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Trucos y consejos en Fast LC para UHPLC y HPLC
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Trucos y consejos en Fast
LC para UHPLC y HPLC
Agenda
Columnas para cromatografía rápida superficialmente y
totalmente porosas.
Elección de fase estacionaria en función de la polaridad de
los compuestos
Page 2
Poroshell 120 – Una nueva aproximación a la Alta
Resolución y la Alta Velocidad en LC
• Poroshell 120 es una columna de alta eficacia y alta resolución para mejorar la productividad en un HPLC o UHPLC.
• Para separaciones de alta resolución en equipos 1200, 1100 y otros HPLCs (Presión < 400 bar).
• Columnas de 4.6 y 3.0 mm ID de gran volumen para cualquier HPLC
• Columnas de 2.1 mm ID adecuadas para LC/MS y sistemas optimizados para bajos volumenes de columna.
• Para separaciones de alta presión en equipos 1200 RRLC, 1290 Infinity u otros UHPLC con Presión > 400 bar
• La columnas Poroshell 120 largas proporcionan una elevada eficacia (un columna o dos columnas en serie).
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1.7um
0.5um
0.5um
Las Columnas Poroshell 120 tienen:
• 80-90% de eficicacia de las sub 2um
• A presiones un ~40-50% más bajas
• Con un tamaño de partícula de 2.7um
• Con una frita de entrada de 2um de
porosidad
• Con el doble de resolución de una
columna de 3.5um
• Con un límite de presión de 600 bar
• La partícula tiene un núcleo sólido
(1.7um) y una cubierta exterior porosa
de 0.5um como zona de difusión
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC:
Las Columnas Poroshell 120 están
disponibles en 9 fases diferentes
5
EC-C18
EC-C8
SB-C18
SB-C8
EC-CN
Fenil-Hexil
Bonus RP
SB-Aq
HILIC Y las precolumnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
Nuestra recomendación es usar
Poroshell 120, disponible en
6
EC-C18
EC-C8
SB-C18
SB-C8
EC-CN
Fenil-Hexil
Bonus RP
SB-Aq
HILIC
1.7um
0.5um
0.5um
Y las precolumnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
Pida el nuevo catálogo
5990-5951EN
Elija Poroshell 120 para HPLC de Alta Eficacia
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min 1 2 3 4 5 6
mAU
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100
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300
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mAU
0
50
100
150
200
250
Poroshell 120 EC-C18,
3.0 x 100mm, 2.7 µm;
N = 21,567, P = 260 bar
RRHT Eclipse Plus C18
3.0 x 100mm, 1.8 µm;
N = 25753, P = 586 bar
Rapid Resolution Eclipse Plus C18,
3.0 x 100mm 3.5 µm;
N = 11651, P = 153 bar
Columnas: 3.0 x 100mm, Fase Móvil: 65% A: 0.2% Ácido Fórmico: 35% B: Metanol Isocratico, Flujo 0.5 mL/min
1 µL inyección 26 °C Sig = 220, 4 nm, Ref = Off Muestra: 1. Sacarina 2. Cafeina 3. Ácido P-hidroxibenzoico
4. Aspartamo 5. Ácido Dehidroacético 6. Ácido Benzoico
Casi 2X la eficicacia de 3.5um
Presión HPLC (< 400 bar)
2 4 6
mAU
0
100
200
300
2 4
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0
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200
300
min 2 4
mAU
0
100
200
Poroshell 120 EC-C18 para Separaciones rápidas en
UHPLC
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Columna: Poroshell 120 EC-C18 3.0 x 100mm, 2.7um Fase Móvil: 65% A: 0.2% Ácido Fórmico: 35% B: Metanol
Isocrático, Varios Flujos 1 µL inyección 26 oC Señal = 220, 4 nm, Ref = Off Muestra: 1. Sacarina 2. Cafeina 3.
Ácido P-hidroxibenzoico 4. Aspartamo 5. Ácido Dehidroacético 6. Ácido Benzoico
Flujo = 0.5 mL/min,
P = 260 bar, NAB = 24567
Flujo = 0.75 mL/min,
P = 380bar
Flujo = 1.0 mL/min,
P = 521bar
3
Pueden usarse Solventes más viscosos como el metanol a presiones HPLC o UHPLC.
Maximizar la Eficacia usando columnas Agilent
Poroshell 120 Evaluacion de N para la Poroshell 120 150 mm × 4.6 mm column
9
Muestra:Thiourea, Acetophenone, Benzene, Toluene
Column: Agilent Poroshell 120 SB-C18 150 mm × 4.6
mm, 2.7 μm
Fase Movil: Agua: ACN = 30:70
Flujo: 1.5 mL/min
Volumen de Inyección: 1 μL
Temperatura columna: 50 °C
Detector: DAD 254 nm/10, Ref 360/100 nm, 20 Hz,
celda estandar
Pressure: 190 bar
Maximizar la Eficacia usando columnas Agilent
Poroshell 120 100.000 platos en menos de 5 min usando 3 columnas en serie
Muestra: Thiourea, Acetophenone, Benzene, Toluene
Columna: Tres columnas Agilent Poroshell 120 SB-
C18, 150 mm × 4.6 mm, 2.7 μm
Fase Movil: Water: ACN = 20:80
Flujo: 1, 1.5, 1.8 mL/min
Volumen de inyección: 1 μL
Temperatura columna: 60 °C
Detector: DAD 254 nm/10, Ref 360/100 nm, 20 Hz,
celda estandard
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna: Poroshell 120 EC-C18, 3.0 x 50mm, 2.7um LC: Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra: Plasma Precipitado: 2 partes Plasma: 7 Partes 20/80 Agua-MeCN w/0.1 % Ácido Fórmico con 1 Parte de
Diflusinal en 50/50 Agua-MeCN 10 ug/ml (Concentracion Final Diflusinal 1 ug/ml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado/ No Filtrado
Volumen de Inyección: 1ul
Solvente A: Agua w/0.1 % TFA
Solvente B: MeCN w/0.08 % TFA
Flujo 1 ml/min 1 ul inyección
Tiempo % B
0 20
0.5 90
0.6 90
1.1 20
2.5 20
Page 11
'Diflunisal' es un anti-inflamatorio no esteroidal
análogo a la aspirina. desarrollado por Merck Sharp
& Dohme .
Criterios de Ajuste de Métodos USP y FDA de
dimensiones de columna
Parámetro Especificaciones Máximas Comentarios/Ejemplos
Longitud de Columna ± 70% 250mm 75mm
150mm 50mm
Diámetro Interno de
Columna
±25% (FDA ORA-LAB 5.4.5*)
USP – ± 25% ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante**
4.6 mm 3.0 mm (-35%)
4.6 mm 2.1 mm (-54%)
3.0 mm 2.1 mm (-30%)
Flow Rate ±50%
Volumen de Inyección
Reducir tanto como se necesite–
debe cumplir los límites de
detección y precisión
Si cambia a una columna más
corta , haga el cambio apropiado
en el volumen de inyección
Tamaño de Partícula Reducir hasta el 50%
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamaño de partícula para mantener la misma
Rs
5um 3.5um (-30%)
5um 2.7um (-46%) *Cambiado en 2/24/09 – Para la copia oficial y actual , ir a
http://www.fda.gov/ScienceResearch/FieldScience/default.htm
** USP 30 Second Supplement Revisions, PF34(5), en proceso.
Ver “ Stimuli article” en Pharmacopeial Forum 2009; 35(6)
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Comparación de 4.6 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 4.6 x 100 mm, 2.7um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
9.7
12
11.1
16
11.5
96
12.6
74
15.2
48
16.1
51
16.4
35
20.6
87
23.0
76
29.2
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
1.7
19
2.1
89
2.3
11
2.6
06
3.8
67
4.4
37 4.5
58
5.4
50
5.9
20
7.0
37
Análisis más rápido(columna más corta, flujo más alto)
Mayor sensibilidad(partícula más pequeña,pico más estrecho)
Más optimizado (un análisis más rápido permite ajustar mejor)
Ambos análisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparación de muestra, frita de
entrada de 2 micras en ambas columnas.
325 bar
110 bar
Sulfadiazina,
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina,
Sulfametazina,
Sulfametazol,
Sulfametoxipiridazina,
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol,
Sulfadimetoxina
Tiempo %B
0 8
33 33
34 33
Columna: Eclipse Plus C18
4.6 x 250mm, 5um
Flujo: 1 mL/min
Fase Móvil:
A: 0.1% Ácido Fórmico en Agua
B: 0.1% Ácido Fórmico en ACN
Tiempo %B
0 8
12 33
13.2 33
Columna: 4.6 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18,
2.7um
Flujo: 1.85 mL/min
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Comparación de 4.6 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 4.6 x 100 mm, 2.7um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
9.7
12
11.1
16
11.5
96
12.6
74
15.2
48
16.1
51
16.4
35
20.6
87
23.0
76
29.2
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
1.7
19
2.1
89
2.3
11
2.6
06
3.8
67
4.4
37 4.5
58
5.4
50
5.9
20
7.0
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
Page 14
Mejor Resolución ,
linea base!!
Análisis más rápido del método USP para pastillas de
Simvastatin en Columnas Poroshell 120– Ajuste del método
4.6 x 250 mm, 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
4.6 x 75 mm, 2.7-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65% CH3CN, 35% 3.9 g/L NaH2PO4 (pH 4.5), 45 oC, Sig = 238, 8; Ref = 360, 100 nm
Flujos: 1.5 mL/min para la columna de 5-um ; 2.8 mL/min para la columna Poroshell 120 2.7um
Requerimiento
USP
5-um
(1.5 mL/min)
2.7-um
(2.8 mL/min)
TR n/a 9.907 1.457
k’ > 3.0 5.962 5.122
N > 4500 16939 14439
Tf < 2.0 1.09 1.10
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Alta Velocidad y Resolución
hasta 5 mL/minuto en el
1290 Infinity LC con las
columnas Poroshell 120
Equación de la presión
Viscosidad Flujo Longitud
Permeabilidad Específica Radio Columna
Diametro Partícula
ΔP = ηFL
K0πr2dp2
LC Calculator:
http://www.chem.agilent.com/en-US/Products/columns-supplies/lc-lc-mscolumns/Pages/calc_app.aspx
La presión que generan columnas totalmente porosas de 250mm/5um,
150mm/3.5um y 50mm/1.8um y columnas superficialmente porosas de
75mm/2.7um es bastante parecidaa
250x4.6mm,5um 150x4.6mm, 3.5um 75x4.6mm, 2.7um 50x4.6mm, 1.8um
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¿Que puede hacerse más alla de esto con UHPLC?
Columnas RRHD para uso con el Infinity 1290 LC
Usar un rango más amplio de fases móviles
Solventes más viscosos– metanol, u otros alcoholes
Aditivos en la fase movil para optimizar las separaciones
Ir más rápido– mayor rango de flujos!
Usar columnas más largas– maximizar la resolución!
Optimizar métodos más rápido, mejorando la productividad!
Page 20
LC más allá de 600 bar requiere las Nuevas
columnas RRHD Agilent ZORBAX RRHT Eclipse Plus C18, 2.1 x 100 mm, 1.8 um; PN 959764-902,
SN USUXU01664, LN B08101
y = 935.21x + 7.1903
R2 = 0.9993
y = 1025.3x + 13.279
R2 = 0.9973
y = 1817.7x + 21.259
R2 = 0.9946
0
100
200
300
400
500
600
700
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Flow Rate (mL/min)
Pre
ssu
re (
bar
)
Acetonitrile/Water(60:40)
Acetonitrile/Water(50:50)
Methanol/Water(60:40)
Aumento de eficacia y Resolución con longitudes
largas 150 + 100 mm = 250 mm 1.8um @ 1100 bar
Page 21
α3,2: 1.20
Rs3,2: 8.76
N6 : 50,200 Pw2: 0.018 min
Pw6: 0.037 min
α3,2: 1.19
Rs3,2: 6.42
N6 : 31,400 Pw2: 0.016 min
Pw6: 0.029 min
150 mm (P:582 bar)
150 +100 mm (P:1095 bar) 1. Uracilo
2. Acetofenona
3. Propiofenona
4. Butirofenona
5. Valerofenona
6. Hexanofenona
Fase Móvil:25:75 agua:acetonitrilo, Flujo: 0.5 mL/min, temperatura ambiente,
Columnas ZORBAX RRHD SB-C18, 1.8um
Alta Rs en 3.5 minutos, 250mm, 1.8um a 1100 bar
La Resolución es buena con la columna de 150mm, pero con una columna más
larga la resolución es mejor
min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
mAU
0
50
100
150
200
250
300
min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
mAU
0
50
100
150
200
250
300
Fases disponibles de columnas RRHD, 1200 bares
(17.400 psi)
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Agilent tiene 3 tipos de columnas para UHPLC
Columnas RRHT – columnas 1.8um para LC rápida hasta 600 bar
• Designadas para su uso con el Agilent 1200RRLC
• Compatible con algunos UHPLC’s con límites de presión hasta 800 bar
Columnas RRHD – columnas1.8um hasta1200 bar
• Designadas para uso con el nuevo Agilent 1290 Infinity LC
• Para trabajos hasta1200 bar
• Totalmente UHPLC compatible
Poroshell 120 columns
• Límite the presión de 600 bar para uso con HPLC/UHPLC
• Excellente ajuste para LC’s de 400 bar con resultados tipo UHPLC
Page 23
Guías de Selección de Columnas Agilent UHPLC
Análisis
Rápido
Alta Rs
(N)
400 bar LC “Compatible”
1000+ bar
UHPLC “Compatible”
Escalabilidad
de Partícula
1.8, 3.5um
etc.
ID’s
4.6, 3.0
& 2.1
mm
Muestras
sucias?
Poroshell
120, 600
bar X only 2.7um
frita
2um
RRHT,
600 bar
<50mm
RRHD,
1200 bar X X
(3.0 &
2.1)
Page 24
Fast Guards para UHPLC
Agilent Fast Guards for UHPLC Why?
• Los cromatografistas trantan de minimizar el costo por muestra
extendiendo la vida de la columna
• Areas primarias de aplicación
– Analisis de muestras sucias
• Extractos de fluidos biologicos
– Orina
– Plasma
• Muchos problemas se pueden evitar con una preparación de muestra
mejorada, pero añadir una precolumna es más fácil y rápido.
Page 26
Agilent Fast Guard for UHPLC Diagram
• Agilent Fast Guards para UHPLC son una precolumna de una
pieza diseñada para su uso con Poroshell 120 y columnas Agilent
RRHD Sub-2um
• Inicialmente disponibles en fases Poroshell 120 EC-C18 y SB-C18
en 2.1mm, 3.0mm, y 4.6mm ID x 5mm length y en 2.1 y 3.0mm ID
para 1.200 bares y 4.6mm ID para 600 bares.
Page 27
Guard
Capilar integrado
Tuerca y ferrulas
(includas con la precolumna)
Impacto en el rendimiento con Guard Column
Page 28
min 0 0.5 1 1.5 2 2.5
mAU
-5
0
5
10
15
20
25
30
35 0
.37
9
0.6
06
1.3
79
2.3
13
min 0 0.5 1 1.5 2 2.5
mAU
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
0.4
02
0.6
41
1.4
51
2.4
30
QC sin guard
QC con guard
2.1x100mm Poroshell 120 EC-C18 column, 2.1x5mm guard column
Naftaleno
17800 platos
Naftaleno
18100 platos
• Agilent Fast Guards para UHPLC están diseñadas para tener un impacto mínimo en
el rendimiento (nunca más de una reducción de un 10% en el rendimiento de una
columna de 50mm) • En algunos casos pueden incluso incrementar ligeramente la resolución (como arriba)
Beneficios de Instalar una Guard column
Page 29
400
450
500
550
600
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
400
450
500
550
600
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Sulfachloropyridazine PW Sulfamethoxazole PW End Pressure
Ancho d
e P
Ico
(m
in)
Ancho d
e P
ico (
min
)
Pre
ssure
(bar)
Pre
ssure
(bar)
Metodo: Test de tiempo de vida acelerado - Similac sample (sustituto de leche diluido 300:1)
conteniendo 2 sulfa drugs; el cambio en el ancho de pico es indicativo del fallo de columna
Sin Guard Fallo columna @
inj. 70; se
requiere nueva
columna
Con Guard Fallo guard @ inj.
80; guard cambiada;
Misma columna
usada para todos
los analisis
Instalando una guard column con las muestas más sucias, se puede alargar el tiempo
de vida de la columna, y utilizar guard columns más baratas que reemplazar una
columna
$$$
Cambio
de
columna
Guard column aumenta la vida de la columna analitica
Guard cambiada
Guard Column Training Video
• Training video mostrando como se instala
una guard column
• Disponible en la pagina de Agilent y en
Youtube.
• Click here for video
Page 30
Elección de fase
estacionaria en función de la
polaridad de los
compuestos
Química de la separación cromatográfica
La dificultad en la separación de los compuestos polares en
fase reversa estriba en su muy poca retención debido a su
hidrofilicidad
A veces requieren fases 100% acuosas para tener una buena
solubilidad lo que conlleva al colapso hidrofóbico de las fases
apolares C18
Se han buscado distintas aproximaciones para estas
separaciones
Separaciones por fase normal
Separaciones por par iónico
Separaciones en fases estacionarias capaces de manejar fases móviles
100% acuosas: fases Aqua, fases poliméricas
Separaciones HILIC
32
Objeciones a los métodos
La cromatografia en fase normal tiene el inconveniente de
que los solventes organicos usados no disuelven bien
determinados compuestos polares y no son compatibles con
la detección por MS.
La cromatografía en fase reversa por par ionico (ICP) es
compleja y requiere un control estricto de la concentración
del reactivo de par iónico.
Las separaciones en fases “Aqua” son una buena alternativa
a la ICP, pero dependen de la capacidad de retención del
compuesto en la fase
La cromatografía HILIC es compleja y todavía no bien
entendida
33
34
C18 es la fase reversa ligada más popular porque...
Las columnas C18 proporcionan buena retencion y resolución
con muchas muestras diferentes
Las columnas C18 tiene una larga duración en muchas fases
móviles diferentes (pH 2-8 o e incluso pH 2-9 y hasta 11.5)
Las columnas C18 son muy flexibles para el desarrollo de
métodos y la optimización, debido a su amplio rango de
condiciones de uso.
Hay una gran variedad de C18’s para optimizar la selectividad y
resolución con diferentes tipos de muestras– i.e. diferentes tipos
de ligado C18 (monomerico vs. polimerico, monofuncional vs.
trifuncional, diferente densidad de ligado, diferentes reactivos de
ligado etc.) y diferentes desactivaciones ( endcapping).
¿Porqué necesitamos alternativas al C18?
Page 35
min 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
mAU
0
10
20
min 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
mAU
0
10
20
min 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
mAU
0
10
20
Fenol
Metilparaben Etilparaben
N,N-Dietil-m-
toluamida
Propilparaben Butilparaben
Tolueno
Heptilparaben
Eclipse Plus C18
Eclipse Plus
PhenylHexyl
Bonus RP
Flujo: 0.5ml/min; Gradiente::25 a 80%ACN en 3min, a 4min 90%ACN,a 4.5min 25%ACN, por 6min25%ACN
Tiempo de análisis: 6min; Vol inyección.: 3µl con needle wash (Agua/Methanol=50/50)por 6 s; T: 30°C (storage/run)
DAD: 254nm bw 10, ref. 360/100nm, 4nm slit, peak width 0.01min
Coelución
Coelución
Orden elución
¿Qué clases de Fármacos son críticos? Ácidos, bases, moleculas polares y compuestos aromáticos/conjugados,
Page 36
4-Acetamidofenol
pKa 9.71
C l
N +
C l -
Clormequat
Adenosintrifosfato (ATP)
Acido acetilsalicílico
pKa = 3.5
cis-Permetrina
Page 37
Separación de Acidos/Bases. Fases Stablebond
Columna: 4.6 x 75 mm, 3.5 m Fase Móvil : 80% 25 mM NaH2PO4, pH 3.0 : 20% MeOH Flujo : 1.0 mL/min Temperatura: 35°C Detección: UV 254 nm
StableBond
SB-C18
Time (min)
0 5 10
1 3
2
StableBond
SB-Phenyl
1
3
StableBond
SB-C8
Time (min)
0 5 10 15
1
2, 3
Time (min)
0 5 10 15 20
Time (min)
0 5 10
2
3
1
2
StableBond
SB-CN
Muestra: 1. Barbital 2. Sulfametoxazol 3. Cafeina
Page 38
Selectividad óptima para separaciones ultrarrápidas
min
RRHT SB-Phenyl: Selectividad más rápida!
Columna: RRHT 4.6 x 50mm, 1.8um Fase Movil: Acetonitrilo (40%):Tampon 60% pH=2.4 25mM NaH2PO4
Flujo: 1.85 mL/min Detección: DAD, 254 nm LC: Agilent 1200 RR LC Vol inyección: 1 uL
Orden de elución: Picos 3,4 & 5
Muestras:
1. Tolmetina
2. Naproxeno
3. Diflusinal
4. Ibuprofeno
5. Diclofenaco
para SB-Phenyl
SB-Phenyl 1.8um
SB-C8 1.8um
SB-C18 1.8um
SB-CN 1.8um
0 1 2 3 4 5
mAU
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Optima!
Doble de tiempo
Tailing
Interacciones secundarias
Co-Elución
Poroshell 120 EC-CN en el método EPA 8330
• El método EPA 8330 requiere el uso de ambas columnas para este análisis.
• Los cromatogramas muestran un analisis en gradiente usando la nueva
Poroshell 120 EC-CN junto con la Poroshell 120 EC-C18
min 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5
mAU
0
10
20
30
40
50
min 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5
mAU
0
10
20
30
40
50
1
2
3 4
5 6 9
12 13 14
7
8 11 10
9
1
7
10 2
11
8
6
5
3
4
12, 13
14
1. HMX
2. RDX
3. 1,3,5-Trinitrobenzene
4. 1,3-Dinitrobenzene
5. Nitrobenzene
6. 2,4,6-Trinitrotoluene
7. 2-Amino-4,6-dinitrotoluene
8. 2,4-Dinitrotoluene
9. Tetryl
10. 4-Amino-2,6-dinitrotoluene
11. 2,6-Dinitrotoluene
12. 2-Nitrotoluene
13. 4-Nitrotoluene
14. 3-Nitrotoluene
Poroshell 120 EC-CN
Poroshell 120 EC-C18
Page 40
ZORBAX: Bonus RP
1
1
1
1
1
1
PG R
PG R
PG R
Rango de pH: 2 - 9
Límite de temperatura: 60ºC Tamaños de Partícuila: 1.8, 3.5, 5, 7 3m
•Gel de sílice ultra pura Zorbax RxSil
•Silanos monofuncionales
•Grupo amida polar embebido
•Cadenas laterales voluminosas para
estabilidad a bajo pH
•Triple desactivación para estabilidad
a pH medio y buenas formas de pico
Ventajas:
Analisis de compuestos altamente
polares en condiciones 100% acuosas.
Selectividad ortogonal
Page 41
Columnas:4.6 x 150 mm, Fase Móvil: 25 mM Citrato
Sódico, pH 6/ MeOH, 75/25, Flujo: 1 mL / min.,
Detección: 254 nm
Volumen de inyección: 3 µLMuestra: Cefalosporinas
(1 Cefalexin, , 2 Cefaclor, 3 Cefuroxim, 4 Cefoxitin)
Columnas: 4.6 x 150 mm, Fase Móvil: MeOH:0.1% TFA
(70:30) Flujo: 1 mL/min., Temperatura: RT, Inj.: 2 µL,
Detección: 254 nm, Muestra: Triazinas (1. Prometrina 2.
Tebuthion, 3. Atrazina, 4. Propazina, 5. Diuron, 6.
Propanill, 7. Dacthal
Selectividad Ortogonal de la Bonus RP
mAu
0
40
80
120 DAD1 A, Sig=254,16 Ref=450,80 (F:\1\DATA\TRANQ\TRANQ063.D)
min2 4 6 8
mAu
0
40
80
120 DAD1 A, Sig=254,16 Ref=450,80 (F:\1\DATA\TRANQ\TRANQ062.D)
0
1
2
3
4
2
3
1
4
Bonus-RP
Alkyl-C8
mAU
0
400
800 DAD1 B, Sig=254,16 Ref=360,60 (F:\2\DATA\TRIAZINE\AZINE046.D)
min0 2 4 6 8
mAU
0
400
800 DAD1 B, Sig=254,16 Ref=360,60 (F:\2\DATA\TRIAZINE\AZINE047.D)
Bonus-RP
Alkyl-C8
1
2 3 4
7
5 6
Cefalosporinas Pesticidas
1
2
3 5
4
7 6
La mejor resolución con Poroshell 120 Bonus-RP –
Compuestos básicos- β-Bloqueantes
2
min 0 2 4 6 8 10 12
mAU
-100
0
100
200
300
min 0 2 4 6 8 10 12
mAU
-100
0
100
200
300
1
1
2
3
3 4
4
5
5 6 7
6 7
Poroshell 120 EC-C18
Poroshell 120 SB-C18
min 0 2 4 6 8 10 12
mAU
-100
0
100
200
300 2
1 3 4 5
7 6
Poroshell 120 Phenyl Hexyl
min 0 2 4 6 8 10 12
mAU
-100
0
100
200
300
2
1 3 4
5 7
6 Poroshell 120 Bonus RP
10 mM pH 3.8 NH4HCO2, Metanol; 90 % B a 30 % B durante 12 min, 0.35 ml/min, todas las columnas 2.1 x 100 mm
1. Atenolol, 2. Pindolol, 3. Naldolol, 4. Metoprolol, 5. Acebutolol, 6. Propranolol, 7. Alprenolol
Page 43
HILIC - Hydrophilic Interaction Chromatography
Tipos de compuestos:
Moléculas altamente polares que no se retienen en fase reversa
Fases estacionarias:
Silica gel Rx Sil, Amino, Diol, Cyano y las especiales (zwitterionicas)
Fase móvil:
>50-60 Acetonitrilo mezclado con fase acuosa/polar , ácido fórmico, formiato, acetato (no tampón fosfato)
Gradiente:
100% ACN a 50%ACN
El agua es el disolvente más fuerte
Detección:
UV y MS-ESI
El alto contenido orgánico ofrece una buena sensibilidad en MS
44
Analitos típicos en HILIC
1. Amino acidos (cuando solo unos pocos
son de interés)
2. Bases nucleicas (purinas y pirimidinas,
uracilo, adenina, guanina, timina,
cistosina)
3. Nucleosidos (Adenosina, citosina.)
4. Alcaloides
5. Carbohidratos
6. Acrilamida
Melamina
Citosina
Amfetamina
CH 2 CHCH 3
NH 3 +
Page 45
Elución de los componentes de una muestra
Alcanos
Olefinas
Aromaticos
Etéres
Esteres, Aldehidos,
cetonas
Alcoholes, Aminas
Amidas
Ácidos carboxílicos
NP
RP
Se
cu
en
cia
de
Elu
ció
n
< k’-Valor
No polar
polar
HILIC
Se
cu
en
cia
de
Elu
ció
n
< k’-Valor
polar
Alcoholes, Aminas
Amidas
Ácidos carboxílicos
< k’-Valor
Page 46
Ventajas con HILIC
Buena retención de compuestos altamente polares que no se
conseguiría en el modo de RP.
Selectividad diferente a la LC RP y NP. Selectividad ortogonal. Orden
de elución inversa a RP
• Pueden usarse flujos más altos y/o columnas más largas debido a la baja
viscosidad de las fases con alto contenido en organico: mayor eficiencia
Mejor sensibilidad en en LC/MS
• Un alto contenido en orgánico lleva a una mejor s/n en ESI-MS
La preparación de la muestra es más fácil gracias a la alta
concentración de fase orgánica
• SPE, o extracción líquido/líquido que dejan las muestras en un alto
contenido orgánico.
• Desolvatación y spray más eficaz en electrospray MS
• Puede facilitar la solubilidad de la muestra
Poroshell 120 HILIC -análisis de Catecolaminas
min 1 2 3 4 5
mAU
0
50
100
150
200
250
0.2
22
0.6
71
1.2
65
1.8
85
2.1
61
3.0
72
A: 90 (Tampón100 mM pH 3) 10 MeCN
B: 90 MeCN 10 (Tampón100 mM pH 3)
% A % B
Inicial 0 100
5 Min 7.5 92.5
6 min 0 100
12 min 0 100
0. 55 mL/min
Poroshell 120 HILIC 2.1x 100mm
1. Dopamina, 2. Epinefrina, 3. Norepinefrina
3
1
2
• Las Catecolaminas pueden ser
dificiles de separar por fase reversa
• Este cromatograma muestra un
rápido análisis de 3 catecolaminas
con la columna Poroshell 120 HILIC
Tipo de fase
Fenil ligada
Desacti
vada
Tipo de
Silica Columna Agilent Qué las diferencia?
Dimetil
Fenilhexil Si B Eclipse Plus Phenyl-
Hexyl
El grupo hexilo más
voluminoso añade
hidrofobicidad a la fase.
Dimetil Feniletil
Si B Eclipse XDB-Phenyl Primera Fenil Silica Tipo B
Diisopropil
Feniletil No B SB-Phenyl
La no desactivación
aumenta las interacciónes
hidrofílicas y con los
silanoles
Dimetil Feniletil
Si A ZORBAX Phenyl
Fenil original
Silica tipo A con diferente
selectividad
Diphenyl
Si B Pursuit Diphenyl Única con funcionalidad
Difenilo
Fases ZORBAX Fenil y Pursuit DiPhenyl.
Un amplio rango de selectividades alternativas.
ZORBAX 300-Diphenyl, 1.8um
La fase difenil es una fase única que previamente solo estaba disponible en columnas 100A Pursuit XRs y 200A Pursuit.
Aplicando esta probada química a las partículas ZORBAX 300A 1.8 μm ,esta selectividad unica puede ser explotada para separaciones de proteinas usando fase móviles de TFA y ácido fórmico.
Page 50
Formulas moleculares de hormonas esteroideas
Pequeños sistemas conjugados
Page 51
Esteroides – Fase Fenilo y ACN
El ACN facilita la separación según la hidrofobicidad
Page 52
Esteroides – Fase Fenilo y MeOH
El MeOH facilita la separación según la aromaticidad/electrones pi
La mejor resolución con Poroshell 120 Phenyl-Hexyl
– Para compuestos esteroideos
0 2 4 6 8 10 12
0 2 4 6 8 10 12
mAU
0
50
100
150
0 2 4 6 8 10 12
mAU
0
50
100
150
0 2 4 6 8 10 12
mAU
0
50
100
150
mAU
0
50
100
150
Poroshell 120 EC-C18
Poroshell 120 SB-C18
Poroshell 120 Phenyl Hexyl
Poroshell 120 Bonus RP
Separación de 8 Esteroides : 40 -80 % MeOH/14 min, 0.4 ml/min 25 C 2.1 x 100 mm , 0.1 % acido fórmico tanto en agua como en MeOH
1.Hydrocortisone, 2.b-Estradiol, 3. Andostadiene 3,17 dione, 4. Testosterone, 5.
Ethyestradione, 6. Estrone, 7. Norethindone acetate, 8. Progesterone
1 3
2,5 6
4 7 8
1
3
2,5,6
4 7 8
1
1
3,2
3
7,8
7 8
4
2 5 6
6,4
5
Page 54
Structures of Azo Dyes
Aniline o-toluidine Methoxyanaline Benzidine
ChloroanilineDimethylbenzidine Napthalamine
Dichlorbenzidine
3,3′-Dimethoxybenzidine
Estructuras de los colorantes azoicos
R-N=N-R‘ Compuestos azo
HN=NH Diazeno
N=N Grupo Azo
Page 55
Condiciones:
Fase Móvil A:10mM Acetato amónico, B: MeOH, Gradiente: 25%B->90%B en 9 min, Flujo: 1ml/min, Vol. Inyección: 2ul,
Temperatura: 25C, Detección: 220nm
Colorantes Azo y sus productos de degradación
en diferentes fases Zorbax Fenil.
C6
C3
Separación de aminas aromáticas derivados de la
degradación de colorantes Azo -N=N-
15 to 100 % MeOH over 10 min @ 0.4 ml/min, Solvent A is 10 mM Ammonium Acetate pH 4.8
min0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
100
200
300
400
DAD1 A, Sig=260,80 Ref=off (C:\DOCUMEN...INGS\WILLLONG\MY DOCUMENTS\DEC14\DATA\AZO DYES\SURVEY30000002.D)
min0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
100
200
300
400
DAD1 A, Sig=260,80 Ref=off (C:\DOCUMEN...INGS\WILLLONG\MY DOCUMENTS\DEC14\DATA\AZO DYES\SURVEY30000004.D)
min0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
100
200
300
400
DAD1 A, Sig=260,80 Ref=off (C:\DOCUMEN...INGS\WILLLONG\MY DOCUMENTS\DEC14\DATA\AZO DYES\SURVEY30000006.D)
min0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
100
200
300
400
DAD1 A, Sig=260,80 Ref=off (C:\DOCUMEN...INGS\WILLLONG\MY DOCUMENTS\DEC14\DATA\AZO DYES\SURVEY30000008.D)
Poroshell 120 EC-C18
Poroshell 120 SB-C18
Poroshell 120 Phenyl Hexyl
Poroshell 120 Bonus RP
9 picos
57
Columnas Agilent ZORBAX y especiales de HPLC Columnas para Pequeñas Moléculas Fase Reversa • Poroshell 120 EC-C18, EC-C8
• Eclipse Plus C18, C8, Phenyl-Hexyl, Poroshell Phenyl-Hexyl
• Eclipse XDB-C18, C8, Phenyl, CN, Poroshell EC-CN
• StableBond-C18, C8, Phenyl, C3, CN and SB-AQ, Poroshell 120 SB-C18 , SB-C8 y SB-Aq
• Bonus-RP, Polaris C18-A , C18-eter. C8-A y C8-eter, Poroshell 120 Bonus-RP
• Extend-C18
• Pursuit XRs Diphenyl y PFP
• Rx-C18, Rx-C8
• Traditional/Original ZORBAX – ODS (C18), C8, Phenyl, CN, TMS
Fase Normal • Rx-Sil
• Original ZORBAX – CN, NH2, Sil, Eclipse XDB-CN
HILIC • ZORBAX HILIC Plus
• Poroshell 120 HILIC
Columnas para BioMoleculas –
Proteinas y Peptidos
Fase Reversa
• 300StableBond
• 300Extend-C18
• Advance BioPeptide Mapping
Intercambio iónico – Bio SCX Series II – para
aplicaciones de proteómica 2D y Bio-IEX
Poroshell (Fase Reversa)
• 300SB-C18, C8, C3, 300Extend-C18
Exclusión Molecular
• GF-250 and GF-450
• Bio-SEC
Bio Monoliths
• Protein A
• Ion-Exchange (DEAE, QA, SCX)
Columnas Poliméricas
• Hi-Plex poliméricas para Carbohidratos y acidos
organicos
• PLRP-S y PL-IEX y PLGel para GPC
Conclusiones Poroshell 120 es una columna para LC de Alta Resolución y Alta
Velocidad, que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC.
Las nuevas columnas Rapid Resolution High Definition (1.8um) son
una solución para los sistemas UHPLC y son únicas en el
mercado gracias a su capacidad de uso por encima de los 1000
bar.
Hay diferentes columnas para compuestos de polaridad diferente:
HILIC ha recibido mucha atención para el análisis de
compuestos polares que no se retienen en columnas RP.
Page 58
Soporte Técnico Agilent
Teléfono de Atención al Cliente:
901 11 68 90
email: [email protected]
www.agilent.com/chem
Page 59
