UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD SECRETARIA ACAOEMICA

A QUIEN CORRESPONDA:

Por medio de la presente se hace constar que la:

del Departamento de BIOTECNOLOGíA de la División de Ciencias Biológicas y de 13 Salud, asesoró el siguiente Servicio Social:

TITULO "EXTRACIÓN DE COMPUESTOS TÓXICOS PRESENTES

ALUMNO LUCERO ROSAS MARTHA GABRIELA MATRiCULA 93229840 LICENCIATURA INGENlERíA DE LOS ALIMENTOS PERIODO

Dra. KEIKO SHIRAI MATSUMOTO

DURANTE LA FERMENTACIÓN LÁCTICA DE CAMARÓN"

JUNIO 8, 1998 a JUNIO 24, 1999

Se extiende la presente para los fines que a la interesada convengan, en la Ciudad de México, Distrito Federal a veinte de septiembre de mil novecientos noventa y nueve.

A T E N T A M E N T E , "CASA ABIERTA AL TIEM~O"

SECRETARIO ACADÉMICO /

UNIDAD IZTAPALAPA Av Michoaen y la PurIsma Col Vcentina O F 09340 Te1 (5) 723 63 51 Fax (51512 80 83 e-rnail CdCbSYXanUm "am mx

Nombre

Matricula

Licenciatura

División

Unidad

Proyecto

Titulo del servicio social

Lugar de realización

Fecha de inicio

Fecha de terminación

Clave de registro

Asesores

Profesor titular C

~.

Juárez Grirnaldo Leticia

932301 16

Ingeniería en Alimentos

Ciencias Biologicas y de la Salud (CBS)

lztapalapa

Teléfono (5) 7 35 36 40

.~ ~

PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PROTEASAS

SP. DE CABEZA DE CAMARÓN DEL GÉNERO PENAEUS

Determinación de compuestos tóxicos (aminas biogénicas) presentes durante la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón del género Penaeus sp

Planta piloto de tecnología de carnes y pescado y laboratorio del edificio S-I30

08 de Junio de 1998

23 de Junio de 1999

IA.017.98

Dra. Keiko Shirai Matsurnoto Dra. Edith Ponce Alquicira

Dh. Ed& Ponce Alquicira Profesor titular C

Juárez Gnmaido Leticia

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

México D.F. a 24 de Junio de 1999

Dr. José Luis Arredondo Figueroa. t -ector de la División de CBS.

P l S E N T E

Por medio de la presente hacemos constar que la pasante de la carrera en Ingeniería en los Alimentos, Martha Gabneia Lucero Rosas con matrícula 93229840, finalizó satisfactonamente el servicio social como lo muestra en su informe final titulado "EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS TÓXICOS QUE SE DERARROLiAN DURANTE LA FERMENTACIÓN LÁCTICA DE CAMARÓN"

El cual se realizó en las instalaciones de la planta piloto de carnes y laboratono S-130 de está Universidad.

Agradecemos de antemano la atención que sirva prestar a la presente, quedamos de usted

ATENTAMENTE

Dra. Keiko Shirai Matsumoto Profesor Titular C.

Dra. Edith P o n e Alquicira Profesor Titular C.

UNIDAD IZTAPALAPA Av. Michoacán y la Purísima, Col. Vicentina, 09340 México, D.F., Tel.: 724-4600, Telefax: (5) 612-0885

Caribiwtriimp

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

Asunto: CARTA DE JUSTIFICACIÓN

Dr. José Luis Arredondo Figueroa. Director de la División de CBS.

PRESENTE

México D.F. a 24 de Junio de 1999

Por medio de la presente, me permito informarle a usted que la fecha de terminación de mi Servicio Social fue posterior a la fecha señalada, debido a la acreditación de las ueas en las que estaba inscrita, por lo que suspendí el desarrollo del mismo.

Sin más por el momento agradezco de antemano la atención prestada a la presente, quedo de usted.

ATENTAMENTE

Matricula: 93229840 Ingeniería en los Alimetos

UNIDAD IZTAPALAPA Av Michoacán y la Purísima. Col. Vicentina. 09340 México. D.F., Tel.: 724-4600, lelefax: (5) 612-0885

L

4

Nonibrc: LUCERO ROSAS MARTHA CABRIELA

Mntriciila: 93229810

Tciéfono: 57337716

Liccnciahira: INGENIERiA DE LOS- ALIMENTOS

División:

Unidad Universitaria:

CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

UNIVERSIDziD AUTÓNOMA METROPOLITANA - IZTAPALAPA

Triiiicstrc Lcctivo: 99 - P

Proyecto: PURIFICACI~N Y CARACTERIZACI~N DE PROTEASAS EN CABEZAS DE CAMARÓN (Penoecrs spp).

Titulo del servicio: EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS TÓXICOS PRESENTES DURANTE LA FERMENTACIÓN LÁCTICA DE CAMAR~N.

PLANTA PILOTO DE CARNES Y LABORATORIO S - 130

Clave de Icegistro: IA.016.98

Profesor Titular C.

I Profesor Titular .C.

LA

--- h. !&rH P&CE ALQUICIRA Profesor Titular C.

Anexo A ________I___ __

1

4

5

6

7 8

10

11

12 13 13 15

18

19

20

25

29

INTRODUCCIQN

En las úitimas dos décadas la explotación de mariscos ha experimentado una significativa expansión, la que produce una gran cantidad de desechos, a consecuencia del impresionante crecimiento de alimentos congelados y enlatados, lo que conduce a la utilización de estos desperdicios para evitar contaminación.

Los desperdicios -de -crustáceos .contiene principalmente conchas, vísceras, cabezas y came adherida, los cuales son utilizados principalmente para la elaboración de harina, el 34 a 43% de la producción corresponde a las cabezas, las cuales, generalmente se tiran, ocasionando serios problemas ecológicos (Shirai y col 1996~).

Ei problema de la utilización de desechos de mariscos es que son muy perecederos bajo condiciones ambientales. Los desechos pueden ser congelados antes de ser procesados pero debido 2 su volumen y al limitado espacio i-n los congeladores hace poco costeable la conservación para su posterior utilización. En México una mínima parte de las cabezas de camarón son convertidas a harina, la mayor parte son desechadas en altamar o en zonas aledatias a las áreas de cultivo con el consiguiente deterioro ambiental (Shirai y col, 19968).

Durante la descomposición de los desperdicios de camarón, se observa un incremento de sustancias básicas volátiles así como en el pH, acompafiado frecuentemente de decoloración debido a la oxidación de los pigmentos y a reacciows enzimáticas (Melanosis), de igual forma se produce una rápida

aautóiisis~de proteínas por enzimas endógenas (Shirai y col 1996A).

La fermentación ácido Iáctica es uno de los métodos de preservación más antiguos, consiste en un proceso microbiano rriuy complejo en el cual una población de bacterias Iácticas llega a ser la microflora predominante', para su crecimiento requieren de azúcares como lactosa, además de aminoácidos. vitaminas y otros factores.

Además de que su rápido crecimiento permite que sean en poco tiempo la población dominante, tiene propiedadec gntagónicas que les permiten competir exitosamente con otros micro&ganismos (Shirai 199%) de descomposición por la reducción de pH. producción de ácidos orgánicos (como ácido láctico). peróxido d e ~ htdr6geno o . bacteriocinas, o ~ bien, 1 inhibiendo rniwoorganismos de descomposición. por competencia por el sustrato (Daeschel 1989).

En general el ácido láctico producido por las bacterias Iácticas en la fennentaaón de tos alimentos reduce e i g H a niveles suficientemente bajos para inhibir o destruir a los microorganisrnos patógenos de descomposición y toxicogénicos.

1

Empleando el ensilado fermentado, donde el ácido es producido in situ por fermentauón Iáctica, como método de conservación es posible evitar las alteraciones, causadas por la actividad de microorganismos capaces de producir enzimas descarboxilantes, promoviendo la formación de diaminas tales como: cadavenna. putrescina, ornitina, histamina. tiramina, triptamina. etc., como un resultado de la descarboxilación de aminoácidos libres presentes en los desechos o bien, liberados a consecuencia de la actividad proteolítica endógena y microbiana(Guillen, 1997).

El término aminas biogénicas se refiere a las aminas volátiles y no volátiles como: putrescina, cadaverina, histamina, tiramina. Trimetilamina y triptamina. Estas aminas biogénicas son bases orgánicas de bajo peso molecular alifáticas. alicíclicas o heterocíclicas y poseen actividad biológica, son formadas y degradadas como resultado de la^ actividad metabolica normal en animales, plantas y microorganismos(Guillen, 1997).

Los pre-requisitos para la formación de aminas biogénicas en alimentos con: La disponibilidad de aminoácidos libres, la presencia de microorganismos, productores de descarboxilasas. las condiciones que permitan el crecimiento bacteriano y la actividad de la dexcarboxilasa (Chen y col., 1989).

Los desechos de camarón son muy utilizados en la producción de alimentos balanceados para animales, al elaborarse las harinas con un alto contenido de histamina se corre el riesgo de causar intoxicación en los animales que la consuman, porque las aminas volátiles tienen un efecto tóxico además de producir olores arnoniacales y putrefactos (Guitlen, 1997). La concentración máxima de histamina permitida por la FDA en los alimentos para-humanos es de 200 mg/kg.

La putrefacción se debe a la descomposición de algunos componentes no proteicoc que-parücipan en el aroma, la formación de compuestos aromáticos volátiles y a la degradación parcial de la carne; además de cambios en las proteínas originan coloraciones y propiedades reológicas indeseables (Zdzislaw, 1990).

Muchos compuestos odoríferos se forman por la degradación de aminoácidos libres y por los :aminoácidos~liberados por la proteólisis, los productos resultantes como las aminas, aldehidos, sulfuros y Licidos grasos de cadena corta, exhiben perceptibles olores pútridos .indeseables.

En cuanto a su toxicidad en pollos y-aves los efectos de mayor importancia de la histamina son: dilatación de los capilares sanguíneos, aumento de la secreción gástnca. erosión de molleja conocido como vómito negro, la cual puede provocar estimulación del sistema nervioso autónomo dando como resultado una disminución en la producción .de canales. para consumo humano y perdidas económicas (Guillen, 1997).

2 I

' 4 Las aminas son indicadores químicos de la aceptabiiidad o contaminación microbiana en los productos, algunos productos de descarboxilación como la putrescina y cadavenna son formadas principalmente por la acción de las bacterias, en la Tabla No 1 se muestran los aminoácidos precursores para la formación de aminas biogénicas (Zdzislaw, 1990).

Histidina üsina Glutarnina

1 1 1 histarnina cadavenna Ornitina < d g i n i n a

I 1 . putresn'na * v a n a t i n a

esperrnidina . esErmina I \

I Tabla 1 . Aminoácidos precunores para la formación de aminas biogénicas tomadas dc (Zdzislaw, 1990).

3

111 I .

OBJETIVO GENERAL

%Establecer las condiciones adecuadas para la extracción de cornpuesros tóxicos, tales corno aminas biogénicas, que se desarrollan durante 13

fermentación Iáctica de camarón.

OBJETIVOS ESPECíFICOS

&Realizar una fermentación láctica de desechos de m m n

cfSDeterminarpH y la concentración de sustancias Ninhidrha (+), as¡ coma la conceetmion de proteína soluble a muestras tornadas a diferentes tiempos de la fermentación Iáctica

&Establecer las condiciones adecuadas para manejo del HPLC en la separación de aminas biogénicas como son:

J Volumen de inyección de las estándares J Tiempo de Retención

&Extraer aminas biogénicas a muestras tomadas a diferentes tiempos ae la fermentación.

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METO DO LOOh EXPERIMENTAL

1.- MATERlAL

El desecho consistió en cabezas de camarón del genero Penaeus sp, que fueron adquiridas en la central de abastos. Dicho desperdicio fue molido en molino para carne (Sanitary, E.U.A.) y almacenado en congelación (-20%) para su uso posterior.

2.- FERMENTACI~N

Lactobacillus sp. (€32) , fue utilizado como iniciador. Este cultivo iniciador fue inoculado en medio APT hasta una concentración de 3 g/L en peso seco (D.O.= 2.0 a 540 nm) y se inocularon 5% (VIP) a las cabezas de camarón previamente descongeladas y adicionadas con 10% de glucosa e incubadas a 3OoC, muestreando a intervalos regulares de 6 horas hasta dos días.

Las unidades experimentales fueron almacenadas en refrigeración hasta su análisis.

3.- TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS

A cada muestra de la fermentación se le realizo las siguientes determinaaones.

3.1 ACIDEZ

pH: Se determino directamente a la muestra fermentada con un potenciómetro Conductronic 20, previamente estandarizado con solución amortiguadora de fosfatos a pH 4 y 7

CCIÓN DE AMINAS BLOGÉNICAS

diferentes proporciones (sólido - solución) y tiempos con las siguientes condiciones. A 59 de la muestra se le adicionó 20ml .de .ácido tricloroacético (6%) y se hornogeneizo por 3 min. El homogeneizado fue centrifugado (12,000 rpm, lOrnin, 4OC) y fiitrado a través de un papel Whatman del No. 2. Esté filtrado se coloco en un matraz volumetrico y se aforo a 50ml.

5

3.3 DETERMINACI~N DE SUSTANCIAS NINHIDRINA (+)

Fundamento Se basa en la reacción del grupo aamino con dos moléculas de ninhidnna. Se efectua una descarboxilación oxidativa. El amoniaco y la ninhidrina formados reaccionan con una segunda molécula formando un compuesto colorido

La determinación y análisis de sustancias Ninhidnna (+) se hizo por duplicado a las muestras experimentales; se realizó de acuerdo al método de Jaswal (1989), con reactivo de Ninhidrina, cuyos pasos se presentan a continuación:

En est rclétodo se realizó una solución 0.002M de 8 aminoácidos para ser utilizados como aminoácidos estándares (ver anexo A, Figura Al) .

Reactivos empleados

Solución I A) 0.8 g de SnCI2 y añadir a 500 mL de buffer de citratos 0.2 M. pH 5 6) Buffer de citratos pH 5 0.2 M

21 .O1 g de ácido cítrico en 500 mL de agua destilada 29.41 g de citrato de sodio en 500 mL de agua destilada

Se mezclan: 20.5 mL de A+ 29.5 mL de B y se afora a 100 mL. -

Solución 2 Disolver 500 mL de metilcelosolve (etilenglicol monometil eter y log de Ninhidnna, (debe hacerse en la obscuridad).

Nota: Se mezcla la solución 1 y 2 al momento de utilizarse

Procedimiento -* Mezcla estándar de aminoácidos (8 aminoácidos) 0.002M

+ Dilución de la mezcla 150

+ Se diluye con agua destilada para preparar una serie de muestras con diferentes concentraciones de O hasta 23.07 pg/mL

t Añadir 2 mL de la solución 1 (Ninhidrina citatos/SnCI2) 50% (v/v)

+ Agitar con vortex y calentar a baño maría por 20 minutos

6

o Adicionar rápidamente 5 mL de n-propanol al 50%

Mezclar con vortex y dejar reposar 15 minutos

Se determina absorbancia a 570 nrn contra blanco en un especirofotómetro.

3.4 DETERMINACIÓN DE PROTEíNA Método Lowry-Peterson (1 977)

La determinación de proteína se siguió de acuerdo al método de Lowry modificado por Peterson (1977), el cual utiliza seroalbúmina bovina (Sigma, San. Luis Misouri) como proteína estándar en un intervalo de concentración de O a 200 mglmL (ver anexo A, Figura A2).

Reactivos empleados

a) Solución de carbonato de sodio tartato de potasio. Se disuleven lentamente en 250 mL de agua destilada 259 de carbonato de sodio, 0.259 de sulfato de cobre pentahidratado, 0.59 de tartato de sodio y potasio.

b) Solución de dodecil sulfato de sodio (SDS) . Se disuelve 259 de SDS en 250 mL de agua destilada

c ) Solución de hidróxido de sodio Se disuelve 89 de NaoH en 250 mL de agua destilada

Reactivo A

Se mezclan volúmenes de las soluciones a, b y c, aforándose con agua destilada a 1L. Nota: Se recomienda conservar el reactivo A en refrigeración, al momento de utilizarse calentado a 25-30°C, hasta que el SDS este en solución nuevamente.

Reactivo B

Se prepara diluyendo 1:l del reactivo fenol-ciocaltieu con agua destilada, se conserva en la obscuridad.

7

Procedimiento

* 1.25 m g de ceroalbúmina bovina (Sigma San Luis E.U.) se disuelven er .~::#; mL de agua destilada para preparar una solución 100 pgimL

* Se diluye con agua destilada para preparar una serie de muestras con aifer,e.i:e concentración de O hasta 1 O0 p g h L

* 1 mL de reactivo A se adiciona a 1 mL de las muestras preparadas deaci:t-irc:i al paso anterior. Se mezclan y se incuban a 30°C 10 minutos.

* 0.5 mL de reactivo B se adiciona y se agita incubándose a 30 "C 30 minutos

* Se determina absorbancia a 750 nm en un espectrofotómetro.

,. ~

3.5

3.5.

DETERMINACIÓN DE AMINAS BIOGÉNICAS

Preparación de estándares

La triptamina hidroclorada( 12.3 mg), putrescina dihidroclorada (1 8.3 ::-,c: cadavenna dihidroclorada (1 7.2mg), tiramina hidroclorada (1 2.7 IT;:;

histamina (16.57 mg) y tnmetilamina (16.17 mg) se disuelven en 10 ni:- (it: agua destilada y utilizadas como muestra estándar. La concentraciCn iirji de cada arnina en base fibre es de 10 mgíinL en solución (ver XIL-XO .l. .;!,I A3) .

3.5.2 Derivatizacih

* 50 pL de cada estándar

* Adicionar 1 mL de NaOH 2M

* Adicionar 10 pL de cloruro de bemoilo

* Mezclar en vortex y dejar reposar por 20 minutos

* Parar la derivatización adicionando 2 mL de solución saturada de NaCY 5M

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1 . < . / ,,,.I ,. , - .= , ;' ,.,,... I 4 "*""

? I 1 * Extraer la amina con 3 mL de dietilether

f .".'

i Y-', j ' . ,,,, '

! #I_ !: I

* transferir la fase orgánica (superior) a un tubo

* Evaporar a sequedad

* Disolver el residuo en 500 pL de metano1

I

f I , , , , ,

* Analizar aticuotas de 10,25,100.200,300 y 500 pL

3.5.3 Análisis por HPLC

La derivatización de las aminas se realizó con cloruro de benzoilo y la separación se hizo mediante un equipo HPLC marca Waters (Milford,MA) equipado con una bomba L-6200 acoplado a un detector de arreglo de diodos 994. Se utilizó una columna de fase reversa C-18 (5prn 125 x 2.5 mm) y un inyector modelo 7125. La determinación se realizó a 254 nm en el software Mileniurn 11, usando un gradiente metanol-agua a un flujo de 0.5 miímin con el siguiente método:

TIEMPOfMIN) I FLUJO %METmOL %AGUA CURVA - 1 0.50 1 O0 8 10 20 21 25 27

0.5Ci 1 O0 I I 0.50 56 44 6 0.50 56 44 I t 0.50 1 O0 - 6 0.50 1 O0 11 0.50 - 1 O0 6

28 I 0.50 - 1 O0 11

Las muestras obtenidas durante la fermentación iactica de desperdicios de camarón siguieron el mismo tratamiento antes descrito.

9

I .

I

ACTIVIDADES REALIZADAS

* Revisión bibliográfica

* Se establecieron y aprendió el fundamento técnicas a utilizar durante el desarrollo del servicio.

* Se realizó una fermentación Iáctica de residuos de camarón adicionada con 10% de glucosa y evaluó el fecto de la utilizacion de Lactobacillus sp (B2) como una alternativa para la conservación de ensilados que pueden ser utilizados para alimentación animal.

* Se determinó el pH, la concentración de sustancias Ninhidnna (+) y la concentración de proteína soluble, los cuales tienen influencia sobre la producción de aminas biogénicas

* Se determinó el volumen de inyección adecuadqara la caracterización de aminas biogénicas presentes durante la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón; además de identificar el Tiempo de Retención característico de cada amina estándar.

* Se establecieron las curvas estándar de cada amina biogénica que seran utilizadas en la determinación de compuestos toxicos presentes durante la fermentación Iáctica de camarón para obtener directamente por interpolacián de la recta la concentración real en muestras fermentadas.

* Realización del reporte final.

10

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS

De acuerdo a los objetivos inicialmente planteados se alcanzarón las metas en cuanto a la realización de la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón, asi como el establecimiento de las condiciones adecuadas para la extracción de las aminas biogénicas y la separación de las mismas.

Para obtener un análisis más completo en cuanto a la extracción de compuestos toxicos que se desarrollan durante la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón, se determinó la concentración de sustancias Ninhidrina (+) y proteína soluble.

Se fomentó el manejo y búsqueda de la información bibliográfica para un adecuado análisis e integración de los resultados.

Otra meta realizada es que este trabajo fue de utilidad para otras investigaciones, como el de 'DETERMINAC16N DE COMPUESTOS T6XiCOS PRESENTES DURANTE iA FERMENTACI6N LÁCTICA DE DESPERDICIOS DE CAMARÓN" realizado por Juárez Gnmaldo Leticia; mediante el establecimiento de técnicas y condiciones de extracción de Compuestos.

11

'E' I

I ii I I

RESULTADOS Y DISCUSIONES

ACIDEZ

Se realizó un análisis de las muestras obtenidas durante la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón adicionadas de 7 'acosa al 5% p/p, sin inocular e inoculadas con Lactobacillus sp (B2), determinándose pH como variable de respuesta hasta 42 horas de fermentación con muestre0 cada 6 horas, estas determinaciones fueron realizadas por duplicado obteniéndose la media y desviación estándar (ver anexo B, rabia Bl).

Las fermentaciones con y sin inoculo presentaron una disminución gradual de pH. Las muestras inoculadas presentaron un mayor descenso de pH por la producción de ácido láctico causado por Lactobacillus sp (82) teniéndose al final de la fermentación un pH de 4.905; mientras que en las unidades experimentales sin inoculo el pH final fue de 5.87.

La disminución de pH durante la fermentación Iáctica de camarón hasta un valor de 4 a 4.5 es un factor determinante en la conservación de ensilado de camarón ya que a éste rango de pH se inhibe el desarrollo de los microorganismos no deseados, principalmente patógenos (Figura i)(Shipi y col. 1996).

En las muestras sin inocular las bacterias Iácticas se encuentran presentes de manera natural, por lo que la producción de ácido~láctico y la subsecuente disminución de pH es más lenta debido a que hay una mayor competitividad de los microorganismos por el sustrato (Han-Ching y MI).

7 5 -

6 -

5 5 -

5 T I

4.5 T

I

I

1 4 < O 6 12 18 24 30 36 42

Tiempo (hs). -3hrir&mk1 =fCunhróculo

Figura I Evolución de pH durante la fermentación Iactica de desperdicios de carnamn con 10% de glucosa e inoculada con Lactobacillo sp (B2).

12

DETERMINACIÓN DE SUSTANCIAS NlNHlDRlNA (+)

La evaluación de aminoácidos libres presentes durante la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón con inoculo y sin inoculo fue realizado por el método Ninhidrina (+) (dentro de estas sustancias se encuentran los aminoácidos libres, la presencia de estos favorece la formación de aminas biogénicas) por duplicado obteniendose la media y desviación estándar (ver anexo B, cabia BI).

En los resultados obtenidos se puede observar que a pesar de que las concentraciones son muy similares si existe una menor cantidad de sustancias Ninhidrina (+) en las muestras que han sido inoculadas, en comparación con las no inoculadas, esto se debe a que en las muestras inoculadas el efecto del pH favoreció la formación de agregados de proteína de elevado peso molecular, teniéndose una menor hidrólisis de las proteínas presentes en los desperdicios de camarón, por lo tanto un menor contenido de aminoácidos libres en comparación con las muestras sin inocular (Shirai y col. 1996).

El proceso de fermentación inhibe a los microorganismos y aminoácidos libres provenientes de proteínas que son requeridos para la formación de aminas junto con otros factores como pH y temperatura que favorecen el crecimiento bacteriano y la actividad de las descarboxilasas (Eerola y col. 1996) (ver Figura 2 y

3).

La inoculación con Lactobacillus sp (B2) presenta un efecto favorable en la conservación del ensilado al disminuir la disponibilidad de aminoácidos libres que pueden ser descarboxilados por algunos microorganismos capaces de producir aminas biogénicas.

DETERMINACIÓN DE PROTEíNA

Se analizó por triplicado el contenido deproteína soluble presente en las nuestras inoculadas y sin inoculo por el método de Lowry-Peterson (1 977), calculándose la media y desviación estándar (ver ~ C X O B, rabia B3).

Dicha determinación se realizó a partir de muestras tratadas con TCA al 6%. El TCA juega un papel muy impo&mb? en esta fase ya que favorece la precipitación de proteínas de mayor peso molecular y de sustancias que interfieren en la determinación induso en soluciummuy-dddas ( Peterson, 1977).

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13

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El pH de la muestra es otro factor importante ya que al producirse ácido láctico hasta un pH final de (4.4 - 5) las proteínas presentes se desnaturalizan desdoblando las cadenas interiores formando agregados de mayor peso molecular que precipitan o coagulan (Shirai y col., 1996).

Un contenido mayor de proteína soluble en la determinación indica que hubo una mayor hidrólisis de las proteínas presentes, lo cual puede aumentar el contenido de aminoácidos libres, que son precursores en la formación de aminas biogénicas. Con base a lo anterior y en función de los resultados se observó una disminución en la concentración de proteína soluble mayor para las muestras con inoculo respecto a las no inoculadas (ver Figura 2 y 3).

30 T

I /

. 10

- 5

5 0

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E O 6 12 18 24 30 36 42

Tiempo (hs) +Aminokidoe t P m t . i n s

Figura 2 Presencia de aminoácidos libres y proteína soluble durante la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón adiaonada con I O % de glucosa -, sin inoculo.

Y

14

/+-

za

30

25

L O O 6 12 18 24 30 36 42

Tiempo (hs) + Arninoicidos t Proteína

Figura 3 Presencia de aminoácidos libres y proteina soluble durante la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón adicionadas con 10% de glucosa e inoculadas con Lactobacillus sp. (E2)

DETERMINACI~N DE AMINAS BIOGÉNICAS ESTÁNDARES

En esta fase se desarrollo el perfil cromatográfico de seis aminas biogénicas estándar (putresuna, cadaverina, tnptamina, tiramrna, trirnetiiamina e histamina), para lo cual se evaluaron diferentes volumenes de inyección y determinó el tiempo que tardan los picos en obtener una buena resolución brillantes y simetría (ver anexo B, tabia B4)

De acuerdo a lo antenor se determinó que el volumen de inyección adecuado para la caracterización de aminas es de 50 pL y el tiempo de resolución de los picos es de 20 min.

Las curvas estándar preparadas en el rango de O - O 1 rngll00 mL se separan perfectamente a los 15 minutos después de la inyección con una buena resolución de pico y simetría (Deng-Fwu y col., 1995).

Los resultados obtenidos en le perfil cromatográfico de las curvas estándar fueron analizados mediante regresión lineal para determinar la confiabilidad de los datos obtenidos mediante el coeficiente de correlación lineal .

Los coeficientes de correlación de O 99 en cada curva indican una relación finita lineal entre la concentración de aminas y el detector utilizado (Deng-Fwu y col, 1995) (vex Figura 4).

15

,. .

El Tiempo de Retención (TR) obtenido para identificar las aminas biogénicas se presenta en la la tabla B4 (ver anexo E); el tiempo de retención y la regresión lineal obtenida en este reporte será utilizada para trabajos posteriores como el de "Determinación de compuestos toxicos presentes durante la fermentación Iactica de desperdicios de camarón".

30000000 -

25000000 - ,f

10000000 - J y=ZE+07x+411075

MOOOOOO -

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R2 = O 9932 5000000

O O 0.5 1 15

Concentración de pumclna (m&W

Putrescina T.R. 6.43

A

70oooO00 - 6 0 0 W W O - 50000000 -

2wowoo - 1 m o t

O 02 0 4 06 Conwnlnclónde blptlminr (mgimL)

Tnptamina T.R. 11.57

7000woO -

60000000 -

50000000 -

¡U 4CQCQOOO -

U 30000000 ~

20000000 y = 8E+07x + 2E+M

e!

10000000 R* = 0.9918

O O 0 5 1

ConcentrasiOn de d a v e h a (mgimL)

Cadavenna T.R. 9.75

B

y = 3EW7X + 267024 30Wü000 - R' = 0.99%' 25M"x)O -

O 0.5 1 Conwninclón da Urmnlna

(WW

Tiramina T.R. 17.23

D

Figura 4 Curvas estándar de las diferentes aminas bibgénicas utilizadas para la caracterización;Tiempo de Retención (TR). A) Putresana, 8) Cadaverina. C) Tnptamina. D) Tiramina

16

1""'"? < < I a ' , , . ' i'"' ;fl 1

7owaOOO - 70000MM 60oooOOO 50000000 -

WoooOW 5-

y = 8E+07x + 2E+06 R' = O 9845

a 40ooM)OO - 0 40000000 a 3 . ~ 0 0 0

200MM00

4: 3-0- L y = 7E107x + 1E+06

R' 0.9932

. ~~~ ~~~~~~

2

O O O S 1

Concentración de trimeülamina (mglmL)

0 . O 2 O 4 O 6 O 8 1

Concenbición da histamina (mglmL)

Trirnetilamina T.R. 11 5 7 Histamina T.R. 13.98

E F

-Figtin 4 (Continuación) Curvas estándar de las diferentes arninas bogénicas utilizadas para la caracterización; Tempo de Retenaón (TR). E) Tnmetilarnma y F) Histamina.

17

CONCLUSIONES

La fermentación Iáctica controlada es un método considerado como alternativo para la conservación del desperdicio de camarón, ya que al inocular con Lactobacillus sp (B2) se reduce rápidamente el pH del medio inhibiendo el desarrollo de microorganismos causantes de la putrefacción.

La evaluación del pH y de las concentraciones de sustancias Ninhidrina (+) y proteína soluble son un parámetro clave para describir la formación de aminas biogénicas.

4 '

: : ( m 1 ,,d

El tratamiento con ácido láctico presentó diferencias significativas en pH respecto a las muestras inoculadas y sin inocular.

En las muestras inoculadas el ácido láctico producido por Lactobacilius sp (82) baja el pH del medio, el cual favorece la formación de agregados de proteína de elevado peso molecular, por lo que se tiene una menor hidrótisis de las proteínas presentes en los desperdicios de camarón dando como resultado un menor contenido de aminoácidos libres los cuales pueden ser descarboxilados por algunos microorganismos capaces de producir aminas biogénicas.

El programa utilizado de elución gradiente fue satisfactorio para la separación de aminas triogénicas, ya que tadas las aminas inyectadas a un volumen de 50 pL son recuperadas casi al 100 YO de su totalidad.

-

Por todo lo anterior podemos decir que la fermentación Iáctica si es un método alternativo para la conservación del desperdicio de camarón y puede ser utilizado para la producción de harinas conciestino a la alimentación animal.

18

..I.

RECOMENDACtONES

Las recomendaciones para proyectos similares son las siguientes:

*Modificar el tiempo de fermentación de los desechos de camarón así como el muestre0 de las unidades experimentales para evaluar el efecto del medio ácido sobre los microorganismos contaminantes.

*El manejo de los parámetros ambientales deben mantenerse lo más constantes posible para obtener datos reproducibles.

*Variar la concentración del ácido tricloroacético (del 6% al 7.5%) utilizado en la preparación de las muestras y extracción de diaminas para favorecer la precipitación de las proteínas de mayor peso molecular.

*Condiciones de inyección al HPLC (Cromatografia líquida de alta resolución):

>Flujo de 0.5 mUmin >Volumen de inyección 50 pL >Tiempo de elución 20 min.

19

I A

E 20

CURVA ESTANDAR DE AMINOÁCIDOS

Preparación de los estándares

Se prepararon aminoácido como se muestra en la tabla No AI .

25 mL de una solución de 8 aminoácidos. 0.002M de cada

Tabla No AI Mezcla de aminoácidos para realizar la curva estándar.

Aminoácido P.M. g de~AalL* ~ g ~ ~ d e Aa I25 mL

Arginina 174.20 0.3484 0.0087 Asparagina 133.1 O 0.2662 0.0067 Glutarnina 146.1 0.2922 0.0073 Leucina 131.2 0.2624 0.0066 Lisina 128.65 0.2573 0.0067 Treonina 119.12 0.2382 0.0060

Valina 117.15 0.2343 0.0059 Total 11 53.72 2.3074 0.0581

Dilución (a partir de ia solución estándar indicada anteriormente) 150 Factor de dilución 0.02 Concentración de la solución-estándar-= 2.30?4mg/mL (0.02) = 46.148 pgí mL

La solución estándar de aminoácidos recibe el tratamiento descrito en metodología para la determinación de sustancias Ninhidrina (+).

(g I mol)

Triptofano 204.2 0.4084 0.0102

Tabla A2 Cu Agua (mL I

1

3.9

0.8

0.7

Q-3

0.5

i estándar de aminoácidos. Solución Absorbancia a 570 nm concentración astándar f P # W

(mL) 0.0 O O

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

O. 1357 4.6148 0.1445 0.3977 9.2296 0.3738 05705 13.8444 0.5733 0.6705 18.4592 0.6937 0.9388 23.074 0.8902

21

Coeficiente de correlación: 0.9918 Ordenada al origen: -0.0095 Pendiente: 0.0397

Ecuación de la recta X = (Y + 0.0095)10.0397

Está ecuación se tomo como base para obtener la concentración en mg de sustancias Ninhidrina (+) presentes durante la fermentación Iácka de desperdicios de camarón.

La Figura AI Muestra la curva estándar obtenida

1 -

0 9 - - 0 8 -

C 0 7 . - O P- 0 6 -

E

E m 0 5 -

y =&0396x - o 0071 m 0 2 - Fp =o9918

I

5 10 15 20 25 -0 1 2 Concentración de Aminoáciaos@ughnL)

Figura AI Curva estándar de mezcla de aminoácidos libres obtenida por el método Ninhidrina (+) (Jaswal, 1989).

22

CURVA ESTANDAR DE SEROALBUMINA BOVINA

La solución estándar de seroalbúmina bovina recibe el tratamiento descrito para proteína en metodología

Tabla A3 Curva patron de seroalburnina bovina gg de alburnind 1 Absorbancia a 750 nrn

O O 0.098 i O. 1077 0.16 0.1921

30 0.229 0.2589 40 0.3314 0.2935 50 0.4122 0.3602 60 0.4202 0.4445 70 0.5096 80 0.5643 0.5743 90 0.6341 0.6585

Coeficiente de correlación (r) O.OS8 Pendiente (m) 6.9 e Ordenada al origen (b) 0.0273 Ecuación de la recta y = 6.9 e X + 0.0237

X (pg de proteínalml de muestra)- 6.9 e 41’

A partir de esta ecuación se obtuvieron las concentraciones pg .de proteína soluble presente durante la fermentación ládka de desperdicios de camarón (Ver anexo 6).

La figura A2 muestra la curva estandar obtenida con el metodo de Lowrv- Peterson, con un c<;eficiente de correlacion de 0.998

23

0.7

O * o 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Concentracion de proteina (ugi..iL)

Figura A2 Curva estándar de seroalbumina bovina analizada por el método de Lowry- Peterson (1 977)

ESTÁNDARES DE AMINAS BIOGENICAS

Tabla A4 Aminas estándares utilizadas para su caracterización durante la fermentación táctica de desperdicios de camarón. Amina @ mg/mL mg % IO@ 2 5 4 lOO@ 200@ 300@ 500pi

I

Triptamina 200 0.01 2 8.34 0.0083 0.0208 0.0833 0.1667 0.25 0.4166

Tiramina 1400 0.01 4 16.17 0.016 0.0416 0.1667 0.3333 0.5 0.8333

Trimetilamina 400 0.01 4 16.17 0.016 0.0416 0.1667 0.3333 0.5 0.8333

Cadaverina 400 0.01 4 16.17 0.016 0.0416 0.1667 0.3333 0.5 0.8333

Histamina 400 0.01 4 16.17 0.016 0.0416 0.1667 0.3333 0.5 0.8333

hikescina 600 0.01 6 25 0.025 0.625 0.25 0.5 0.75 1.25

24

25

Tabla 61 Resultados de la evaluación de pH durante la fermentación Iactica de desperdicios de camarc Tiempo (W

O

6

12

I 8

24

30

36

42

femen Tmmpa

fhsJ

6

18

24

30

42

Medición de pH Desviación Medición de pH Desviación

de muestras Media di^ estándar de muestras

7.32 7.3 7.31 0.014 7.17 5 7.17 O

7 19 7 15 7.17 0.028 6.58 6.6 6.59 0.0141

6.49 6.48 6.475 0.00707 6.41 6.47 6.44 0.0424

6.43 6.38 6.405 0.0353 6.1 6.12 6.1 1 0.0141

6.13 6.2 6.165 0.049 5.59 5.58 5.585 0.0071

5.92 5.88 5.9 0.0282 5.53 5.33 5.43 0.1414

5.89 5 58 5.87 0.0283 5.32 5.29 5305 0.0212

5.87 5.8 5.835 0.0495 4.9 4.91 4905 0.0071

sin inoculo con inoculo

Tabla 82 Resultados de la determinacion de sustancias Ninhidrina (+) durante la ión Iáctica de desperdicios de camarón. Muestras s/inoculo M a -*&n Muestras choculo o&a&n

estdndar n‘g susi. N(+l/g mu&

30.544 30.5063 0.0377 mg susi. N(+,!ig mw>sfliJ esnindar

38.4534 38.1688 0.2846 37.8842 30.4686

37.5012 38.5214 1,0202 38.5214 37.0026

39.9798 40.7959 0.8161 39.3602 39.3199 0.0403 41.61 2 39.2796

42.0302 42.4308 0.4006 39.1084 39.4257 0.3173

36.277 36.6398 0.3628

-. 42.8514 39.743

40.3476 ~ ~ 40.4635 0.8841 40.5844 39.4433 0.8589 40.5794 40.3022

26

f

I '

2462

23.77

20.83

21.17

20.44

-

20.84

25.62

0.40 23.36 24.32 23.95

0.86 21.42 22.32 22.55

2.18

0.37 20.03 20.54 21.04

029 19.37 20.7 20.38

- 18.36 17.93 18.75

0.431 -

23.91

22.09

-

20.53

20.15

18.35

-

0.43 L

6 D 9 b

G.59

0.5

0.69

1.11

-

27

Amina , * , , .I Biogenica

,".?I Putrescina

Cadaverina

Tnptamina

,..,I iI Trimetilamina

Histamina

,.I.,

.ll,i

:::u nr. Tiramina

../b

3 "I I ,

Tiempo Coeficiente Ordenada al Pendiente Ecuación de la recta de de origen

(TR) 6.43 0.9965 41 I 075 29787484.42 Y =29787484.4?(Conc)

9.75 0.9957 1852737.794 78247595.51 Y 4247595.51 (Conc)

11.57 0.9968 1 ia39~8.785 1 4 ~ 0 5 2 5 2 . 7 Y -145405252.7 (Cone)

retención correlación

+ 267029.298

+ 1852737.794

+ 11839558.785

13.98 0.9923 1648159.716 ii630322.68 Y =77630322.68(Conc) + 1648159.716

17.23 0.9967 267029.2018 267024 Y =29787489.42 (Conc) + 267029.2018

28

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30

Nombre: Lucero Rosas Martha Gabriela iMatrícuia: 93229840 Licenciatura: ingeniería en los Alimentos Título del proyecto: EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS TÓXICOS QUE SE

DE CAMARÓN.

24 de Junio de 1999

Profesor Tituiar C. Dra. Edith Ponce Alquicira Profesor Tiruiar C.

DESARROLLAN DURANTE LA FERMENTACI~N LACTICA

Clave de registro: JA.016.98 Fecha de entrega: Asesores: Dra. Keiko Shirai iMatsumoto

RESUMEN

3 presente proyecto tuvo como objetivo la extracción de compuestos tóxicos, tales comc minas biogénicas que se desarrollan durante la fermentación láctica de camarón .

31 estudio se realizó con desechos de cabezas de camarón del genero Penaeus sp. que heron adquiridos en la central de abastos de la Ciudad de México y mantenidas er :ongelación hasta su utilización.

Se evaluó el ._ k t o de la utilización de un iniciador (Lactobacillus sp (B2) y 10 % dc &cosa) durante la femntación sobre los parámetros pH, sustancias Ninhidrina (+) xoteina soluble y aminas biogénicas. Además se realizó un perfil cromatográfico de sei: uninas estándares (putrescina, cadaverina, triptamina, trimetilamina, tiramina e histamina) >ara lo cual se evaluarón diferentes volúmenes de inyección y determinó el tiempo quc =dan los picos producidos por las aminas en obtener una buena resolución.

Los desechos de camarón son muy utilizados en la producción de alunentos baianceado! para animales, al elaborarse harinas con un alto contenido de histamina se corre el riesgo de iausar intoxicación en los animales que lo consuman, porque las aminas volátiles tiene UT efecto tóxico además de producir olores amoniacales y putrefactos; dando como resultadc una disminución en la producción de canales para consumo humano y por lo tanto pérdida! económicas.

La fermentación de desperdicios de camarón del genero Penaeus sp. se puede emplea como un método altenativo para aumentar el tiempo de conservación por adición de Lactobacillus sp; el cual al producir ácido láctico como metabolito primario reduce rápidamete el pH del medio contribuyendo en gran medida a su efecto bacteriostático yr que la mayoría de los microorganismos patógenos no toleran la presencia de los ácidos z valores de pH menores a 5.0; además de disminuir la disponibilidad de aminoácidos libre! que pueden ser descarboxiiados por dgkos micmorganismos capaces de producir amina! biogénicas.