uUniversitat de Lleida

Escola Tcnica Superior d'Enginyeria AgrriaDepartament de Tecnologia d'Aliments

Efecto de la Aplicacin de Pulsos Elctricosde Alta Intensidad de Campo sobre

Enzimas y Vitaminas en Leche

Silvia Bendicho PortaTesis Doctoral

Mayo 2002

(043)"2002"BEN

x:

Uajvenssat d- '

!1 -" Gsnerai

1 O MAIO 2002

Universitat de LleidaEscola Tcnica Superior d'Enginyeria Agraria

Departament de Tecnologia d'Aliments

Efecto de la Aplicacin de Pulsos Elctricosde Alta Intensidad de Campo sobre Enzimas

y Vitaminas en Leche

Memoria presentada por:

Silvia Bendicho Portapara optar al grado de Doctora

Directora: Olga Martn BellosoLleida, mayo de 2002

Este trabajo se ha realizado en la plantapiloto y en el laboratorio de NuevasTecnologas del Departamento deTecnologa de la Universidad de Lleida, y enla planta piloto y en el laboratorio deIngeniera de Alimentos del Departamentode Ingeniera de Sistemas Biolgicos de laUniversidad Estatal de Washington (WA,USA). Para su realizacin, se ha contadocon ayuda econmica del MEC y la CICYT.

RESUMEN

En la actualidad, el mtodo ms usado para la pasteurizacin de alimentos es la aplicacinde calor, aunque en estas ltimas dcadas estn surgiendo tecnologas alternativas entre lasque cabe destacar el uso de los pulsos elctricos de alta intensidad de campo (PEAIC).

Se ha visto que con esta tcnica se pueden conseguir altos niveles de inactivacinmicrobiana en leche, aunque al igual que en otros productos, hay pocos estudios acerca delefecto que produce en enzimas y componentes minoritarios. En este trabajo, se ha estudiadoel efecto de los PEAIC en una lipasa y una proteasa producidas por dos bacteriaspsicrtrofas, Pseudomonas flor escens y Bacillus subtilis, respectivamente, suspendidas enleche o solucin modelo de ultrafiltrado de leche (SMUL). Adems, se ha estudiado elefecto de los PEAIC en diversas vitaminas tanto hidrosolubles como liposolubles; para as,evaluar la efectividad de esta tcnica en la inactivacin de enzimas y el grado de alteracinque provoca en el valor nutricional de la leche.

En primer lugar, se eligieron y validaron los mtodos que iban a ser usados para lacuantificacin de las actividades de ambos enzimas y el contenido en vitaminas,observndose que en todos los casos, los mtodos resultaron fiables para el uso previsto.

La leche o la SMUL conteniendo la lipasa o proteasa se proces mediante PEAIC o calor,observndose que mediante PEAIC se pudo reducir en un elevado porcentaje la actividadde estos enzimas termoresistentes, aunque la efectividad del tratamiento dependi de lascaractersticas del medio, las condiciones de procesado y de las caractersticas del equipode tratamiento.La lipasa de Pseudomonas fluorescens suspendida en SMUL result resistente a lostratamientos trmicos de pasteurizacin, mientras que cuando se someti a tratamientosmediante PEAIC por tandas o en flujo continuo, la actividad disminuy con el aumento dela intensidad de campo (16.4-37.3 kV/cm) y el nmero de pulsos (hasta 80 pulsos). Eltratamiento por tandas fue mucho ms efectivo que el continuo, ya que aplicandodensidades de energa similares (504.97 y 424.36 kJ/1) la actividad se redujo un 62.1% y un13%, respectivamente.La proteasa de Bacillus subtilis result mucho ms resistente a los tratamientos mediantePEAIC que la lipasa estudiada, tanto en SMUL como en leche desnatada, ya que despusde aplicar hasta 500 kJ/1 en equipos diferentes se observ poca efectividad en lainactivacin de la proteasa tanto en tratamiento por tandas como en flujo continuo. Paraconseguir una inactivacin considerable del enzima se requirieron tratamientos dedensidades de energa superiores a 6000 kJ/1. La actividad del enzima suspendido en SMULo en leche (desnatada y entera) se redujo al aumentar la duracin del tratamiento (hasta895.8 u.s), la intensidad de campo (19.7-35.5 kV/cm), la densidad de energa (hasta 6786.8U/1) y la frecuencia (66.66-111.11 Hz). El medio en que los tratamientos resultaron msefectivos fue la leche desnatada, consiguindose una inactivacin del 81.1% despus de untratamiento de 6559.8 kJ/1 a 111.11 Hz. Al pasteurizar las muestras trmicamente, seobserv un comportamiento similar, ya que en condiciones de pasteurizacin alta (75C-15s) el enzima result mucho ms sensible en leche desnatada que en SMUL.En ambos casos, la reduccin de la actividad enzimtica se pudo relacionar mediantediversos modelos matemticos respecto a la densidad de energa, tiempo de tratamiento y/ointensidad de campo.

El efecto de los PEAIC en las vitaminas (tiamina, riboflavina, cido ascrbico,colecalciferol y tocoferol) en lche y SMUL, se estudi aplicando tratamientos de hasta 400(is a intensidades de campo de 18.3 a 27.1 kV/cm. El efecto tambin se compar con elresultante de aplicar diversos tratamientos trmicos. A excepcin del cido ascrbico, enningn caso se produjeron prdidas significativas del contenido en vitaminas. La lecheretuvo mayor cantidad de cido ascrbico despus de un tratamiento de 400 jas a 22.6kV/cm (93.4%) que despus de aplicar procesos trmicos de pasteurizacin baja (49.7%) oalta (86.7%). La disminucin del contenido en cido ascrbico sigui una tendencia de tipoexponencial en ambos tipos de tratamiento (PEAIC y calor). Tambin se observ que laretencin de vitamina despus de aplicar el tratamiento mediante PEAIC fue mayor enleche que en SMUL, demostrndose un efecto protector de los componentes naturales de laleche.

En este trabajo se ha probado que los PEAIC pueden ser una buena alternativa altratamiento trmico para la conservacin de leche; ya que con esta tcnica se puedenconseguir niveles altos de inactivacin de enzimas indeseables sin causar grandesalteraciones en el contenido en vitaminas.

RESUM

En l'actualitat, el mtode ms utilitzat per a la pasteuritzaci d'aliments es l'aplicaci decalor, encara que en aquestes darreres dcades estan sorgint tecnologies alternatives, entreles quals cal destacar l's dels polsos elctrics d'alta intensitat de camp (PEAIC).

En llet, s'ha vist que amb l'aplicaci d'aquesta tcnica es poden aconseguir alts nivellsd'inactivaci microbiana, encara que igual que en altres productes, hi ha pocs estudis sobrel'efecte que produeixen en enzims i components minoritaris. En aquest treball, s'ha estudiatl'efecte dels PEAIC en una lipasa i una proteasa produides per dos bacteris psicrtrofs,Pseudomonas fluorescens i Bacillus subtilis, respectivament, en llet o soluci modeld'ultrafiltrat de llet (SMUL). A ms, s'ha estudiat l'efecte dels PEAIC en diversesvitamines tant hidrosolubles como liposolubles; per aix, avaluar 1' efectivitat d'aquestatcnica en la inactivaci d'enzims i el grau d'alteraci que provoca en el valor nutricionalde la llet.

En primer lloc, es van elegir i validar els mtodes que s'utilitzarien per quantificar lesactivitats d'ambds enzims i el contingut en vitamines, observant-se que en tots els casos,els mtodes van resultar fiables pel seu s previst.

La llet o la SMUL amb la lipasa o proteasa es van processar mitjanant PEAIC o calor,observant-se que amb PEAIC es va poder reduir en un elevat percentatge l'activitatd'aquests enzims termoresistents, encara que l'efectivitat del tractament depn de lescaracterstiques del medi, les condicions de processat i de les caracterstiques de l'equip detractament.La lipasa de Pseudomonas fluorescens suspesa en SMUL va resultar resistent alstractaments trmics de pasteurizaci, mentre que quan es va sotmetre a un tractamentmitjanant PEAIC per tandes o en fluxe continu, l'activitat va disminuir amb l'augment dela intensitat de camp (16.4-37.3 kV/cm) i el nombre de polsos (fins a 80 polsos). Eltractament per tandes va ser molt ms efectiu que el continu, ja que aplicant densitats d'energia similars (504.97 y 424.36 kJ/1) l'activitat es va reduir un 62.1% i un 13%,respectivament.La proteasa de Bacillus subtilis va resultar molt ms resistent que la lipasa estudiada alstractaments mitjanant PEAIC, tant en SMUL com en llet desnatada, ja que desprs d'aplicar fins a 500 kJ/1 en tres equips diferents es va observar poca efectivitat en lainactivaci de la proteasa tant en el procs en tandes com en el continu. Per aconseguir unainactivaci considerable de l'enzim es van requerir tractaments de densitats d' energiasuperiors a 6000 kJ/1. L'activitat de l'enzim susps en SMUL o en llet (desnatada i sencera)es va reduir amb 1' increment de la duraci del tractament (fins a 895.8 (is), la intensitat decamp (19.7-35.5 kV/cm), la densitat d'energia (fins a 6786.8 kJ/1) i la freqncia (66.66-111.11 Hz). El medi en que els tractaments van resultar ms efectius va ser la lletdesnatada, on es va aconseguir una inactivaci del 81.1% desprs d'un tractament de6559.8 kJ/1 a 111.11 Hz. Al pasteuritzar les mostres trmicamente es va observar uncomportament similar, ja que en condicions de pasteurizacin alta (75C-15 s) l'enzim varesultar molt ms sensible en llet desnatada que en SMUL.En ambds casos, la reducci de l'activitat enzimtica es va poder relacionar mitjanantdiversos models matemtics respecte a la densitat d'energia, temps de tractament i/ointensitat de camp.

L'efecte dels PEAIC en les vitamines (tiamina, riboflavina, cid ascorbic, colecalciferol itocoferol) en llet i SMUL, es va estudiar aplicant tractaments de fins a 400 (is a intensitatsde camp de 18.3 a 27.1 kV/cm. L'efecte tamb es va comparar amb el resultant d'aplicardiversos tractaments trmics. A excepci de l'cid ascorbic, en cap cas es va produirprdues significatives del contingut en vitamines. La llet va retenir major quantitat d'cidascorbic desprs d'un tractament de 400 |j.s a 22.6 kV/cm (93.4%) que desprs d'aplicarprocessos trmics de pasteuritzaci baixa (49.7%) o alta (86.7%). La disminuci delcontingut en cid ascorbic va seguir una tendncia de tipus exponencial en ambds tipus detractament (PEAIC i calor). Tamb es va observar que la retenci de vitamina desprs d'aplicar el tractament mitjanant PEAIC va ser ms alta en llet que en SMUL, demostrant-seun efecte protector dels components naturals de la llet.

En aquest treball s'ha provat que els PEAIC poden ser una bona alternativa al tractamenttrmic per la conservacin de llet; ja que amb aquesta tcnica es poden aconseguir nivellsalts d'inactivaci d'enzims indesitjables sense causar grans alteracions en el contingut envitamines.

SUMMARY

Nowadays, the most used method for food pasteurization is the application of heat.Nevertheless, in the last decades, several alternative technologies are emerging and one ofthe most promising is high intensity pulsed electric fields (HIPEF).

In milk, high levels of microbial destruction can be achieved using this technology.However, as for other products, few studies exist about the effect of HIPEF on enzymesand other minor food components. In this work, the effect of HIPEF on a lipase and aprotease produced by the psychrothophic bacteria Pseudomonas fluorescens and Bacillussubiilis, suspended in milk or simulated milk ultrafiltrate (SMUF) has been studied. Theeffect of HIPEF on several hidro or liposoluble vitamins has also been studied in order toknow the effectiveness of this technology in inactivating undesirable enzymes and thechanges that cause on the nutritional value of milk.

First or all, the methods required for the quantification of enzyme activities and vitamincontent were chosen and validated. It was observed that in all the cases, the methodsresulted reliable for their use.

Milk or SMUF samples containing lipase or protease were processed by HIPEF or heat.HIPEF could reduce quite a lot the activity of this thermorsistant enzymes, althoughtreatments effectiveness depended on the medium characteristics, process conditions andequipment configuration.Lipase from Pseudomonas fluorescens suspended in SMUF resulted resistant to thermalpasteurization, whereas when subjected to a batch or a continuous mode HIPEF treatment,its activity decreased with the increase of the field strength (16.4-37.3 kV/cm) and thenumber of pulses (up to 80 pulses). The batch mode treatment was much more effectivethan that on continuous mode, since after applying similar energy densities (504.97 and424.36 kJ/1) the activity was reduced a 62.1% and a 13%, respectively.Protease from Bacillus subtilis resulted much more resistant than the evaluated lipase toHIPEF processes whatever was the treatment medium (SMUL, skim milk). After FflPEFtreatments of up to 500 kJ/1 using different equipments (batch or continuous), loweffectiveness on protease inactivation was observed. To achieve a notable level of enzymeinactivation, treatments of energy densities higher than 6000 kJ/1 were required.Protease activity suspended in SMUF or milk (skim or whole milk) subjected to HIPEFdecreased with the increase of the treatment duration (up to 895.8 (as), field strength (19.7-35.5 kV/cm), energy density (up to 6786.8 kJ/1) and the pulse repetition rate (66.66-111.11Hz).Treatments resulted more effective in skim milk than in SMUF and whole milk, since up toa 81.1% inactivation was achieved after a HIPEF treatment of 6559.8 kJ/1 at 111.11 Hz.When samples were processed thermally, a similar behavior was observed, since theenzyme resulted more sensitive in skim milk than in SMUF after a pasteurization process(75C-15 s).In both cases, the reduction of enzyme activity could be fitted to several mathematicalmodels related to the energy density, treatment time and/or field strength.

The effect of HIPEF on vitamins (thiamin, riboflavin, ascorbic acid, cholecalciferol andtocopherol) in milk and SMUF, was studied by applying treatments of up to 400 (is at fieldstrengths form 18.3 to 27.1 kV/cm. The effect of HIPEF on vitamins was also compared tothat of thermal pasteurization. Only ascorbic acid showed changes on its content afterHIPEF or thermal treatments. Milk retained higher levels of ascorbic acid after a HIPEFtreatment of 400 (is at 22.6 kV/cm (93.4%) than after thermal pasteurization processes of63C-30 min (49.7%) or 75C-15 s (86.7%). Ascorbic acid content reduction followed anexponential model in both cases (HIPEF and heat). It was also observed that vitaminretention after a HIPEF treatment was higher in milk than in SMUF, demonstrating aprotective effect of milk components.

In this work, it has been proved that HIPEF might be a good alternative to thermal processfor food preservation. Using this technology, high levels of enzyme inactivation can beachieved without causing important changes in the vitamin content.

INDICE

INTRODUCCINI. La leche: Composicin, microorganismos y enzimas alteradores y

procesado trmico 1

II. Pulsos elctricos de alta intensidad de campo. Tecnologa delproceso 23

m. Procesado de leche mediante pulsos elctricos de alta intensidad decampo 36

IV. Validacin de mtodos analticos 53

OBJETIVOS 62

PUBLICACIONES

1. Validation and comparison of analytical methods based on therelease of p-nitrophenol to determine Upase activity inmilk. 63

2. Determination of proteolytic activity in different milksystems 77

3. Effects of high intensity pulsed electric field and thermal treatmentson a lipase from Pseudomonasfluorescens 87

4. Inactivation kinetics of a lipase from Pseudomonas fluorescensexposed to high intensity pulsed electric fields 106

5. High intensity pulsed electric fields and heat treatments on aprotease from Bacillus subtilis. A comparison study with multiplesystems 119

6. Reduction of protease activity in simulated milk by continuous flowhigh intensity pulsed electric field treatment 136

7. Reduction of protease activiy in milk by continuous flow highintensity pulsed electric field treatments 152

8. Effect of high intensity pulsed electric fields and heat treatments onvitamins of milk. 165

DISCUSIN GENERAL 179

CONCLUSIONES 192

INTRODUCCIN

LA LECHE:

> Composicin

> Microorganismos y enzimasalteradores

> Procesado trmico

Introduccin

CONSIDERACIONES GENERALES.

Segn el captulo 15 del Cdigo Alimentario Espaol de 1982, la leche natural es "elproducto ntegro, no alterado ni adulterado y sin calostros, del ordeo higinico, regular,completo e ininterrumpido de las hembras mamferos, domsticas, sanas y bienalimentadas". Aunque la leche puede tener orgenes muy diferentes, siempre debe tenerunas caractersticas fsicas ms o menos constantes (Tabla 1) (Luquet, 1991).

La leche se puede considerar un liquido alimentario, blanco y opaco; aunque, en algunoscasos, puede presentar una tonalidad ligeramente amarillenta. Debe tener un saborcaracterstico, puro, suave, fresco y ligeramente dulzn, as como un olor igualmentecaracterstico y puro (Spreer, 1991). Los mtodos modernos de obtencin y refrigeracin dela leche en la granja han contribuido, de forma muy importante, a la conservacin del gustocaracterstico de la leche (Amiot, 1991). La consistencia de la leche {coherencia entre suspartculas) es homognea y debe carecer de grumos y copos (Spreer, 1991).

Tabla 1. Caractersticas fsicas de la leche (Luquet, 1991).Parmetro Valores

pH 6.5 - 6.7Acidez valorable 15 - 18 DomicDensidad 1.028 -1.036 g/mlTemperatura de congelacin 0.51 a -0.55 Cndice de refraccin 1.3440 -1.3485Tensin superficial 50 dinas-cm"1 a 20 CPotencial redox 10 - 20 VConductividad elctrica 4 - 5,5 mS/cm a 25 C, (Spreer, 1991).Viscosidad 1,79-2,13 mPa-s a20C (Spreer, 1991)

COMPOSICIN DE LA LECHELa leche es un fluido biolgico complejo, cuya composicin y propiedades fsicas

varan de una especie a otra en funcin de las necesidades dietticas de las cras (Varaam,1995), as como tambin existe un amplio margen de variacin dentro de la especie, eincluso entre individuos de una raza de la misma especie (Porter, 1980).

De todos es sabido que la leche ofrece unos constituyentes integrados por agua en sufraccin lquida y en la que se hallan en suspensin o disolucin tanto componentesnutritivos energticos (grasas e hidratos de carbono) como elementos nutritivos plsticos(protenas y minerales). Entre los biocatalizadores figuran pigmentos, enzimas y vitaminas.De hecho, la leche contiene cantidades adecuadas de casi todas las vitaminas necesariaspara el funcionamiento correcto de los procesos bioqumicos que se producen en elorganismo humano y que son esenciales para la vida. Es, sin duda, el mejor alimento

Introduccin

natural porque cuenta con cantidades relativamente importantes de unos 55 nutrientesesenciales para el hombre. Asimismo, se hallan en disolucin gases como oxigeno,nitrgeno y anhdrido carbnico (Santo Domingo, 1993). Sin embargo, no es un alimentocompleto; la leche, con independencia de su origen, es deficitaria en vitamina D y en hierro(Porter, 1980).

En la Tabla 2 se refleja la composicin general de la leche de vaca segn Alais (1985).Los datos cuantitativos que se recogen son slo aproximados, ya que varan en funcin demltiples factores. De hecho, debe quedar claro que la composicin exacta de una muestrade leche nicamente se puede conocer mediante su anlisis qumico pormenorizado (Amiot,1991).

Tabla 2. Composicin tpica de la leche de vaca (Alais, 1985).Composicin

(g/1) Estado fisico de los componentes

Agua 905 Agua libre (disolvente + agua ligada (3,7%) Glcidos: lactosa 49 Solucin

Lpidos 35Materia grasa propiamente dicha. 34 Emulsin de los glbulos grasos (3 a 5 mieras)Lecitina (fosfolpdos) 0,5Parte insaponifcable (esterles,carotenos, tocoferoles) 0,5

Prtidos 34 Suspensin micelar de fosfocaseinato de calCasena 27 (0,08 a 0,12 mieras)Prtidos "solubles" (globulinas,albminas) 5,5 Solucin (coloidal)

Sustancias nitrogenadas noproteicas 1,5 Solucin (verdadera)

Sales 9 Solucin o estado coloidal ( P y Ca)Del cido ctrico (en cido) 2 (Sales de K, Ca, Na, Mg, etc.)Del cido fosfrico (PiOs) 2,6Del cido clorhdrico (NaCl) 1,7

Componentes diversos (vitaminas,enzimas, gases disueltos) indicios

Extracto seco (total) 127 Extracto seco desengrasado 92

Introduccin

La leche puede considerarse como un sistema coloidal constituido por una solucinacuosa de lactosa (5%), sales (0,7%) y muchos otros elementos en disolucin, donde seencuentran suspendidas las protenas (3,2%) y la materia grasa en emulsin. El extractoseco total de la leche es por trmino medio del 13,1 % y el extracto seco desengrasado del9,2 % (Amiot, 1991).

La caracterstica esencial de la leche es el equilibrio en que se encuentran suscomponentes, lo que le proporciona un inestimable valor nutritivo y buena digestibilidad.Por ello, su presencia es necesaria en dietas de personas de edades y de situaciones crticascomo la infancia o, en el otro extremo, la ancianidad; situaciones de patologas de diferenteetiologa y tambin en situaciones fisiolgicas especiales, como la gestacin o la lactacin.As pues, no cabe la menor duda de que las cualidades nutricionales de la leche sonexcelentes, lo cual la convierte en un alimento de importancia bsica (Santo Domingo,1993).

Lpidos

De todos los componentes de la leche, la fraccin que ms vara es la formada por lasgrasas, estando en una proporcin que oscila entre el 3,2 y el 6%. Entre los diversosfactores que influyen sobre el "porcentaje graso" se encuentran la diferente alimentacin, elalojamiento, el estado sanitario y las caractersticas individuales de las vacas lecheras(Spreer, 1991).

La composicin de la grasa de la leche es compleja. Aunque est dominada portriglicrdidos (98% de la grasa de la leche), pequeas cantidades de diglicridos,monoglicridos y cidos grasos libres, tambin contiene otras clases de lpidos; entre losque se incluyen fosfolpidos, cerebrsidos y esterles (colesterol y esteres de colesterol).Tambin se encuentran pequeas cantidades de vitaminas liposolubles (principalmente, A,D y E) y componentes del flavor (lactonas, aldehidos y cetonas).

Las proporciones de los diferentes cidos grasos, de los distintos tipos de fosfolpidos yde las diversas sustancias insaponificables no son fijas y de ello resultan las variaciones quepueden presentar las propiedades de la materia grasa de la leche (Alais, 1985).

Protenas

Las protenas constituyen alrededor del yj/o uci muugeno de la leche, lo que suponeunos 32 g de protena/kg de leche. De ellas, el 76-86% est constituido por las casenas quese encuentran en la leche en forma micelar correspondiendo el resto a las seroprotenas y aun grupo de enzimas y protenas minoritarias (Calvo, 1989).

Bajo la denominacin genrica de casenas se agrupan una serie de protenas queprecipitan a pH 4.6 y presentan por lo menos un enlace ster-fosfato en su molcula. Seagrupan 4 tipos de cadenas polipeptdicas denominadas asi, ctsz, P y K casena, y una seriede derivados formados por la forforilacin, transglicosilacin, o la simple proteolisis(Veisseyre, 1988).

Introduccin

Las seroprotenas o protenas del suero son las protenas que permanecen en el suerodespus de llevar el pH de la leche a 4.6. Todas ellas poseen en comn una estructuraglobular y son trmicamente inestables (Veisseyre, 1988). Estn la p-Iactoglobulina (p-lg),ot-lactoalbmina (a-la), inmunoglobulinas y seroalbmina (SA), en orden de concentracindecreciente (Veisseyre, 1988).

Tambin existen otras protenas minoritarias entre las que se incluyen protenas comolactoferrina y tranferrina, microglobulina p2, glicoprotenas acidas, etc (Amiot, 1991).

Carbohidratos

Los carbohidratos de la leche estn constituidos casi exclusivamente por lactosa, esta seencuentra en una concentracin de 45-50 g/1 en el suero lcteo. En el suero tambin seencuentran otros azcares en menor proporcin como: monosacridos, principalmenteglucosa y galactosa; oligosacridos neutros que contienen glucosa y lactosa y puedenencontrarse libres o combinados; oligosacridos cidos; fosfatos de azcares como pentosafosfato, glucosa 1-fosfato, etc.; N-glucsicos, se cree que son intermediarios de la sntesisde glicoprotenas (Veisseyre, 1988).

Adems de los azcares presentes en el suero, existen glcidos unidos a lpidos oprotenas en las unidades estructurales de la leche (ncelas de casena y glbulos grasos).

Vitaminas

Las vitaminas pueden definirse como compuestos orgnicos que el organismo necesitaen pequeas cantidades para los procesos metablicos (Talanen, 1995). Estas no secorrelacionan entre s, ni qumica ni fimcionalmente y cada una de ellas desempea en elorganismo su propia funcin y no puede ser substituida por ninguna otra substancia. Lasvitaminas son acalricas, es decir, no generan energa directamente. Adems, el organismono puede producir cantidades suficientes de vitaminas para cubrir sus necesidades y cuantoms desarrollado est el animal menos vitaminas sintetiza (Talanen, 1995).

Las funciones biolgicas de las vitaminas en algunos casos no estn del todo claras perose sabe que en muchos casos stas forman parte de algunos sistemas enzimticos,coenzimas y catalizan reacciones qumicas del metabolismo de los alimentos. Tambin,muchas veces cooperan entre s y con diversos minerales y cidos grasos, lo cual quieredecir que si se toman juntas su efecto es mayor que si se toman por separado (Walstra yJeness, 1987; Talanen, 1995).

La clasificacin de las vitaminas es muy dificil puesto que tienen muy pocascaractersticas en comn. Pero, se suelen clasificar en dos grandes grupos segn susolubilidad: vitaminas hidrosolubles y vitaminas liposolubles (Veisseyre, 1988).

Introduccin

Vitaminas Hposolubles

Las vitaminas que componen este grupo son: La vitamina A, D, E y K. Las fuentes msricas son las grasas, los aceites vegetales, la verdura y los lpidos de la carne, de losderivados lcteos y de los huevos (Talanen, 1995).

Estas vitaminas son aquellas que son solubles en disolventes orgnicos o en grasas einsolubles en el agua. Entre ellas tienen pocas caractersticas en comn, pero todas soncompuestos orgnicos con grupos hidrfobos y constan de una estructura qumica bsicaformada por la condensacin de molculas de isopropeno, es decir, tienen caractersticaterpnica (Badui, 1986).

En la leche, el contenido de vitamina A y de vitamina D dependen de la alimentacin yde las radiaciones solares que ha tenido el ganado; las vitaminas E y K estn en trazas. Engeneral, todas ellas son estables a los tratamientos trmicos (Yufera, 1987) (Tabla 3). Todasellas estn presentes en la leche, pero desde el punto de vista nutritivo, la de mayorimportancia es la vitamina A, ya que aporta aproximadamente el 13% de nuestrasnecesidades (Amiot, 1991).

Vitamina A. La vitamina A (retinol) es una sustancia indispensable para la visin y elbuen estado de las mucosas, y tiene una accin antiinfecciosa. El retinol se forma porescisin de los carotenoides (provitamina A). Los vegetales sintetizan carotenoides pero noretinol; los animales no pueden sintetizar carotenoides pero los escinden a retinol. Elcontenido de la leche en vitamina A vara mucho entre la alimentacin de verano (hierbarica en caroteno) y de invierno (heno y races, muy pobres en caroteno). El calostrocontiene unas diez veces ms de vitamina que la leche. La leche y particularmente lamantequilla son una de las principales fuentes de vitamina A para el hombre. Esta vitaminaes estable al calor (Alais, 1985; Walstra y Jeness, 1987; Fox y McSweeney, 1998).

f] la esattri pof este puntoI I da dos molculas de tetirt

I-Caroteno

Figura 1. Estructura del retinol y del p-caroteno.

Introduccin

Vitamina D. La vitamina D comprende varias sustancias con actividad antirraqutica.En los vegetales hay ergocalciferol (D2) que se forma por irradiacin UV del ergosterol. Elcolecalciferol (D^) se origina en los animales por irradiacin UV del 7-dehidrocolesterol,especialmente de la piel (Figura 2). En la leche hay tanta D2 como D3 que procedenrespectivamente del pienso y de la irradiacin de la piel de la vaca. El contenido devitamina D de la leche es muy variable, pero siempre bajo. La vitamina D es estable altratamiento trmico de la leche (Alais, 1985; Walstra y Jeness, 1987; Fox y McSweeney,1998).

Figura 2. Estructura del colecalciferol

Vitamina E. La vitamina E est constituida por un grupo de tocoferoles; en la leche, elprincipal es el a-tocoferol (Figura 3). Se trata de un potente reductor que sirve deanlioxidante protegiendo a los lpidos de la oxidacin. El contenido de vitamina E de laleche es bajo. Depende, hasta cierto grado, del pienso; la leche de verano tienegeneralmente una mayor concentracin que la de invierno. Es estable al calor pero puededestruirse parcialmente iluminndola intensamente en presencia de 02 (Alais, 1985; Fox yMcSweeney, 1998).

H

Tocofo*>

a- R,rH..R :CHi.R,CH,Ji- K, -Cil,. Rj- 11. K, - tit,Y- R, H, R, CH,. R, CH,6- K, *H.Ri~H.RiCHt

Figura 3. Estructura de los diferentes tocoferoles

Introduccin 8

Vitamina K. La vitamina K tiene funcin antihemorrgica, su ausencia provocatrastornos en la coagulacin sangunea debido a la insuficiencia de protrombina. En laleche, si aparece, slo se encuentra en cantidades vestigiales. Las necesidades humanas deesta vitamina se cubren al ingerir vegetales que la contienen y por sntesis microbiana en eltracto digestivo (Walstra y Jeness, 1987; Fox y McSweeney, 1998).

Vitaminas hidrosolubles,

Las vitaminas que constituyen este grupo son las vitaminas del grupo B (Bi, B2, B6,B12, niacina, cido pantotnico, biotina y cido flico) y la vitamina C (Fox y McSweeney,1998).

Este grupo de vitaminas son aquellas que se encuentran disueltas en la fase acuosa delos alimentos. Se deben aportar diariamente en la dieta puesto que el sistema metablico nopermite su acumulacin sino que los excedentes son eliminados con la orina (Aurand et al.,1987). La mayora de estas vitaminas actan como coenzimas de diferentes sistemasenzimticos en procesos metablicos (Fox y McSweeney, 1998).

Otra caracterstica es que debido a su alta solubilidad se eliminan con gran facilidad porlixiviacin a travs de tratamientos por los que el alimento pierde agua, por ejemplo,durante la descongelacin de los productos, lavado, tratamientos trmicos y deshidratacin(Badui, 1986) (Tabla 3).

Las vitaminas hidrosolubles presentes en la leche, en su gran mayora, han sidosintetizadas por las bacterias del rumen y su concentracin en ella vara muy poco (Primo,1987) (Tabla 3). La riboflavina o vitamina B2 es la ms importante, ya que puede aportarhasta el 41% de nuestras necesidades diarias. La leche cubre ms del 20% de nuestrasnecesidades en cianocobalamina (vitamina B12). Tambin contienen cantidades apreciablesde otras vitaminas hidrosolubles como la vitamina BI o tiamina (9% de las RDA), vitaminaB6 o piridoxina (10% de las RDA) y cido ascrbico o vitamina C (4% de las RDA)(Amiot, 1991). (RDA=Recommended Dietary Allowances).

Vitamina Bj. La vitamina BI (tiamina) se presenta en la leche en gran parte en estadolibre, pero una porcin (18-45%) est fosforilada y una pequea proporcin unida a laprotena (Figura 4). La forma biolgicamente activa de la tiamina es su pirofosfato, queacta como enzima de la carboxilasa; en la leche no se encuentra en este estado; la porcinfosforilada probablemente es el pirofosfato. En los bvidos, las bacterias del aparatodigestivo pueden sintetizar esta vitamina, por tanto, el contenido de tiamina de la leche nose afecta apenas por el pienso de la vaca, ni por la estacin del ao, ni por la raza; aunque laproporcin de tiamina es mayor al comienzo de la lactacin. Los tratamientos trmicos y laexposicin a la luz y al O2 provocan una disminucin del contenido en tiamina (Walstra yJeness, 1987; Veisseyre, 1988; Fox y McSweeney, 1998)

Introduccin

HjN

TUntina (Vitamina B,)

Figura 4. Estructura de la tiamina

Vitamina B2. La vitamina B2 (riboflavina) aparece en la leche principalmente en estadolibre (65-95%) y la mayora de la restante se encuentra formando parte del coenzima flavin-adenin-dinucletido (FAD) y posiblemente, una porcin est en forma de riboflavin-5'-fosfato (o flavin mononucletido, FMN) que intervienen el el proceso de oxidacin celularde donde procede la energa necesaria para el mantenimiento de la vida (Figura 5). Elporcentaje de esta vitamina suele ser poco variable, sin embargo, se eleva un poco con laalimentacin de primavera y principios de verano. Como algunas otras vitaminashidrosolubles, la riboflavina es sintetizada por la microflora del rumen. Para el hombre, laleche constituye la fuente ms importante de riboflavina. La concentracin en el calostro esde dos a cuatro veces la de la leche. La riboflavina es estable al calor y a la presencia deoxigeno a pH cido; pero en condiciones alcalinas es bastante termolbil. El factor que msafecta en la estabilidad de la riboflavina es la exposicin a la luz. Es el principalcomponente fotolbil de la leche (Alais, 1985; Walstra y Jeness, 1987; Veisseyre, 1988;Fox y McSweeney, 1998).

1 CH.----CHjOHI 1 H H H

ORibofUviiu (Tituniiu B,)

Figura 5. Estructura de la riboflavina

Vitamina B6. La vitamina B6 consta de tres componentes activos (piridoxina, piridoxaly piridoxamina) que constituyen una importante coenzima del metabolismo de losaminocidos (Figura 6). En la leche, se encuentra, principalmente, en forma de piridoxal. Elcontenido de vitamina B6 en leche es algo mayor cuando las vacas se encuentran en elinicio de la poca de pastos y tambin es ms alto en los periodos avanzados de lactacin.Es sensible al calor y a la luz (Alais, 1985; Walstra y Jeness, 1987; Fox y McSweeney,1998).

Introduccin 10

HrNK,,CH,OH HO

Figura 6. Formas activas de la vitamina B: piridoxina, piridoxal y piridoxamina.

Vitamina B12. La vitamina Bi2 (cobalamina) es la nica vitamina que contiene unmetal: un tomo de Co. El contenido de esta vitamina en la leche depende en gran parte dela ingestin de Co por la vaca. La nica o al menos la fuente predominante de vitamina B nde la leche, es su biosntesis por los microorganismos del rumen. La leche es una fuenterelativamente importante de vitamina Bn. Su contenido vara mucho con la alimentacin, laraza, la poca estacional y el estado de lactacin, salvo en el caso del calostro, dondeabunda. Esta vitamina es bastante estable al calor (dependiendo del tipo de tratamiento) ytotalmente a la exposicin a la luz (Walstra y Jeness, 1987; Fox y McSweeney, 1998).

Niacina. La niacina (cido nicotnico) y su amida, niacinamida (nicotinamida)constituyen una vitamina que en forma de nucletidos (NAD+ y NADP+) acta comocoenzima de muchas deshidrogenasas. La vitamina se encuentra en la leche,principalmente, como niacinamida. Las diferencias en concentraciones atribuibles al pienso,raza, poca estacional y fase de lactacin no son grandes ni constantes. La vitamina esbastante estable a la exposicin al aire, a la luz y al calor.

La leche es pobre en niacina propiamente dicha, pero es sabido que muchos animales,incluido el hombre, sintetizan niacina a partir del triptfano; y la leche, por su contenido entriptfano, es una buena fuente de equivalentes de niacina (Alais, 1985; Walstra y Jeness,1987; Veisseyre, 1988; Fox y McSweeney, 1998).

cido pantotnico. El cido pantotnico es el constituyente esencial del coenzima A,que estimula la sntesis de acetilcolina, de colina y de diversos aminocidos. Toma partetambin en la sntesis de los cidos grasos y en el metabolismo de los glcidos. La floraintestinal humana puede sintetizar una parte de las necesidades. La leche constituye, sinembargo, una fuente muy interesante de cido pantotnico. Su contenido en la lechedepende de la alimentacin, la raza, de la poca estacional y del estado o fase de lactacin.Es estable al calor y a la luz (Alais, 1985; Walstra y Jeness, 1987; Veisseyre, 1988).

Biotina. La biotina (o vitamina H) es sintetizada por los microorganismos del rumen ydel intestino de la vaca. La concentracin de biotina de la leche es relativamente constante.La biotina es estable durante el procesado y almacenamiento de la leche (Walstra y Jeness.1987; Veisseyre, 1988; Fox y McSweeney, 1998).

cido flico. El cido flico se encuentra en la leche principalmente como 5-metiltetrahidrofolato. LA leche contiene una protena especfica que liga especfica yfuertemente el folato aumentando su biodisponibilidad. Esta vitamina es relativamente

11 Introduccininestable, ya que se pierde por calentamiento, exposicin al 2 o a la luz. La protege elascorbato, que tambin es muy sensible (Walstra y Jeness, 1987; Fox y McSweeney, 1998).

Vitamina C. La vitamina C (cido L-ascrbico) tiene poco inters como vitamina en laleche de vaca, debido a su baja concentracin en comparacin con las necesidades humanasy a su labilidad frente al calor y la oxidacin. El cido L-ascrbico de la leche procede delos alimentos y de la biosntesis heptica; es importante en los fenmenos de oxidacin-reduccin. La oxidacin del ascorbato a dehidroascorbato es reversible, por lo tanto lapotencia vitaminica C de la leche es la suma de ambos. Al segregarse la leche solamentepresenta cido L-ascrbico pero la oxidacin origina pronto dehidro-L-ascorbato (Figura 7);la luz, mediante su influencia en la riboflavina, favorece la oxidacin. Tambin es sensiblea los tratamientos trmicos y a la presencia de O2 (Alais, 1985; Walstra y Jeness, 1987; Foxy McSweeney, 1998).

CH,OH

HCOH

oxidacin

diccin

cido (khidroascibko

Figura 7. Reaccin reversible de oxidacin de la vitamina C

Tabla 3. Contenido medio en vitaminas de la leche fresca de vaca ynecesidades diarias de un hombre de 20-39 aos (Yufera, 1987; Mataix, 1996).

Contenido Necesidades(mg/100 mi) (mg)Vitaminas

Vitamina A (Ul/1 00 mi)*Vitamina D (UI/ 100 ml)*Vitamina EVitamina KTiaminaRiboflavinaVitamina BgVitamina B nMacinaAcido pantotnicoBiotinaAcido flicoVitamina C

1592.210.100

0.004670.040.170.06

0.00420.090.340.0030.0059

2.09

1.80.05

12

1.21.81.8

0.00220

0.260

UI: unidad internacional (0.3 ng de retinol; 0.025 u.g de vitamina D)

Introduccin 12

MICROORGANISMOS ALTERADORES DE LA LECHE

Aunque tericamente la leche al salir del pezn debera ser estril, siempre contiene de100 a 10 000 bacterias por mi La poblacin media se sita alrededor de 1.000 mi"1, pero losdatos son muy variables (Amiot, 1991) Las tasas y tipos de microorganismos presentes enla leche cruda reflejan la contaminacin y proliferacin microbiana ocurrida durante suordeo, almacenamiento y transporte El recuento total mximo tolerado en leches de cuartacategora es de IO6 mi"1 (M Agricultura, Pesca y Alimentacin, 1985)

La incidencia de los principales grupos microbianos en leche cruda vara dependiendo delas fuentes de contaminacin existentes, de la estacin del ao y de los mtodos de limpiezay desinfeccin de los equipos empleados en las granjas En leche cruda de buena calidadmicrobiolgica, es frecuente que los micrococos y estreptococos sean los dos gruposmicrobianos ms abundantes de la flora inicial (Cousins y Bramley, 1987)

La leche cruda puede ser un vehculo importante de transmisin de microorganismospatgenos al hombre, entre ellos destacan Mycobactermm tuberculosis, Brucella abortus,Escherichia coli, Coxiella burnettt, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus y Clostridiumperfrmgens Todos ellos se destruyen durante la pasteurizacin, aunque el gnero Bacillus yClostridium pueden llegar a soportar dicho tratamiento debido a la capacidad que tienen deformar esporas (Cousins y Bramley, 1987)

El empleo generalizado de la refrigeracin para preservar la calidad inicial del productocrudo hasta el momento de su tratamiento, a temperaturas entre 4 y 7C, ha hecho que laduracin de su vida td y la de los productos lcteos procesados est, hoy por hoy,estrechamente ligada a la presencia y accin de las bacterias psicrtrofas (Bishop y White,1986)

Flora psicrtrofa

Cuando la leche cruda se obtiene higinicamente, el nmero de bacterias psicrtrofas nosuele representar ms del 10 % del total de la microflora inicial (Suhren, 1989), por lo quesu presencia en la leche, por tanto, resulta normalmente de una contaminacin exgenaDada la gran ubicuidad de los microorganismos psicrtrofos, las fuentes de contaminacinson numerosas y variadas a partir del aire, cuando el ordeo se realiza a mano, y cuando lamama y el pezn no son bien lavados tras el ordeo, a travs de la instalacin de ordeo, deun mal diseo de las tuberas, de un estado defectuoso de las ordeadoras, a travs delmaterial de lechera insuficientemente desinfectado o en mal estado, equipo de recogida,etc (Veisseyre, 1988) As, en condiciones deficientes de produccin se estima que suproporcin puede llegar a superar el 75 % (Thomas y Thomas, 1973) La cantidad deenzimas bacterianos presentes en la leche est determinada por el tiempo y condiciones deconservacin que ha sufrido (Law, 1979)

La mayor parte de las bacterias psicrtrofas son Gram-negativas y los gneros msfrecuentemente identificados son Pseudomonas, Alcalgenes, Serrana, Chromobactermm yFlavobactenum (Thomas y Thomas, 1973)

13 Introduccin

Como consecuencia de un prolongado mantenimiento en fro, a pesar de que la lechetenga una buena calidad bacteriolgica, igual que en el caso de que la leche cuente con unacontaminacin inicial elevada, se produce una preponderancia del gnero Pseudomonas.(Cousin, 1982; Griffiths et al., 1989; Griffiths y Phillips, 1984; Walker y Gingold, 1988;Cousins y Bramley, 1987). Pseudomonas es el gnero ms abundante, llegando a constituirms del 50 % de todos los organismos Gram-negativos presentes (Stadhouders, 1975;Suhren, 1989). Dentro del gnero Pseudomonas, la especie P. fluorescens es lapredominante en leche, aunque tambin abundan P. putida, P. fragi y P. aeruginosa(Cousins y Bramley, 1987; Suhren, 1989). Tambin, aunque en menor proporcin, seencuentran bacterias psicrotrofas Gram-positivas de los gneros Arthrobacier, Bacillus,Micrococcus, Lactobacillus y Streptococcus (Lactococcus) (Cousin, 1982).

La mayora de bacterias psicrotrofas presentes en la leche producen lipasas y/o proteasasque pueden causar determinadas alteraciones organolpticas, que se observan en elproducto final, incluso despus de morir los organismos responsables al someter la leche apasteurizacin (Visser, 1981; Cousin, 1982; Janzen et al., 1982; McKellar y Cholette, 1984;Varnam y Sutherland, 1995). Adems, estos microorganismos pueden proceder de unacontaminacin posterior, multiplicndose durante la elaboracin y el almacenamiento delproducto (Bishop y White, 1986).

Lipasas y proteasas producidas por microorganismos psicrtrofos

Muchas de las especies bacterianas presentes en la leche, entre ellas Pseudomonasfluorescens, producen lipasas del tipo glicerol ester hidrolasa (EC 3.1.1.3). Estas lipasashidrolizan los esteres de glicerol preferentemente con cadenas largas de cidos grasos(Figura 8) y actan en la interfase que se forma por la presencia de un sustrato lipdico(hidrofbico) en un medio acuoso (hidroflico) (Jaeger et al., 1994; Wong, 1995, Svendsen,2000).

3 HjO

r-OH

OH

IOH

Figura 8. Reaccin enzimtica de la lipasa, donde cataliza la hidrlisis de un triacilglicerol.

Normalmente, las lipasas bacterianas pueden hidrolizar completamente un triacilglicerolaunque se ha observado cierta preferencia por los esteres primarios.

Las diferentes lipasas bacterianas tienen pocas similitudes en su estructura primaria. Sinembargo, en su estructura tridimensional se observa que la mayora tienen un estructuraplegada o/3-hidrolasa; el centro catalitico se oculta dentro de una protena que contiene una

Introduccin 14

trada de aminocidos caracterstica y el centro activo esta cubierto por una estructura et-hlice en forma de tapadera que se mueve cuando la lipasa entra en contacto con el sustrato.

Esta estructura explica a nivel molecular lo especfico que es el fenmeno de la activacininterfacial. Los iones Ca2+ son de importancia para estabilizar la estructura tridimensional ytienen influencia en la activida enzimtica (Jaeger et al., 1994; Wong, 1995, Svendsen,2000).

El trmino proteasa se refiere a todos los enzimas que hidrolizan enlaces peptdicos. Estegrupo de enzimas se puede dividir en exo y endopeptidasas, segn si escinden las molculasprogresivamente desde el final de la cadena o en puntos especficos en el medio de lacadena, respectivemente. Las endopeptidasas tambin son conocidas como proteinasas(Figura 9) (Wong, 1995; Bugg, 1997).

R |H OPptido NH-JSI r-v^ NH- Pptido

of R'

Figura 9. Reaccin catalizada por una endopeptidasa

Las proteinasas se han clasificado en cuatro tipos segn los grupos encontrados en elcentro activo y que llevan a cabo la catlisis: serina (EC 3.4.21), cistena (EC 3.4.22),asprtico (3.4.23) y metaloproteinasas (EC 3.4.24). En este caso nos centraremos en lasmetaloproteinasas, ya que la proteasa de Bacillus subtilis (EC 3.4.24.28) evaluada en estetrabajo es de este tipo (Wong, 1995).

Las metaloproteasas se caracterizan porque requieren un ion metlico, usualmente zinc(Zn2+) en su centro activo que est involucrado en el ciclo cataltico, aunque en su molculatambin puede incluir otros iones como el Ca2+. Estos enzimas se pueden distinguirfcilmente de otras clases si se tratan con agentes quelantes metlicos como el cidoetilendiamino tetractico (EDTA) o la 1,10 fenantrolina, que llegan a inactivar totalmente elenzima porque secuestran el ion metlico (Wong, 1995).

La proteinasa de Bacillus subtilis (bacilolisina) estaba inicialmente incluida en el grupo(EC 3.4.24.4) al igual que otras proteinasas de especies de Bacillus como B.amyloliquefaciens, B. megaierum, B. mesentericus, B. creas, B, searothermophilus yBacillus thermoproteolyticus. El enzima ms estudiado de este grupo es la termolisina, unaendopeptidasa de 35 kDa producida por Bacillus thermoproteolyticus. Este enzima es muyparecido en su estrucutura y mecanismo de accin a la bacilolisina aunque ms resistente alcalor.

Algunos factores que pueden afectar en el aumento de la termoresistencia de estosenzimas son el nmero de enlaces entre puentes de hidrgeno; los aminocidos quecontiene la estructura que pueden variar la hidrofobicidad y el volumen de algunas partes dela molcula; y las perturbaciones que pueda haber alrededor del lugar donde se encuentra elcalcio (Pauptit et al., 1988; Sidler et al., 1986; Frigerio et al., 1996).

15 Introduccin

Efectos producidos en la leche por las Hpasas y proteasas de microorganismospsicrtrofos

Las proteasas y lipasas producidas por bacterias psicrtrofas son bastante resistentes alcalor y con frecuencia resisten los tratamientos de pasteurizacin o esterilizacin UHTcausando ciertos defectos incluso en leche tratada (Visser, 1981; Cousin, 1982; Janzen etal., 1982). El deterioro de la leche pasteurizada debido a enzimas termoestables es deimportancia limitada ya que el tiempo de conservacin en refrigeracin es relativamentecorto; mientras que en el caso de la leche UHT, su vida til est ms directamentecondicionada por la actividad de estos enzimas que, durante el almacenamiento, provocanla aparicin de sabores desagradables y hacen que gelifique la leche (Bengtsson et al., 1973;Adams et al., 1976; Law et al, 1977; Mottar et al., 1979; Richardson y Newstead, 1979;Adams y Brawley, 1981; Mckellar y Cholette, 1984; Mottar, 1989; Varnam y Sutherland,1995).

Las proteasas hidrolizan la casena provocando la gelificacin de la leche debido a laagregacin de las micelas de casena modificadas que forman una estructura de gel queincluye protenas del suero y glbulos grasos. En esta reaccin tambin est implicada laplasmina. Adems, el proceso UHT produce una alta proporcin de micelas de pequeotamao, haciendo que la leche coagule con ms facilidad. Los enzimas proteolticostambin son responsables de la aparicin de olores desagradables y del desarrollo desabores astringentes y amargos que se atribuyen a la formacin de determinadospolipptidos resultado de la hidrlisis de la casena (Adams et al., 1976; Mckellar yCholette, 1984; Varnam y Sutherland, 1995).

Las lipasas generalmente no estn involucradas en cambios estructurales de la leche;aunque debido a que provocan la hidrlisis de los triglicridos causan la aparicin desabores y olores desagradables (rancidez hidroltica) en leche y productos lcteos, as comode algunos defectos en la aptitud de la leche para su procesado. Algunos de los sabores yolores que desencadena la lipolisis se deben directamente a la liberacin de cidos grasos decadena corta y media; otros sin embargo, son debidos a productos derivados de estos cidosgrasos libres, por oxidacin y otras reacciones (San Jos y Jurez, 1983; Mottar, 1989;Varnam y Sutherland, 1995)

La poblacin de bacterias psicrtrofas necesaria para producir cambios dtectables en laleche vara dependiendo de los gneros y de las especies presentes. Aunque se han descritodefectos en la leche y en los productos lcteos con niveles comprendidos entre LIO2 y 1.109ufc/ml (Tekinson y Rothwell, 1974), generalmente los cambios de aroma y sabor seperciben cuando la poblacin excede de 106 ufc/ml (Punch et al., 1965; Richter, 1979).Aparte de los cambios de aroma y sabor (sabor rancio, ptrido, amargo,...) la presencia deenzimas extracelulares en la leche cruda tambin ocasiona algunos problemas tecnolgicosdurante el procesado y posterior almacenamiento (Reimerdes, 1982).

Durante la fabricacin de quesos, el desarrollo de psicrtrofos y la produccin de proteasadetermina un rendimiento menor por prdida de nitrgeno en el suero (Law, 1979; Fairbairny Law, 1986), un acortamiento del tiempo de coagulacin, una mayor firmeza de la cuajada(Cousin y Marth, 1977), y un desuerado ms difcil (Juffs, 1974). Los cidos grasosliberados durante la lipolisis de la grasa de la leche son importantes en el desarrollo del

Introduccin 16

sabor y aroma del queso (Mikolajoik, 1979). Sin embargo, la liplisis excesiva por accinde las lipasas de las bacterias psicrotrofas origina la aparicin de sabores y olores anmalosen queso (Law et al., 1976).

En el caso de la mantequilla, nata y mazada, la presencia de proteasas reviste pocaimportancia por el bajo contenido en proteina de estos productos. Sin embargo, la actuacinde las lipasas es significativa, dado que liberan cidos grasos durante el almacenamiento delproducto, originando sabores a rancio y a jabn (Deeth et al., 1979).

PROCESADO TRMICO DE LA LECHE

La produccin de leche en Espaa se centra mayoritariamente en leche lquida nomodificada excepto por el calentamiento. Las leches concentradas (condensadas oevaporadas) y desecadas (leche en polvo) por la accin del calor o, excepcionalmente, porliofilizacin (leche humana); as como las leches modificadas (leches medicamentosas,maternizadas, humanizadas, aromatizadas esterilizadas, fermentadas o acidificadas yreconstituidas) se producen en menor cantidad.

Para garantizar que la leche que se vende para el consumo humano es un producto sano esnecesario desarrollar sistemas de manejo y procesado que destruyan todos losmicroorganismos patgenos y reduzcan la presencia de otros microorganismos. Debido aque las bacterias se multiplican ms rpidamente en la leche caliente que en la leche fra, elprimer paso para reducir el deterioro de la leche, dado que sta abandona la ubre a latemperatura del cuerpo, es enfriarla hasta unos 4 C (figura 4) (Porter, 1980).

La leche fresca resultante se transporta a las centrales lecheras para su procesado. Una vezall, el medio ms eficaz para destruir las bacterias de la leche es calentarla durante eltiempo necesario a una temperatura lo suficientemente alta como para matar a todos losorganismos patgenos, sin afectar de manera importante a las propiedades fsicas yqumicas de la leche. Este es el principio de la pasteurizacin (Porter, 1980).

La pasteurizacin consiste en calentar la leche por debajo del punto de ebullicin pero auna temperatura adecuada para destruir a los patgenos y reducir suficientemente el restode microorganismos, para que pueda ser transportada, distribuida y consumida conseguridad. Existen dos tipos de pasteurizacin, la LTLT (Low Temperature Long Time)que consiste en aplicar tratamientos de larga duracin (30 min) a temperaturas suaves(63C), y la pasteurizacin HTST (High Temperature Short Time) que consiste en aplicartemperaturas ms altas (71-75C) durante tiempos cortos (15-20 s.). Despus, la leche pasaa una seccin de enfriamiento, donde, tras una refrigeracin inmediata, se reduce sutemperatura hasta alcanzar unos 4 C. A continuacin se produce un envasado asptico enbotellas (figura 4) (Porter, 1980; Madrid, 1996).

La esterilizacin puede ser de dos tipos: tradicional y UHT. En el primer caso, despus deun precalentamiento de la leche a unos 80C, sta se envasa en botellas, que posteriormente,se llevan a un autoclave y se esterilizan a 115-120C durante un tiempo que oscila alrededorde los 20-30 minutos (Madrid, 1996). De todas formas, en Espaa, el proceso deesterilizacin que se aplica ms habitualmente a las leches lquidas comerciales es el

17 Introduccin

sistema continuo a temperatura ultra-alta (UHT). En la esterilizacin UHT, la leche secalienta hasta 135-150 C durante unos segundos (2-4 s), se enfra y se envasaaspticamente (figura 4). Este proceso se puede aplicar a la leche de forma directa oindirecta. El tratamiento UHT directo consiste en la inyeccin de vapor directamente en laleche, seguido de una parcial evaporacin y enfriamiento; mientras que, en el tratamientoindirecto, el intercambio trmico se realiza mediante intercambiadores de placas o tubulares(Porter, 1980; Madrid, 1996).

El procedimiento UHT consiste en aplicar temperaturas altas durante un tiempo corto,para eliminar todas las bacterias causando pocas modificaciones en el sabor y el color(Porter, 1980). La leche esterilizada por el sistema UHT se expende generalmente enenvase laminado complejo de cartn, recubierto de plstico y forrado con una lmina dealuminio que asegura la opacidad del recipiente (Porter, 1980).

Efecto del tratamiento trmico en microorganismos y enzimas

Los tratamientos trmicos de pasteurizacin o esterilizacin han sido definidos entemperatura y tiempo para destruir principalmente los microorganismos patgenosprocurando alterar lo menos posible la estructura fsica y qumica de la leche. A su vez,estos tratamientos inactivan enzimas que posiblemente causaran importantes alteracionesen la leche. Por ambas razones, la aplicacin de calor consigue la prolongacin de laconservacin del producto que ser mayor o menor segn la intensidad del tratamiento.

Efecto sobre los microorganismosActualmente, se admite que la destruccin trmica de los microorganismos est

relacionada con la degradacin de los cidos nucleicos y la desnaturalizacin de protenascelulares (Veisseyre, 1988). Cuando se mantienen temperaturas de 65-70C durante unosminutos, la mayora de microorganismos que constituyen la flora banal de la leche sondestruidos. Pero, existen ciertos microorganismos que pueden sobrevivir a los tratamientosde pasteurizacin, son los llamados termoresistentes (Veisseyre, 1988).

Entre las bacterias termoresistentes no esporuladas cabe destacar principalmente especiesde los gneros: Streptococcus, Micrococcus, Lacobacillus. Alguno de los cuales ademsson termfilos (S. termophilus, L. Termophilus), pudindose desarrollar en lechepasteurizada insuficientemente refrigerada. Entre las bacterias termoresistentes esporuladas,las pertenecientes a los gneros Bacillus y Clostridium son los que pueden encontrarse conms frecuencia en la leche (Veisseyre, 1988).

Las levaduras y los hongos, incluso despus de la esporulacin, no presentantermoresistencia (Veisseyre, 1988).

Efecto sobre los enzimasLos enzimas de la leche empiezan a inactivarse a partir de los 50C, aunque el intervalo

concreto de temperaturas depende de cada tipo de enzima. Esta caracterstica permiteutilizar determinados enzimas como indicadores de los tratamientos trmicos aplicados enla leche; as, por ejemplo, la inactivacin de fosfatasa alcalina se suele utilizar como

Introduccin 18

indicador de la pasteurizacin baja (63C-30 min). Durante la pasteurizacin alta (72-75C,15-20 s.), adems de la inactivacin de fosfatasa alcalina, se produce la inactivacin de lalactoperoxidasa y de la mayora de enzimas, a excepcin de la proteasa nativa de la leche yde algunas lipasas y proteasas bacterianas. Con los tratamientos de esterilizacin, ya seanen botella o UHT, se consigue la inactivacin de prcticamente la totalidad de los enzimas,excepto algunos de origen microbiano, como los producidos por bacterias psicrotrofas(Walstra y Jenness, 1987), aunque en ciertos casos (plasmina y fosfatasa alcalina) ladesnaturalizacin es parcialmente reversible despus del tratamiento UHT.

Efecto del tratamiento trmico en el valor nutritivo de la leche

Actualmente, el tratamiento trmico es uno de los mtodos ms eficaces para laconservacin de los alimentos ya que reduce el recuento de microorganismos y inactiva losenzimas que podran desestabilizar el alimento durante el almacenamiento. Pero tambincomporta una serie de inconvenientes, entre los cuales cabe citar (Veisseyre, 1988):

- Modificacin de la estabilidad coloidal y de la emulsin de la grasa- Modificacin del color y gusto- Disminucin del contenido en biocatalizadores como enzimas y vitaminas

Los cambios nutricionales durante la pasteurizacin HTST o la esterilizacin UHT sonlimitados en la mayora de los casos, aunque los efectos del procesado mediante UHTindirecto son mayores que los del UHT directo. El tratamiento que provoca cambios msimportantes en el valor nutritivo de la leche es la esterilizacin en botella, aunque el gradode alteracin varia considerablemente con la severidad del proceso (Varnam y Sutherland,1995).

Efecto en las vitaminas

La leche pasteurizada o UHT muestra prdidas de vitamina similares por efecto deltratamiento de conservacin, aunque normalmente es mayor en la UHT. Las vitaminasliposolubles A, D, E y las hidrosolubles biotina, cido nicotnico, cido pantotnico yriboflavina son relativamente estables al calor y no se observan prdidas dtectables durantela pasteurizacin o en la mayora de los procesos UHT. Vitaminas como el cido flico,tiamina, vitamina B6 y vitamina B!2 pueden sufrir prdidas menores del 10-20% despus dela pasteurizacin o el proceso UHT (en este caso la prdida de vitamina Be puede sermayor). La vitamina C es la que sufre las prdidas ms importantes, ya que su contenidopuede reducirse un 5-25% durante la pasteurizacin y un 25% o ms durante el procesoUHT (Tabla 4) (Mottar y Noudts, 1979; Haddad y Loewenstein, 1983; Alais, 1985;Lavigne, 1989; Varnam y Sutherland, 1995; Jurez, 1996).

Las prdidas de vitaminas despus de la esterilizacin en botella varan con el procesoaplicado, pero en la mayora de los casos son importantes. El contenido en vitamina C sereduce un 30-100%, tiamina 20-50%, vitamina B6 15-50%, vitamina B12 20-100% y elcido flico un 30-50% (Tabla 4) (Alais, 1985; Lavigne, 1989; Amiot, 1991; Varnam ySutherland, 1995; Jurez, 1996).

19 Introduccin

Tabla 4. Efectos de los tratamientos trmicos industriales sobre las vitaminas de la leche(Alais, 1985;Lavigne, 1989; Amiot, 1991; Varnam y Sutherland, 1995; Jurez, 1996)1.

Vitaminas

Vitamina BI (ug)Vitamina B2 (ug)Vitamina B6 (ug)Vitamina B n (ug)Acido flicoVitamina C (ug)

PasteurizadaHTST

2-100

Introduccin 20

lactulosa puede ser usado como parmetro para distinguir la leche segn el tipo detratamiento que se le ha aplicado (Varnam y Sutherland, 1995).

Efecto en los lpidos

En general, los tratamientos trmicos no afectan a la materia grasa, aunque en algunostratamientos a temperatura elevada se produce la agrupacin de algunos glbulos de grasa,producindose la degradacin de glicridos a 5-lactonas y metilcetonas que son causantesde la aparicin de cambios en el gusto (Veisseyre, 1988).

BIBLIOGRAFAAdams, D.M., Barach, J.T., Speck, M.L. 1976. Effect of psychrotrophic bacteria from raw

milk in milk proteins and stability of milk proteins on ultra-high-temperature treatment.J. Dairy Sci., 59, 823-827.

Adams, D., Brawley, T. 1981. Heat Resistant Bacterial Lipases and Ultra-High TemperatureSterilisation of Dairy Products. I Dairy Sci., 64, 1951-1957.

Alais, C.H. 1985. Ciencia de la leche, principios de tcnica lechera. Ed. Reverte, Barcelona.Amiot, J. 1991. Ciencia y tecnologa de la leche. Ed. Acribia, Zaragoza.Aurand, L.W., Woods, A.E., Wells, M.R. 1987. Food composition and analysis. Ed AVI,

USA.Badui, S.D. 1986. Qumica de los alimentos. Ed. Alhambra mexicana, Mxico D.F.Bengtsson, K., Gardhage, L., Saksson, B.I. 1973. Gelation in UHT treated milk, whey and

casein solution. The effect of heat-resistant proteases. Milchwissenschaft, 28, 495-499.Bishop, J.R., White, C.H. 1986. Assessment of dairy product quality and potential shelf-life,

a review. I Food Prot., 49, 739-753.Calvo, M.M. 1989. Efecto del tratamiento trmico sobre los componentes del suero de la

leche. Tesis doctoral, Departamento de Nutricin y Bromatologia IH, UniversidadComplutense de Madrid.

Cousin, M.A. 1982, Presence and activity of psychrotrophic micro-organisms in milk anddairy products: A review. J. Food Prot., 45, 172-207.

Cousin, M.A., Marth, E.H. 1977. Cottage cheese and yogurt manufactured from milksprecultured with psychrotrophic bacteria. Cultured Dairy Prod. J., 10, 15-18, 30.

Cousins, C.M., Brarnley, AJ. 1987. Microbiologa de la leche cruda. En: Microbiologalactolgica. Vol. 1. R.K. Robinson (ed). Ed. Acribia. Zaragoza.

Deeth, H.C., Fitz-Gerald, C.H., Wood, A.F. 1979. Lipolysis and butter quality. Ausi. J.Dairy Technol., 34, 146-149.

Fairbaim, D.J., Law, B. 1986. Purification and characterisation of the extracellularproteinase of Pseudomonas fluorescens NCDO 2085. J. Dairy Res,, 53, 457-466.

Fox, P.F., McSweeney, P.L.H. 1998. Dairy Chemistry and Biochemistry. Ed. ThomsonScience, London, UK.

Frigerio, F., Margarit, I., Nogarotto, R, de Filippis, V., Grandi, G. 1996. Cumulativestabilizing effects of hydrofobic interactions on the surface of the neutral protease fromBacillus subtilis. Protein Eng., 9(5), 439-445.

Griffiths, M.W. 1989. Effect of temperature and milk fat on extracellular enzyme synthesis

21 Introduccin

by psychrotrophic bacteria during growth in milk. Milchwiseenchaft, 44, 539-543.Griffiths, M.W., Philips, J.D. 1984. Effect of aeration on extracellular enzyme synthesis by

psychrotrophs growing in milk during refrigerated storage. J. Food. Prot, 47, 697-702.Haddad, O.S., Loewenstein, M. 1983. Effect of several heat treatments and frozen storage

on thiamine, riboflavin and acid ascorbic content of milk. J. Dairy Sci., 66, 1601-1606.Jaeger, K.E., Ransac, S. Dijkstra, B.W., Colson, C., van Heuvel, M., Misset, O. 1994.

Bacterial upases. FEMS Microbiology Reviews, 15, 29-63.Janzen, J.J., Bishop, J.R., Bodine, A.B. 1982. Relationship of protease activity to shelf-life

of skim and whole milk. J. Dairy Sci., 65, 2237-2240.Jurez, M. 1996. Leche y productos lcteos, aspectos nutricionales. Alimentacin, nutricin

y salud, 3 (3), 45-50.Juffs, H. S. 1974. Influence of proteinases produced by Pseudomonas aeruginosa and

Pseudomonas fluorescens on manufacture and quality of Chedar cheese. Aust. J. DairyTechnol., 29, 74-78.

Lavigne, C., Zee, J.A., Simard, R.E., Beliveau, B. 1989. Effect of processing and storageconditions on the fate of vitamins BI, 82 and C on the shelf-life of goat's milk. J. FoodSci., 54 (1), 30-34.

Law, B.A., Sharpe, M.E., Chapman, H.R. 1976. The effect of lipolytic Gram-negativepsychrotrophs in stored milk on the development of rancidity in Cheddar cheese. J.Dairy Res., 43, 459-468.

Law, B.A., Andrews, A.T., Chapman, H.R. 1977. Gelation of UHT-sterilized milk byproteases from a strain of Pseudomonas fluorescens, isolated from raw milk. J. DairyRes., 44, 145-148.

Law, B.A. 1979. Enzymes of psychrotrophic bacteria and their effects on milk and milkproducts. J. Dairy Res., 46, 573-588.

Luquet, M.F. 1991. Leche y productos lcteos. Ed. Acribia. Zaragoza, pp. 390.Madrid, A. 1996. Curso de industrias lcteas. AMV Ediciones, Mundi-Prensa libros S.A.,

Madrid.Mataix, F.J. 1996. Recomendaciones nutricionales y alimentarias para la poblacin.

Necesidades y limitaciones. Alimentacin, nutricin y salud, 3 (3), 51-57.Mckellar, R.C., CHOLETTE, H. 1984. Synthesis of extracellular proteinase by

Pseudomonas fluorescens under conditions of limiting carbon, nitrogen and phosphate.Appi. Environ. Microbiol., 47, 1224-1227.

Mikolajcik, E.M. 1979. Psychrotrophic bacteria and dairy product quality. I. Majororganisms involved and defects produced. Cult. Dairy Prod. J., 14, 6-10.

Mottar, J., Noudts, M. 1979. Quality of UHT milk compared with pasteurised an in-bottlesterilised milks. Lait, 59, 476.

Mottar, J.F., Waes, G., Moermans, R., Naudts, M. 1979. Sensorie changes in UHT milkduring uncooled storage. Milchwissenschaft, 34, 257-262.

Mottar, J.F. 1989. Effect on the quality of Dairy Products. En: Enzymes of psychrotrops inraw food. R.C. McKellar (ed) Ed. CRC Press Inc. Boca Ratn y Florida.

Pauptit, R.A., Karlsson, R., Picot, D., Jenkins, J.A., Niklaus-Reimer, A.S., Jansonius, J.N.1988. Crystal structure of neutral protease from Bacillus cereus refined at 3.0 Aresolution and comparison with the homologous but more thermostable enzymethermolysin. J. Mol. Biol, 199, 525-537.

Porter, J.W.G. 1980. Leche y productos lcteos. Ed. Acribia, Zaragoza, pp. 88.Punch, J.D., Olson, J.C., Jr., Thomas, E.L. 1965. Psychrophilic bacteria III. Population

levels associated with flavor or physical change in milk. J. Dairy Sci., 44, 43-46.

Introduccin 22

Reimerdes, E.H. 1982. Changes in the proteins of raw milk during storage. En"Developments in Dairy Chemistry-1, Proteins". P.P. Fox (d.). Ed. Applied SciencePublishers, London y New York.

Richardson, B.C., Newstead, D.F. 1979. Effect of heat-stable proteases on storage life ofUHT milk. N.Z. J. Dairy Sci. Technol., 14, 273-279.

Richter, R. 1979. Psychrotrophic bacteria and self-life. Am. Dairy Res., 41, 48-50.Santo Domingo, M.A. 1993. La leche y los productos lcteos en la diettica actual.

Alimentaria, noviembre, 246, 29-32.Sidler, W., Niederer, E., Suter, F., Zuber, H. 1986. The primary structure of Bacillus cereus

neutral proteinase and comparison with thermolysin and Bacillus subtilis neutralproteinase. Biol. Chem., 367(7), 643-657.

Spreer, E. 1991. Lactologia Industrial. Ed.Acribia. Zaragoza, pp. 617.Stadhouders, J. 1975. Microbes in milk and dairy products. An ecological approach. Neth.

Milk Dairy!., 29, 104-126.Suhren, G. 1989. Producer micro-organisms. En: Enzymes of psychrotrops in raw food.

R.C. McKellar (d.), Ed. CRC Press Inc. Boca Ratn y Florida.Svendsen, A. 2000. Review. Lipase protein engineering. Biochimica et Biophysica Acta

1543, 223-238.Talanen, M. 1995. Vitaminas y minerales en la salud y en la nutricin. Ed. Acribia,

Zaragoza.Tetnson, O.C., Rothwell, J. 1974. A study of the effect of storage at 5C on the microbial

flora of heat-treated market cream. J. Soc. Dairy Technol., 27, 57-62.Thomas, S.B., Thomas, B.F. 1973. Psychrotrophic bacteria in refrigerated pasteurised milk.

Dairy Ind., 34, 351-355.Varnam, A.H., Sutherland, J.P. 1995. Leche y productos lcteos. Tecnologia, qumica y

microbiologa. Ed. Acribia. Zaragoza. Pp. 476.Veisseyre, R. 1988. Lactologia tcnica. Ed. Acribia, Zaragoza.Visser, S. 1981. Proteolytic enzymes and their action on milk proteins. A review. Neth. Milk

Dairy I, 35, 65-88.Walker, J.M., Gingold, E.B. 1988. Biologa Molecular Y Biotecnologa. Ed. Acribia.

Zaragoza.Walstra, P., Jeness, R. 1987. Qumica Y Fsica Lactolgica. Ed. Acribia, Zaragoza.Wong, D.W.S. 1995. Food Enzymes. Structure And Mechanism. Ed. Chapman & Hall,Yufera, P. 1987. Qumica agrcola III, alimentos. Ed. Alhambra, Madrid.

II

PULSOS ELCTRICOS DE ALTAINTENSIDAD DE CAMPO:

> Ingeniera del Proceso

Introduccin 24

INTRODUCCIN

Los alimentos fluidos estn compuestos principalmente por agua y nutrientes comoprotenas, vitaminas, triglicridos y minerales. Son, en general, conductores elctricos ya quecontienen altas concentraciones de iones que pueden ser transportadores de cargas elctricas(Martn et al., 1994). Gracias a esta propiedad, a principios de siglo se consigui procesaralimentos mediante la aplicacin de electricidad con un considerable xito (Beattie, 1915).Esta tcnica de tratamiento de alimentos se ha ido perfeccionando con el tiempo yactualmente, el procesado mediante pulsos elctricos de alta intensidad de campo (PEAIC)est dando buenos resultados en la destruccin de diversos microorganismos y enzimas(Barsotti et al., 1999; Wouters et al., 1997; Barbosa et al., 1999).

El equipo tpico de procesado de alimentos lquidos mediante PEIAC consta de unafuente de alimentacin de alta tensin, cuya misin es almacenar energa en un condensadory un interruptor que permite la descarga de esa energa en pulsos rpidos (|as) de alta tensin(decenas de kV) a un recipiente que contiene el alimento a tratar (cmara de tratamiento)(Martn et al., 1994; Zhang et al., 1995; Barbosa-Cnovas et al., 1998).

Cuando se aplica un campo elctrico a la cmara de tratamiento que contiene el alimento,la polarizacin de las molculas dipolares y el movimiento de los transportadores de cargas,como los iones, en el interior del producto, inducen corrientes capacitivas y resistivas (Riley& Watson, 1987; Zhang et al., 1995). Por tanto, la cmara de tratamiento conteniendo elalimento se puede considerar elctricamente como un circuito con una resistencia y uncondensador conectados en paralelo (RC) (Figura 1), ya que, el circuito que modeliza lapolarizacin dielctrica es un condensador y el que modeliza la conduccin por transporte decargas es una resistencia.Por consiguiente, en el diseo del procesado por PEAIC y para conseguir una buenaefectividad del mismo, las propiedades elctricas de los alimentos adquieren granimportancia. La resistencia, la conductividad y las propiedades dielctricas del alimento atratar afectan en la forma en que los alimentos interaccionan con el campo elctrico (Lewis,1993).

Propiedades elctricas de los alimentos

El alimento a tratar es un material conductor de cargas elctricas. Cuando fluye corrienteelctrica a travs de cualquier material conductor existe una relacin directa entre ladiferencia de potencial a travs de ste (V) y la intensidad de corriente (I). La resistencia (R)de un conductor es la constante que relaciona ambos parmetros. Esta relacin, denominadaLey de Ohm se resume en la ecuacin 1 (Lewis, 1993).

R=V/I Ecuacin 1

La resistencia de un determinado material depende de su longitud, del rea de su seccin,del tipo de material y de la temperatura. Cada material tiene una resistencia especfica,llamada resistividad (p), segn el valor de sta presentar mayor o menor dificultad al pasode la corriente elctrica. El parmetro inverso es la conductividad (a), y representa lafacilidad que da un material al paso de corriente elctrica (Tipler, 1994). La conductividadde un lquido aumenta con la fuerza inica del medio y con la temperatura. El valor de la

25 Introduccin

conductividad molar de la mayora de las soluciones incrementa en un 2 % aproximadamentecon cada C de cambio de temperatura (Lewis, 1993).

a)nodo Ctodo

VMqtffl)

b)

7T

1 O0Q)

4

Q +0

"-

T

O 1o |O *j

* * '4o ;^

rf

Aita

C)

11

(Tj) Molaculas djpotots

Introduccin 26

El alimento contenido en la cmara de tratamiento, adems de comportarse como unaresistencia, tambin se comporta como un condensador y por tanto puede almacenar cargaelctrica (Lewis, 1993). La cantidad de carga elctrica (Q) que puede almacenar uncondensador por unidad de diferencia de potencial (V) es su capacidad (C) (Tipler, 1994)(Ecuacin 3).

C=Q/V Ecuacin 3

La constante dielctrica relativa de un alimento, que se comporta como condensador, esla relacin entre la capacidad del alimento a estudio y la capacidad del aire o del vaco bajolas condiciones estudiadas. Cuando aumenta la constante dielctrica del alimento, ste, comocondensador, puede almacenar una cantidad mayor de energa. La capacidad efectiva sepueden calcular mediante la ecuacin 4.

C=E0SrA/d Ecuacin 4

Donde S0 = 8,84.10"12 (F.m"1) es la constante dielctrica del vaco y Gf es la constantedielctrica relativa (adimensional).

La impedancia (Z) es un concepto que surge cuando se trabaja con corriente alterna yrepresenta la oposicin por parte de un aparato o de un circuito al paso de esta corriente auna determinada frecuencia (Plonus, 1982). Se puede representar como un nmero complejodonde la resistencia (R) es la parte real y la reactancia es la imaginaria. En un circuito, elcondensador dar la reactancia capacitiva (xc) y la bobina dar la reactancia inductiva (%).Dentro de la cmara de tratamiento no acostumbran a formarse corrientes inductivas, por loque no habr reactancia inductiva. As pues, la impedancia se puede calcular como se indicaen la ecuacin 5.

Z = -j R2 + xl Ecuacin 5

Se ha observado que la impedancia puede variar con las caractersticas del producto y latemperatura, Arntegui et al. (1999) observaron que este parmetro disminua con latemperatura, y en zumo de melocotn, encontraron que la impedancia era mnima cuando elzumo contena una concentracin en pulpa del 10-12.5%.

Para conocer la eficacia con la que llega el voltaje transmitido a la cmara de tratamientose utiliza la transmitancia (T), que representa la tensin que realmente se aplica a la cmarade tratamiento (Tipler, 1994). El coeficiente de transmisin (Tr) se define como el voltajetransmitido en relacin al voltaje incidente (Bailo, 1997). La transmitancia debe ser prximaal 100% para conseguir un buen rendimiento del equipo. sta varia con las caractersticasdel producto y la temperatura del medio a tratar (Arntegui et al., 1999).

Introduccin

Equipos para el tratamiento de alimentos

Conceptos generales

El procesado de alimentos mediante PEIAC est relacionado con una utilizacin mnimade energa y con un uso ms eficiente de la misma que en los procesos trmicos, Qin et al.(1995a) calcul que la energa usada en el tratamiento de zumos de manzana mediantePEIAC era un 90% menor que la cantidad de energa usada en el mtodo de procesado aaltas temperaturas y tiempos cortos.

40Los aspectos ms importantes en esta tecnologa son la generacin de intensidades decampo altas, el diseo de cmaras para tratar el alimento de forma uniforme con el mnimoincremento de temperatura y evitando el fenmeno de electrlisis. Para que no haya unincremento elevado en la temperatura durante el tratamiento, se tiene que utilizar algnsistema de refrigeracin o usar una frecuencia muy baja de aplicacin de pulsos. Adems, eluso de pulsos cortos reduce la cantidad de calor aportada al alimento (Zhang et al., 1995).

La fuerza de campo elctrico (E), la duracin del pulso (i) y el tiempo de tratamiento (t)estn definidos por las ecuaciones 6, 7 y 8; donde V es la diferencia de potencial entre dospuntos dados, R es la resistencia, Co es la capacidad del condensador y n es el nmero depulsos.

E = V/d Ecuacin 6

t = RC0 Ecuacin 7

t = nt Ecuacin 8

El proceso de descarga del condensador que da lugar al pulso de tensin sobre la cmaraque contiene la muestra puede tener diferentes formas: cada exponencial, onda cuadrada yoscilatorio y en el caso de que se alterne o no la polaridad de la descarga se consiguenpulsos bipolares o unipolares, respectivamente. Las formas de pulso ms comnmenteusadas son las de cada exponencial y las de onda cuadrada (Figura 2). Se ha observado quese consiguen mejores resultados en el nivel de inactivacin microbiana con los de ondacuadrada (Qiu et al., 1998) ya que al aplicar este tipo de pulsos la intensidad de campomxima se mantienen durante ms tiempo que los de cada exponencial. Para poder obtenerestos diferentes tipos de pulsos debe hacerse modificaciones en el equipo (Figura 3) (Qin etal., 1994).

Introduccin 28

(a) (b)

li

Tiempo (mes) Tiempo (mes)

Figura 2. Pulsos de cada exponencial (a) y de onda cuadrada (b).

(a) (b)Interruptor de descarga

JL Interruptor, 'vvvn

81

tate \>tu 1i*./ "

Condensadores ^^L

O mar deTrattmientn

TTT\ AlimentoAlimento

Figura 3. Circuitos simplificados para la generacin de pulsos de caida exponencial (a) yonda cuadrada (b).

Existen varios sistemas, tanto para la generacin de pulsos monopolares como bipolares,que permiten controlar los parmetros elctricos que influyen en el proceso, adems de laanchura de pulso o el tiempo que debe transcurrir entre dos pulsos (Universidad Estatal deOhio, Thomson-CSF y Centralp) (Figura 4).

En lo concerniente a la polaridad del pulso, se ha observado que el empleo de pulsosunipolares provoca la formacin de una capa protectora en los electrodos producida por lamigracin que sufren algunos componentes de los alimentos debido a la carga elctrica quepresentan. En esta capa suele crearse una intensidad del campo elctrico significativamentemayor que el resto de la cmara, perdindose la uniformidad del campo elctrico en suinterior, lo que puede inducir la ruptura dielctrica del alimento (arco elctrico) con valores

29 Introduccin

nominales del campo elctrico inferiores a los que seran de esperar en el caso de campouniforme. El empleo de pulsos bipolares mediante la alternancia de la polaridad de loselectrodos evita la formacin de la mencionada capa protectora, aunque ello se consigueutilizando generadores de pulsos ms complejos y costosos (Qin et al., 1994; Zhang et al.,1995).

Existe otro tipo de generadores que consiguen descargar pulsos con una parte positiva yuna parte negativa. A diferencia de los pulsos bipolares, en este tipo de pulsos la reversinde la carga es instantnea y se ha observado que son mucho ms eficaces para inactivarmicroorganismos que los de cada exponencial simple (Ho et al., 1997).

10000

8000

6000

4000

2000

S o -MOO

> -4000

-6000

-8000-

-10000

0.000002 0.000004 0.000006 0.000008 0.0 001 0.000012/ 0.000014 0.001016

Tiempo (s)

Figura 4. Ciclo de pulsos de diferentes polaridades (Equipo de la Universidad Estatal deOhio).

Cmaras de tratamiento

La funcin principal de las cmaras de tratamiento es la creacin de un campo elctricoen su interior cuando contiene el alimento. Teniendo en cuenta que mediante su diseo sedebe evitar al mximo la rotura dielctrica del alimento y proporcionar una uniformidad decampo mxima, stas no pueden ser totalmente estancas y deben permitir la refrigeracin encaso necesario (Martn et al., 1994; Qin et al., 1995b; Zhang et al., 1995).

Al disear la cmara de tratamiento debe tenerse en cuenta la geometra de los electrodosy deber elegirse el tipo de material a usar en la construccin de las cmaras, que deber serfcilmente lavable y esterilizable. Los electrodos, normalmente, son de acero inoxidable ografito y el aislante suele ser de material polimrico o de cermica. Por otra parte, el diseode la cmara debe ser tal que permita fcilmente el llenado y vaciado de los alimentos.Adems, dado que las burbujas de gas pueden inducir la formacin de arcos elctricos, sedebe permitir la completa eliminacin del aire durante el proceso de llenado (Martn et al.,1994).

Introduccin 30

La geometra de los electrodos (y, por extensin, de la cmara) puede ser muy variable,predominando los electrodos en forma de placas paralelas, cilindros concntricos, cablesparalelos y varillas (Hofmann, 1989). La geometra de placas paralelas es una de las msadecuadas por su simplicidad y la uniformidad del campo elctrico que se crea en su interior(Martn et al., 1994)

Las cmaras de tratamiento de alimentos pueden ser diseadas para trabajar por lotes oen continuo, dependiendo de si el alimento permanece en la cmara durante todo eltratamiento o si, en cambio, existe un flujo continuo del mismo a travs de la cmara duranteel intervalo de tiempo que dura el tratamiento, respectivamente. Sale y Hamilton (1967) yDunn y Pearlman (1987) disearon cmaras estticas que podan conseguir un campomximo de 25 kV/cm. Grahl et al. (1992) disearon una cmara de este tipo dnde seconsegua un campo de 30 kV/cm y Zhang et al. (1996) construy una con la que se llegabahasta campos de 40 kV/cm. En la Universidad de Lleida se han diseado cmaras estticasen cuyo interior se consigue una intensidad de campo uniforme y elevada a la vez que unabuena transmitancia elctrica. La cmara est formada por dos electrodos lisos, de aceroinoxidable y dispuestos en paralelo, recubiertos con material aislante.

En cuanto a las cmaras de flujo continuo, pueden disearse tomando como base lasestticas. Sin embargo, debe tomarse en consideracin la cantidad de energa aportada a lacmara y adecuar la velocidad de repeticin del pulso a la velocidad de flujo del alimento.Puede hacerse necesaria la refrigeracin durante el tratamiento, lo que normalmente se hacemediante agua (Martn et al., 1994).

Dunn y Pearlman (1987) disearon una cmara con 2 electrodos paralelos, que noestaban en contacto directo con el alimento, sino separados por unas membranas permeablesa los iones (Figura 5). Otra cmara de tratamiento en continuo descrita por Dunn y Pearlman(1987) presenta varias zonas con electrodos separadas por un material aislante, donde laintensidad de campo elctrico va variando a lo largo de la cmara segn la posicin en la quese encuentre el fluido (Figura 6).

Entrada

31 Introduccin

Oriner Separador aislantedielctrico

Electrolito

Membrana permeablea los iones

Zona reservoriodel electrodo

Electrodo

Figura 6. Esquema de la cmara de tratamiento en flujo continuo en la que la cmara tienezonas reservorio de los electrodos (Dunn y Pearlmann, 1987).

En la Figura 7 se puede observar la cmara de tratamiento diseada por Matsumoto et al(1991), en la que los electrodos circulares estn separados por un placa de tefln con unorificio en el medio; la intensidad de campo elctrico aplicada se concentra en este pequeoespacio.

Entrada del producto

Zona de tratamiento Lmina de teflnagujereada

Salida del producto

Figura 7. Cmara de flujo continuo diseada por Matsumoto et al. (1991).

Zhang et al. (1995) describen una cmara de electrodos paralelos en la que el diseo sebasa en una modificacin de una cmara para tratamiento esttico por adicin de canales deflujo incluidos en el interior de la cmara (Figura 8).

Aunque en las cmaras de tratamiento de forma coaxial la intensidad de campo no esuniforme, se ha centrado mucho la atencin en ellas debido a la uniformidad en el flujo delfluido y la simplicidad en la estructura de la cmara (Zhang et al., 1995) (Figura 9).

Introduccin 32

Electrodo

Canales

Zona de tratamientoOrificio de entrada/salida

del producto

Figura 8. Cmara de flujo continuo de electrodos paralelos en la que el alimento fluye poruna serie de canales (Zhang et al., 1995).

Salida del producto Soporte de aluminio

Cuerpo da la cmara

Electrodo de arto voltale

Sooorte del electrodo

Alto voltaje

Figura 9. Cmara coaxial propuesta para un equipo de PEAIC (Zhang et al., 1995).

En lugar de usar una nica cmara de tratamiento, en la Universidad Estatal de Ohio seha diseado un sistema de varias cmaras dispuestas en serie en las que los electrodospueden ser de diferentes formas (tubulares, cilindricos, rectangulares, elpticas o con undiseo no uniforme) (Figura 10). El alimento se refrigera en el espacio entre cmaras (Yin etal., 1997).

33 Introduccin

tanqueGn*f*dor da pulso* d* alio vofajs

frecuencia > 1 W-te

nnnaaProducto final

Figura 10. Equipo de tratamiento de alimentos liquidos por PEAIC mediante varias cmarasdispuestas en serie (Yin et al., 1997).

BIBLIOGRAFAArntegui, J. Roseli, J.R., Purroy, P., Barbosa-Cnovas, G.V., Martn, O. 1999. Electrical

properties of peach juice and milk. European Conference of Emerging Food Scienceand Technology, Tampere, Finland.

Ballo, D. 1997. Back to basics. Hewlett Packard.Barbosa-Cnovas, G.V., Pothakamury, U.K., Palou, E., Swanson, E.G. 1998. Nonthermal

preservation of foods. Marcel Dekker Inc., New York.Barbosa-Cnovas, G.V., Gngora-Nieto, M.M., Pothakamury, U.K., Swanson, B.G. 1999.

Preservation of foods with pulsed electric fields. Food Science and Technology,International Series, Taylor S. L. (editor). Academic Press, San Diego, London, Boston.

Barsotti, L., Cheftel, J.C. 1999. Food processing by pulsed electric fields. II. Biologicalaspects. Food Reviews International, 15(2), 181-213.

Beattie, J.M. 1915. Report on the electrical treatment of milk to the city of Liverpool.Liverpool: C. Tinling and Co.

Centralp. 2000. Informacin tcnica.Dunn, J.E., Pearlman, J.S. 1987. Methods and apparatus for extending the shelf-life of fluid

food products. US Patent n 4,695,472.Edebo, L., Holme, T., Selin, I. 1969. Influence of the Conductivity of the Discharge Liquid

on the Microbicidal Effect of Transcient Electric Arcs in Aqueous Systems. AppliedMicrobiology, 1 (17), 59-62.

Introduccin 34

Grahl, T , Sitzmann, W, Markl, J 1992 Killing of microorganisms in fluid media by high-voltage pulses In Kreysa G, Dnsel X (eds ), 10th Dechema Biotechnology ConferenceSeries SB, 675-678, Verlagsgesellschaft, Hamburg

Ho, S Y, Mittal, G S , Cross, J D 1997 Effects of high electric pulses on the activity ofselected encimes Journal of Food Engineering, 31, 69-84

Jeness, R., Koops, J 1962 Preparation of a salt solution which simulates milk ultrafiltrateNetherlands Milk and Dairy Journal, 16 (3), 153-164

Lewis, M J 1993 Propiedades fsicas de los alimentos y de los sistemas de procesadoEditorial Acribia, Zaragoza

Martin, O, Zhang, Q, Castro, A J, Barbosa-Canovas, GV, Swanson, B G 1994Revisin Empleo de pulsos elctricos de alto voltaje para la conservacin de alimentosMicrobiologa e ingeniera del proceso Revista Espaola de Ciencia y TecnologaAlimentaria, 1 (34), 1-34

Matsumoto, Y, Shioji, N , Satake, T , Sakuma, A 1991 Inactivation of microorganisms bypulsed high voltage application IEEE Conf Rec Ind Appi Soc Ann, 652-659

Ohio State University 2000 Informacin tcnicaQin, B L , Zhang, Q, Barbosa-Canovas, GV, Swanson, B G , Pedrow, P D 1994

Inactivation of microorganisms by pulsed electric fields of diffrent voltage waveformsIEEE Transactions Dielectrics and Electrical Insulation, 1, 1047-1057

Qin, BL, Chang, F J , Barbosa-Canovas, G V , Swanson, B G 1995a Non-thermalinactivation of Saccharomyces cerevisiae in apple juice using pulsed electric fieldsLebensmittel Wissenschaft und Technology, 28, 564-568

Qm, BL, Zhang, Q, Barbosa-Canovas, GV, Swanson, BG, Pedrow, P D 1995bPulsed electric field treatment chamber design for liquid food pasteurization using afinite element method Transactions of American Society of Agncultrual Engineering,38, 557-565

Qiu, X, Sharma, S , Tuhela, L, Jia, M, Zhang, Q 1998 An integrated PEIAC Pilot PlantFor Continuous Nonthermal Pasteurization of Fresh Orange Juice AgnculturalEngineering, 41, 1069-1074

Riley, T , Watson, A 1987 Polarography and other voltametnc methods New York JohnWiley and Sons

Sale, A J H , Hamilton, W A 1967 Effect of high electric fields on microorganisms IKilling of bacteria and yeasts Biochimica and Biophysica Acta, 148, 781-788

Thomson-CSF 2000 Informacin tcnicaTipler, PA 1994 Fsica Tomoli Editorial Reverte, BarcelonaVega-Mercado, H, Pothakamury, U R, Chang, F J, Barbosa-Canovas, G V, Swanson,

B G 1996 Inactivation of Eschenchia coli by combining pH, ionic strength and pulsedelectric field hurdles Food Research International, 29, 117-121

Vega-Mercado, H, Martn-Belloso, O , Qin, B L, Chang, F J , Gngora-Nieto, M M,Barbosa-Canovas, GV, Swanson, B G 1997 Non-thermal food preservation pulsedelectric fields Trends in Food Science and Technology, 8, 151-157

Wouters, P C , Smelt, J P P M 1997 Inactivation of microorganisms with pulsed electricfields potential for food preservation Food Biotechnology, 11, 193-229

Wouters, P C , Dutreux, N , Smelt, J P P M, Lelieveld, H L M 1999 Effects of pulsedelectric fields on inactivation kinetics of Listena innocua. Applied And EnvironmentalMicrobiology, 65 (12), 5364-5371

Yin, Y, Zhang, Q H, Sastry, S K 1997 High voltage pulsed electnc field treatment

_35 Introduccin

chambers for the preservation of liquid food products. U.S. Patent n 5,690,978.Zhang, Q., Barbosa