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Manual de Preparación de Medios de Cultivo, Colorantes y SolucionesCódigo: M-CCBA-LB-03 Revisión: 03 Página: 1 de 35Fecha de emisión: 19 de abril de 2010

Fecha de modificación: 31 de agosto de 2016

Manual de

Preparación de Medios

de Cultivo, Colorantes y

Soluciones



Objetivo / Pág. 4Alcance / Pág. 4Políticas / Pág. 4Contenido, Introducción / Pág. 5Medios de Cultivo / Pág. 6

Requerimientos necesarios para el crecimiento bacteriano / Pág. 6Proteínas / Pág. 6Carbohidratos / Pág. 6Factores accesorios del crecimiento / Pág. 7Sales minerales / Pág. 7Atmósfera / Pág. 7Temperatura / Pág. 7Luz / Pág. 7pH / Pág. 7

Preparación de Medios de Cultivo / Pág. 8Ajuste de pH / Pág. 8Esterilización / Pág. 9Vertido de placas / Pág. 9

Clasificación de los Medios de Cultivo / Pág. 9Control de Esterilidad de los Medios de Cultivo / Pág. 11Control de Calidad de los Medios de Cultivo / Pág. 12Control de caducidad de los Medios de Cultivo / Pág. 12Medios de Cultivo básicos usados en el laboratorio / Pág. 15

Preparación de Colorantes / Pág. 23Cristal violeta / Pág. 23Lugol / Pág. 23Alcohol acetona / Pág. 23Safranina / Pág. 23Colorante Wayson / Pág. 23Azul de metileno alcalino (Tinción de Hansen) / Pág. 24Solución acuosa de safranina / Pág. 24Azul de Metileno Alcalino Loeffler / Pág. 24Fucsina Fenicada (Tinción de Ziehl -Neelsen) / Pág. 25Alcohol Acido (Tinción de Ziehl-Neelsen) / Pág. 25Verde Malaquita al 5 % (Tinción de esporas) / Pág. 25Safranina al 5 % (Tinción de espora) / Pág. 26Sulfato de cobre al 20 % (Tinción de cápsula) / Pág. 26Fucsina básica (Tinción de cápsula) / Pág. 26

ÍNDICE



Fucsina fenicada (Tinción de Campylobacter) al 0.8 % / Pág. 26Preparación de soluciones / Pág. 27

Indicador de rojo de metilo / Pág. 27Soluciones, empleadas para la prueba (Reducción de nitratos) / Pág. 27Reactivo de Kovac / Pág. 28Reactivos empleados para la prueba de Voges Proskauer / Pág. 28Hidróxido de potasio (KOH) 40 % agente oxidante / Pág. 28Peróxido de hidrógeno al 30% / Pág. 29Solución salina fisiológica 0.85 % / Pág. 29Preparación de HCl 0.1 N / Pág. 29Solución Verde Brillante al 0.1 % (Salmonella) / Pág. 29Estándar sulfato de bario (para ANTIBIOGRAMAS) / Pág. 30Solución buffer fosfatos para alimentos (PBS) / Pág. 31Agua peptonada concentrada para salmonella en aves (APC) / Pág. 31Agua peptonada diluida para salmonella en carne molida / Pág. 31Buffer fosfatos para salmonella en aves / Pág. 31Preparación de Lugol para Tetrathionate / Pág. 32Preparación del hipurato de sodio al 1 % / Pág. 32Solución de fosfatos para mantener remojados los electrodos / Pág. 32Solución buffer diluyente para bacteriológico de alimentos / Pág. 32Soluciones para ajustar pH de muestras / Pág. 33Solución de Hidróxido de Sodio 1,0 N / Pág. 33Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada) / Pág. 33Agua Peptonada / Pág. 34

Documentos de Referencia / Pág. 35Glosario / Pág. 35Control de Revisiones / Pág. 35



Describir los diferentes medios de cultivo que se utilizan en el laboratorio de

Bacteriología, su clasificación, requerimientos, preparación, así como su control de calidad,

para el procesamiento de muestras de origen animal.

Proporcionar la información necesaria para la preparación de colorantes y

soluciones utilizadas en el laboratorio de bacteriología.

Aplica a todo el personal del laboratorio de Bacteriología que procese medios de

cultivo, colorantes y soluciones.

Todos los medios de cultivo deberan ser preparados y conservados según lo

establecido en este manual.

Todos los colorantes y soluciones mencionados en este manual deben apegarse a las

instrucciones del mismo para su preparación.

I. OBJETIVO

II. ALCANCE

III. POLÍTICAS



Para estudiar debidamente los microorganismos se necesita como requisito previo el

cultivarlos en condiciones de laboratorio. Para lograr esto es preciso conocer cuáles son los

nutrientes y las condiciones físicas que requieren. Las distintas mezclas de sustancias

empleadas en el laboratorio para cultivos de bacterias se denominan genéricamente medios

de cultivo.

El medio de cultivo sirve como terreno sobre el que se siembra con fines de estudio, ya

que las necesidades nutricionales de las bacterias varían de manera muy amplia, existen

diferencias muy importantes en cuanto la composición de los medios empleados. Las bacterias

también tienen diferencias notables en lo que respecta a las condiciones del ambiente que

favorece su proliferación. Los medios de cultivo tienen como objetivo:

a. Fomentar el crecimiento microbiano en forma que puedan comprobarse las

características de cultivo.

b. Facilitar algunas reacciones bioquímicas, que luego pueden ser demostrables por

observación directa, o bien indirectamente por subsecuente reacción en presencia de

algunos reactivos adicionales.

Sólo algunos de los muchos compuestos orgánicos que actúan como colorantes se usan

para teñir microorganismos. Se trata de modificaciones de las primeras anilinas obtenidas de

productos del alquitrán, introducidas alrededor de 1880 por Koch, Weigert y Ehrlich en las

técnicas bacteriológicas.

Los colorantes se dividen en ácidos, básicos o neutros. En los colorantes ácidos, como

la eosina, el grupo iónico que imparte color (llamado cromóforo) tiene carga negativa (es un

anión) y forma una sal colorante al combinarse con una base (NaOH). Los colorantes básicos,

como el azul de metileno, son tinturas en la que el ión que lleva al color está cargado

IV. CONTENIDO

INTRODUCCIÓN



positivamente (un catión), que se combina con un ácido (HCl) para formar la sal colorante. No

todas las tinturas actúan mediante la formación de sales.

Los colorantes neutros como el de Giemsa, son compuestos en los que se mezclan

colorantes ácidos y básicos. Debido a la presencia de abundantes partículas (ribosomas) que

contienen ácido ribonucleico en todo el protoplasma de la célula bacteriana, las tinturas

básicas son las más útiles en bacteriología. Con estos colorantes, la mayoría de las células

bacterianas intactas se tiñen profunda y uniformemente, como los núcleos de las células de

vegetales y animales superiores.

Las soluciones en química, son mezclas homogéneas de sustancias en iguales o

distintos estados de agregación. La concentración de una solución constituye una de sus

principales características. Bastantes propiedades de las soluciones dependen exclusivamente

de la concentración. Su estudio resulta de interés tanto para la física como para la química.

Algunos ejemplos de soluciones son: agua salada, oxígeno, nitrógeno del aire y el gas

carbónico en los refrescos. Todas las propiedades: color, sabor, densidad, punto de fusión y

ebullición dependen de las cantidades que pongamos de las diferentes sustancias. La sustancia

presente en mayor cantidad suele recibir el nombre de solvente, y a la de menor cantidad se le

llama soluto y es la sustancia disuelta.

a) Requerimientos necesarios para el crecimiento bacteriano1. Proteínas. Se suministran generalmente como peptonas que se encuentran

disponibles en el comercio. Las peptonas se obtienen por diferentes tipos de

digestión ya sea ácida, alcalina o enzimática, consisten en polipéptidos y

aminoácidos, y suministra metabolitos nitrogenados.

2. Carbohidratos. En los medios de cultivo, los carbohidratos son muy usados como

fuente de energía por las bacterias y particularmente, para diferenciar géneros e

identificar especies.

MEDIOS DE CULTIVO

http://www.monografias.com/trabajos14/soluciones/soluciones.shtml

http://www.monografias.com/trabajos6/fuso/fuso.shtml

http://www.monografias.com/trabajos5/estat/estat.shtml

http://www.monografias.com/trabajos5/colarq/colarq.shtml

http://www.monografias.com/trabajos10/gase/gase.shtml

http://www.monografias.com/trabajos/aire/aire.shtml

http://www.monografias.com/trabajos14/falta-oxigeno/falta-oxigeno.shtml

http://www.monografias.com/trabajos14/problemadelagua/problemadelagua.shtml

http://www.monografias.com/Quimica/index.shtml

http://www.monografias.com/Fisica/index.shtml

http://www.monografias.com/trabajos7/tain/tain.shtml

http://www.monografias.com/trabajos14/soluciones/soluciones.shtml

http://www.monografias.com/trabajos10/carso/carso.shtml

http://www.monografias.com/trabajos15/separacion-mezclas/separacion-mezclas.shtml

http://www.monografias.com/Quimica/index.shtml



3. Factores accesorios del crecimiento. Son también requeridos por algunas bacterias.

Entre ellos están las vitaminas del complejo B (Tiamina, ácido nicotínico, piridoxina

y biotina). Estas suministran enzimas necesarias para las bacterias que son incapaces

de sintetizar. Otros factores necesarios para algunas bacterias son obtenidas de

nutrimentos más complejos, como el suero, la sangre, la yema de huevo etc.

4. Sales minerales. Elementos con sodio, potasio, calcio, etc.; también son requeridos

por algunas bacterias en su desarrollo.

5. Atmósfera. Algunos microorganismos precisan de una atmósfera con oxígeno para

su desarrollo (aerobios obligados); otros son incapaces de reproducirse en presencia

de oxígeno libre (anaerobios obligados), en tanto que los de un tercer grupo aunque

pueden crecer en una atmósfera con oxígeno, logran sobrevivir y crecer sin él

(anaerobios facultativos) y aquellos que requieren de baja tensión de oxígeno

(microaerofílicos).

6. Temperatura. La temperatura en la cual el microorganismo bacteriano crece mejor,

es considerada temperatura óptima, para la mayoría de las especies patógenas es de

37° C. Los microorganismos importantes en Bacteriología Médica son generalmente

Mesofílicos (límites entre 5 y 43°C), sin embargo hay microorganismos que crecen

entre límites de temperatura mucho más bajas (Psicrofílicos), o bien superiores

(Termofílicos).

7. Luz. La mayoría de las bacterias se desarrollan mejor en ausencia de luz, la luz del

sol con su componente ultravioleta puede incluso ser letal.

8. pH. La mayoría de las bacterias crecen mejor en un medio ligeramente alcalino (pH

7.2 a 7.6), pero existente también un limite de potencialidad bastante amplio. Se

recomienda comprobar el pH y proceder a su corrección si fuera necesario. El valor

del pH de los medios depende mucho de la composición del medio de cultivo, de la

temperatura que tenga este medio de cultivo en el momento de su medición y del

tratamiento a que se halla sometido dicho medio.



b) Preparación de los medios de cultivo1. Para la preparación de lo medios de cultivo se utiliza agua limpia, destilada o

desmineralizada y cuya reacción sea lo más cercana posible a pH neutro.

2. Los recipientes destinados a su preparación (por lo general Matraces Erlenmeyer) se

limpiarán escrupulosamente, con el fin de eliminar totalmente eventuales residuos de

otras sustancias. Deben ser lo suficientemente grandes para que el medio de cultivo

que se prepara pueda ser agitado con facilidad y concienzudamente.

3. De ser posible no se prepararán más de 1-2 litros por recipiente, si se va a preparar un

litro utilizar un matraz de 2 litros, si se va a preparar 500 mililitros utilizar un matraz

de 1 litro. Primero colocar la mitad del agua destilada al matraz, después agregar el

medio pesado y agitar vigorosamente para añadir después el resto del volumen total

del agua, aprovechando esta adición para desprender e incorporar al conjunto las

partículas del medio de cultivo que hubiera quedado adherida a la pared interna del

recipiente. Los medios de cultivo líquidos no requieren de calentamiento porque no

contienen agar como los medios sólidos. NOTA: Todo tipo de medio de cultivo es

sensible al calentamiento, por este motivo no debe calentarse más de lo

estrictamente necesario.

4. Ajuste de pH. El pH de los medios se ajusta en el momento de la fabricación, sin

embargo, la calidad del agua utilizada para la hidratación o la utilización de

medios no recientes pueden modificar este parámetro por lo que es aconsejable

verificarlo y reajustarlo si fuera necesario. Para realizar esta medición, lo mejor es

utilizar el potenciómetro (peachimetro) o bien utilizar tiras reactivas a pH. Para la

verificación del pH, se debe medir una muestra extraída del volumen total del

medio preparado, tanto en medios líquidos como sólidos. En los casos donde se

deba reajustar el pH, se puede utilizar una solución estéril de ácido clorhídrico

(para acidificar el medio) o hidróxido sódico (para basificar el medio). Si el medio

es sólido la medición y el eventual ajuste se hace a 45°-50°C (aún está liquido) y



en los medios líquidos se hace a temperatura ambiente. La corrección del pH se

efectúa con 0.1 M de HCl o 1M de NaOH tomando una muestra del medio de

cultivo preparado y estéril, se mide el pH y si fuera necesario se ajusta en la

muestra calculando después el volumen de ácido o base que sea requerido para el

total de medio.

5. Esterilización.Si las normas de preparación no indican otra cosa, la esterilización

se lleva a cabo en autoclave, a 121°C, (15 libras) durante 15 minutos. El autoclave

es la forma de esterilización más segura para los medios de cultivo. Si no se

dispone de autoclave, se puede utilizar una olla grande de presión.

6. Vertido de las placas. Para evitar la formación de vapor en las cajas, el medio

debe verterse a una temperatura de 45-55°C, cerca de un mechero Bunsen o en una

campana de flujo laminar, en un área estéril y si es necesario utilizar cubrebocas.

c) Clasificación de los Medios de CultivoLos medios de cultivo son fabricados para promover el desarrollo de grupos

bacterianos más o menos homogéneos de bacterias. Como es lógico suponer no todos los

medios de cultivo son utilizados para el cultivo de todas las bacterias, en ocasiones no sólo no

son aptos para el desarrollo de microorganismos en general, sino que además poseen la

capacidad de inhibir a algunos y favorecer el desarrollo de otros. Debe tenerse cuidado de

emplear el medio más adecuado para el aislamiento e identificación de las colonias

bacterianas.

Los medios pueden ser de acuerdo a su:

1. Consistencia.- Líquidos, Semisólidos y Sólidos. La ventaja de estos últimos estriba

en la facilidad para reconocer los tipos de colonias y realizar una descripción

macroscópica (tamaño, color, textura, forma etc.).

2. Función o aplicación.- S imples, De Enriquecimiento, Selectivos, Diferenciales,

Especiales y De Transporte.



3. Medios simples: Son medios que sólo contienen algún extracto de carne u otra

infusión simple, peptona, sal y agua, estos medios son líquidos.

4. Medios enriquecidos: La adición de componentes como sangre, suero o extractos de

tejidos de animales y plantas al caldo nutritivo o agar les proporciona sustancias

nutritivas complementarias para que el medio pueda soportar el crecimiento de las

bacterias exigentes.

5. Medios Selectivos: La adición al agar nutritivo de ciertas sustancias químicas

específicas, por ejemplo, el cristal violeta en concentraciones adecuadas previene el

crecimiento de bacterias Grampositivas sin afectar el desarrollo de variedades de

Gramnegativas.

6. Medios Diferenciales: La adición de ciertos reactivos o sustancias químicas a los

medios de cultivo trae como resultado determinado tipo de crecimiento bacteriano o

de cambios, después de la siembra e incubación del medio, lo cual permite al

observador diferenciar distintos tipos de bacterias. Por ejemplo, si siembra una

mezcla de bacterias en un medio de agar sangre, algunas de las bacterias pueden

hemolizar (destruir) los glóbulos rojos mientras que otras no lo hacen. Cuando

aparece una zona clara alrededor de la colonia bacteriana, es indicativo de que ocurre

la hemólisis. Así es posible distinguir entre bacterias hemolíticas y no hemolíticas

que proliferan en el mismo medio. De hecho, el medio Agar Sangre sirve

simultáneamente como medio de enriquecimiento y diferencial.

7. Medios Especiales: La mayoría de estos medios son empleados para comprobar una

o más características bioquímicas.

8. Medios de Transporte: Son substratos empleados en el transporte y conservación de

especímenes para cultivos de diversos gérmenes como Estreptococos,

Enterobacterias y muchos otros más. Ejemplo solución salina glicerinada de Stuart.



d) Control de Esterilidad de los Medios de CultivoActualmente los medios de cultivo para microorganismos se preparan a partir de

productos deshidratados, suplementados con aditivos de procedencia comercial. Cada vez

que el laboratorio recibe un nuevo lote de medios de cultivo deshidratado, el analista

anotará en la bitácora correspondiente los siguientes datos: la clave asignada en el

inventario, el nombre del medio del cultivo, la marca comercial, el número de lote, la fecha

de recepción, caducidad, cuando se realizó y el día de apertura. Posteriormente el analista,

almacenará y preparará el medio de cultivo, según datos de la firma suministradora,

teniendo en cuenta las siguientes normas:

1. Guardar los medios de cultivo en un área cuya temperatura se encuentre entre los

2-30°C, donde la humedad no exceda el 80% y no incida directamente la luz del

sol.

2. No dejar el frasco del medio abierto más que el tiempo indispensable.

3. Utilizar agua destilada o desionizada para su preparación.

4. Calentar de preferencia en placas calefactoras provistas de imán agitador.

5. Mantener durante un minuto la temperatura de ebullición de los medios sólidos,

los caldos solo se calientan hasta solubilizar sus ingredientes.

6. Comprobar el pH del medio, generalmente estará dentro de los límites expuestos

por el fabricante, si no lo está, se corregirá añadiendo soluciones de NaOH para

alcalinizar ó HCL para acidificar.

7. Esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras) durante 15 minutos.

8. Enfriar los medios esterilizados a 48°C-50°C antes de añadir suplementos estériles

y termolábiles.

9. En el momento de la adición los suplementos estarán a temperatura ambiente

(nunca recién salidos del refrigerador).

10. Una parte proporcional da cada lote de fabricación (5%), se aparta para efectuar un

control de esterilidad, que consiste en comprobar la ausencia de crecimiento



después de dos días de incubación a 35° y 5 días a temperatura ambiente, para

descartar hongos.

11. Si no hay crecimiento del grupo control, se mantiene el resto del lote en

refrigeración hasta su utilización (suponiendo que pase el segundo control).

e) Control de Calidad de los Medios de CultivoDada la variabilidad debida a pequeños errores en la preparación de los medios de

cultivo, tanto los generales como los selectivos, es preciso hacer controles periódicos que

permitan comprobar que las bacterias buscadas crecen incluso a partir de células aisladas

(colonias aisladas), además, que las bacterias de la flora general son satisfactoriamente

inhibidas (no crecen salvo cuando se siembra un gran volumen). Este tipo de control de los

medios de cultivo se denomina econométrico. Una parte proporcional de cada lote de

fabricación de medios de cultivo se aparta para ser inoculado, por lo menos con dos

microorganismos control característicos del citado medio. Así por ejemplo, si se quiere

comprobar la calidad de un medio selectivo, se siembra una placa con el germen control

conocido que a priori se sabe que cultiva, y otra, con un germen control que no pueda

crecer. Si el medio de cultivo es diferencial e incluye un determinado azúcar, se inocula una

placa con un germen productor de acidez y otra con un germen inerte. Para estandarizar el

método, las cepas patrón se incuban en caldo durante una noche, y al día siguiente, se

resiembra por agotamiento en estría, con el fin de conseguir un aislamiento.

f) Control de Caducidad de los Medios de CultivoDespués de emplacar los agares es preciso rotular de forma visible sino sobre cada

placa, alguna etiqueta que indique el nombre del medio de cultivo, la fecha de su

preparación, caducidad, así como de la persona que lo preparó. De esta forma, será fácil en

todo momento identificarlo y conocer el tiempo que separa al gel de su límite de caducidad.



En la tabla 1 se exponen datos sobre el tiempo de almacenaje de algunos medios de

cultivo, partiendo del supuesto que se encuentren en la nevera, e introducidos o no en una

bolsa de plástico.

Tabla 1. Caducidad de los Medios de Cultivo emplacados, según temperatura de almacenamiento y protección

Medios de Cultivo En nevera a 4°C Sin bolsa de plástico

En nevera a 4°CEn bolsa de plástico

Agar Sangre 15 días 50 díasAgar Chocolate 15 días 60 días

Agar Mueller Hinton 15 días 70 díasAgar Mac Conkey 15 días 70 días

Agar Manitol 15 días 60 díasXLT-4 Agar 15 días 60 días

Medios sólidos en general 15 días 70 díasMedios Líquidos 15 días 60 días

Soluciones Preparadas 15 días 120 días

Los medios de cultivo mantenidos en tubo (pruebas bioquímicas u otros), están

sometidos a los mismos controles que los medios emplacados, es decir, previamente deben

pasar un control de esterilidad, después uno de calidad y finalmente, no sobrepasar un

límite de caducidad.

El control de esterilidad se efectúa incubando durante 5 días a 35°C, un lote de

tubos escogidos del grupo al azar, comprobando al final que no tienen crecimiento. El

control de calidad consiste en sembrar en cada tipo de medio, diferencial o de

identificación, por lo menos dos microorganismos con distinta actividad fisiológica o de

crecimiento. En la Tabla 2 se exponen algunos microorganismos que pueden emplearse

para comprobar la calidad de algunos medios entubados.



Tabla 2. Microorganismos utilizados en el Control de Calidad de Medios de Cultivo mantenidos en tubo

Prueba Bioquímica Microorganismo Características de cultivo

Reacción

TSI Escherichia coli 24 hrs. aerobiosis Acido fondo y superficiePseudomona aeruginosa

24 hrs. aerobiosis Alcalino fondo y superficie

Citrato de Simmons Escherichia coli 24 hrs. aerobiosis No cultiva. Verde(-)Klebsiella

pneumoniae24 hrs. aerobiosis Cultiva. Azul (+)

LIALisina y Hierro

SalmonellaTyphimurium

24 hrs. aerobiosis Púrpura fondo y superficie. H2S (+)

Proteus mirabilis 24 hrs. aerobiosis Rojo fondo, amarillo superficie.

Movilidad (Agar semi-sólido)

Proteus mirabilis 24 hrs. aerobiosis Cultiva. Desplazamiento lateral.

Klebsiellapneumoniae

24 hrs. aerobiosis Cultiva. No desplaza.

Indol (Kovac) Escherichia coliKlebsiella

pneumoniae

24 hrs. aerobiosis Cultiva. Da color rojo.Cultiva. Da incoloro.

Urea de christensen Escherichia coliProteus mirabilis

Klebsiella pneumoniae

24 hrs. aerobiosis24 hrs. aerobiosis24 hrs. aerobiosis

Cultiva pero no da color.Todo el medio rosado.Solo el fondo rosa.

Rojo de metilo Escherichia coli 24 hrs. aerobiosis Cultiva. Color rojoEnterobacter spp. 24 hrs. aerobiosis Cultiva. Color Amarillo

Voges Proskauer Escherichia coli 24 hrs. aerobiosis Cultiva. No da colorEnterobacter cloacae 24 hrs. aerobiosis Cultiva.Da color rojo

Urea caldo Escherichia coli 24 hrs. aerobiosis No cambiaProteus mirabilis 24 hrs. aerobiosis Color púrpura.

Oxidasa Escherichia coli 24 hrs. aerobiosis No cambia.Pseudomona 24 hrs. aerobiosis Color purpura.

Catalasa S.aureus 24 hrs. aerobiosis Forma burbujas.Streptococcus 24 hrs. aerobiosis No forma burbujas.

Coagulasa S. aureus 24 hrs. aerobiosis Coágulo. PositivoS. epidermidis 24 hrs. aerobiosis No coágulo.

CAMP S. agalactiae Streptococcus spp.

24 hrs. aerobiosis24 hrs. aerobiosis

Positivo. Flecha.Negativo.



g) Medios de Cultivo Básicos usados en el LaboratorioMedios de Cultivo Sólidos

1. Base de Agar Sangre. La base de agar sangre es adecuada para aislar y cultivar

diversos microorganismos que crecen con dificultad. Con la adición de sangre,

puede usarse para demostrar la actividad hemolítica. Para la preparación de Agar

Sangre, Agar Chocolate, Agar con Azida de sodio se utiliza la sangre de cordero

desfibrinada.

Obtención de la sangre para su uso en medios de cultivo. La vena yugular es el

sitio de obtención, este se desinfecta perfectamente lavando con agua y jabón, se

rasura y posteriormente se limpia con torundas con alcohol. La sangre se obtiene

con una jeringa estéril de 20 ml y se pasa a un matraz estéril con perlas de vidrio en

condiciones estériles cerca del mechero. La sangre se agita de modo que la fibrina

se elimina y se obtiene la sangre sin hemolizar. La sangre de cordero desfibrinada se

emplea en medios de cultivo como enriquecimiento, pero se usa especialmente para

la determinación de reacciones hemolíticas. Estando desfibrinada la sangre esta

libre de citratos y otros agentes quelantes que pueden interferir con el desarrollo

microbiano, impidiendo que los microorganismos puedan disponer de elementos

esenciales importantes. La sangre desfibrinada se puede almacenar en el

refrigerador hasta ser empleada, no congelar.

Forma de actuación. Su abundante base nutritiva ofrece condiciones óptimas de

crecimiento a todos los microorganismos presentes. El valor del pH de 6.8 2, es

especialmente favorable para la conservación de los eritrocitos y para la formación

de halos hemolíticos claros. Para la determinación de las formas de hemólisis es

adecuado añadir sangre de oveja, recién obtenida, desfibrinada.

Preparación. Al agar esterilizado, fundido y enfriado a 45°-50°C, se le añade

sangre desfibrinada estéril de carnero al 5-10% vertiendo la sangre sobre las paredes

del matraz y se hace rotar suavemente hasta que la sangre este uniformemente



mezclada con el medio, teniendo cuidado de no formar burbujas de aire. El medio

de cultivo preparado es, antes de la adición de la sangre, claro y amarillo parduzco y

posteriormente a la adición de la sangre del color de la misma y no hemolizado.

2. Agar Chocolate. Se utiliza para el aislamiento de microorganismos exigentes

como el Actinobacillus pleuropneumoniae (en nuestro laboratorio) adicionado con

Polienriquecimiento de Bioxon al 1% y extracto de levadura al 5 %.

Forma de actuación. Mediante la adición del Polienriquecimiento se estimula el

crecimiento de Actinobacillus pleuropneumoniae pero pueden crecer otros

microorganismos.

Preparación. La señalada por el fabricante.

3. Agar Mac Conkey. Se utiliza para el aislamiento de Salmonellas, y bacterias

coliformes a partir de heces fecales, para examen de productos lácteos.

Forma de actuación. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben

considerablemente la flora gram-positiva. La lactosa, junto con el indicador de pH

rojo neutro, sirven para la comprobación de la degradación de dicho azúcar.


Interpretación. Las colonias lactosa negativas son incoloras y las lactosa

positivas son rojas con un halo turbio debido de descenso de pH provocado por los

ácidos biliares.

Tabla 3. Interpretación de Agar Mac Conkey

COLONIAS MICROORGANISMOSIncoloras, transparentes Salmonella, Shigella y otros.

Grandes, rojas, halo turbio. Escherichia coli.

Grandes rosadas mucosa. Enterobacter, Klebsiella.

Diminutas de crecimiento. Enterococos.



4. Agar Manitol Sal. Agar selectivo para la demostración de Estafilococos

patógenos en alimentos y en otros materiales objeto de investigación.

Forma de actuación. Debido a la concentración extremadamente alta de sal,

permite solamente el crecimiento de microorganismos tolerantes a ella, entre los

que se encuentran, entre otros, los del género Staphylococcus. La degradación del

manitol, con formación de ácido, está notablemente relacionada con la

patogenicidad del germen en cuestión y sirve, por lo tanto, como indicativo de la

presencia de Staphylococcus aureus.

Preparación. La señalada por el fabricante. Las placas con medio de cultivo son

claras y de color rojo.

Empleo e interpretación. Debido al potente efecto inhibidor de este medio, debe

sembrarse masivamente. Incubación: hasta 3 días a 37°C.

Tabla 4. Interpretación de Agar Manitol SalCOLONIAS MICROORGANISMOS

Con halo amarillo, crecimiento intenso.

Manitol positivo. S. aureus

Sin cambio de color, crecimiento débil.

Manitol negativo. S. epidermidis y otros.

5. Medio XLT-4. Para el aislamiento de Salmonella. En combinación con un

enriquecimiento adecuado, con el Agar XLT-4, se puede detectar un número

notablemente mayor de Salmonellas que en otros medios de cultivo selectivos.

Forma de actuación. La degradación de los carbohidratos xilosa, lactosa y

trehalosa produce un viraje a amarillo del Rojo de fenol. El tiosulfato y la sal de

hierro (III) revelan la formación de ácido sulfhídrico por la precipitación de

sulfuro de hierro negro en las colonias. El efecto ihnibidor d este medio de cultivo

es débil.

Preparación. El medio se pesa y se disuelve en el agua se mezcla perfectamente

bien y se añade más agua, se añade el Suplemento (7 ethyl-2-methyl-4-



undecanol-hydrogen sulfate, sodium salt) (utilizar mascarilla) 4.6 ml por litro de

medio, se calienta hasta disolver el agar perfectamente, se hierve unos segundos y

se espera a que tenga una temperatura de 45-50°C. No se esteriliza en autoclave.

El Suplemento se usa con el XLT-4 Agar Base para aislamiento de no Salmonella

typhi. Se almacena en la obscuridad a 15-30°C. Las placas con medio de cultivo

son de color rojo y casi siempre claras.

Interpretación. Sembrar por estrías, en capa fina e incubar a 36 °C por 24-48hrs.

Tabla 5. Interpretación de medio XLT-4Empleo e

Medios de Cultivo líquidos

1. Caldo Brain Heart Infusion (BHI). Base para el Cultivo de microorganismos

difíciles entre los que se incluyen estreptococos, neumococos y meningococos.

Forma de actuación. Este medio está basado en el principio de que contiene

pequeñas piezas de tejido de cerebro y puede ser usado para cultivar organismos

fastidiosos. Puede ser usado para la prueba de coagulasa y para sembrar muestras

que necesiten enriquecimiento.


2. Gn Broth, Hajna. Base para el aislamiento de microorganismos Gram negativos

MICROORGANISMO COLONIASEscherichia coli, Enterobacter spp.

Colonias amarillas, con zona amarilla alrededor, opacas.

Klebsiella spp. Colonias amarillas, con halo amarillo, opacas, mucosas.

Proteus spp. Colonias rosadas, ligeramente elevadas, brillo.

Pseudomona

Colonias rojas, planas, rugosas, bordes irregulares.

Salmonella spp. Colonias rojas, elevadas, brillo, redondas, lisas.



Forma de actuación. La triptosa sirve como base nutritiva. El citrato y el

desoxicolato actúan como agentes selectivos para inhibir el crecimiento de

microorganismos Gram positivos, especialmente Estreptococos fecales, todo tipo

de bacilos esporulantes y ciertas bacterias Coliformes. El manitol favorece

selectivamente el crecimiento de Salmonellas y Shigellas que la utilizan. Un

tampón de fosfatos impide la acidificación precoz del medio de cultivo a cargo de

productos metabólicos ácidos. Caso de estar presentes Proteus y Pseudomona

aeruginosa, estos germenes se multiplican, por regla general poquísimo en las

primeras 6 a 8 horas y más lentamente que Salmonella y Shigella. Este medio

contiene desoxicolato de sodio que inhibe microorganismos Gram positivos,

favoreciendo el desarrollo de Gram negativos entre ellos las Salmonellas.


Empleo e interpretación. Sembrar el caldo de enriquecimiento con el material

objeto de investigación. En caso de heces fecales 1 gr. por 10 ml del medio de

cultivo. Incubar a 36 °C por 24 horas.

3. Caldo de Enriquecimiento Tetrationato. Para el enriquecimiento selectivo de

Salmonellas, a partir de heces fecales y diversos materiales de investigación. El

medio de cultivo basal preparado, puede almacenarse durante largo tiempo, pues el

tetrationato no se sintetiza, a partir del tiosulfato, hasta que se añade el compuesto

de yodo antes del uso.

Forma de actuación. El tetrationato junto con el tiosulfato excedente, inhibe a

Coliformes y otras bacterias acompañantes. En cambio, todas la bacterias

reductoras de tetrationato, como por ejemplo las Salmonellas y Proteus, pueden

multiplicarse más o menos sin obstáculo. El ácido procedente de la reducción del

tetrationato es neutralizado por el carbonato cálcico. Las sales biliares inhiben

considerablemente a todos los microorganismos de presencia no obligatoria en el



intestino. La adición de verde brillante- recomendada por la United States

Pharmacopoeia-sirve, sobre todo, para inhibir a la flora Gram positiva. Dado que

el medio de cultivo con Verde Brillante posee un efecto inhibidor muy intenso,

resulta ventajoso a veces suprimir la adición de Verde Brillante a fin de obtener un

rendimiento satisfactorio de Salmonellas. Según Jefries (1959), el Proteus es

inhibido por la adición de 0.04g/litro de Novobiocina.

Preparación. La señalada por el fabricante. No esterilizar en autoclave. Antes de

su uso, añadir 20 ml/litro de yodo y yoduro potásico, además eventualmente 10

ml/litro de solución al 1% de Verde Brillante y en caso necesario, 0,04gr/litro de

Novobiocina. Evitar todo calentamiento posterior. Al distribuir el medio de

cultivo, repartir homogéneamente el precipitado que eventualmente hubiera

podido formarse. La preparación de la solución de yodo y yoduro de potasio se

realiza de la manera siguiente: Yodo 6 gr; Yoduro potásico 5 gr. mezclar, añadir

agua destilada 20 ml.

4. Caldo de Enriquecimiento para Salmonella según Rappaport y Vassiliadis.

Para el enriquecimiento selectivo de Salmonella con excepción de Salmonella

typhi y Salmonella paratyphi A, en alimentos y otros materiales.

Forma de actuación. El verde malaquita y cloruro de magnesio favorecen el

crecimiento de Salmonella, para el mismo fin sirve la peptona de harina. La

reducción del pH a 5.2 mejora la selectividad.

Preparación. La señalada por el fabricante. El medio de cultivo preparado puede

almacenarse en refrigerador como mínimo durante 7 meses.

Empleo e interpretación. El medio de cultivo se siembra con el material

procedente de otro medio líquido (no deberá ser inoculado con alta cantidad de

inoculo porque perdería su selectividad. Se incuba a 36°C por 24 horas. De este

medio se pasa a los medios sólidos.



5. Base Caldo Rojo de Fenol. Medio de cultivo de ensayo para identificación

bioquímica, mediante la adición de sustancias reaccionantes.

Forma de actuación. Se utiliza con el Caldo lactosado para las pruebas de

Coliformes en agua y otros materiales de investigación. La fermentación de la

sustancia reaccionante, producida por el cultivo sembrado, se pone de manifiesto

por un cambio del color del Rojo de fenol, que vira de rojo a amarillo. Las

sustancias reaccionantes se agregan al 1%.

Preparación. Disolver 15 gr./litro con la sustancia reaccionante al 1%, distribuir

en tubos con tapa de rosca de 12x120, provistos de campanas de DURHAM y

esterilizar en autoclave 15 minutos a 15 libras de presión. El caldo listo para su uso

es claro y de color rojo.

Empleo e interpretación. Para detectar Coliformes en agua se siembran con

volumen de la muestra según lo indique la técnica. Se incuban 24-48 hrs. a 36°C. y

se observa el cambio de color de rojo a amarillo y formación de gas en las

campanas producto de la fermentación del carbohidrato.

6. Caldo Lactosa. Medio de cultivo exento de sustancias inhibidoras para el ensayo

previo orientativo de bacterias Coliformes.

Forma de actuación. La utilización de la lactosa se demuestra con la presencia

del indicador Rojo de fenol base al cambiar de color rojo a amarillo y la

formación de gas en la campana de DURHAM.

Preparación. Disolver 13 gr./litro , en la base caldo Rojo de fenol, distribuir en

tubos con tapa de rosca de 12x125 con campana de DURHAM y esterilizar 15

minutos a 15 libras de presión, pH 6.9 0.1. El caldo preparado es claro y de color

rojo.



Empleo e interpretación. Se añade un volumen determinado de la muestra a

investigar según la técnica correspondiente. Incubar 24-48hrs. a 36°C. Color

amarillo con formación de gas en la campana de DURHAM, nos indica la

presencia de bacterias Coliformes.

7. Caldo EC. Para la demostración selectiva de Coliformes y de Escherichia coli en

aguas alimentos y otros materiales.

Forma de actuación. En tanto que el contenido en lactosa favorece a las bacterias

lactosa-positivas, especialmente Coliformes y E. coli las sales biliares inhiben

notablemente el crecimiento de gérmenes Gram positivos o de especies

microbianas no adaptadas al medio ambiente intestinal. Los gérmenes lactosa

positivos consumen lactosa, con producción de gas.

Preparación. Disolver 37 gr/litro o bien 74 gr/litro, distribuir en tubos provistos

con campana DURHAM y esterilizar en autoclave 15minutos 121°C. pH 6.90.1.

El caldo preparado y distribuido es claro y amarillento.

Empleo e interpretación. El material sometido a investigación proveniente de

una prueba presuntiva en caldo Lactosado, se incorpora directamente al Caldo EC

aproximadamente 100 microlitros. Se incuba a 45°C, si se busca E.coli más otras

Coliformes o a 37°C, si se busca solo la presencia de Coliformes. Turbidez con

formación de gas en el tubo de Durham es un tubo positivo.

CRISTAL VIOLETA.- Almacenar en frasco ámbar.

PREPARACIÓN DE COLORANTES



Cristal violeta (85%) 1 gr.

Etanol (95 %) 20 ml.

Oxalato de Amonio 0.8 gr.

Agua destilada 100 ml.

LUGOL

Cristales de Iodo 1 gr.

Yoduro de potasio 2 gr.

Disolver completamente en 5 ml. de agua destilada, luego adicionar:


Guardar en frasco ámbar.

ALCOHOL- ACETONA

Etanol 95 % 250 ml.

Acetona 250 ml.

SAFRANINA

Safranina 2.5 gr.

Alcohol (95 %) 100.0 ml.

COLORANTE DE WAYSON

Solución " A "

Fucsina básica 0.2 gr.

Alcohol etílico absoluto 20.0 ml.

Azul de metileno 0.75 gr.

Disolver los colorantes en el alcohol.

Solución " B "

Fenol 10 gr.




Solución para empleo.

1. Echar la solución A en B lentamente.

2. Dejar reposar durante 48 horas.

3. Filtrar y guardar en fresco ámbar. Nota: Este colorante ofrece mayor tinción después

de 1 ó 2 años.

AZUL DE METILENO ALCALINO (TINCIÓN DE HANSEN)

Solución " A "


Agua destilada 100.0 ml.

Solución " B "

Hidróxido de potasio 0.04 gr.


Mezclar 3 ml. de solución A + 10 ml. de solución B antes de usarla.

SOLUCIÓN ACUOSA DE SAFRANINA

Safranina 1 gr.


AZUL DE METILENO ALCALINO DE LOEFFLER

Tinción de gránulos metacrómaticos.

Solución " A”


Alcohol etílico (95 %) 30.0 ml.

Disolver completamente: se trata de una solución saturada.

Solución " B "





Para su empleo: Añadir la solución A en la solución B, agitando continuamente. Filtrar

antes de su empleo.

FUCSINA FENICADA (Tinción de Ziehl- Neelsen)


Alcohol etílico (95 %) 10.0 ml.

Fenol cristales 5.0 ml.


ALCOHOL - ÁCIDO (Tinción de Ziehl- Neelsen)

Alcohol etílico (95 %) 97 ml.

HCL Q. P. 3 ml.

1. Azul de metileno de Loeffler. (Tinción de Ziehl- Neelsen)


Alcohol ( 95 %) 30.0 ml.

2. KOH 0.01 % (Tinción de Ziehl - Neelsen)


Agua destilada 100.ml.

Mezclar 1 y 2 agitar continuamente. Filtrar antes de su empleo.

VERDE MALAQUITA AL 5 % (TINCIÓN DE ESPORAS)

Verde malaquita 5 gr.


SAFRANINA AL 5 % (TINCIÓN DE ESPORAS)

Safranina 5 gr.




SULFATO DE COBRE AL 20 % (TINCIÓN DE CÁPSULA)

Sulfato de cobre 20 gr.


FUCSINA BÁSICA (TINCIÓN DE CÁPSULA)



FUCSINA FENICADA (TINCIÓN DE CAMPYLOBACTER) AL 0.8%

Fenol 2.5 ml

Alcohol 100% 5.0 ml

Fucsina Básica 0.8 gr.

Agua destilada 100 ml

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES



INDICADOR DE ROJO DE METILO

1. Disolver 0.1 gr. de rojo de metilo en 300 ml. de alcohol etílico al 95 %.

2. Agregar 200 ml. de agua destilada a la mezcla alcohol-indicador.

Conservación: guardar el reactivo en un refrigerador 4°C mientras no se usa.

SOLUCIONES EMPLEADAS PARA LA PRUEBA REDUCCIÓN DE NITRATOS

Reactivo A

Dimetil alfa naftilamina al 0.6%:

250 ml de agua destilada

100 ml de ácido acético glacial

2.1 ml de dimetil alfa naftilamina

Mezclar en el orden que se mencionan.

Reactivo B

Ácido Sulfanílico al 0.8%:

250 de agua destilada

100 de ácido acético glacial

1.8 gr. de ácido sulfanílico.

Mezclar en el orden mencionado.

Zinc en polvo (reduce el nitrato a nitrito).

Guardar ambos reactivos en el refrigerador (4°C).

Por lo general estos reactivos se mantienen estables durante por lo menos tres meses.

Sin embargo, periódicamente se hará un control de calidad, desechándolos si dan una reacción

negativa o débil con un organismo conocido.

REACTIVO DE KOVAC



Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alcohol butílico)

150 ml.

p- dimetil- amino- benzaldehido 10 gr.

HCl (concentrado) 50 ml.

Preparación: Disolver el aldehído en el alcohol. Agregar lentamente el ácido a la

mezcla aldehído-alcohol. Guardar en el refrigerador a 4°C. Su estabilidad es variable, por lo

tanto se hará todas las semanas un control de calidad, desechando si muestra una reacción

débil o negativa con un organismo positivo conocido.

REACTIVOS EMPLEADOS PARA LA PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER

Alfa naftol 5 %, intensificador del color.

Alfa naftol (1- naftol) 5 gr.

Alcohol etílico (absoluto) 100 ml.

Preparación: Disolver el alfa naftol en menos de 100 ml. de alcohol etílico absoluto.

Trasvasar la solución a un frasco volumétrico de 100 ml. y agregar a alcohol etílico absoluto

c.s.p. 100 ml.

HIDRÓXIDO DE POTASIO (KOH) 40 % AGENTE OXIDANTE

Hidróxido de potasio 40 gr.


Preparación: Pesar rápidamente el KOH y disolverlo en menos de 100 ml. de agua

destilada. Este reactivo es muy higroscópico. Colocar el vaso en un baño de agua fría

circulante para controlar la temperatura. Enfriar y transvasar la solución de KOH a un frasco

volumétrico de 100 ml. agregando agua destilada c.s.p. 100 ml. Guardar en un frasco para

reactivos color ámbar. Rotular perfectamente. Los reactivos deben ser controlados con

cultivos positivos y negativos conocidos antes de su empleo. Guardar los reactivos en el

refrigerador (4°C).

PERÓXIDO DE HIDRÓGENO AL 30 %



Conserve en un frasco ámbar, evitar la innecesaria exposición a la luz. Mantener a 4°C.

SOLUCIÓN SALINA FISIOLÓGICA 0.85 %

Cloruro de sodio (NaCl) 8.5 gr.

Agua destilada c.s.p. 1000 ml.

Disolver en agua destilada, aforar a 1000 ml. y filtrar con papel filtro Whatman No. 40

o equivalente. Esterilizar a 15 libras durante 15 minutos. Mantener en refrigeración a 4°C.

PREPARACIÓN DE HCl 0.1 NHCl 0.1 N. 3.46/ lit.

P.E. 1.192 = 37.23 gr de HCl

44.3 gr. -------- 100ml .

3.646 gr. -------- X X= 8.23 ml./lit. 4.15 ml. / 500 ml.

Titulación del HCL 0.1 N con - NaHCO3 Q.P.

Pesar 0.15, 0.20, 0.25 gr. NaHCO3

Añadir a cada porción 50 ml de H20 + III gotas de naranja de metilo; a esto dejarle caer el

HCL preparado.

Cálculos: NORMALIDAD= Gr.

Milieq.x Lit.

SOLUCIÓN VERDE BRILLANTE AL 0.1 % (SALMONELLA)

Para inhibir otras bacterias Gram. (-) que no sean Salmonella.

Preparación

Verde Brillante 0.1 gr.

Agua destilada estéril 100.0 ml.

Conservar en frasco ámbar 4°C.

ESTÁNDAR DE SULFATO DE BARIO (PARA ANTIBIOGRAMAS)



Prepare dicho estándar agregando 0.5 ml del Cloruro de Bario (BaCl2) 0.048 M

(1.175% P/V BaCl2 . 2H2O) a 99.5 ml de H2SO4 0.18 M (0.36) (1%). Mezcle agitando las

soluciones en una parrilla agitadora. Verifique la densidad correcta del estándar usando un

espectrofotómetro. La absorbancia a 625 nm debería ser 0.08-0.1 para el estándar 0.5

MacFarland. Distribuir 5 ml dentro de tubos similares a los que se van a usar para preparar los

inóculos. Para evitar la evaporación mantenga sellado los tubos y almacenados a temperatura

ambiente al abrigo de la luz. Agite vigorosamente el estándar antes de su uso para lograr una

turbidez homogénea. Remplace o verifique la confiabilidad de los estándares mensualmente.

TABLA 6. Composición de estándar para turbidez Escala de McFarland.

Estándar de

Turbidez N°-

Cloruro de Bario

diluido 1.175%

Ácido Sulfúrico

(1%)

Densidad aprox. De

bacterias por ml

0.5 0.5 ml 99.5 ml 1 x 108

1 0.1 ml 9.9 ml 3 x 108

2 0.2 ml 9.8 ml 6 x 108

3 0.3 ml 9.7 ml 9 x 108

4 0.4 ml 9.6 ml 12 x 108

5 0.5 ml 9.5 ml 15 x 108

6 0.6 ml 9.4 ml 18 x 108

7 0.7 ml 9.3 ml 21 x 108

8 0.8 ml 9.2 ml 24 x 108

9 0.9 ml 9.1 ml 27 x 108

10 1.0 ml 9.0 ml 30 x 108

Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. Cuando se

indique agua debe entenderse como agua destilada.

SOLUCIÓN BUFFER FOSFATOS PARA ALIMENTOS (PBS)



Na2HPO4 2.3 gr.

NaH2PO4 0.5 gr.

NaCl 9.0 gr.

Agua 1000 ml.

pH 7.2

Distribuir en tubos con 20 ml y esterilizar a 15°C por 15 min. Este PBS es utilizado cuando se

hacen diluciones para muestras de alimento.

AGUA PEPTONADA CONCENTRADA PARA SALMONELLA EN AVES (APC)

Peptona 10 gr.

NaCl 5 gr

Na2HPO4 3.5 gr.

KH2PO4 1.5 gr.

Agua Destilada 100 ml

Distribuir en frascos 2 ml, esterilizar a 15 lib. Por 15 min.

AGUA PEPTONADA DILUIDA PARA SALMONELLA EN CARNE MOLIDA

La misma fórmula pero para 1000 ml de agua destilada y distribuir 100 ml en frascos con tapa

de rosca. Esterilizar a 15 lib. Por 15 min.

BUFFER FOSFATOS PARA SALMONELLA EN AVES

Na2HPO4 2.3 gr.

NaH2PO4 0.5 gr

NaCl 9.0 gr.

Agua destilada 1000 ml

Distribuir 20 ml en tubos con tapa de rosca. Esterilizar 15 lib. Por 15 min.

PREPARACIÓN DE LUGOL PARA TETRATHIONATE



Yodo 6.0 gr.

Yoduro de Potasio 5.0 gr.

Mezclar

Añadir Agua Destilada 20 ml.

PREPARACIÓN DEL HIPURATO DE SODIO AL 1%

Hipurato de sodio 1 gr.

Agua destilada estéril 97 ml

Disolver y repartir en volúmenes de 400 microlitros en tubos de rosca estériles.

Congelar a -20 °C.

SOLUCIÓN DE FOSFATOS PARA MANTENER REMOJADOS LOS

ELECTRODOS

Solución A

NaH 2 PO4 2.78 gr.


Solución B

Na2HPO4 . 7H2O 5.37 gr.


Mezclar: A : 30.0 ml + B: 61 0 ML pH 7.0-7.2

SOLUCIÓN BUFFER DILUYENTE PARA BACTERIOLÓGICO DE ALIMENTOS

KH2PO4 34 gr.


Diluir 1.25 en un litro de agua destilada pH 7.2

Distribuir 9 ml en tubos con tapa de rosca.

SOLUCIONES PARA AJUSTAR pH DE MUESTRAS.



NaOH 1 M 4.0 gr. de NaOH en 100 ml de Agua Destilada

NaOH 3 M 12 gr. de NaOH en 100 ml de Agua Destilada

HCL 1 M 8.3 ml de HCl en 100 ml de Agua Destilada

HCL 0.1M 0.83 ml de HCL en 100 ml de Agua Destilada

SOLUCIÓN DE HIDRÓXIDO DE SODIO 1,0 N

Hidróxido de sodio 4,0 g

Agua 100,0 ml

Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 ml con agua.

SOLUCIÓN REGULADORA DE FOSFATOS (SOLUCIÓN CONCENTRADA)

Fosfato de sodio monobásico 34,0 g

Agua 1,0 l

Preparación: Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con

solución de hidróxido de sodio 1,0 N. Llevar a un litro con agua.

Esterilizar durante 15 minutos a 121° ± 1,0°C.

Conservar en refrigeración (solución concentrada). Tomar 1,25 ml de la solución

concentrada y llevar a un litro con agua (solución de trabajo).

Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera.

Esterilizar a 121° ± 1,0°C durante 15 minutos.

Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo

deberán ser iguales a los iniciales.

AGUA PEPTONADA



Peptona 1,0 g

Cloruro de sodio 8,5 g

Agua 1,0 l

Preparación: Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7 ± 0,1

con hidróxido de sodio 1,0 N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualquier

volumen múltiplo de nueve según se requiera. Esterilizar a 121 ± 1,0°C durante 15 minutos.

Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo

deberán ser iguales a los iniciales. Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar

en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en

condiciones tales que no alteren su volumen o composición.

V. DOCUMENTOS DE REFERENCIA



Código Nombre del documento Lugar de almacenamiento

N/AManual de Bacteriología Veterinaria. UADY. Mérida Yucatán, México. Autores: Salazar F. M del R., Echeverría C. Pilar E.(2000).

Laboratorio de Bacteriología

CAMP: Nombre que se le da a la prueba que se utiliza para la identificación

presuntiva de Streptococcus del grupo B (Streptococcus agalactiae), su significado es

Christie, Atkins y Munch-Peterson, quienes la describieron en 1944.

Nivel de revisión

Sección y/o página Descripción de la modificación y mejora Fecha de

modificación01 1 Actualización de las firmas. Octubre 2012

02

Todo el documento

Se modificó la redacción y el número de páginas de cada apartado.Se cambio la redacción de los párrafos en los apartados de todas las secciones. Se anexaron las secciones de preparación de colorantes y de soluciones.Se modifico el nombre del manual.

31/Agosto/2016

Nota: Esta sección será utilizada a partir de la primera modificación a este documento. La revisión 00, se mantendrá en blanco.

VI. GLOSARIO

VII. CONTROL DE REVISIONES

Las firmas avalan la responsabilidad de las personas que: elaboran el documento, revisan su adecuación y aprueban para su implementación dentro del Sistema de Gestión de la Calidad de la Universidad Autónoma de Yucatán

Aprobó

Dr. José Alberto Rosado AguilarResponsable del Laboratorio

Elaboró

QFB Ana Ma. Rejón MagañaTécnico Académico

Revisó

Dr. José Alberto Rosado AguilarResponsable del Laboratorio

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