasas de

Brevibacterium sterolicum y Streptomyces así como otras oxidorreductasas tienen

en su centro activo 3 residuos hidrofílicos conservados que actúan como bases

catalíticas: His447, Glu361 y Asn485 (Vrielink et al., 1991; Yue et al., 1999). ChoD

y ChoDMS también presentan estos residuos en posiciones cercanas a las

descritas (Fig. 16).

100

Resultados

MSMEG_1604 MKPDYDVLVIGSGFGGSVSALRLTEKGYRVGVLEAGRRFSDEEFAKTSWQLRKFLWAPKL 60 NT02MT3722 MKPDYDVLIIGSGFGGSVTALRLTEKGYRVGVLEAGRRFSDEEFAKTSWDLRKFLWAPRL 60 ********:*********:******************************:********:* MSMEG_1604 GCYGIQRIHLLRNVMILAGAGVGGGSLNYANTLYVPPEPFFADRQWAGITDWRAELTPHY 120 NT02MT3722 GCYGIQRIHPLRNVMILAGAGVGGGSLNYANTLYVPPEPFFADQQWSHITDWRGELMPHY 120 ********* *********************************:**: *****.** *** MSMEG_1604 DQAQRMLGVVTNPTFTDADRVVKEVADDMGVGDTFVQTPVGVFFGPDGEKTPGKTVPDPY 180 NT02MT3722 QQAQRMLGVVQNPTFTDADRIVKEVADEMGFGDTWVPTPVGVFFGPDGTKTPGKTVPDPY 180 :********* *********:******:**.***:* *********** *********** MSMEG_1604 FGGVGPDRTGCIECGSCMTGCRYGAKNTLLKNYLGLAERGGAEVHPLRTVAGFEQLPDGT 240 NT02MT3722 FGGAGPARTGCLECGCCMTGCRHGAKNTLVKNYLGLAESAGAQVIPMTTVKGFERRSDGL 240 ***.** ****:***.******:******:******** .**:* *: ** ***: .** MSMEG_1604 WRVDTVRTGRWARKDKRSFTATHVVLAAGTWGTQRLLFKMRDTGKLPKLSSRLGVLTRTN 300 NT02MT3722 WEVRTVRTGSWLRRDRRTFTATQLVLAAGTWGTQHLLFKMRDRGRLPGLSKRLGVLTRTN 300 *.* ***** * *:*:*:****::**********:******* *:** **.********* MSMEG_1604 SESIVGAGRYEVTPDLDLTHGVAITSSIHPTPDTHIEPVRYGKGSNAMGLLQTLMTDGDG 360 NT02MT3722 SESIVGAATLKVNPDLDLTHGVAITSSIHPTADTHIEPVRYGKGSNAMGLLQTLMTDGSG 360 *******. :*.******************.**************************.* MSMEG_1604 PDGAGIPRWKQLLRNAAEDPRGTLRLLNVHRWSERTLIALVMQHLDNSITTYTKRNRLGI 420 NT02MT3722 PQGTDVPRWRQLLQTASQDPRGTIRMLNPRQWSERTVIALVMQHLDNSITTFTKRGKLGI 420 *:*:.:***:***:.*::*****:*:** ::*****:**************:***.:*** MSMEG_1604 RRYLSKQGHGAPNPTWIPVGNEVTRRIAKKIDGVAGGTWGELFNIPLTAHFLGGAAIGDS 480 NT02MT3722 RWYSSKQGHGEPNPTWIPIGNQVTRRIAAKIDGVAGGTWGELFNIPLTAHFLGGAVIGDD 480 * * ****** *******:**:****** **************************.***. MSMEG_1604 PETGVIDPYQRVYNYPTLHVMDGAAISANLGVNPSLSITAQAERATSLWPNKGEQDQRPA 540 NT02MT3722 PEHGVIDPYHRVYGYPTLYVVDGAAISANLGVNPSLSIAAQAERAASLWPNKGETDRRPP 540 ** ******:***.****:*:*****************:******:******** *:**. MSMEG_1604 QGEPYRRLAPIAPVRPVVPADAPGALRRLPIEPVSSAG 578 NT02MT3722 QGEPYRRLAPIQPAHPVVPADAPGALRWLPIDPVSNAG 578 *********** *.:************ ***:***.** Figura 16. Alineamiento del producto del gen MSMEG_1604 (ChoDMS) y ChoD de M. tuberculosis H37Rv y supuestos motivos consenso hallados en las secuencias. Los residuos

marcados en amarillo estarían implicados en la unión de la coenzima FAD y los residuos marcados

en rojo formarían parte del centro activo.

Para apoyar estos datos, se llevó a cabo la predicción de la estructura

secundaria y la estructura tridimensional de ChoDMS utilizando para ello el

programa LOOPP, alojado en el servidor BioHPC

(http://cbsuapps.tc.cornell.edu/loopp.aspx). Este programa busca el molde más

adecuado para la secuencia proteica problema dentro de las estructuras presentes

en las bases de datos. En el caso de ChoDMS, se seleccionó como molde para la

construcción del modelo la cadena A de la colesterol oxidasa de Streptomyces

(PDB: 1B4V) (Yue et al., 1999), ya que el programa en este caso fue capaz de

comparar el 86 % de la secuencia de la proteína con una identidad de secuencia

101

Resultados

de 21 %. Su estructura se presenta con la proteína unida a la coenzima FAD.

Aunque el modelo no presenta una elevada confianza, permite visualizar la

disposición conservada de los aminoácidos consenso (Figura 17).

A B Figura 17. Predicción de la estructura tridimensional de la proteína ChoDMS tomando como modelo la colesterol oxidasa de Streptomyces (PDB: 1B4V cadena A). A. Modelo de la

estructura propuesto para ChoDMS. B. Estructura publicada de la cadena A de la colesterol oxidasa

de Streptomyces (Yue et al., 1999). Los aminoácidos marcados en amarillo son aquellos para los

que se predice su implicación en la unión de la coenzima FAD. La Gly27 de ChoDMS así como la

Gly28 de 1B4V no parecen implicadas en esta unión, ya que se sitúan en la superficie externa de

la proteína alejadas del sitio de unión a FAD. Los residuos marcados en rojo formarían parte del

centro activo. En verde se ha marcado la coenzima FAD en la proteína de Streptomyces.

102

Resultados

2.1.2 MSMEG_5228

La transformación de colesterol en 4-colesten-3-ona puede estar catalizada,

además de por enzimas del tipo colesterol oxidasa, por las hidroxiesteroide

deshidrogenasas, como ya se comentó en la Introducción. Así, Horinouchi et al.

(1991) describieron una colesterol deshidrogenasa NAD(P)-dependiente (NAD(P)-

CDH, número de acceso BAA14290.1) en Nocardia sp. encargada de realizar esta

transformación. El análisis comparativo in silico de esta proteína se efectuó, como

en el apartado anterior, comparando su secuencia frente a la totalidad de las

secuencias proteicas de las bases de datos utilizando el programa BLASTP. Este

análisis nos condujo al gen MSMEG_5228 (1068 pb) cuyo producto, que se

describe como perteneciente a la familia de las 3-β hidroxiesteroide

deshidrogenasas/isomerasas, presenta una identidad del 77% (cuantificado por

ClustalW) con la proteína de Nocardia (tabla 12). Las demás proteínas bacterianas

que mostraron cierta similitud con la NAD(P)-CDH que salieron a la luz como

resultado de este análisis pertenecen todas ellas, sorprendentemente, a especies

bacterianas del género Mycobacterium (las siguientes proteínas en orden de

similitud con NAD(P)-CDH pertenecen a vegetales, datos no mostrados). Al igual

que en el caso de ChoD, aparecen proteínas de especies tanto patógenas como

no patógenas, y tanto de crecimiento rápido como lento (tabla 11). En el genoma

de M. smegmatis parece ser el gen MSMEG_5228 el único ortólogo al gen de

Nocardia, siendo el siguiente gen en orden de similitud MSMEG_6142, que

codifica una nucleósido-difosfato-azúcar epimerasa, con una identidad de sólo el

22% con la proteína de Nocardia.

103

Resultados

72Colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium tuberculosis T17]ZP_03536067.1

73Colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium tuberculosis H37Rv]NP_215622.1

71Colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium leprae TN]NP_302310.1

763-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium sp. JLS]YP_001072602.1

72Proteína de la familia 3-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium intracellulare ATCC 13950]ZP_05224707.1

763-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium sp. MCS]YP_641270.1

73Colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium marinum M]YP_001852621.1

753-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium gilvum PYR-GCK]YP_001133341.1

72Colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium ulcerans Agy99]YP_904397.1

75Posible colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium kansasii ATCC 12478]ZP_04749754.1

73Proteína hipotética MAP2688 [Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10]NP_961622.1

77Proteína de la familia 3-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium smegmatis mc2155]YP_889474.1

74Proteína de la familia 3-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium avium 104]YP_880472.1

773-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium vanbaalenii PYR-1]YP_955416.1

% ID con NAD(P)-

CDHClustalW

Proteína/microorganismo

% ID con NAD(P)-

CDHClustalW

Proteína /microorganismo

72Colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium tuberculosis T17]ZP_03536067.1

73Colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium tuberculosis H37Rv]NP_215622.1

71Colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium leprae TN]NP_302310.1

763-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium sp. JLS]YP_001072602.1

72Proteína de la familia 3-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium intracellulare ATCC 13950]ZP_05224707.1

763-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium sp. MCS]YP_641270.1

73Colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium marinum M]YP_001852621.1

753-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium gilvum PYR-GCK]YP_001133341.1

72Colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium ulcerans Agy99]YP_904397.1

75Posible colesterol deshidrogenasa [Mycobacterium kansasii ATCC 12478]ZP_04749754.1

73Proteína hipotética MAP2688 [Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10]NP_961622.1

77Proteína de la familia 3-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium smegmatis mc2155]YP_889474.1

74Proteína de la familia 3-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium avium 104]YP_880472.1

773-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Mycobacterium vanbaalenii PYR-1]YP_955416.1

% ID con NAD(P)-

CDHClustalW

Proteína/microorganismo

% ID con NAD(P)-

CDHClustalW

Proteína /microorganismo

Tabla 11. Resultados de la comparación de la NAD(P)-CDH de Nocardia sp. frente a las bases de datos de secuencias proteicas utilizando el programa BLASTP. Se muestran las 14

proteínas más similares, el microorganismo al que pertenecen, su código de acceso y su similitud

con la NAD(P)-CDH indicada en porcentaje de identidad hallado con ClustalW. La proteína

producto del gen MSMEG_5228 de M. smegmatis mc2155 se ha señalado en color azul.

La NAD(P)-CDH de Nocardia sp. así como el producto del gen MSMEG_5228

(a partir de ahora denominado en el texto 3-β HSDMS) presentan un motivo Gly-X-

Gly-(X)2-Gly-(X)10-Gly (donde X representa cualquier aminoácido) en la región N-

terminal (Fig. 18) que está bien conservado entre los dominios de unión a NAD de

muchas deshidrogenasas NAD(P)-dependientes (Scrutton et al., 1990). Así

104

Resultados

mismo, presentan una tétrada catalítica característica de proteínas de la

superfamilia de las deshidrogenasas/reductasas de cadena corta (SDR)

constituída por una Asn alrededor de la posición 111, una Ser alrededor de la

posición 138 y Tyr-(X3)-Lys alrededor de la posición 151 (Oppermann et al., 2003).

Además de esta tétrada presentan otras características propias de las SDR, como

son un Asp alrededor de la posición 60, una Ala alrededor de la posición 88 y un

motivo Pro-Gly alrededor de la posición 180 seguido de una Thr conservada

alrededor de la posición 188 (Fig. 18).

MSMEG_5228 MADS--TTDLGRILVTGGSGFVGANLVTELLDRGYAVRSFDRVPSPLPAHAGLEVATGDI 58 NAD_P_-CDH MGDASLTTDLGCVLVTGGSGFVGANLVTELLDRGYAVRSFDRAPSPLGDHAGLEVIEGDI 60 *.*: ***** :*****************************.**** ****** *** MSMEG_5228 CDLDNVTNAVAGVDTVFHTAAIIDLMGGASVTAEYRQRSFAVNVGGTENLVRAAQSAGVK 118 NAD_P_-CDH CDKETVAAAVKDIDTVIHTAAIIDLMGGASVTEAYRQRSFAVNVEGTKNLVHASQEAGVK 120 ** :.*: ** .:***:*************** ********** **:***:*:*.**** MSMEG_5228 RFVYTASNSVVMGGQHIVHGDETLPYTERFNDLYTETKVVAEKFVLGRNGVAGMLTCSIR 178 NAD_P_-CDH RFVYTASNSVVMGGQDIVNGDETMPYTTRFNDLYTETKVVAEKFVLAENGKHDMLTCAIR 180 ***************.**:****:*** ******************..** .****:** MSMEG_5228 PSGIWGRGDQTMFRKVFESVLAGHVKVLVGRKSTLLDNSYVHNLVHGFILAAEHLTPNGT 238 NAD_P_-CDH PSGIWGRGDQTMFRKVFENVLAGHVKVLVGNKNIKLDNSYVHNLIHGFILAGQDLVPGGT 240 ******************.***********.*. *********:******.:.*.*.** MSMEG_5228 APGQAYFINDGEPVNMFEFARPVIEACGRKLPRVRVPGRAVHAAMSGWQRLHFRFGIPEP 298 NAD_P_-CDH APGQAYFINDGEPINMFEFARPVLAACGRPLPTFYVSGRLVHKVMMAWQWLHFKFALPEP 300 *************:*********: **** ** . *.** ** .* .** ***:*.:*** MSMEG_5228 LLEPLAVERLYLNNYFSIAKATRDLGYRPLFTTEQARVDCLPYYVDLFKQME-AQARPA- 356 NAD_P_-CDH LIEPLAVERLYLNNYFSIAKAKRDLGYEPLFTTEQAMAECMPYYVEMFHQMESAQKAPAA 360 *:*******************.*****.******** .:*:****::*:*** ** ** MSMEG_5228 ---- NAD_P_-CDH AVAR 364 Figura 18. Alineamiento del producto del gen MSMEG_5228 (3-β HSDMS) y la NAD(P)-CDH de Nocardia sp. y supuestos motivos consenso hallados en las secuencias. Los residuos

marcados en amarillo estarían implicados en la unión de la coenzima mediante el mantenimiento

de la estructura de la lámina β central; los residuos marcados en azul estarían implicados en

interacciones con la coenzima y los residuos marcados en rojo formarían la tétrada catalítica.

Las funciones postuladas para estos residuos en estas posiciones

particulares se resumen en la tabla 12, adaptada de Opperman et al. (2003).

105

Resultados

Unión a la carboxamida del anillo de nicotinamida188T

Dirección de la reacción183-184P-G

Conexión del bucle de unión al sustrato y el sitio activo179N

Sitio activo138, 151,155S-Y-K

Sitio activo111N

Estabilización de la lámina β central88A

Estabilización del bolsillo del anillo de adenina, unión débil a la coenzima

60D

FunciónPosición aproximada

Motivo

Unión a la carboxamida del anillo de nicotinamida188T

Dirección de la reacción183-184P-G

Conexión del bucle de unión al sustrato y el sitio activo179N

Sitio activo138, 151,155S-Y-K

Sitio activo111N

Estabilización de la lámina β central88A

Estabilización del bolsillo del anillo de adenina, unión débil a la coenzima

60D

FunciónPosición aproximada

Motivo

Tabla 12. Función de los motivos conservados encontrados en enzimas SDR. Para las

posiciones se ha utilizado como referencia la 3β/17β-HSD de C. testosteroni (código PDB 1hxh)

(Oppermann et al., 2003). Los aminoácidos se han escrito en código de una letra.

Las SDR forman una gran familia de proteínas funcionalmente heterogénea.

A pesar de las bajas identidades de secuencia entre las diferentes formas

(alrededor de un 15-20 %), las estructuras tridimensionales presentan patrones de

plegamiento α/β similares con una lámina β central típica del plegamiento de

Rossmann (motivo estructural de unión a NAD).

La predicción de las estructuras secundaria y tridimensional de 3-β HSDMS se

llevó a cabo, al igual que se hizo con ChoDMS, utilizando el programa LOOPP. En

el caso de 3-β HSDMS se seleccionó como molde para la construcción del modelo

la cadena A de la proteína DesIV (dTDP-glucosa 4,6-deshidratasa) de

Streptomyces venezuelae (PDB: 1R66) (Allard et al., 2004), un miembro de la

familia de las SDR. Su estructura se presenta con la proteína unida a la coenzima

NAD y a dTDP (el nucleótido desoxitimidina difosfato, que forma parte del sustrato

de DesIV, la dTDP glucosa). El programa pudo comparar el 90 % de DesIV con

una identidad de secuencia de 22 %. Este modelo presenta un bajo nivel de

confianza, pero permite visualizar la disposición conservada de los aminoácidos

consenso (Figura 19).

106

Resultados

A B Figura 19. Predicción de la estructura tridimensional de la proteína 3-β HSDMS tomando

como modelo la SDR DesIV de Streptomyces venezuelae (PDB: 1R66 cadena A). A. Modelo

de la estructura propuesto para 3-β HSDMS. B. Estructura publicada de la cadena A de la proteína

DesIV de Streptomyces venezuelae (Allard et al., 2004). Los aminoácidos marcados en amarillo

son aquellos para los que se predice su implicación en la unión de la coenzima NAD. La Gly24 de

3-β HSDMS así como la Gly23 de DesIV no parecen implicadas en esta unión, ya que se sitúan

alejadas del sitio de unión de NAD (la Gly23 de DesVI se sitúa detrás de una hélice α y

prácticamente no es visible en esta imagen). Los residuos marcados en rojo formarían parte del

centro activo. En azul se ha señalado el Asp60 relacionado con interacciones con la coenzima

NAD. En lila se ha señalado la Asn180 que actúa como conector del bucle de unión al sustrato y el

sitio activo. Este residuo no aparece en la proteína 3-β HSDMS. En verde se ha marcado la

coenzima NAD en la proteína de Streptomyces, y en rosa, la desoxitimidina difosfato (dTDP).

107

Resultados

2.2 Análisis mediante RTq-PCR de la expresión diferencial en colesterol de los genes MSMEG_1604 y MSMEG_5228

Una vez localizados los genes MSMEG_1604 y MSMEG_5228 mediante

análisis in silico, que podrían ser responsables de catalizar la transformación de

colesterol en 4-colesten-3-ona, se analizó en primer lugar su expresión diferencial

en colesterol para comprobar si el crecimiento en este esteroide inducía la

expresión de ambos o alguno de los genes, lo que apoyaría su papel en la

degradación del colesterol. Para ello se cultivó M. smegmatis mc2155 en colesterol

1,8 mM en β-ciclodextrina y en glicerol 18 mM en β-ciclodextrina, se extrajo el

RNA de los cultivos en fase logarítmica como se describe en el apartado 7.1 de

Materiales y Métodos y se ejecutaron análisis mediante RTq-PCR como se

describe en los apartados 7.3 y 7.4 de Materiales y Métodos. Los resultados

indican que el gen MSMEG_5228 sí se expresa de manera diferencial en

colesterol, resultado que se reproduce con cada una de las tres cantidades de

cDNA total con las que se realizó la PCR en tiempo real: 5, 2 y 0,5 ng (Figura 20

A). Sin embargo, el gen MSMEG_1604 no presenta expresión diferencial en

colesterol, sino una expresión basal en colesterol y glicerol (Figura 20 B). Estos

resultados parecían implicar al gen MSMEG_5228 en la degradación de colesterol

frente a MSMEG_1604, aunque eran necesarios estudios de actividad enzimática

para corroborar esta hipótesis.

108

Resultados

Expresión diferencial de MSMEG_1604 en colesterol 1,8 mM- glicerol 18 mM

0,000E+00

5,000E-02

1,000E-01

1,500E-01

2,000E-01

2,500E-01

3,000E-01

3,500E-01

1 2 3

Nive

l de

trans

crip

ción

(ng

de tr

ánsc

rito

)

Colesterol

Glicerol

Expresión difrencial de MSMEG_5228 en colesterol 1,8 mM-Glic 18 mM

0,000E+00

5,000E-0

A B Figura 20. Expresión diferencial obtenida mediante RTq-PCR de los genes MSMEG_5228 (A) y MSMEG_1604 (B) de M. smegmatis mc2155 cultivado en colesterol 1,8 mM comparado con M. smegmatis mc2155 cultivado en glicerol 18 mM. Los niveles de transcripción se midieron

mediante RTq-PCR como se describe en los apartados 7.3 y 7.4 de Materiales y Métodos. Las

barras de error representan la desviación estándar calculada. Los valores de P del test t de Student

no pareado fueron menores de 0,05 para MSMEG_5228 en todos los casos, lo que implica que la

diferencia de expresión es estadísticamente significativa a este nivel de confianza, mientras que

para MSMEG_1604 fueron mayores de 0,1, lo que implica que la diferencia de expresión no es

estadísticamente significativa a este nivel de confianza (datos no mostrados). Las parejas de

barras colesterol (azul)/glicerol (morado) se han señalado con los números 1, 2 o 3 que indican el

nivel de transcripción obtenido a partir de distintas cantidades de cDNA: 1: 5 ng, 2: 2 ng y 3: 0,5 ng.

2.3 Clonación y expresión heteróloga de los genes MSMEG_1604 y MSMEG_5228

2.3.1 Clonación de los genes MSMEG_1604 y MSMEG_5228

Para estudiar el posible papel del producto de los genes MSMEG_1604 y

MSMEG_5228 en la ruta de degradación del colesterol se procedió, en primer

lugar, a su clonación e hiperexpresión en E. coli. Para ello, fueron amplificados por

PCR y subclonados en el vector de hiperexpresión pET-29a (+) bajo el control de

un promotor fuerte, el promotor 10 del fago T7, y con una región de unión al

ribosoma (SD) heteróloga consenso, resultando en los plásmidos pET1604 y

pET5228, respectivamente (Fig. 21). Estos plásmidos fueron posteriormente

1 tra

1,000E+00

1,500E+00

2,000E+00

1 2 3

Niv

el d

ens

crip

ción

(ng

de tr

ánsc

rito)

Colesterol

Glicerol

Expresión diferencial de MSMEG_1604 en colesterol 1,8 mM- glicerol 18 mM

0,000E+00

5,000E-02

1,000E-01

1,500E-01

2,000E-01

2,500E-01

3,000E-01

3,500E-01

1 2 3

Nive

l de

trans

crip

ción

(ng

de tr

ánsc

rito

)

Colesterol

Glicerol

Expresión difrencial de MSMEG_5228 en colesterol 1,8 mM-Glic 18 mM

0,000E+00

5,000E-0

1,000E+00

1,500E+00

2,000E+00

1 2 3

ánsc

rito)

1 tra

Niv

el d

ens

crip

ción

(ng

de tr

Colesterol

Glicerol

109

Resultados

transferidos a la cepa E. coli BL21 (DE3) (Tabla 1 Materiales y Métodos) que

posee el fondo genético necesario para la correcta expresión desde el promotor

PT7.

pGEM®-TEasy (3,0 kb)

ori

ApR

pGEM1604(4,7 kb)

pGEM5228(4 kb)

ApR

ori

KmR

ori

lacI

PT7

Polilinker

pET-29a(+)(5,4 kb)

pET1604(7,1 kb)

pET5228(6,4 kb)

KmR

ori

lacI

PT7

MSMEG_1604

MSMEG_5228

NdeI

NdeI

EcoRI

HindIII

CO5 CO3

5228-F 5228-R

Ligación

Ligación

Digestión

pGEM®-TEasy (3,0 kb)

ori

ApR

pGEM®-TEasy (3,0 kb)

ori

ApR

pGEM1604(4,7 kb)

pGEM5228(4 kb)

ApR

ori

pGEM1604(4,7 kb)

pGEM5228(4 kb)

ApR

ori

KmR

ori

lacI

PT7

Polilinker

pET-29a(+)(5,4 kb)

KmR

ori

lacI

PT7

Polilinker

pET-29a(+)(5,4 kb)

pET1604(7,1 kb)

pET5228(6,4 kb)

KmR

ori

lacI

PT7 pET1604(7,1 kb)

pET5228(6,4 kb)

KmR

ori

lacI

PT7

MSMEG_1604

MSMEG_5228

NdeI

NdeI

EcoRI

HindIII

CO5 CO3

5228-F 5228-R

MSMEG_1604

MSMEG_5228

NdeI

NdeI

EcoRI

HindIII

CO5 CO3

5228-F 5228-R

Ligación

Ligación

Digestión

Figura 21. Representación esquemática de la construcción de los plásmidos pET1604 y pET5228. Los genes MSMEG_1604 y MSMEG_5228 fueron amplificados mediante PCR utilizando

cada uno la pareja de oligonucleótidos correspondiente señalada en la figura (secuencias en Tabla

3 de Materiales y Métodos) y DNA genómico de M. smegmatis mc2155 como molde. Cada gen

amplificado se clonó en el plásmido pGEM-T easy (dando lugar a los plásmidos pGEM1604 y

pGEM5228) y fue subclonado en el vector pET-29a (+) empleando las enzimas de restricción

correspondientes para cada gen señaladas en la figura (y que están presentes en los

oligonucleótidos utilizados para la amplificación de los genes), dando lugar a los plásmidos

pET1604 y pET5228. Las abreviaturas utilizadas son: ApR, gen que confiere resistencia a

ampicilina; KmR, gen que confiere resistencia a kanamicina; lacI, gen que codifica el represor LacI;

PT7, promotor del gen 10 del fago T7; ori, origen de replicación.

110

Resultados

2.3.2 Expresión heteróloga de MSMEG_1604

Los extractos proteicos obtenidos de la cepa E. coli BL21 (DE3) (pET1604),

fueron analizados mediante SDS-PAGE. Tras analizar distintas condiciones de

fermentación, en las cuales se cambiaron la temperatura, agitación, tiempo de

inducción con IPTG, etc., finalmente se seleccionaron las indicadas en el apartado

5.1.1 de Materiales y Métodos (inducción de cultivos a DO600 de 0,6 con IPTG 50

μM en agitación durante 3 horas a 20 ºC). Estas condiciones provocan la

insolubilización de parte de la proteína, pero también se detectan niveles

apreciables de proteína soluble (Fig. 22, calle 3).

66,0

116,0

KDa

200,0

45,0

31,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

97,4

A B Figura 22. Geles SDS-PAGE en los que se muestra la expresión del producto de MSMEG_1604 (ChoDMS) en células E. coli BL21 (DE3) bajo distintas condiciones y tratamientos. A: 1. Marcadores de peso molecular (en el margen izquierdo de la figura se detallan

los pesos moleculares de los marcadores en KDa). El peso molecular de ChoDMS se ajusta al

teórico calculado por el programa Compute pI/Mw del servidor Expasy

(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html): 62,88 KDa. La posición de la proteína se indica con una

flecha roja. 2-10: Fracciones celulares solubles de E. coli BL21 (DE3) (pET1604) inducidas a

temperatura ambiente (20 ºC) con: 2. IPTG 50 µM 4 h. 3. IPTG 50 µM 3 h. 4. IPTG 50 µM 2 h. 5. IPTG 50 µM 1,5 h. 6. IPTG 50 µM 1 h. 7. IPTG 50 µM 45 min. 8. IPTG 50 µM 30 min. 9. IPTG 1,25

µM 12 h. 10. IPTG 0,125 µM 12 h. B: 1. Marcadores de peso molecular. 2-10: Fracciones celulares

insolubles de E. coli BL21 (DE3) (pET1604) inducidas a temperatura ambiente (20 ºC) con: 2. IPTG

50 µM 4 h. 3. IPTG 50 µM 3 h. 4. IPTG 50 µM 2 h. 5. IPTG 50 µM 1,5 h. 6. IPTG 50 µM 1 h. 7. IPTG 50 µM 45 min. 8. IPTG 50 µM 30 min. 9. IPTG 1,25 µM 12 h. 10. IPTG 0,125 µM 12 h.

111

Resultados

2.3.3 Expresión heteróloga de MSMEG_5228

Los extractos proteicos de la cepa E. coli BL21 (DE3) (pET5228) fueron

analizados mediante SDS-PAGE. Se probaron distintas condiciones de

fermentación, pero en ningún caso se pudo obtener un extracto en el que fuese

visible proteína en forma soluble, sino que se mostraba hiperproducida en forma

insoluble. Como norma general para posteriores experimentos se utilizaron las

mismas condiciones de inducción que para E. coli BL21 (DE3) (pET1604) (Fig.

23).

66,097,4

KDa

21,5

116,0

45,0

31,0

1 2 3

14,4

Figura 23. Geles SDS-PAGE en los que se muestra la expresión del producto de MSMEG_5228 (3-β HSDMS) en células E. coli BL21 (DE3). En este caso se cargaron como

muestra células enteras, ya que no hay proteína visible en las fracciones celulares solubles expresando esta proteína con las condiciones utilizadas. 1. Marcadores de peso molecular (en el

margen izquierdo de la figura se detallan los pesos moleculares de los marcadores). 2. Células

enteras E. coli BL21(DE3) con plásmido pET29 (control negativo de expresión) inducidas 3 h a 20

ºC con 50 μM IPTG. 3. Células enteras E. coli BL21(DE3) (pET5228) inducidas 3 h a 20 ºC con 50

μM IPTG. El peso molecular de 3-β HSDMS se ajusta al teórico calculado por el programa Compute

pI/Mw del servidor Expasy (http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html): 38,8 KDa.

2.4 Ensayos enzimáticos mediante TLC con colesterol marcado con 14C

Las proteínas ChoDMS y 3-β HSDMS fueron ensayadas utilizando colesterol

marcado radiactivamente. Los productos de las reacciones fueron separados

mediante la técnica de cromatografía en capa fina (TLC) y éstos fueron detectados

112

Resultados

posteriormente mediante autorradiografía. Esta técnica supone una alternativa

más sensible a los ensayos espectrofotométricos, que fueron probados

previamente, sin que se pudiese detectar con ellos actividad enzimática. La

técnica de TLC con radiactividad ya se había utilizado con anterioridad para la

determinación de la actividad colesterol deshidrogenasa/isomerasa de la proteína

AcmA de S. denitrificans (Chiang et al., 2008b). Los protocolos utilizados para el

ensayo de AcmA se adaptaron para ensayar y posteriormente visualizar nuestras

muestras proteicas (véanse los apartados 5.4.1, 5.4.2 y 9 de Materiales y

Métodos). Mediante esta metodología adaptada se ensayaron extractos proteicos

de E. coli BL21 (DE3) (pET1604), E. coli BL21 (DE3) (pET5228) y sobrenadantes

de cultivos de E. coli BL21(DE3) (pET1604) y de M. smegmatis mc2155 y distintos

mutantes de esta cepa.

2.4.1 Experimentos in vitro con ChoDMS y 3-β HSDMS. Cinética enzimática

La puesta a punto del método cromatográfico con muestras procedentes de

in vitro se llevó a cabo utilizando como control positivo la colesterol oxidasa

comercial de Pseudomonas fluorescens. Se cargaron las placas de TLC con

muestras procedentes de soluciones de proteína incubadas con colesterol

marcado radiactivamente durante 20 min a 30 ºC. Los resultados muestran la

aparición de una marca cuyo tiempo de retención (Rf) coincidía con el de la 4-

colesten-3-ona (Datos no mostrados). Esta marca no aparecía en ninguno de los

controles negativos empleados (muestra incubada sin proteína o extracto soluble

de E. coli BL21 (DE3) portando el plásmido pET29 sin inserto) (Fig. 24).

Curiosamente, en la muestra de colesterol oxidasa comercial aparece además de

las marcas de colesterol y de la 4-colesten-3-ona, otra marca por debajo de la del

colesterol, que podría corresponder, teniendo en cuenta la fase móvil utilizada en

nuestros ensayos, a la 6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona (Fig. 25), un compuesto

que aparece, incluso de manera mayoritaria, como producto de algunas colesterol

oxidasas (Doukyu y Aono, 1999; Doukyu et al., 2008).

113

Resultados

N

C

H

1 2 3

N

C

H

N

C

H

1 2 3

Figura 24. Producción de productos a partir de colesterol marcado con 14C por soluciones de colesterol oxidasa comercial. La línea marcada con una C indica la altura a la que migra el

colesterol, la marcada con una N la de la 4-colesten-3-ona y la marcada con una H la de un

producto no identificado que podría tratarse de la 6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona. Las muestras

se cargaron en las placas de TLC tras un ensayo enzimático de 20 min. Las muestras cargadas

proceden de ensayos realizados con: 1. Colesterol radiactivo sin extracto proteico. 2. Ensayo con

colesterol oxidasa comercial. 3. Ensayo con extracto soluble de E. coli BL21 (DE3) portando el

plásmido pET29 vacío.

Para confirmar la estructura del compuesto que se hipotetiza como 6β-

hidroperoxi-4-colesten-3-ona, la muestra de reacción fue analizada por LC/MS

(véanse los apartados 5.4.1 y 8 de Materiales y Métodos). En un primer análisis,

en el que se recogieron los iones producidos en full scan, encontramos un pico a

tiempo de retención 14,53 minutos en el que el ión quasimolecular [M+H]+

corresponde a m/z 417 y en el que los iones mayoritarios son, en orden de

abundancia, m/z 371, m/z 400 y m/z 383. El ión quasimolecular corresponde con

la masa de la 6-β-hidroxi-4-colesten-3-ona (peso molecular 416) mientras que los

iones mayoritarios concuerdan con la pérdida de un grupo carboxilo, un grupo

hidroxilo y dos grupos hidroxilo respectivamente, presentes en la estructura de

este compuesto. Al fraccionar tanto el ión quasimolecular como los iones

mayoritarios, encontramos espectros de masas que indican que el compuesto que

estamos estudiando presenta una cadena lateral similar a la del colesterol y que

114

Resultados

puede perder hasta tres moléculas de agua al ser sometido a la energía de

colisión necesaria para producir su fragmentación.

O

OOH

O

OOH

Figura 25. Estructura de la 6-β-hidroxi-4-colesten-3-ona.

Estos resultados sugieren que el compuesto tiene una estructura similar a la

6-β-hidroxi-4-colesten-3-ona, en cuanto a su estructura esteroidea y a su cadena

lateral, aunque serían necesarios análisis de RMN para establecer definitivamente

esta estructura en su totalidad.

Tras el ensayo realizado con éxito empleando la colesterol oxidasa comercial,

se procedió a realizar el mismo protocolo con los extractos proteicos de E. coli

expresando ChoDMS y 3-β HSDMS (E. coli BL21 (DE3) (pET1604) y E. coli BL21

(DE3) (pET5228)). En este caso se analizaron en las placas de TLC las muestras

incubadas y extraídas a distintos tiempos de reacción, a los 2, 20, 40 y 60 min.

En las muestras que expresan 3-β HSDMS se aprecia una marca en la

movilidad corrrespondiente a la 4-colesten-3-ona, y su intensidad aumenta con el

tiempo de ensayo (Fig. 26). También se aprecia, como ya se había visto con el

control con colesterol oxidasa comercial, otra marca con menor movilidad que el

colesterol, que podría corresponder a la 6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona. Esta es

la primera vez que se describe la presencia de este tipo de metabolito para una

hidroxiesteroide deshidrogenasa hasta el momento.

En las muestras procedentes de extractos que expresan ChoDMS no se

aprecia ninguna banda adicional a la de colesterol. Estos resultados confirman la

115

Resultados

capacidad de transformación del colesterol de 3-β HSDMS y mantienen las dudas

sobre la actividad de ChoDMS.

2 min ensayo 20 min 40 min 60 min

N

H

C

1 2 3 41 2 3 41 2 3 41 2 3 4

2 min ensayo 20 min 40 min 60 min

N

H

CC

1 2 3 41 2 3 41 2 3 41 2 3 4

Figura 26. Producción de productos a partir de colesterol marcado con 14C por extractos celulares solubles expresando las proteínas ChoDMS y 3-β HSDMS. La línea marcada con una C

indica la altura a la que corre el colesterol, la marcada con una N la de la 4-colesten-3-ona y la

marcada con una H la de un producto no identificado que podría tratarse de la 6β-hidroperoxi-4-

colesten-3-ona. Las muestras se cargaron en las placas de TLC a diferentes tiempos de reacción

que se indica en la vertical: 2, 20, 40 y 60 min. Las muestras cargadas proceden de ensayos

realizados con: 1. Colesterol oxidasa comercial. 2. Extracto soluble de E. coli BL21 (DE3)

(pET5228). 3. Extracto soluble de E. coli BL21 (DE3) (pET5228) al que no se adicionó NAD en el

ensayo enzimático (el resultado indica que en el extracto proteico hay suficiente NAD para que la

reacción enzimática tenga lugar). 4. Extracto soluble de E. coli BL21 (DE3) (pET1604).

2.4.2 Detección de la actividad de ChoDMS in vivo

El hecho de que los extractos proteicos que expresan ChoDMS no produzcan

4-colesten-3-ona podría ser debido a que la proteína se esté excretando al medio

de cultivo y sea a nivel extracelular donde se cataliza esta transformación. De

hecho, se ha sugerido que la ChoD de M. tuberculosis es extracelular (Cowley y

Av-Gay, 2001). Para comprobar si esto era lo que estaba sucediendo, se cultivó la

cepa E. coli BL21 (DE3) (pET1604) durante 24 h en medio mínimo con glicerol 20

mM como fuente de carbono y colesterol 1 mM marcado radiactivamente. Tras

tomar muestras de sobrenadante de cultivo (véase apartado 5.4.2 de Materiales y

116

Resultados

Métodos), éstas se visualizaron mediante TLC. Como se muestra en la figura 27,

no se apreció la existencia de una marca de 4-colesten-3-ona.

N

C

H

N

C

H

Figura 27. Producción de metabolitos a partir de colesterol marcado con 14C por muestras procedentes de sobrenadante de cultivo de E. coli. La línea marcada con una C indica la altura a

la que corre el colesterol, la marcada con una N la de la 4-colesten-

3-ona y la marcada con una H la de un producto no identificado

que podría tratarse de la 6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona. Las

muestras cargadas proceden de ensayos realizados con: 1. Colesterol oxidasa comercial. 2. Sobrenadante de cultivo de E. coli

BL21 (DE3) portando el plásmido pET29 vacío en glicerol 20 mM-

colesterol 1 mM. 3. Sobrenadante de cultivo de E. coli BL21 (DE3)

(pET1604) en glicerol 20 mM-colesterol 1mM.

1 2 3

2.5 Ensayo de ChoDMS y 3-β HSDMS mediante LC/MS

Como método de análisis complementario a los ensayos de radiactividad, se

llevaron a cabo análisis mediante LC/MS con muestras procedentes de extractos

proteicos expresando los productos de MSMEG_1604 y MSMEG_5228.

Estos ensayos se realizaron con distintas muestras procedentes de ensayos

enzimáticos para determinar actividad colesterol oxidasa o colesterol

deshidrogenasa a tiempo de ensayo 1 h (véanse los apartados 5.4.1 y 8 de

Materiales y Métodos). Los ensayos enzimáticos se realizaron siguiendo el mismo

método que para su análisis mediante TLC pero sin adición de colesterol

radiactivo. La figura 28 muestra el espectro MS/MS de 4-colesten-3-ona obtenido

por APCI+ para extractos de E. coli BL21(DE3) (pET5228) a tiempo final 1 h.

Como se puede observar, aparece un pico correspondiente a la 4-colesten-3-ona,

concretamente el ión 367 procedente a su vez de la reacción del ión 385 de la 4-

colesten-3-ona. Este ión es uno de los iones que se generan al fragmentarse la

molécula de 4-colesten-3-ona mediante espectrometría de masas. Esta

fragmentación siempre genera los mismos iones padre para una molécula dada.

117

Resultados

La fragmentación de uno de estos iones mediante espectrometría de masas (por

ejemplo el 385 en el caso de la 4-colesten-3-ona) genera a su vez varios iones,

que igualmente siempre son los mismos (en el caso de la 4-colesten-3-ona uno de

ellos es el 367). Así, la detección del ión de fraccionamiento de una molécula

mediante MS/MS ofrece una garantía mucho mayor sobre la identidad de la misma

que limitarse a detectar uno de los iones originales, ya que dos moléculas pueden

tener un ión original común, pero difícilmente la fragmentación de éste dará a su

vez lugar a iones de fragmentación comunes. Estos resultados confirmarían los

obtenidos mediante ensayos con colesterol radiactivo visualizados mediante TLC.

Los espectros MS/MS obtenidos con los extractos de E. coli BL21 (DE3)

(pET1604) no se muestran ya que en ellos no apareció el pico de 4-colesten-3-

ona, con lo que se repiten los resultados negativos ya obtenidos mediante

ensayos espectrofotométricos y TLC.

Hay que destacar que la concentración más elevada de 4-colesten-3-ona

que se consiguió obtener en estos ensayos fue de 9 μM, valor obtenido en los

ensayos de tiempo 1 h con el extracto proteico de E. coli BL21 (DE3) (pET5228).

Teniendo en cuenta que por cada mol de colesterol que se degrada se forma un

mol de NADH, el coeficiente de extinción molar del NADH y el volumen total de

muestra, se puede estimar que el aumento de absorbancia a 340 nm del NADH

sería de unas 0,055 unidades en estas condiciones de ensayo, un valor que

habría sido considerado poco significativo de haberse utilizado ensayos

espectrofotométricos. Estos valores tan bajos de transformación pueden deberse a

que la expresión heteróloga de estas proteínas no es adecuada para su correcto

plegamiento.

118

Resultados

: 7,84 - 51,69 SM: 9B

10 15 20 25 30 35 40 45 500

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100 NL: 1,99E3TIC F: ITMS + c APCI corona SRM ms2 385,30@cid15,50 [366,80-367,80] MS cal3

: Figura 28. Espectro MS/MS de 4-colesten-3-ona obtenido por APCI+ a partir de muestras procedentes de ensayos de actividad deshidrogenasa a tiempo final 1 h con extractos solubles de E. coli BL21(DE3) (pET5228). Se registradó el ión hijo m/z 367 del ión padre m/z 385

de la 4-colesten-3-ona. En la figura se señalan en el primer espectro los picos correspondientes al

colesterol y a la 4-colesten-3-ona. Las muestras proceden de ensayos de actividad deshidrogenasa

realizados durante 1 h. E.p. pET5228 indica la muestra procedente de un ensayo con extractos

solubles de E. coli BL21(DE3) (pET5228). En la misma se puede apreciar la aparición del pico

correspondiente a la 4-colesten-3-ona.

2.6 Ensayo de afinidad de ChoDMS por el colesterol

Como complemento a los ensayos de actividad de ChoDMS se hizo un

sencillo ensayo de purificación de colesterol oxidasa por afinidad con colesterol

(Ghasemian et al., 2009). Brevemente, a 2 ml de un extracto proteico que contiene

la proteína ChoDMS se añadieron 20 mg de colesterol en polvo y se incubó a 4 ºC

durante 2 h. Tras centrifugar la mezcla a 10000 g durante 10 min se retiró el

sobrenadante y se hicieron tres lavados sucesivos del precipitado con los

NL: 9,89E2TIC F: ITMS + c APCI corona SRM ms2 385,30@cid15,50 [366,80-367,80] MS muestrab

NL: 2,76E3TIC F: ITMS + c APCI corona SRM ms2 385,30@cid15,50 [366,80-367,80] MS muestrac

Tiempo (min)

Abu

ndan

cia

rela

tiva

Patrón

4-colesten-3-ona

Colesterol

Control negativo

E.p. pET5228

Abu

ndan

cia

rela

tiva

Abun

danc

ia re

lativ

a

7,84 - 51,69 SM: 9B

10 15 20 25 30 35 40 45 500

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100 NL: 1,99E3TIC F: ITMS + c APCI corona SRM ms2 385,30@cid15,50 [366,80-367,80] MS cal3

Tiempo (min)

Abu

ndan

cia

rela

tiva

Patrón

4-colesten-3-ona

Colesterol

: 7,84 - 51,69 SM: 9B

NL: 9,89E2TIC F: ITMS + c APCI corona SRM ms2 385,30@cid15,50 [366,80-367,80] MS muestrab

NL: 2,76E3TIC F: ITMS + c APCI corona SRM ms2 385,30@cid15,50 [366,80-367,80] MS muestrac

Abu

ndan

cia

rela

tiva

Abun

danc

ia re

lativ

a

10 15 20 25 30 35 40 45 500

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100

100

0

20

40

60

80

NL: 1,99E3TIC F: ITMS + c APCI corona SRM ms2 385,30@cid15,50 [366,80-367,80] MS cal3

Tiempo (min)

Abu

ndan

cia

rela

tiva

Patrón

4-colesten-3-ona

Colesterol

Control negativo

E.p. pET5228

Control negativo

E.p. pET5228

vael

ati

ncia

rAb

unda

NL: 9,89E2TIC F: ITMS + c APCI corona SRM ms2 385,30@cid15,50 [366,80-367,80] MS muestrab

tiva

rel

anc

iaun

daA

b

NL: 2,76E3TIC F: ITMS + c APCI corona SRM ms2 385,30@cid15,50 [366,80-367,80] MS muestrac

119

Resultados

siguientes tampones: tampón fosfato potásico 0,1 M pH 7,5 (para eliminar las

proteínas no unidas a colesterol), tampón fosfato potásico pH 7,5 con NaCl 0,5 M

(para precipitar las proteínas remanentes) y tampón fosfato potásico pH 7,5 con

1% de Triton X-100 (para extraer las proteínas unidas a colesterol). Se recogió el

sobrenadante de la muestra tras la centrifugación posterior a este último lavado y

se analizaron 5 μl mediante SDS-PAGE. Los resultados indican que la supuesta

colesterol oxidasa ChoDMS se extrae de manera selectiva en estas condiciones

(Fig. 29), lo que apoyaría la hipótesis de la existencia de algún tipo de interacción

de esta proteina con el colesterol, a pesar de no haber presentado actividad

colesterol oxidasa en nuestros distintos ensayos. No obstante, serían necesarios

controles de hidrofobicidad con otros compuestos hidrofóbicos insolubles distintos

al colesterol.

97,4

KDa

21,5

116,0

66,0

45,0

31,0

1 2 3

Figura 29. Purificación de ChoDMS mediante afinidad por colesterol. 1. Marcadores de peso

molecular (en el margen izquierdo de la figura se detallan los pesos moleculares de los

marcadores). 2. Fracción celular soluble de E. coli BL21 (DE3) (pET1604) antes de la purificación.

3. Fracción celular soluble de E. coli BL21 (DE3) (pET1604) después de la purificación. Se observa

un aumento notable de la concentración relativa de la supuesta colesterol oxidasa. La posición de

la proteína se indica con una flecha roja.

120

Resultados

2.7 Mutagénesis de MSMEG_1604 y MSMEG_5228

Para comprobar si la mutagénesis de los supuestos genes implicados en el

primer paso del catabolismo del colesterol hallados mediante análisis in silico

alteraba la utilización de este esteroide en M. smegmatis, se procedió a la

interrupción de los mismos mediante la inserción del plásmido no replicativo en

micobacterias pJQ200x (véase el apartado 4.6 de Materiales y Métodos), o bien a

su deleción, en el caso del gen MSMEG_5228 (deleción necesaria para la

construcción de un doble mutante de los genes MSMEG_1604 y MSMEG_5228)

(véase el apartado 4.7 de de Materiales y Métodos).

2.7.1 Ensayos de crecimiento en colesterol de los distintos mutantes

Los mutantes así obtenidos se crecieron con colesterol 1,8 mM en β-

ciclodextrina como única fuente de carbono. Como puede observarse en las

figuras 30 A, B y C, el crecimiento en colesterol no se ve alterado en ninguno de

los mutantes simples en los genes MSMEG_1604 y MSMEG_5228. Tampoco ve

reducida su capacidad de crecimiento en el mutante doble M.

smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228 (Fig. 30 D), que presenta el gen

MSMEG_5228 delecionado y el gen MSMEG_1604 interrumpido con pJQ200x.

Estos resultados podían indicar que se trata de un caso de redundancia, y existan

más genes no descritos que codifican proteínas con esta misma actividad en el

genoma de M. smegmatis.

121

Resultados

Figu

ras

30 A

, B, C

y D

. Cur

vas

de c

reci

mie

nto

en c

oles

tero

l 1,8

mM

de d

ifere

ntes

mut

ante

s de

M. s

meg

mat

isfr

ente

a la

cep

a co

ntro

l M. s

meg

mat

ism

c215

5. E

n ca

da g

rafic

ala

linea

nara

nja

repr

esen

ta a

l mut

ante

cor

resp

ondi

ente

y la

line

aaz

ul r

epre

sent

a a

M. s

meg

mat

ism

c215

5. A

. M. s

meg

mat

is::M

SM

EG

_160

4. B

. M

. sm

egm

atis

::MS

MEG

_522

8. C

. M.

smeg

mat

isΔ

MS

MEG

_522

8.D

. M

. sm

egm

atis

::MS

ME

G_1

604-ΔM

SM

EG

_522

8.El

mut

ante

por

del

ecio

nre

pres

enta

do e

n la

figu

raC

se c

reo´

para

la p

oste

rior c

onst

rucc

ion

del m

utan

te

dobl

e. C

omo

se o

bser

va e

n la

s gr

afic

asB

yC

, el m

utan

te o

bten

ido

med

iant

e de

leci

ony

el o

bten

ido

med

iant

e in

terr

upci

onde

MS

MEG

_522

8se

com

porta

n in

dist

inta

men

te. D

ado

que

los

mut

ante

s ob

teni

dos

med

iant

e de

leci

onso

n m

ases

tabl

es s

e ut

ilizo´

M. s

meg

mat

isΔ

MS

ME

G_5

228

en lu

gar d

e M

. sm

egat

is::M

SM

EG

_522

8en

pos

terio

res

expe

rimen

tos.

Crec

imie

nto

en c

oles

tero

l 1,8

mM

. M. s

meg

mat

isΔ

MSM

EG_5

228

0,010,

1110

020

4060

80

Tiem

po (h

)

DO 600

M. s

meg

mat

is m

c²15

5

M. s

meg

mat

isΔ

MS

MEG

_522

8

Crec

imie

nto

en c

oles

tero

l 1,8

mM

. Mut

ante

dob

le

0,010,

1110

020

4060

80

Tiem

po (h

)

DO 600

M. s

meg

mat

is m

c²15

5

M. s

meg

mat

is::M

SM

EG_1

604-

ΔM

SM

EG_5

228

Crec

imie

nto

en c

oles

tero

l 1,8

mM

. M. s

meg

mat

is::M

SMEG

_160

4

0,010,

1110

020

4060

80

Tiem

po (h

)

DO 600

M. s

meg

mat

is m

c²15

5

M. s

meg

mat

is::M

SM

EG_1

604

Crec

imie

nto

en c

oles

tero

l 1,8

mM

.

0,010,

1110

020

406

Tiem

po (h

)

DO 600

M. s

meg

mat

is::M

SMEG

_522

8

080

M. s

meg

mat

is m

c²15

5

M. s

meg

mat

is::M

SM

EG_5

228

A CDB

Crec

imie

nto

en c

oles

tero

l 1,8

mM

. M. s

meg

mat

isΔ

MSM

EG_5

228

0,010,

1110

020

4060

80

Tiem

po (h

)

DO 600

M. s

meg

mat

is m

c²15

5

M. s

meg

mat

isΔ

MS

MEG

_522

8

Crec

imie

nto

en c

oles

tero

l 1,8

mM

. Mut

ante

dob

le

0,010,

1110

020

4060

80

Tiem

po (h

)

DO 600

M. s

meg

mat

is m

c²15

5

M. s

meg

mat

is::M

SM

EG_1

604-

ΔM

SM

EG_5

228

Crec

imie

nto

en c

oles

tero

l 1,8

mM

. M. s

meg

mat

is::M

SMEG

_160

4

0,010,

1110

020

4060

80

Tiem

po (h

)

DO 600

M. s

meg

mat

is m

c²15

5

M. s

meg

mat

is::M

SM

EG_1

604

Crec

imie

nto

en c

oles

tero

l 1,8

mM

.

0,010,

1110

020

406

Tiem

po (h

)

DO 600

M. s

meg

mat

is::M

SMEG

_522

8

080

M. s

meg

mat

is m

c²15

5

M. s

meg

mat

is::M

SM

EG_5

228

A CDB

122

Resultados

2.7.2 Ensayos de sobrenadante de cultivo en colesterol de los distintos mutantes mediante TLC

Por otra parte, se analizaron los sobrenadantes de cultivos de las distintas

cepas mutantes M. smegmatis::MSMEG_1604, M. smegmatisΔMSMEG_5228 y

M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228 con el fin de comprobar si, a pesar

de ser todas ellas capaces de crecer en colesterol, se apreciaba alguna diferencia

en el perfil de los intermediarios producidos durante su catabolismo. Las células se

cultivaron durante 24 h en medio mínimo con colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina

como fuente de carbono y tras extraer los sobrenadantes se visualizaron en placas

de TLC (véanse los apartados 5.4.2 y 9 de Materiales y Métodos). Los resultados

indican que, comparativamente, el mutante M. smegmatisΔMSMEG_5228 y el

mutante doble M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228 presentan menos 4-

colesten-3-ona que los demás mutantes a este tiempo de cultivo. También se

aprecia menos cantidad de la supuesta 6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona (Fig. 31).

Estos resultados son reproducibles y parecen indicar que la proteína codificada

por MSMEG_5228 sería la implicada en la degradación del colesterol para su

aprovechamiento como fuente de carbono y energía, aunque su ausencia es

suplida sin que el crecimiento de M. smegmatis en el esteroide se vea

apreciablemente alterado.

123

Resultados

N

C

H

N

C

H

1 2 3 1 2 4 1 2 5

Figura 31. Producción de metabolitos a partir de colesterol marcado con 14C por muestras procedentes de sobrenadante de cultivo de distintas cepas de M. smegmatis. La línea

marcada con una C indica la altura a la que corre el colesterol, la marcada con una N la de la 4-

colesten-3-ona y la marcada con una H la de un producto no identificado que podría tratarse de la

6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona. Las muestras cargadas derivan de sobrenadantes de cultivos de

distintas cepas de M. smegmatis crecidas en colesterol 1,8 mM durante 24 h. 1. Control procedente

de un ensayo con colesterol oxidasa comercial. 2. M. smegmatis mc2155. 3. M.

smegmatis::MSMEG_5228. 4. M. smegmatis::MSMEG_1604. 5. M. smegmatis::MSMEG_1604-

ΔMSMEG_5228.

2.7.3 Ensayos de sobrenadante de cultivo en colesterol de los distintos mutantes mediante LC/MS

Para analizar el perfil de intermediarios de la degradación del colesterol en

distintas cepas de M. smegmatis, éstas se crecieron en medio mínimo con

colesterol en β-ciclodextrina como única fuente de carbono, y se fueron

extrayendo alícuotas a distintos tiempos de incubación para su análisis mediante

LC/MS (véanse los apartados 5.4.2 y 8 de Materiales y Métodos). Los resultados

se muestran en la figura 32. Como cabría esperar teniendo en cuenta los

crecimientos de los distintos mutantes en colesterol, la desaparición del esteroide

sigue una tendencia muy similar en los distintos mutantes y la cepa salvaje (Fig.

32 A). Sin embargo, la tendencia que se aprecia tanto en el mutante en el gen

MSMEG_5228 como en el mutante doble M. smegmatis::MSMEG_1604-

ΔMSMEG_5228 es una aparición mucho menor de 4-colesten-3-ona y de los

124

Resultados

posibles tercer y cuarto intermediarios de la ruta de degradación (26-hidroxi-4-

colesten-3-ona y 26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona, estructuras 5A y 5B de la figura

15 de introducción, respectivamente) que en el mutante en el gen MSMEG_1604 y

en M. smegmatis mc2155 (Fig. 32 B, C y D). Las concentraciones de

intermediarios parece que tienden a igualarse en las distintas cepas en

intermediarios posteriores (ácido 4-colesten-3-ona-26-oico y ácido 1,4-colestadien-

3-ona-26-oico, estructuras 6A y 6B de la figura 15 de introducción,

respectivamente) (Fig. 32 E y F).

4-colesten-3-ona

0,000000,005000,010000,015000,020000,025000,030000,035000,04000

0 24 48 72

Tiempo (h)

Áre

a de

l com

pues

to/á

rea

del

patr

ón in

tern

o M. smegmatis::MSMEG_1604

M. smegmatisΔMSMEG_5228

M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228M. smegmatis mc2155

26-hidroxi-4-colesten-3-ona

0,00000

0,02000

0,04000

0,06000

0,08000

0,10000

0 24 48 72

Tiempo (h)

Áre

a de

l com

pues

to/á

rea

del

patr

ón in

tern

o M. smegmatis::MSMEG_1604

M. smegmatisΔMSMEG_5228

M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228M. smegmatis mc2155

Colesterol

0,000000,100000,200000,300000,400000,500000,600000,700000,80000

0 24 48 72

Tiempo (h)

Áre

a de

l com

pues

to/á

rea

del

patr

ón in

tern

o M. smegmatis::MSMEG_1604

M. smegmatisΔMSMEG_5228

M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228M. smegmatis mc2155

26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona

0,00000

0,00100

0,00200

0,00300

0,00400

0,00500

0,00600

0,00700

0 24 48 72

Tiempo (h)

Áre

a de

l com

pues

to/á

rea

del

patr

ón in

tern

o M. smegmatis::MSMEG_1604

M. smegmatisΔMSMEG_5228

M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228M. smegmatis mc2155

Ácido 4-colesten-3-ona-26-oico

0,00000

0,05000

0,10000

0,15000

0,20000

0,25000

0,30000

0,35000

0 24 48 72

Tiempo (h)

Áre

a de

l c

Figura 32. Perfil de intermediarios de la degradación del colesterol hallado en los sobrenadantes de cultivo en colesterol de distintas cepas de M. smegmatis. Las figuras

representan la relación entre las áreas de los compuestos indicados en la leyenda con respecto al

área de la 5-pregnen-3-ol-20-ona, empleado como patrón interno, frente al tiempo. A. Colesterol;

B. 4-colesten-3-ona; C. 26-hidroxi-4-colesten-3-ona; D. 26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona; E. Ácido

4-colesten-3-ona-26-oico; F. Ácido 1,4-colestadien-3-ona-26-oico.

ompu

esto

/áre

a de

l pa

trón

inte

rno M. smegmatis::MSMEG_1604

M. smegmatisΔMSMEG_5228

M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228M. smegmatis mc2155

Ácido 1,4-colestadien-3-ona-26-oico

0,000000,000200,000400,000600,000800,001000,001200,001400,00160

0 24 48 72

Tiempo (h)

Áre

a de

l com

pues

to/á

rea

del

patr

ón in

tern

o

M. smegmatis::MSMEG_1604

M. smegmatisΔMSMEG_5228

M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228M. smegmatis mc2155

A B

C D

E F

Colesterol 4-colesten-3-ona

26-hidroxi-4-colesten-3-ona

Ácido 4-colesten-3-ona-26-oico Ácido 1,4-colestadien-3-ona-26-oico

26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona

4-colesten-3-ona

0,000000,005000,010000,015000,020000,025000,030000,035000,04000

0 24 48 72

Tiempo (h)

Áre

a de

l com

pues

to/á

rea

del

patr

ón in

tern

o M. smegmatis::MSMEG_1604

M. smegmatisΔMSMEG_5228

M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228M. smegmatis mc2155

26-hidroxi-4-colesten-3-ona

0,00000

0,02000

0,04000

0,06000

0,08000

0,10000

0 24 48 72

Tiempo (h)

Áre

a de

l com

pues

to/á

rea

del

patr

ón in

tern

o M. smegmatis::MSMEG_1604

M. smegmatisΔMSMEG_5228

M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228M. smegmatis mc2155

Colesterol

0,000000,100000,200000,300000,400000,500000,600000,700000,80000

0 24 48 72

Tiempo (h)

Áre

a de

l com

pues

to/á

rea

del

patr

ón in

tern

o M. smegmatis::MSMEG_1604

M. smegmatisΔMSMEG_5228

M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228M. smegmatis mc2155

Colesterol 4-colesten-3-ona

26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona

0,00000

0,00100

0,00200

0,00300

0,00400

0,00500

0,00600

0,00700

0 24 48 72

Tiempo (h)

Áre

a de

l com

pues

to/á

rea

del

patr

ón in

tern

o M. smegmatis::MSMEG_1604

M. smegmatisΔMSMEG_5228

M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228M. smegmatis mc2155

Ácido 4-colesten-3-ona-26-oico

0,00000

0,05000

0,10000

0,15000

0,20000

0,25000

0,30000

0,35000

0 24 48 72

Tiempo (h)

Áre

a de

l cst

o/ár

ea d

el

patr

ón in

tern

oom

pue

M. smegmatis::MSMEG_1604

M. smegmatisΔMSMEG_5228

M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228M. smegmatis mc2155

Ácido 1,4-colestadien-3-ona-26-oico

0,000000,000200,000400,000600,000800,001000,001200,001400,00160

0 24 48 72

Tiempo (h)

Áre

a de

l com

pues

to/á

rea

del

patr

ón in

tern

o

M. smegmatis::MSMEG_1604

M. smegmatisΔMSMEG_5228

M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228M. smegmatis mc2155

A B

C D

E F

26-hidroxi-4-colesten-3-ona 26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona

Ácido 4-colesten-3-ona-26-oico Ácido 1,4-colestadien-3-ona-26-oico

125

Resultados

La menor producción de 4-colesten-3-ona en las cepas con el gen

MSMEG_5228 mutado y en la cepa mutante doble M. smegmatis::MSMEG_1604-

ΔMSMEG_5228 ya se había observado en los ensayos con colesterol radiactivo.

En la tabla 13 se muestran la concentración de colesterol y 4-colesten-3-ona

cuantificada en cada cepa en cada punto de la extracción.

0,0070,167M. smegmatis mc2155 72h

0,0951,051M. smegmatis mc2155 48h

0,0351,377M. smegmatis mc2155 24h

0,0071,774M. smegmatis mc2155 0h

trazas0,172M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_522872h

0,0111,312M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_522848h

0,0081,427M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_522824h

0,0071,737M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_52280h

trazas0,163M. smegmatisΔMSMEG_5228 72h

0,0080,754M. smegmatisΔMSMEG_5228 48h

0,0071,187M. smegmatisΔMSMEG_5228 24h

n.d.1,782M. smegmatisΔMSMEG_5228 0h

0,0070,160M. smegmatis::MSMEG_1604 72h

0,0810,802M. smegmatis::MSMEG_1604 48h

0,0561,490M. smegmatis::MSMEG_1604 24h

n.d.1,715M. smegmatis::MSMEG_1604 0h

Conc. 4-colesten-3-ona (mM)

Conc. Colesterol(mM)

Muestra

0,0070,167M. smegmatis mc2155 72h

0,0951,051M. smegmatis mc2155 48h

0,0351,377M. smegmatis mc2155 24h

0,0071,774M. smegmatis mc2155 0h

trazas0,172M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_522872h

0,0111,312M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_522848h

0,0081,427M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_522824h

0,0071,737M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_52280h

trazas0,163M. smegmatisΔMSMEG_5228 72h

0,0080,754M. smegmatisΔMSMEG_5228 48h

0,0071,187M. smegmatisΔMSMEG_5228 24h

n.d.1,782M. smegmatisΔMSMEG_5228 0h

0,0070,160M. smegmatis::MSMEG_1604 72h

0,0810,802M. smegmatis::MSMEG_1604 48h

0,0561,490M. smegmatis::MSMEG_1604 24h

n.d.1,715M. smegmatis::MSMEG_1604 0h

Conc. 4-colesten-3-ona (mM)

Conc. Colesterol(mM)

Muestra

Tabla 13. Concentración de 4-colesten-3-ona hallada en los sobrenadantes de cultivo en colesterol de distintas cepas de M. smegmatis a distintos tiempos.

126

Resultados

Curiosamente, en las cepas M. smegmatisΔMSMEG_5228 y M.

smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228 se detectan niveles bastante

superiores de hidroxicolesterol (26-hidroxicolesterol o 27-hidroxicolesterol) que en

las cepas M. smegmatis::MSMEG_1604 y M. smegmatis mc2155 (Fig. 33). Estos

resultados sugieren que la carencia del gen MSMSEG_5228 tiene como resultado

la acumulación de este compuesto por la acción sobre el colesterol de la primera

enzima de la degradación de la cadena lateral (Cyp125) y la posibilidad de que

parte del catabolismo del colesterol se desvíe hacia una ruta alternativa.

Hidroxicolesterol

0,0000000,0020000,0040000,0060000,0080000,0100000,0120000,0140000,0160000,0180000,020000

0 24 48 72

Tiempo (h)

Áre

a de

l com

pues

to/á

rea

del

patró

n in

tern

o

M. smegmatis::MSMEG_1604

M. smegmatisΔMSMEG_5228

M. smegmatis::MSMEG_1604-ΔMSMEG_5228M. smegmatis mc2155

Figura 33. Perfil de hidroxicolesterol hallado en los sobrenadantes de cultivo en colesterol de distintas cepas de M. smegmatis. Las figuras representan la relación entre el área de

hidroxicolesterol con respecto al área de la 5-pregnen-3-ol-20-ona, empleado como patrón interno,

frente al tiempo.

2.8 Búsqueda de nuevas enzimas con actividad colesterol oxidasa/ deshidrogenasa: SDRMS

Los resultados de los ensayos enzimáticos realizados con ChoDMS y 3-β

HSDMS y los resultados de los experimentos realizados con los distintos mutantes

de estos genes hacían pensar en la necesidad de la existencia de una o más

proteínas adicionales capaces de catalizar la conversión de colesterol en 4-

colesten-3-ona en M. smegmatis. Por lo tanto se realizó una nueva búsqueda de

127

Resultados

posibles enzimas con actividad colesterol oxidasa o colesterol deshidrogenasa

presentes en este microorganismo.

2.8.1 Análisis in silico de genes ortólogos a acmA

El primer paso en el catabolismo anóxico del colesterol en S. denitrificans

está catalizado por la proteína AcmA (una colesterol deshidrogenasa/isomerasa)

(Chiang et al., 2008b). Dado que el análisis mediante RT-PCR reveló que AcmA

se expresa tanto si las células crecen aeróbica como anaeróbicamente en

colesterol (Chiang et al., 2008b), lo que indica que puede ser activa también en

aerobiosis, se decidió hacer un análisis comparativo de su secuencia frente a la

base de datos de secuencias proteicas generales (Tabla 14) y frente al genoma de

M. smegmatis mc2155, por si este microorganismo presentase algún gen ortólogo

a acmA. En la comparación de AcmA frente a las bases de datos proteicas

generales, aparece en cuarto lugar con mayor grado de similitud el producto del

gen MSMEG_5233 (1080 pb) de M. smegmatis mc2155, anotado como un

miembro de la superfamilia de dominio de unión a sustrato RmlD. RmlD es una

proteína implicada en la síntesis del precursor de la L-ramnosa, monosacárido

presente en la pared micobacteriana (Blankenfeldt et al., 2002). Las demás

proteínas similares a AcmA que se detectan en las bases de datos generales son

la mayoría pertenecientes a micobacterias, aunque también aparecen proteínas de

otros actinomicetos como Rhodococcus, de algunos anaerobios como

Dictyoglomus (Saiki et al., 1985) o Pelotomaculum (Imachi et al., 2002), y de algún

patógeno como Brucella.

128

Resultados

23Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente [Brucella ceti M644/93/1]ZP_05173817

27Proteína con dominio deunión a sustrato RmlD[Mycobacterium aviumsubsp. avium ATCC25291]ZP_05216670

25Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente[Burkholderia multivorans ATCC

17616]YP_001583471

30Epimerasa nucleósidodifosfato-azúcar[Pelotomaculumthermopropionicum SI]YP_001213184

21Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente[Brucella canis ATCC 23365]YP_001594114

26Epimerasa/deshidratasaNAD-dependiente[Mycobacterium gilvumPYR-GCK]YP_001133690

25Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente[Delftia acidovorans SPH-1]YP_001563835

29Proteína con dominio deunión a sustrato RmlD[Mycobacteriumintracellulare ATCC 13950]ZP_05225603

23Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente [Brucella sp. 83/13]ZP_05182429

31Epimerasa/deshidratasaNAD-dependiente[Mycobacteriumvanbaalenii PYR-1]YP_955010

27Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente [Mycobacterium sp. MCS]YP_640922

30Epimerasa/deshidratasaNAD-dependiente[Mycobacteriumintracellulare ATCC 13950]ZP_05223429

27Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente [Mycobacterium sp. JLS]YP_001072039

27Proteína con dominio deunión a sustrato RmlD[Mycobacteriumsmegmatis mc2155]YP_889479

30Proteína hipotética MAP1751 [Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10]NP_960685

27Proteína de la familia 3-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Dictyoglomusthermophilum H-6-12]YP_002251571

29Proteína con dominio de unión a sustrato RmlD[Mycobacterium kansasii ATCC 12478]ZP_04749067

27Epimerasa/deshidratasaNAD-dependiente[Dictyoglomus turgidumDSM 6724]YP_002352010

27Proteína con dominio de unión a sustrato RmlD[Mycobacterium avium 104]YP_881689

39Colesterol deshidrogenasa/isomerasa[Rhodococcus erythropolisSK121]ZP_04385748

% ID conAcmA

ClustalW

Proteína/microorganismo

% ID conAcmA

ClustalW

Proteína /microorganismo

23Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente [Brucella ceti M644/93/1]ZP_05173817

27Proteína con dominio deunión a sustrato RmlD[Mycobacterium aviumsubsp. avium ATCC25291]ZP_05216670

25Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente[Burkholderia multivorans ATCC

17616]YP_001583471

30Epimerasa nucleósidodifosfato-azúcar[Pelotomaculumthermopropionicum SI]YP_001213184

21Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente[Brucella canis ATCC 23365]YP_001594114

26Epimerasa/deshidratasaNAD-dependiente[Mycobacterium gilvumPYR-GCK]YP_001133690

25Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente[Delftia acidovorans SPH-1]YP_001563835

29Proteína con dominio deunión a sustrato RmlD[Mycobacteriumintracellulare ATCC 13950]ZP_05225603

23Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente [Brucella sp. 83/13]ZP_05182429

31Epimerasa/deshidratasaNAD-dependiente[Mycobacteriumvanbaalenii PYR-1]YP_955010

27Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente [Mycobacterium sp. MCS]YP_640922

30Epimerasa/deshidratasaNAD-dependiente[Mycobacteriumintracellulare ATCC 13950]ZP_05223429

27Epimerasa/deshidratasa NAD-dependiente [Mycobacterium sp. JLS]YP_001072039

27Proteína con dominio deunión a sustrato RmlD[Mycobacteriumsmegmatis mc2155]YP_889479

30Proteína hipotética MAP1751 [Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10]NP_960685

27Proteína de la familia 3-beta hidroxiesteroidedeshidrogenasa/isomerasa[Dictyoglomusthermophilum H-6-12]YP_002251571

29Proteína con dominio de unión a sustrato RmlD[Mycobacterium kansasii ATCC 12478]ZP_04749067

27Epimerasa/deshidratasaNAD-dependiente[Dictyoglomus turgidumDSM 6724]YP_002352010

27Proteína con dominio de unión a sustrato RmlD[Mycobacterium avium 104]YP_881689

39Colesterol deshidrogenasa/isomerasa[Rhodococcus erythropolisSK121]ZP_04385748

% ID conAcmA

ClustalW

Proteína/microorganismo

% ID conAcmA

ClustalW

Proteína /microorganismo

129

Resultados

Tabla 14. Resultados de la comparación de AcmA de S. denitrificans frente a las bases de datos de secuencias proteicas utilizando el programa BLASTP. Se muestran las 20 proteínas

más similares, el microorganismo al que pertenecen, su código de acceso y su similitud con AcmA

indicada en porcentaje de identidad hallado con ClustalW. La proteína producto del gen

MSMEG_5233 de M. smegmatis mc2155 se ha señalado en color azul.

El producto de MSMEG_5233 presenta un 27% de identidad (cuantificado por

ClustalW) con AcmA. El siguiente gen del genoma de M. smegmatis con mayor

similitud con AcmA es MSMEG_4184, cuyo producto codifica una dTDP-glucosa-

46-deshidratasa y tiene una identidad de secuencia del 25% con AcmA

(cuantificado por ClustalW), aunque su longitud es de tan sólo 60 aminoácidos.

AcmA presenta un 18 % de similitud (cuantificado por ClustalW) con la

NAD(P)-CDH de Nocardia sp. descrita en el apartado 2.1.2; como esta, tanto

AcmA como el producto de MSMEG_5233 (al que a partir de ahora nos

referiremos como SDRMS) presentan un motivo Gly-X-Gly-(X)2-Gly-(X)10-Gly de

unión a NAD (aunque en estas dos proteínas la glicina inicial está separada de la

segunda no por uno, sino por dos aminoácidos) y la tétrada catalítica característica

de proteínas de la superfamilia de las deshidrogenasas/reductasas de cadena

corta (SDR) N-S-Y-K. También presentan un Asp alrededor de la posición 60 y

una Ala alrededor de la posición 88, aunque carecen del motivo Pro-Gly alrededor

de la posición 180 seguido de una Thr 188 también propio de las SDR (Fig. 34).

130

Resultados

MSMEG_5233 --------MSDAVLVTGAFGLVGSAVVATLAAQGRPVVATDVGTPANRKSATGLPPTVEV 52 AcmA ---------MKTVLVTGACGAIGRRVVAGLVERGCAVSTLDFDTSANRAAARDRDARVRS 51 NAD_P_-CDH MGDASLTTDLGCVLVTGGSGFVGANLVTELLDRGYAVRSFDRAPSP-----LGDHAGLEV 55 *****. * :* :*: * :* .* : * ... . . :. MSMEG_5233 RWADLTDAAAVDTLVADVAPAAIVHLAAIIPPF-----CYMRRELARKVNVDATESLLRA 107 AcmA HFGDLDDAAPLRAAVAGVA--HVIHLAELRPPD-----TDADQFAGYRANVCATRALLAA 104 NAD_P_-CDH IEGDICDKETVAAAVKDID--TVIHTAAIIDLMGGASVTEAYRQRSFAVNVEGTKNLVHA 113 .*: * .: : * .: ::* * : : . .** .*. *: * MSMEG_5233 AEARATPPRFVLASSVAVYGTRNPHRITDMLTADTPVNPVDIYGAHKVEAENLVRASRLD 167 AcmA CADRVTPPRFVFASSVAVFGGQ-QTDAARRADAPAILAAADSYGRQKAAAEALVRASGLD 163 NAD_P_-CDH SQEAGVKRFVYTASNSVVMGGQDIVNGDETMPYTTRFN--DLYTETKVVAEKFVLAENGK 171 . . . **. .* * : : . * * *. ** :* *. . MSMEG_5233 WLILRLGGVMSSTFSVDMDVELIS-------LESVLPADGRLQTVDVRDVATAFAAATTV 220 AcmA HLILRLALTPDLAPDAGRPHPWLFGFHPDMRVEFLHPADAALALVNALD---AFGVLDSL 220 NAD_P_-CDH HDMLTCAIRPSGIWGRGDQTMFRK------VFENVLAGHVKVLVGNKNIKLDNSYVHNLI 225 :* . . . . .* : ... : : . : MSMEG_5233 PVETANHEVLLIGGDPQTHRHTQARVGSEAAQAMGIRGGLPAGRPGNPDDDHAWFHTDWM 280 AcmA DGQAVRGRTLLLGGG-ARNRYRYLDWLNMALEARGLR-PLPRTAFGRAD-----YLTDWV 273 NAD_P_-CDH HGFILAGQDLVPGGTAPGQAYFINDGEPINMFEFARPVLAACGRPLPT------FYVSGR 279 . *: ** : : . . . : .. MSMEG_5233 DTTRAQEVLTFQHHSWPQLLADTRANAGWKRYPLGLAAPLIRAFLRSKSAYKNYPGRYAD 340 AcmA DTDESEALLRYQRHDYPDWLREQVG-AVRPRWLDAGSAPLARRYLLAHSAHHAAASGQRP 332 NAD_P_-CDH LVHKVMMAWQWLHFKFALPEPLIEPLAVERLYLNNYFSIAKAKRDLGYEPLFTTEQAMAE 339 . . : :..:. * : : . .. MSMEG_5233 VWNAVEKRWGNPRPDRSEA------ 359 AcmA RLLELRRAWTLARRGLAAARLYLS- 356 NAD_P_-CDH CMPYYVEMFHQMESAQKAPAAAVAR 364 . : . .

Figura 34. Alineamiento del producto del gen MSMEG_5233 (SDRMS), AcmA y la NAD(P)-CDH de Nocardia sp. y supuestos motivos consenso hallados en las secuencias. Los residuos

marcados en amarillo estarían implicados en la unión de la coenzima mediante el mantenimiento

de la estructura de la lámina β central; los residuos marcados en azul estarían implicados en

interacciones con la coenzima y los residuos marcados en rojo formarían la tétrada catalítica.

La predicción de la estructura secundaria y la estructura tridimensional de

SDRMS se llevó a cabo, al igual que se hizo con ChoDMS y 3-β HSDMS, utilizando el

programa LOOPP. En el caso de SDRMS se seleccionó como plantilla para la

construcción del modelo la cadena A de la proteína WbmH de Bordetella

bronchiseptica (PDB:2Q1W) (King et al., 2007) un miembro de la familia de las

SDR. Su estructura se presenta con la proteína unida a la coenzima NAD. El

programa pudo comparar el 83 % de WbmH con una identidad de secuencia de 22

%. Este modelo presenta un bajo nivel de confianza, pero permite visualizar la

disposición conservada de los aminoácidos consenso (Figura 35).

131

Resultados

A B Figura 35. Predicción de la estructura tridimensional de la proteína SDRMS tomando como modelo la SDR WbmH de Bordetella bronchiseptica (PDB:2Q1W, cadena A). A. Modelo

propuesto para SDRMS. B. Estructura publicada de la cadena A de la proteína WbmH de B.

bronchiseptica (King et al., 2007). Los aminoácidos marcados en amarillo son aquellos para los

que se predice su implicación en la unión de la coenzima NAD. La Gly26 de SDRMS así como la

Gly25 de WbmH no parecen implicadas en esta unión, ya que se sitúan alejadas del sitio de unión

de NAD. Los residuos marcados en rojo formarían parte del centro activo. En azul se ha señalado

el Asp60 relacionado con interacciones con la coenzima NAD. En verde se ha marcado la

coenzima NAD en la proteína WbmH. 2.8.2 Análisis mediante RTq-PCR de la expresión diferencial en colesterol

del gen MSMEG_5233

La expresión diferencial en colesterol de MSMEG_5233 fue analizada como

en el caso de MSMEG_1604 y MSMEG_5228. Para ello se cultivó M. smegmatis

mc2155 en colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina y en glicerol 18 mM en β-

ciclodextrina, se extrajo el RNA de los cultivos en fase logarítmica (véase el

apartado 7.1 de Materiales y Métodos) y se llevaron a cabo análisis mediante RTq-

PCR (véanse los apartados 7.3 y 7.4 de Materiales y Métodos). Los resultados

132

Resultados

indican que MSMEG_5233 presenta una ligera inducción en colesterol en los

ensayos efectuados con 5 ng y 2 ng de cDNA total, pero no en los efectuados con

0,5 ng (Figura 36). Los valores de P del test t de Student fueron mayores de 0,05

en todos los casos (datos no mostrados), lo que implica que la inducción en

colesterol no es estadísticamenete significativa a este nivel de confianza.

Expresión diferencial de MSMEG_5233 en colesterol 1.8 mM-glicerol 18 mM

0,000E+005,000E-021,000E-011,500E-012,000E-012,500E-013,000E-013,500E-014,000E-014,500E-01

1 2 3Niv

eles

de

tran

scrip

ción

(ng

de tr

ánsc

rito)

ColesterolGlicerol

Figura 36. Expresión diferencial obtenida mediante RTq-PCR del gen MSMEG_5233 de M. smegmatis mc2155 cultivado en colesterol 1,8 mM comparado con M. smegmatis mc2155 cultivado en glicerol 18 mM. Los niveles de transcripción se midieron mediante RTq-PCR

(véanse los apartados 7.3 y 7.4 de Materiales y Métodos). Las barras de error representan la

desviación estándar calculada. Los valores de P del test t de Student no pareado fueron mayores

de 0,05 en todos los casos, lo que implica que la diferencia de expresión no es estadísticamente

significativa a este nivel de confianza (datos no mostrados). Las parejas de barras colesterol

(azul)/glicerol (morado) se han señalado con los números 1, 2 o 3 que indican el nivel de

transcripción obtenido a partir de distintas cantidades de cDNA: 1: 5 ng, 2: 2 ng y 3: 0,5 ng.

2.8.3 Clonación y expresión heteróloga del gen MSMEG_5233

Para estudiar el papel de la posible colesterol deshidrogenasa codificada por

el gen MSMEG_5233, este se clonó e hiperexpresó en E. coli. Para ello, se

amplificó por PCR y se subclonó en el vector de hiperexpresión pET-29a (+) (tal y

como se hizo con los genes MSMEG_1604 y MSMEG_5228) resultando en el

133

Resultados

plásmido pET5233 (Fig. 37). Este plásmido fue posteriormente transferido a la

cepa E. coli BL21 (DE3).

pGEM®-TEasy (3,0 kb)

ori

ApR

pGEM5233(4 kb)

ApR

ori

KmR

ori

lacI

PT7

Polilinker

pET-29a(+)(5,4 kb)

pET5233(6,4 kb)

KmR

ori

lacI

PT7

MSMEG_5233

NdeI BamHI

5233 pET F 5233 pET R

Ligación

Ligación

Digestión

pGEM®-TEasy (3,0 kb)

ori

ApR

pGEM®-TEasy (3,0 kb)

ori

ApR

pGEM5233(4 kb)

ApR

ori

KmR

ori

lacI

PT7

Polilinker

pET-29a(+)(5,4 kb)

KmR

ori

lacI

PT7

Polilinker

pET-29a(+)(5,4 kb)

pET5233(6,4 kb)

KmR

ori

lacI

PT7

MSMEG_5233

NdeI BamHI

5233 pET F 5233 pET R

Ligación

Ligación

Digestión

Figura 37. Representación esquemática de la construcción del plásmido pET5233. El gen

MSMEG_5233 fue amplificado mediante PCR utilizando la pareja de oligonucleótidos señalada en

la figura (secuencias en Tabla 3 de Materiales y Métodos) y DNA genómico de M. smegmatis

mc2155 como molde. El gen amplificado se clonó en el plásmido pGEM-T easy (dando lugar al

plásmido pGEM5233) y fue subclonado en el vector pET-29a (+) empleando las enzimas de

restricción señaladas en la figura (y que están presentes en los oligonucleótidos utilizados para la

amplificación del gen), dando lugar al plásmido pET5233. Las abreviaturas utilizadas son: ApR, gen

que confiere resistencia a ampicilina; KmR, gen que confiere resistencia a kanamicina; lacI, gen que

codifica el represor LacI; PT7, promotor del gen 10 del fago T7; ori, origen de replicación.

134

Resultados

Los extractos de la cepa recombinante E. coli BL21 (DE3) (pET5233) fueron

analizados mediante SDS-PAGE y aunque se probaron distintas condiciones de

fermentación e inducción con IPTG, con ninguna de ellas se pudo obtener un

extracto en el que fuese visible la proteína en forma soluble. La proteína aparecía

siempre hiperproducida en forma insoluble. Como norma general para posteriores

experimentos se utilizaron las mismas condiciones de inducción que para E. coli

BL21(DE3) (pET1604) (Fig. 38).

66,0

97,4

KDa

21,5

116,0

45,0

31,0

1 2 3

14,4

Figura 38. Gel SDS-PAGE en el que se muestra la expresión de SDRMS en células E. coli BL21 (DE3). En este caso se cargaron como muestra células enteras, ya que no hay proteína

visible en las fracciones celulares solubles expresando esta proteína con las condiciones utilizadas. 1. Marcadores de peso molecular (en el margen izquierdo de la figura se detallan los pesos

moleculares de los marcadores). 2. Células enteras E. coli BL21(DE3) con plásmido pET29 sin

inserto (control negativo de expresión) inducidas 3 h a 20 ºC con 50 μM IPTG. 3. Células enteras E.

coli BL21(DE3) (pET5233) inducidas 3 h a 20 ºC con 50 μM IPTG. El peso molecular de SDRMS se

ajusta al teórico calculado por el programa Compute pI/Mw del servidor Expasy

(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html): 38,68 KDa. La posición aproximada de la proteína se

indica con una flecha roja.

135

Resultados

2.8.4 Cinética enzimática de SDRMS mediante TLC con colesterol marcado con 14C

y 3-β HSD la actividad enzimática de SDRComo en el caso de ChoDMS MS MS

se analizó mediante la técnica de TLC (véanse los apartados 5.4.1 y 9 de

Materiales y Métodos). Se analizaron las muestras procedentes de extractos

proteicos de E. coli BL21(DE3) (pET5233) incubados con colesterol marcado

radiactivamente durante 2, 20, 40 y 60 min a 30 ºC. Los resultados indicaron que

aparecía una marca radiactiva a la altura de la del patrón de 4-colesten-3-ona en

las muestras que expresan SDRMS. Esta marca aumenta su intensidad con el

tiempo de ensayo (Figura 39). En este caso no se aprecia una marca en la zona

de la 6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona.

Estos resultados indican que la SDR posee, al igual que la 3-β HSDMS MS, una

actividad colesterol deshidrogenasa productora de 4-colesten-3-ona a partir de

colesterol, lo que confirma las sospechas de que existe más de una enzima capaz

de catalizar esta reacción en M. smegmatis mc2155.

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

N

H

C

2 min ensayo 20 min 40 min 60 min

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

N

H

CC

2 min ensayo 20 min 40 min 60 min

Figura 39. Producción de productos a partir de colesterol marcado con 14C por extractos celulares solubles expresando la proteína SDRMS. La línea marcada con una C indica la altura a

la que corre el colesterol, la marcada con una N la de la 4-colesten-3-ona y la marcada con una H

la de un producto no identificado que podría tratarse de la 6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona. Las

muestras se cargaron en las placas de TLC a diferentes tiempos de reacción que se indica en la

vertical: 2, 20, 40 y 60 min. Las muestras cargadas proceden de ensayos realizados con: 1. Colesterol oxidasa comercial. 2. Extracto soluble de E. coli BL21 (DE3) (pET5233). 3. Extracto

soluble de E. coli BL21 (DE3) (pET1604) (aquí actúa como control negativo de reacción).

136

Resultados

2.8.5 Ensayos mediante LC/MS de SDRMS

Estos ensayos se realizaron con muestras procedentes de ensayos

enzimáticos con extractos de E. coli BL21 (DE3) (pET5233) para determinar la

actividad colesterol deshidrogenasa a distintos tiempos de reacción hasta un

máximo de 40 min (véanse los apartados 5.4.1 y 8 de Materiales y Métodos). Los

ensayos enzimáticos se realizaron de la misma manera que para su análisis

mediante TLC pero sin adición de colesterol radiactivo. La figura 40 muestra el

espectro MS/MS de 4-colesten-3-ona obtenido por APCI+ para extractos de E. coli

BL21 (DE3) (pET5233) a distintos tiempos. Como se puede observar, en todos

ellos aparece un pico correspondiente a la 4-colesten-3-ona (concretamente el ión

367 procedente a su vez del ión 385 de la 4-colesten-3-ona). Estos resultados

confirmarían los obtenidos mediante ensayos con colesterol radiactivo

visualizados mediante TLC.

Las concentraciones de 4-colesten-3-ona obtenidas en los ensayos a

distintos tiempos con los extractos de E. coli BL21(DE3) (pET5233) fueron

cuantificadas y se muestran en la figura 41.

137

Resultados

Figura 40. Espectro MS/MS de 4-colesten-3-ona obtenido por APCI + a partir de muestras procedentes de ensayos de actividad deshidrogenasa a distintos tiempos con extractos solubles de E. coli BL21(DE3) (pET5233). Se registradó el ión hijo m/z 367 del ión padre m/z 385

de la 4-colesten-3-ona. En la figura se señalan en el primer espectro los picos correspondientes al

colesterol y a la 4-colesten-3-ona. Las muestras proceden de ensayos de actividad deshidrogenasa

realizados durante 2, 20 y 40 min con extractos solubles de E. coli BL21(DE3) (pET5233). Se

puede observar cómo la relación entre las áreas de los picos de colesterol y 4-colesten-3-ona varía

con el tiempo.

Figura 41. Concentración de colesterol y 4-colesten-3-ona hallada a distintos tiempos de ensayo hidroxiesteroide deshidrogenasa con los extractos proteicos de E. coli BL21(DE3) (pET5233).

2,94120,67E. coli BL21(DE3) (pET5233) 40 min

2,91155,32E. coli BL21(DE3) (pET5233) 20 min

n.d.163,46E. coli BL21(DE3) (pET5233) 2 min

Conc. 4-colesten-3-ona (µM) (en los 900 μl)

Conc. colesterol (µM) (en los 900 μl)

MUESTRA

2,94120,67E. coli BL21(DE3) (pET5233) 40 min

2,91155,32E. coli BL21(DE3) (pET5233) 20 min

n.d.163,46E. coli BL21(DE3) (pET5233) 2 min

Conc. 4-colesten-3-ona (µM) (en los 900 μl)

Conc. colesterol (µM) (en los 900 μl)

MUESTRA

Abu

ndan

cia

ra

And

anc

e

0.00 - 60.09

elat

ivbu

ia r

lativ

a

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 600

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100 NL: 7.03E3TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms2 385.00@cid13.50 [105.00-400.00] MS 33-2

Tiempo (min)

Abu

ndan

cia

rela

tiva

Colesterol

4-colesten-3-ona pET5233 2 min

pET5233 20 min

pET5233 40 min

nda

ra

And

anc

e

0.00 - 60.09

ncia

elat

ivbu

ia r

lativ

a

NL: 5.66E3TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms2 385.00@cid13.50 [105.00-400.00] MS 33-22

NL: 5.85E3TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms2 385.00@cid13.50 [105.00-400.00] MS 33-42

Abu

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 600

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100 NL: 7.03E3TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms2 385.00@cid13.50 [105.00-400.00] MS 33-2

Tiempo (min)

Abu

ndan

cia

rela

tiva

Colesterol

4-colesten-3-ona pET5233 2 min

pET5233 20 min

pET5233 40 min

0.00 - 60.09

NL: 5.66E3TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms2 385.00@cid13.50 [105.00-400.00] MS 33-22

NL: 5.85E3TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms2 385.00@cid13.50 [105.00-400.00] MS 33-42

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 600

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100

100

0

20

40

80

60

NL: 7.03E3TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms2 385.00@cid13.50 [105.00-400.00] MS 33-2

Tiempo (min)

Abu

ndan

cia

rela

tiva

Colesterol

4-colesten-3-ona pET5233 2 min

pET5233 20 min

pET5233 40 min

NL: 5.66E3TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms2 385.00@cid13.50 [105.00-400.00] MS 33-22

NL: 5.85E3TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms2 385.00@cid13.50 [105.00-400.00] MS 33-42

138

Resultados

2.8.6 Mutagénesis del gen MSMEG_5233

El gen MSMEG_5233 fue mutado para comprobar si su ausencia afectaba a

la capacidad de de transformación de colesterol en 4-colesten-3-ona de M.

smegmatis, aunque habiendo comprobado la existencia de, por lo menos, otro gen

que codifica una actividad colesterol deshidrogenasa (MSMEG_5228) no se

esperaba una pérdida significativa de la capacidad de crecimiento en colesterol.

La interrupción de MSMEG_5233 se llevó a cabo mediante el método ya descrito

para MSMEG_1604 y MSMEG_5228, la inserción del plásmido no replicativo en

micobacterias pJQ200x tal y como se detalla en el apartado 4.6 de Materiales y

Métodos.

2.8.6.1 Ensayos de crecimiento con el mutante M.

smegmatis::MSMEG_5233

El mutante en MSMEG_5233 se cultivó con colesterol 1,8 mM en β-

ciclodextrina como única fuente de carbono. Como puede observarse en la figura

42, el crecimiento en colesterol no se ve alterado en el mutante M.

smegmatis::MSMEG_5233.

139

Resultados

Figura 42. Crecimiento en colesterol del mutante M. smegmatis::MSMEG_5233 frente a la cepa control M. smegmatis mc2155. Crecimiento en medio mínimo 457 con colesterol 1,8 mM en

β-ciclodextrina como fuente de carbono. M. smegmatis::MSMEG_5233 (línea naranja) representa

al mutante M. smegmatis::MSMEG_5233 y M. smegmatis mc2155 (línea azul) representa a la

cepa no mutada M. smegmatis mc2155.

Crecimiento en colesterol 1,8 mM. M. smegmatis ::MSMEG_5233

0,01

0,1

1

10

0 20 40 60 80

Tiempo (h)

DO

600

M. smegmat is mc²155

M. smegmat is::MSMEG_5233

2.8.6.2 Análisis de la composición del sobrenadante de cultivo en colesterol del mutante M. smegmatis::MSMEG_5233 mediante TLC

El sobrenadante de cultivos del mutante M. smegmatis::MSMEG_5233 en

colesterol se analizó mediante TLC con el fin de comprobar si, a pesar de ser

capaz de crecer en colesterol, se apreciaba alguna diferencia en el perfil de los

intermediarios producidos durante su catabolismo. Las células se cultivaron

durante 24 h en medio mínimo con colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina como

fuente de carbono y tras extraer el sobrenadante se visualizaron las muestras en

placas de TLC (véanse los apartados 5.4.2 y 9 de Materiales y Métodos). Los

resultados indican que este mutante tiene un perfil de intermediarios idéntico a la

cepa salvaje a las 24 h (Fig. 43). Este hecho apoyaría la hipótesis de que la

enzima 3-β HSDMS está más implicada que la enzima SDRMS en la degradación

del colesterol para su aprovechamiento como fuente de carbono y energía,

aunque también apunta hacia la posibilidad de que haya más proteínas implicadas

en este paso enzimático en M. smegmatis.

140

Resultados

Figura 43. Producción de metabolitos a partir de colesterol radiactivo por muestras procedentes de sobrenadante de cultivo del mutante M. smegmatis::MSMEG_5233. La línea

marcada con una C indica la altura a la que corre el colesterol, la marcada con una N la de la 4-

colesten-3-ona y la marcada con una H la de un producto no identificado que podría tratarse de la

6β-hidroperoxi-4-colesten-3-ona. Las muestras cargadas derivan de sobrenadantes de cultivos de

distintas cepas de M. smegmatis crecidas en colesterol 1,8 mM durante 24 h. 1. Control procedente

de un ensayo con colesterol oxidasa comercial. 2. M. smegmatis mc2155. 3. M.

smegmatis::MSMEG_5233.

N

C

H

N

C

H

1 2 3

2.8.6.3 Ensayos de sobrenadante de cultivo en colesterol del mutante M. smegmatis::MSMEG_5233 mediante LC/MS

Para analizar el perfil de intermediarios de la degradación del colesterol en M.

smegmatis::MSMEG_5233, la cepa se creció en medio mínimo con colesterol en

β-ciclodextrina como única fuente de carbono, y se fueron extrayendo alícuotas a

distintos tiempos de incubación para su análisis mediante LC/MS (véanse los

apartados 5.4.2 y 8 de Materiales y Métodos). La desaparición del esteroide no

presenta diferencias entre el mutante y la cepa salvaje, así como tampoco hay

diferencias en la aparición de 4-colesten-3-ona y de otros intermediarios de la ruta

de degradación (26-hidroxi-4-colesten-3-ona, 26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona,

ácido 4-colesten-3-ona-26-oico y ácido 1,4-colestadien-3-ona-26-oico; estructuras

5A, 5B, 6A y 6B de la figura 15 de introducción, respectivamente) (Fig. 44). Los

resultados obtenidos mediante LC/MS coinciden con los observados mediante

141

Resultados

TLC, donde no se apreciaban diferencias en la concentración de colestenona

entre la cepa M. smegmatis::MSMEG_5233 y M. smegmatis mc2155.

26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona

0,00000

0,00100

0,00200

0,00300

0,00400

0,00500

0,00600

0,00700

0 24 48 72

Tiempo (h)

Áre

a de

l com

pues

to/á

rea

del

patr

ón in

tern

oM. smegmatis::MSMEG_5233

M. smegmatis mc2155

Ácido 4-colesten-3-ona-26-oico

0,000000,050000,100000,150000,200000,250000,300000,350000,40000

0 24 48 72

Tiempo (h)

Área

del

com

pues

to/á

rea

del

patró

n in

tern

o

M. smegmatis::MSMEG_5233

M. smegmatis mc2155

Ácido 1,4-colestadien-3-ona-26-oico

0,000000,000200,000400,000600,000800,001000,001200,001400,00160

0 24 48 72

Tiempo (h)

Área

del

com

pues

to/á

rea

del

patró

n in

tern

o

M. smegmatis::MSMEG_5233

M. smegmatis mc2155

Colesterol

0,00000

Figura 44. Perfil de intermediarios de la degradación del colesterol hallado en los sobrenadantes de cultivo en colesterol de M. smegmatis::MSMEG_5233 y M. smegmatis mc2155. Las figuras representan la relación entre las áreas de los compuestos indicados en la

leyenda con respecto al área de la 5-pregnen-3-ol-20-ona, empleado como patrón interno, frente al

tiempo. A. Colesterol; B. 4-colesten-3-ona; C. 26-hidroxi-4-colesten-3-ona; D. 26-hidroxi-1,4-

colestadien-3-ona; E. Ácido 4-colesten-3-ona-26-oico; F. Ácido 1,4-colestadien-3-ona-26-oico.

0,20000

40000

60000

80000

0 24 48 72

Tiempo (h)

Áre

a de

l com

pues

to/á

rea

del

patró

n in

tern

o

0,

0,

0,

M. smegmatis::MSMEG_5233

M. smegmatis mc2155

4-colesten-3-ona

0,000000,005000,010000,015000,020000,025000,030000,035000,04000

0 24 48 72

Tiempo (h)

Área

del

com

pues

to/á

rea

del

patr

ón in

tern

o

M. smegmatis::MSMEG_5233

M. smegmatis mc2155

26-hidroxi-4-colesten-3-ona

0,00000

0,01000

0,02000

0,03000

0,04000

0,05000

0,06000

0,07000

0 24 48 72

Tiempo (h)

Área

del

com

pues

to/á

rea

del

patr

ón in

tern

o

M. smegmatis::MSMEG_5233

M. smegmatis mc2155

C D

E F

BA

Colesterol 4-colesten-3-ona

26-hidroxi-4-colesten-3-ona

Ácido 4-colesten-3-ona-26-oico Ácido 1,4-colestadien-3-ona-26-oico

26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona

0,00000

0,00100

0,00200

0,00300

0,00400

0,00500

0,00600

0,00700

0 24 48 72

Tiempo (h)

Áre

a de

l com

pues

to/á

rea

del

patr

ón in

tern

oM. smegmatis::MSMEG_5233

M. smegmatis mc2155

Ácido 4-colesten-3-ona-26-oico

0,000000,050000,100000,150000,200000,250000,300000,350000,40000

0 24 48 72

Tiempo (h)

Área

del

com

pues

to/á

rea

del

patró

n in

tern

o

M. smegmatis::MSMEG_5233

M. smegmatis mc2155

Ácido 1,4-colestadien-3-ona-26-oico

0,000000,000200,000400,000600,000800,001000,001200,001400,00160

0 24 48 72

Tiempo (h)

Área

del

com

pues

to/á

rea

del

patró

n in

tern

o

M. smegmatis::MSMEG_5233

M. smegmatis mc2155

Colesterol

0,00000

20000

40000

60000

80000

0 24 48 72

Tiempo (h)

Áre

a de

l com

pues

to/á

rea

del

patró

n in

tern

o

0,

0,

0,

0,

M. smegmatis::MSMEG_5233

M. smegmatis mc2155

4-colesten-3-ona

0,000000,005000,010000,015000,020000,025000,030000,035000,04000

0 24 48 72

Tiempo (h)

Área

del

com

pues

to/á

rea

del

patr

ón in

tern

o

M. smegmatis::MSMEG_5233

M. smegmatis mc2155

Colesterol 4-colesten-3-ona

26-hidroxi-4-colesten-3-ona

0,00000

0,01000

0,02000

0,03000

0,04000

0,05000

0,06000

0,07000

0 24 48 72

Tiempo (h)

Área

del

com

pues

to/á

rea

del

patr

ón in

tern

o

M. smegmatis::MSMEG_5233

M. smegmatis mc2155

C D

E F

BA

26-hidroxi-4-colesten-3-ona 26-hidroxi-1,4-colestadien-3-ona

Ácido 4-colesten-3-ona-26-oico Ácido 1,4-colestadien-3-ona-26-oico

142

Resultados

La concentración de colestenona cuantificada en cada punto se muestra en

la tabla 15.

Tabla 15. Concentración de colestenona hallada en los sobrenadantes de cultivo en colesterol de M. smegmatis::MSMEG_5233 y M. smegmatis mc2155 a distintos tiempos.

En el caso de la aparición de hidroxicolesterol, tampoco se aprecian

diferencias significativas entre la cepa M. smegmatis::MSMEG_5233 y M.

smegmatis mc2155 (Fig. 45). En conjunto todos estos resultados obtenidos

mediante LC/MS parecen apuntar a que aunque SDRMS sí transforma el colesterol

en 4-colesten-3-ona, no ejerce un papel principal en este paso, y esto sugiere

nuevamente la posible existencia de más enzimas con esta misma actividad y/o

enzimas que permiten que parte de la degradación de colesterol se efectúe a

través de hidroxicolesterol cuando la enzima 3-β HSDMS no es funcional en M.

smegmatis mc2155.

0,0070,167M. smegmatis mc2155 72h

0,0951,051M. smegmatis mc2155 48h

0,0351,377M. smegmatis mc2155 24h

0,0071,774M. smegmatis mc2155 0h

0,0080,171M. smegmatis::MSMEG_5233 72h

0,0921,200M. smegmatis::MSMEG_5233 48h

0,0271,426M. smegmatis::MSMEG_5233 24h

n.d.1,747M. smegmatis::MSMEG_5233 0h

Conc. 4-colesten-3ona (mM)

Conc. colesterol(mM)

Muestra

0,0070,167M. smegmatis mc2155 72h

0,0951,051M. smegmatis mc2155 48h

0,0351,377M. smegmatis mc2155 24h

0,0071,774M. smegmatis mc2155 0h

0,0080,171M. smegmatis::MSMEG_5233 72h

0,0921,200M. smegmatis::MSMEG_5233 48h

0,0271,426M. smegmatis::MSMEG_5233 24h

n.d.1,747M. smegmatis::MSMEG_5233 0h

Conc. 4-colesten-3ona (mM)

Conc. colesterol(mM)

Muestra

143

Resultados

Figura 45. Perfil de hidroxicolesterol hallado en los sobrenadantes de cultivo en colesterol de M. smegmatis::MSMEG_5233 y M. smegmatis mc2155. Las figuras representan la relación

entre el área de hidroxicolesterol con respecto al área de la 5-pregnen-3-ol-20-ona, empleado

como patrón interno, frente al tiempo.

Hidroxicolesterol

0,0000000,0005000,0010000,0015000,0020000,0025000,0030000,0035000,0040000,004500

0 24 48 72

Tiempo (h)

Área

del

com

pues

to/á

rea

del

patró

n in

tern

o

M. smegmatis::MSMEG_5233

M. smegmatis mc2155

3. Análisis genómico mediante microarrays de la ruta de degradación del colesterol

Para tener una visión global de las zonas del genoma de M. smegmatis

mc2155 implicadas en el catabolismo del colesterol, se realizaron estudios de

expresión diferencial de la cepa cultivada en colesterol 1,8 mM frente a glicerol 18

mM utilizando la técnica de los microarrays y RTq-PCR. (véanse los apartados

7.3, 7.4 y 7.5 de Materiales y Métodos).

Como se detalla más adelante, los resultados obtenidos apoyan el papel de

los reguladores KstR y KstR2 como represores de esta ruta de degradación y

ponen de manifiesto las similitudes existentes para esta ruta entre las especies de

Rhodococcus y Mycobacterium. Así mismo, se han identificado nuevos genes

cuya posible implicación en el catabolismo del colesterol no había sido constatada

en ningún microorganismo hasta el momento.

144

Resultados

3.1 Resultados de los análisis mediante microarrays del genoma de M.

smegmatis mc2155

El análisis de los microarrays reveló que 89 genes se inducían durante su

crecimiento en colesterol al menos 3 veces comparado con el crecimiento en

glicerol. Estos genes inducidos se encuentran repartidos a lo largo de todo el

genoma de M. smegmatis (alojado en el servidor CMR: http://cmr.jcvi.org/tigr-

scripts/CMR/GenomePage.cgi?org=gms) y parecen reflejar una adaptación

fisiológica general de la bacteria al crecimiento en este compuesto policíclico

altamente hidrofóbico. Sin embargo, muchos de ellos se encuentran dentro de dos

regiones localizadas en el genoma (agrupaciones génicas o clusters). Otro grupo

de genes inducidos se encuentra a lo largo de todo el genoma, algunos formando

unidades transcripcionales sencillas y otros dentro de operones.

Para facilitar la presentación del elevado número de genes hallados, se

dividirán en cinco grupos:

- Cluster 1: Abarca la región MSMEG_5990-MSMEG_6042.

Comprende genes que se encuentran bajo el control del represor KstR

o KstR2 (Tabla 16 y Figura 46).

- Cluster 2: Abarca la región MSMEG_5903-MSMEG_5943. Comprende

genes que se encuentran bajo el control del represor KstR (Tabla 17 y

Figura 47).

- Genes no incluidos en el cluster 1 o 2 y que se encuentran bajo el

control del represor KstR (Tabla 18).

- Genes inducidos en colesterol que no presentan motivos de unión

para KstR o KstR2 en su región 5’ (Tabla 19). - Genes bajo el control de KstR que no se encuentran inducidos en

colesterol en nuestros experimentos (Tabla 20).

145

Resultados

Cluster 1 (Tabla 16 y Figura 46) Este cluster abarca 42 kb del cromosoma (MSMEG_5990-MSMEG_6042).

Del total de genes incluidos en esta región, 33 están regulados por KstR o KstR2

como ha sido identificado previamente (Kendall et al., 2007) y en este trabajo,

como se verá más adelante (Kendall et al., 2010) (Tabla 16). Estos genes se

encuentran organizados en 8 posibles operones más algunas unidades

transcripcionales sencillas. Los ensayos mediante microarrays revelaron que 21

de los genes presentan inducción con colesterol (Tabla 16 y Figura 46). Dos de los

genes de este cluster codifican reguladores tipo TetR y han sido ya descritos, se

trata de MSMEG_6042 y MSMEG_6009.

El producto del gen MSMEG_6042 ha sido identificado como el represor

KstR, que controla la expresión de 83 genes relacionados con el metabolismo del

colesterol (Kendall et al., 2007).

El producto del gen MSMEG_6009 ha sido identificado como el represor

KstR2, que controla la expresión de 15 genes adicionales también implicados en

esta ruta degradativa (Kendall et al., 2010).

El primer supuesto operón que aparece en esta región está compuesto por

los genes MSMEG_5995_5994_5993_5992_5991_5990, y muestra una similitud

elevada con el operón igr de M. tuberculosis, el que se ha comprobado

recientemente que es necesario para la utilización del colesterol como fuente de

carbono en esta bacteria, aunque se desconoce su implicación exacta en esta ruta

de degradación (Miner et al., 2009). Estos dos operones micobacterianos son muy

similares a su vez al operón de función desconocida ro04483-04484-04485-04486-

04487-04488 de Rhodococcus jostii RHA1, que también se induce en presencia

de colesterol (van der Geize et al., 2007). Aunque el gen ro4483 (fadE34) no

aparece en el operón de M. smegmatis, tiene una elevada identidad con el gen

MSMEG_6041 localizado lejos de este operón pero en esta misma región

denominada cluster 1. Aunque la inducción de este gen no se detecta mediante

microarrays, sí fue confirmada mediante RTq-PCR (apartado 3.2 de Resultados).

Curiosamente, ambos genes fadE34 de M. smegmatis y Rhodococcus se localizan

contiguos pero en sentido opuesto al regulador KstR, lo que sugiere una

146

Resultados

ordenación genética original común a ambas especies. En M. tuberculosis, el gen

Rv3573c, ortólogo de MSMEG_6041, se encuentra en una posición en el genoma

equivalente a la del gen de M. smegmatis (Figura 48). El gen MSMEG_5990

codifica una supuesta cetoacil-CoA tiolasa (Lpt2). Los genes MSMEG_5993

(fadE29) y MSMEG_5994 (fadE28) codifican dos supuestas acil-CoA

deshidrogenasas, mientras que el gen MSMEG_5991 codifica una proteína similar

a MaoC, una enzima que puede actuar como una enoil-CoA hidratasa frente al

crotonil-CoA (Park y Lee, 2003). Es interesante apuntar que MaoC es homóloga a

la enoil-CoA hidratasa PhaJ1 de Pseudomonas aeruginosa (Tsuge et al., 2000). El

gen MSMEG_5992 también codifica una proteína que contiene en su extremo N-

terminal el típico plegamiento denominado hot-dog que se encuentra en las enoil-

CoA hidratasas que muestran especificidad por el enántiomero (R). En

Pseudomonas se ha visto que estas hidratasas que muestran especificidad por el

enántiomero (R) son enzimas que interconectan la β-oxidación con la biosíntesis

de polihidroxialcanoato. Además, este operón de M. smegmatis presenta el gen

MSMEG_5995, que codifica un citocromo P450 (Cyp125) que también se induce

en colesterol. Como se verá en el apartado 4.3, la mutación de este citocromo

impide el crecimiento en este esteroide, lo que sugiere que este operón puede

estar implicado en la oxidación de la cadena lateral. Curiosamente, en R. jostii

RHA1 el ortólogo de MSMEG_5995 (r04679) aparece alejado de este operón.

Como ya se ha comentado anteriormente, el gen ortólogo a MSMEG_5995 en M.

tuberculosis, Rv3545c, codifica un citocromo implicado en patogénesis (Chang et

al., 2009), y ha sido recientemente propuesto como una hidroxilasa del C27

esteroideo (Capyk et al., 2009b). Por otra parte, la enzima ortóloga en R. jostii

RHA1 parece ser la responsable de iniciar el catabolismo del colesterol en esta

especie, también iniciando la degradación de la cadena lateral (Rosłoniec et al.,

2009).

Contiguo pero en sentido opuesto al gen MSMEG_5995 se encuentra otro

posible operón formado por los genes MSMEG_5996_5997_5998. El gen

MSMEG_5996 codifica una supuesta acetil-CoA acetiltransferasa (tiolasa, FadA5),

y los otros dos genes codifican dos proteínas hipotéticas, una de ellas similar a la

147

Resultados

orf33 de C. testosteroni (MSMEG_5997). Hay que destacar que este gen

MSMEG_5997 no presenta ortólogos ni en M. tuberculosis ni en R. jostii RHA1.

Este nuevo operón también podría estar implicado en la degradación de la

cadena lateral del colesterol, ya que como se ha explicado en el apartado 1.3 de

Resultados hemos constatado la expresión diferencial en colesterol de este

operón mediante RT-PCR semicuantitativa.

Cabe mencionar que la cadena lateral del colesterol muy probablemente se

transforma en un 2-metil ácido graso ramificado (BFA) y por tanto, el primer paso

de la β-oxidación requeriría enzimas adicionales y específicas para oxidar este

BFA.

Otro supuesto operón que se ha identificado en este cluster 1 es el formado

por los genes MSMEG_6001_6002_6003_6004, que son muy similares a las

orfs5-1-2-4 de C. testosteroni, respectivamente. La expresión diferencial de los

genes MSMEG_6001 a MSMEG_6003 se había comprobado anteriormente

mediante RT-PCR semicuantitativa (apartado 1.3 de Resultados). Este operón

está próximo a los genes MSMEG_5999 (que podría formar un operón con

MSMEG_6000) y MSMEG_6008, que son muy similares a las orf27 y orf23 de C.

testosteroni, respectivamente (Horinouchi et al., 2004b) y de los que también se

había visto inducción en colesterol mediante RT-PCR semicuantitativa (apartado

1.3 de Resultados).

Como ya se ha comentado anteriormente, el gen MSMEG_6009 codifica el

represor KstR2 (Kendall et al., 2010), lo que sugiere claramente la implicación de

esta región en el catabolismo del colesterol. Concretamente se encuentran bajo el

control de KstR2 los genes de la región MSMEG_5999-MSMEG_6017, con la

excepción de los genes MSMEG_6005, MSMEG_6006, MSMEG_6007 y

MSMEG_6010 (véase con más detalle en el apartado 5.3 de Resultados).

Aunque se ha propuesto la implicación de todos estos genes en la

mineralización completa del DOHNAA (Figura 5 de Introducción, estructura 15)

sus funciones exactas son todavía desconocidas. Los cuatro primeros genes del

supuesto operón MSMEG_6013_6014_6015_6016_6017 son ortólogos a las

orfs18-21-22-28 de C. testosteroni, respectivamente. La orf18 codifica una

supuesta CoA ligasa de ácidos grasos que parece participar en la degradación del

148

Resultados

DOHNAA en C. testosteroni, mientras que las orfs21-22-28 codifican tres

supuestas acil-CoA deshidrogenasas (Horinouchi et al., 2004b). Mediante RT-PCR

semicuantitativa se observó que estos genes no se inducían en M. smegmatis en

presencia de colesterol, sin embargo mediante microarrays se ven inducidos los

genes MSMEG_6013, MSMEG_6015 y MSMEG_6016 de este operón.

Un operón muy similar a este también se detectó en R. jostii RHA1: fadD3-

ro4594-fadE31-fadE32-fadE33 (van der Geize et al, 2007). Curiosamente, el

supuesto operón contiguo MSMEG_6012_6011 que está localizado en sentido

opuesto es también muy similar al operón conservado en la misma posición en R.

jostii RHA1 (fadE30-ro04597). Ambos operones contienen genes ortólogos a las

orfs30-31 de C. testosteroni que codifican una supuesta FadE30 acil-CoA

deshidrogenasa y una oxidorreductasa, respectivamente, también supuestamente

implicadas en la degradación de DOHNAA (Horinouchi et al., 2004). Los genes

que conforman este posible operón no aparecen inducidos en los microarrays,

aunque sí se ha comprobado su inducción en colesterol mediante RT-PCR

semicuantitativa (apartado 1.3 de Resultados) y RTq-PCR (apartado 3.2 de

Resultados).

Aunque se han descrito varios compuestos como posibles intermediarios de

la mineralización de DOHNAA, la información disponible no permite establecer una

ruta catabólica precisa (Kieslich, 1985). Sin embargo, se asume que el primer

paso en la degradación de este compuesto podría ser la eliminación de su fracción

propionil para producir ácido 9,17-dioxo-1,2,3,4,5,6,10,19-octanorandrostan-7-oico

(Figura 5 introducción, (17)) a través de una β-oxidación típica (Kieslich, 1985). El

gen MSMEG_6013, que codifica una supuesta acil-CoA ligasa podría representar

el primer gen de esta ruta.

Por otra parte, en este cluster 1 se encuentra un supuesto operón catabólico

muy similar al operón hsaADCB de R. jostii RHA1 (van der Geize et al., 2007)

(MSMEG_6038_6037_6036_6035) que codifica cuatro proteínas que comparten

una similitud significativa (33, 34, 42 y 31 % cuantificados por ClustalW), con las

enzimas codificadas por los genes tesA2, tesD, tesB y tesA1, respectivamente, de

C. testosteroni TA441, que transforman el compuesto 3-HSA en DOHNAA y ácido

2-hidroxihexa-2,4-dienoico (Figura 5 de Introducción, estructuras 11-15) durante el

149

Resultados

crecimiento en testosterona (Horinouchi et al., 2001; Horinouchi et al., 2003a;

Horinouchi et al., 2004a). Se confirman así los resultados obtenidos mediante

análisis in silico del genoma de M. smegmatis frente a estos genes de C.

testosteroni así como los análisis mediante RT-PCR semicuantitativa que se

presentaron en el apartado 1.3 de Resultados en los que estos genes presentaban

inducción en colesterol. Este operón es contiguo, pero en dirección opuesta, al

gen MSMEG_6039, probable ortólogo del gen kshB, implicado en la

transformación de ADD en 3-HSA (Figura 5 de introducción, estructuras 9B y 11)

junto con el gen kshA en R. erythropolis (van der Geize et al., 2001; van der Geize

et al., 2002b; van der Geize et al., 2008) y en M. tuberculosis (Capyk et al.,

2009a). El ortólogo de kshA en M. smegmatis es el gen MSMEG_5925, que

codifica la proteína KstH (Andor et al., 2006) y que está localizado lejano a kshB,

en el cluster 2.

150

Resultados

ro04482 Regulador transcripcional de la familia TetR (kstR1)89Rv3574KstR121.99*MSMEG_6042

ro04483 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE34)73Rv3573cKstR1_MSMEG_6041

_Proteína hipotética conservada 30Rv3572KstR1_MSMEG_6040

ro05833Cetoesteroide 9α-hidroxilasa, reductasa (kshB)73Rv3571KstR1_MSMEG_6039

ro04539 Hidroxilasa de producción de pigmento (hsaA)81Rv3570cKstR147.73*MSMEG_6038

ro04540 Hidrolasa del ácido 2-hidroxi-6-cetonona-2,4-dienodioico (hsaD)81Rv3569cKstR131.54*MSMEG_6037

ro04541 Bifenil-2,3-diol 1,2-dioxigenasa (hsaC)81Rv3568cKstR18.33MSMEG_6036

ro04542 Nitrilotriacetato monooxigenasa, componente B (hsaB)79Rv3567cKstR14.14MSMEG_6035

_Proteína hipotética__KstR1_MSMEG_6033

_Aminotransferasa, clase I 80Rv3565KstR2_MSMEG_6017

ro04591Supuesta acil-CoA deshidrogenasa68Rv3564KstR28.98MSMEG_6016

ro04592 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE32)75Rv3563KstR28.61MSMEG_6015

ro04593 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE31)84Rv3562KstR2_MSMEG_6014

ro04595 Probable CoA sintetasa de ácidos grasos(fadD3)74Rv3561KstR28.72MSMEG_6013

ro04596 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE30)84Rv3560cKstR2_MSMEG_6012

ro04597Deshidrogenasa de cadena corta84Rv3559cKstR2_MSMEG_6011

ro04598Regulador transcripcional de la familia TetR (kstR2)73Rv3557cKstR23.29MSMEG_6009

ro04599 Acetil-CoA acetiltransferasa (fadA6)80Rv3556cKstR2_MSMEG_6008

ro04649Oxidorreductasa, familia 2-nitropropano dioxigenasas82Rv3553KstR2_MSMEG_6004

ro04650Coenzima A transferasa, subunidad B 81Rv3552KstR23.32MSMEG_6003

ro04651Coenzima A transferasa, subunidad A 81Rv3551KstR28.41MSMEG_6002

ro04652 Enoil-CoA hidratasa (echA20)86Rv3550KstR25.76MSMEG_6001

ro04653Deshidrogenasa de cadena corta73Rv3549cKstR217.51*MSMEG_6000

ro04654Deshidrogenasa de cadena corta83Rv3548cKstR25.93MSMEG_5999

ro04677Proteína hipotética conservada 49Rv3547KstR117.92*MSMEG_5998

_Proteína hipotética conservada __KstR18.07MSMEG_5997

ro04678 Acetil-CoA acetiltransferasa (fadA5)84Rv3546KstR110.31MSMEG_5996

ro04679Citocromo P450 125 (cyp125)75Rv3545cKstR166.03*MSMEG_5995

ro04484 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE28)73Rv3544cKstR173.05*MSMEG_5994

ro04485 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE29)77Rv3543cKstR149.89*MSMEG_5993

ro04486Proteína hipotética conservada 74Rv3542cKstR122.46*MSMEG_5992

ro04487Supuesto dominio MaoC76Rv3541cKstR123.15*MSMEG_5991

ro04488Proteína de transferencia de lípidos (ltp2)84Rv3540cKstR125.48*MSMEG_5990

7654321

ro04482 Regulador transcripcional de la familia TetR (kstR1)89Rv3574KstR121.99*MSMEG_6042

ro04483 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE34)73Rv3573cKstR1_MSMEG_6041

_Proteína hipotética conservada 30Rv3572KstR1_MSMEG_6040

ro05833Cetoesteroide 9α-hidroxilasa, reductasa (kshB)73Rv3571KstR1_MSMEG_6039

ro04539 Hidroxilasa de producción de pigmento (hsaA)81Rv3570cKstR147.73*MSMEG_6038

ro04540 Hidrolasa del ácido 2-hidroxi-6-cetonona-2,4-dienodioico (hsaD)81Rv3569cKstR131.54*MSMEG_6037

ro04541 Bifenil-2,3-diol 1,2-dioxigenasa (hsaC)81Rv3568cKstR18.33MSMEG_6036

ro04542 Nitrilotriacetato monooxigenasa, componente B (hsaB)79Rv3567cKstR14.14MSMEG_6035

_Proteína hipotética__KstR1_MSMEG_6033

_Aminotransferasa, clase I 80Rv3565KstR2_MSMEG_6017

ro04591Supuesta acil-CoA deshidrogenasa68Rv3564KstR28.98MSMEG_6016

ro04592 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE32)75Rv3563KstR28.61MSMEG_6015

ro04593 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE31)84Rv3562KstR2_MSMEG_6014

ro04595 Probable CoA sintetasa de ácidos grasos(fadD3)74Rv3561KstR28.72MSMEG_6013

ro04596 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE30)84Rv3560cKstR2_MSMEG_6012

ro04597Deshidrogenasa de cadena corta84Rv3559cKstR2_MSMEG_6011

ro04598Regulador transcripcional de la familia TetR (kstR2)73Rv3557cKstR23.29MSMEG_6009

ro04599 Acetil-CoA acetiltransferasa (fadA6)80Rv3556cKstR2_MSMEG_6008

ro04649Oxidorreductasa, familia 2-nitropropano dioxigenasas82Rv3553KstR2_MSMEG_6004

ro04650Coenzima A transferasa, subunidad B 81Rv3552KstR23.32MSMEG_6003

ro04651Coenzima A transferasa, subunidad A 81Rv3551KstR28.41MSMEG_6002

ro04652 Enoil-CoA hidratasa (echA20)86Rv3550KstR25.76MSMEG_6001

ro04653Deshidrogenasa de cadena corta73Rv3549cKstR217.51*MSMEG_6000

ro04654Deshidrogenasa de cadena corta83Rv3548cKstR25.93MSMEG_5999

ro04677Proteína hipotética conservada 49Rv3547KstR117.92*MSMEG_5998

_Proteína hipotética conservada __KstR18.07MSMEG_5997

ro04678 Acetil-CoA acetiltransferasa (fadA5)84Rv3546KstR110.31MSMEG_5996

ro04679Citocromo P450 125 (cyp125)75Rv3545cKstR166.03*MSMEG_5995

ro04484 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE28)73Rv3544cKstR173.05*MSMEG_5994

ro04485 Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE29)77Rv3543cKstR149.89*MSMEG_5993

ro04486Proteína hipotética conservada 74Rv3542cKstR122.46*MSMEG_5992

ro04487Supuesto dominio MaoC76Rv3541cKstR123.15*MSMEG_5991

ro04488Proteína de transferencia de lípidos (ltp2)84Rv3540cKstR125.48*MSMEG_5990

7654321

Tabla 16. Genes inducidos en colesterol en M. smegmatis mc2155 (Cluster 1). Columna 1. Anotación de los genes de M. smegmatis mc2155 que presentan inducción en colesterol. Se

seleccionaron aquellos como mínimo más de 3 veces inducidos y con un valor máximo de P de 0,1,

tras un análisis visual previo de las imágenes escaneadas de los microarrays. Columna 2. Se

muestra el número de veces que cada gen está inducido. Los valores marcados con un asterisco

tienen un valor de P ajustado (FDR) <0,05. Se marcan con una línea aquellos casos en los que los

valores de inducción no se ajustaban a los parámetros seleccionados y por tanto fueron

descartados. Columna 3. Regulón al que pertenece cada gen (KstR o KstR2). Columna 4. Genes

similares en M. tuberculosis H37Rv. Columna 5. Porcentaje de identidad (ClustalW) entre los

genes de M. smegmatis y M. tuberculosis. Columna 6. Descripción de los productos de los genes.

151

Resultados

Entre paréntesis se indica, de tener uno asignado, el nombre del gen. Columna 7. Genes similares

en R. jostii RHA1 que también presentan inducción en colesterol (van der Geize et al, 2007).

Figura 46. Representación esquemática de la disposición en el genoma de los genes de M. smegmatis mc2155 incluidos en el cluster 1. Se señalan con una estrella aquellos genes que

presentan inducción en colesterol en los microarrays. Los números que se muestran por debajo de

los genes señalan el número de pb entre genes adyacentes. Los números entre corchetes indican

separación y los números entre paréntesis solapamiento. Los números que aparecen sobre las

líneas en diagonal indican las posiciones del genoma, en kb, entre las que se encuentran las

distintas agrupaciones génicas.

5996 5999 6001 60046002 600360005997 5998

6035 6036 6037 6038 6039

6102

59955994

6033 6034 6040 6041 6042

6110

6013 6014 6015 6016

6082

5993599259915990

6011 60126010

60076005 6006 60096008

6056

6017

(4) (19) (4) (1) [18] [124] [2] [7] [77] [15] [61] (4) (4) (4) [43] (4) [7] [88] (8) [314]

[125] (4) [105] (1) (4) (4) [17] (133) [142] [7] (0) [2] [159] [42] [80] [263]

5996 5999 6001 60046002 600360005997 5998

6035 6036 6037 6038 6039

6102

59955994

6033 6034 6040 6041 6042

6110

6013 6014 6015 6016

6082

5993599259915990

6011 60126010

60076005 6006 60096008

6056

6017

(4) (19) (4) (1) [18] [124] [2] [7] [77] [15] [61] (4) (4) (4) [43] (4) [7] [88] (8) [314]

[125] (4) [105] (1) (4) (4) [17] (133) [142] [7] (0) [2] [159] [42] [80] [263]

Cluster 2 (Tabla 17 y figura 47) El segundo cluster de genes inducidos en colesterol comprende una zona de

50 kb en el cromosoma de M. smegmatis mc2155 (MSMEG_5903-MSMEG_5943).

Del total de genes incluidos en esta región, 24 están regulados por KstR (Tabla

17) y aparecen organizados en 8 posibles operones. De ellos, 16 genes presentan

inducción en colesterol en nuestros ensayos de expresión con los microarrays

(Tabla 17 y Figura 47).

El primer supuesto operón incluido en este cluster comprende los genes

MSMEG_5904_5903, y ambos presentan inducción en colesterol. El gen hsd4A,

ortólogo a MSMEG_5903 en R. jostii RHA1, junto con otros cuatro genes, hsd4B,

fadD19, fadE26 y ltp3, que también están inducidos por colesterol, y que se

corresponden con los genes MSMEG_5943, MSMEG_5914, MSMEG_5906 y

MSMEG_5923 de M. smegmatis también presentes en este cluster e inducidos por

152

Resultados

colesterol, parece que podría llevar a cabo un ciclo completo de β- oxidación, ya

que codifican todas las enzimas necesarias para realizar este proceso (van der

Geize et al., 2007). Por tanto, estos genes podrían estar implicados en la

degradación de la cadena lateral del colesterol. Además, Hsd4A es homóloga al

dominio N-terminal de la 17β-hidroxiesteroide deshidrogenasa IV de eucariotas

(17βHSD4) (Mindnich et al., 2004). Este dominio actúa como una 17β-

hidroxiesteroide deshidrogenasa y, en presencia de ácidos grasos ramificados y

ácidos biliares, como una D-3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa. Hsd4B es

homóloga al dominio central de esta 17βHSD4, que es una 2-enoil acil-CoA

hidratasa de la que se ha propuesto que puede estar implicada en el acortamiento

de la cadena lateral del colesterol. Estas homologías apoyarían la implicación de

Hsd4A y Hsd4B en la transformación a través de un ciclo de β-oxidación de la

cadena lateral del C17 para dar lugar a propionil-CoA y acetil-CoA (van der Geize

et al., 2007).

También en Rhodococcus se ha identificado otro grupo de genes, echA19,

fadD17, fadE27 y ltp4, relacionados con la β-oxidación (van der Geize et al., 2007)

cuyos ortólogos en M. smegmatis se sitúan así mismo en este cluster 2. Estos

genes de Rhodococcus presentan una menor inducción por colesterol que los

anteriormente señalados. Los genes ortólogos en M. smegmatis son

MSMEG_5915, MSMEG_5908, MSMEG_5907 y MSMEG_5922,

respectivamente. Todos ellos se encuentran inducidos por colesterol o dentro de

un operón que presenta inducción por colesterol según los datos obtenidos

mediante microarrays (Fig. 47).

Dentro de este cluster 2 de M. smegmatis encontramos así mismo el gen

MSMEG_5925, ortólogo del gen kshA de R. erythropolis y que en M. smegmatis

codifica la proteína KstH (Andor et al., 2006). KstH está implicada en la

hidroxilación del ADD que conlleva, tras la apertura espontánea del anillo A, a su

transformación en 3-HSA (Figura 5 de introducción, estructuras 9B, 10B y 11).

Como se ha comentado anteriormente, la proteína KshA de Rhodococcus y M.

tuberculosis actúa junto con la proteína KshB (cuyo ortólogo en M. smegmatis es

el gen MSMEG_6039) para llevar a cabo esta transformación (Capyk et al., 2009a;

van der Geize et al., 2001; van der Geize et al., 2002b). Hasta la fecha se

153

Resultados

desconoce si en M. smegmatis sucede lo mismo. El gen MSMEG_5925 se

organiza dentro de un posible operón MSMEG_5925_5927, lo que sugiere la

participación del gen MSMEG_5927, que codifica una proteína hipotética, en esta

ruta catabólica.

Finalmente, en este cluster 2 se encuentra también el posible operón

hsaEGF (MSMEG_5940_5939_5937) que codifica proteínas que comparten una

alta similitud de secuencia de aminoácidos (39, 55 y 46 % cuantificados por

ClustalW, respectivamente) con las enzimas codificadas por los genes tesEFG de

C. testosteroni, que transforman el ácido 2-hidroxi-2,4-hexadienoico (Figura 5 de

introducción, estructura 14) en propionil-CoA y piruvato durante la degradación de

la testosterona (Horinouchi et al, 2003). La inducción de este operón de M.

smegmatis en presencia de colesterol ya se había observado mediante ensayos

de RT-PCR semicuantitativa (véase el apartado 1.3 de resultados). Este operón es

contiguo, pero su transcripción es opuesta, a la del gen kstD (MSMEG_5941) cuyo

producto transforma el AD en ADD (Figura 5 de introducción, estructuras 9A y 9B)

(Brzostek et al, 2005). Es interesante apuntar que los operones hsaEGF y

hsaADCB (comentados en el apartado anterior) se disponen en posiciones

adyacentes en R. jostii RHA1 y C. testosteroni (excepto el gen tesB, que en en

este microorganismo parece hallarse aislado del resto), pero se encuentran

considerablemente alejados en M. smegmatis y M. tuberculosis.

154

Resultados

ro04531Supuesta enzima peroxisomal multifuncional tipo 2 (hsd4B)73Rv35389.09MSMEG_5943

ro045323-cetoesteroide deshidrogenasa (kstD)82Rv353713.00*MSMEG_5941

ro045332-ceto-4-pentenoato hidratasa (hsaE)78Rv3536c_MSMEG_5940

ro04534Acetaldehido deshidrogenasa (hsaG)83Rv3535c13.30*MSMEG_5939

ro045354-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa (hsaF)89Rv3534c7.23MSMEG_5937

_conserved hypothetical protein80Rv3531c_MSMEG_5932

ro04537Proteína hipotética conservada 62Rv35274.71MSMEG_5927

ro04538Cetoesteroide-9α-hidroxilasa (kstH, kshA)79Rv35266.91MSMEG_5925

ro046833-ceto-acil-CoA tioloasa (ltp3)87Rv352332.15*MSMEG_5923

ro046843-ceto-acil-CoA tioloasa (ltp4)80Rv352227.42*MSMEG_5922

ro04685Proteína hipotética conservada 76Rv352112.05*MSMEG_5921

ro04686Monooxigenasa FMN-dependiente 85Rv3520c_MSMEG_5920

ro04586Monooxigenasa66Rv3519_MSMEG_5919

ro04588Citocromo P450 monooxigenasa (cyp142)78Rv3518c_MSMEG_5918

ro04688Enoil-CoA hidratasa (echA19)82Rv351613.74MSMEG_5915

ro04689Acil-CoA sintasa (fadD19)83Rv3515c7.19MSMEG_5914

_Dioxigenasa__3.55MSMEG_5913

_Regulador transcripcional similar a AraC_MSMEG_5911

_Oxidorreductasa___MSMEG_5909

ro04691Acil-CoA sintasa (fadD17)65Rv3506_MSMEG_5908

ro04692Acil-CoA deshidrogenasa (fadE27)74Rv350510.74MSMEG_5907

ro04693Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE26)84Rv35049.59MSMEG_5906

ro04694Ferredoxina (fdxD)80Rv3503c7.34MSMEG_5904

ro04695Proteína de la familia deshidrogenasas/reductasas de

cadena corta (hsd4A)72Rv3502c3.33MSMEG_5903

654321

ro04531Supuesta enzima peroxisomal multifuncional tipo 2 (hsd4B)73Rv35389.09MSMEG_5943

ro045323-cetoesteroide deshidrogenasa (kstD)82Rv353713.00*MSMEG_5941

ro045332-ceto-4-pentenoato hidratasa (hsaE)78Rv3536c_MSMEG_5940

ro04534Acetaldehido deshidrogenasa (hsaG)83Rv3535c13.30*MSMEG_5939

ro045354-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa (hsaF)89Rv3534c7.23MSMEG_5937

_conserved hypothetical protein80Rv3531c_MSMEG_5932

ro04537Proteína hipotética conservada 62Rv35274.71MSMEG_5927

ro04538Cetoesteroide-9α-hidroxilasa (kstH, kshA)79Rv35266.91MSMEG_5925

ro046833-ceto-acil-CoA tioloasa (ltp3)87Rv352332.15*MSMEG_5923

ro046843-ceto-acil-CoA tioloasa (ltp4)80Rv352227.42*MSMEG_5922

ro04685Proteína hipotética conservada 76Rv352112.05*MSMEG_5921

ro04686Monooxigenasa FMN-dependiente 85Rv3520c_MSMEG_5920

ro04586Monooxigenasa66Rv3519_MSMEG_5919

ro04588Citocromo P450 monooxigenasa (cyp142)78Rv3518c_MSMEG_5918

ro04688Enoil-CoA hidratasa (echA19)82Rv351613.74MSMEG_5915

ro04689Acil-CoA sintasa (fadD19)83Rv3515c7.19MSMEG_5914

_Dioxigenasa__3.55MSMEG_5913

_Regulador transcripcional similar a AraC_MSMEG_5911

_Oxidorreductasa___MSMEG_5909

ro04691Acil-CoA sintasa (fadD17)65Rv3506_MSMEG_5908

ro04692Acil-CoA deshidrogenasa (fadE27)74Rv350510.74MSMEG_5907

ro04693Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE26)84Rv35049.59MSMEG_5906

ro04694Ferredoxina (fdxD)80Rv3503c7.34MSMEG_5904

ro04695Proteína de la familia deshidrogenasas/reductasas de

cadena corta (hsd4A)72Rv3502c3.33MSMEG_5903

654321

Tabla 17. Cluster 2 de genes inducidos en colesterol en M. smegmatis mc2155. Columna 1. Anotación de los genes de M. smegmatis mc2155 que presentan inducción en colesterol. Se

seleccionaron aquellos como mínimo más de 3 veces inducidos y con un valor máximo de P de 0,1,

tras un análisis visual previo de las imágenes escaneadas de los microarrays. Columna 2. Se

muestra el número de veces que cada gen está inducido. Los valores marcados con un asterisco

tienen un valor de P ajustado (FDR) <0,05. Se marcan con una línea aquellos casos en los que los

valores de inducción no se ajustaban a los parámetros seleccionados y por tanto fueron

descartados. Columna 3. Genes similares en M. tuberculosis H37Rv. Columna 4. Porcentaje de

identidad (ClustalW) entre los genes de M. smegmatis y M. tuberculosis. Columna 5. Descripción

de los productos de los genes. Entre paréntesis se indica, de tener uno asignado, el nombre del

gen. Columna 6. Genes similares en R. jostii RHA1 que también presentan inducción en colesterol

(van der Geize et al., 2007).

155

Resultados

Figura 47. Representación esquemática de la disposición en el genoma de los genes de M. smegmatis mc2155 incluidos en el cluster 2. Se señalan con una estrella aquellos genes que

presentan inducción en colesterol en los microarrays. Los números que se muestran por debajo de

los genes señalan el número de pb entre genes adyacentes. Los números entre corchetes indican

separación y los números entre paréntesis solapamiento. Los números que aparecen sobre las

líneas en diagonal indican las posiciones del genoma, en kb, entre las que se encuentran las

distintas agrupaciones génicas.

59245923 5926592759255922

5963

59435939 59415940

6003

5936 59385921

59155913 59145907 59085906590559045903

5989

59375928

59105911 59165912 5918 5919

5995

59205917

[42] [133] (65) [19] [2] (4) (46) (64) [127] [3] [10] [68] [54] [275] [71] (4) [43] [159]

5909

[39] (1) [158] [104] (1) (4) [35] [86] (4) [38] [73] [1]

59245923 5926592759255922

5963

59435939 59415940

6003

5936 59385921

59155913 59145907 59085906590559045903

5989

59375928

59105911 59165912 5918 5919

5995

59205917

[42] [133] (65) [19] [2] (4) (46) (64) [127] [3] [10] [68] [54] [275] [71] (4) [43] [159]

5909

[39] (1) [158] [104] (1) (4) [35] [86] (4) [38] [73] [1]

156

Resultados

157

tesBO

RF1

23

45

2122

2325

2627

2830

3134

3332

tesDtesA

1tesE

tesGtesF

OR

F18O

RF17

tesItesH

tesA2

Com

amonas

testosteroniTA441

Rhodococcus

jostiiRH

A1

59965999

60016004

60026003

60005997

5998

60356036

60376038

6039

6102

59245923

59265927

59255922

599559946033

60346040

5963 Mycobacterium

smegm

atism

c²155

hsaEhsaG

hsaFro04536

ro04537kshA

hsaAhsaD

hsaChsd4B

hsaBkstD

gabD3

4789

4842

47764733

4724ro04481kstR

fadE34fadE28

fadE29ro04486

ro04487ltp2

ro04489

ro04590fadE33

fadE32fadE31

ro04594fadD

3fadE30

ro04597fadA

6ro04598

ro04600

48534902ro04648

ro04649ro04650

ro04651echA20

ro04653ro04654

ro04655

4909

4929ro04677fadA

5ro04681

ro04682ltp3

ltp4ro04685

ro04687ro04686

ro04679ro04680

fadD19

ro04690ro04694

echA19fadD

17fadE27

fadE26hsd4A

ro04696

495160416042

6110

60136014

60156016

6082

59935992

59915990

60116012

60106007

60056006

60096008

59435939

59415940

6005

59365938

5942

59215909

59155913

59145907

59085906

59055904

5903

9946056

5989

5

Mycobacterium

tuberculosisH

37 Rv

3534c3537

35383539

3536c3535c

3540c3541c

3542c3543c

3544c3545c

35463547

35503551

35523553

3548c3549c

3557c3560c

3554

35583561

3559c3562

35633565

35713572

35643567c

3568c3569c

3566c3570c

3573c

4018

3574

3972

3566A3556c

3555c

35213522

35253524

35233527

3526

3965

3515c3504

3505

39513925

3921

3502c3503c

Genes inducidos en colesterol 1,8 m

Men los m

icroarrays

6017

5937

5928

3516

59165918

59195920

5917

3518c3520

35173519

tesBO

RF1

23

45

2122

2325

2627

2830

3134

3332

tesDtesA

1tesE

tesGtesF

OR

F18O

RF17

tesItesH

tesA2

Com

amonas

testosteroniTA441

Rhodococcus

jostiiRH

A1

59965999

60016004

60026003

60005997

5998

60356036

60376038

6039

6102

59245923

59265927

59255922

599559946033

60346040

5963 Mycobacterium

smegm

atism

c²155

hsaEhsaG

hsaFro04536

ro04537kshA

hsaAhsaD

hsaChsd4B

hsaBkstD

gabD3

4789

4842

47764733

4724ro04481kstR

fadE34fadE28

fadE29ro04486

ro04487ltp2

ro04489

ro04590fadE33

fadE32fadE31

ro04594fadD

3fadE30

ro04597fadA

6ro04598

ro04600

48534902ro04648

ro04649ro04650

ro04651echA20

ro04653ro04654

ro04655

4909

4929ro04677fadA

5ro04681

ro04682ltp3

ltp4ro04685

ro04687ro04686

ro04679ro04680

fadD19

ro04690ro04694

echA19fadD

17fadE27

fadE26hsd4A

ro04696

495160416042

6110

60136014

60156016

6082

59935992

59915990

60116012

60106007

60056006

60096008

59435939

59415940

6005

59365938

5942

59215909

59155913

59145907

59085906

59055904

5903

9946056

5989

5

Mycobacterium

tuberculosisH

37 Rv

3534c3537

35383539

3536c3535c

3540c3541c

3542c3543c

3544c3545c

35463547

35503551

35523553

3548c3549c

3557c3560c

3554

35583561

3559c3562

35633565

35713572

35643567c

3568c3569c

3566c3570c

3573c

4018

3574

3972

3566A3556c

3555c

35213522

35253524

35233527

3526

3965

3515c3504

3505

39513925

3921

3502c3503c

Genes inducidos en colesterol 1,8 m

Men los m

icroarrays

6017

5937

5928

3516

59165918

59195920

5917

3518c3520

35173519

Resultados

Figura 48. Representación esquemática de las zonas del genoma que abarcarían los denominados en este trabajo cluster 1 y 2 en M. smegmatis mc2155 y zonas relacionadas encontradas en los genomas de C. testosteroni TA441, R. jostii RHA1 y M. tuberculosis H37Rv. Los genes supuestos ortólogos de los distintos organismos se han coloreado de manera

idéntica y el número que los representa es su denominación en las bases de datos. Los números

que aparecen sobre las líneas en diagonal indican las posiciones del genoma, en kb, entre las que

se encuentran las distintas agrupaciones génicas.

Genes no incluidos en el cluster 1 o 2 y que se encuentran bajo el control del represor KstR (Tabla 18)

Aparte de las dos grandes regiones del genoma de M. smegmatis que se

acaban de describir (cluster 1 y 2) que incluyen una gran cantidad de genes

supuestamente relacionados con el catabolismo del colesterol, a lo largo de todo

el genoma de M. smegmatis nos encontramos con genes no agrupados en ningún

gran cluster metabólico definido que se encuentran inducidos en colesterol según

se ha comprobado en los experimentos de expresión mediante microarrays. En

este apartado se tratará de aquellos genes que, además de inducirse en presencia

del esteroide, están precedidos por secuencias que pueden funcionar como

operadores para el regulador KstR, lo que sugiere que se inducen directamente

por colesterol y por tanto estarían muy probablemente implicados en su

metabolismo. Cabe destacar que ninguno de los genes incluidos en este apartado

tienen ortólogos en R. jostii RHA1 que se hayan observado inducidos por

colesterol en esta bacteria (van der Geize et al., 2007). El gen MSMEG_0302,

aunque no presentó inducción en colesterol mediante microarrays se ha incluido

en este grupo de genes, ya que se encuentra formando parte de un operón que sí

presentó inducción en colesterol.

El primero y más significativo de estos genes es el gen MSMEG_0217, que

codifica una alcohol deshidrogenasa B, y es muy similar a genes implicados en la

oxidación de alcoholes primarios. Se induce de manera muy notable en colesterol,

más de 20 veces, y su mutagénesis produce una disminución de la capacidad de

crecimiento en colesterol de M. smegmatis (véase el apartado 4.4 de Resultados).

158

Resultados

Por todo ello postulamos que podría catalizar la oxidación de la 26-hidroxi-4-

colesten-3-ona a ácido 4-colesten-3-ona-26-oico (figura 5 de Introducción,

estructuras 5A y 6A).

La región situada desde el gen MSMEG_0302 al gen MSMEG_0310 incluye

8 genes organizados en 3 supuestos operones, i) MSMEG_0305_0304_0302, ii)

MSMEG_0306_0307_0308 y iii) MSMEG_0309_0310, de los cuales el primero y el

último poseen sitios de unión para KstR en las regiones que los preceden. En los

ensayos de expresión con microarrays aparecen inducidos en colesterol los genes

MSMEG_0304, MSMEG_0305 y MSMEG_0309. El producto del gen

MSMEG_0305 presenta similitud con aciltransferasas implicadas en la biosíntesis

de fosfolípidos; el gen MSMEG_0304 codifica una posible acil-CoA sintetasa y el

gen MSMEG_0302 codifica una posible esterasa. El gen MSMEG_0309 codifica

una proteína que tiene similitud con las 5-carboximetil-2-hidroximuconato

semialdehido deshidrogenasas y succinato-semialdehido deshidrogenasas, por lo

que podría participar en los pasos finales de degradación de colesterol a

succinato. El gen MSMEG_0310 codifica una proteína que presenta similitud con

la familia de las metiltransferasas S-adenosilmetionina dependientes (SAM o

AdoMet-MTase) de clase I.

El gen MSMEG_1098 (fadD18) codifica una acil-CoA sintetasa y el gen

MSMEG_1410 una deshidrogenasa/reductasa de cadena corta, y ambos podrían

estar implicados en la degradación de la cadena lateral del colesterol.

Los genes MSMEG_3515, MSMEG_3516 y MSMEG_3519 están bajo el

control de KstR y también aparecen inducidos en presencia de colesterol. Aunque

están localizados próximos en el cromosoma no forman parte de un operón, ya

que el gen MSMEG_3515 es divergente a los genes MSMEG_3516 y

MSMEG_3519. Se desconoce el papel que podrían jugar estos genes en la ruta

catabólica del colesterol. El gen MSMEG_3515 codifica una hidroxiesteroide

deshidrogenasa, el gen MSMEG_3516 una proteína hipotética conservada que

parece relacionada con la actividad dihidrodipicolinato reductasa que participa en

la biosíntesis de la lisina y el producto del gen MSMEG_3519 ha sido identificado

como una 2-nitropropano dioxigenasa (NDP), enzima implicada en la

desnitrificación oxidativa de nitroalcanos a sus correspondientes compuestos

159

Resultados

carbonilo y nitritos. NDP pertenece a la familia de las flavin oxidorreductasas

NADP(H)-dependientes. La mutación de este gen en M. smegmatis no altera la

capacidad de crecimiento en colesterol de la bacteria (véase el apartado 4.6 de

Resultados).

El posible operón formado por los genes MSMEG_3843_3844 también se

encuentra inducido en colesterol. El gen MSMEG_3843 presenta un dominio de

función desconocida, y el gen MSMEG_3844 podría estar relacionado con la

biosíntesis y degradación de polisacáridos y lipopolisacáridos de superficie.

El gen MSMEG_5228, que codifica una 3β-hidroxiesteroide

deshidrogenasa/isomerasa (3-β HSDMS) y que se ha estudiado en profundidad en

esta Tesis doctoral, se sitúa dentro de este conjunto de genes. Las observaciones

de que presente un motivo de unión para KstR y de que se induzca en colesterol

en los ensayos de expresión con microarrays apoyan su implicación directa en

esta ruta catabólica actuando en la transformación de colesterol en 4-colesten-3-

ona. Relacionado con este aspecto hay que señalar que se ha demostrado en este

trabajo que el gen MSMEG_5233, que codifica una deshidrogenasa de cadena

corta (SDRMS), puede también catalizar el paso de colesterol a 4-colesten-3-ona.

Además este gen presenta en la región que lo precede un motivo de unión para

KstR, aunque curiosamente este gen no se encuentra inducido en una cepa con el

regulador KstR delecionado (Kendall et al., 2007). Así mismo, este gen no aparece

inducido en colesterol en los ensayos de expresión con microarrays, aunque se

puede apreciar una ligera inducción en RTq-PCR (véase apartado 2.8.2 de

resultados) lo que sugiere que también podría estar directamente implicado en

esta ruta de degradación.

Por último, el gen MSMEG_5520, que codifica una proteína hipotética,

también se encuentra claramente inducido en colesterol.

160

Resultados

Tabla 18. Genes inducidos en colesterol en M. smegmatis mc2155 no incluidos en el cluster 1 o 2 y que se encuentran bajo el control del represor KstR. Columna 1. Anotación de los

genes de M. smegmatis mc2155 que presentan inducción en colesterol. Se seleccionaron aquellos

como mínimo más de 3 veces inducidos y con un valor máximo de P de 0,1, tras un análisis visual

previo de las imágenes escaneadas de los microarrays. Columna 2. Se muestra el número de

veces que cada gen está inducido. Los valores marcados con un asterisco tienen un valor de P

ajustado (FDR) <0,05. Se marcan con una línea aquellos casos en los que los valores de inducción

no se ajustaban a los parámetros seleccionados y por tanto fueron descartados. Columna 3. Genes similares en M. tuberculosis H37Rv. Columna 4. Porcentaje de identidad (ClustalW) entre

los genes de M. smegmatis y M. tuberculosis. Columna 5. Descripción de los productos de los

genes. Entre paréntesis se indica, de tener uno asignado, el nombre del gen. Columna 6. Genes

similares en R. jostii RHA1 que también presentan inducción en colesterol (van der Geize et al.,

2007). Como se muestra en la tabla, no se halló ningún gen similar a los genes de Mycobacterium

en este microorganismo que estuviese inducido en colesterol en los microarrays.

_Proteína hipotética conservada 84Rv0953c16.77*MSMEG_5520

_3-β hidroxiesteroide deshidrogenasa/isomerasa77Rv1106c5.01MSMEG_5228

_Proteína de transferencia de lípidos91Rv1627c5.52MSMEG_3844

_Proteína hipotética conservada 73Rv1628c9.3MSMEG_3843

_Oxidorreductasa, 2-nitropropano dioxigenasa89Rv1894c10.90MSMEG_3519

_Proteína hipotética conservada 60Rv0926c10.20MSMEG_3516

_3-α-(o 20-β)-hidroxiesteroide deshidrogenasa 60Rv200210.42MSMEG_3515

_Deshidrogenasa/reductasa de cadena corta 76Rv06879.25MSMEG_1410

_Acil-CoA sintasa (fadD8)80Rv0551c8.04MSMEG_1098

_Aldehido deshidrogenasa 68Rv0223c9.89MSMEG_0309

_Proteína de dominio aciltransferasa65Rv1428c18.89*MSMEG_0305

_Acil-CoA sintasa (fadD12)76Rv1427c8.61MSMEG_0304

_Esterasa (lipO)59Rv1426c_MSMEG_0302

_Alcohol deshidrogenasa B (adhE1)31Rv0162c22.92*MSMEG_0217

654321

_Proteína hipotética conservada 84Rv0953c16.77*MSMEG_5520

_3-β hidroxiesteroide deshidrogenasa/isomerasa77Rv1106c5.01MSMEG_5228

_Proteína de transferencia de lípidos91Rv1627c5.52MSMEG_3844

_Proteína hipotética conservada 73Rv1628c9.3MSMEG_3843

_Oxidorreductasa, 2-nitropropano dioxigenasa89Rv1894c10.90MSMEG_3519

_Proteína hipotética conservada 60Rv0926c10.20MSMEG_3516

_3-α-(o 20-β)-hidroxiesteroide deshidrogenasa 60Rv200210.42MSMEG_3515

_Deshidrogenasa/reductasa de cadena corta 76Rv06879.25MSMEG_1410

_Acil-CoA sintasa (fadD8)80Rv0551c8.04MSMEG_1098

_Aldehido deshidrogenasa 68Rv0223c9.89MSMEG_0309

_Proteína de dominio aciltransferasa65Rv1428c18.89*MSMEG_0305

_Acil-CoA sintasa (fadD12)76Rv1427c8.61MSMEG_0304

_Esterasa (lipO)59Rv1426c_MSMEG_0302

_Alcohol deshidrogenasa B (adhE1)31Rv0162c22.92*MSMEG_0217

654321

Genes inducidos en colesterol que no presentan motivos de unión para KstR o KstR2 (Tabla 19)

Existen 37 genes a lo largo del genoma de M. smegmatis que presentan

inducción en colesterol en los microarrays pero que no están precedidos por

secuencias que puedan funcionar como operadores para los reguladores KstR o

161

Resultados

KstR2. Muchos de ellos parecen estar inducidos por una respuesta de estrés

general provocada por el cultivo del microorganismo en un medio que incluye un

compuesto altamente hidrofóbico como es el colesterol. Otros parecen poder

participar genuinamente en el catabolismo de este compuesto, y para otros su

posible función y el motivo de su inducción en colesterol es desconocido.

La región MSMEG_1203-1205-1206 incluye dos genes que forman un

posible operón (MSMEG_1205_1203) y poseen ortólogos en M. tuberculosis

(Rv0644c y Rv0645c, respectivamente) y el gen MSMEG_1206, situado a 220 bp

en la región 5’ de este operón, y que codifica una proteína hipotética sin ortólogo

en M. tuberculosis. La inducción del operón MSMEG_1205_1203 en presencia de

colesterol podría deberse a una respuesta a estrés, ya que los productos de

MSMEG_1203 y MSMEG_1205 pueden identificarse como una sintasa 1 de ácido

metoximicólico y una sintasa 1 de ciclopropano-acil-fosfolípido respectivamente, y

están muy probablemente implicadas en la biosíntesis de ácidos micólicos, que

podría ser necesaria para reparar el posible daño causado por el colesterol en la

pared celular micobacteriana.

Un caso diferente es el del gen MSMEG_1366 (mceG en M. tuberculosis),

muy probablemente implicado en el transporte del colesterol junto con el locus

mce, situado en otra región del genoma. Se ha postulado que el gen mceG

codifica una ATPasa responsable de aportar la energía necesaria para la

traslocación del colesterol (Pandey y Sassetti, 2008). En esta Tesis doctoral se ha

comprobado que un mutante en este gen tiene reducida drásticamente su

capacidad de crecimiento en colesterol (véase el apartado 4.2 de Resultados), por

lo que su implicación en esta ruta catabólica parece demostrada.

El gen MSMEG_1543 codifica una aldehido deshidrogenasa inducible por

EPTC (S-etil dipropiltiocarbamato). Un mutante en este gen no tiene alterada su

capacidad de crecimiento en colesterol (véase apartado 4.5 de resultados), por lo

que posiblemente se trate de un gen inducido por respuesta a estrés. Un supuesto operón que también parece inducido como consecuencia de

una respuesta a estrés es el constituido por los genes

MSMEG_1683_1682_1681_1680_1679_1677. Las proteínas codificadas por estos

genes no parecen estar en absoluto relacionadas con el catabolismo del

162

Resultados

colesterol: el gen MSMEG_1677 codifica una supuesta aspartato-amonio liasa, el

gen MSMEG_1679 una amidasa/aminoacilasa/carboxipeptidasa metal-

dependiente, el gen MSMEG_1680 una proteína de función desconocida, el gen

MSMEG_1681 un dominio conservado (que ha sido implicado en diferentes

funciones como la biosíntesis de isoleucina y purina, la degradación anaeróbica de

treonina y el mantenimiento del DNA mitocondrial), el gen MSMEG_1682 codifica

una supuesta flavoproteína implicada en el transporte del ión potasio y el gen

MSMEG_1683 una permeasa para citosina/purinas, uracilo, tiamina y alantoína.

El gen MSMEG_1786 codifica un supuesto dominio STAS (transportador de

sulfato y antagonista anti-sigma) que también podría inducirse en respuesta a

estrés.

Con respecto a los genes que parecen inducidos por una respuesta general a

estrés, es particularmente interesante el caso de un operón que codifica una

supuesta propano monooxigenasa multicomponente. Este operón contiene los

genes MSMEG_1971_1972_1973_1974, que son muy similares a los genes

prmABCD que codifican la propano monooxigenasa de Gordonia sp. cepa TY-5

(Kotani et al., 2003). Estos genes parecen formar un operón con cinco orfs

adicionales MSMEG_1975_1976_1977_1978_1979. El mismo operón ha sido

encontrado en R. jostii RHA1, y ha sido implicado en la degradación de N-

nitrosodimetilamina (Sharp et al., 2007). El gen MSMEG_1970 que codifica una

proteína similar a un factor sigma se localiza en sentido opuesto a este operón, y

también aparece inducido. Aunque los genes prmABCD parecen participar en el

metabolismo del propano, también están implicados en la respuesta a

condiciones de estrés (Sharp et al., 2007) y son capaces de hidroxilar otros

compuestos diferentes al propano (Shennan, 2006; Steffan et al., 1997). Por lo

tanto, hemos asumido que estos genes no están directamente implicados en el

metabolismo del colesterol sino que su inducción indica que las células se

encuentran bajo condiciones de estrés.

Otros genes de los que se desconoce su posible función en el catabolismo

del colesterol y que podrían estar inducidos como respuesta a estrés son: el gen

MSMEG_2303 (proteína hipotética conservada), el gen MSMEG_2514 (proteína

hipotética), el gen MSMEG_2663 (proteína hipotética conservada), el gen

163

Resultados

MSMEG_3164 (proteína hipotética), el operón formado por los genes

MSMEG_3330-3329-3328 (que codifica tres proteínas hipotéticas cortas, una de

ellas (el producto del gen MSMEG_3330) similar a la proteína CsbD bacteriana de

respuesta general a estrés), el gen MSMEG_3562 (proteína con dominio 4-

carboximuconolactona decarboxilasa PcaC), el gen MSMEG_4298 (3-metil-2-

oxobutanoato hidroximetiltransferasa, PanB), el gen MSMEG_4829 (citocromo

P450) y el gen MSMEG_5230 (proteína hipotética conservada).

La región MSMEG_3727 a MSMEG_3719 forma un supuesto operón que

incluye una posible deshidrogenasa que utiliza pirrolo-quinolina quinona (PQQ)

como cofactor (MSMEG_3726) similar a etanol, metanol y glucosa

deshidrogenasas. Los genes MSMEG_3725-3721 codifican las proteínas A, B, C,

D y E de biosíntesis de coenzima PQQ. Los genes MSMEG_3720 y

MSMEG_3719 codifican una supuesta proteína activadora de recombinación 1 y

un intercambiador de sodio/calcio, respectivamente. El papel de este operón en la

degradación del colesterol es desconocido en la actualidad.

Por último nos encontramos con el operón inducido en colesterol

MSMEG_6645_6646_6647_6648, que codifica enzimas similares a una 2-

metilcitrato deshidratasa (PrpD), una metilisocitrato liasa (PrpB), una citrato

sintasa (PrpC) y una piruvato carboxilasa (Pyc), respectivamente. Su inducción

sugiere que estos genes pueden estar implicados en el catabolismo del propionil

CoA (Pandey y Sassetti, 2008). A este respecto, es interesante comentar el papel

que la enzima Pyc podría desempeñar en este operón. Pyc transforma el piruvato

en oxalacetato, que puede ser condensado con propionil-CoA por PrpC para

formar 2-metilcitrato, el primer producto del ciclo del metilcitrato (Upton y

McKinney, 2007) (Fig. 49), lo que sugeriría que este operón ha evolucionado

específicamente para la degradación de colesterol. De acuerdo con esta hipótesis,

se ha descrito que las enzimas Prp de M. smegmatis son responsables de la

transformación del propionil-CoA en piruvato a través del ciclo del metilcitrato

(Upton and McKinney, 2007) pero es también cierto que M. smegmatis puede

crecer en propionato en ausencia de este operón usando los genes icl1 e icl2

(Upton and McKinney, 2007). Además, la presencia del gen pyc en este operón es

única para M. smegmatis, ya que en otros casos el operón prpBCD contiene un

164

Resultados

gen adicional prpE que codifica una propionil-CoA sintasa (Horswill y Escalante-

Semerena, 1999) que no se requiere en este caso porque el propionil-CoA es el

producto final de la ruta catabólica del colesterol junto con el piruvato. Por tanto,

dado que no se requiere una propionol-CoA sintasa, una rápida transformación de

piruvato en oxalacetato por Pyc debería reducir el tiempo de procesado del

propionil-CoA.

Propionil-CoA

Piruvato

Ciclo del metilcitrato

Oxalacetato

Propionato

Piruvato

2-metilisocitrato

2-metil-cis-aconitato

2-metilcitratoPrpD

Acn

Figura 49. Representación esquemática del catabolismo del propionil-CoA. Particularidades propuestas para M. smegmatis. En la bacteria M. smegmatis el catabolismo del colesterol tiene

como productos finales piruvato y propionil-CoA (señalados en azul). Los resultados obtenidos

mediante microarrays sugieren que una piruvato carboxilasa (Pyc) transforma el piruvato en

oxalacetato, que junto con el propionil-CoA entrarían en el ciclo del metilcitrato (cuyos

intermediarios y productos se señalan en verde) transformándose en 2-metilcitrato por la enzima

citrato sintasa (PrpC). El proceso metabólico seguiría a través de la enzima 2-metilcitrato

deshidratasa (PrpD), una enzima aconitasa (Acn) y la enzima metilisocitrato liasa (PrpB), que tiene

como productos piruvato y succinato. En el catabolismo del colesterol llevado a cabo por M.

smegmatis no es necesaria por tanto una enzima propionil CoA sintasa (PrpE) que transforme el

propionato (señalado en negro) en propionil CoA.

Utilizando este operón especializado, las células de M. smegmatis no

requieren un ciclo real de metilcitrato porque el propionil-CoA y el piruvato son

transformados directamente en piruvato y succinato a través de un proceso

metabólico único constituido por las enzimas PrpBCD, Pyc y una aconitasa Acn

adicional.

PrpE

Pyc

PrpC

Propionil-CoA

Piruvato

Ciclo del metilcitrato

Oxalacetato

Propionato

Succinato

PrpBPiruvato

2-metilisocitrato

2-metil-cis-aconitato

2-metilcitratoPrpD

Acn

PrpE

Pyc

PrpC

ColesterolColesterol

PrpB

Succinato

165

Resultados

_Piruvato carboxilasa (pyc) 80Rv2967c_MSMEG_6648

_Citrato sintasa 2 (prpC)79Rv1131_MSMEG_6647

_Metilisocitrato liasa (prpB) __13.92*MSMEG_6646

_2-metilcitrato deshidratasa 2 (prpD) 81Rv113011.35*MSMEG_6645

_Proteína hipotética conservada 34Rv1738 5.99MSMEG_5230

_Citocromo P450 32Rv0766c10.71MSMEG_4829

_3-metil-2-oxobutanoato hidroximetiltransferasa (panB)79Rv222510.23MSMEG_4298

_Proteína hipotética__20.09*MSMEG_3727

_Alcohol deshidrogenasa __12.00*MSMEG_3726

_Proteína A de biosíntesis de coenzima PQQ (pqqA) __5.40MSMEG_3725

_Proteína B de biosíntesis de coenzima PQQ (pqqB) __7.81MSMEG_3724

_Proteína C de biosíntesis de coenzima PQQ (pqqC) __9.53MSMEG_3723

_Proteína bifuncional C/D de biosíntesis de coenzima PQQ ___MSMEG_3722

_Proteína E de biosíntesis de coenzima PQQ (pqqE)___MSMEG_3721

_Proteína activadora de recombinación 1___MSMEG_3720

_Proteína intercambiadora de sodio/calcio___MSMEG_3719

_Proteína con dominio 4-carboximuconolactona descarboxilasa (pcaC)__11.88*MSMEG_3562

_Proteína hipotética conservada __9.66MSMEG_3330

_Proteína hipotética__8.10MSMEG_3329

_Proteína hipotética__5.70MSMEG_3328

_Proteína hipotética__13.15*MSMEG_3164

_Proteína hipotética conservada 41Rv1128c8.77MSMEG_2663

_Proteína hipotética conservada __7.49MSMEG_2514

_Transportador integral de membrana __10.39MSMEG_2303

ro00449Monooxigenasa de biosíntesis de antibiótico 58Rv111711.84*MSMEG_1979

ro00448Chaperonina GroL (groL)50Rv04406.61MSMEG_1978

ro00447Alcohol deshidrogenasa 29Rv22595.45MSMEG_1977

ro00446Proteína hipotética conservada __5.38MSMEG_1976

ro00445Amidohidrolasa 2 __4.80MSMEG_1975

ro00444Proteína de enganche de la propano monooxigenasa__6.33MSMEG_1974

ro00443Propano monooxigenasa hidroxilasa, subunidad pequeña __4.64MSMEG_1973

ro00442 Metano monooxigenasa, componente C (reductasa)___MSMEG_1972

ro00441Propano monooxigenasa hidroxilasa, subunidad grande __17.15*MSMEG_1971

ro00440Factor sigma__13.28*MSMEG_1970

_Posible dominio stas__10.97MSMEG_1786

_Proteína de la familia citosina/purina/uracilo/tiamina/alantoina permeasa25Rv3065 8.79MSMEG_1683

_Monooxigenase FMO contenedora de flavina__10.21MSMEG_1682

_Proteína de la superfamilia endorribonucleasa L-PSP 26Rv270412.05*MSMEG_1681

_AmiB46Rv3306c10.33MSMEG_1679

_Aspartato-amonio liasa (aspA)40Rv1098c_MSMEG_1677

_Aldehido deshidrogenasa eptc-inducible84Rv04588.07MSMEG_1543

_Transportador ABC, proteína de unión a ATP 79Rv06557.80MSMEG_1366

_Proteína hipotética__5.09MSMEG_1206

_Sintasa 1 de ciclopropano-graso-acil-fosfolípidos 61Rv0644c6.59MSMEG_1205

_Sintasa 1 de ácido metoxi micólico58Rv0645c7.08MSMEG_1203

654321

_Piruvato carboxilasa (pyc) 80Rv2967c_MSMEG_6648

_Citrato sintasa 2 (prpC)79Rv1131_MSMEG_6647

_Metilisocitrato liasa (prpB) __13.92*MSMEG_6646

_2-metilcitrato deshidratasa 2 (prpD) 81Rv113011.35*MSMEG_6645

_Proteína hipotética conservada 34Rv1738 5.99MSMEG_5230

_Citocromo P450 32Rv0766c10.71MSMEG_4829

_3-metil-2-oxobutanoato hidroximetiltransferasa (panB)79Rv222510.23MSMEG_4298

_Proteína hipotética__20.09*MSMEG_3727

_Alcohol deshidrogenasa __12.00*MSMEG_3726

_Proteína A de biosíntesis de coenzima PQQ (pqqA) __5.40MSMEG_3725

_Proteína B de biosíntesis de coenzima PQQ (pqqB) __7.81MSMEG_3724

_Proteína C de biosíntesis de coenzima PQQ (pqqC) __9.53MSMEG_3723

_Proteína bifuncional C/D de biosíntesis de coenzima PQQ ___MSMEG_3722

_Proteína E de biosíntesis de coenzima PQQ (pqqE)___MSMEG_3721

_Proteína activadora de recombinación 1___MSMEG_3720

_Proteína intercambiadora de sodio/calcio___MSMEG_3719

_Proteína con dominio 4-carboximuconolactona descarboxilasa (pcaC)__11.88*MSMEG_3562

_Proteína hipotética conservada __9.66MSMEG_3330

_Proteína hipotética__8.10MSMEG_3329

_Proteína hipotética__5.70MSMEG_3328

_Proteína hipotética__13.15*MSMEG_3164

_Proteína hipotética conservada 41Rv1128c8.77MSMEG_2663

_Proteína hipotética conservada __7.49MSMEG_2514

_Transportador integral de membrana __10.39MSMEG_2303

ro00449Monooxigenasa de biosíntesis de antibiótico 58Rv111711.84*MSMEG_1979

ro00448Chaperonina GroL (groL)50Rv04406.61MSMEG_1978

ro00447Alcohol deshidrogenasa 29Rv22595.45MSMEG_1977

ro00446Proteína hipotética conservada __5.38MSMEG_1976

ro00445Amidohidrolasa 2 __4.80MSMEG_1975

ro00444Proteína de enganche de la propano monooxigenasa__6.33MSMEG_1974

ro00443Propano monooxigenasa hidroxilasa, subunidad pequeña __4.64MSMEG_1973

ro00442 Metano monooxigenasa, componente C (reductasa)___MSMEG_1972

ro00441Propano monooxigenasa hidroxilasa, subunidad grande __17.15*MSMEG_1971

ro00440Factor sigma__13.28*MSMEG_1970

_Posible dominio stas__10.97MSMEG_1786

_Proteína de la familia citosina/purina/uracilo/tiamina/alantoina permeasa25Rv3065 8.79MSMEG_1683

_Monooxigenase FMO contenedora de flavina__10.21MSMEG_1682

_Proteína de la superfamilia endorribonucleasa L-PSP 26Rv270412.05*MSMEG_1681

_AmiB46Rv3306c10.33MSMEG_1679

_Aspartato-amonio liasa (aspA)40Rv1098c_MSMEG_1677

_Aldehido deshidrogenasa eptc-inducible84Rv04588.07MSMEG_1543

_Transportador ABC, proteína de unión a ATP 79Rv06557.80MSMEG_1366

_Proteína hipotética__5.09MSMEG_1206

_Sintasa 1 de ciclopropano-graso-acil-fosfolípidos 61Rv0644c6.59MSMEG_1205

_Sintasa 1 de ácido metoxi micólico58Rv0645c7.08MSMEG_1203

654321

166

Resultados

Tabla 19. Genes inducidos en colesterol en M. smegmatis mc2155 que no presentan motivos de unión para KstR o KstR2. Columna 1. Anotación de los genes de M. smegmatis mc2155 que

presentan inducción en colesterol. Se seleccionaron aquellos como mínimo más de 3 veces

inducidos y con un valor máximo de P de 0,1, tras un análisis visual previo de las imágenes

escaneadas de los microarrays. Columna 2. Se muestra el número de veces que cada gen está

inducido. Los valores marcados con un asterisco tienen un valor de P ajustado (FDR) <0,05. Se

marcan con una línea aquellos casos en los que los valores de inducción no se ajustaban a los

parámetros seleccionados y por tanto fueron descartados. Columna 3. Genes similares en M.

tuberculosis H37Rv. Columna 4. Porcentaje de identidad (ClustalW) entre los genes de M.

smegmatis y M. tuberculosis. Columna 5. Descripción de los productos de los genes. Entre

paréntesis se indica, de tener uno asignado, el nombre del gen. Columna 6. Genes similares en R.

jostii RHA1 que también presentan inducción en colesterol (van der Geize et al., 2007).

Genes bajo el control de KstR que no se encuentran inducidos en

colesterol en nuestros experimentos (Tabla 20)

Por último, en este apartado se han querido reseñar aquellos genes situados

fuera de los clusters 1 y 2 que, pese a presentar un motivo de unión para KstR

precediéndolos y estar inducidos en una cepa con el regulador KstR delecionado

(Kendall et al., 2007) no aparecen inducidos en colesterol en los ensayos de

expresión con microarrays hibridados y analizados como parte del trabajo de esta

tesis doctoral, ni forman parte de un operón que aparezca inducido. Muchos de

estos genes codifican proteínas hipotéticas, por lo que su supuesta función en el

catabolismo del colesterol es desconocida. Sin embargo, hay una excepción

notable, el locus mce4, que está implicado en el transporte de colesterol (véase el

apartado 4 de Introducción), lo que ha sido confirmado en R. jostii RHA1 (Mohn et

al., 2008) y también en M. tuberculosis (Pandey y Sassetti, 2008). Este hecho

unido a la presencia de un motivo para unión de KstR precediendo este operón

hacía pensar que éste aparecería claramente inducido en colesterol, lo que

sorprendentemente, según el resultado obtenido en los microarrays, no sucede

(Tabla 20). Este locus mce4 se corresponde en M. smegmatis con los genes

MSMEG_5893-MSMEG_5902. Como en el caso de M. tuberculosis y R. jostii

RHA1, está formado por dos genes yrbE (denominados sup en Rhodococcus), que

167

Resultados

presentan homología con permeasas de transportadores ABC, y seis genes mce,

homólogos a proteínas de unión a sustrato. A continuación de lo genes mce se

sitúan dos genes conservados que codifican proteínas asociadas a mce (mas4A y

mas4B) (Casali y Riley, 2007) (Figura 50). Este operón se sitúa justo precediendo

el cluster 1 antes definido, lo que concuerda con su implicación en el catabolismo

de colesterol y nuevamente hace que el hecho de que no se induzcan estos genes

sea extraño. Para descartar que la técnica de microarrays no fuese

suficientemente sensible para captar la inducción de este operón, se llevó a cabo

la RTq-PCR de uno de los genes del operón, MSMEG_5895. Los resultados

mostraron que sí existe una inducción, aunque leve, de este gen (véase el

apartado 3.2, figura 51) que no se detecta por lo tanto mediante la técnica de

microarrays.

168

Resultados

_Proteína hipotética conservada 71Rv0138MSMEG_6475

_Oxidorreductasa67Rv0139MSMEG_6474

ro04696Supuesta subunidad permeasa de transporte de esteroles (transportador ABC) (yrbE4A)90Rv3501cMSMEG_5902

ro04697Supuesta subunidad permeasa de transporte de esteroles (transportador ABC) (yrbE4B)92Rv3500cMSMEG_5901

ro04698Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4A)67Rv3499cMSMEG_5900

ro04699Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4B)67Rv3498cMSMEG_5899

ro04700Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4C)65Rv3497cMSMEG_5898

ro04701Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4D)63Rv3496cMSMEG_5897

ro04702Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4E)63Rv3495cMSMEG_5896

ro04703Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4F)65Rv3494cMSMEG_5895

ro04704 (NI)Proteína hipotética conservada asociada a mce (mas4A)60Rv3493cMSMEG_5894

ro04705 (NI)Proteína hipotética conservada asociada a mce (mas4B)58Rv3492cMSMEG_5893

_Proteína hipotética conservada 75Rv0926cMSMEG_5586

_Deshidrogenasa de cadena corta81Rv0927cMSMEG_5584

_Proteína hipotética conservada 80Rv0940cMSMEG_5555

_Supuesto regulador de respuesta anti-terminador__MSMEG_5554

_Monooxigenasa__MSMEG_5519

_Dihidrodipicolinato reductasa (dapB) 71Rv1059MSMEG_5286

_Proteína hipotética conservada 72Rv1132MSMEG_5202

_Proteína hipotética conservada __MSMEG_3658

_Proteína hipotética conservada 49Rv2668MSMEG_2790

_Acetiltransferasa, familia GNAT 60Rv2669MSMEG_2789

_Proteína hipotética conservada 61Rv2799MSMEG_2645

_Supuesta hidrolasa64Rv2800MSMEG_2644

54321

_Proteína hipotética conservada 71Rv0138MSMEG_6475

_Oxidorreductasa67Rv0139MSMEG_6474

ro04696Supuesta subunidad permeasa de transporte de esteroles (transportador ABC) (yrbE4A)90Rv3501cMSMEG_5902

ro04697Supuesta subunidad permeasa de transporte de esteroles (transportador ABC) (yrbE4B)92Rv3500cMSMEG_5901

ro04698Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4A)67Rv3499cMSMEG_5900

ro04699Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4B)67Rv3498cMSMEG_5899

ro04700Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4C)65Rv3497cMSMEG_5898

ro04701Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4D)63Rv3496cMSMEG_5897

ro04702Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4E)63Rv3495cMSMEG_5896

ro04703Proteína de la familia mce: operón mce4 (mce4F)65Rv3494cMSMEG_5895

ro04704 (NI)Proteína hipotética conservada asociada a mce (mas4A)60Rv3493cMSMEG_5894

ro04705 (NI)Proteína hipotética conservada asociada a mce (mas4B)58Rv3492cMSMEG_5893

_Proteína hipotética conservada 75Rv0926cMSMEG_5586

_Deshidrogenasa de cadena corta81Rv0927cMSMEG_5584

_Proteína hipotética conservada 80Rv0940cMSMEG_5555

_Supuesto regulador de respuesta anti-terminador__MSMEG_5554

_Monooxigenasa__MSMEG_5519

_Dihidrodipicolinato reductasa (dapB) 71Rv1059MSMEG_5286

_Proteína hipotética conservada 72Rv1132MSMEG_5202

_Proteína hipotética conservada __MSMEG_3658

_Proteína hipotética conservada 49Rv2668MSMEG_2790

_Acetiltransferasa, familia GNAT 60Rv2669MSMEG_2789

_Proteína hipotética conservada 61Rv2799MSMEG_2645

_Supuesta hidrolasa64Rv2800MSMEG_2644

54321

Tabla 20. Genes bajo el control de KstR que no se encuentran inducidos en colesterol en nuestros experimentos de expresión diferencial mediante microarrays. Columna 1. Anotación

de los genes de M. smegmatis mc2155 que no presentan inducción en colesterol significativa en los

microarrays (menos de 3 veces inducidos y/o con un valor de P > 0,1) pero sí presentan un motivo

de unión para KstR precediendo su secuencia. Columna 2. Genes similares en M. tuberculosis

H37Rv. Columna 3. Porcentaje de identidad (ClustalW) entre los genes de M. smegmatis y M.

tuberculosis. Columna 4. Descripción de los productos de los genes. Entre paréntesis se indica, de

tener uno asignado, el nombre del gen. Columna 5. Genes similares en R. jostii RHA1 que también

presentan inducción en colesterol (van der Geize et al., 2007) (a excepción de los genes seguidos

de las siglas NI, que indican que no están inducidos en colesterol).

169

Resultados

Figura 50. Representación esquemática del locus mce4. Se representa la disposición en el

genoma de M. tuberculosis, M. smegmatis y R. jostii RHA1 de este operón. La nomenclatura de los

genes se sitúa por encima de los mismos. Los números que se muestran por debajo de los genes

señalan el número de pb entre genes adyacentes. Los números entre corchetes indican separación

y los números entre paréntesis solapamiento. Los números que aparecen sobre las líneas en

diagonal indican las posiciones del genoma, en kb, entre las que se encuentran las distintas

agrupaciones génicas.

Rhodococcus jostii RHA1

04697 04698 04699 04700 04701 04702 04703 04704 04705

4960

04696

[20] [12] [2] [2] (3) (4) (4) (4) (4)

4949 supA supB mce4A mce4B mce4C mce4D mce4E mce4F mas4A mas4B

Mycobacterium tuberculosis H37Rv

3921

3492c 3493c 3494c 3495c 3496c 3497c 3498c 3499c 3500c 3501c

[1] (0) [11] (3) (3) (10) [3] [20] [34]

3910 mas4B mas4A mce4F mce4E mce4D mce4C mce4B mce4A yrbE4B yrbE4A

Mycobacterium smegmatis mc²155

5964

5893 5895 5896 5897 5898 5899 5900 5901 59025894

(0) [68] (0) [59] (4) (8) (0) [6] [34]

5952 mas4B mas4A mce4F mce4E mce4D mce4C mce4B mce4A yrbE4B yrbE4A

Rhodococcus jostii RHA1

04697 04698 04699 04700 04701 04702 04703 04704 04705

4960

04696

[20] [12] [2] [2] (3) (4) (4) (4) (4)

4949 supA supB mce4A mce4B mce4C mce4D mce4E mce4F mas4A mas4B

Mycobacterium tuberculosis H37Rv

3921

3492c3492c 3493c3493c 3494c3494c 3495c3495c 3496c3496c 3497c3497c 3498c3498c 3499c3499c 3500c3500c 3501c3501c

[1] (0) [11] (3) (3) (10) [3] [20] [34]

3910 mas4B mas4A mce4F mce4E mce4D mce4C mce4B mce4A yrbE4B yrbE4A

Mycobacterium smegmatis mc²155

5964

58935893 58955895 58965896 58975897 58985898 58995899 59005900 59015901 5902590258945894

(0) [68] (0) [59] (4) (8) (0) [6] [34]

5952 mas4B mas4A mce4F mce4E mce4D mce4C mce4B mce4A yrbE4B yrbE4A

3.2 Validación de los resultados de expresión obtenidos con los microarrays mediante RTq-PCR de diversos genes

Los análisis de expresión diferencial en colesterol mediante microarrays

fueron validados para 12 de los genes mediante retrotranscripción-PCR en tiempo

real (cuantitativa) (RTq-PCR) (véanse los apartados 7.3 y 7.4 de Materiales y

Métodos). Dentro de los genes así analizados se encuentra un gen que presenta

una inducción elevada en colesterol en los microarrays (MSMEG_0217), seis

170

Resultados

genes con una inducción más discreta (MSMEG_1366, MSMEG_5906,

MSMEG_5228, MSMEG_5925, MSMEG_6009, MSMEG_6036) y cinco genes que

no presentaron inducción en colesterol a pesar de estar precedidos por

secuencias de unión a KstR o dentro de operones inducidos (MSMEG_5895,

MSMEG_5920, MSMEG_6012, MSMEG_6039 y MSMEG_6041) (Figura 51). Los

resultados indicaron que todos los genes que muestran inducción en colesterol

mediante microarrays también la muestran mediante RTq-PCR, siendo el gen

MSMEG_0217 el que presenta unos niveles más elevados de inducción (Figura

52). Con respecto a los genes que no presentan inducción en colesterol en los

microarrays, se comprobó que en tres de ellos esta inducción sin embargo existe,

como se esperaba en un principio (MSMEG_6012, MSMEG_6039 y

MSMEG_6041, que se inducen en colesterol respecto a en glicerol 9,7, 3,6 y 9

veces respectivamente). En los otros dos (MSMEG_5895 y MSMEG_5920) se

corrobora sin embargo una inducción bastante más leve (1,6 y 1,9 veces,

respectivamente) que por lo tanto no fue detectada en los microarrays.

171

Resultados

Expresión diferencial en colesterol 1,8 mM- glicerol 18 mM

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

MSMEG_1

366

MSMEG_5

906

MSMEG_5

228

MSMEG_5

895

MSMEG_5

920

MSMEG_5

925

MSMEG_6

009

MSMEG_6

012

MSMEG_6

036

MSMEG_6

039

MSMEG_6

041

Nive

l de

trans

crip

ción

(ng

de tr

ánsc

rito)

ColesterolGlicerol

Expresión diferencial en colesterol 1,8 mM- glicerol 18

mM

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

MSMEG_021

7

Niv

el d

e tr

ansc

ripci

ón (n

g de

trán

scrit

o)

Colesterol

Glicerol

Expresión diferencial en colesterol 1,8 mM- glicerol 18 mM

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

MSMEG_1

366

MSMEG_5

906

MSMEG_5

228

MSMEG_5

895

MSMEG_5

920

MSMEG_5

925

MSMEG_6

009

MSMEG_6

012

MSMEG_6

036

MSMEG_6

039

MSMEG_6

041

Nive

l de

trans

crip

ción

(ng

de tr

ánsc

rito)

ColesterolGlicerol

Expresión diferencial en colesterol 1,8 mM- glicerol 18

mM

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

MSMEG_021

7

Niv

el d

e tr

ansc

ripci

ón (n

g de

trán

scrit

o)

Colesterol

Glicerol

Figura 51. Expresión diferencial obtenida mediante RTq-PCR de los genes seleccionados de M. smegmatis mc2155 crecido en colesterol 1,8 mM comparado con M. smegmatis mc2155 crecido en glicerol 18 mM. Los niveles de transcripción se midieron mediante RTq-PCR como se

describe en los apartados 7.3 y 7.4 de Materiales y Métodos. Las barras de error representan la

desviación estándar calculada. Los niveles de transcripción del gen MSMEG_0217 se muestran

separadamente, ya que son significativamente mayores que el del resto de los genes. Los valores

de P del test t de Student no pareado fueron menores de 0,05 en todos los casos excepto para los

genes MSMEG_5895 y MSMEG_5920 (datos no mostrados).

4. Estudio mediante mutagénesis insercional de diversos genes implicados en el catabolismo del colesterol

Para validar los datos obtenidos mediante RT-PCR y también los datos de

expresión diferencial en colesterol/glicerol de M. smegmatis mc2155 obtenidos

mediante microarrays, se llevó a cabo la mutagénesis insercional de distintos

genes probablemente implicados en la degradación del colesterol. Los mutantes

se obtuvieron mediante interrupción del gen de interés utilizando el plásmido

suicida pJQ200x (véase apartado 4.6 de Materiales y Métodos). Posteriormente

los mutantes así obtenidos fueron cultivados en medio mínimo con colesterol 1,8

172

Resultados

mM en β-ciclodextrina como única fuente de carbono y se comparó su crecimiento

con el de la cepa no mutada.

Como se verá a continuación los resultados obtenidos indican que para la

mayoría de los genes analizados la capacidad o la velocidad de crecimiento en

colesterol de M. smegmatis mc2155 se encuentra atenuada cuando éstos son

mutados, lo que apoya una implicación directa en su catabolismo.

4.1 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_6036

El gen MSMEG_6036 es ortólogo al gen tesB de C. testosteroni (Horinouchi

et al., 2001) en M. smegmatis mc2155. El gen correspondiente en R. erythropolis

(van der Geize et al., 2007) y en M. tuberculosis (Yam et al., 2009) se denomina

hsaC. La proteína codificada por este gen está anotada en M. smegmatis mc2155

como una bifenil-2,3-diol-1,2-dioxigenasa por su similitud con estradiol

dioxigenasas que catalizan la apertura de 2,3-dihidroxibifenilo, pero su principal

función, como en el caso de los microorganismos anteriormente expuestos, sería

la apertura meta de 3,4-DHSA para producir 4,9-DSHA (Figura 5 de introducción,

intermediarios (12) y (13)). En estos microorganismos se ha comprobado que la

mutación de este gen conlleva efectivamente la acumulación de 4,9-DSHA y

disminuye en gran medida la capacidad de crecimiento en colesterol. Así mismo,

los mutantes presentan un rasgo fenotípico característico, que es la coloración

rojiza que producen en el medio cuando crecen en colesterol. El color rojizo se

aprecia a menudo cuando se acumulan derivados catecólicos durante la

degradación microbiana de compuestos aromáticos, debido a que el catecol se

oxida para producir derivados quinónicos que confieren un color rojizo oscuro al

medio (Horinouchi et al., 2004a). En el caso de M. smegmatis mc2155 nuestros

resultados demuestran que la mutación del gen MSMEG_6036 conlleva

efectivamente una disminución notable en el crecimiento en colesterol (Figura 52),

así como la aparición de una coloración rojiza en colesterol 1,8 mM a partir de las

48 horas de cultivo (Figura 53).

173

Resultados

Figura 52. Diferencia de crecimiento en colesterol de M. smegmatis::MSMEG_6036 y M. smegmatis mc2155. Crecimiento en medio mínimo 457 en colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina

como fuente de carbono. M. smegmatis::MSMEG_6036 (línea naranja) representa a M. smegmatis

mc2155 con el gen MSMEG_6036 interrumpido mediante inserción de pJQ200x. M. smegmatis

mc²155 (línea azul) representa a la cepa no mutada M. smegmatis mc2155.

Crecimiento en colesterol 1,8 mM. M. smegmatis ::MSMEG_6036

0,01

0,1

1

10

0 20 40 60 80 100

Tiempo (h)

DO

600 M. smegmat is mc²155

M. smegmat is::MSMEG_6036

Estos resultados apoyan los obtenidos por RT-PCR (véase apartado 1.3 de

Resultados) y microarrays (véase apartado 3.1 de Resultados, tabla 16), por lo

que se ha confirmado el papel del producto del gen MSMEG_6036 en la ruta de

degradación del colesterol.

174

Resultados

A B

Figura 53. Coloración del medio con colesterol producida por el mutante M. smegmatis::MSMEG_6036.

A. Cultivo del mutante M. smegmatis::MSMEG_1366 en colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina de 96

horas. B. Cultivo de 96 horas de la cepa no mutada M. smegmatis mc2155.

4.2 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_1366

Como se ha comentado en la introducción (apartado 4), el locus mce4 parece

ser el responsable del transporte de colesterol en distintas actinobacterias. En M.

smegmatis mc2155 el locus mce4 se corresponde, por homología de secuencia

con M. tuberculosis, con los genes MSMEG_5893-MSMEG_5902, siendo el grado

de similitud muy elevado (véase apartado 3.1 de Resultados, tabla 19). La ATPasa

mceG de M. tuberculosis se corresponde así mismo con el gen MSMEG_1366.

Este gen aparece inducido en los microarrays de expresión diferencial en

colesterol/glicerol (véase apartado 3.1 de resultados), lo que apoya su

participación en el transporte de colesterol. La interrupción de este gen con el

plásmido suicida pJQ200x conlleva una reducción drástica en la capacidad de

crecimiento en colesterol de M. smegmatis mc2155 (Figura 54). A diferencia de lo

que sucede en M. tuberculosis (Pandey y Sassetti, 2008), la capacidad de

175

Resultados

crecimiento en colesterol parece no recuperarse con el tiempo; el aumento en la

DO600 que puede ser atribuido al colesterol a las 98 h es de aproximadamente 0,3

unidades, una vez que se resta el crecimiento facilitado por la presencia de β-

ciclodextrina. Sin embargo, al tratarse de una micobacteria de crecimiento rápido

es difícil equiparar este resultado al obtenido para M. tuberculosis, ya que el

tiempo final difiere en ambos experimentos.

Crecimiento en colesterol 1,8 mM. M. smegmatis ::MSMEG_1366

0,01

0,1

1

10

0 20 40 60 80 100

Tiempo (h)

DO

600

mc2 155

M. smegmat is::MSMEG_1366

Figura 54. Diferencia de crecimiento en colesterol de M. smegmatis::MSMEG_1366 y M. smegmatis mc2155. Crecimiento en medio mínimo 457 con colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina

como fuente de carbono. M. smegmatis::MSMEG_1366 (línea naranja) representa a M. smegmatis

mc2155 con el gen MSMEG_1366 interrumpido mediante inserción de pJQ200x. M. smegmatis

mc²155 (línea azul) representa a la cepa no mutada M. smegmatis mc2155.

Tras estos resultados, nos propusimos investigar si el colesterol podría ser

transportado al interior de la micobacteria por algún otro sistema alternativo si se

suministra energía al sistema de transporte a partir de otra fuente de carbono

distinta del colesterol. Para ello M. smegmatis fue cultivado en glicerol 5 mM al

que se añadió colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina como inductor o β-ciclodextrina

únicamente como control. Los resultados indicaron que el mutante crecía en

medio con glicerol y colesterol hasta una DO600 próxima a 2 a las 135 h, mientras

que el medio sin colesterol en estas condiciones alcanzaba una DO600 de 0,8

(Figura 55). El valor de la DO600 alcanzado en el medio con glicerol y colesterol

comparado con el valor alcanzado en medio con glicerol es mayor al esperado

176

Resultados

teniendo en cuenta el comportamiento del mutante en medio sólo con colesterol.

En el caso del colesterol era de 0,3 unidades y con glicerol y colesterol el

aumento de DO600 atribuido al crecimiento en colesterol a las 98 h es

aproximadamente el doble, es decir de 0,6 unidades. Este hecho podría deberse a

que al disponer de una fuente de carbono adicional, el mutante puede utilizar la

energía obtenida para activar otro/s sistema/s de transporte capaces de

transportar colesterol. Esta hipótesis está en proceso de estudio en nuestro

laboratorio. Figura 55. Diferencia de crecimiento de M. smegmatis::MSMEG_1366 en glicerol 5mM con/sin colesterol 1,8 mM. Crecimiento del mutante M. smegmatis::MSMEG_1366 en medio

mínimo 457 con glicerol 5mM y colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina como fuente de carbono (línea

rosa) o con glicerol 5 mM en β-cilcodextrina (línea azul). Los resultados mostrados son la media de

tres experimentos independientes.

Crecimiento en glicerol +/- colesterol de M. smegmatis ::MSMEG_1366

0,01

0,1

1

10

0 50 100 150

Tiempo (h)

DO

600 Glicerol

Glicerol +Colesterol

4.3 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_5995

El gen MSMEG_5995 se encuentra en una región del genoma delimitada por

los genes MSMEG_5990 y MSMEG_6004 cuyos genes se inducen en colesterol,

como indican los resultados obtenidos mediante RT-PCR (véase apartado 1.3 de

177

Resultados

Resultados) y mediante microarrays (véase apartado 3.1 de Resultados, tabla 16).

Aun así, hasta hace muy poco tiempo no se había empezado a dilucidar la posible

función de ninguno de estos genes en la ruta de degradación del colesterol. Como

se comentó en la introducción, estudios muy recientes han demostrado que la

proteína codificada por el gen ro04679 de R. jostii RHA1 (Rosłoniec et al., 2009),

que codifica el citocromo P450 125 (Cyp125), así como su homóloga en M.

tuberculosis H37Rv, codificada por el gen Rv3545c (Capyk et al., 2009b), son

responsables del primer paso de hidroxilación de la cadena lateral del colesterol.

El supuesto gen ortólogo de ro04679 y Rv3545c en M. smegmatis es

MSMEG_5995, cuyo producto presenta una identidad del 75% (cuantificado por

ClustalW) con el del gen de M. tuberculosis.

Como se puede apreciar en la figura 56, la mutagénesis insercional de

MSMEG_5995 produce una reducción drástica del crecimiento en colesterol.

Crecimiento en colesterol 1,8 mM. M. smegmatis ::MSMEG_5995

0,01

0,1

1

10

0 20 40 60

Tiempo (h)

DO

600

M. smegmat is mc²155

M. smegmat is::MSMEG_5995

Figura 56. Diferencia de crecimiento en colesterol de M. smegmatis::MSMEG_5995 y M. smegmatis mc2155. Crecimiento en medio mínimo 457 con colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina

como fuente de carbono. M. smegmatis::MSMEG_5995 (línea naranja) representa a M. smegmatis

mc2155 con el gen MSMEG_5995 interrumpido mediante inserción de pJQ200x. M. smegmatis

mc2155 (línea azul) representa a la cepa no mutada M. smegmatis mc2155.

Los mutantes de R. jostii RHA1 y M. bovis BCG en el gen ortólogo también

pierden la capacidad de crecimiento en colesterol (Capyk et al., 2009; Rosłoniec et

al., 2009), pero curiosamente, M. tuberculosis crece perfectamente en colesterol

178

Resultados

cuando se deleciona el gen Rv3545c. La explicación más probable es que exista

una enzima que complementa la pérdida de Cyp125.

Se ha observado que existen tres genes que están presentes en el genoma

de H37Rv pero no en el de M. bovis que codifican monooxigenasas que parecen

implicadas en patogénesis (Rv1256c, Rv3121 y Rv3618) y se postula que alguno

de ellos podría complementar a cyp125 en H37Rv (Capyk et al., 2009). Para

comprobar si M. smegmatis mc2155 poseía ortólogos a estos genes, se hicieron

comparaciones in silico y se encontraron dos genes con elevada similitud con

Rv1256c y Rv3618 (Tabla 21). El gen Rv3121 no tiene un claro ortólogo en M.

smegmatis; la proteína más similar, denominada FAS1, a pesar de codificar

también un citocromo P450, presenta sólo una similitud del 28% (cuantificado por

ClustalW).

81Limoneno 1,2monooxigenasa

MSMEG_6107Limonenomonooxigenasa

Rv3618

28Citocromo P450 FAS1

MSMEG_0762Citocromo P450Cyp141

Rv3121

77Posible citocromoP450 Cyp123

MSMEG_5038Citocromo P450Cyp130

Rv1256c

% ClustalWFunciónGen M. smegmatismc2155

FunciónGen M. tuberculosis

81Limoneno 1,2monooxigenasa

MSMEG_6107Limonenomonooxigenasa

Rv3618

28Citocromo P450 FAS1

MSMEG_0762Citocromo P450Cyp141

Rv3121

77Posible citocromoP450 Cyp123

MSMEG_5038Citocromo P450Cyp130

Rv1256c

% ClustalWFunciónGen M. smegmatismc2155

FunciónGen M. tuberculosis

Tabla 21. Comparación de secuencias de monooxigenasas de M. tuberculosis H37Rv vs M. smegmatis mc2155.

El hecho de que R. jostii RHA1 tampoco posea ningún claro gen ortólogo a

Rv3121 (Tabla 22) puede apoyar que Rv3121 podría efectivamente codificar la

enzima que complementa la actividad de Cyp125 en M. tuberculosis.

179

Resultados

Tabla 22. Comparación de secuencias de monooxigenasas de M. tuberculosis H37Rv vs R.

jostii RHA1.

40Monooxigenasaro00392Limonenomonooxigenasa

Rv3618

29Citocromo P450Cyp105

ro02604Citocromo P450Cyp141

Rv3121

69Citocromo P450Cyp130

ro05719Citocromo P450Cyp130

Rv1256c

% ClustalWFunciónGen R. jostii RHA1FunciónGen M.tuberculosis

40Monooxigenasaro00392Limonenomonooxigenasa

Rv3618

29Citocromo P450Cyp105

ro02604Citocromo P450Cyp141

Rv3121

69Citocromo P450Cyp130

ro05719Citocromo P450Cyp130

Rv1256c

% ClustalWFunciónGen R. jostii RHA1FunciónGen M.tuberculosis

4.4 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_0217

El gen MSMEG_0217 es uno de los más interesantes hallados mediante

análisis de expresión diferencial en colesterol mediante microarrays (véase

apartado 3.1 de Resultados, tabla 18). La inducción en colesterol de este gen es

muy clara, tanto en microarrays como en RT-PCR cuantitativa, y su expresión está

sujeta al control del represor transcripcional KstR (Kendall et al., 2007). Este gen

es muy similar a genes implicados en la oxidación de alcoholes primarios y

aldehídos y es un candidato claro para ser el responsable de la transformación de

26-hidroxi-4-colesten-3-ona en ácido 4-colesten-3-ona-26-oico (estructuras (5A) y

(6A) de la figura 5 de introducción). El mutante por inserción de pJQ200x crece

lentamente en colesterol durante las primeras 50 horas de cultivo, llegando a

DO600 entre 0,6-0,8 a las 48 horas, mientras que la cepa salvaje alcanza en ese

intervalo una DO600 próxima a 2 (Figura 57). Además, el cultivo presenta un

fenotipo característico a partir de las 35-40 h, cuando las células comienzan a

formar agregados. A tiempos más largos, la capacidad de crecer se recupera, y se

ha comprobado que a estos tiempos se ha producido la reversión de la

recombinación homóloga y se puede detectar mediante RT-PCR el gen completo

no mutado en el genoma (resultados no mostrados). Debido a la inestabilidad de

este mutante, en el presente se está construyendo en nuestro laboratorio el

mutante por deleción para posteriores estudios, dado que los resultados hallados

180

Resultados

con el mutante por inserción resultan prometedores y parecen apoyar la

implicación directa de este gen en la ruta de degradación de colesterol.

Figura 57. Diferencia de crecimiento en colesterol de M. smegmatis::MSMEG_0217 y M. smegmatis mc2155. Crecimiento en medio mínimo 457 con colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina

como fuente de carbono. M. smegmatis::MSMEG_0217 (línea naranja) representa a M. smegmatis

mc2155 con el gen MSMEG_0217 interrumpido mediante inserción de pJQ200x. M. smegmatis

mc2155 (línea azul) representa a la cepa no mutada M. smegmatis mc2155.

Crecimiento en colesterol 1,8 mM. M. smegmatis ::MSMEG_0217

0,01

0,1

1

10

0 20 40 60 80 100

Tiempo (h)

DO

600

M. smegmat is mc²155

M. smegmat is::MSMEG_0217

4.5 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_1543

El gen MSMEG_1543, que codifica una aldehído deshidrogenasa inducible

por EPTC (S-etil dipropiltiocarbamato) aparece inducido en los microarrays de

colesterol frente a glicerol (véase apartado 3.1 resultados, tabla 19). Este gen no

parece estar regulado por KstR1 o KstR2 por lo que se postula que su inducción

puede estar relacionada con una respuesta a estrés producida por el colesterol. La

interrupción del gen mediante la inserción de pJQ200x no altera el crecimiento en

colesterol (Figura 58), lo que apoya esta hipótesis.

181

Resultados

Crecimiento en colesterol 1,8 mM. M. smegmatis ::MSMEG_1543

0,01

0,1

1

10

0 20 40 60 80 100

Tiempo (h)

DO

600

M. smegmat is mc²155

M. smegmat is::MSMEG_1543

Figura 58. Diferencia de crecimiento en colesterol de M. smegmatis::MSMEG_1543 y M. smegmatis mc2155. Crecimiento en medio mínimo 457 con colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina

como fuente de carbono. M. smegmatis::MSMEG_1543 (línea naranja) representa a M. smegmatis

mc2155 con el gen MSMEG_1543 interrumpido mediante inserción de pJQ200x. M. smegmatis

mc2155 (línea azul) representa a la cepa no mutada M. smegmatis mc2155.

4.6 Estudio mediante mutagénesis insercional del gen MSMEG_3519

El producto de MSMEG_3519, un gen inducido diferencialmente en colesterol

(véase apartado 3.1 de resultados, tabla 18), ha sido identificado como una 2-

nitropropano dioxigenasa (NDP), una de las enzimas oxidantes de nitroalcanos,

que catalizan la desnitrificación oxidativa de nitroalcanos a compuestos

carbonílicos y nitritos. NDP es un miembro de la familia de las flavin

oxidoreductasas NAD(P)H-dependientes. Este gen así como algunos genes

adyacentes (MSMEG_3515, MSMEG_3516) parecen estar bajo el control de

KstR1 (Kendall et al., 2007). Sin embargo, la interrupción del gen MSMEG_3519

no produce una disminución en el crecimiento de M. smegmatis en colesterol

(Figura 59), lo que podría indicar que, en caso de que este gen efectivamente

participe en la degradación del colesterol, podría ser complementado por otro gen

alternativo.

182

Resultados

Crecimiento en colesterol 1,8 mM. M. smegmatis ::MSMEG_3519

0,01

0,1

1

10

0 50 100

Tiempo (h)

DO

600

M. smegmat is mc²155

M. smegmat is::MSMEG_3519

Figura 59. Diferencia de crecimiento en colesterol de M. smegmatis::MSMEG_3519 y M. smegmatis mc2155. Crecimiento en medio mínimo 457 con colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina

como fuente de carbono. M. smegmatis::MSMEG_3519 (línea naranja) representa a M. smegmatis

mc2155 con el gen MSMEG_3519 interrumpido mediante inserción de pJQ200x. M. smegmatis

mc2155 (línea azul) representa a la cepa no mutada M. smegmatis mc2155.

5. Introducción al estudio de la regulación transcripcional del catabolismo del colesterol por las proteínas represoras KstR y KstR2

Como se ha visto en el apartado 3 de esta sección de Resultados, gran parte

de los genes que se han relacionado con el catabolismo del colesterol en M.

smegmatis mc2155 están regulados por alguno de los dos represores descritos

hasta la fecha: KstR (Kendall et al., 2007) o KstR2 (Kendall et al., 2010). Ambos

pertenecen a la familia de reguladores transcripcionales TetR, una familia bien

representada y ampliamente distribuida entre las bacterias, cuyos miembros

presentan un motivo de unión a DNA hélice-giro-hélice (HTH) (Ramos et al.,

2005). Para ambos reguladores se han identificado secuencias de unión en la

región 5’ de distintos genes y operones en M. smegmatis mc2155,

aproximadamente 32 secuencias para KstR y 3 para KstR2. En el caso de KstR,

se ha podido demostrar su unión a la región 5’ del gen KstR en M. tuberculosis

183

Resultados

(Kendall et al., 2007). En el caso de KstR2, se ha demostrado su unión a tres

regiones con secuencias consenso en M. tuberculosis (Kendall et al., 2010).

En este apartado se presentan los resultados de los estudios llevados a cabo

sobre algunos aspectos funcionales de ambos reguladores.

5. 1 Ensayos de crecimiento con los mutantes de los reguladores KstR y KstR2

Para comenzar el estudio de estos reguladores, se analizó el efecto que

tienen sobre el crecimiento de M. smegmatis mc2155 distintos mutantes en los

genes reguladores. Estos mutantes se construyeron mediante deleción (Kendall et

al., 2007; Kendall et al., 2010) y actualmente se dispone de tres mutantes: M.

smegmatisΔkstR, M. smegmatisΔkstR2 y M. smegmatisΔkstR/ΔkstR2, que

corresponden respectivamente a un mutante en el gen kstR (ΔkstR), otro en el

gen kstR2 (ΔkstR2), y un tercer mutante doble que posee los dos genes

reguladores delecionados (ΔkstR/ΔkstR2). Se comparó el crecimiento de estos

tres mutantes en un medio con colesterol 1,8 mM en β-ciclodextrina como fuente

de carbono frente al crecimiento de la cepa salvaje. Dado que en los tres mutantes

se encuentran desreprimidos un gran número de genes relacionados con el

catabolismo del colesterol, se podría esperar un aumento en la capacidad o

velocidad de crecimiento en colesterol en los mismos, pero no se encontraron

diferencias respecto a la cepa control en ninguno de ellos. (Figura 60). Este

resultado parece indicar que KstR y KstR2 dejan de ejercer su acción represora de

manera rápida cuando existe colesterol en el medio. Por este motivo no se

aprecian diferencias en el crecimiento de la cepa salvaje en colesterol respecto a

los mutantes en estos reguladores.

184

Resultados

0,01

0,1

1

0 50 100 150

Tiempo (h)

DO

600

mc²155

ΔkstR

ΔkstR2

ΔkstR/kstR2

Figura 60. Crecimiento en colesterol 1,8 mM-ciclodextrina de los distintos mutantes en los reguladores KstR y KstR2 frente al crecimiento de la cepa M. smegmatis mc2155. Como se

puede observar en la gráfica, no se aprecian diferencias en la capacidad o velocidad de

crecimiento en colesterol de los distintos mutantes KstR y KstR2 frente a la cepa salvaje M. smegmatis mc2155.

5.2 Introducción al estudio del represor transcripcional KstR

El regulador KstR perteneciente a la familia TetR está implicado en el control

directo de 83 genes en M. smegmatis y de 74 en M. tuberculosis (Kendall et al.,

2007). En un primer momento, se apuntó que estos genes podrían estar

implicados en la utilización de diversos lípidos, no solo el colesterol, como fuente

de energía (Kendall et al., 2007). Los resultados presentados en el apartado 3 de

esta sección sin embargo sugieren que el colesterol por sí solo es capaz de

producir la inducción de la gran mayoría de ellos. Parece que, para ejercer su

acción represora, KstR se une a un motivo conservado (TnnAACnnGTTnnA) que

ha sido localizado en su propio promotor y en 31 regiones intergénicas del

genoma de M. smegmatis que preceden a un gran número de genes y operones

relacionados con el catabolismo del colesterol (Kendall et al., 2007). Se ha

comprobado que la proteína KstR de M. tuberculosis (KstRMtb) se une a una sonda

185

Resultados

de DNA que contiene este motivo conservado de su región promotora (Kendall et

al., 2007). Así mismo, se comprobó mediante cromatografía de exclusión

molecular (SEC) que la unión a DNA se lleva a cabo como un dímero (Kendall et

al., 2007).

Con el fin de estudiar la regulación mediada por la proteína KstR de M.

smegmatis (KstRMsm), se procedió a la clonación del gen kstR y a la realización de

distintos ensayos in vitro para estudiar la interacción de KstR con sus regiones

operadoras. Para ello se eligió la región que precede al gen MSMEG_5228, uno

de los genes pertenecientes al regulón de KstR (Kendall et al., 2007) que codifica

la 3-β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (3-β HSDMS) ampliamente estudiada en

este trabajo y de la que se ha comprobado su capacidad de catalizar el primer

paso en el catabolismo del colesterol, la transformación del colesterol en 4-

colesten-3-ona (apartado 2 de Resultados).

5.2.1 Caracterización del promotor P5228

El gen MSMEG_5228 codifica la proteína 3-β HSDMS responsable (como se

ha demostrado en este trabajo) de realizar el primer paso de la ruta de

degradación del colesterol. El promotor de dicho gen, P5228, contiene una probable

secuencia operadora para el regulador KstR (Kendall et al., 2007) aunque hasta la

fecha no se había demostrado experimentalmente. Con el fin de caracterizar el

promotor P5228, se realizó una fusión de la región promotora (situada entre los

genes MSMEG_5227 y MSMEG_5228) con el gen marcador lacZ. El fragmento

que portaba la región promotora se amplificó por PCR a partir de DNA

cromosómico utilizando los oligonucleótidos 5228pUJ9 F y 5228pUJ9 R. El

fragmento amplificado de 191 pb se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y

BamHI y se clonó en el plásmido pUJ9. El plásmido resultante pUJ9-5228 se

secuenció para confirmar que la secuencia de nucleótidos del fragmento clonado

era la correcta (Fig. 61 B).

186

Resultados

5.2.1.1 Identificación del sitio de inicio de la transcripción del promotor P5228

Para determinar el sitio de inicio de la transcripción se utilizó la técnica de

extensión del cebador o primer extension utilizando el oligonucleótido Lac57 y

como molde el plásmido pUJ9-5228. Como resultado se obtuvo una monohebra

de cDNA cuyo tamaño coincidía con el tránscrito debido al promotor P5228.

Sorprendentemente se comprobó que la transcripción comienza en el codón de

iniciación (ATG) de la traducción del gen MSMEG_5228 (Fig 61 A). Este resultado

indica que por la posición del inicio el mRNA transcrito a partir de P5228 es un

mRNA denominado leaderless, es decir, un mRNA que carece de la región 5’ no

traducida (5’UTR) que normalmente contiene la secuencia Shine-Dalgarno (SD)

(Moll et al., 2002). Justo aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción se

encuentra una posible caja −10 (TATGCT) cuya secuencia se ha reconocido en

micobacterias (Gomez y Smith, 2000) y a 17 pb de ésta se encuentra una posible

caja −35 (TCGAAA) que difiere en un nucleótido de regiones −35 consenso

reconocidas en micobacterias (Gomez y Smith, 2000).

187

Resultados

+1 T G C A

AAAGTCAATACGACGCCC

+1 T G C A

A TTGGATGATTCGCTGCAGCTCTGGGAGCGTGGCGAGGCGCTGGCGAAACGCTGTGAAGAGCACTTAGCCGGAGCGCGTCAGCGCGTCGAGCAGGCGATCGCCGCCCGCGAGGCCGACGAGGACTGAAATGCGCGTAGTGCCCGCCGCTCACCATCGAAACTGGAACGTGTTTCAGTTATGCTGCGGGCATG B Figura 61. Localización del sitio de inicio de la transcripción en el promotor P5228. A. Ensayo

de extensión del cebador. El experimento de extensión del cebador se realizó según se detalla en

el apartado 7.6 de Materiales y Métodos a partir del RNA total aislado de células de las cepas E.

coli DH10B conteniendo el plásmido pUJ9-5228. Se utilizó el oligonucleótido Lac57, el cual hibrida

entre los nucleótidos 39 y 62 en posición 3’ respecto al residuo de adenina del codón de inicio de la

traducción del gen lacZ (Tabla 3) para producir la extensión. La localización del producto de

extensión se determinó comparándolo con el patrón de secuencia del promotor utilizando el mismo

oligonucleótido Lac57 (calles T, G, C, A). En el lateral derecho de la figura se muestra la secuencia

5228pUJ9 F

5228pUJ9 R

GTAC

AAAGTCAATACGACGCCC

AC

GT

188

Resultados

de nucleótidos que flanquea el sitio +1 (señalado en rojo), de la hebra no codificante. B. Secuencia

del promotor P5228. En azul se han marcado las zonas donde hibridan los oligonucleótidos

5228pUJ9 F y 5228pUJ9 R utilizados para la amplificación de esta región promotora. En gris se ha

marcado el supuesto sitio −10 de la región promotora del gen. El posible sitio −35 se ha señalado

en rosa. En rojo se ha marcado el sitio +1 de inicio de la transcripción, que coincide con la adenina

del codón de iniciación del gen MSMEG_5228, y en verde el final del gen (codón STOP) que

precede a MSMEG_5228.

5.2.2 Regulación del promotor P5228 por KstR

La región promotora del gen MSMEG_5228 así como el principio de este gen

se analizó con el fin de diseñar los oligonucleótidos necesarios para amplificar una

sonda de DNA adecuada para el análisis de su regulación mediante KstR. Esta

región se muestra en la figura 62 donde se pueden apreciar las zonas donde

hibridan los oligonucleótidos 5228 FP F y 5228 FP R. La amplificación de la región

comprendida entre estas zonas da lugar a la sonda 5228 FP (196 pb). En la figura

se ha marcado el supuesto sitio −10 de la región promotora del gen. Este

supuesto sitio −10 de MSMEG_5228 (TATGCT) se sitúa a una distancia de dos

bases del motivo de unión a KstR (señalado en la figura). La posible caja −35 se

encuentra a una base de distancia del motivo de unión a KstR. Aunque no

coincide exactamente (por una posición de diferencia) con regiones −35 conocidas

(Gomez y Smith, 2000), se sabe que las regiones −35 micobacterianas toleran una

gran variedad de secuencias (Bashyam et al., 1996). En la figura también se han

marcado el codón de iniciación de MSMEG_5228, y el final del gen (codón STOP)

que precede a MSMEG_5228.

189

Resultados

TCAGCGCGTCGAGCAGGCGATCGCCGCCCGCGAGGCCGACGAGGACTGAAATGCGCGTAGTGCCCGCCGCTCA

CCATCGAAACTGGAACGTGTTTCAGTTATGCTGCGGGCATGGCTGACTCCACCACCGACCTCGGGCG

GATCCTGGTCACCGGGGGTTCCGGCTTCGTCGGCGCCAACCTGGTCACCGAACTGC

5228 FP F

5228 FP R Figura 62. Región amplificada por la sonda 5228 FP. En azul se han marcado las zonas donde

hibridan los oligonucleótidos 5228 FP F y 5228 FP R. La amplificación de la región comprendida

entre estas zonas da lugar a la sonda 5228 FP. En gris se ha marcado el supuesto sitio −10 de la

región promotora del gen. El motivo de unión a KstR se ha señalado en rojo. El posible sitio −35 se

ha señalado en rosa. En amarillo se ha marcado el codón de iniciación de MSMEG_5228, y en

verde el final del gen (codón STOP) que precede a MSMEG_5228.

5.2.2.1 Clonación, hiperexpresión y purificación de la proteína KstRMsm

Para caracterizar el mecanismo de regulación mediado por KstRMsm se

procedió en primer lugar a la clonación del gen kstRMsm (MSMEG_6042). Para ello,

se amplificó por PCR y se subclonó en el vector de hiperexpresión pET-29a (+),

fusionando 6 tripletes en fase en su extremo 3’ que codifican un tag de 6His,

dando como resultado el plásmido pET6042 (Fig. 63). Este plásmido fue

posteriormente transferido a la cepa E. coli BL21 (DE3) y los extractos proteicos

de la cepa E. coli BL21 (DE3) (pET6042) fueron analizados mediante SDS-PAGE.

Se probaron distintas condiciones de cultivo, y finalmente se seleccionaron las

descritas en el apartado 5.3 de Materiales y Métodos (inducción de cultivos a

DO600 0,6 con IPTG 200 μM durante 3 h a 37 ºC), que dan lugar a la aparición de

una banda de hiperproducción cuyo tamaño aproximado coincide con el predicho

de 27,7 kDa (24,84 kDa + 2,86 kDa) para KstR fusionada con un tag de 6His

(Kendall et al., 2007) (Figura 64).

La proteína de fusión fue purificada a homogeneidad electroforética a partir

del extracto de E. coli mediante cromatografía de afinidad utilizando columnas de

níquel-nitrilotriacetato en gel de sílice (véase apartado 5.3 de Materiales y

Métodos) (figura 64).

190

Resultados

KmR

ori

lacI

PT7

Polilinker

pET-29a(+)(5,4 kb)

pET6042(6,1 kb)

KmR

ori

lacI

PT7

MSMEG_6042

NdeI XhoI

pET6042 F pET6042 R

Ligación

Ligación

Digestión

pGEM®-TEasy (3,0 kb)

ori

ApR

pGEM6042(3,7kb)

ori

ApRKmR

ori

lacI

PT7

Polilinker

pET-29a(+)(5,4 kb)

KmR

ori

lacI

PT7

Polilinker

pET-29a(+)(5,4 kb)

pET6042(6,1 kb)

KmR

ori

lacI

PT7

MSMEG_6042

NdeI XhoI

pET6042 F pET6042 R

Ligación

Ligación

Digestión

pGEM®-TEasy (3,0 kb)

ori

ApR

pGEM®-TEasy (3,0 kb)

ori

ApR

pGEM6042(3,7kb)

ori

ApR

Figura 63. Representación esquemática de la construcción del plásmido pET6042. El gen

kstR (MSMEG_6042) fue amplificado por PCR utilizando la pareja de oligonucleótidos pET6042 F y

pET6042 R (Tabla 3 de Materiales y Métodos) y DNA genómico de M. smegmatis mc2155 como

molde. El oligonucleótido pET6042 R fue diseñado eliminando el codón stop del gen kstR e

introduciendo en su lugar la diana de restricción XhoI. El gen se clonó directamente en el vector

pGEMT-easy originando el plásmido pGEMT6042. Posteriormente, el fragmento que contenía el

gen kstR fue subclonado en el vector pET-29a (+) como un inserto NdeI/XhoI originando el

plásmido pET6042 que expresa un gen kstR cuyo extremo 3’ tiene fusionados en fase 6 tripletes

que codifican un tag de 6His. Las abreviaturas utilizadas son: ApR, gen que confiere resistencia a

ampicilina; KmR, gen que confiere resistencia a kanamicina; lacI, gen que codifica el represor LacI;

PT7, promotor del gen 10 del fago T7; ori, origen de replicación.

191

Resultados

192

Las fracciones de elución de la columna seleccionadas se concentraron y se

eliminó el imidazol de las mismas (véase el apartado 5.3 de Materiales y

Métodos). La concentración de proteína pura KstR-His se calculó

espectrofotométricamente utilizando un Nanodrop. Siguiendo este protocolo, se

obtuvieron concentraciones de entre 80-100 μM de proteína purificada a partir de

100 ml de cultivo inicial.

66 ,0

116

45 ,0 ,0

,0 97,4

31

21,5

14,4

200,0

KDa 1 2 3 4 5 6

Figura 64. Purificación de la proteína KstR-His a partir de extractos de E. coli BL21 (DE3) (pET6042). Se muestran las fracciones de la proteína KstR-His eluída desde columnas de níquel

utilizando distintas concentraciones de imidazol. 1. Marcadores de peso molecular (en el margen

izquierdo de la figura se detallan los pesos moleculares de los marcadores). 2-6. Fracciones de un

extracto de E. coli BL21 (DE3) (pET6042) eluído tras la cromatografía de afinidad utilizando

sucesivamente las distintas concentraciones de imidazol: 2. 10 mM. 3. 200 mM. 4. 300 mM. 5. 500

mM. 6. 1 M. En todas las calles se cargaron 5 μl de muestra.

5.2.2.2 Unión de KstR a la región intergénica 5228

Con el fin de estudiar el mecanismo de represión ejercido por KstR se

realizaron ensayos de retardo en gel para analizar la capacidad de unión de esta

proteína a la región intergénica 5228. Para ello en primer lugar se utilizó como

sonda de DNA el fragmento 5228 FP (196 pb) y concentraciones crecientes de

extracto proteico E. coli BL21 (DE3) (pET6042) (0,5-10 μg totales) (Fig. 65). Los

resultados muestran que el extracto que contiene la proteína KstR se une a la

Resultados

región intergénica 5228, mientras que el extracto obtenido a partir de la cepa con

el plásmido sin inserto no (Fig. 65). Además, esta unión es específica, ya que

cuando se añade a la mezcla de reacción la sonda 5228 FP no marcada no se

observó retardo debido a la proteína KstR (datos no mostrados).

1 2 3 4 51 2 3 4 5

Sonda 5228 FP

Complejo 5228 FP/Extracto 6042

Figura 65. Ensayos de retardo en gel con el extracto proteico E. coli BL21 (DE3) (pET6042) sobre la sonda 5228 FP. 1. Sonda sin proteína. 2. Sonda con extracto control E. coli BL21 (DE3)

conteniendo el plásmido pET29 sin inserto. Se añadieron 20 μg de proteínas totales. 3-5, sonda

con concentraciones crecientes de extracto proteico E. coli BL21 (DE3) (pET6042): 3. 0,5 μg de

proteínas totales. 4. 5 μg de proteínas totales. 5. 10 μg de proteínas totales. Los ensayos de

retardo en gel se realizaron como se indica en el apartado 6.2 de Materiales y Métodos. La

localización de las sondas y los complejos sonda/proteína se indican con flechas.

Los ensayos de retardo en gel también se llevaron a cabo adicionando

cantidades crecientes de KstR purificada (Fig. 66). El resultado muestra que el

complejo KstR-DNA se observa ya a concentraciones muy bajas de la proteína

cercanas a 20 nM.

La mayoría de los represores transcripcionales descritos ejercen su efecto

represor mediante un mecanismo de unión a la región operadora que bloquearía la

unión de la RNA polimerasa, o bien la elongación del mRNA. La represión se

anularía en presencia de la molécula inductora, que provocaría un cambio

conformacional en el represor y la posterior desunión de éste al DNA, permitiendo

así la transcripción. Para comprobar si KstR era capaz de desunirse del DNA en

presencia de colesterol, se realizaron ensayos de retardo en gel en presencia de

colesterol disuelto en Triton X-100 al 10% (0,25-4,00 mM). En todas las

193

Resultados

condiciones ensayadas la proteína KstR permanecía unida a la sonda 5228 FP en

presencia de este compuesto, y tampoco se observó una disminución de la

afinidad del regulador por la sonda (resultados no mostrados).

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

Sonda 5228 FP

Complejo 5228 FP/KstR

Figura 66. Ensayo de retardo en gel con la proteína KstR purificada sobre la sonda 5228 FP. 1. Sonda sin proteína. 2-8, concentraciones crecientes de sonda con la proteína KstR-His6: 2. 2,5

nM. 3. 5 nM. 4. 10 nM. 5. 20 nM. 6. 40 nM. 7. 80 nM. 8. 100 nM. Los ensayos de retardo en gel se

realizaron como se indica en el apartado 6.2 de Materiales y Métodos. La localización de las

sondas y los complejos sonda/proteína se indican con flechas.

5.2.2.3 Determinación de las regiones operadoras de KstR en la región promotora de MSMEG_5228

Para identificar los sitios de unión de KstR a la región promotora de

MSMEG_5228 se analizó el complejo KstR-DNA mediante un ensayo de

protección de la sonda de DNA 5228 FP a la digestión con DNasaI con

concentraciones crecientes de extracto proteico de E. coli BL21 (DE3) (pET6042)

(Fig. 67, calles 4-6) y proteína KstR purificada (Fig. 67, calles 7-10) (véase el

apartado 6.3 de Materiales y Métodos). El resultado reveló que el operador de

KstR es una secuencia de 31 nucleótidos, localizados entre la posición −5 y −35

respecto al codón de inicio ATG del gen MSMEG_5228, siendo curiosamente la

huella obtenida con extractos proteicos más nítida que la hallada con la proteína

KstR pura. Esta región solapa por tanto con las posibles cajas −10 y −35, lo que

sugiere que la unión de KstR al operador impediría la unión de la RNA polimerasa

y con ello el inicio de la transcripción desde el promotor.

194

Resultados

A+G DNA Control Ep Ep6042 KstR DNA

C G T C G T A T T G

C A A A G C T

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

A C T T T G T G C A A G G T

Figura 67. Identificación de los sitios de unión de la proteína KstR a la región promotora de MSMEG_5228 mediante experimentos de protección frente a la digestión con DNasaI. La

calle señalada como A+G muestra la reacción de secuenciación de la sonda 5228 FP por el

método de Maxam y Gilbert. Como sonda se utilizó el fragmento 5228 FP marcado en el extremo

5’. Como control se utilizaron 5 y 20 μg de extracto de E. coli BL21 (DE3) conteniendo el plásmido

pET29 sin inserto (calles 2 y 3, respectivamente). Los ensayos se llevaron a cabo tanto con

extracto proteico E. coli BL21 (DE3) (pET6042) como con proteína KstR pura. Para los

experimentos realizados con extractos se utilizaron 5, 10 y 20 μg de proteínas totales (calles 4, 5 y

6, respectivamente). Las concentraciones de proteína KstR pura utilizadas en los experimentos

fueron 2,5, 40, 100 y 400 nM (calles 7, 8, 9 y 10, respectivamente). A la izquierda de la figura se

muestra la secuencia de la región protegida por KstR, señalándose en rojo el motivo de unión a

KstR (cuyas regiones palindrómicas se señalan con flechas), en azul el supuesto sitio −10 y en

verde el supuesto sitio −35.

195

Resultados

5.3 Estudio de la regulación mediada por KstR2 mediante la técnica de microarrays

La presencia y posible función del regulador transcripcional KstR2 se hizo

evidente tras el análisis de la región regulada por KstR (Kendall et al., 2007) ya

que dentro de esta región destacaba una zona formada por 19 genes

(MSMEG_5999-MSMEG_6017) cuya expresión no estaba afectada en el mutante

del regulador KstR. En R. jostii RHA1 los correspondientes genes ortólogos

estaban inducidos en colesterol (van der Geize et al., 2007). Así mismo, genes de

M. smegmatis mc2155 situados dentro de esta zona también presentaron

inducción en colesterol en los experimentos con microarrays realizados durante

esta tesis doctoral (véase apartado 3 de Resultados). Estas pruebas apoyaban la

implicación de este conjunto de genes en el catabolismo del colesterol. Dentro de

esta zona se localiza un gen que codifica una segunda proteína que presenta

similitud con reguladores tipo TetR (MSMEG_6009), lo que sugería la posible

implicación de esta proteína, denominada KstR2 (Kendall et al., 2010) en la

regulación de estos genes, así como la posibilidad de que se tratase de un

represor transcripcional, como en el caso de KstR y de la mayoría de los

reguladores tipo TetR (Ramos et al., 2005).

Mediante el programa MEME se identificó un posible motivo de unión para

KstR2 (AnCAAGnnCTTGnT) y se encontraron tres de ellos en el genoma de M.

smegmatis y M. tuberculosis, dos de ellos situados en regiones intergénicas de

genes divergentes cercanos a kstR2 y el tercero en la región que lo precede

(Kendall et al., 2010) (Fig. 68). Estos datos apoyaban el papel de KstR2 como

regulador de genes relacionados con el catabolismo del colesterol.

Para demostrar esta posible función reguladora, se llevaron a cabo

experimentos de expresión diferencial de un mutante de deleción del gen kstR2

frente a la cepa salvaje M. smegmatis mc2155. Estos experimentos de expresión

diferencial mediante microarrays se han realizado en colaboración con el grupo de

Neil G. Stoker en el Departamento de Patología y enfermedades Infecciosas del

Royal Veterinary College de Londres.

196

Resultados

5.3.1 Resultados de los análisis mediante microarrays de M.

smegmatisΔkstR2

Para determinar los genes de M. smegmatis mc2155 regulados por KstR2, se

realizaron estudios de expresión diferencial de una cepa con el gen kstR2

delecionado frente a la cepa salvaje, ambas crecidas en medio rico (7H9-ADC)

utilizando la técnica de los microarrays (véase el apartado 7.5 de Materiales y

métodos).

5999 6001 60046002 60036000 6013 6014 6015 6016

6082

6011 6012601060076005 6006 60096008

6064

6017

[125] (4) [105] (1) (4) (4) [17][15] [61] (4) (4) (4) [43] (4) [7] [88] (8) [314] 5999 6001 60046002 60036000 6013 6014 6015 6016

6082

6011 6012601060076005 6006 60096008

6064

6017

[125] (4) [105] (1) (4) (4) [17][15] [61] (4) (4) (4) [43] (4) [7] [88] (8) [314]

Figura 68. Región del genoma de M. smegmatis mc2155 controlada por KstR2. Se han

señalado con una estrella aquellos genes cuya represión (o la del operón del que forman parte) por

KstR2 se ha comprobado mediante microarrays o RTq-PCR. Con una flecha roja se han señalado

las 3 regiones intergénicas donde se han hallado motivos de unión para KstR2. Los números que

se muestran por debajo de los genes señalan el número de pb entre genes adyacentes. Los

números entre corchetes indican separación y los números entre paréntesis solapamiento. Los

números que aparecen sobre las líneas en diagonal indican las posiciones del genoma, en kb,

entre las que se encuentra esta región.

Los resultados muestran un total de 8 genes significativamente inducidos

(con un valor de P<0,05) en esta zona, sin embargo se ha asumido que en total

son 14 los genes que presentan inducción en el mutante (Tabla 23), ya que

aunque el valor de P es mayor de 0,05, se encuentran dentro de un operón

inducido. Además en algunos de los genes se ha confirmado su inducción

mediante RTq-PCR (Kendall et al., 2010).

Los niveles de inducción de los genes MSMEG_5999-MSMEG_6004 en el

mutante en KstR2 son muy elevados. Estos genes parecen estar organizados en

dos operones divergentes, MSMEG_6001-MSMEG_6004 y MSMEG_6000-

197

Resultados

MSMEG_5999, y en la región intergénica de 61 pb que los separa se encuentra un

motivo de unión para KstR2 (Fig.68).

Los genes MSMEG_6005-MSMEG_6007 parecen no estar regulados por

KstR2. Su expresión no está alterada significativamente en los microarrays y

tampoco presentan motivos de unión para KstR2 en las regiones que los

preceden. Estos datos se ven apoyados por el hecho de que estos genes no

aparecen inducidos en colesterol en los microarrays de expresión diferencial en

este esteroide (véase el apartado 3 de Resultados), y porque tampoco presentan

genes ortólogos en M. tuberculosis o R. jostii (Kendall et al., 2010).

El gen MSMEG_6009, que codifica la proteína KstR2, se encuentra ausente

en el mutante, ya que está delecionado. El gen situado tras kstR2, MSMEG_6008,

parece formar un operón con él, y se detectan niveles de expresión muy elevados

en el mutante. Sin embargo, la expresión del gen MSMEG_6010 no se encuentra

alterada en el mutante y tampoco muestra inducción en colesterol (véase el

apartado 3 de Resultados), lo que sugiere que KstR2 se une a la región

intergénica entre MSMEG_6009 y MSMEG_6010 para regular la expresión génica

en una sola dirección (Kendall et al., 2010).

Los genes MSMEG_6011-MSMEG_6017 también aparecen inducidos en el

mutante y parecen organizarse en dos operones divergentes, MSMEG_6012-

MSMEG_6011 y MSMEG_6013-MSMEG_6017 (Fig. 68). En la región intergénica

de 105 pb que separa a MSMEG_6012 de MSMEG_6013 se encuentra un motivo

de unión para KstR2.

198

Resultados

M M M M M

M

M M M M M M M

M

M M M M M

Tabla 23. Análisis de expresión de ΔkstR2Msm y el regulón kstR2. Se muestran los valores de

fold change de los genes de la región regulada por KstR2. Aquellos señalados con un asterisco

presentaron un valor de P<0,05. Los genes MSMEG_6005-MSMEG_6007 y MSMEG_6010 no se

consideran inducidos, así como el gen MSMEG_6009, que codifica KstR2 y por tanto está

delecionado en el mutante. Se señalan los genes ortólogos en M. tuberculosis y la función de las

proteínas codificadas. Tabla adaptada de Kendall et al., 2010.

Aminotransferasa, clase I Rv3565100,8SMEG_6017

Supuesta acil-CoA deshidrogenasaRv35649,5SMEG_6016

Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE32)Rv356315,5*SMEG_6015

Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE31)Rv35621,6SMEG_6014

Probable CoA sintetasa de ácidos grasos(fadD3)Rv35612,2SMEG_6013

Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE30)Rv3560c173,6*SMEG_6012

Deshidrogenasa de cadena cortaRv3559c3,2SMEG_6011

Proteína hipotética_-3,0SMEG_6010

Regulador transcripcional de la familia TetR (kstR2)Rv3557c-1,2SMEG_6009

Acetil-CoA acetiltransferasa (fadA6)Rv3556c88,8*SMEG_6008

Transportador de difusión de cationes_-1,1SMEG_6007

Proteína hipotética_1,1SMEG_6006

Proteína hipotética_2,3SMEG_6005

Oxidorreductasa, familia 2-nitropropano dioxigenasasRv35535,2SMEG_6004

Coenzima A transferasa, subunidad B Rv3552110,6*SMEG_6003

Coenzima A transferasa, subunidad A Rv3551150,5*SMEG_6002

Enoil-CoA hidratasa (echA20)Rv3550250,7*SMEG_6001

Deshidrogenasa de cadena cortaRv3549c2017,0*SMEG_6000

Deshidrogenasa de cadena cortaRv3548c140,3*SMEG_5999

FunciónGen de M.

tuberculosisFold

change

Gen de M.egmatis

mc²155Sm

Aminotransferasa, clase I Rv3565100,8SMEG_6017

Supuesta acil-CoA deshidrogenasaRv35649,5SMEG_6016

Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE32)Rv356315,5*SMEG_6015

Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE31)Rv35621,6SMEG_6014

Probable CoA sintetasa de ácidos grasos(fadD3)Rv35612,2SMEG_6013

Supuesta acil-CoA deshidrogenasa (fadE30)Rv3560c173,6*SMEG_6012

Deshidrogenasa de cadena cortaRv3559c3,2SMEG_6011

Proteína hipotética_-3,0SMEG_6010

Regulador transcripcional de la familia TetR (kstR2)Rv3557c-1,2SMEG_6009

Acetil-CoA acetiltransferasa (fadA6)Rv3556c88,8*SMEG_6008

Transportador de difusión de cationes_-1,1SMEG_6007

Proteína hipotética_1,1SMEG_6006

Proteína hipotética_2,3SMEG_6005

Oxidorreductasa, familia 2-nitropropano dioxigenasasRv35535,2SMEG_6004

Coenzima A transferasa, subunidad B Rv3552110,6*SMEG_6003

Coenzima A transferasa, subunidad A Rv3551150,5*SMEG_6002

Enoil-CoA hidratasa (echA20)Rv3550250,7*SMEG_6001

Deshidrogenasa de cadena cortaRv3549c2017,0*SMEG_6000

Deshidrogenasa de cadena cortaRv3548c140,3*SMEG_5999

M

M

M

M

M

M

M

M

M

M

M

M

M

M

M

M

M

M

M

Función

Gen de M.egmatis

mc²155Fold

changeGen de M.

tuberculosisSm

199

200

Discusión

V. DISCUSIÓN

201

Discusión

202

Discusión

V. DISCUSIÓN

1. Estudio del potencial catabólico de degradación de esteroides de M. smegmatis mc2155

A lo largo de esta tesis doctoral se ha abordado el estudio de la degradación

de esteroides, principalmente el colesterol, llevado a cabo por la bacteria M.

smegmatis mc2155. Así, uno de los primeros objetivos fue la realización de un

perfil de los compuestos esteroideos que pueden ser utilizados como fuente de

carbono y energía por este microorganismo.

El crecimiento de M. smegmatis mc2155 en diferentes esteroides parece

bastante específico para aquellos de cadena lateral de 8 átomos de carbono como

son el colesterol y la 4-colesten-3-ona. Su crecimiento es bastante más limitado en

derivados de estas moléculas que son intermediarios de la ruta de degradación del

colesterol, como AD y ADD, y en otros esteroides sin cadena lateral o con una

cadena lateral más corta que la del colesterol, como son la androsterona,

dehidroandrosterona, β-estradiol o pregnenolona, entre otros (véase apartado 1.1

de Resultados). Este comportamiento sugiere la importancia que la presencia de

la cadena lateral puede tener en la capacidad de crecimiento en esteroides de M.

smegmatis. Comparativamente, en especies del género Rhodococcus se ha

observado el crecimiento en un mayor rango de compuestos esteroídicos. Por

ejemplo R. erythropolis SQ1 es capaz de degradar AD, ADD y 9α-hidroxi-4-

androsten-3,17-diona (van der Geize et al., 2000). R. jostii RHA1 por su parte es

capaz de crecer, además de en colesterol, en AD, 5-α-colestanol, 5-α-colestanona,

ácido cólico, progesterona y β-sitosterol, aunque como en el caso de M.

smegmatis, su crecimiento es deficiente en esteroides como el ergosterol o el

estradiol (Mohn et al., 2008). Curiosamente, un mutante de R. jostii RHA1 en el

locus mce4, que está implicado en el transporte de esteroides, pierde la

capacidad de crecimiento en colesterol, 5-α-colestanol, 5-α-colestanona y en β-

sitosterol, mientras que la conserva en AD, ácido cólico y progesterona (Mohn et

al., 2008). El colesterol, 5-α-colestanol, 5-α-colestanona y β-sitosterol tienen

203

Discusión

estructuras muy similares con largas cadenas laterales (de 8 átomos de carbono

las 3 primeras y de 10 el β-sitosterol). Las estructuras de AD, ácido cólico y

progesterona tienen cadenas laterales más cortas y polares (la AD presenta un

grupo ceto en el C-17 y las cadenas laterales del ácido cólico y la progesterona

son de 5 y de 2 átomos de carbono respectivamente). Este resultado sugiere que

estos esteroides con cadena lateral más corta y polar podrían ser transportados en

R. jostii RHA1 por otro sistema distinto del constituido por el locus mce4 (Mohn et

al., 2008). Esta hipótesis podría explicar el crecimiento deficiente de M. smegmatis

en esteroides con cadena lateral corta, ya que esta bacteria podría carecer de un

sistema de transporte eficiente para los mismos, por lo que su capacidad

degradativa se centraría principalmente en los esteroides con cadena lateral larga,

que se transportarían por el sistema codificado por el locus mce4 que M.

smegmatis posee. Un caso aparte parece ser el del ergosterol, que a pesar de

poseer una cadena lateral de 9 átomos de carbono permite un crecimiento limitado

a M. smegmatis, pero curiosamente este comportamiento también se observa en

R. jostii RHA1. Este hecho sugiere que la dificultad de crecimiento en este

esteroide podría estar relacionada con otras propiedades estructurales. A este

respecto podría tener importancia la existencia de un doble enlace en la cadena

lateral del ergosterol más que la longitud de su cadena lateral.

2. Análisis de las enzimas que catalizan la transformación de colesterol en 4-colesten-3-ona en M. smegmatis mc2155

Otro de los objetivos de este trabajo fue el estudio de distintas proteínas

posiblemente implicadas en el primer paso de degradación del colesterol. Así,

dentro del apartado 2 de Resultados se han analizado 3 enzimas que podrían

catalizar la transformación de colesterol en 4-colesten-3-ona. Sin embargo, se ha

constatado este paso solo en dos de ellas, 3-β HSDMS y SDRMS. La tercera

enzima, ChoDMS, que presenta una elevada identidad (83% cuantificada por

ClustalW) con la ChoD de M. tuberculosis no ha demostrado ser activa en

nuestros experimentos. En M. tuberculosis se verificó que un mutante en el gen

204

Discusión

ksdD (que es incapaz de transformar AD en ADD y por tanto continuar la

degradación de colesterol a partir de este paso) complementado con el gen choD

(expresado bajo un promotor micobacteriano fuerte, el promotor de choque

térmico Phsp65, e integrado en el cromosoma utilizando el vector integrativo

pMV306) podía acumular temporalmente 4-colesten-3-ona, lo que sugería la

capacidad de catalizar la oxidación de colesterol por ChoD (Brzostek et al., 2007).

En ese mismo trabajo también se apuntó que el gen choD de M. tuberculosis

clonado en un sistema de expresión de E. coli bajo el control de un promotor

inducible por IPTG mostró actividad utilizando un ensayo colorimétrico. Sin

embargo, no se verificó la conversión de colesterol en 4-colesten-3-ona, por lo que

algunos autores cuestionan este resultado (Kreit y Sampson, 2009), y se inclinan

por la opinión de que las enzimas tipo ChoD podrían no poseer actividad colesterol

oxidasa, aunque sí pertenecer al grupo de las glucosa-metanol-colina (GMC)

oxidorreductasas (Navas et al., 2001). Nuestros intentos de ensayar la actividad

enzimática de ChoDMS en un sistema de expresión de E. coli (en nuestro caso

utilizando el vector pET29) que se realizaron, además de con ensayos

colorimétricos, con ensayos de LC/MS y mediante visualización de intermediarios

radiactivos mediante TLC, no dieron lugar a resultados positivos. Este hecho pone

en duda también para nosotros los datos obtenidos por Brzostek et al. (2007), ya

que aunque su trabajo está realizado con la ChoD de M. tuberculosis ésta es muy

similar a ChoDMS, y cabría esperar por tanto un comportamiento similar en ambas

enzimas. Sin embargo, tampoco se puede descartar que la falta de actividad de

ChoDMS pueda deberse a que la proteína no se excreta o se pliega de manera

adecuada en el sistema heterólogo utilizado. Por otra parte, cabe destacar que en

este trabajo se ha demostrado que un mutante en el gen choDMS no presenta

alterado su crecimiento en colesterol, lo que no es sorprendente dado que, como

ya se ha apuntado, en este trabajo se han encontrado otras dos enzimas capaces

de catalizar este paso enzimático en M. smegmatis.

Por otro lado, el gen choDMS (MSMEG_1604) se localiza en una zona del

genoma de M. smegmatis que no parece tener ninguna relación con la

degradación de esteroides (Fig. 69).

205

Discusión

Figura 69. Región del genoma de M. smegmatis mc2155 circundante al gen MSMEG_1604. En

el cuadro se indica la posible función de los productos de los genes de la zona. Información

extraída del servidor CMR: http://cmr.jcvi.org/tigr-scripts/CMR/CmrHomePage.cgi

MSMEG_1599: Factor sigma-70 RNA polimerasaMSMEG_1600: Proteina hipotetica conservada MSMEG_1601: Proteina hipotetica conservadaMSMEG_1602: Inosina-5-monofosfato deshidrogenasaMSMEG_1603: Proteina de la familia IMP deshidrogenasa

MSMEG_1605: Proteina reguladora del transporte de fosfatoMSMEG_1606: BenzoilformatodecarboxilasaMSMEG_1607: Supuesta tautomerasaMSMEG_1608: GlicosiltransferasaMSMEG_1609: Beta-fosfoglucomutasahidrolasa

MSMEG_1599: Factor sigma-70 RNA polimerasaMSMEG_1600: Proteínahipotética conservada MSMEG_1601: Proteína hipotética conservadaMSMEG_1602: Inosina-5-monofosfato deshidrogenasaMSMEG_1603: Proteína de la familia IMP deshidrogenasa

MSMEG_1605: Proteína reguladora de transporte de fosfatoMSMEG_1606: Benzoilformato decarboxilasaMSMEG_1607: Supuesta tautomerasaMSMEG_1608: Glicosil transferasaMSMEG_1609: Beta -fosfoglucomutasa hidrolasa

MSMEG_1599: Factor sigma-70 RNA polimerasaMSMEG_1600: Proteina hipotetica conservada MSMEG_1601: Proteina hipotetica conservadaMSMEG_1602: Inosina-5-monofosfato deshidrogenasaMSMEG_1603: Proteina de la familia IMP deshidrogenasa

MSMEG_1605: Proteina reguladora del transporte de fosfatoMSMEG_1606: BenzoilformatodecarboxilasaMSMEG_1607: Supuesta tautomerasaMSMEG_1608: GlicosiltransferasaMSMEG_1609: Beta-fosfoglucomutasahidrolasa

MSMEG_1599: Factor sigma-70 RNA polimerasaMSMEG_1600: Proteínahipotética conservada MSMEG_1601: Proteína hipotética conservadahipotética conservadaMSMEG_1602: Inosina-5-monofosfato deshidrogenasaMSMEG_1603: Proteína de la familia IMP deshidrogenasa

MSMEG_1605: Proteína reguladora de transporte de fosfatoMSMEG_1606: Benzoilformato decarboxilasaMSMEG_1607: Supuesta tautomerasaMSMEG_1608: Glicosil transferasaMSMEG_1609: Beta -fosfoglucomutasa hidrolasa

Al igual que sucede en el gen choDMS, el cual se ha comprobado que no se

induce en presencia de colesterol y que no posee en su región promotora

secuencias operadoras de KstR o KstR2, ninguno de los genes circundantes se ha

visto implicado en el metabolismo del colesterol o inducido en su presencia, y

ninguno de ellos presenta en su región promotora secuencias consenso para la

unión de KstR o KstR2, que aunque como hemos visto no es requisito

indispensable para inducirse en la presencia de colesterol, podría indicar una

posible implicación de esta zona con el catabolismo del colesterol.

La secuencia completa del genoma de M. leprae, un patógeno intracelular

obligado, muestra una reducción dramática de genes funcionales, con una

capacidad codificante menor del 50%. A pesar de esta reducción masiva de

genes, el bacilo de la lepra ha conseguido preservar un grupo mínimo de genes, la

mayoría de ellos compartidos con M. tuberculosis, que permiten su supervivencia

en el hospedador dando lugar a las consiguientes manifestaciones patológicas.

Uno de estos genes conservados y cuya expresión se ha comprobado in vivo en

M. leprae es choD (Marques et al., 2008). La proteína codificada por este gen se

encuentra en la fracción de proteínas presentes en la pared celular, donde se

produciría la oxidación del colesterol. La pared celular parece de hecho un

compartimento celular muy activo en la degradación lipídica en general en este

206

Discusión

patógeno (Marques et al., 2008). Aunque M. leprae no parece contener la

maquinaria metabólica necesaria para catabolizar completamente el colesterol, se

ha propuesto que el colesterol es un factor necesario para su crecimiento en

macrógafos (Kato, 1978). Además M. leprae es capaz de adquirir colesterol del

medio ambiente y parece que incluso podría sintetizarlo (Lamb et al., 1998). Se

desconoce aún el porqué de la necesidad de colesterol en M. leprae, y para qué lo

oxida (supuestamente utilizando ChoD). Estos datos sugieren que esta proteína

presente en general en todas las micobacterias no estaría implicada

exclusivamente en el catabolismo del colesterol para su aprovechamiento como

fuente de carbono y energía. El hecho de que un mutante en este gen en M.

tuberculosis esté atenuado en ratones (Brzostek et al., 2007) puede sugerir que

podría actuar sobre el colesterol de algún modo que favorezca su patogenicidad

(mecanismo que compartiría con M. leprae). Un estudio in vitro sugiere que

durante la invasión de macrófagos por parte de Rhodococcus equi, la lisis de la

membrana está facilitada por la inducción de una colesterol oxidasa extracelular

(Fuhrmann et al., 2002). Esta posible implicación en un mecanismo invasivo

explicaría la presencia de ChoD en M. leprae, aunque el hecho de que esté

también presente en bacterias no patógenas parece indicar que en principio su

función no está exclusivamente relacionada con mecanismos de patogenicidad.

Curiosamente, de los posibles genes relacionados con la degradación del

colesterol, M. leprae tan sólo posee ortólogos a choD y a MSMEG_5228, que

codifica la proteína 3-β-HSDMS. El gen kstR está presente como un pseudogen. La

presencia de estos dos genes transformadores de colesterol pero no de los demás

genes catabólicos de esta ruta apoya la posible implicación de este paso

enzimático en patogénesis en esta bacteria.

Al contrario que ChoD, la enzimas 3-β HSDMS y SDRMS sí han presentado

actividad deshidrogenasa en nuestros ensayos y se ha podido constatar la

producción de 4-colesten-3-ona a partir de ambas proteínas, tanto con ensayos de

LC/MS como mediante visualización de intermediarios radiactivos mediante TLC.

Los genes que codifican ambas enzimas (MSMEG_5228 y MSMEG_5233,

respectivamente) se sitúan próximos en el genoma (Fig. 70).

207

Discusión

MSMEG_5223: Proteina hipotetica conservadaMSMEG_5224: Difosfato reductasa (ispH) MSMEG_5225: Proteina hipotetica conservadaMSMEG_5226: Exodesoxiribonucleasa VII sub.MSMEG_5227: Exodesoxiribonucleasa VII sub.MSMEG_5229: Proteina hipoteticaMSMEG_5230: Proteina hipotetica conservadaMSMEG_5231: Proteina hipotetica

MSMEG_5232: Proteina hipoteticaMSMEG_5234: Oxidorreductasa de la familia SCD/R MSMEG_5235: Oxidorreductasa de la familia SCD/R MSMEG_5236: Proteina de la familia dienolactona hidrolasaMSMEG_5237:Dominio de funcion desconocidaMSMEG_5238: Proteina hipotetica conservadaMSMEG_5239: fructosa-1,6-bisfosfatasa, clase II

MSMEG_5223: Proteína hipotética conservadaMSMEG_5224: Difosfato reductasa (ispH) MSMEG_5225: Proteína hipotética conservadaMSMEG_5226: Exodesoxiribonucleasa VII sub.MSMEG_5227: Exodesoxiribonucleasa VII sub.MSMEG_5229: Proteína hipotéticaMSMEG_5230: Proteína hipotética conservadaMSMEG_5231: Proteína hipotética

MSMEG_5232: Proteína hipotéticaMSMEG_5234: Oxidorreductasa de la familia SCD/R MSMEG_5235: Oxidorreductasa de la familia SCD/R MSMEG_5236: Proteína de la familia dienolactona hidrolasaMSMEG_5237: Dominio de función desconocidaMSMEG_5238: Proteína hipotética conservadaMSMEG_5239: Fructosa-1,6-bisfosfatasa, clase II

MSMEG_5223: Proteina hipotetica conservadaMSMEG_5224: Difosfato reductasa (ispH) MSMEG_5225: Proteina hipotetica conservadaMSMEG_5226: Exodesoxiribonucleasa VII sub.MSMEG_5227: Exodesoxiribonucleasa VII sub.MSMEG_5229: Proteina hipoteticaMSMEG_5230: Proteina hipotetica conservadaMSMEG_5231: Proteina hipotetica

MSMEG_5232: Proteina hipoteticaMSMEG_5234: Oxidorreductasa de la familia SCD/R MSMEG_5235: Oxidorreductasa de la familia SCD/R MSMEG_5236: Proteina de la familia dienolactona hidrolasaMSMEG_5237:Dominio de funcion desconocidaMSMEG_5238: Proteina hipotetica conservadaMSMEG_5239: fructosa-1,6-bisfosfatasa, clase II

MSMEG_5223: Proteína hipotética conservadaMSMEG_5224: Difosfato reductasa (ispH) MSMEG_5225: Proteína hipotética conservadaMSMEG_5226: Exodesoxiribonucleasa VII sub.MSMEG_5227: Exodesoxiribonucleasa VII sub.MSMEG_5229: Proteína hipotéticaMSMEG_5230: Proteína hipotética conservadaMSMEG_5231: Proteína hipotética

MSMEG_5232: Proteína hipotéticaMSMEG_5234: Oxidorreductasa de la familia SCD/R MSMEG_5235: Oxidorreductasa de la familia SCD/R MSMEG_5236: Proteína de la familia dienolactona hidrolasaMSMEG_5237: Dominio de función desconocidaMSMEG_5238: Proteína hipotética conservadaMSMEG_5239: Fructosa-1,6-bisfosfatasa, clase II

Figura 70. Región del genoma circundante a los genes MSMEG_5228 y MSMEG_5233. En

el cuadro se indica la la posible función de los productos de los genes de la zona. Información

extraída del servidor CMR: http://cmr.jcvi.org/tigr-scripts/CMR/CmrHomePage.cgi

Sus regiones promotoras presentan secuencias consenso del operador KstR,

pero tan sólo MSMEG_5228 aparece inducido en el mutante del regulador KstR

mediante la técnica de microarrays (Kendall et al., 2007). Este gen también

aparece inducido en colesterol en los ensayos de expresión diferencial de M.

smegmatis mediante microarrays realizados en esta tesis.

El gen MSMEG_5233 no se encuentra inducido en los microarrays del

mutante de KstR, ni en los microarrays de expresión diferencial en M. smegmatis

en colesterol, aunque sí se puede apreciar una ligera inducción mediante RTq-

PCR. El hecho de que la proteína codificada por este gen, SDRMS, presente la

misma actividad colesterol deshidrogenasa que 3-β HSDMS, sugiere que podría

suplir la carencia de esta enzima.

Los mutantes tanto en el gen MSMEG_5228 como en el gen MSMEG_5233

no presentan alterada su capacidad de crecimiento en colesterol, lo que sugiere

que ninguna de las enzimas codificadas por estos dos genes ejerce su función de

manera exclusiva, lo que apunta la posibilidad de que existan más genes que

puedan catalizar este paso. La redundancia de genes que codifican una misma

función puede indicar la versatilidad metabólica de M. smegmatis.

208

Discusión

3. Análisis global de los genes inducidos diferencialmente en colesterol en M. smegmatis mc2155

Uno de los grandes objetivos de esta tesis doctoral fue la búsqueda global de

los genes implicados en la degradación del colesterol en M. smegmatis mc2155.

Tras confirmarse mediante análisis in silico la implicación en esta ruta catabólica

de los genes ortólogos a los implicados en la degradación de testosterona en C.

testosteroni, la técnica de microarrays, validada mediante RTq-PCR y

mutagénesis, nos aportó gran cantidad de información acerca de los posibles

genes implicados en la degradación del colesterol a lo largo de todo el genoma de

M. smegmatis mc2155. Estos datos se han contrastado con los resultados

anteriormente obtenidos por otros investigadores, en particular con los estudios

sobre los genes regulados por KstR, que se ha identificado como un represor de

gran número de genes relacionados con el catabolismo del colesterol (Kendall et

al., 2007) y con los estudios de expresión diferencial en colesterol de R. jostii

RHA1 (van der Geize et al., 2007).

El regulón KstR está formado por 84 genes; este elevado número sugería

que no todos ellos debían estar implicados en la degradación del colesterol

(Kendall et al., 2007). Sin embargo, nuestros resultados de expresión diferencial

en colesterol de M. smegmatis mc2155 mediante microarrays presentados en este

trabajo muestran que de hecho el colesterol por sí solo es capaz de inducir la gran

mayoría de los genes del regulón KstR (70 incluyendo el operón mce4, cuya

inducción en colesterol es pequeña pero cuya implicación en su transporte está

demostrada) y además inducir los genes regulados por KstR2. Dado que ha sido

posible asignarles una función específica dentro del catabolismo del colesterol a

gran parte de ellos, parecería que estos dos regulones se han especializado en la

degradación de este esteroide.

La ruta de degradación de colesterol parece estar altamente conservada en

R. jostii RHA1 y M. smegmatis mc2155, y las comparaciones in silico indican que

así mismo está conservada en otras especies micobacterianas como M.

tuberculosis, M. bovis y M. avium (van der Geize et al., 2007). Sin embargo, cabe

209

Discusión

destacar algunas diferencias entre los genes que se han relacionado con el

catabolismo del colesterol en R. jostii RHA1 y M. smegmatis mc2155 teniendo en

cuenta sus respectivos análisis de expresión diferencial en presencia de

colesterol.

En primer lugar se ha sugerido un catabolismo distinto de los anillos C y D de

colesterol para R. jostii RHA1 frente a las especies micobacterianas (van der

Geize et al., 2007). En R. jostii RHA1, aparece inducido en colesterol el cluster

ro06687-ro06698 constituido por genes que podrían relacionarse con el

metabolismo de cicloalcanonas, entre los que se incluyen ro06698 y ro06693, que

codifican una probable monooxigenasa y una lactona hidrolasa, respectivamente,

que podrían ser identificadas con la Baeyer-Villiger monooxigenasa y la hidrolasa

típicamente asociadas con la fisión de anillos de cicloalcanonas. Por estos datos

se sugiere que este cluster podría estar implicado en la degradación del anillo

esteroideo D del DOHNAA (Figura 5 de introducción, estructura 15) (van der Geize

et al., 2007). Este cluster de genes no está conservado en las especies

micobacterianas. Los datos obtenidos en el presente trabajo sugieren que en la

mineralización del DOHNAA en M. smegmatis mc2155 están implicados los genes

MSMEG_5996-MSMEG_6017. La degradación de alcanos cíclicos y policíclicos

no se ha estudiado en profundidad, y existe una información limitada para

especular sobre los mecanismos implicados en la degradación de los anillos C y D

del colesterol, sin embargo, teniendo en cuenta que muchas proteínas codificadas

por los genes de la región MSMEG_5996 a MSMEG_6017 son similares a

enzimas asociadas con la β-oxidación de ácidos grasos, se puede asumir que la

apertura de los anillos C y D podría ser llevada a cabo por actividades tiolasa,

aunque este tipo de mecanismo de apertura mediante tiolasas no ha sido descrito

hasta la fecha para alcanos cíclicos. R. jostii RHA1 posee genes ortólogos a estos

de M. smegmatis (con la excepción notable de MSMEG_5997, que curiosamente

no está tampoco presente en M. tuberculosis, aunque sí en C. testosteroni

(orf33)), con lo cual de confirmarse su implicación en el metabolismo del DOHNAA

es posible que R. jostii RHA1 dispusiese de dos clusters distintos para la

mineralización de este compuesto.

210

Discusión

La segunda diferencia que podría dar lugar a un metabolismo distinto de los

anillos C y D en las especies micobacterianas es la presencia (observada

concretamente en M. bovis BCG y M. tuberculosis H37Rv) de un gen que codifica

una N-acetil-transferasa en el operón hsa (Anderton et al., 2006) (que como se ha

visto en este trabajo es el encargado de la transformación de 3-HSA en DOHNAA

y ácido 2-hidroxihexa-2,4-dienoico (Figura 5 de Introducción, estructuras 11-15)).

Se ha sugerido que esta enzima podría ser utilizada para transformar esta porción

de la molécula del colesterol para obtener una función alternativa a su

metabolismo completo, posiblemente relacionada con señalización o con el

mantenimiento de la integridad de la pared celular (van der Geize et al., 2007). Sin

embargo, un análisis detallado muestra que aunque en M. bovis BCG sí existe

este gen al final del operón posiblemente ortólogo a hsa, en M. tuberculosis

H37Rv no. La afirmación de la presencia de una N-acetil-transferasa en el operón

hsa de M. tuberculosis H37Rv (Anderton et al., 2006) está basada en la primera

anotación completa del genoma de M. tuberculosis H37Rv (Cole et al., 1998), que

fue posteriormente reanotado (Camus et al., 2002). En esta segunda anotación, la

longitud del gen nat (el supuesto codificante de una N-acetil-transferasa en este

operón) fue acortada 49 aminoácidos. Consultando la anotación del genoma de M.

tuberculosis H37Rv en las bases de datos (Tuberculist, CMR) se observa que este

gen no está formando parte de este operón, encontrándose a 286 pb del mismo

(según Tuberculist) o a 181 pb (y divergente) según el servidor CMR. Además, ya

es un hecho confirmado que M. tuberculosis H37Rv puede utilizar el colesterol

como fuente de carbono y energía (Pandey y Sassetti, 2008), y por lo tanto este

hecho apoya que su metabolismo no difiera del llevado a cabo por especies no

patógenas como R. jostii RHA1 o M. smegmatis mc2155, que tampoco posee un

gen en el operón hsa que codifique una N-acetil-transferasa. No obstante, la

presencia del gen nat en M. bovis BCG, especie que también es capaz de crecer

en colesterol, supone una incógnita.

Otras diferencias entre el metabolismo del colesterol de R. jostii RHA1 y M.

smegmatis mc2155 han sido observadas a partir de nuestros ensayos de

expresión diferencial durante el crecimiento en este esteroide.

211

Discusión

En primer lugar cabe destacar un conjunto de genes controlados por KstR y

con expresión diferencial en colesterol en M. smegmatis mc2155 demostrada

mediante microarrays que sin embargo no aparecen inducidos en R. jostii RHA1

mediante la técnica de microarrays. Estos genes se muestran en la tabla 18 del

apartado 3.1 de Resultados. Se desconoce la posible función para la mayoría de

los genes situados dentro de este conjunto; sin embargo cabe destacar dos de los

genes aquí presentes. El primero de ellos, MSMEG_0217, que codifica una

alcohol deshidrogenasa B, presenta una inducción muy elevada en colesterol, y su

mutagénesis afecta al crecimiento de M. smegmatis en el esteroide, lo que apoya

su implicación directa en esta ruta degradativa; curiosamente, su probable

ortólogo en R. jostii RHA1 ro01205 (67% de identidad cuantificada por ClustalW)

no se induce en presencia de colesterol (van der Geize et al., 2007). El segundo

de los genes que cabe destacar es MSMEG_5228, que codifica la proteína 3-β

HSDMS, una de las encargadas de catalizar el paso de colesterol a 4-colesten-3-

ona en M. smegmatis. Este gen no presenta un claro ortólogo en R. jostii RHA1.

Cabría esperar que la enzima encargada de oxidar el colesterol en esta bacteria

fuera, al igual que sucede en R. equi, una colesterol oxidasa (Navas et al., 2001).

Y efectivamente, dentro de los genes asignados específicamente a la ruta de

degradación del colesterol en R. jostii RHA1 se encuentra una colesterol oxidasa,

codificada por el gen ro04305 (van der Geize et al., 2007). Este gen, además de

presentar similitud con colesterol oxidasas de distintas especies de Rhodococus y

de otros actinomicetos degradadores de colesterol como Gordonia

cholesterolivorans (Drzyzga et al., pendiente de publicación), comparte una

identidad del 61% con la proteína ChoDMS, cuya implicación en este paso

enzimático se cuestiona en este trabajo. Los resultados obtenidos en esta tesis

parecen apuntar a que el género Rhodococcus y otras actinobacterias como

Gordonia utilizan enzimas tipo colesterol oxidasa en esta ruta catabólica, mientras

otros, como el género Mycobacterium o Nocardia (Horinouchi et al., 1991) utilizan

enzimas tipo colesterol deshidrogenasa NAD(P) dependientes.

En el análisis de la expresión diferencial en colesterol de M. smegmatis

también nos encontramos un caso opuesto a los mencionados anteriormente: un

operón regulado por KstR, inducido en R. jostii RHA1 pero no en M. smegmatis: el

212

Discusión

operón mce4, del que se ha comprobado que está implicado en el transporte de

colesterol en R. jostii RHA1 (Mohn et al., 2008) y en M. tuberculosis (Pandey y

Sassetti, 2008) y que curiosamente apenas se encuentra inducido en colesterol en

M. smegmatis, apreciándose tan sólo una leve inducción del mismo mediante

RTq-PCR (apartado 3.2 de resultados). Este resultado contrasta con la inducción

que se esperaba encontrar en colesterol de un operón especializado para el

transporte de esteroides. Sin embargo, los resultados obtenidos en R. jostii RHA1

tampoco muestran una inducción elevada de este cluster, siendo el valor más

elevado de fold change de 3,6 (yrbE4A; ro04696), e incluso los dos últimos genes

del operón (mas4A y mas4B; ro04704 y ro04705, respectivamente) aparecen

ligeramente reprimidos en colesterol (van der Geize, 2007). Por lo tanto, el hecho

de que este operón no se induzca en colesterol de manera apreciable ni en R.

jostii RHA1 ni en M. smegmatis podría ser debido a que se esté expresando de

manera basal para poder captar de una manera más rápida y por tanto eficiente el

esteroide que en momentos puntuales podría ponerse en contacto con la bacteria

en el medio ambiente. De hecho, en R. jostii RHA1 se han hecho ensayos de

transporte de colesterol por el operón mce4 con células no inducidas en el

esteroide (Mohn et al., 2008) y el sistema de transporte funciona igualmente, lo

que implica la existencia de una expresión basal del mismo.

De las proteínas de esta ruta catabólica conservadas en R. jostii RHA1 y las

micobacterias, las proteínas Mce4 son las que presentan una identidad más baja,

lo que podría reflejar funciones distintas en los dos tipos de organismos aparte de

su implicación en el transporte del colesterol, que es común para ambos. Aunque

estas diferencias entre las proteínas Mce4 homólogas también podría reflejar las

diferencias del medio del que estas bacterias obtienen el colesterol (van der Geize

et al., 2007).

Otro grupo de genes que aparece inducido en colesterol en M. smegmatis

mc2155 pero no en R. jostii RHA1 (a excepción del operón MSMEG_1971-

MSMEG1979 y el gen adyacente MSMEG_1970), se muestra en la tabla 19 del

apartado de resultados 3.1. Estos genes no se encuentran regulados por KstR o

KstR2, y de ellos una gran mayoría además de inducirse en colesterol, presentan

la característica de que tienen una elevada expresión basal en glicerol, lo que

213

Discusión

sugiere que su mayor inducción en el esteroide puede ser debida a condiciones de

estrés y no a una implicación directa en su metabolismo. Además, no se ha podido

asignar ninguna posible función claramente relacionada con el catabolismo del

colesterol a estos genes. El hecho curioso de que los únicos genes que parecen

inducirse como respuesta a estrés en R. jostii RHA1 de manera común con M.

smegmatis sean los ortólogos a MSMEG_1970-MSMSEG_1979 podría indicar que

el género Rhodococcus es más resistente a los posibles daños causados en la

pared celular por el colesterol, o simplemente que ambos géneros de

microorganismos tienen una maquinaria genética de respuesta a estrés por

compuestos hidrofóbicos distinta.

Existen dos excepciones dentro de este grupo de genes referidas a genes no

relacionados con estrés; en primer lugar el gen MSMEG_1366, que codifica la

probable ATPasa implicada en el sistema de transporte de colesterol. El supuesto

ortólogo en R. jostii RHA1 (identidad del 74% a nivel de secuencia de aminoácidos

cuantificado por ClustalW) es el gen ro02744. El hecho de que no aparezca

inducido en colesterol puede deberse, como también hipotetizamos para la

discreta inducción en colesterol del operón mce4 en ambas especies, a que en R.

jostii RHA1 se exprese de manera basal para poder captar de manera eficiente el

colesterol del medio. También podría suceder que esta actividad enzimática esté

catalizada por una enzima diferente a la de M. smegmatis en R. jostii RHA1. Sin

embargo, ninguna enzima ATPasa se ha visto inducida en colesterol en R. jostii

RHA1 cuando se analiza la expresión mediante la técnica de microarrays (van der

Geize et al., 2007).

La segunda excepción es el operón MSMEG_6648-MSMEG_6645, que

puede estar implicado en el catabolismo del propionil-CoA (Pandey y Sassetti,

2008). En este caso, R. jostii RHA1 ni siquiera posee ortólogos a estos genes, lo

que sugiere que en esta bacteria el metabolismo del propionil-CoA procedente de

la degradación del colesterol es diferente al descrito para M. smegmatis.

Dentro de las semejanzas entre ambas rutas, cabe destacar la presencia de

varios grupos de genes en cada una de ellas que parecen implicados en una

misma función: la degradación de la cadena lateral esteroidea. Esta redundancia

en un proceso específico pone de manifiesto la importancia que este paso tiene en

214

Discusión

la degradación de las moléculas esteroideas, y sugiere un gran potencial

catabólico.

En el presente estudio también se ha profundizado en el análisis de la

regulación del catabolismo del colesterol mediada por KstR tomando como modelo

de estudio el gen MSMEG_5228 que codifica la enzima 3-β HSDMS.

Mediante estudios de retardo en gel (EMSA) se confirmó la unión específica

del represor a una sonda de DNA formada por la región promotora del gen

MSMEG_5228. Posteriormente los ensayos de footprinting demostraron por

primera vez la unión del regulador al motivo de unión predicho in silico. Sin

embargo, los resultados más sorprendentes se obtuvieron a partir del estudio

mediante primer extension de la región promotora del gen MSMEG_5228. Este

estudio mostró que el mRNA que se transcribe a partir de este gen es leaderless,

es decir, carece de una región 5’ no traducida (5’UTR) y comienza directamente

con el codón de iniciación 5’AUG. Los mRNAs leaderless son muy frecuentes en

bacterias Gram-positivas como Streptococci, Lactococci, Streptomyces y

Corynebacterium (Janssen, 1993), siendo menos comunes en bacterias Gram-

negativas. El estudio de genomas completos de algunas arqueas sugiere que los

mRNAs leaderless son también bastante comunes en este dominio (Slupska et al.,

2001; Tolstrup et al., 2000). El hecho de que mRNAs leaderless heterólogos

derivados de una bacteria puedan ser transcritos con éxito en sistemas eucariotas

y arqueas justifica la suposición de que los mRNAs leaderless actuales podrían

ser remanentes de mRNAs ancestrales (Moll et al., 2002). La presencia de ocho

tránscritos leaderless en el pequeño genoma de las mitocondrias humanas

(Janssen, 1993) apoya esta hipótesis.

El hecho de la existencia de un mRNA leaderless dentro de los genes

relacionados con el catabolismo del colesterol nos impulsó a realizar un análisis in

silico de las regiones promotoras de otros genes/operones relacionados con este

metabolismo para comprobar si se trata de un hecho extendido.

Dentro de los genes/operones a analizar se seleccionaron tanto genes

regulados por KstR (como es el caso del gen MSMEG_5228) como por KstR2 y

también un gen no regulado por ninguno de estos dos represores pero sí inducido

en colesterol (MSMEG_1366). En total se analizaron 17 genes. Como control se

215

Discusión

estudiaron otros 17 genes adicionales no relacionados con el catabolismo del

colesterol que fueron seleccionados al azar.

Los resultados para los genes relacionados con el metabolismo del colesterol

(Tabla 24) muestran que por una parte, la mayoría de los genes/operones

investigados presentaron en su región promotora una secuencia que podría actuar

como sitio de unión al ribosoma (RBS) y regiones −10 y −35 que se ajustan a las

posiciones esperadas. Sin embargo se encontraron otros 5 genes además de

MSMEG_5228 que podrían dar lugar a tránscritos leaderless. Todos estos casos

se corresponden con genes regulados por KstR o KstR2, y en ellos la secuencia

consenso de unión del regulador se sitúa entre las supuestas cajas −10 y −35,

salvo en uno de los genes, en que se situaría 8 pb secuencia arriba de la región

−35 (MSMEG_6013). De los genes analizados, los regulados por KstR que no

presentan un posible RBS en su región promotora (MSMEG_0217, MSMEG_5228,

MSMEG_5520), curiosamente se sitúan a lo largo del genoma de M. smegmatis, y

no dentro de ninguno de los dos grandes clusters de catabolismo del colesterol

descritos en este trabajo (véase apartado 3.1). Este resultado sugería que la

ausencia de RBS quizás fuese una característica común a los genes regulados

por KstR no agrupados en uno de los dos grandes clusters de catabolismo de

colesterol, pero sin embargo el gen MSMEG_0305 que entra dentro de este grupo,

sí presenta un posible RBS en su promotor.

Caso especialmente curioso es el de los genes regulados por KstR2, que

como ya se ha explicado en el apartado 5.3 se agrupan en 5 operones, 4 de ellos

divergentes dos a dos, por lo que existen 3 secuencias de unión a KstR2 en el

genoma. Los resultados indican que en el caso de los operones que comparten

región intergénica por situarse divergentes en el genoma, uno de ellos presenta

RBS, mientras el otro no (el operón que comienza con el gen MSMEG_6000 no

presenta RBS, mientras que su operón divergente que comienza con el gen

MSMEG_6001 sí, y lo mismo sucede con los operones que comienzan con

MSMEG_6012, que no presenta RBS, y MSMEG_6013, que sí). En el caso de los

genes divergentes MSMEG_6041/MSMEG_6042 que comparten secuencia de

unión a KstR ambos presentan RBS.

216

Discusión

Por último, cabe mencionar que el gen kstR (MSMEG_6042) sí presenta RBS

en su promotor, mientras que el gen kstR2 (MSMEG_6009) no. Regulado por KstR. Situado en el cluster 1SíMSMEG_6042

Regulado por KstR. Situado en el cluster 1SíMSMEG_6041

Regulado por KstR. Situado en el cluster 1SíMSMEG_6038

Regulado por KstR2. Situado en el cluster 1SíMSMEG_6013

Regulado por KstR2. Situado en el cluster 1NoMSMEG_6012

Regulado por KstR2. Situado en el cluster 1NoMSMEG_6009

Regulado por KstR2. Situado en el cluster 1SíMSMEG_6001

Regulado por KstR2. Situado en el cluster 1NoMSMEG_6000

Regulado por KstR. Situado en el cluster 2SíMSMEG_5925

Regulado por KstR. Situado en el cluster 2SíMSMEG_5920

Regulado por KstR. Situado en el cluster 2SíMSMEG_5906

Regulado por KstR. Adyacente al cluster 2SíMSMEG_5902

Regulado por KstR. No situado en el cluster 1 o 2NoMSMEG_5520

Regulado por KstR. No situado en el cluster 1 o 2NoMSMEG_5228

No regulado por KstR ni KstR2. No situado en cluster 1 o 2SíMSMEG_1366

Regulado por KstR. No situado en el cluster 1 o 2SíMSMEG_0305

Regulado por KstR. No situado en el cluster 1 o 2NoMSMEG_0217

Características del gen/operónPresencia deposible RBS

Gen analizado(región

promotora)

Regulado por KstR. Situado en el cluster 1SíMSMEG_6042

Regulado por KstR. Situado en el cluster 1SíMSMEG_6041

Regulado por KstR. Situado en el cluster 1SíMSMEG_6038

Regulado por KstR2. Situado en el cluster 1SíMSMEG_6013

Regulado por KstR2. Situado en el cluster 1NoMSMEG_6012

Regulado por KstR2. Situado en el cluster 1NoMSMEG_6009

Regulado por KstR2. Situado en el cluster 1SíMSMEG_6001

Regulado por KstR2. Situado en el cluster 1NoMSMEG_6000

Regulado por KstR. Situado en el cluster 2SíMSMEG_5925

Regulado por KstR. Situado en el cluster 2SíMSMEG_5920

Regulado por KstR. Situado en el cluster 2SíMSMEG_5906

Regulado por KstR. Adyacente al cluster 2SíMSMEG_5902

Regulado por KstR. No situado en el cluster 1 o 2NoMSMEG_5520

Regulado por KstR. No situado en el cluster 1 o 2NoMSMEG_5228

No regulado por KstR ni KstR2. No situado en cluster 1 o 2SíMSMEG_1366

Regulado por KstR. No situado en el cluster 1 o 2SíMSMEG_0305

Regulado por KstR. No situado en el cluster 1 o 2NoMSMEG_0217

Características del gen/operónPresencia deposible RBS

Gen analizado(región

promotora)

Tabla 24. Análisis de la región promotora de genes relacionados con el catabolismo del colesterol.

Los resultados obtenidos en el caso de los genes no relacionados con el

metabolismo del colesterol son así mismo dispares; de las 17 regiones promotoras

analizadas 9 presentaron un posible sitio RBS, mientras que las 8 restantes no

(Tabla 25).

217

Discusión

O-metiltransferasa, familia de proteínas 3NoMSMEG_5003

Proteína periplásmica de unión de transportador ABC YphSíMSMEG_3999

Proteína reguladora del operón glicerolSíMSMEG_2125

selenido, agua diquinasaNoMSMEG_1852

Proteína de catabolismo de rizopinaSíMSMEG_1304

Deshidrogenasa de cadena cortaSíMSMEG_1114

Proteína hipotéticaNoMSMEG_0938

serina/treonina-proteína quinasa PknDNoMSMEG_0886

3-oxoacil-[ proteina transportadora de acilo] reductasaNoMSMEG_0715

Proteína de la familia glioxilasaSíMSMEG_0608

Posible factor sigma RpoE1NoMSMEG_0574

Oxidorreductasa FAD dependienteNoMSMEG_0481

2-nitropropano dioxigenasaSíMSMEG_0332

Tauria dioxigenasa alfa-cetoglutarato-dependienteSíMSMEG_0181

Fosfoenolpiruvato-proteína fosfotransferasaSíMSMEG_0088

Proteína hipotéticaNoMSMEG_0041

Formil transferasaSíMSMEG_0014

Función del genPresencia de posible RBS

Gen analizado(región promotora)

O-metiltransferasa, familia de proteínas 3NoMSMEG_5003

Proteína periplásmica de unión de transportador ABC YphSíMSMEG_3999

Proteína reguladora del operón glicerolSíMSMEG_2125

selenido, agua diquinasaNoMSMEG_1852

Proteína de catabolismo de rizopinaSíMSMEG_1304

Deshidrogenasa de cadena cortaSíMSMEG_1114

Proteína hipotéticaNoMSMEG_0938

serina/treonina-proteína quinasa PknDNoMSMEG_0886

3-oxoacil-[ proteina transportadora de acilo] reductasaNoMSMEG_0715

Proteína de la familia glioxilasaSíMSMEG_0608

Posible factor sigma RpoE1NoMSMEG_0574

Oxidorreductasa FAD dependienteNoMSMEG_0481

2-nitropropano dioxigenasaSíMSMEG_0332

Tauria dioxigenasa alfa-cetoglutarato-dependienteSíMSMEG_0181

Fosfoenolpiruvato-proteína fosfotransferasaSíMSMEG_0088

Proteína hipotéticaNoMSMEG_0041

Formil transferasaSíMSMEG_0014

Función del genPresencia de posible RBS

Gen analizado(región promotora)

Tabla 25. Análisis de la región promotora de genes no relacionados con el catabolismo del colesterol.

La eficiencia traduccional de los mRNAs leaderless comparada con la de los

RNAs bacterianos canónicos no está intrínsecamente determinada, pero parece

que puede alterarse dependiendo de la disponibilidad de los componentes de la

maquinaria traduccional. Así, estudios en E. coli han mostrado que el ratio de los

factores de iniciación IF2 e IF3 juega un papel decisivo en la iniciación de la

traducción de mRNAs leaderless (Grill et al., 2001; Moll et al., 2002). Por tanto, se

puede especular que la relativa deficiencia de IF3 que tiene lugar a velocidades de

crecimiento elevadas podría favorecer el incremento de la velocidad de traducción

de los mRNAs leaderless y una competición más eficiente de estos mRNAs con

los mRNAs canónicos. Un efecto similar se ha observado debido a una elevación

transitoria del nivel de IF2 (Grill et al., 2000; Grill et al., 2001), que tiene lugar

cuando las células de E. coli son sometidas a un choque de frío (Jones et al.,

1987). Así, parece concebible que cambios en las condiciones medioambientales

218

Discusión

y diferentes tipos de estrés puedan incrementar las oscilaciones transitorias de los

niveles relativos de los factores de iniciación y por tanto modular la eficiencia

traduccional de los mRNAs leaderless en bacterias. Por otra parte, parece que los

mRNAs leaderless, a diferencia de los mRNAs canónicos, no requieren de la

presencia de la proteína ribosomal S1 para su traducción (Moll et al., 2002; Tedin

et al., 1997). Existe la posibilidad de que, dado que no existen homólogos

funcionales de S1 en todos los sistemas biológicos que contienen mRNAs

leaderless, la población ribosomal sea heterogénea en lo que respecta a la

presencia de S1, y esto podría contribuir al control traduccional de estos mRNAs.

La traducción de mRNAs leaderless se ha estudiado in vivo en un rango de

temperaturas desde 25 ºC a 42 ºC (Grill et al., 2000). Los ensayos de competición

de traducción con extractos de E. coli revelaron que los mRNAs leaderless pueden

competir eficazmente a baja temperatura (25 ºC) con mRNAs canónicos, mientras

que a 42 ºC la traducción de mRNAs canónicos sobrepasa completamente a la de

los mRNAs leaderless.

La correlación inversa de la traduccionalidad de las dos clases de mRNA en

función de la temperatura se ha atribuido a la proteína ribosómica S1, cuya

actividad parece ser sensible al frío (Grill et al., 2000). Así, la reducción de la

traducción de mRNAs canónicos causada por la reducción de S1 a bajas

temperaturas parece conducir a un incremento en la traducción de mRNAs

leaderless debido a una competición reducida frente a los mRNAs canónicos (Moll

et al., 2002).

Los mRNAs leaderless identificados en bacterias hasta el momento no

codifican genes funcionalmente relacionados. Cabe señalar sin embargo que al

menos tres mRNAs leaderless de elementos genéticos accesorios, dos en E. coli

(Baumeister et al., 1991; Walz et al., 1976) y uno en Lactococcus lactis (Nauta et

al., 1996) codifican proteínas reguladoras. Para asegurar un estado latente de

estos elementos genéticos, los represores correspondientes tienen que ser

continuamente sintetizados, aunque a un nivel bajo. Se podría por tanto especular

que el hecho de ser leaderless proporciona un medio para conseguir un bajo nivel

de traducción en un rango de diferentes condiciones biológicas.

219

Discusión

El control traduccional de los mRNAs leaderless en las bacterias Gram-

positivas, entre las que incluiríamos al género Mycobacterium, así como en

arqueas requiere ser estudiado para comprobar si se lleva a cabo por los mismos

mecanismos observados en E. coli.

4. Estudio de los reguladores transcripcionales KstR y KstR2

Los reguladores KstR y KstR2 implicados en la regulación de la ruta de

degradación del colesterol pertenecen por homología de secuencia a la familia

TetR de reguladores transcripcionales. Utilizando la base de datos PROSITE, que

permite la búsqueda de dominios, familias y sitios funcionales de secuencias

proteicas y que está alojada en el servidor ExPASy, se identifica tanto en la

secuencia de KstR como en la de KstR2 el dominio HTH de la familia de

reguladores TetR. Este es un dominio de unión a DNA hélice-giro-hélice de

aproximadamente 60 residuos presente en esta familia de reguladores

transcripcionales procariotas. El motivo de unión a DNA hélice-giro-hélice se

localiza en el extremo N-terminal de estos reguladores (Aramaki et al., 1995). La

región C-terminal de los reguladores TetR contiene varias regiones que pueden

estar implicadas en i) la unión de inductores y ii) en oligomerización. La familia de

reguladores TetR incluye más de 2000 secuencias no redundantes, mientras que

la función específica regulada por los miembros de esta familia sólo es conocida

para cerca de 90 de ellos. Estas proteínas controlan genes implicados en

multiresistencia a fármacos, enzimas implicadas en distintas rutas catabólicas,

biosíntesis de antibióticos, estrés osmótico y patogenicidad en bacterias Gram-

positivas y Gram-negativas (Ramos et al., 2005). Utilizando la base de datos

PROSITE no se ha encontrado ningún motivo conservado en la región C-terminal

de KstR o KstR2. Tampoco haciendo una búsqueda frente a la base de

secuencias de proteínas no redundante (nr) utilizando el programa BLASTP se

encuentra una posible similitud de estas regiones C-terminal con regiones

relacionadas con la unión a colesterol u otros esteroides derivados, que podrían

ser los inductores de esta ruta de degradación y por tanto unirse a estos

220

Discusión

represores para inhibir su unión al DNA. Ambos extremos C-terminal sólo

presentan similitud con reguladores tipo TetR de micobacterias y otros

actinomicetos principalmente, nada que las relacione con unión a esteroides, lo

que no permite hacer conjeturas acerca de la posible molécula inductora. El hecho

de no existir proteínas homólogas a la región C-terminal de estos dos reguladores

unido a la posibilidad de que estos dominios reconozcan como ligandos

estructuras esteroideas hace particularmente interesantes a estos dos reguladores

para un estudio más detallado de los mismos que incluiría su cristalización y la

posibilidad de construir a partir de los mismos sensores de estructuras

esteroideas.

Se han resuelto varias estructuras de reguladores transcripcionales TetR.

Sus dominios de unión a DNA están formados por un conjunto de tres hélices (H1-

H3) y la parte N-terminal de la siguiente hélice 4, que contribuye al centro

hidrofóbico del dominio de unión a DNA y lo une al dominio regulador (Orth et al.,

2000).

En este estudio hemos llevado a cabo la predicción de la estructura

tridimensional de KstR y KstR2 utilizando para ello el programa LOOPP, alojado

en el servidor BioHPC.

En el caso de KstR, se seleccionó como molde para la construcción del

modelo la cadena A del represor transcripcional EthR (PDB: 1T56), miembro de la

familia TetR/CamR presente en M. tuberculosis e implicado en la resistencia a

etionamida (Dover et al., 2004). El programa en este caso fue capaz de comparar

el 80 % de la secuencia de la proteína con una identidad de secuencia del 16 %.

La proteína EthR es responsable de la regulación negativa de EthA, una

monooxigenasa implicada en la activación del fármaco etionamida. Para ejercer su

acción represora EthR se une a la región intergénica situada entre los genes ethA

y ethR (Dover et al., 2004). En su dominio C-terminal, EthR presenta una larga

cavidad hidrofóbica en forma de túnel (que podría aparecer de forma similar en

KstR) que se especula que podría ser el sitio de unión de su ligando, todavía

desconocido (Dover et al., 2004). En otro trabajo sobre la estructura de EthR, se

observó la presencia de un ligando fortuito identificado como hexadecil octanoato,

221

Discusión

que induce un estado conformacional en EthR incompatible con la función

represora, lo que conduce a la inducción de ethA (Frénois et al., 2004).

En el caso de KstR2, el molde utilizado fue el del supuesto regulador

transcripcional de la familia TetR Rha06780 de Rhodococcus jostii RHA1 (PDB:

2NX4) (Zhang et al., pendiente de publicación). El programa comparó el 86 % de

la secuencia de la proteína con una identidad de secuencia del 22 %.

En las figuras 71 y 72 se representan los modelos de KstR y KstR2,

respectivamente, junto con sus proteínas molde correspondientes. En rojo se ha

marcado la región predicha por el programa PROSITE para ser el dominio de

unión a DNA HTH.

A B Figura 71. Predicción de la estructura tridimensional de la proteína KstR tomando como modelo el represor transcripcional tipo TetR EthR de Mycobacterium tuberculosis (PDB: 1T56). A. La estructura corresponde con el modelo propuesto para KstR. B. Estructura del regulador

transcripcional EthR de M. tuberculosis (PDB: 1T56) (Dover et al., 2004). Las zonas de las proteínas

señaladas en rojo se corresponden con el dominio HTH de unión a DNA encontrado para ambas

proteínas utilizando la base de datos PROSITE.

Como se puede observar, los modelos de ambas proteínas presentan una

región que se ajusta muy bien al dominio HTH de los reguladores tipo TetR.

222

Discusión

En el caso concreto de KstR ya se había demostrado que se une a las

regiones operadoras de los distintos promotores que regula en forma de dímero

(Kendall et al., 2007), como la mayoría de los reguladores de la familia TetR

(Ramos et al., 2005). En este trabajo se ha demostrado que el regulador KstR se

une a su región operadora en el promotor del gen MSMEG_5228 y que esta unión

es específica. Concretamente KstR se une a una región de 31 nucleótidos,

localizados entre la posición −5 y −35 respecto al codón de inicio ATG de

MSMEG_5228. Esta región solapa con las posibles cajas −10 y −35, lo que

sugiere que la unión de KstR al operador impediría la unión de la RNA polimerasa

y con ello el inicio de la transcripción desde el promotor. Concentraciones de hasta

4 mM de colesterol no causan la desunión de KstR en este promotor. Los ensayos

de inhibición de retardo frente a un posible inductor de la ruta se deberían efectuar

en un futuro también con intermediarios de la ruta de degradación como por

ejemplo la 4-colesten-3-ona, o AD o ADD, y también con ácido palmítico, el cual

se ha demostrado que induce 22 genes del regulón KstR (Kendall et al., 2007). Si

la 4-colesten-3-ona fuese la molécula inductora de la ruta quizás se explicaría la

existencia de enzimas redundantes encargadas de su producción a partir del

colesterol, ya que sin este compuesto no se podría inducir la ruta de degradación

del colesterol.

223

Discusión

A B

Figura 72. Predicción de la estructura tridimensional de la proteína KstR2 tomando como modelo el supuesto regulador transcripcional de la familia TetR Rha06780 de Rhodococcus jostii RHA1 (PDB: 2NX4). A. La estructura corresponde con el modelo propuesto para KstR2. B. Estructura del supuesto regulador transcripcional tipo TetR de Rha06780 de Rhodococcus jostii

RHA1 (PDB: 2NX4) (Zhang et al., pendiente de publicación). Las zonas de las proteínas señaladas

en rojo se corresponden con el dominio HTH de unión a DNA encontrado para ambas proteínas

utilizando la base de datos PROSITE.

Como se ha indicado con anterioridad, 22 de los genes regulados por KstR e

inducidos en colesterol también se inducen en ácido palmítico (ácido graso

saturado de 16 átomos de carbono) en M. tuberculosis, incluido el propio KstR

(Kendall et al., 2007; Schnappinger et al., 2003), por lo que se sugirió que el

regulón KstR podría estar implicado en el transporte y catabolismo de una

variedad de lípidos además del colesterol (Kendall et al., 2007). No obstante, no

se puede descartar que la inducción de estos genes por palmitato se lleve a cabo

de manera inespecífica. El hecho de que el palmitato no induzca todos los genes

del regulón KstR parece indicar que no sería el efector para el regulador, o bien la

existencia de otros posibles sistemas reguladores además del de KstR.

224

Discusión

También se ha observado que los genes homólogos a MSMEG_6008 y

MSMEG_6013, que están bajo el control de KstR2, aparecen inducidos en

presencia de palmitato en M. tuberculosis (Schnappinger et al., 2003). El hecho de

que KstR2 también sea capaz de interaccionar con palmitato es intrigante, ya que

los genes controlados por él parecen estar implicados en la degradación del

DOHNAA, y cabría esperar que una molécula similar a ésta, que no posee una

cadena lateral larga, fuera el inductor de este regulador.

Se ha demostrado que ambos reguladores actúan independientemente el

uno del otro, ya que la expresión de los genes del regulón de KstR2 no está

afectada por una deleción en el gen que codifica KstR (Kendall et al., 2007), y así

mismo la expresión del gen MSMEG_6038, controlado por KstR, no se ve

afectada por un mutante en KstR2 (Kendall et al., 2010). Tanto KstR como KstR2

se autorregulan reprimiendo su propia expresión (Kendall et al., 2007; Kendall et

al., 2010). Esta es una característica común en la regulación génica, y ocurre en

más del 40% de los factores transcripcionales en E. coli (Shen-Orr et al., 2002).

Recientemente se ha demostrado que la autorregulación negativa acelera el

tiempo de respuesta, reduce el ruido producido por la expresión genética

estocástica y es económico metabólicamente para la célula (Nevozhay et al.,

2009).

El hecho de que los genes responsables del catabolismo del colesterol estén

controlados por, al menos, dos reguladores transcripcionales distintos parece

indicar una inducción secuencial de los regulones. Los datos sugieren que el

primero en inducirse sería el regulón de KstR, que aparentemente contiene los

genes responsables de la degradación de la cadena lateral del colesterol y los

genes necesarios para las consiguientes transformaciones desde el intermediario

AD (Figura 5 de introducción, estructura 9A) hasta DOHNAA (Figura 5 de

introducción, estructuras 15), propionil-CoA y piruvato. Posteriormente se podría

inducir el regulón de KstR2, que parece contener los genes necesarios para la

transformación de DOHNAA hasta succinato. Esta inducción secuencial de genes

metabólicos podría ayudar al ahorro energético de la célula. Así mismo podría

sugerir que ambos represores están regulados por distintas moléculas efectoras,

que en el caso de KstR2 podría ser DOHNAA.

225

Discusión

En conclusión, los resultados presentados en esta tesis han permitido

avanzar significativamente en el conocimiento global del metabolismo aeróbico del

colesterol principalmente en Mycobacterium smegmatis, aunque muchos de los

hallazgos son también extrapolables a la bacteria patógena Mycobacterium

tuberculosis, cuyo metabolismo del colesterol ha cobrado recientemente una gran

importancia. Al mismo tiempo este trabajo ha aportado una cantidad notable de

material que presenta un gran interés para el desarrollo de futuros trabajos de

investigación. Así mismo, el estudio de una ruta de degradación en un

microorganismo Gram-positivo es un tema pionero en nuestro laboratorio, lo que

ha servido para el aprendizaje y utilización de nuevas técnicas de trabajo

diferentes a las utilizadas normalmente en nuestro grupo.

226

Conclusiones

VI.CONCLUSIONES

227

Conclusiones

228

Conclusiones

VI. CONCLUSIONES

El trabajo descrito a lo largo de esta Tesis ha dado lugar a las siguientes

conclusiones:

1. Micobacterium smegmatis mc2155 es capaz de utilizar diferentes compuestos

con estructura esteroidea como única fuente de carbono y energía tales como

colesterol, 4-colesten-3-ona, ADD, AD, testosterona y β-estradiol, siendo mayor el

rendimiento obtenido con colesterol y 4-colesten-3-ona. Se han identificado 89

genes en el genoma de M. smegmatis mc2155 que presentan una expresión

diferencial en colesterol frente a glicerol, de los cuales al menos 59 genes parecen

implicados directamente en el metabolismo, regulación o transporte del colesterol.

Estos genes se encuentran principalmente agrupados en 2 grandes clusters. Sin

embargo, fuera de estos dos clusters también aparecen genes inducidos en este

esteroide, y para algunos de ellos su implicación en el metabolismo del colesterol

se ha constatado.

2. Se han identificado al menos dos genes en el genoma de M. smegmatis mc2155

implicados en la transformación de colesterol en 4-colesten-3-ona: MSMEG_5228

y MSMEG_5233, que codifican las enzimas 3-β HSD y SDRMS MS respectivamente,

que pueden englobarse dentro de la familia de las deshidrogenasas de cadena

corta. La actividad enzimática de estas dos proteínas ha sido comprobada

mediante ensayos in vitro.

3. Resulta improbable que el gen homólogo de choD contenido en M. smegmatis,

MSMEG_1604, codifique una colesterol oxidasa, ya que no ha podido asignarse a

este gen una actividad colesterol oxidasa ni in vivo ni in vitro y el gen no se induce

selectivamente en presencia de colesterol.

4. El regulador transcripcional KstR está implicado mayoritariamente en la

represión de genes que se inducen en presencia de colesterol, lo que sugiere que

229

Conclusiones

su acción se ejerce exclusivamente sobre genes relacionados con su catabolismo

y no sobre genes adicionales relacionados con el metabolismo de otros lípidos,

como había sido propuesto por otros autores.

5. Se ha confirmado la interacción de la proteína KstR con el promotor P5228 del

gen MSMEG_5228 en su región operadora mediante estudios de footprinting y

retardo en gel. Esta región operadora es una secuencia palindrómica de 31 pb

centrada en la posición −5 respecto al inicio de la transcripción. Así mismo se ha

comprobado que el mRNA derivado de la transcripción de este gen es leaderless,

ya que la posición +1 coincide con el primer nucleótido del codón de inicio del gen.

6. El regulador KstR2 es un represor transcripcional implicado en la regulación de

genes relacionados con el catabolismo del colesterol. Mediante la técnica de

microarrays se han identificado 15 genes regulados por KstR2.

230

Bibliografía

VII.BIBLIOGRAFÍA

231

Bibliografía

232

Bibliografía

VII.BIBLIOGRAFÍA Aínsa, J. A., Martín, C., Cabeza, M., De la Cruz, F. y Mendiola, M. V. (1996). Construction of a family of Mycobacterium/Escherichia coli shuttle vectors derived from pAL5000 and pACYC184: their use for cloning an antibiotic-resistance gene from Mycobacterium fortuitum. Gene 176, 23-26. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. y Lipman, D. (1990). Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215, 403-410. Allard, S. T. M., Cleland, W. W. y Holden, H. M. (2004). High Resolution X-ray Structure of dTDP-Glucose 4,6-Dehydratase from Streptomyces venezuelae. J Biol Chem 279, 2211-2220. Amadou, C., Pascal, G., Mangenot, S., Glew, M., Bontemps, C., Capela, D., Carrère, S., Cruveiller, S., Dossat, C., Lajus, A., Marchetti, M., Poinsot, V., Rouy, Z., Servin, B., Saad, M., Schenowitz, C., Barbe, V., Batut, J., Médigue, C. y Masson-Boivin, C. (2008). Genome sequence of the β-rhizobium Cupriavidus taiwanensis and comparative genomics of rhizobia. Genome Res 18, 1472-1483. Anderton, M. C., Bhakta, S., Besra, G. S., Jeavons, P., Eltis, L. D. y Sim, E. (2006). Characterization of the putative operon containing arylamine N-acetyltransferase (nat) in Mycobacterium bovis BCG. Mol Microbiol 59, 181-192. Andor, A., Jekkel, A., Hopwood, D. A., Jeanplong, F., Ilkoy, E., Konya, A., Kurucz, I. y Ambrus, G. (2006). Generation of Useful Insertionally Blocked Sterol Degradation Pathway Mutants of Fast-Growing Mycobacteria and Cloning, Characterization, and Expression of the Terminal Oxygenase of the 3-Ketosteroid 9α-Hydroxylase in Mycobacterium smegmatis mc2155. Appl Environ Microbiol 72, 6554-6559. Aparicio, J. F. y Martin, J. F. (2008). Microbial cholesterol oxidases: bioconversion enzymes or signal proteins? Mol Biosyst 4, 804-809. Aramaki, H., Yagi, N. y Suzuki, M. (1995). Residues important for the function of a multihelical DNA binding domain in the new transcription factor family of Cam and Tet repressors. Protein Eng 8, 1259-1266. Arima, K., Nagasawa, M., Bae, M. y Tamura, G. (1969). Microbial transformation of sterols. Part I. Decomposition of cholesterol by microorganisms. Agric Biol Chem 33, 1636-1643. Arruda, S., Bomfim, G., Knights, R., Huima-Byron, T. y Riley, L. W. (1993). Cloning of an M. tuberculosis DNA fragment associated with entry and survival inside cells. Science 261, 1454-1457.

233

Bibliografía

Av-Gay, Y. y Sobouti, R. (2000). Cholesterol is accumulated by mycobacteria but its degradation is limited to non-pathogenic fast-growing mycobacteria. Can J Microbiol 46, 826-831. Baker, M. E. y Blasco, R. (1992). Expansion of the mammalian 3β-hydroxysteroid dehydrogenase/plant dihydroflavonol reductase superfamily to include a bacterial cholesterol dehydrogenase, a bacterial UDP-galactose-4-epimerase, and open reading frames in vaccinia virus and fish lymphocystis disease virus. FEBS Lett 301, 89-93. Bashyam, M. D., Kaushal, D., Dasgupta, S. K. y Tyagi, A. K. (1996). A study of mycobacterial transcriptional apparatus: identification of novel features in promoter elements. J Bacteriol 178, 4847-4853. Baumeister, R., Flache, P., Melefors, O., Gabain, A. v. y Hillen, W. (1991). Lack of a 5' non-coding region in Tn 1721 encoded tetR mRNA is associated with a low efficiency of translation and a short half-life in Escherichia coli. Nucl Acids Res 19, 4595-4600. Björkhem, I. y Eggertsen, G. (2001). Genes involved in initial steps of bile acid synthesis. Curr Opin Lipidol 12, 97-103. Blankenfeldt, W., Kerr, I. D., Giraud, M. F., McMiken, H. J., Leonard, G., Whitfield, C., Messner, P., Graninger, M. y Naismith, J. H. (2002). Variation on a theme of SDR. dTDP-6-deoxy-L- lyxo-4-hexulose reductase (RmlD) shows a new Mg2+-dependent dimerization mode. Structure 10, 773-786. Bloch, K. (1965). The Biological Synthesis of Cholesterol. Science 150, 19-28. Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72, 248-254. Breitling, R., Armengaud, P., Amtmann, A. y Herzyk, P. (2004). Rank products: a simple, yet powerful, new method to detect differentially regulated genes in replicated microarray experiments. FEBS Lett 573, 83-92. Brown, R. L. y Peterson, G. E. (1966). Cholesterol Oxidation By Soil Actinomycetes. J Gen Microbiol 45, 441-450. Brzostek, A., Sliwinski, T., Rumijowska-Galewicz, A., Korycka-Machala, M. y Dziadek, J. (2005). Identification and targeted disruption of the gene encoding the main 3-ketosteroid dehydrogenase in Mycobacterium smegmatis. Microbiology 151, 2393-2402. Brzostek, A., Dziadek, B., Rumijowska-Galewicz, A., Pawelczyk, J. y Dziadek, J. (2007). Cholesterol oxidase is required for virulence of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiol Lett 275, 106-112.

234

Bibliografía

Brzostek, A., Pawelczyk, J., Rumijowska-Galewicz, A., Dziadek, B. y Dziadek, J. (2009). Mycobacterium tuberculosis Is Able To Accumulate and Utilize Cholesterol. J Bacteriol 191, 6584-6591. Camus, J.-C., Pryor, M. J., Medigue, C. y Cole, S. T. (2002). Re-annotation of the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Microbiology 148, 2967-2973. Capyk, J. K., D'Angelo, I., Strynadka, N. C. y Eltis, L. D. (2009a). Characterization of 3-Ketosteroid 9α-Hydroxylase, a Rieske Oxygenase in the Cholesterol Degradation Pathway of Mycobacterium tuberculosis. J Biol Chem 284, 9937-9946. Capyk, J. K., Kalscheuer, R., Stewart, G. R., Liu, J., Kwon, H., Zhao, R., Okamoto, S., Jacobs, W. R., Eltis, L. D. y Mohn, W. W. (2009b). Mycobacterial Cytochrome P450 125 (Cyp125) Catalyzes the Terminal Hydroxylation of C27 Steroids. J Biol Chem 284, 35534-35542. Casali, N. y Riley, L. (2007). A phylogenomic analysis of the Actinomycetales mce operons. BMC Genomics 8, 60. Cole, S. T., Brosch, R., Parkhill, J., Garnier, T., Churcher, C., Harris, D., Gordon, S. V., Eiglmeier, K., Gas, S., Barry, C. E., Tekaia, F., Badcock, K., Basham, D., Brown, D., Chillingworth, T., Connor, R., Davies, R., Devlin, K., Feltwell, T., Gentles, S., Hamlin, N., Holroyd, S., Hornsby, T., Jagels, K., Krogh, A., McLean, J., Moule, S., Murphy, L., Oliver, K., Osborne, J., Quail, M. A., Rajandream, M. A., Rogers, J., Rutter, S., Seeger, K., Skelton, J., Squares, R., Squares, S., Sulston, J. E., Taylor, K., Whitehead, S. y Barrell, B. G. (1998). Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 393, 537-544. Collins, M. D., Smida, J., Dorsch, M. y Stackebrandt, E. (1988). Tsukamurella gen. nov. Harboring Corynebacterium paurometabolum and Rhodococcus aurantiacus. Int J Syst Bacteriol 38, 385-391. Coulombe, R., Yue, K. Q., Ghisla, S. y Vrielink, A. (2001). Oxygen Access to the Active Site of Cholesterol Oxidase through a Narrow Channel Is Gated by an Arg-Glu Pair. J Biol Chem 276, 30435-30441. Cowley, S. C. y Av-Gay, Y. (2001). Monitoring promoter activity and protein localization in Mycobacterium spp using green fluorescent protein. Gene 264, 225-231. Chang, J. C., Miner, M. D., Pandey, A. K., Gill, W. P., Harik, N. S., Sassetti, C. M. y Sherman, D. R. (2009). igr Genes and Mycobacterium tuberculosis Cholesterol Metabolism. J Bacteriol 191, 5232-5239. Chiang, Y.-R., Ismail, W., Muller, M. y Fuchs, G. (2007). Initial Steps in the Anoxic Metabolism of Cholesterol by the Denitrifying Sterolibacterium denitrificans. J Biol Chem 282, 13240-13249.

235

Bibliografía

Chiang, Y.-R., Ismail, W., Gallien, S., Heintz, D., Van Dorsselaer, A. y Fuchs, G. (2008a). Cholest-4-En-3-One-Δ1-Dehydrogenase, a Flavoprotein Catalyzing the Second Step in Anoxic Cholesterol Metabolism. Appl Environ Microbiol 74, 107-113. Chiang, Y.-R., Ismail, W., Heintz, D., Schaeffer, C., Van Dorsselaer, A. y Fuchs, G. (2008b). Study of Anoxic and Oxic Cholesterol Metabolism by Sterolibacterium denitrificans. J Bacteriol 190, 905-914. Chipley, J. R., Dreyfuss, M. S. y Smucker, R. A. (1975). Cholesterol metabolism by Mycobacterium. Microbios 12, 199-207. Daughton, C. G. y Ternes, T. A. (1999). Pharmaceuticals and Personal Care Products in the Environment: Agents of Subtle Change? Environ Health Perspect 107, 907-938. de Lorenzo, V., Herrero, M., Jakubzik, U. y Timmis, K. N. (1990). Mini-Tn5 transposon derivatives for insertion mutagenesis, promoter probing, and chromosomal insertion of cloned DNA in gram-negative eubacteria. J Bacteriol 172, 6568-6572. DeLano, W. L. (2002). The PyMOL Molecular Graphics System Palo Alto, CA, USA.: DeLano Scientific. Demain, A. L. (1992). Microbial secondary metabolism: a new theoretical frontier for academia, a new opportunity for industry. Ciba Found symp 171, 3-16. Denke, M. A. (1995). Review of human studies evaluating individual dietary responsiveness in patients with hypercholesterolemia. Am J Clin Nutr 62, 471S-477. Doukyu, N. y Aono, R. (1999). Two moles of O consumption and one mole of H O2 2 2 formation during cholesterol peroxidation with cholesterol oxidase from Pseudomonas sp. strain ST-200. Biochem J 341, 621-627. Doukyu, N., Shibata, K., Ogino, H. y Sagermann, M. (2008). Purification and characterization of Chromobacterium sp. DS-1 cholesterol oxidase with thermal, organic solvent, and detergent tolerance. Appl Microbiol Biotechnol 80, 59-70. Doukyu, N. (2009). Characteristics and biotechnological applications of microbial cholesterol oxidases. Appl Microbiol Biotechnol 83, 825-837. Dover, L. G., Corsino, P. E., Daniels, I. R., Cocklin, S. L., Tatituri, V., Besra, G. S. y Fütterer, K. (2004). Crystal Structure of the TetR/CamR Family Repressor Mycobacterium tuberculosis EthR Implicated in Ethionamide Resistance. J Mol Biol 340, 1095-1105. Fahrbach, M., Kuever, J., Meinke, R., Kampfer, P. y Hollender, J. (2006). Denitratisoma oestradiolicum gen. nov., sp. nov., a 17β-oestradiol-degrading, denitrifying betaproteobacterium. Int J Syst Evol Microbiol 56, 1547-1552.

236

Bibliografía

Fahrbach, M., Kuever, J., Remesch, M., Huber, B. E., Kampfer, P., Dott, W. y Hollender, J. (2008). Steroidobacter denitrificans gen. nov., sp. nov., a steroidal hormone-degrading gammaproteobacterium. Int J Syst Evol Microbiol 58, 2215-2223. Ferreira, N. P. y Tracey, R. P. (1984). Numerical taxonomy of cholesterol-degrading soil bacteria. J Appl Microbiol 57, 429-446. Florin, C., Kohler, T., Grandguillot, M. y Plesiat, P. (1996). Comamonas testosteroni 3-ketosteroid-Δ4(5 α)-dehydrogenase: gene and protein characterization. J Bacteriol 178, 3322-3330. Frénois, F., Engohang-Ndong, J., Locht, C., Baulard, A. R. y Villeret, V. (2004). Structure of EthR in a ligand bound conformation reveals therapeutic perspectives against tuberculosis. Mol Cell 16, 301-307. Fuhrmann, H., Dobeleit, G., Bellair, S. y Gück, T. (2002). Cholesterol Oxidase and Resistance of Rhodococcus equi to Peroxidative Stress in vitro in the Presence of Cholesterol. J Vet Med B 49, 310-311. Gagné, F., Blaise, C. y André, C. (2006). Occurrence of pharmaceutical products in a municipal effluent and toxicity to rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) hepatocytes. Ecotox Environ Saf 64, 329-336. Gatfield, J. y Pieters, J. (2000). Essential Role for Cholesterol in Entry of Mycobacteria into Macrophages. Science 288, 1647-1651. Gerard, P., Lepercq, P., Leclerc, M., Gavini, F., Raibaud, P. y Juste, C. (2007). Bacteroides sp. Strain D8, the First Cholesterol-Reducing Bacterium Isolated from Human Feces. Appl Environ Microbiol 73, 5742-5749. Ghasemian, A., Yazdi, M., Sepehrizadeh, Z., Yazdi, Z. y Zarrini, G. (2009). Overexpression, one-step purification, and characterization of a type II cholesterol oxidase from a local isolate Rhodococcus sp. PTCC 1633. World J Microbiol Biotechnol 25, 773-779. Göhler, A., Xiong, G., Paulsen, S., Trentmann, G. y Maser, E. (2008). Testosterone-inducible Regulator Is a Kinase That Drives Steroid Sensing and Metabolism in Comamonas testosteroni. J Biol Chem 283, 17380-17390. Gomez, M. y Smith, I. (2000). Determinants of mycobacterial gene expression. En Molecular Genetics of Mycobacteria, pp. 111-129. Editado por G. F. Hatfull y W. R. J. Jacobs. Washington, DC: American Society for Microbiology Press. Grill, S., Gualerzi, C. O., Londei, P. y Blasi, U. (2000). Selective stimulation of translation of leaderless mRNA by initiation factor 2: evolutionary implications for translation. EMBO J 19, 4101-4110.

237

Bibliografía

Grill, S., Moll, I., Hasenöhrl, D., Gualerzi, C. O. y Bläsi, U. (2001). Modulation of ribosomal recruitment to 5'-terminal start codons by translation initiation factors IF2 and IF3. FEBS Lett 495, 167-171. Groh, H., Schade, K. y Hörhold-Schubert, C. (1993). Steroid metabolism with intestinal microorganisms. J Basic Microbiol 33, 59-72. Hanahan, D. (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol 166, 557-580. Hanselman, T. A., Graetz, D. A. y Wilkie, A. C. (2003). Manure-Borne Estrogens as Potential Environmental Contaminants: A Review. Environ Sci Technol 37, 5471-5478. Harder, J. y Probian, C. (1997). Anaerobic mineralization of cholesterol by a novel type of denitrifying bacterium. Arch Microbiol 167, 269-274. Hayami, M., Okabe, A., Sasai, K., Hayashi, H. y Kanemasa, Y. (1979). Presence and synthesis of cholesterol in stable staphylococcal L-forms. J Bacteriol 140, 859-863. Holthaus, K. I. E., Johnson, A. C., rgens, M. D., Williams, R. J., Smith, J. J. L. y Carter, J. E. (2002). The potential for estradiol and ethinylestradiol to sorb to suspended and bed sediments in some English rivers. Environ Toxicol Chem 21, 2526-2535. Hong, F., Breitling, R., McEntee, C. W., Wittner, B. S., Nemhauser, J. L. y Chory, J. (2006). RankProd: a bioconductor package for detecting differentially expressed genes in meta-analysis. Bioinformatics 22, 2825-2827. Horinouchi, M., Yamamoto, T., Taguchi, K., Arai, H. y Kudo, T. (2001). Meta-cleavage enzyme gene tesB is necessary for testosterone degradation in Comamonas testosteroni TA441. Microbiology 147, 3367-3375. Horinouchi, M., Hayashi, T., Koshino, H., Yamamoto, T. y Kudo, T. (2003a). Gene Encoding the Hydrolase for the Product of the meta-Cleavage Reaction in Testosterone Degradation by Comamonas testosteroni. Appl Environ Microbiol 69, 2139-2152. Horinouchi, M., Hayashi, T., Yamamoto, T. y Kudo, T. (2003b). A New Bacterial Steroid Degradation Gene Cluster in Comamonas testosteroni TA441 Which Consists of Aromatic-Compound Degradation Genes for Seco-Steroids and 3-Ketosteroid Dehydrogenase Genes. Appl Environ Microbiol 69, 4421-4430. Horinouchi, M., Hayashi, T. y Kudo, T. (2004a). The genes encoding the hydroxylase of 3-hydroxy-9,10-secoandrosta-1,3,5(10)-triene-9,17-dione in steroid degradation in Comamonas testosteroni TA441. J Steroid Biochem Mol Biol 92, 143-154. Horinouchi, M., Kurita, T., Yamamoto, T., Hatori, E., Hayashi, T. y Kudo, T. (2004b). Steroid degradation gene cluster of Comamonas testosteroni consisting of 18 putative genes

238

Bibliografía

from meta-cleavage enzyme gene tesB to regulator gene tesR. Biochem Biophys Res Commun 324, 597-604. Horinouchi, M., Hayashi, T., Koshino, H., Kurita, T. y Kudo, T. (2005). Identification of 9,17-Dioxo-1,2,3,4,10,19-Hexanorandrostan-5-oic Acid, 4-Hydroxy-2-Oxohexanoic Acid, and 2-Hydroxyhexa-2,4-Dienoic Acid and Related Enzymes Involved in Testosterone Degradation in Comamonas testosteroni TA441. Appl Environ Microbiol 71, 5275-5281. Horinouchi, S., Ishizuka, H. y Beppu, T. (1991). Cloning, nucleotide sequence, and transcriptional analysis of the NAD(P)-dependent cholesterol dehydrogenase gene from a Nocardia sp. and its hyperexpression in Streptomyces spp. Appl Environ Microbiol 57, 1386-1393. Horswill, A. R. y Escalante-Semerena, J. C. (1999). The prpE gene of Salmonella typhimurium LT2 encodes propionyl-CoA synthetase. Microbiology 145, 1381-1388. Horvath, J. y Kramli, A. (1947). Microbiological Oxidation of Cholesterol with Azotobacter. Nature 160, 639. Hwang, C.-C., Chang, Y.-H., Hsu, C.-N., Hsu, H.-H., Li, C.-W. y Pon, H.-I. (2005). Mechanistic Roles of Ser-114, Tyr-155, and Lys-159 in 3α-Hydroxysteroid Dehydrogenase/Carbonyl Reductase from Comamonas testosteroni. J Biol Chem 280, 3522-3528. Imachi, H., Sekiguchi, Y., Kamagata, Y., Hanada, S., Ohashi, A. y Harada, H. (2002). Pelotomaculum thermopropionicum gen. nov., sp. nov., an anaerobic, thermophilic, syntrophic propionate-oxidizing bacterium. Int J Syst Evol Microbiol 52, 1729-1735. Ishikawa, J., Yamashita, A., Mikami, Y., Hoshino, Y., Kurita, H., Hotta, K., Shiba, T. y Hattori, M. (2004). The complete genomic sequence of Nocardia farcinica IFM 10152. Proc Natl Acad Sci USA 101, 14925-14930. Ivshina, I., Grishko, V., Nogovitsina, E., Kukina, T. y Tolstikov, G. (2005). Bioconversion of β-Sitosterol and Its Esters by Actinobacteria of the Genus Rhodococcus. Appl Biochem Microbiol 41, 551-557. Jackson, M., Camacho, L. R., Gicquel, B. y Guilhot, C. (2001). Gene Replacement and Transposon Delivery Using the Negative Selection Marker sacB. En Mycobacterium tuberculosis Protocols, pp. 59-75. Editado por T. Parish y N. G. Stoker. Totowa, NJ: Humana Press Inc. Janssen, G. R. (1993). Eubacterial, archaebacterial, and eukaryotic genes that encode leaderless mRNA. En Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, pp. 59–67. Editado por R. H. Baltz, G. D. Hegeman y P. L. Skatrud. Washington, DC: American Society for Microbiology Press. JCBN (1989). Nomenclature of steroids. Pure & Appl Chem 61, 1783-1822.

239

Bibliografía

Jones, P. G., VanBogelen, R. A. y Neidhardt, F. C. (1987). Induction of proteins in response to low temperature in Escherichia coli. J Bacteriol 169, 2092-2095. Joshi, S. M., Pandey, A. K., Capite, N., Fortune, S. M., Rubin, E. J. y Sassetti, C. M. (2006). Characterization of mycobacterial virulence genes through genetic interaction mapping. Proc Natl Acad Sci USA 103, 11760-11765. Kato, L. (1978). Cholesterol, a factor which is required for growth of mycobacteria from leprous tissues. Int J Lepr Other Mycobact Dis 46, 133-143. Kendall, S. L., Rison, S. C. G., Movahedzadeh, F., Frita, R. y Stoker, N. G. (2004). What do microarrays really tell us about M. tuberculosis? Trends Microbiol 12, 537-544. Kendall, S. L., Withers, M., Soffair, C. N., Moreland, N. J., Gurcha, S., Sidders, B., Frita, R., ten Bokum, A., Besra, G. S., Lott, J. S. y Stoker, N. G. (2007). A highly conserved transcriptional repressor controls a large regulon involved in lipid degradation in Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol 65, 684-699. Kendall, S. L., Burgess, P., Balhana, R., Withers, M., ten Bokum, A., Lott, J. S., Gao, C., Uhia Castro, I. y Stoker, N. G. (2010). Cholesterol utilisation in mycobacteria is controlled by two TetR-type transcriptional regulators; kstR and kstR2. Microbiology, mic.0.034538-034530. Keum, Y. S., Lee, Y. J. y Kim, J.-H. (2008). Metabolism of Nitrodiphenyl Ether Herbicides by Dioxin-Degrading Bacterium Sphingomonas wittichii RW1. J Agric Food Chem 56, 9146-9151. Kieslich, K. (1985). Microbial side-chain degradation of sterols. J Basic Microbiol 25, 461-474. King, J., D., Harmer, N., J., Preston, A., Palmer, C., M., Rejzek, M., Field, R., A., Blundell, T., L. y Maskell, D., J. (2007). Predicting protein function from structure : The roles of short-chain dehydrogenase/reductase enzymes in Bordetella O-antigen biosynthesis. J Mol Biol 374, 749-763. Klein, U., Gimpl, G. y Fahrenholz, F. (1995). Alteration of the Myometrial Plasma Membrane Cholesterol Content with β-Cyclodextrin Modulates the Binding Affinity of the Oxytocin Receptor. Biochemistry 34, 13784-13793. Knol, J., Bodewits, K., Hessels, G. I., Dijkhuizen, L. y van der Geize, R. (2008). 3-Keto-5α-steroid Δ1-dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis SQ1 and its orthologue in Mycobacterium tuberculosis H37Rv are highly specific enzymes that function in cholesterol catabolism Biochem J 410, 339-346.

240

Bibliografía

Kotani, T., Yamamoto, T., Yurimoto, H., Sakai, Y. y Kato, N. (2003). Propane Monooxygenase and NAD+-Dependent Secondary Alcohol Dehydrogenase in Propane Metabolism by Gordonia sp. Strain TY-5. J Bacteriol 185, 7120-7128. Kreit, J. y Sampson, N. S. (2009). Cholesterol oxidase: physiological functions. FEBS J 276, 6844-6856. Krumme, M. L., Timmis, K. N. y Dwyer, D. F. (1993). Degradation of trichloroethylene by Pseudomonas cepacia G4 and the constitutive mutant strain G4 5223 PR1 in aquifer microcosms. Appl Environ Microbiol 59, 2746-2749. Kuliopulos, A., Shortle, D. y Talalay, P. (1987). Isolation and sequencing of the gene encoding Δ5-3-ketosteroid isomerase of Pseudomonas testosteroni: overexpression of the protein. Proc Natl Acad Sci USA 84, 8893-8897. Lack, N., Lowe, E. D., Liu, J., Eltis, L. D., Noble, M. E. M., Sima, E. y Westwooda, I. M. (2008). Structure of HsaD, a steroid-degrading hydrolase, from Mycobacterium tuberculosis. Acta Cryst F64, 2-7. Lack, N. A., Yam, K. C., Lowe, E. D., Horsman, G. P., Owen, R. L., Sim, E. y Eltis, L. D. (2009). Characterization of a Carbon-Carbon Hydrolase from Mycobacterium tuberculosis Involved in Cholesterol Metabolism. J Biol Chem 285, 434-443. Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685. Lamb, D. C., Kelly, D. E., Manning, N. J. y Kelly, S. L. (1998). A sterol biosynthetic pathway in Mycobacterium. FEBS Lett 437, 142-144. Lamberti, Y., Perez Vidakovics, M. L., van der Pol, L.-W. y Rodríguez, M. E. (2008). Cholesterol-rich domains are involved in Bordetella pertussis phagocytosis and intracellular survival in neutrophils. Microb Pathog 44, 501-511. Lario, P. I., Sampson, N. y Vrielink, A. (2003). Sub-atomic Resolution Crystal Structure of Cholesterol Oxidase: What Atomic Resolution Crystallography Reveals about Enzyme Mechanism and the Role of the FAD Cofactor in Redox Activity. J Mol Biol 326, 1635-1650. Larkin, M. J., Kulakov, L. A. y Allen, C. C. R. (2005). Biodegradation and Rhodococcus - masters of catabolic versatility. Curr Opin Biotechnol 16, 282-290. Lee, L. S., Strock, T. J., Sarmah, A. K. y Rao, P. S. C. (2003). Sorption and Dissipation of Testosterone, Estrogens, and Their Primary Transformation Products in Soils and Sediment. Environ Sci Technol 37, 4098-4105. Leonardo, M. R., Moser, D. P., Barbieri, E., Brantner, C. A., MacGregor, B. J., Paster, B. J., Stackebrandt, E. y Nealson, K. H. (1999). Shewanella pealeana sp. nov., a

241

Bibliografía

member of the microbial community associated with the accessory nidamental gland of the squid Loligo pealei. Int J Syst Bacteriol 49, 1341-1351. Li, J., Vrielink, A., Brick, P. y Blow, D. M. (1993). Crystal structure of cholesterol oxidase complexed with a steroid substrate: Implications for flavin adenine dinucleotide dependent alcohol oxidases. Biochemistry 32, 11507-11515. Linares, M., Pruneda-Paz, J. L., Reyna, L. y Genti-Raimondi, S. (2008). Regulation of testosterone degradation in Comamonas testosteroni. J Steroid Biochem Mol Biol 112, 145-150. Maldonado, L. A., Fenical, W., Jensen, P. R., Kauffman, C. A., Mincer, T. J., Ward, A. C., Bull, A. T. y Goodfellow, M. (2005). Salinispora arenicola gen. nov., sp. nov. and Salinispora tropica sp. nov., obligate marine actinomycetes belonging to the family Micromonosporaceae. Int J Syst Evol Microbiol 55, 1759-1766. Marques, M. A., Neves-Ferreira, A. G., da Silveira, E. K., Valente, R. H., Chapeaurouge, A., Perales, J., da Silva Bernardes, R., Dobos, K. M., Spencer, J. S., Brennan, P. J. y Pessolani, M. C. (2008). Deciphering the proteomic profile of Mycobacterium leprae cell envelope. Proteomics 8, 2477-2491. Martin, C. K. A. (1977). Microbial cleavage of sterol side chains. Adv Appl Microbiol 22, 29-58. Maxam, A. M. y Gilbert, W. (1977). A new method for sequencing DNA. Proc Natl Acad Sci USA 74, 560-564. McLeod, M. P., Warren, R. L., Hsiao, W. W. L., Araki, N., Myhre, M., Fernandes, C., Miyazawa, D., Wong, W., Lillquist, A. L., Wang, D., Dosanjh, M., Hara, H., Petrescu, A., Morin, R. D., Yang, G., Stott, J. M., Schein, J. E., Shin, H., Smailus, D., Siddiqui, A. S., Marra, M. A., Jones, S. J. M., Holt, R., Brinkman, F. S. L., Miyauchi, K., Fukuda, M., Davies, J. E., Mohn, W. W. y Eltis, L. D. (2006). The complete genome of Rhodococcus sp. RHA1 provides insights into a catabolic powerhouse. Proc Natl Acad Sci USA 103, 15582-15587. Miller, W. L. (1988). Molecular Biology of Steroid Hormone Synthesis. Endocr Rev 9, 295-318. Mindnich, R., Moller, G. y Adamski, J. (2004). The role of 17β-hydroxysteroid dehydrogenases. Mol Cell Endocrinol 218, 7-20. Miner, M. D., Chang, J. C., Pandey, A. K., Sassetti, C. M. y Sherman, D. R. (2009). Role of cholesterol in Mycobacterium tuberculosis infection. Indian J Exp Biol 47, 407-411.

242

Bibliografía

Mohn, W. W., van der Geize, R., Stewart, G. R., Okamoto, S., Liu, J., Dijkhuizen, L. y Eltis, L. D. (2008). The Actinobacterial mce4 Locus Encodes a Steroid Transporter. J Biol Chem 283, 35368-35374. Moll, I., Grill, S., Gualerzi, C. O. y Bläsi, U. (2002). Leaderless mRNAs in bacteria: surprises in ribosomal recruitment and translational control. Mol Microbiol 43, 239-246. Morii, S., Fujii, C., Miyoshi, T., Iwami, M. y Itagaki, E. (1998). 3-Ketosteroid-Δ1-dehydrogenase of Rhodococcus rhodochrous: sequencing of the genomic DNA and hyperexpression, purification, and characterization of the recombinant enzyme. J Biochem 124, 1026-1032. Nagasawa, M., Bae, M., Tamura, G. y Arima, K. (1969). Microbial transformation of steroids. Part II. Cleavage os sterols side chains by microorganisms. Agric Biol Chem 33, 1644-1650. Nauta, A., Sinderen, O., Karsens, H., Smit, E., Venema, G. y Kok, J. (1996). Inducible gene expression mediated by a repressor-operator system isolated from Lactococcus lactis bacteriophage r1t. Molecular Microbiology 19, 1331-1341. Navas, J., Gonzalez-Zorn, B., Ladron, N., Garrido, P. y Vazquez-Boland, J. A. (2001). Identification and Mutagenesis by Allelic Exchange of choE, Encoding a Cholesterol Oxidase from the Intracellular Pathogen Rhodococcus equi. J Bacteriol 183, 4796-4805.

thNelson, D. L. y Cox, M. M. (2004). Lehninger Principles of Biochemistry, 4 edn: Freeman, W. H. Nevozhay, D., Adams, R. M., Murphy, K. F., Josic, K. y Balázsi, G. (2009). Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression. Proc Natl Acad Sci USA 106, 5123-5128. Oppermann, U., Filling, C., Hult, M., Shafqat, N., Wu, X., Lindh, M., Shafqat, J., Nordling, E., Kallberg, Y., Persson, B. y Jörnvall, H. (2003). Short-chain dehydrogenases/reductases (SDR): the 2002 update. Chem Biol Interact 143-144, 247-253. Orth, P., Schnappinger, D., Hillen, W., Saenger, W. y Hinrichs, W. (2000). Structural basis of gene regulation by the tetracycline inducible Tet repressor-operator system. Nat Struct Mol Biol 7, 215-219. Owen, R. W., Mason, A. N. y Bilton, R. F. (1983). The degradation of cholesterol by Pseudomonas sp. NCIB 10590 under aerobic conditions. J Lipid Res 24, 1500-1511. Pandey, A. K. y Sassetti, C. M. (2008). Mycobacterial persistence requires the utilization of host cholesterol. Proc Natl Acad Sci USA 105, 4376-4380.

243

Bibliografía

Papa, R., Parrilli, E. y Sannia, G. (2009). Engineered marine Antarctic bacterium Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125: a promising micro-organism for the bioremediation of aromatic compounds. J appl microbiol 106, 49-56. Parish, T. y Stoker, N. G. (1998). Electroporation of Mycobacteria. En Mycobacteria Protocols, pp. 129-144. Editado por T. Parish y N. G. Stoker: Humana Press. Park, S. J. y Lee, S. Y. (2003). Identification and Characterization of a New Enoyl Coenzyme A Hydratase Involved in Biosynthesis of Medium-Chain-Length Polyhydroxyalkanoates in Recombinant Escherichia coli. J Bacteriol 185, 5391-5397. Peyron, P., Bordier, C., N'Diaye, E.-N. y Maridonneau-Parini, I. (2000). Nonopsonic Phagocytosis of Mycobacterium kansasii by Human Neutrophils Depends on Cholesterol and Is Mediated by CR3 Associated with Glycosylphosphatidylinositol-Anchored Proteins. J Immunol 165, 5186-5191. Podust, L. M., Poulos, T. L. y Waterman, M. R. (2001). Crystal structure of cytochrome P450 14α-sterol demethylase (CYP51) from Mycobacterium tuberculosis in complex with azole inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 98, 3068-3073. Poole, A. J. y Cord-Ruwisch, R. (2004). Treatment of strongflow wool scouring effluent by biological emulsion destabilisation. Water Res 38, 1419-1426. Pruneda-Paz, J. L., Linares, M., Cabrera, J. E. y Genti-Raimondi, S. (2004). TeiR, a LuxR-Type Transcription Factor Required for Testosterone Degradation in Comamonas testosteroni. J Bacteriol 186, 1430-1437. Raman, D. R., Williams, E. L., Layton, A. C., Burns, R. T., Easter, J. P., Daugherty, A. S., Mullen, M. D. y Sayler, G. S. (2004). Estrogen Content of Dairy and Swine Wastes. Environ Sci Technol 38, 3567-3573. Ramos, J. L., Martinez-Bueno, M., Molina-Henares, A. J., Teran, W., Watanabe, K., Zhang, X., Gallegos, M. T., Brennan, R. y Tobes, R. (2005). The TetR Family of Transcriptional Repressors. Microbiol Mol Biol Rev 69, 326-356. Richet, H. M., Craven, P. C., Brown, J. M., Lasker, B. A., Cox, C. D., McNeil, M. M., Tice, A. D., Jarvis, W. R. y Tablan, O. C. (1991). A cluster of Rhodococcus (Gordona) Bronchialis sternal-wound infections after coronary-artery bypass surgery. N Engl J Med 324, 104-109. Romine, M. F., Stillwell, L. C., Wong, K.-K., Thurston, S. J., Sisk, E. C., Sensen, C., Gaasterland, T., Fredrickson, J. K. y Saffer, J. D. (1999). Complete Sequence of a 184-Kilobase Catabolic Plasmid from Sphingomonas aromaticivorans F199. J Bacteriol 181, 1585-1602. Rosłoniec, K. Z., Wilbrink, M., Capyk, J. K., Mohn, W. W., Ostendorf, M., van der Geize, R., Dijkhuizen, L. y Eltis, L. D. (2009). Cytochrome P450 125 (CYP125) catalyzes

244

Bibliografía

C26-hydroxylation to initiate sterol side chain degradation in Rhodococcus jostii RHA1. Mol Microbiol 74, 1031-1043. Routledge, E. J., Sheahan, D., Desbrow, C., Brighty, G. C., Waldock, M. y Sumpter, J. P. (1998). Identification of Estrogenic Chemicals in STW Effluent. 2. In Vivo Responses in Trout and Roach. Environ Sci Technol 32, 1559-1565. Saeed, A. I., Sharov, V., White, J., Li, J., Liang, W., Bhagabati, N., Braisted, J., Klapa, M., Currier, T., Thiagarajan, M., Sturn, A., Snuffin, M., Rezantsev, A., Popov, D., Ryltsov, A., Kostukovich, E., Borisovsky, I., Liu, Z., Vinsavich, A., Trush, V. y Quackenbush, J. (2003). TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis. Biotechniques 34, 374-378. Saiki, T., Kobayashi, Y., Kawagoe, K. y Beppu, T. (1985). Dictyoglomus thermophilum gen. nov., sp. nov., a Chemoorganotrophic, Anaerobic, Thermophilic Bacterium. Int J Syst Bacteriol 35, 253-259. Sambrook, J. y Russell, D. W. (2001). Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd edn: Cold Spring Harbor Laboratory Press Sanger, F., Nicklen, S. y Coulson, A. R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 74, 5463–5467. Sassetti, C. M. y Rubin, E. J. (2003). Genetic requirements for mycobacterial survival during infection. Proc Natl Acad Sci USA 100, 12989-12994. Scrutton, N. S., Berry, A. y Perham, R. N. (1990). Redesign of the coenzyme specificity of a dehydrogenase by protein engineering. Nature 343, 38-43. Schnappinger, D., Ehrt, S., Voskuil, M. I., Liu, Y., Mangan, J. A., Monahan, I. M., Dolganov, G., Efron, B., Butcher, P. D., Nathan, C. y Schoolnik, G. K. (2003). Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med 198, 693-704. Schoemer, U. y Martin, C. K. A. (1980). Microbial transformation of sterols. Biotechnol Bioeng 22, 11-25. Sedlaczek, L. y Smith, L. L. (1988). Biotransformations of Steroids. Crit Rev Biotechnol 7, 187-236. Sharp, J. O., Sales, C. M., LeBlanc, J. C., Liu, J., Wood, T. K., Eltis, L. D., Mohn, W. W. y Alvarez-Cohen, L. (2007). An Inducible Propane Monooxygenase Is Responsible for N-Nitrosodimethylamine Degradation by Rhodococcus sp. Strain RHA1. Appl Environ Microbiol 73, 6930-6938. Shen-Orr, S. S., Milo, R., Mangan, S. y Alon, U. (2002). Network motifs in the transcriptional regulation network of Escherichia coli. Nat Genet 31, 64-68.

245

Bibliografía

Shennan, J. L. (2006). Utilization of C2-C4 gaseous hydrocarbons and isoprene by microorganisms. J Chem Technol Biotechnol 81, 237-256. Slupska, M. M., King, A. G., Fitz-Gibbon, S., Besemer, J., Borodovsky, M. y Miller, J. H. (2001). Leaderless transcripts of the crenarchaeal hyperthermophile Pyrobaculum aerophilum. J Mol Biol 309, 347-360. Smith, A. G. y Brooks, C. J. W. (1974). Application of Cholesterol oxidase in the analysis of steroids. J Chromatogr 101, 373-378. Snapper, S. B., Melton, R. E., Mustafa, S., Kieser, T. y Jacobs, W. R. J. (1990). Isolation and characterization of efficient plasmid transformation mutants of Mycobacterium smegmatis. Mol Microbiol 4, 1911-1919. Söhngen, N. L. (1913). Benzin, Petroleum, Paraffinöl und Paraffin als Kohlenstoff- und Energiequelle für Mikroben. Zentr Bacteriol Parasitenk Abt II 37, 595-609. Steffan, R. J., McClay, K., Vainberg, S., Condee, C. W. y Zhang, D. (1997). Biodegradation of the gasoline oxygenates methyl tert-butyl ether, ethyl tert-butyl ether, and tert-amyl methyl ether by propane-oxidizing bacteria. Appl Environ Microbiol 63, 4216-4222. Studier, F. W. y Moffatt, B. A. (1986). Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol 189, 113-130. Stutzenberger, F. J. (1971). Cellulase Production by Thermomonospora curvata Isolated from Municipal Solid Waste Compost. Appl Environ Microbiol 22, 147-152. Swank, R. T. y Munkres, K. D. (1971). Molecular weight analysis of oligopeptides by electrophoresis in polyacrylamide gel with sodium dodecyl sulfate. Anal Biochem 39, 462-477. Szentirmai, A. (1990). Microbial physiology of sidechain degradation of sterols. J Ind Microbiol Biotechnol 6, 101-115. Tak, J. (1942). On bacteria decomposing cholesterol. Antonie van Leeuwenhoek 8, 32-40. Tarlera, S. y Denner, E. B. M. (2003). Sterolibacterium denitrificans gen. nov., sp. nov., a novel cholesterol-oxidizing, denitrifying member of the β-Proteobacteria. Int J Syst Evol Microbiol 53, 1085-1091. Taylor, C. D., Smith, S. O. y Gagosian, R. B. (1981). Use of microbial enrichments for the study of the anaerobic degradation of cholesterol. Geochim Cosmochim Acta 45, 2161-2168.

246

Bibliografía

Tedin, K., Resch, A. y Bläsi, U. (1997). Requirements for ribosomal protein S1 for translation initiation of mRNAs with and without a 5' leader sequence. Mol Microbiol 25, 189-199. Thompson, J. D., Higgins, D. G. y Gibson, T. J. (1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucl Acids Res 22, 4673-4680. Tolstrup, N., Sensen, C. W., Garrett, R. A. y Clausen, I. G. (2000). Two different and highly organized mechanisms of translation initiation in the archaeon Sulfolobus solfataricus. Extremophiles 4, 175-179. Trefault, N., Iglesia, R. D. l., Molina, A. M., Manzano, M., Ledger, T., Pérez-Pantoja, D., Sánchez, M. A., Stuardo, M. y González, B. (2004). Genetic organization of the catabolic plasmid pJP4 from Ralstonia eutropha JMP134 (pJP4) reveals mechanisms of adaptation to chloroaromatic pollutants and evolution of specialized chloroaromatic degradation pathways. Environ Microbiol 6, 655-668. Tsuge, T., Fukui, T., Matsusaki, H., Taguchi, S., Kobayashi, G., Ishizaki, A. y Doi, Y. (2000). Molecular cloning of two (R)-specific enoyl-CoA hydratase genes from Pseudomonas aeruginosa and their use for polyhydroxyalkanoate synthesis. FEMS Microbiol Lett 184, 193-198. Turfitt, G. E. (1944). Microbiological Agencies in the Degradation of Steroids: I. The Cholesterol-Decomposing Organisms of Soils. J Bacteriol 47, 487-493. Turfitt, G. E. (1948). The microbiological degradation of steroids 4. Fission of the steroid molecule. Biochem J 42, 376-383. Upton, A. M. y McKinney, J. D. (2007). Role of the methylcitrate cycle in propionate metabolism and detoxification in Mycobacterium smegmatis. Microbiology 153, 3973-3982. van der Geize, R., Hessels, G. I., van Gerwen, R., Vrijbloed, J. W., van der Meijden, P. y Dijkhuizen, L. (2000). Targeted Disruption of the kstD Gene Encoding a 3-Ketosteroid Δ1-Dehydrogenase Isoenzyme of Rhodococcus erythropolis Strain SQ1. Appl Environ Microbiol 66, 2029-2036. van der Geize, R., Hessels, G. I., van Gerwen, R., van der Meijden, P. y Dijkhuizen, L. (2001). Unmarked gene deletion mutagenesis of kstD, encoding 3-ketosteroid Δ1-dehydrogenase, in Rhodococcus erythropolis SQ1 using sacB as counter-selectable marker. FEMS Microbiol Lett 205, 197-202. van der Geize, R., Hessels, G. I. y Dijkhuizen, L. (2002a). Molecular and functional characterization of the kstD2 gene of Rhodococcus erythropolis SQ1 encoding a second 3-ketosteroid Δ1-dehydrogenase isoenzyme. Microbiology 148, 3285-3292.

247

Bibliografía

van der Geize, R., Hessels, G. I., van Gerwen, R., van der Meijden, P. y Dijkhuizen, L. (2002b). Molecular and functional characterization of kshA and kshB, encoding two components of 3-ketosteroid 9α-hydroxylase, a class IA monooxygenase, in Rhodococcus erythropolis strain SQ1. Mol Microbiol 45, 1007-1018. van der Geize, R. y Dijkhuizen, L. (2004). Harnessing the catabolic diversity of rhodococci for environmental and biotechnological applications. Curr Opin Microbiol 7, 255-261. van der Geize, R., Yam, K., Heuser, T., Wilbrink, M. H., Hara, H., Anderton, M. C., Sim, E., Dijkhuizen, L., Davies, J. E., Mohn, W. W. y Eltis, L. D. (2007). A gene cluster encoding cholesterol catabolism in a soil actinomycete provides insight into Mycobacterium tuberculosis survival in macrophages. Proc Natl Acad Sci USA 104, 1947-1952. van der Geize, R., Hessels, G. I., Nienhuis-Kuiper, M. y Dijkhuizen, L. (2008). Characterization of a Second Rhodococcus erythropolis SQ1 3-Ketosteroid 9α-Hydroxylase Activity Comprising a Terminal Oxygenase Homologue, KshA2, Active with Oxygenase-Reductase Component KshB. Appl Environ Microbiol 74, 7197-7203. Veiga, P., Juste, C., Lepercq, P., Saunier, K., Béguet, F. y Gérard, P. (2005). Correlation between faecal microbial community structure and cholesterol-to-coprostanol conversion in the human gut. FEMS Microbiol Lett 242, 81-86. Vrielink, A., Lloyd, L. F. y Blow, D. M. (1991). Crystal structure of cholesterol oxidase from Brevibacterium sterolicum refined at 1.8 Å resolution. J Mol Biol 219, 533-554. Walz, A., Pirrotta, V. y Ineichen, K. (1976). Lambda represser regulates the switch between PR and Prm promoters. Nature 262, 665-669. Warren, R., Hsiao, W. W. L., Kudo, H., Myhre, M., Dosanjh, M., Petrescu, A., Kobayashi, H., Shimizu, S., Miyauchi, K., Masai, E., Yang, G., Stott, J. M., Schein, J. E., Shin, H., Khattra, J., Smailus, D., Butterfield, Y. S., Siddiqui, A., Holt, R., Marra, M. A., Jones, S. J. M., Mohn, W. W., Brinkman, F. S. L., Fukuda, M., Davies, J. y Eltis, L. D. (2004). Functional Characterization of a Catabolic Plasmid from Polychlorinated- Biphenyl-Degrading Rhodococcus sp. Strain RHA1. J Bacteriol 186, 7783-7795. Weeks, O. B. y Francesconi, M. D. (1978). Occurrence of squalene and sterols in Cellulomonas dehydrogenans (Arnaudi 1942) comb. nov. Hester 1971. J Bacteriol 136, 614-624. Whitmarsh, J. M. (1964). Intermediates of microbiological metabolism of cholesterol. Biochem J 90, 23.

248

Bibliografía

Xiong, G., Martin, H.-J., Blum, A., Schäfers, C. y Maser, E. (2001). A model on the regulation of 3α-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase expression in Comamonas testosteroni. Chem Biol Interact 130-132, 723-736. Xiong, G., Martin, H.-J. y Maser, E. (2003). Characterization and recombinant expression of the translational repressor RepB of 3α-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase in Comamonas testosteroni. Chem-Biol Interact 143-144, 425-433. Yam, K. C., D'Angelo, I., Kalscheuer, R., Zhu, H., Wang, J.-X., Snieckus, V., Ly, L. H., Converse, P. J., Jacobs, W. R., Jr., Strynadka, N. y Eltis, L. D. (2009). Studies of a Ring-Cleaving Dioxygenase Illuminate the Role of Cholesterol Metabolism in the Pathogenesis of Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog 5, e1000344. Yang, X., Dubnau, E., Smith, I. y Sampson, N. S. (2007). Rv1106c from Mycobacterium tuberculosis Is a 3β-Hydroxysteroid Dehydrogenase. Biochemistry 46, 9058-9067. Yue, Q. K., Kass, I. J., Sampson, N. S. y Vrielink, A. (1999). Crystal Structure Determination of Cholesterol Oxidase from Streptomyces and Structural Characterization of Key Active Site Mutants. Biochemistry 38, 4277-4286. Zhao, J.-S., Manno, D., Leggiadro, C., O'Neil, D. y Hawari, J. (2006). Shewanella halifaxensis sp. nov., a novel obligately respiratory and denitrifying psychrophile. Int J Syst Evol Microbiol 56, 205-212.

249