UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIAINSTITUTO DE INVESTIGACIONES EN CIENCIAS VETERINARIAS

LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA VETERINARIA

II Congreso Internacional de Leptospirosis,Sífilis y Borreliosis

"Espiroquetas Habana 2012"23 - 25 de abril de 2012

La Habana, Cuba

Borreliosis (Borrelia burgdorferi) y factores de riesgo en perros de una ciudad que sólo ha reportado garrapatas Rhipicephalus sanguineus en caninos, Mexicali, Baja

California, México

Luis Tinoco Gracia

SAPUVETNETRed auspiciada por el Grupo Alfa de la Unión Europea

Integrada por 16 países de América Latina y Europa

Mexicali, Baja California, México

Mexicali

INTRODUCCIÓN

BORRELIOSIS (ENFERMEDAD DE LYME):

Enfermedad inflamatoria multisistémica Transmitida por garrapatasZoonóticaDistribución mundial

ETIOLOGÍA: Complejo Borrelia burgdorferi sensu lato.

Norteamérica: B. burgdorferi sensu stricto (Johnson, 1984).Europa: B. afzelli y B. garinii (Berglund, 1995; Derdáková, 2003).Asia: B. japonica (Kawabata, 1993).

BANCO DE GENES National Center for Biotechnology Information (NCBI)

Ciclo biológico de I. scapularis relacionado con B. burgdorferi

Reservorio

Transmisión de borrelias al huésped por ninfas

Transmisión de borrelias al huésped por garrapata adulta

Otros vectores: I. pacificus, A. americanum, D. variabilis

Larvas

Huevos

BORRELIOSIS: Enfermedad inflamatoria multisistémica

Depresión, emaciación

Claudicación Garrapatas

ANTECEDENTES DE PREVALENCIA EN PERROS

Monterrey, Nuevo León:16% (136/850) a B. burgdorferi por IFA

(Salinas-Meléndez et al., 1999)

Mexicali, B. C.:6.6% (2/30) a B. burgdorferi por ELISA

(Romano et al., 1998)

8.2% (95% I.C. 1.5-13.3%) a B. burgdorferi por ELISA(Tinoco et al., 2007)

59.6% (56/94) a garrapatas (100% Rhipicephalus sanguineus)

(Tinoco et al., 2008)

ANTECEDENTES DE PREVALENCIA EN HUMANOS

Estados Unidos:Actualmente: 200,000 (CDC)

República Mexicana:

Por ELISA y Western blotDistrito Federal: 3.4%Noreste de la Rep. Mexicana: 6.2% (Gordillo et al., 2003)

Por PCR y Secuenciación (Flagelina y OspA)Distrito Federal: 4 pacientes (Gordillo et al., 2007)

OBJETIVOS

1. Estimar la prevalencia de B. burgdorferi por ELISA y PCR en perros atendidos en clínicas veterinarias y en perros capturados por los centros de control animal; y demostrar evidencia molecular en garrapatas por PCR, en Mexicali, Baja California, México.

2. Evaluar factores de riesgo asociados a B. burgdorferi en perros de la zona urbana de Mexicali, Baja California.

3. Demostrar la transmisión experimental de B. burgdorferi a través de la garrapata adulta R. sanguineus en perros.

MATERIAL Y MÉTODOS

FASES DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

1. Monitoreo de B. burgdorferi.

2. Aislamiento de B. burgdorferi.

3. Estudio experimental de la transmisión de B. burgdorferi por R. sanguineus.

1. MONITOREO

MARCO MUESTRAL DEL AREA DE ESTUDIO

Establecimientos:a) 39 clínicas veterinarias de la ciudad de Mexicalib) 2 centros de control animal de Mexicali

Sujetos: (768) i) 384 Perros atendidos en clínicas veterinariasii) 384 Perros capturados por los centros de control animaliii) Garrapatas recolectadas de los animales muestreados

Muestreo sanguíneo y de garrapatas

a) Perros atendidos en clínicas veterinariasb) Perros capturados por los centros de control animalc) Garrapatas conservadas en tubos con etanol al 70% o

congeladas a -20°C.

DIAGNÓSTICO

1. PERROS

Serología: Borrelia burgdorferi ELISA® Helica Biosystems, Inc.PCR: Sangre y líquido sinovial

2. GARRAPATAS

PCR: Glándula salival e intestino.

Iniciadores: Fragmentos de genes codificantes de B. burgdorferi sensu latoa) Flagelina (FLA): 256 pb

b) Proteína A de la superficie externa (OspA): 345 pb

SEROLOGÍA DE Borrelia burgdorferi

PUNTO DE CORTE

> 1.6

1.0 – 1.5 Positivo

0.5 – 1.0

0.3 – 0.5 Corte

0.2 – 0.3 Negativo

0.1 – 0.2

<0.1

Densidad öptica

Sensibilidad = 95.8%Especificidad = 94.7%Punto de corte = 0.300 DO (Densidad

óptica)

1. Tamaño de muestra:2

d

Z)1(n

n = tamaño de muestra, resultando 384 por cada grupo de estudio. = estimador de varianza máxima 50 %Z = valor de tablas = 1.96d = precisión = 5 % (Scheafer et al., 1987)

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

2. Se estimó la prevalencia y su intervalo de confianza mediante el estimador Rogan-Gladen (Greiner y Gardner, 2000).

3. Para evaluar la asociación de los factores de riesgo con la seropositividad a B. burgdorferi se utilizaron la razón de probabilidades (Odds ratio, OR) y X2 de Mantel-Haenszel.

4. Todos los análisis estadísticos utilizando el paquete SAS (Statistical Analysis System) para Windows ver 8.2 (Walker, 1997; SAS, 2004).

Seroprevalencia ajustada de Borrelia burgdorferi ELISA® Helica Biosystems, Inc.

Perros atendidos en clínicas veterinarias: 24/384 6.8% (95% CI 3.5-8.9)

Perros capturados por los centro de control animal: 42/384 12.0% (95% CI 7.5-14.3)

Ambos grupos: 66/768 9.3% (95% CI 6.3-10.6)

RESULTADOS

FACTORES DE RIESGO

Perros de las clínicas veterinarias

Parámetro X2 P OR (95% IC )

Edad 5.2724 0.02 4.7 (1.1-20.6) Falta de programa preventivo 7.8519 0.005 4.9(1.4 -16.8)

EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR

Manhattan, Kansas, 26 de septiembre de 2007

PCR de FLA en sangre de perros seropositivos

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

41 42 43 44 45 46 47 48 49

256 pb

256 pb

256 pb

EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCRManhattan, Kansas, 29 de septiembre de 2007

PCR de FLA en tejidos de perros seropositivos

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

256 pb

256 pb

EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCRManhattan, Kansas, 30 de septiembre de 2007

PCR de OspA en tejidos, coágulos sanguíneos y garrapatas de perros seropositivos

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

1. Marcador2. C+ N403. 506 Coágulos sanguíneos Sero+ FLA+4. 2032 Coágulos sanguíneos Sero+ FLA+5. 675 Coágulos sanguíneos Sero+ FLA+6. 1312 Coágulos sanguíneos Sero+ FLA+7. 1272 M, sinovial Sero+ FLA+8. 1326 M, sinovial Sero+ FLA+9. ENS1 M, sinovial Sero+ FLA+10. 39 CA M, sinovial Sero+ FLA+11. 1165 Garrapatas Sero+ FLA+12. 1346 Garrapatas Sero+ FLA+13. C-

345 pb

EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR

M

1 2 3 4 5 6 7 P N M

Mexicali, B.C., 22 de octubre de 2007

PCR de FLA en tejidos de perros seropositivos

256 pb

EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR

Mexicali, B.C., 19 de marzo de 2008

PCR de FLA en tejidos y garrapatas de perros seropositivos

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 P N MM. Marcador BioLadder 100• 889 Coágulos sanguíneos•2063 Coágulos sanguíneos•1272 Coágulos sanguíneos•1368 Garrapatas•1368 Garrapatas•1368 Garrapatas•1368 Garrapatas•1272 Vejiga•1272 Vejiga•1272 Vejiga •1272 VejigaP. Positivo

N. NegativoM. Marcador BioLadder 100

256 pb

EVIDENCIA DE Borrelia burgdorferi - SecuenciaciónManhattan, Kansas, 17 de octubre de 2007

Perro #1312  Muestra: Coágulo sanguíneo100% de identidad con OspA de Borrelia burgdorferi

TAACAATTTCTGACGATCTAGGTCAAACCACACTTGAAGTTTTCAAAGAAGATGGCAAAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||TAACAATTTCTGACGATCTAGGTCAAACCACACTTGAAGTTTTCAAAGAAGATGGCAAAA

CACTAGTATCaaaaaaaGTAACTTCCAAAGACAAGTCATCAACAGAAGAAAAATTCAATG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||CACTAGTATCAAAAAAAGTAACTTCCAAAGACAAGTCATCAACAGAAGAAAAATTCAATG

AAAAAGGTGAAGTATCTGAAAAAATAATAACAAGAGCAGACGGAACCAGACTTGAATACA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||AAAAAGGTGAAGTATCTGAAAAAATAATAACAAGAGCAGACGGAACCAGACTTGAATACA

CAGAAATTAAAAGCGATGGATCTGGAAAAGCTAAAGAGGTTTTAAAAGGCTATGTTCTTG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||CAGAAATTAAAAGCGATGGATCTGGAAAAGCTAAAGAGGTTTTAAAAGGCTATGTTCTTG

AAGGAACTCTAACTGCTGAAAAAACAAC||||||||||||||||||||||||||||AAGGAACTCTAACTGCTGAAAAAACAAC

2. AISLAMIENTO

Medio de cultivo: BSK-H® SIGMA + suero de conejo (6%) + gelatina de cerdo (6%) + rifampicina (100 mg/L) + fosfomicina (50 mg/L) + anfotericina B (2.5 mg/L)

Fuente: Vejiga.Temperatura: 33°CComprobación de crecimiento: Microscopia de campo obscuroCriopreservación : -20°C (CryoCare Bacterial Preservers® Key Scientific Products)

Secuenciación: 99% Borrelia burgdorferi sensu stricto

3. TRANSMISION EXPERIMENTAL

3 perros sanos de 8 meses de edad, de talla mediana, pelaje corto.

a) Grupo A: 2 perros expuestos a R. sanguineus con B. burgdorferi.

b) Grupo B: 1 perro expuesto a R. sanguineus no infectadas.

Incubación y desarrollo de R. sanguineus

1. Recolección de hembras adultas repletas recién alimentadas.2. Preovoposición: 4 d.3. Ovoposición: 5 d.4. Incubación de huevos: 11 d.5. Ayuno: 3 d.6. Colocación de larvas en perros: 3 d.7. Muda de larvas a ninfas: 7 d.8. Ayuno: 3 d.9. Colocación de ninfas en perros: 4 d.10. Muda de ninfas a adultas: 11 d.11. Ayuno: 2 d.12. Inoculación de borrelias en hembras adultas: 1 d.13. Colocación de garrapatas adultas en perros: 7 d.

Total del ciclo: 61 d.

Incubación: 30°C con 80% de humedad.

CICLO DE R. sanguineus EN MEXICALI

Inoculación de B. burgdorferi en R. sanguineus

5 hembras adultas inoculadas/perro.

El inóculo fue por capilaridad con medio BSK-H y Borrelia burgdorferi.

Concentración: 1×108 espiroquetas/ml de BSK-H.

En cámara húmedad a 34°C durante 24 horas.

Exposición experimental en perros a R. sanguineus infectadas con B. burgdorferi

Colocación de 5 machos y 5 hembras adultas/perro.Duración: 7 días.

CONCLUSIONES

1. Seroprevalencia de 6.8% (95% IC 3.5-8.9%) a B. burgdorferi en perros atendidos en clínicas veterinarias.

2. Seroprevalencia de 12% (95% IC 7.5-14.3%) en perros capturados por los centros de control animal.

3. Perros ≥ 1 año de edad: OR= 2.7 (95% IC 1.2-6.1).

4. Perros que no tuvieron acceso a un programa preventivo: OR= 4.9 (95% IC 1.4-16.8).

5. Evidencias serológicas y moleculares confirman la existencia de B. burgdorferi en perros y garrapatas en donde sólo se han registrado R. sanguineus.

6. Hasta el momento no se ha comprobado la transmisión de B. burgdorferi por garrapatas adultas de R. sanguineus en perros utilizando el protocolo para Ixodes scapularis.

Modificación del protocolo de la transmisión experimental de B. burgdorferi a través de R. sanguineus:

1. Utilizar 5 µL de medio BSK-H con 1×108 espiroquetas/ml como inóculo en lugar de 20 µL.

2. Realizar la inoculación de borrelias incluyendo la fase de ninfa no sólo la adulta.

3. Inocular con borrelias a 30 garrapatas hembras en lugar de 5 por cada perro de experimentación.

GRACIASMexicali, Baja California, México

Tinoco.luis@yahoo.com