UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA ... · Pérez, 2004). Diferentes...

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

GENOTIPIFICACIÓN DE Brucella spp., DE AISLAMIENTOS OBTENIDOS EN

BOVINOS FAENADOS EN DOS CAMALES DE LA PROVINCIA DE

PICHINCHA.

Trabajo de grado presentado como requisito para obtener el título de Médico

Veterinario y Zootecnista.

AUTOR:

Julian Omar López Balladares

[email protected]

TUTOR:

Prof. Washington Benítez Ortíz, Ph.D.

[email protected]

Quito, Diciembre 2015

mailto:[email protected]

ii

DEDICATORIA

Este logro se lo dedico a mi familia, por haberme brindado todo su apoyo

incondicional a lo largo de mi vida personal y mi carrera estudiantil. De manera

muy especial a mi madre por todo el amor y confianza.

Y por supuesto a mi hija Ariana, por ser mi mayor bendición y fortaleza.

Omar López

“All we need is love”, Canserbero.

iii

AGRADECIMINENTO

A Dios, por haberme brindado vida y salud para poder alcanzar esta meta.

Al Dr. Richar Rodríguez Ph.D., Director del Centro Internacional de Zoonosis,

por abrirme sus puertas y permitirme realizar el trabajo de titulación en tan

prestigioso centro.

Un agradecimiento especial a la Lcda. Maritza Celi por brindame la oportunidad

de participar en el proyecto: " Aislamiento y tipificación de brucella spp., en

reservorios animales sacrificados en seis camales de la sierra norte

ecuatoriana".

Sincero reconocimiento a la Ing. Elizabeth Minda A., Responsable del

Laboratorio de Biología Molecular por compartir su amplio conocimiento dentro

y fuera del laboratorio y facilitar el desarrollo de esta tesis.

Un especial reconocimiento a mi tutor: Dr. Washington Benítez Ph.D., quien

con mucha atención supo dirigir el trabajo hasta su culminación.

Finalmente, a todos los amigos, maestros, aquellos que marcaron cada etapa

de mi camino universitario, y que ayudaron de una u otra forma para culminar

con mi formación académica.

iv

AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL

v

INFORME DEL TUTOR

vi

APROBACIÓN DEL TRABAJO/ TRIBUNAL

TÍTULO DEL TRABAJO DE GRADO

vii

ÍNDICE DE CONTENIDO

DEDICATORIA ---------------------------------------------------------------------------------- ii

AGRADECIMINENTO ------------------------------------------------------------------------ iii

AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL --------------------------------- iv

INFORME DEL TUTOR ----------------------------------------------------------------------- v

APROBACIÓN DEL TRABAJO/ TRIBUNAL ------------------------------------------- vi

ÍNDICE DE CONTENIDO -------------------------------------------------------------------- vii

LISTA DE CUADROS -------------------------------------------------------------------------- x

LISTA DE FIGURAS -------------------------------------------------------------------------- xi

TABLA DE ABREVIACIONES ------------------------------------------------------------- xii

Abreviatura -------------------------------------------------------------------------------------- xii

Significado -------------------------------------------------------------------------------------- xii

RESUMEN -------------------------------------------------------------------------------------- xiv

ABSTRACT -------------------------------------------------------------------------------------- xv

CAPÍTULO I -------------------------------------------------------------------------------------- 1

INTRODUCCIÓN -------------------------------------------------------------------------------- 1

CAPÍTULO II ------------------------------------------------------------------------------------- 4

REVISIÓN DE LITERATURA ---------------------------------------------------------------- 4

Antecedentes de la investigación ----------------------------------------------------- 4

Generalidades -------------------------------------------------------------------------------- 5

Sinonimias ------------------------------------------------------------------------------------ 6

Etiología ---------------------------------------------------------------------------------------- 6

Evolución y Clasificación taxonómica ----------------------------------------------- 7

Especies y biotipos del género -------------------------------------------------------- 8

Genética de la Bacteria ------------------------------------------------------------------ 10

viii

IS711 o IS6501 ------------------------------------------------------------------------------- 12

Secuencias de inserción (IS) ----------------------------------------------------------- 12

Epidemiología ------------------------------------------------------------------------------- 12

Brucelosis en el mundo ----------------------------------------------------------------- 12

Brucelosis en Latinoamérica ----------------------------------------------------------- 13

Brucelosis en el Ecuador ---------------------------------------------------------------- 13

Transmisión de la enfermedad -------------------------------------------------------- 14

Diagnóstico ---------------------------------------------------------------------------------- 17

Diagnóstico indirecto --------------------------------------------------------------------- 17

Pruebas serológicas ---------------------------------------------------------------------- 17

Diagnóstico Directo ---------------------------------------------------------------------- 17

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ------------------------------------ 18

IS711 PCR ---------------------------------------------------------------------------------- 20

AMOS PCR convencional -------------------------------------------------------------- 21

AMOS PCR modificado ----------------------------------------------------------------- 22

Electroforesis ------------------------------------------------------------------------------- 23

CAPÍTULO III ------------------------------------------------------------------------------------ 24

METODOLOGÍA -------------------------------------------------------------------------------- 24

Ubicación ------------------------------------------------------------------------------------- 24

Población de estudio --------------------------------------------------------------------- 24

Unidades de Muestreo ------------------------------------------------------------------- 24

Extracción de ADN bacteriano -------------------------------------------------------- 25

Pre-tratamiento ---------------------------------------------------------------------------- 25

Procedimiento ------------------------------------------------------------------------------ 25

IS711 PCR ------------------------------------------------------------------------------------ 26

AMOS PCR Convencional --------------------------------------------------------------- 27

AMOS PCR modificada ------------------------------------------------------------------- 28

Visualización de Resultados ----------------------------------------------------------- 29

Procedimiento ------------------------------------------------------------------------------ 29

ix

Análisis de datos --------------------------------------------------------------------------- 30

CAPÍTULO IV ----------------------------------------------------------------------------------- 31

RESULTADOS Y DISCUSIÓN ------------------------------------------------------------- 31

CAPÍTULO V ------------------------------------------------------------------------------------ 36

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ------------------------------------------- 36

CONCLUSIONES --------------------------------------------------------------------------- 36

RECOMENDACIONES -------------------------------------------------------------------- 37

Bibliografía -------------------------------------------------------------------------------------- 38

ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------ 49

x

LISTA DE CUADROS

Cuadro 1. Sinonimias de la brucelosis ---------------------------------------------------- 6

Cuadro 2. Clasificación taxonómica de Brucella spp. --------------------------------- 7

Cuadro 3. Especies y biotipos del género Brucella. ----------------------------------- 9

Cuadro 4. Brucelosis: Prevalencia en Latinoamérica --------------------------------- 13

Cuadro 5. División epidemiológica de brucelosis bovina en el Ecuador --------- 14

Cuadro 6. Supervivencia de Brucella spp., en el medio ambiente. --------------- 15

Cuadro 7. Flujograma: Infección con B. abortus en ganado bovino adulto ----- 16

Cuadro 8. Rangos de concentración final de los componentes del PCR. ------- 20

Cuadro 9. Secuencia de primers para IS711 PCR ------------------------------------ 21

Cuadro 10. Secuencia de primers para AMOS PCR convencional. -------------- 21

Cuadro 11. Secuencia de primers para AMOS PCR modificada. ----------------- 22

Cuadro 12. Elaboración de Master Mix. -------------------------------------------------- 26

Cuadro 13. Ejemplo del volumen final de la solución para la PCR.--------------- 26

Cuadro 14. Programación del Termociclador, para IS711 PCR. ------------------ 27


Cuadro 16. Ejemplo de volumen final de la solución para la PCR. --------------- 28

Cuadro 17. Programación del Termociclador, para AMOS PCR Convencional.

------------------------------------------------------------------------------------------------------ 28


Cuadro 19. Ejemplo volumen final de la solución para la PCR. ------------------- 29

Cuadro 20. Programación del Termociclador, para AMOS PCR Modificada. -- 29

Cuadro 21. Resultados de la PCR -------------------------------------------------------- 34

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Dendograma: Relación entre Brucella spp., y las bacterias más

importantes del subgrupo alfa-2 de la clase Proteobacteria. ------------------------- 8

Figura 2. Dendograma: Relación evolutiva de las especies del género

Brucella, tanto de cepas terrestres como de cepas marinas. ------------------------ 9

Figura 3. Representación circular de los dos cromosomas de B. suis cepa

1330. ----------------------------------------------------------------------------------------------- 11

Figura 4. Fases de amplificación deL ADN, por PCR. ------------------------------- 19

Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa 2% de productos de amplificación de

IS711 PCR. MP: marcador de peso molecular. Líneas 1-9: muestras

analizadas. Líneas 10, 11, 14: controles negativos. Líneas 12, 13, 15: controles

positivos. ------------------------------------------------------------------------------------------ 31

Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa 20%. A) AMOS PCR convencional.

B) AMOS PCR modificada. MP: marcador de peso molecular. Líneas 1-9 y 12-

20: muestras analizadas. Líneas 10 y 21: control negativo. Líneas 11 y 22:

control positivo. --------------------------------------------------------------------------------- 33

xii

TABLA DE ABREVIACIONES

Abreviatura Significado

ADN Ácido Desoxirribonucleico.

AFLPs Polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados

(Amplified Fragment Length Polymorphism).

AGROCALIDAD Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de la Calidad

del Agro.

AMOS Abortus, Melitensis, Ovis, Suis.

ARNr Ácido Ribonucleico ribosómico o ribosomal.

CFT Técnica de Fijación de Complemento.

CIZ Centro Internacional de Zoonosis.

DNTPs Desoxinucleótido trifosfato.

ELISA Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas

(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).

FAO Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura

y la Alimentación.

GC Guanina y citosina.

IFI Inmunofluorescencia Indirecta.

IS Inserción.

LPS Lipopolisacárido.

MAG Ministerio de Agricultura y Ganadería.

MRT Anillo coloreado en leche (Milk Ring Test).

OIE Organización Mundial de la Sanidad Animal (World

Organisation for Animal Health).

ORF Marco abierto de lectura (Open Reading Frame).

PAT Técnica de aglutinación en placa (Huddleson).

PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa.

PNSA Programa Nacional de Sanidad Animal.

PSO Polisacárido O.

RAPDs Amplificación aleatoria de ADN polimórfico (Random

https://es.wikipedia.org/wiki/Polimorfismos_en_la_longitud_de_fragmentos_amplificados

http://www.oie.int/es/

http://www.oie.int/es/

xiii

Amplification of Polymorphic DNA).

RB Rosa de Bengala.

RFLPs Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción

(Restriction Fragment Length Polymorphism).

SAT-EDTA Sero-aglutinación lenta en tubo en presencia de EDTA.

TAT-2ME Técnica de aglutinación de 2- mercaptoetano.

UCE Universidad Central del Ecuador.

VNTRs Numero variable de repeticiones en tándem (Variable

Number of Tandem Repeats).

WHO Organización Mundial de la salud (OMS), (World Health

Organization).

https://www.google.com.ec/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&cad=rja&uact=8&ved=0CCsQFjABahUKEwiA6dvqoYHIAhVBmh4KHeRIDR4&url=https%3A%2F%2Fes.wikipedia.org%2Fwiki%2FPolimorfismos_de_longitud_de_fragmentos_de_restricci%25C3%25B3n&usg=AFQjCNHugIHrejN8vGccpGFRVyx0gkiPJw&bvm=bv.102829193,d.dmo

http://www.who.int/

http://www.who.int/

xiv


FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

GENOTIPIFICACIÓN DE Brucella spp., DE AISLAMIENTOS OBTENIDOS EN BOVINOS FAENADOS EN DOS CAMALES DE LA PROVINCIA DE PICHINCHA.

Autor: Julian Omar López Balladares Tutor: Prof. Washington Benítez Ph. D.

Asesora Científica: Ing. Elizabeth Minda A. Fecha: Noviembre, 2015

RESUMEN

La brucelosis es una zoonosis de origen animal que, por sus características epidemiológicas y evolutivas, genera un importante impacto social y económico; ocasiona enormes pérdidas a la industria pecuaria y representa un verdadero problema para la salud pública. El objetivo de este estudio fue realizar la genotipificación de bacterias de género Brucella mediante técnicas de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), para lo cual se contó con un total de nueve aislamientos bacterianos, obtenidos de bovinos sacrificados en los camales de los cantones Mejía y Cayambe, pertenecientes a la provincia de Pichincha, y que, al ser sometidas a las técnicas moleculares: IS711 PCR, AMOS PCR Convencional y AMOS PCR Modificada, se determinó que las nueve muestras correspondían a Brucella abortus cepas de campo; de los cuales, ocho aislamientos corresponden a animales procedentes del cantón Mejía provincia de Pichincha y un aislamiento corresponde a un animal procedente del cantón El Carmen, provincia de Manabí.

Palabras claves: Brucella abortus, bovino, Pichincha, IS711 PCR, AMOS PCR Convencional, AMOS PCR Modificada.

xv


SCHOOL OF VETERINARY MEDICINE AND ZOOTECHNICS

VETERINARY MEDICINE AND ZOOTECHNICS

GENOTYPING OF Brucella spp., FROM ISOLATIONS OBTAINED FROM

SLAUGHTERED BOVINES IN SLAUGHTERHOUSES, PICHINCHA

PROVINCE

Author: Julian Omar López Balladares

Tutor: Prof. Washington Benítez Ph. D.

Scientific Advice: Ing. Elizabeth Minda A.

Date: November, 2015

ABSTRACT

Brucellosis is an animal-borne zoonosis that, in accordance to epidemiologic and evolutionary characteristics, generates relevant social and economic impact. Large losses are caused to the livestock industry and are a true trouble for public health. The purpose of the current study was making a genotyping of bacteria Brucella gender, by using PCR technique (Polymerase Chain Reaction), for which a total of nine bacterial isolations were provided, obtained from bovines slaughtered in slaughterhouses of Mejía and Cayambe canton, Pichincha province, and that when submitted to molecular techniques: IS711 PCR, AMOS PCR conventional and AMOS PCR modified, it was determined that the nine samples were field strains of Brucella abortus; out of which, eight isolations correspond to an animal from El Carmen canton, Manabí province.

Keywords: Brucella abortus, bovine, Pichincha, IS711 PCR, Convectional

AMOS PCR, modified AMOS PCR.

1

CAPÍTULO I

INTRODUCCIÓN

La Brucelosis es una zoonosis que presenta una elevada tendencia a producir

infecciones crónicas, tanto en el hombre como en los animales (Orduña et al.,

2001). La diversidad de animales hospederos de la bacteria, complica en gran

medida las acciones de lucha contra esta infección (Castro et al., 2005).

La enfermedad es endémica en la mayoría de los países del mundo, excepto

en aquellos que han implementado programas de erradicación exitosos como

Canadá, Inglaterra y países del Norte de Europa (Lopetegui, 2005). En

Latinoamérica, se encuentra distribuida ampliamente en todo el continente,

presentando prevalencias altas como es el caso de México y Perú con valores

mayores al 10% y otros, como Uruguay con prevalencias menores al 1%,

debido a la implementación de programas de vigilancia epidemiológica (Gil &

Samartino, 2001).

En Ecuador, se estima que las pérdidas económicas directas e indirectas, para

el año 2000 fueron de 5 millones de dólares anuales y una prevalencia del 6%

según el estudio realizado por el antiguo PNSA (Programa Nacional de

Sanidad Animal) del MAG (Ministerio de Agricultura y Ganadería) en el año

1978-1979 (AGROCALIDAD, 2009); sin embargo, estos valores podrían ser

subestimados debido a la falta de datos de la enfermedad, ya que en el país se

practica una vigilancia pasiva (Ron et al., 2014). En la actualidad se estima que

la prevalencia promedio es de 2,37% a nivel de animales y 9,2% a nivel de

predios, lo que significaría que uno de cada diez predios tiene anticuerpos

circulantes contra Brucella spp., y las pérdidas económicas estimadas serían

de 20’000.000 de dólares (Com. pers., Benítez Ortíz, 2014).

Con el afán de conseguir una identificación rápida, segura y confiable de los

agentes patógenos causales de enfermedades infecciosas, la Microbiología

Clásica encontró, en la Biología Molecular, una gran herramienta para obtener

mayor eficacia del diagnóstico, sin desplazar los métodos tradicionales, más

2

bien como un siguiente paso hacia la confirmación de los resultados (Méndez &

Pérez, 2004).

Diferentes investigaciones y análisis moleculares, con los cuales se ha

estudiado a Brucella spp., sirven para conocer la genética de la especie y sus

biovariedades, además profundizan en el análisis de varios marcadores

moleculares para diagnóstico y tipificación.

Taxonomistas clásicos del género bacteriano desarrollaron un sistema de

clasificación que reconoce seis especies basadas en fenotipo (análisis

microbiológico), diferencias antigénicas y especificidad de los hospederos

(Whatmore et al., 2006). Este sistema taxonómico se mantiene desde 1963,

cuando el Subcomité de Taxonomía de Brucella de la Comisión Internacional

de Nomenclatura Bacteriológica, oficializó en su informe dicha clasificación

(FAO/OMS, 1986); sin embargo, con la aparición de herramientas

biotecnológicas como la hibridación ADN-ADN o análisis de la secuencia del

ARNr 16S, se propuso que el género Brucella es mono-específico, de ahí que

se considera a Brucella melitensis, por lo completo de su secuencia genómica,

como el nombre de la especie, con múltiples biovariedades; por ejemplo:

Brucella melitensis biovar abortus o Brucella melitensis biovar canis (Rodicio &

Mendoza, 2004; Michaux et al., 1997). Este planteamiento ha producido gran

controversia acerca de la taxonomía interna del género (Scholz et al., 2010);

sin embargo, otros estudios basados en la revisión de la estructura bacteriana y

el análisis de la diversidad genética demostraron que no existe suficiente

sustento científico para la aplicación del concepto genómico de especies, al

género Brucella, sino el mantener el concepto biológico amplio de la especie

(Moreno et al., 2002). Es así que, tomando en cuenta el rango de hospederos

como criterio biológico, ya reconocido, y la presencia de los marcadores

específicos de la especie, en genes externos de la proteína de membrana y en

otros genes, se demuestran que B. melitensis, B. abortus, B. ovis, B. canis y B.

neotomae no son solo patovares sino especies biológicamente significativas

(Moreno et al., 2002).

La biotipificación es la identificación de biotipos (conjunto de fenotipos que

corresponden al mismo genotipo) de una misma especie, la importancia de su

3

estudio radica en que permite determinar las fuentes de infección, indicando la

necesidad de clasificar los biotipos en los aislamientos múltiples antes de

establecer definitivamente el biotipo de cepa infectante, además de convertirse

en una valiosa herramienta epizootiológica (Jones et al., 1982). Desde el punto

de vista epidemiológico, la brucelosis se presenta como una zoonosis de

extraordinaria complejidad, debido a la variedad de especies y biotipos del

género, además de la aparición de variantes genéticas y a las características

epidemiológicas que presenta cada una de ellas. Según la FAO/OMS (1986),

siempre que sea posible, debe llevarse la identificación hasta la categoría de

biotipo, pues los biotipos a menudo tienen una distribución geográfica particular

y pueden proporcionar información epidemiológica importante.

Tomando en cuenta las consideraciones anteriores, los objetivos que se

plantearon para la realización de este trabajo de tesis, permitieron la

Genotipificación de Brucella spp., de aislamientos obtenidos de bovinos de dos

camales de la Provincia de Pichincha. Para alcanzar estos objetivos se

utilizaron técnicas de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), dentro de

las que tenemos: IS711 PCR, para determinar género bacteriano; AMOS PCR

convencional, para discriminar entre B. abortus biovar 1, 2 y 4, B. melitensis

biovar 1, 2 y 3, B. ovis y B. suis biovar 1 (Bricker & Halling, 1994) y AMOS

PCR modificada (Ewalt & Bricker, 2000; Bricker et al., 2003), para diferenciar

dentro de B. abortus la presencia de cepas vacunales (S19 y RB51) o de

campo (Bricker & Halling, 1995). Los métodos mencionados anteriormente,

utilizan como ADN target la secuencia de inserción (IS) llamada IS711, la

misma que es única en el género bacteriano y cuyo número de copias depende

de cada especie (Michaux et al., 1993). El desarrollo y validación de

marcadores altamente polimórficos aumentan la sensibilidad y poder de

resolución debido a la alta homología genética entre bacterias del género

(Mahillon & Chandler, 1998).

Esta investigación forma parte del proyecto: “Aislamiento y Tipificación de

Brucella spp., en reservorios animales sacrificados en seis camales de la sierra

norte ecuatoriana”, realizado en el Centro Internacional de Zoonosis (CIZ-

UCE); la información generada permitió obtener datos actualizados de las

especies de Brucella presentes en la región.

4

CAPÍTULO II

REVISIÓN DE LITERATURA

Antecedentes de la investigación

Para el diagnóstico e identificación de Brucella spp., la utilización de

herramientas biotecnológicas, con mayor especificidad, rapidez y confianza, es

la tendencia, en comparación con métodos tradicionales como

inmunodiagnóstico o biotipificación; considerando además que dichas

herramientas se las utiliza como métodos de confirmación.

En Ecuador se han realizado varios trabajos, utilizando técnicas de serología

como, Rosa de Bengala (RB) (Ron et al., 2003; Celi & Vizvaíno, 2004;

Sanchez, 2012), Sero-aglutinación lenta en tubo en presencia de EDTA (SAT-

EDTA) (Ron et al., 2003; Díaz & Lamiña, 2013), Anillo Coloreado en Leche

(MRT) (Neppas, 2013), ELISA competitivo (Ensayo por inmuno-absorción

ligado a enzimas), realizado por AGROCALIDAD (2009), entre otros; sin

embargo la aplicación de técnicas de aislamiento y tipificación de cepas no son

muy comunes (Ron et al., 2010; Carlosama, 2013). En cuanto a trabajos de

genotipificación empleando técnicas de biología molecular se refiere, los

estudios son escasos (Rodríguez-Hidalgo et al., 2015); razón por la cual la

utilización de estas herramientas biotecnológicas son fundamentales.

Varios son los estudios relevantes a nivel internacional, para el análisis

molecular de Brucella spp., mismos que fueron la base de los métodos

empleados en este estudio:

Differentiation of Brucella abortus bv. 1, 2, and 4, Brucella melitensis,

Brucella ovis, and Brucella suis bv. 1 by PCR (Bricker & Halling, 1994).

Enhancement of the Brucella AMOS PCR Assay for Differentiation of

Brucella abortus Vaccine Strains S19 and RB51 (Bricker & Halling,

1995).

5

Validation of the Abbreviated Brucella AMOS PCR as a Rapid Screening

Method for Differentiation of Brucella abortus Field Strain Isolates and

the Vaccine Strains, 19 and RB51 (Ewalt & Bricker, 2000).

Evaluation of the Brucella abortus species-specific polymerase chain

reaction assay, an improved version of the Brucella AMOS polymerase

chain reaction assay for catlle (Bricker et al., 2003).

Generalidades

Bruce, en 1887, señaló que la Fiebre de Malta del hombre la producía una

pequeña bacteria, a la cual llamó Micrococcus melitensis (López et al., 2008).

Bang y Stribolt, en 1896, lograron comprobar que el aborto infeccioso en las

vacas, lo causaba una bacteria que denominaron Bacillus infectiosi (Sbriglio et

al., 2007). Zammit, en 1905, informa que las cabras transmiten la enfermedad

al hombre y surge el concepto de zoonosis a partir del consumo de la leche

infectada (Laval, 2006). Evans, en 1918, comprueba el íntimo parentesco entre

el Micrococcus melitensis y el Bacillus abortus, estos resultados junto con los

de Meyer y Shaw en 1920 permitieron agrupar a estos microorganismos en un

solo género bacteriano: Brucella spp. (Benítez, 1979; citado por Rodríguez et

al., 2005).

La brucelosis es una zoonosis de origen animal, producida por bacterias del

género Brucella, la cual tiene una elevada virulencia y cuenta con una

distribución cosmopolita, además de representar un problema en la Salud

Pública, al ser una enfermedad de carácter ocupacional en aquellas personas

que trabajan con derivados pecuarios o por consumo de productos lácteos y/o

sus derivados no pasteurizados (John et al., 2010; Saegerman et al., 2010).

Sus características evolutivas y epidemiológicas, hacen que esta enfermedad

tenga un impacto social importante ya que representa cuantiosas pérdidas

económicas en la industria pecuaria en diferentes países (Sbriglio et al., 2007).

Esta enfermadad está relacionada con especies domésticas o semi-domésticas

que son ampliamente utilizadas para la carne, leche, pelo, lana, cueros,

fertilizantes, combustible, para llevar cargas o para el cultivo de la tierra (López-

Goñi & Moriyón, 2005).

6

Sinonimias

Existen varios nombres atribuidos a la enfermedad que dependen,

principalmente, de si la misma se presente en animales o humanos, así por

ejemplo:

Cuadro 1. Sinonimias de la brucelosis

HOSPEDADOR NOMBRES DE LA ENFERMEDAD

Humano Fiebre ondulante

Fiebre de Malta

Fiebre Mediterránea

Animal Aborto epizoótico,

Aborto contagioso,

Enfermedad de Bang

Fuente: (The Center for Food Security & Public Health, 2009)

Etiología

El agente causal de esta infección son bacterias del Género Brucella;

cocobacilos o bacilos, Gram negativos, que al ser observados por el

microscopio aparecen solos o en grupos. Su tamaño está entre 0.5-0.7µm de

diámetro x 0.6-1.5µm de largo, pueden llegar a ser pleomórficos (variable en

forma), no capsulados, no son capaces de formar esporas, poseen crecimiento

lento, son oxidasa y catalasa positivas, generalmente no fermentan los

carbohidratos (Fernández & Gómez, 2009). Son bacterias aerobias

intracelulares facultativas y algunas especies requieren CO2 adicional (5-10%)

para su crecimiento (Aréstegui et al., 2001).

La membrana externa de Brucella spp., es rica en fosfatidilcolina, a diferencia

de la perteneciente a las enterobacterias relacionadas con ella, la cual es rica

en fosfatidiletanolamina. Su componente más abundante es el

(lipopolisacárido) LPS, que se conoce también con el nombre de endotoxina;

en el que se distinguen tres regiones: el lípido A, inserto en la hoja externa de

la membrana, un oligosacárido intermedio, llamado núcleo, y el polisacárido O

(PSO), también conocido como cadena O (Castro et al., 2005). Según

7

Aréstegui y colaboradores (2001), otra característica importante del LPS, es

que en su extremo terminal, presenta moléculas de manosa que favorecen la

adherencia a las células del huésped a través de sus receptores.

Evolución y Clasificación taxonómica

El estudio de la secuencia del gen 16S rRNA, la composición lipídica y algunos

aspectos fisiológicos y biológicos ubican al género Brucella en la subdivisión

alfa-2 de la clase proteobacteria (Paulsen et al., 2002).

Cuadro 2. Clasificación taxonómica de Brucella spp.

Dominio: Bacteria

Filo: Proteobacteria

Clase: Proteobacteria alfa

Orden: Rhizobiales

Familia: Brucellaceae

Género: Brucella

Fuente: (Ficht, 2010; Koneman et al., 2005)

Los miembros de la clase Proteobacteria alfa incluyen las familias de

organismos considerados patógenos o simbiontes, ya sea de mamíferos o de

plantas (Jumas-Bilak et al., 1998; Boussau et al., 2004; López et al., 2008).

Varios estudios que utilizan análisis filogenéticos ponen en evidencia la

relación genética de Brucella spp., con plantas simbiontes y patógenos de

plantas como es el caso de Bartonella spp., una estrecha relación con

microorganismos de suelo tales como Ochrobactrum spp., con el cual

comparten hasta un 98% de similitud en el gen 16S RNA, e incluso se observa

vínculos genéticos con fitopatógenos como Agrobacterium spp., y simbiontes

de plantas como Rhizobium spp. (Scholz et al., 2012; Velasco et al., 1998;

Paulsen et al., 2002).

La particularidad de Brucella spp., de ser una bacteria intracelular estricta ha

sido muy estudiada, por ejemplo en condiciones biológicas naturales, las

bacterias del género son patógenos que no se multiplican en ambientes

abiertos y cuyo ciclo característico es de huésped a huésped (Meyer, 1990).

Por lo tanto, parece ser que la asociación intracelular con eucariotas es una

8

tendencia evolutiva, que comparte Brucella spp., con otros miembros de la

subdivisión alfa-2 (Jumas-Bilak et al., 1998 Moriyón et al., 2001).

Fuente: (Moriyón et al., 2001)

Figura 1. Dendograma: Relación entre Brucella spp., y las bacterias más

importantes del subgrupo alfa-2 de la clase Proteobacteria.

Especies y biotipos del género

La taxonomía clásica propuso un sistema de clasificación para el género

Brucella, con seis especies y sus diferentes biotipos (Allardet et al., 1988;

Whatmore et al., 2006), donde encontramos a B. abortus con sus siete

biovares, B. melitensis con tres biovares, B. suis con cinco biovares, B. canis,

B. ovis y B. neotomae (Corbel & Brinley, 1982). En la actualidad la cantidad de

especies ha aumentado, pero el número de cepas virulentas se ha mantenido

(Sbriglio et al., 2007). Es así que hoy en día el género Brucella está compuesto

por once especies, en el que se incluye: B. pinnipediae y B. ceti (Foster et al.,

2007), B. microti (Scholz et al., 2008), B. inopinata (scholz et al., 2010) y por

último B. papionis (Whatmore et al., 2014). De esta manera queda demostrado

que el género bacteriano cuenta con una gran variedad de especies, presentes

en mamíferos tanto marinos como terrestres; con lo cual, Bourg y

colaboradores (2007) al analizar la filogenia de las cepas marinas junto con las

terrestres, sugieren que la divergencia de los diferentes especies del género

Brucella, pudo haber tenido lugar hace 60 millones de años, concomitante con

9

la radiación de sus huéspedes mamíferos (Artiodactyla) de otros órdenes de

mamíferos .

Fuente: (Bourg et al., 2007)

Figura 2. Dendograma: Relación evolutiva de las especies del género

Brucella, tanto de cepas terrestres como de cepas marinas.

Cuadro 3. Especies y biotipos del género Brucella.

Especies Biotipos Huésped natural Primera Descripción

B. melitensis 1 – 3 Cabra, oveja, bovinos,

cánidos, hombre Meyer & Shaw, 1920

B. abortus 1 - 6, 9 Bovinos, cánidos,

hombre Meyer & Shaw, 1920

B. suis 1 – 5 Cerdo, cánidos, hombre Huddleson, 1929

B. ovis Ninguno Ovinos Buddle, 1956

B. neotomae Ninguno Rata del desierto Stoenner & Lackman,

1957

B. canis Ninguno Cánidos, hombre Carmichael & Bruner,

1968

B. pinnipediae Ninguno Focas, lobos marinos Cloeckaert et al., 2001;

Foster et al., 2007

B. ceti Ninguno Delfines, ballenas Cloeckaert et al., 2001;

Foster et al., 2007

10

B. microti Ninguno Zorros Hubalek et al., 2007;

Scholz et al., 2008

B. inopinata Ninguno Humanos De et al., 2008; Scholz

et al., 2010

B. papions Ninguno Babuinos

Schlabritz-Loutsevitch

et al., 2009; Whatmore

et al., 2014

Fuente: (Whatmore et al., 2014; Castro et al., 2005; Scholz et al., 2012)

Genética de la Bacteria

El material genético de estos microorganismos está contenido en dos

cromosomas, pero cabe destacar que son carentes de plásmidos, lo cual refleja

probablemente la adaptación a un nicho ecológico (el ambiente intracelular)

estable y sin competencia microbiana, en donde no es necesaria la plasticidad

genética que se deriva de los plásmidos y que es propia de ambientes con gran

cantidad de microorganismos (intestino, tierra, entre otros), (Moreno, 1998;

Rivers et al., 2006). En el 2002, dos genomas de Brucella fueron secuenciados

y analizados, B. melitensis 16M y B. suis 1330 (Sobral & Wattam, 2012)

demostrando que el genoma de estas bacterias consiste en dos cromosomas

circulares de aproximadamente 2.05 y 1.15 Mb, con un contenido de 58-59%

de GC (guanina y citosina); 3197 ORFs (Open Reading Frame) fueron

identificados, además de varios genes, operones, rutas metabólicas de

secreción adhesión y características de la pared celular (Michaux et al., 1997;

DelVecchio et al., 2002; Pappas et al., 2005; Sobral & Wattam, 2012). En

contraste, B. suis biovar 2 y 4 tienen dos replicones de 1.35 Mb y 1.85 Mb y B.

suis biovar 3 presenta un solo cromosoma de 3.1 Mb (Pappas et al., 2005;

Mantur & Amarnath, 2008).

11

Fuente: (Paulsen et al., 2002)

Figura 3. Representación circular de los dos cromosomas de B. suis cepa

1330.

El género Brucella, es altamente homogéneo entre si (95%), pero estudios que

analizan determindas secuencias de ADN, seguido de análisis de restricción

han dado evidencia de la existencia de polimorfismo en ciertos genes, como:

omp2, dnaK, htr y ery (Aréstegui et al., 2001). Por ejemplo: el gen omp2, es

considerado taxonomicamente importante porque determina sensibilidad a las

tinciones (crecimiento en medios coloreados), uno de los métodos utilizados

para tipficación de los diferentes biovares de Brucella spp. (Cloeckaert et al.,

2001). El gen dnaK de B. melitensis, es responsable de la síntesis del chaperón

Dna K, y cuando es cortado con enzimas de restricción el resultado es la

aparición de dos fragmentos, mientras que la restricción en otras especies del

género produce un fragmento simple (Cloeckaert et al., 1996). Por otra parte el

gen ery, común en la mayoría de cepas del género, se encuentra ausente en B.

abortus biovar 1 cepa 19 (cepa vacunal), lo cual es importante en el momento

de la genotipificación para diferenciar Brucela abortus, entre cepas de campo y

cepas vacunales (Sangari et al., 1994).

12

IS711 o IS6501

Secuencias de inserción (IS): Los elementos de inserción (IS) son segmentos

de DNA que pueden moverse de una posición cromosómica a otra dentro del

mismo cromosoma o a uno diferente (Stanier et al., 1996; Mahillon & Chandler,

1998); las secuencias de inserciones son responsables de un número de

reordenamientos genéticos, incluyendo la inactivación de genes por

mutagénesis insercional, supresión de la expresión génica o la activación de

genes, entre otras (Mahillon & Chandler, 1998).

Un estudio realizado en el año 1993 por Ouahrani y colaboradores, demostró la

identificación, clonación y caracterización de una IS de B. ovis, denominada

IS6501, conocida también como IS711, donde además se probó que esta IS se

encuentra presente únicamente en las especies del género Brucella (Halling et

al., 1993; Ouahrani et al., 1993). Cuando se utiliza RFLP (Restriction Fragment

Length Polymorphism) basado en la secuencia IS6501, ésta es capaz de

distinguir entre especies de Brucella spp., donde el número de copias de la IS

varía ampliamente de una cepa a otra dentro de la misma especie (Ouahrani et

al., 1993). Así por ejemplo, el número de copias de la IS711, en el genoma de

Brucella spp., va desde siete en B. abortus, B. melitensis y B. suis a más de

30 en B. ovis y en las cepas de Brucella aisladas de los mamíferos marinos

(Ocampo-Sosa & García-Lobo, 2008).

La presencia de IS711 podría conferir una posible ventaja selectiva al

organismo; tales como, alterar la patogenicidad o modificando la especificidad

(Halling et al., 1993; Ouahrani et al., 1993).

Epidemiología

Brucelosis en el mundo

La brucelosis es considerada como una de las enfermedades zoonósicas de

mayor distribución en el mundo, causante de cuantiosas pérdidas económicas

y un verdadero problema de salud pública; por cuanto, los gobiernos de

muchos países, han optado por la implementación de un programa de

vigilancia epidemiológica, este es el caso de Inglaterra, el norte de Europa,

13

Japón, Canadá, Nueva Zelanda (Lopetegui, 2005; APHIS, 2012); donde el

programa funcionó y se logró erradicar la enfermedad.

Brucelosis en Latinoamérica

En Latinoamérica la brucelosis representa un verdadero problema, al estar

distribuida en todo el continente y presentar prevalencias alarmantes como es

el caso de Venezuela y Argentina, donde sobrepasa el 10%, por otro lado

algunos países han implementado programas de control de la enfermedad con

lo cual presentan mínimos valores de prevalencias, por ejemplo Uruguay con

0.04% (Gil & Samartino, 2001; APHIS, 2012).

Cuadro 4. Brucelosis: Prevalencia en Latinoamérica

PAIS PREVALENCIA %

ESTADOS UNIDOS 0,0001

URUGUAY 0,04

BRAZIL 0,06

CHILE 0,2

BOLIVIA 2,27

PARAGUAY 3,15

VENEZUELA 10,5

ARGENTINA 10-13

Fuente: (APHIS, 2012; Aznar et al., 2012)

Brucelosis en el Ecuador

El único estudio a nivel nacional, realizado por el organismo oficial (PNSA-

MAG) en el año de 1979, y reportado por AGROCALIDAD en el año 2009,

realiza la siguiente división epidemiológica.

14

Cuadro 5. División epidemiológica de brucelosis bovina en el Ecuador

REGIÓN PROVINCIAS PREVALENCIA %

1 (Alta prevalencia) Carchi, Imbabura, Pichincha,

Cotopaxi, Tungurahua y

Chimborazo

1.97-10.62

2 (Alta prevalencia) Esmeraldas, Manabí, Santa

Elena, Guayas, Los Ríos, El

Oro y Santo Domingo de los

Tsáchilas

4.2-10.62

3 (Baja prevalencia) Bolívar, Cañar, Azuay y Loja 1.3-2.6

4 (Baja prevalencia) Provincias amazónicas Sin datos 1-2

5 (Indemne) Islas Galápagos Indemne

Fuente: (AGROCALIDAD, 2009)

Transmisión de la enfermedad

En humanos presenta dos patrones epidemiológicos:

Patrón urbano-alimentario, por consumo de leche y quesos no

pasteurizados.

Patrón rural-laboral, por exposición profesional al ganado infectado o sus

productos, sea por contacto directo o aerosoles.

La bacteria puede incluso entrar por vía respiratoria (aerosoles), en el momento

de la manipulación de animales contaminados en la granja o al limpiar establos

o zonas de ordeño (WHO et al., 2006). En países desarrollados es una

enfermedad típicamente ocupacional donde las personas más expuestas son

veterinarios, peones de campo y trabajadores de la industria de la carne

(Dirección General de Epidemiología, 2012).

Brucella spp., tiene además afinidad por los tejidos de los órganos

reproductivos, en consecuencia los mamíferos sexualmente maduros o en

15

estado de preñez son más susceptibles a la infección (WHO et al., 2006). Los

animales infectados eliminan las bacterias después de un aborto o de un parto;

así como, a través de la leche, secreciones vaginales, semen, sangre, orina y

heces (Cuadro 6), contaminando así pastos, agua y el medio ambiente y;

sobreviviendo en dichos lugares durante variado tiempo (Quinn et al., 2002).

De esta forma se completa el ciclo infeccioso (Cuadro 7), asegurando la

contaminación de otros animales y la persistencia del microorganismo en la

naturaleza (Castro et al., 2005). Cabe mencionar que la brucelosis humana

únicamente puede admitirse en función de la existencia de la enfermedad en

los animales, ya que el contagio interhumano existe pero es excepcional

(Crespo-León, 1994)

Cuadro 6. Supervivencia de Brucella spp., en el medio ambiente.

MATERIAL TIEMPO DE

SUPERVIVENCIA

Suelo y estiércol 80 días

Polvo 15-40 días

Leche a temperatura ambiente 2-4 días

Fluidos y secreciones en verano 10-30 minutos

Fetos mantenidos a la sombra 6-8 meses

Paja 29 días

Grasa de ordeño 9 días

Heces bovinas naturales 1-100 días

Fuente: (Castro et al., 2005)

16

Cuadro 7. Flujograma: Infección con B. abortus en ganado bovino adulto

Fuente: (Quinn et al., 2002)

B. abortus

Por ingestión en animales adultos

Animal infectado

Localización en tejido linfoide

Bacterias transportadas por macrófagos al torrente sanguíneo

Animal preñado

Animal no preñado Hembra

Útero

Partos Posteriores

B. abortus presente en

feto, placenta, líquidos

fetales y descargas

uterinas

Placenta

Preñez

inicial

Aborto

Expulsión de B.

abortus en el parto

Orquitis, Epididimitis

Órganos reproductores

Macho

B. abortus permanece

en bazo, ganglios

supramamario y otros

tejidos linfoideos

Expulsa B.

abortus de forma

intermitente en la

leche

Glándula

mamaria

Infertilidad

B. abortus

presente en el

semen

17

Diagnóstico

Diagnóstico indirecto

Algunas de las pruebas de laboratorio para diagnóstico de brucelosis son las

que se enlistan a continuación:

Pruebas serológicas

Rosa de Bengala (RB)

Aglutinación lenta en tubo de Wright (SAT)

Milk Ring Test o Anillo Coloreado en Leche (MRT)

Técnica de aglutinación en placa (Huddleson) (PAT)

Técnica de aglutinación de 2- mercaptoetanol (TAT-2ME)

Precipitación con Rivanol

Prueba de Coombs

Inmunodifusión en agar

ELISA: directo, indirecto y competitivo

Fijación de Complemento (CFT)

Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)

Diagnóstico Directo

Sin duda, a través del tiempo, el cultivo microbiológico, ha sido la principal

herramienta a la hora de diagnosticar e identificar Brucella spp. Se basa en

evidenciar la presencia de la bacteria en los tejidos de los animales o del

hombre (OIE, 2008).

Los cultivos deben mantenerse en incubación un tiempo, no menor a 30 días,

debido a que las bacterias del género son de crecimiento lento. La muestra a

utilizar para el aislamiento bacteriano, puede ser: sangre (hemocultivo),

ganglios linfáticos, hígado, bazo o leche. (Blasco et al., 2001).

Con el tiempo y la aparición de nuevas tecnologías, este procedimiento ha sido

complementado con la aplicación de técnicas de Biología Molecular, que

presentan una sensibilidad y especificidad más alta, haciendo el diagnóstico e

identificación mucho más confiable y determinando con mayor facilidad y

rapidez los biovares de las especies correspondientes al género.

18

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Uno de los descubrimientos más importantes de la historia que marcó el inicio

de una nueva era en el estudio y conocimiento de los ácidos nucleicos fue el de

Watson y Crick, al descifrar la estructura del ADN (ácido desoxirribonucleico)

(Mullis, 1990; Somma & Querci, 2012). Desde entonces, varios grupos han

mostrado un gran interés por desarrollar métodos sensibles y reproducibles que

les permitan estandarizar protocolos experimentales para estudiar los ácidos

nucleicos; probablemente la más importante sea la reacción en cadena de la

polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), desarrollada por Kary Mullis (Saiki

et al., 1985; Tamay de Dios et al., 2013).

La PCR es una reacción enzimática in vitro que amplifica, de manera

exponencial, una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos,

en los que la secuencia blanco es copiada fielmente (Tamay de Dios et al.,

2013), aprovechando los mecanismos de replicación natural del ADN. Para

ello, la reacción aprovecha la actividad de la polimerasa, una enzima

termoestable, que proviene de la bacteria Thermus aquaticus que sobrevive a

temperaturas de entre 79oC a 85oC, de ahí su nombre comercial de: Taq

polimerasa (Mullis, 1990).

Esta técnica contiene tres etapas repetitivas (Somma & Querci, 2012):

Desnaturalización del ADN por fusión a temperatura elevada (rango

entre 94°C a 96°C), a fin de convertir el ADN bicatenario en ADN

monocatenario.

Hibridación, unión (anillamiento) de los oligonucleótidos (primers),

utilizados como cebadores, al ADN diana, cuya temperatura oscila entre

45°C a 65°C.

Extensión de la cadena de ADN por adición de nucleótidos (dNTP’s) a

partir de los cebadores utilizando la ADN polimerasa como catalizador,

en presencia de iones Mg2+. La temperatura a la que se realiza es de

72°C.

19

Fuente: (Somma & Querci, 2012)

Figura 4. Fases de amplificación del ADN, por PCR.

El tiempo, la temperatura y el número de ciclos son factores determinantes en

los resultados de la PCR, por lo que modificarlos optimizará la reacción. Otra

de los factores que se debe considerar al momento de ensamblar una reacción

de PCR es la concentración inicial y final de los componentes de la PCR, cuya

variación permite la estandarización de la misma (Cuadro 8). Pese al alto grado

de homología del ADN dentro del género Brucella, se han desarrollado varios

métodos que permiten, la diferenciación entre especies y sus biovariedades,

como por ejemplo análisis de polimorfismos de fragmentos de restricción

(RFLP) (Salehi et al., 2006), la hibridación tipo Southern, entre otras. Se ha

desarrollado también una electroforesis en campo pulsante que permite la

diferenciación entre varias especies de Brucella (OIE, 2008).

20

Cuadro 8. Rangos de concentración final de los componentes del PCR.

Reactivo Concentración

Inicial

Concentración

Final

Buffer TBE 10 X 1 X

dNTP’s 10 mM 50 - 200 µM

MgCl2 50 mM 2 - 4 mM

Primers ------ 0.2 - 1 µM

DNA Polimerase 5 U/µL 2 U/100 µL

Fuente: (Surzycki, 2002)

A nivel de Biología Molecular se manejan dos aspectos: el Diagnóstico

Molecular, el cual va a permitir reconocer la presencia del agente causal; y la

Tipificación Molecular o Genotipificación, misma que identifica al

microorganismo a nivel de especie y como en el caso de Brucella spp., hasta la

biovariedad.

Varias son la técnicas moleculares empleadas para la genotipificación, en el

caso de brucelosis, se han realizado análisis de RAPD’s (Random Amplification

of Polymorphic DNA) (Tcherneva et al., 2000), AFLP’s (Amplified Fragment

Length Polymorphism) (Fekete et al., 1992), RFLP’s (Restriction Fragment

Length Polymorphism) (Salehi et al., 2006), VNTRs (Variable Number of

Tandem Repeats) (Bricker et al., 2003), entre otros, con el objetivo no solo de

determinar la genética del género, sino además de diferenciar las especies

terrestres de las marinas (Ocampo-Sosa & García-Lobo, 2008).

IS711 PCR

Para la tipificación molecular de Brucella spp, la secuencia diana o target que

se maneja, para todas las metodologías, es el elemento multi-copy IS711, que

al ser única en el género permite discriminar de las demás alfa Proteobacterias.

Es decir, este método es una PCR simple y permite determinar el género

bacteriano (Grégoire et al., 2012; Clavareau et al., 1998) para ello se utiliza el

par de primers que se detallan a continuación:

21

Cuadro 9. Secuencia de primers para IS711 PCR

Primer (nombre) 5’-3’ Secuencia

IS6501 3' GAT AGA AGG CTT GAA GCT TGC GGA C

IS6501 5' ACG CCG GTG TAT GGG AAA GGC TTT T

Fuente: (Clavareau et al., 1998)

AMOS PCR convencional

Varios ensayos se han realizado con el objetivo de identificar especie y

biovariedad de Brucella spp., es así que, a la fecha, la prueba de PCR múltiple

específica más difundida para la identificación de Brucella spp., fue descrita por

Bricker & Halling en 1994, y la denominaron AMOS PCR, ya que se deriva de

las cuatro iniciales de las especies de Brucella capaz de identificar: B. abortus,

B. melitensis, B. ovis y B. suis (Ewalt & Bricker, 2000). Al tratarse de una PCR

multiplex, estamos hablando de reacciones que consiguen amplificar

simultáneamente y en un único tubo diferentes secuencias diana, permitiendo

la detección e identificación simultánea de distintos genes de interés (Méndez

& Pérez, 2004). El fundamento se basa en la identificación del polimorfismo

resultante de la localización específica de especie, de la secuencia de inserción

IS711, en el cromosoma de Brucella spp., para lo cual, incluye cinco primers,

donde uno hibridiza en una diana única y los cuatro restantes son específicos

de cada especie, obteniendo fragmentos de diferente tamaño según la especie

bacteriana: B. abortus biovar 1, 2 y 4: 498-bp, B. melitensis biovar 1, 2 y 3: 731-

bp, B. ovis: 976-bp y B. suis biovar 1: 285-bp (Bricker & Halling, 1995).

Cuadro 10. Secuencia de primers para AMOS PCR convencional.

Primer Secuencia (5’ – 3’)

B. abortus-specific primer GAC GAA CGG AAT TTT TCC AAT CCC

B. melitensis-specific primer AAA TCG CGT CCT TGC TGG TCT GA

B. ovis-specific primer CGG GTT CTG GCA CCA TCG TCG

B. suis-specific primer GCG CGG TTT TCT GAA GGT TCA GG

22

IS711-specific primer TGC CGA TCA CTT AAG GGC CTT CAT

Fuente: (Bricker & Halling, 1994)

AMOS PCR modificado

Si bien la AMOS PCR convencional permite identificar y diferenciar especie de

Brucella spp., este método tiene el inconveniente de no distinguir entre cepas

vacunales (S19 y RB51) y cepas de campo de B. abortus, motivo por el cual se

modificó la metodología inicial, incluyendo tres nuevos primers para alcanzar

esta diferenciación (OIE, 2008; Ewalt & Bricker, 2000). Se observó un

polimorfismo que parecía ser único para RB51 y su cepa parental, la cepa

2308. Este polimorfismo, que se ubica en un locus dentro de la IS711. Estos

nuevos primers fueron diseñados para diferenciar B. abortus cepa 2308 y RB51

de otras cepas de B. abortus mediante amplificación de un producto de 364 bp

(Bricker & Halling, 1995). Y por último, para la diferenciación de la cepa vacunal

S19 de B. abortus biovar 1 (cepa de campo) se incluyó dos cebadores más, los

cuales reconocen el gen ery; mismo que se encuentra ausente en la cepa

mencionada a diferencia del resto, y cuyo producto tiene 178 bp (Bricker &

Halling,1995; Sangari et al., 1994).

Cuadro 11. Secuencia de primers para AMOS PCR modificada.

Primer Sequence (5’- 3’)

RB51/2308 primer CCC CGG AAG ATA TGC TTC GAT CC

eri primer 1 GCG CCG CGA AGA ACT TAT CAA

eri primer 2 CGC CAT GTT AGC GGC GGT GA


23

Electroforesis

La electroforesis consiste en la separación de moléculas (proteínas,

isoenzimas, ácidos nucleicos) a través de una matriz tamponada (agarosa,

acrilamida, almidón). La matriz funciona como un filtro, separando las

moléculas en un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que

poseen. En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable

por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los

fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis

(Posso & Ghneim, 2008).

24

CAPÍTULO III

METODOLOGÍA

Ubicación

El trabajo fue realizado en los laboratorios del:

Centro Internacional de Zoonosis (CIZ); ubicado en las calles Jerónimo Leitón y

Gato Sobral, Ciudadela Universitaria, 3er Piso. Quito-Provincia de Pichincha.

Población de estudio

La población objeto de estudio, estuvo constituido por los aislamientos

obtenidos de un estudio previo que involucró la seroprevalencia, el aislamiento

e identificación microbiológica de bovinos faenados en dos camales de la

Provincia de Pichincha y que forman parte del banco de cepas del Laboratorio

de Microbiología del Centro Internacional de Zoonosis.

Unidades de Muestreo

El muestreo realizado fue de tipo observacional no probabilístico.

Las unidades de muestreo o suspensiones bacterianas, para este estudio

fueron en un total de 9, mismas que se aislaron en el Laboratorio de

Microbiología del CIZ, y de manera paralela, en el mismo Laboratorio, se

identificaron por pruebas bioquímicas.

Una vez obtenidas las bacterias, se toma 2-3 colonias diferenciadas en un

microtubo de 1.5 mL que contiene 500 µL de agua destilada; y se traslada al

Laboratorio de Biología Molecular (considerando las normas de bioseguridad)

para su posterior procesamiento.

25

Métodos específicos del experimento

Extracción de ADN bacteriano

Método de extracción de ADN por Chelex® en suspensión bacteriana

Protocolo de Chelex®-100 tomado y modificado de Al-Ajlan et al. (2011) y

Nishiguchi et al. (2002).

Pre-tratamiento

Considerando que el nivel de Bioseguridad (NB) para el manejo de Brucella

spp., es NB3, es necesario realizar un pre-tratamiento para inactivar a la

bacteria.

1. Inactivar la suspensión bacteriana a 65 oC por 45 minutos.

2. Centrifugar la suspensión bacteriana (SB) inactivada a 2000 g por 10

minutos.

3. Eliminar el sobrenadante y re-suspender las bacterias en 200 µL de

Buffer TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA).

Procedimiento

4. Añadir 100 µL de Chelex®-100 al 10%.

5. Añadir 3 µL de Proteinasa K (20 mg/mL).

6. Incubar durante 2 horas a 56oC en el Termomixer a 1300 RPM.

7. Incubar durante 10 minutos a 100oC en el Termomixer a 1300 RPM.

8. Esperar 20 minutos y dejar enfriar los viales.

9. Incubar durante 20 minutos a 70oC en el Termomixer a 1300 RPM.

10. Centrifugar la solución a 13000 g durante 5 minutos.

11. Transferir el sobrenadante a un nuevo microtubo de 1.5 mL y almacenar

a -20 oC hasta su utilización.

26

IS711 PCR

Para la IS711 PCR primero se realizó una master mix con: agua grado PCR

(miliQ), buffer, dNTP Mix, MgCl2, primers (Cuadro 9) y la Taq Polimerasa como

se muestra en el siguiente cuadro.

Cuadro 12. Elaboración de Master Mix.

Master Mix


Inicial Concentración

Final Una reacción/

volumen

Agua - - 14.50 µL

Buffer 10X 1X 2.0 µL

dNTP Mix 10 mM 0.2 mM 0.4 µL

MgCl2 50 mM 1.5 mM 0.6 µL

Primer 1 100 µM 1 µM 0.2 µL

Primer 2 100 µM 1 µM 0.2 µL

Taq 5 U/µL 2.5 U/100 µL 0.1 µL

Total

18.0 µL

Fuente: CIZ

Una vez obtenido la master mix dispensamos en tubos de reacción de 200 µL y

posteriormente añadimos 2 µL de la muestra, del control positivo y negativo.

Cuadro 13. Ejemplo del volumen final de la solución para la PCR.

Tubos de Reacción: Volumen final 20 µL

Componente Tubo # 1 Tubo # 2

Master Mix 18.0 µL 18.0 µL

ADN 2 µL -

Agua - 2 µL

Fuente: CIZ

Por último colocamos los tubos con las soluciones en el termociclador con la

programación para IS711 PCR, como se aprecia en el siguiente cuadro.

27

Cuadro 14. Programación del Termociclador, para IS711 PCR.

Termociclador: IS711 PCR

Programa (35 ciclos)

Temperatura Tiempo

94 oC 00:05:00

94 oC 00:01:00

62 oC 00:01:00

72 oC 00:00:45

72 oC 00:10:00

Fuente: CIZ

AMOS PCR Convencional

Para la realización de la AMOS PCR Convencional se prepara el master mix

con los componentes del PCR, tomando en consideración que al ser una PCR

Multiplex se manejan cinco primers (Cuadro 10), como se muestra en el

siguiente cuadro.


Master Mix




volumen

Agua - - 14.55 µL




Primer Esp. 100 µM 0.2 µM 0.04 µL x 4

IS711 100 µM 1 µM 0.2 µL

Taq 5 U/µL 1 U/45 µL 0.09 µL

Total

18.0 µL


Luego de haber obtenido la master mix añadimos 2 µL de ADN, ya sea de la

muestra como, de los controles positivos y negativos.

28

Cuadro 16. Ejemplo de volumen final de la solución para la PCR.




ADN 2 µL -

Agua - 2 µL


Y por último colocamos los tubos con las soluciones en el termociclador con la

programación para AMOS PCR.

Cuadro 17. Programación del Termociclador, para AMOS PCR Convencional.



Temperatura Tiempo

95 oC 00:05:00

95 oC 00:01:15

55.5 oC 00:02:00

72 oC 00:02:00

72 oC 00:05:00


AMOS PCR modificada

Para la AMOS PCR modificada, al igual que en las anteriores técnicas,

preparamos una master mix con las químicas de PCR, tomando en cuenta la

utilización de primers (Cuadro 11) como se muestra en el siguiente cuadro.


Master Mix




volumen

Agua - - 14.75 µL




Primers (4) 100 µM 0.2 µM 0.04 µL x 4

Taq 5 U/µL 1 U/45 µL 0.09 µL

Total

18.0 µL


29

Así mismo, luego de haber obtenido la master mix añadimos 2 µL de ADN ya

sea de la muestra como de los controles positivos y negativo.

Cuadro 19. Ejemplo volumen final de la solución para la PCR.




ADN 2 µL -

Agua - 2 µL


Y por último colocamos los tubos con las soluciones en el termociclador con la

programación para AMOS PCR modificada.

Cuadro 20. Programación del Termociclador, para AMOS PCR Modificada.



Temperatura Tiempo

95 oC 00:05:00

95 oC 00:01:15

55.5 oC 00:02:00

72 oC 00:02:00

72 oC 00:05:00


Visualización de Resultados

Para la visualización de resultados, la técnica empleada fue electroforesis en

geles de agarosa.

Procedimiento

Preparar el gel de agarosa al 2% utilizando como disolvente Buffer TBE

(Tris-HCl, borato, EDTA) 0,5X.

En los pocillos del gel colocar el marcador de peso molecular, los

controles positivos, control negativo, y las muestras a analizar.

Para la corrida electroforética, programar la fuente de poder a 30

minutos y a 100 voltios.

30

Observar el gel mediante la utilización de luz ultravioleta y una cámara

digital (sistema de foto-documentación).

Análisis de datos

Una vez culminado el trabajo en el laboratorio de Biología Molecular y haber

obtenido los resultados, estos fueron reportados mediante fotografías y

cuadros, utilizando el software Excel 2010 de microsoft office, emparentándolos

con la procedencia de los animales sacrificados en los diferentes camales.

31

CAPÍTULO IV

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Existe una amplia variedad de métodos descritos para genotipificar especies

del género Brucella. Algunos nos ayudan a diferenciar Brucella spp., del gran

número de microorganismos que se pueden encontrar en órganos como

ganglios, bazo o hígado; y se los utiliza preferentemente como diagnóstico

molecular de la enfermedad (Bricker, 2002). Según los resultados obtenidos de

la IS711 PCR, tras la lectura de electroforesis, tenemos que la totalidad de las

muestras analizadas (nueve), dieron positivo (+), esto se corrobora

visualizando en el gel de agarosa un fragmento de 261 bp; indicando la

pertenencia de las muestras al género Brucella, como lo sugieren Ouahrani y

colaboradores (1993); y también Halling y colaboradores (1993); al decir que la

inserción IS711 es específica de dicho género bacteriano y ayuda en el

reconocimiento de las bacterias dentro del mencionado género, como lo

demostraron Bricker & Halling (1994).

Fuente: El autor

Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa 2% de productos de amplificación de

IS711 PCR. MP: marcador de peso molecular. Líneas 1-9: muestras

analizadas. Líneas 10, 11, 14: controles negativos. Líneas 12, 13, 15: controles

positivos.

MP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

MP 13 14 15

32

Una vez ubicado las cepas en el género Brucella se procedió a realizar el

AMOS PCR Convencional y su posterior visualización por electroforesis en

geles de agarosa, se obtuvo que las nueve muestras del estudio dieron como

producto un fragmento de 498 bp; con lo cual tendríamos que las muestras

pertenecen a Brucella abortus, biovar 1, 2 o 4; según lo planteado por Bricker &

Halling (1994) y validado por Ewalt & Bricker (2000). Esta técnica es un paso

para establecer la identidad de las variantes genéticas de la especie y así

identificar posibles brotes y diseminación de la enfermedad, ya que todas las

cepas patógenas de éste género son potencialmente diseminadoras (Bricker,

2004).

Dentro del complejo B. abortus bv. 1, se pueden encontrar cepas de campo y

cepas vacunales. Para la diferenciación entre cepas vacunales (RB51 y S19) y

cepas de campo se empleó la AMOS PCR Modificada, desarrollada por Bricker

& Halling (1995) y validado por Ewalt & Bricker (2000); dando como resultado,

en las nueve muestras sometidas a la prueba, un producto de 178 bp;

perteneciente al gen ery (ausente en B. abortus cepa S19) ya que la cepa S19

no posee habilidad para catabolizar el eritritol, resultado de una deleción de

700 bp en el operon eryCD (Whatmore & Gopaul, 2012; Sangari & Agüero,

1994). Adicionalmente, no se observó amplificación del fragmento de 364 bp

(presente en B. abortus cepa RB51) confirmando que todas las muestras

pertenecen a cepas de campo y no vacunales.

33

Fuente: El autor

Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa 20%. A) AMOS PCR convencional.

B) AMOS PCR modificada. MP: marcador de peso molecular. Líneas 1-9 y 12-

20: muestras analizadas. Líneas 10 y 21: control negativo. Líneas 11 y 22:

control positivo.

Así tenemos que, las 9 muestras aisladas y tras ser sometidas a las técnicas

moleculares de PCR planteadas en este estudio, como son la IS711, AMOS

PCR Convencional y AMOS PCR Modificada, arrojaron como resultados que

en su totalidad se trataba de bacterias del género Brucella especie abortus

cepas de campo, lo cual concuerda con los trabajos realizados por Rodríguez-

Hidalgo y colaboradores (2015), en la provincia de Santo Domingo de los

Tsáchilas, aplicando genotipificación por PCR y el trabajo de Carlosama

(2013), en aislamiento y tipifiación, en Tulcán; quienes reportan como resultado

de sus estudios, unicamente la precencia de B. abortus cepa de campo. Siendo

hasta el momento la única especie de Brucella reportada en el Ecuador.

MP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

MP 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

A)

B)

34

Cuadro 21. Resultados de la PCR

RESULTADOS PCR

Muestra N°

IS711 PCR

AMOS PCR Convencional

AMOS PCR Modificada

1 Brucella abortus cepa de campo









Fuente: El autor

Los resultados obtenidos en el presente estudio mediante la aplicación de

métodos de Biología Molecular (PCR) concuerdan y confirman los resultados

obtenidos por Ortega (2015), mediante aislamiento y biotipificación. Dicho

estudio en conjunto con el presente, forman parte del proyecto: “Aislamiento y

tipificación de Brucella spp., en reservorios animales sacrificados en seis

camales de la Sierra Norte Ecuatoriana”, por lo cual en las dos investigaciones

se trabajó exactamente a partir de los mimos animales muestreados, contando

para nuestro estudio, con los aislamientos bacterianos obtenidos por Ortega

(2015), razón por la cual los resultados obtenidos pretenden ser una

herramienta de ayuda, para la confirmación de resultados obtenidos en

microbiología.

Sin embargo la presente investigación a diferencia de los estudios realizados

en aislamiento y tipificación por Carlosama (2013) y Ortega (2015); no logró,

identificar los biovares de las muestras procesados, por lo cual convendría

aplicar la técnica molecular de VNTR (Número Variable de Repeticiones en

Tándem), como lo realizado por Rodríguez-Hidalgo y colaboradores (2015),

quienes luego de aplicar la IS711 PCR, AMOS PCR Convencional y AMOS

PCR Modificada, someten las muestras a la técnica de VNTR, para determinar

el biovar de las cepas con exactitud.

35

Cabe mencionar que de un total de 1211 animales sacrificados en los camales

de los cantones Mejía y Cayambe, las nueve muestras de aislamiento

bacteriano fueron obtenidas a partir de los animales muestreados en el camal

del Cantón Mejía. Esto no significa que Cayambe esté libre de Brucelosis,

pues en estudios serológicos realizados a nivel de predios ganaderos por

Sánchez (2012) y Neppas (2013) se ha demostrado la presencia de

anticuerpos para Brucella spp, lo que propone llevar a cabo un estudio a nivel

de predios empleando técnicas de PCR similares como lo planteado por

Hamdy & Amin (2002) y Rentería y colaboradores (2005), quienes utilizan la

secreción láctea para el diagnóstico de brucelosis, por PCR. Además Bricker y

colaboradores (2003), mencionan que las técnicas de PCR pueden alcazar un

100 % de sensibilidad y especificidad, por lo que, los errores se atribuyen al

mal procesamiento, por parte de las personas.

De las 9 muestras PCR positivas, 8 corresponden a animales procedentes del

cantón Mejía y una al cantón El Carmen, lo cual respalda la investigación de

Miño & Pico (2003), quienes mencionan la presencia de brucelosis en

explotaciones ganaderas del cantón Mejía, lo que representa un gran problema

al ser una de las mayores cuencas lecheras del país.

36

CAPÍTULO V

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

CONCLUSIONES:

Mediante la aplicación de la técnica molecular de IS711 PCR se logró

identificar nueve muestras del Género Brucella spp., a partir de

aislamientos bacterianos.

Las nueve muestras identificadas fueron B. abortus, lo que fue

comprobado utilizando la AMOS PCR convencional.

Con la utilización de la AMOS PCR Modificada para la diferenciación

entre cepas de campo y cepas vacunales de B. abortus, se demostró

que las nueve muestras del presente trabajo corresponden a B. abortus

cepas de campo.

37

RECOMENDACIONES:

Se sugiere ampliar el número de aislamientos para obtener información

a nivel nacional, mediante la colaboración interinstitucional.

En caso de replicar el modelo del presente estudio, se recomienda

complementar la genotipificación bacteriana con la aplicación de la

técnica de VNTR’s (Número Variable de Repeticiones en Tándem), para

poder identificar especies y biovariedades bacterianas que la

metodología AMOS no contempla.

Realizar la toma de muestras y el diagnóstico de brucelosis del personal

que trabaja en los camales, para evaluar el riesgo sanitario y establecer

medidas de control oportunas.

38

Bibliografía

AGROCALIDAD. (2009). Programa Nacional de Brucelosis Bovina. (H. Torres,

& P. Sandoval, Edits.) Recuperado el 18 de Marzo de 2015, de

http://www.agrocalidad.gob.ec/agrocalidad/images/pdfs/sanidadanimal/pr

ograma_nacional_brucelosis_bovina.pdf

Allardet, A., Bourg, G., Ramuz, M., Pages, M., Bellis, M., & Roizes, G. (1988).

DNA Polymorphism in Strains of the Genus Brucella. Journal of

Bacteriology, 4603-4607.

APHIS. (2012). Veterinary Services Centers for Epidemiology and Animal

Health National Surveillance Unit. National Bovine Brucellosis

Surveillance Plan, 1-22.

Aréstegui, M., Gualtieri, C., Domínguez, J., & Scharovsky, G. (2001). El Genero

Brucella y su Interacción con el Sistema Mononucler Fagocítico.

Veterinaria México, 131-139.

Aznar, MN, Samartino, LE, Humblet, M-F, Saegerman C. (2012). Bovine

brucellosis in Argentina and bordering countries: update. Transboundary

Emerging Diseases, (2):121-33.

Blasco, J., Rodríguez, A., Orduña, A., Ariza, X., Moriyón, I., Díaz, R., y otros.

(2001). Brucelosis Animal: La Enfermedad y Medidas para su control y

erradicación. En: Manual de Brucelosis, España: Junta de Castilla y

León, 33-43.

Bourg, G., Callaghan, D., & Boschiroli, M. (2007). The Genomic Structure of

Brucella Strains Isolated from Marine Mammals Gives Clues to

Evolutionary History Within the Genus. Veterinary Microbiology, Elsevier,

125 (3-4), 375-80.

Bricker, B. (2002). PCR as a diagnostic tool for brucelosis. Veterinary

Microbiology, 90:435-446.

39

Bricker, B. (2004). Molecular diagnostics of animal brucelosis: A review of PCR-

bassed assays and approaches, In López-Goñi I., Moriyon I., (eds).

Brucella: Molecular an Cellular Biology, Biosciences Horizon, 25-51.

Bricker, B., & Halling, S. (1994). Differentiation of Brucella abortus bv. 1, 2, and

4, Brucella melitensis, Brucella ovis, and Brucella suis bv. 1 by PCR.

Journal of Clinical Microbiology, 2660-2666.

Bricker, B., & Halling, S. (1995). Enhancement of the Brucella AMOS PCR

Assay for Differentiation of Brucella abortus Vaccine Strains S19 and

RB51. Journal of Clinical Microbiology, 1640-1642.

Bricker, B., Ewalt, D., & Halling, S. (2003). Brucella 'HOOF-Prints': strain typing

by multi-locus analysis of variable number tandem repeats (VNTRs).

BMC Microbiology, 1-13.

Bricker, B., Ewalt, D., Olsen, S., & Jensen, A. (2003). Evaluation of the Brucella

abortus species–specific polymerase chain reaction assay, an improved

version of the Brucella AMOS polymerase chain reaction assay for cattle.

Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 374-378.

Carlosama Yépez, M. H. (Julio de 2013). Aislamiento y biotipificación de

Brucella spp., de reservorios animales seropositivos, en el centro de

faenamiento de Tulcán.Trabajo de grado.Universidad Cental del

Ecuador. Facultad de MedIcina Veterinaria y Zootecnia. Quito, Ecuador.

Castro, H., Prat, M., & Gonzáles, S. (2005). Brucelosis: Una Revisión Practica.

Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana, 203-216.

Celi, M., & Vizcaíno, L. (2004). Determinación de la seropresencia de

anticuerpos contra Brucella spp., en trabajadores de explotaciones

ganaderas del cantón Mejía. Quito-Ecuador. (Tesis de grado de tercer

nivel), Universidad Central del Ecuador.

Clavareau, C., Wellemans, V., Walravens, K., Tryland, M., Verge, J., Grayon,

M., y otros. (1998). Phenotypic and molecular characterization of

Brucella strain isolated from a minke whale (Balaenoptera acutorostrata).

Microbiology, 144: 3267-3273.

40

Cloeckaert, A., Verger, J., Grayon, M., & Grépinet, N. (1996). Polymorphism at

the dnaK locus of Brucella species and identification of a Brucella

melitensis speciesspecific marker. Journal of Medical Microbiology, 200-

205.

Cloeckaert, A., Verger, J., Grayon, M., Paquet, J., Garin, B., Foster, G., y otros.

(2001). Classification of Brucella spp. isolated from marine mammals by

DNA polymorphism at the omp2 locus. Microbes and Infection, 729-738.

Corbel, M., & Brinley, W. (1982). Clasificación del género Brucella: Situación

presente. Revue scientifique et technique (International Office of

Epizootics), 301-310.

Crespo-León, F. (1994). Influencia de los elementos y factores geográficos en

la epidemiología de la Brucelosis del ganado ovino y caprino. Papeles de

Geografía, 189-209.

De, B., Stuaffer, L., Koylass, M., Sharp, S., Gee, J., Helsel, L., y otros. (2008).

Novel Brucella strain (BO1) associated with a prosthetic breast implant

infection. Journal of Clinical Microbiology, 43-49.

DelVecchio, V., Redkar, R., Patra, G., Mujer, C., Los, T., Ivanova, N., y otros.

(2002). The genome sequence of the facultative intracellular pathogen

Brucella melitensis. Proceedings of the National Academy of Sciences,

443-448.

Díaz, R., & Lamiña, O. (2013). Determinación de la Seroprevalencia y Análisis

de Factores de Riesgo de Brucelosis en Bovinos, en las Provincias de

Zamora Chinchipe, Loja y el Oro.Trabajo de grado.Universidad Central

de Ecuador. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Quito,

Ecuador.

Dirección General de Epidemiología. (Septiembre de 2012). Manual de

procedimientos estandarizados para la vigilancia epidemiológica de la

brucelosis, IEPSA, Delegación Iztapalapa, C.P. 09830, Distrito federal,

México.

41

Ewalt, D., & Bricker, B. (2000). Validation of the Abbreviated Brucella AMOS

PCR as a Rapid Screening Method for Differentiation of Brucella abortus

Field Strain Isolates and the Vaccine Strains, 19 and RB51. Journal of

Clinical Microbilogy, 1-2.

FAO/OMS. (1986). Comite Mixto FAO/OMS de Experots en Brucelosis, sexto

informe, Organización Mundial de la Salud, Ginebra-Suiza, 1-145.

Fekete, A., Bantle, J., Halling, S., & Stich, W. (1992). Amplification Fragment

Length Polymorphism in Brucella Strains by Use of Polymerase Chain

Reaction with Arbitrary Primers. Journal of bacteriology, 7778-7783.

Fernández , E., & Gómez , F. (2009). Brucelosis: Revisión Bibliográfica. Revista

Médica de Costa Rica y Centroamérica(LXVII), 1-6.

Ficht, T. (2010). Brucella taxonomy and evolution. Future Microbiology, 5(6)

859–866.

Foster, G., Osterman, B., Godfroid, J., Jacques, I., & Cloeckaert, A. (2007).

Brucella ceti sp. nov. and Brucella pinnipedialis sp. nov. for Brucella

strains with cetaceans and seals as their preferred hosts. International

Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2688-2693.

Gil, A., & Samartino, L. (2001). Soonosis en los sistemas de producción animal

de las áreas urbanas y periurbanas de América Latina. Livestock

Information and Police Branch, AGAL.

Grégoire, F., Hanrez, D., Michaux, C., Walravens, K., & Linden, A. (2012).

Serological and bacteriological survey of brucellosis in wild boar (Sus

scrofa) in Belgiun. BMC Veterinary Research, 8:80.

Halling, S., Tatum, F., & Bricker, B. (1993). Sequence and characterization of

an insertion sequence, IS711, from Brucella ovis. Elsevier Scrence

Publishers, 123-127.

Hamdy, M., & Amin, A. (2002). Detection of Brucella Species in the Milk of

Infected Cattle, Sheep, Goats and Camels by PCR. The Veterinary

Journal , 299-305.

42

Hubalek, Z., Scholz, H., Sedlacek, I., Mezler, F., Sanogo, Y., & Nesvadbova, J.

(2007). Brucellosis of the common vole. Vector Borne Zoonotic

Diseases, 679-687.

John, K., Fitzpatrick, J., French, N., Kazwala, R., Kambarage, D., Mfinanga, G.,

y otros. (2010). Quantifying Risk Factors for Human Brucellosis in Rural

Northern Tanzania. PLoS ONE, 1-6.

Jones, R., Deyoe, B., Meyer, M., Buening, G., & Falles, W. (1982). Isolation of

Two Brucella abortus Biotypes from Tissues of a Naturally Infected Cow.

Journal of Clinical Microbiology, 641-643.

Koneman, E., Janda, P., Allen, S., & Winn, W. (2005). Diagnóstico

Microbiológico: Bacilos Gam Negativos. Médica Panamericana, 424-430.

Laval, E. (2006). A contribution to historical understanding of brucellosis in

Chile. Revista Chilena de Infectología, 362-366.

Lopetegui, P. (Marzo de 2005). Avances de la Erradicación de Brucelosis

Bovina en Chile. Boletin Veterinario Oficial, 1-14.

López, C., Ariza, R., & Rodríguez, F. (2008). Brucelosis. Una Infección Vigente

. Acta Médica Grupo Ángeles, 158-165.

López-Goñi, I., & Moriyón, I. (2005). Brucella: Molecular and Cellular Biology.

Norfolk, UK: Taylor & Francise-Library.

Lucero, N., Escobar, G., Ayala, S., & Deborah, H. (2008). Manual de

Procedimientos: Técnicas para el Diagnóstico de Brucelosis Humana.

WHO Global Salm Surv, 1-72.

Mahillon, J., & Chandler, M. (1998). Insertion Sequences. MICROBIOLOGY

AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, 725-774.

Mantur, B., & Amarnath, S. (2008). Brucellosis in India – a review. J. biosci,

539-547.

Méndez, S., & Pérez, E. (2004). La PCR múltiple en microbiología clínica.

Enferm Infecc Microbiol Clin, 183-192.

43

Michaux, S., Bourg, G., Jumas, E., Guigue, P., Allardet, A., Callaghan, D., y

otros. (1997). Genome Structure and Phylogeny in the Genus Brucella.

Journal of Bacteriology, 3244-3249.

Michaux, S., Paillisson, J., Carles , M., Bourg, G., Allardet, A., & Ramuz, M.

(1993). Presence of Two Independent Chromosomes in the Brucella

melitensis 16M Genome. Journal of Bacteriology, 701-705.

Miño, E., & Pico, V. (2003). Estudio de la presencia de brucelosis bovina en

explotaciones ganaderas del Cantón Mejía. (Tesis doctoral), Universidad

Central del Ecuador.

Moreno, E. (1998). Genome evolution within the alpha Proteobacteria; why

dosome bacteria not possess plasmids and others exhibit more than one

diferent chromosome? FEMS Microbiology Reviews, 22: 255-275.

Moreno, E., Cloeckaert, A., & Moriyón, I. (2002). Brucella evolution and

Taxonomy. Veterinary microbiology, 209-227.

Moriyón, I., Rodrírguez, A., Orduña, A., Ariza, X., Díaz, R., Blasco, J., y otros.

(2001). Bacteriologia del Género Brucella. Manual de Brucelosis, 21-30.

Mullis, K. (1990). The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci Am.,

262: 56-61.

Neppas, M. (2013). Prevalencia de brucelosis bovina mediante la prueba de

Anillo en Leche (Ring Test) y Rosa de Bengala en la Asociación

Agropecuaria el Ordeño de la Chimba-Cayambe. (Tesis de grado de

tercer nivel), Universidad Politécnica Salesiana.

Ocampo-Sosa, A., & García-Lobo, J. (2008). Demonstration of IS711

transposition in Brucella ovis and Brucella pinnipedialis. BMC

Microbiology, 1-10.

OIE. (2008). Brucelosis Bovina. Manual de la OIE sobre animales terrestres,

682-719.

44

Orduña, A., Rodriguez, A., Ariza, X., Miriyón, I., Díaz, R., Blasco, J., y otros.

(2001). La Brucelosis: Etiología y Origen de la Infección Humana.

Manual de Brucelosis, 13-20.

Ouahrani, S., Michux, S., Widada, J., Bourg, G., Tournebize, R., Ramus, M., y

otros. (1993). Identification and Sequence Analysis of IS6501, an

Insertion Sequence in Brucella spp. : Relationship Between Genomic

Structure and the Number of IS6501 Copies. Journal of General

Microbiology, 3265-3273.

Pappas, G., Akritidis, N., Bosilkovski, M., & Tsianos, E. (2005). Brucellosis. The

New England Journal of Medicine, 2325-2336.

Paulsen, I., Seshadri, R., Nelson, K., Heidelberg, J., Read, T., Dodson, R., y

otros. (2002). The Brucella suis genome reveals fundamental similarities

between animal and plant pathogens and symbionts. PNAS, 13148-

13153.

Posso, D., & Ghneim, T. (2008). Manual De Laboratorio: Uso De Marcadores

Microsatélites Para La Estimación De Diversidad Genética En Plantas.

Caracas: Instituto Venezolano De Investigaciones Científicas.

Quinn, P., Markey, B., Leonard, F., Hartigan, P., Fanning, S., & FitzPatrick, E.

(2002). Veterinary Microbiology and Microbial Disease. Wiley-Blackwell.

Rentería, T., Organes, H., Licea, A., Medina, G., Klaus, N., Montaño, M., y

otros. (2005). Evaluación de la prueba Reacción en Cadena de la

Polimerasa (PCR) a partir de muestras de leche y cultivos puros en el

diagnóstico de la brucelosis bovina. Tec Pecu Méx, 117-226.

Rivers, R., Andrews, E., González-Smith, A., Donoso, G., & Oñate, A. (2006).

Brucella abortus: inmunidad, vacunas y estrategias de prevención

basadas en ácidos nucleicos. Arch. Med. Vet. 38, 1-11.

Rodicio, M., & Mendoza, M. (2004). Identificación bacteriana mediante

secuenciación del ARNr 16S: fundamento, metodología y aplicaciones

en microbiología clínica. Enfermedades Infecciosas Microbiología

Clínica, 81-87.

45

Rodríguez, R. I., Guerrero, K., Contreras, J., Salcan, H., Benítez, W., Minda, E.,

y otros. (2015). Circulating strains of Brucella abortus in cattle in the

province of Santo Domingo de los Tsáchilas - Ecuador. Frontiers in

PUBLIC HEALTH, 1-11.

Rodríguez, Y., Ramírez, W., Antúnez, G., Pérez, F., Ramírez, Y., & Igarza, A.

(2005). Brucelosis bovina, aspectos históricos y epidemiológicos.

Revista Electrónica de Veterinaria REDVET, 1-9.

Ron, J. (2003). Validación de técnicas diagnosticas para la detección de

brucelosis y estudio epidemiológico en una región andina del Ecuador.

(Tesis presentada para la obtención del grado de Master en Ciencias en

Salud Animal), Amberes-Bélgica: Instituto de medicina Tropical Prince

Léopold. Departamento de Sanidad Animal Tropical Thesis No 118.

Ron, J., Ron, L., Abatih, E., Celi, M., Vizcaíno, L., Calva, J., y otros. (2014).

Human Brucellosis in Northwest Ecuador: Typifying Brucella spp.,

Seroprevalence, and Associated Risk Factors. VECTOR-BORNE AND

ZOONOTIC DISEASES in press, 1-10.

Saegerman, C., Berkvens, D., Godfroid, J., & Walravens, K. (2010). Bovine

brucellosis . (P. Lefevre, J. Blancou, R. Chermette, & G. Uilenberg,

Edits.) Infectus an Parasitic Diseases of Livestock, Chapter 77, 1-57.

Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn , G., Erlich, H., y otros. (1985).

Enzymatic amplification of ß-globin genomic sequences and restriction

site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230, 1350.

Salehi, M., Pishva, E., Salehi, R., & Rahmani, M. (2006). Isolation of Brucella

abortus Using PCR-RFLP Analysis. Iranian J Publ Health, 22-27.

Sánchez, C. (2012). Prevalencia de brucelosis bovina mediante el método de

Card-Test (Rosa de Bengala) en la comunidad de Pisillo Cayambe-

Ecuador. (Tesis de grado de tercer nivel), Universidad Politécnica

Salesiana.

46

Sangari, F., & Agüero, J. (1994). Identification of Brucella abortus B19 Vaccine

strain by the detection of DNA polimorphism at the ery locus. Vaccine,

12(5): 435-438.

Sangari, F., Garcia-Lobo, J., & Agüero, J. (1994). The Brucella abortus vaccine

strain B19 carries a deletion in the erythritol catabolic genes. FEMS

Microbiology Letters, 337-342.

Sbriglio, J., Sbriglio, H., & Sainz, S. (2007). BRUCELOSIS: Una patología

generalmente subdiagnosticada en Humanos y que impacta

negativamente en la producción pecuaria y desarrollo de nuestros

paices. Bioanálisis, 1-5.

Schlabritz-Loutsevitch, N., Whatmore, A., Quance, C., Koylass, M., Cummins,

L., Dick, E., y otros. (2009). A novel Brucella isolate in association with

two cases of stillbirth in non-human primates – fi rst report. Journal of

Medical Primatology, 70-73.

Scholz , H., Kampfer, P., & Cloeckaert, A. (2012). Brucella: Relationship to

Other Alphaproteobacteria, Current Taxonomy and the Emergence of

New Species. (López-Goñi, & D. O'Callaghan, Edits.) Brucella: Molecular

Microbiologyand Genomics.

Scholz, H., & Vergnaud, G. (2013). Molecular characterisation of Brucella

species. Revue scientifique et technique (International Office of

Epizootics, 149-162.

Scholz, H., Hubalek, Z., Sedlácek, I., Vergnaud, G., Tomaso, H., Al Dahouk, S.,

y otros. (2008). Brucella microti sp. nov., isolated from the common vole

Microtus arvalis. International Journal of Systematic and Evolutionary


Scholz, H., Nöckler, K., Göllner, C., Bahn, P., Vergnaud, G., Tomaso, H., y

otros. (2010). Brucella inopinata sp. nov., isolated from a breast implant

infection. International Journal of Systematic and Evolutionary


47

Sobral, B., & Wattam, A. (2012). Comparative Genomics and Phylogenomics of

Brucella. (I. López-Goñi, & D. O`Callaghan, Edits.) Brucella: Molecular

Microbiology and Genomics.

Somma, M., & Querci, M. (2012). Análisis de la Presencia de Organismos

Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos: Reacción en

Cadena de la Polimerasa (PCR). JRC European Commission, 1-34.

Stanier, R., Ingraham, J., Wheelis, M., & Painter, P. (1996). Microbiología

(Segunda edición ed.). Editorial REVÉRTE.

Surzycki, S. (2002). Basic Techniques in Molecular Biology. Springer Lab

Manual.

Tamay de Dios, L., Ibarra, C., & Velasquillo, C. (2013). Fundamentos de la

reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real.

Medigraphic, 70-78.

Tcherneva, E., Rijpens, N., Jersek, B., & Herman, L. (2000). Differentiation of

Brucella species by Random Amplified Polymorphic DNA analysis.

Journal of Applied Microbiology , 69–80.

The Center for Food Security & Public Health. (2009). Brucelosis. Collage of

Veterinary Medicine, 1-15.

Velasco, J., Romero, C., López-Goñi, I., Leiva, J., Díaz, R., & Moriyón, I.

(1998). Evaluation of the relatedness of Brucella spp. and Ochrobactrum

anthropi and description of Ochrobactrum intermedium sp. nov., a new

species with a closer relationship to Brucella spp. International Journal of

Systematic Bacteriology, 759-768.

Whatmore, A., & Gopaul, K. (2012). Recent advances in molecular approaches

to Brucella diagnostics and epidemiology. In López-Goñi I., Callaghan D.

(edes). Brucella: Molecular Microbiology and Genomics. Caister

Academic Press, 57-88.

Whatmore, A., Davison, N., Cloeckaert, A., Al Dahouk, S., Zygmunt, M., Brew,

S., y otros. (2014). Brucella papionis sp. nov., isolated from baboons

48

(papio spp.). International Journal of Systematic and Evolutionary


Whatmore, A., Shankster, S., Perrett, L., Murphy, T., Brew, S., Thirlwall, R., y

otros. (2006). Identification and Characterization of Variable-Number

Tandem-Repeat Markers for Typing of Brucella spp. Journal of Clinical


WHO, FAO, OIE. (2006). brucellosis in humans and animals. World Health

Organization, 1-89.

49

ANEXOS

50

EXTRACCIÓN DE ADN BACTERIANO: Incubación en termomixer

Foto: CIZ, 2015

ELABORACIÓN DE MASTER MIX:

Cámara de flujo

Foto: CIZ, 2015

MONTAJE DE PCR: Termociclador

Foto: CIZ, 2015

51

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

Foto: CIZ, 2015

REACTIVOS PARA MASTER

MIX: Gradilla térmica

Foto: CIZ, 2015

SISTEMA DE FOTO-DOCUMENTACIÓN

Foto: CIZ, 2015

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA ... · Pérez, 2004). Diferentes...

Documents

Transcript of UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA ... · Pérez, 2004). Diferentes...