Troubleshooting SecuenciacinHaga clic para modificar el estilo de subttulo del patrn

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INSTRUMENTO/HARDWARE/CONSUMIBLES 1. Contaminacin en consumibles: Background alto/efecto cascada. 2. Trailing peaks: Amplitud entre los picos muy heterognea, con poca

resolucin.

3. Obstruccin de capilar. 4. Arco voltaico. 5. Contaminacin de los Bloques. 6. Falla en la cmara CCD. 7. Falla en el laser. .SOFTWARE 8. Falla en la calibracin espectral. .QUIMICA/REACTIVOS/USUARIO 9. Background alto: Polmero degradado. 10.Picos del polmero.

5/18/12 11.No se produce reaccin o esta decae poco despus de comenzar.

16. La reaccin comienza de forma normal pero

existe doble lectura a partir de un determinado punto cae

17. La secuencia pierde bruscamente la seal y 18. La seal decae progresivamente de forma

temprana19. Doble lectura inicial que se resuelve antes

de la base 20020. Presencia de picos saturados y fuera de

escala en el cromatograma forma repentina

21. La secuencia es normal pero aparece un pico5/18/12 de

35. Sin seal. 36. Seal baja. 37. Exceso de DNA. 38. Background Alto: Problema en la Extraccin del DNA. 39. Big Dye Blobs: Purificacin. 40. Degradacin del Primer (-1bp).

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INSTRUMENTO/HARDWAR E/CONSUMIBLESHaga clic para modificar el estilo de subttulo del patrn

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1. Contaminacin en consumibles: Background alto/efecto cascada.

Posible causa

Posible solucin

Contaminacin Evitar cualquier tipo en consumibles de contaminacin.

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2. Trailing peaks: Amplitud entre los picos muy heterognea, con poca resolucin.

Posible causa Posible solucin Exceso de muestra cargada en la inyeccin Checar procedimiento de usuario. Capilar Viejo: Los arreglos Capilares tienen una vida til de 100150 inyecciones ms all de este nmero de inyecciones el laboratorio deber hacer su propia validacin interna

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3. Obstruccin de capilar.

Posible solucin El polmero no debe permanecer en el equipo por ms de una semana. Los capilares deben almacenarse con ambos extremos sumergidos en agua. Inyecte polmero fresco al capilar antes de retirarlo del equipo (SeqFill Capillary-310)

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4. Arco voltaico

Posible causa Burbujas de aire en el sistema

Posible solucin Verificar si hay burbujas de aire en el sistema, si es as eliminarla atreves del wizard eliminacin de burbujas. Mantener la humedad recomendada para el aparato.

Humedad presente en los componentes exteriores del sistema bloques, buffer viales, septa, etc. Tubos conectores conectados de forma incorrecta.

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5. Contaminacin de los Bloques y Exceso de Primer

Contaminacin de los bloques y/ jeringas: puede resultar en una lnea base elevada por toda la muestra

Posible causa Posible solucin Contaminacin de los bloques y/ jeringas porLos bloques, jeringas y reservorios se detergente, etanol, etc. lavan NICAMENTE CON AGUA MILLI Q. Las septas no son reutilizables

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6. Falla en la cmara CCD.

7. Fallas en el laser.

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SOFTWAREHaga clic para modificar el estilo de subttulo del patrn

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8. Falla en la calibracin espectral.

Posible causa Falla en la matriz

Posible solucin Recordar que la matriz es un ARCHIVO matemtico que debe ser actualizado.

Seales muy fuertes (necesidad de diluir laEn la grfica se observan picos AZULES muestra) dentro de los ROJOS casi a lo largo de toda la secuencia (no hay separacin entre estos colores)

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QUIMICA/REACTIV OS/USUARIOHaga clic para modificar el estilo de subttulo del patrn

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9. Background alto: Polmero Degradado.

Posible causa

Posible solucin

Polmero viejo o Cambiar el polmero degradado cada 7 das

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10. Picos del polmero.

Posible causa Cristales de rea, polvo que fluorescen.

Posible solucin Cambiar el polmero cada 7 das.

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11. No se produce reaccin o esta decae poco despus de comenzar

Posible causa No hay DNA o hay menos del necesario

Posible solucin Aumentar la cantidad de DNA

No hay cebador o la concentracin es inferior a Aumentar la concentracin o cantidad de la necesaria cebador El cebador no encuentra el sitio de hibridacin Cambiar el cebador El DNA presenta contaminacin Volver a preparar el DNA El cebador est mal diseado o la temperatura Redisear el cebador de melting no es la adecuada El sitio de unin del cebador en el vector se ha Volver a clonar en el vector perdido o daado En los productos de PCR puede que los Cambiar de cebador amplificados no sean el producto de la amplificacin con los dos cebadores 5/18/12

12. Seal de baja intensidad.Posible causa Mala calidad del DNA Posible solucin Volver a purificar el DNA DNA presenta estructura Cambiar de cebador secundaria en el sitio de hibridacin del cebador La concentracin del Aumentar la DNA inferior a la concentracin necesaria El cebador utilizado en la Cambiar el cebador secuenciacin no es el adecuado: - Estructura secundaria - Tm del cebador demasiado baja

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13. El cromatograma es correcto pero presenta mucho ruido de fondo

Posible causa Existe un sitio secundario subptimo de unin del cebador que da lugar a picos extra de menor intensidad

Posible solucin Intentar eliminar aadiendo DMSO en la secuenciacin, incrementando la temperatura de hibridacin o cambiar de cebador La cantidad de DNA es insuficiente y la seal Aumentar la cantidad de DNA es demasiado baja confundindose con el ruido normal de fondo. El DNA presenta contaminacin con otro DNA Purificar el DNA que contiene un sitio de hibridacin para el primer de secuenciacin La PCR no fue especifica y existen Cambiar de cebador o purificar por gel el amplicones contaminantes en la muestra amplicn de inters Cebador mal purificado Cambiar de cebador o purificar Fragmento de PCR mal purificado Eliminar los cebadores de la amplificacin 5/18/12

1.Puede verse una secuencia sombra (N-1, N-2 o N-i). El cebador est compuesto mayoritariamente por cadenas completas (N), pero debido a una purificacin defectuosa puede existir una subpoblacin de molculas con una base menos (N-1), o si el problema es mayor con N-i bases menos. Esto da lugar a un cromatograma ilegible al tener picos superpuestos y desfasados. Cebador mal purificado o parcialmente degradado1 Cambiar la alcuota de cebador o purificar por gel

14. El cromatograma presenta una secuencia sombra

5/18/12Posible causa Posible solucin

15. El cromatograma presenta dos secuencias superpuestas

Posible causa El cebador tiene varias dianas Presencia de cebadores procedentes de la PCR Cebador degenerado DNA seccionado existiendo dos sitios diana para el cebador universal utilizado1 Hay ms de un DNA molde en la muestra2 PCR inespecfica: diana del cebador en ambos extremos, es decir, amplicn inespecfico generado por un solo cebador

Posible solucin Cambiar de cebador Purificar mejor el DNA Cambiar de cebador Secuenciar con otro cebador Aislar de nuevo el DNA Cambiar de cebador

Comprobar, si se ha arrastrado polinker durante la succin, que cebadores universales tienen sitio de hibridacin duplicado y no utilizarlos en la secuenciacin de esa muestra. Asegurarnos de que partimos de una nica colonia o que no es PCR mltiple con 5/18/12 amplificaciones secundarias.

16. La reaccin comienza de forma normal pero existe doble lectura a partir de un determinado punto

Posible causa Clon mltiple, PCR mltiple: ms de un molde de DNA en la muestra Diana mltiple del cebador en el DNA Mutaciones de insercin o delecin

Posible solucin Volver a preparar la muestra para aislar un nico molde Cambiar de cebador

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17. La secuencia pierde bruscamente la seal y cae

Posible causa Posible solucin Efecto de una estructura secundaria Aadir DMSO La cantidad entre el DNA y el cebador no es Respetar las concentraciones y cantidades la equilibrada indicadas en las tablas de entrega de muestras Interaccin con secuencias del vector que Realizar PCR sobre el clon (cebadores dan lugar a estructuras que impiden la universales o propios) y mandar a secuenciar progresin de la polimerasa el amplicn resultante y no el DNA plasmdico DNA cortado, digerido a ese nivel o finalizacin de producto de PCR

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18. La seal decae progresivamente de forma temprana

Posible causa Presencia de compuestos contaminantes en la muestra

Posible solucin No re suspender nunca el DNA en solucin que contenga EDTA

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19. Doble lectura inicial que se resuelve antes de la base 200

Posible causa Presencia de primer dimers o amplicones inespecficos de menor tamao que el producto de inters.

Posible solucin Optimizar condiciones de PCR para evitar la aparicin de artefactos o purificar el producto a partir de gel.

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20. Presencia de picos saturados y fuera de escala en el cromatograma

Posible causa Demasiada cantidad de DNA

Posible solucin Reducir la cantidad de DNA (segn figura en las tablas de entrega de muestras)

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21. La secuencia es normal pero aparece un pico de forma repentina

Posible causa Terminadores no incorporados

Posible solucin Repetir la reaccin de secuenciacin

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22. Aparicin de picos muy abiertos con la consecuente prdida de resolucin

Posible causa Exceso de DNA (capilar) Presencia de sales o contaminantes en la muestra Problema del capilar*

Posible solucin Respetar la cantidad y concentracin de DNA Volver a purificar la muestra

Repetir la secuencia y, si el problema persiste, reemplazar capilares *Esta causa solamente es aplicable si el problema de falta de resolucin es consistente para todas las muestras corridas en ese capilar.

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23. Secuenciacin de regiones ricas en GCs

Posible causa Posible solucin Estructura secundaria en la cadena molde de Aadir DMSO en la secuenciacin, aumentar DNA la t de desnaturalizacin a 98 , aumentar el numero de ciclos de PCR. Si es posible disear oligos que salven la regin rica en GC. Cuando se secuencien organismos con un alto contenido GC indicarlo en el apartado de observaciones del formulario de solicitud.

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24. Prdida de la seal debido a una zona rica en G

Posible causa Presencia de una estructura secundaria Homopolmero G

Posible solucin Repetir secuenciacin aadiendo DMSO Secuenciar cadena complementaria

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25. Presencia de microsatlites.

Posible causa Presencia Microsatlites

Posible solucin Secuenciar a partir del plsmido no del producto de PCR y aadir DMSO en la reaccin de secuenciacin Crear delecciones en esas zonas Cambios ya recomendados

Repeticiones dinucletidos GC

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26. Presencia de zonas ricas de GT o GA

Posible causa Repeticiones dinucletidos GT o GA Formacin de dplex que alteran estabilidad del cebador

Posible solucin Secuenciar la cadena complementaria Usar temperaturas de secuenciacin ms bajas que la estndar

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27. Presencia de una zona con poliA o poliT

Posible causa Presencia de poliA/poliT1

Posible solucin Secuenciar cadena complementaria Empleando cebador degenerado del tipo T25(A, G C) si no se conoce la base siguiente a la regin poliA/poliT o los cebadores individuales especficos T25A, T25G T25C. La base 3 del cebador permite anclar este a la secuencia al final del homopolmero, mejorando los resultados obtenidos 1. La polimersa patina dando lugar a una lectura ilegible despus de la regin homopolimrica, aunque los datos de antes de esa regin sean de buena calidad. Este problema se puede producir en la reaccin de secuenciacin o en la de amplificacin, aunque en este ltimo caso no son aparentes cuando el fragmento se visualiza en un gel de agarosa.

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28. Presencia de largos homopolmeros

Posible causa Homopolmero causa deslizamiento de la polimerasa generndose una secuencia ilegible

Posible solucin Secuenciar cadena complementaria Usar un cebador ms interno Empleando cebador degenerado del tipo T25(A, G C) o los cebadores individuales especficos T25A, T25G T25C. En los productos de PCRs pueden existir Secuenciar el material clonado, adems saltos, problemas que no existen en el del amplificado. Si es posible, es mejor material clonado verificar la especificidad de la secuencia a partir de otros clones

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29. Reacciones completamente fallidas.

Posible causa Posible solucin Sitio de unin del iniciador eliminado o Seguir el procedimiento para el mutado. diseo de primers para la secuenciacin. Insuficiente o deficiente calidad de Respetar las cantidades de ADN de templado o iniciador. acuerdo al procedimiento establecido.

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30. Secuencias mixtas.

-Ms deunasecuenciaenlos datos de seguimientoanalizados -Ms deunasecuencia de arranquedespus dela base 30a 100 (sitio de -clonacinmltiple) -Picos bajos en los datos en crudo. Posible causa Posible solucin Preparacin de plsmidos mixtos. Secuenciar plasmido por separados Productos de PCR multiples. Utilizar una sola cadena de ADN y un solo primer con un solo sitio de unin en la cadena de ADN Multiples sitios de primers Disear primer adecuadamnete Multiples primers en el mix de reaccion Usar un solo par de primers por reaccion Contaminacin por primer-dimer Evitar usar primers dimer.

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31. Regiones repetitivas.

Posible causa Regiones repetidas en la secuencia

Posible solucin Secuenciar el lado opuesto de la cadena de ADN o utilizar un iniciador diferente.

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32. Contaminacin de los Bloques y Exceso de Primer

Exceso de primers resulta en muchos picos altos y agudos al inicio de la muestra

Posible causa Exceso de primers resulta en muchos picos altos y agudos al inicio de la muestra

Posible solucin

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33. Contaminacin por reactivos.

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Posible causa Posible solucin Falta de experiencia en la preparacin deCapacitar y entrenar al investigador muestras a secuenciar. responsable de la preparacin de muestras.

34. Degradacin de formamida

Posible causa Degradacin de formamida

Posible solucin Las muestras son estables en formamida a T ambiente por 48 horas

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35. Sin seal

Posible causa Kit Big Dye caduco Fluorescencia degradada. No hay DNA Primer degradado o errneo

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36. Seal Baja

Posible causa Poco DNA (Error en la cuantificacin) Mucha sal en la muestra (compite con el DNA por cargas) Autosampler descalibrado Volumen bajo de la muestra burbujas dentro del pozo Insuficiente tiempo de inyeccin Muestras resuspendidas en exceso de formamida

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37. Exceso de DNA

Posible causa Exceso de DNA desequilibra la reaccin de secuencia y resulta en un perfil triangular en los datos crudos (Cuantificacin) Mucha muestra inyectada en el capilar Background elevado por contaminacin (jeringas, bloques, muestras, etc.) Contaminacin de extraccin (ej: protenas)

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Polmero precipitado (spikes)

38. Background Alto: Problema en la Extraccin del DNA

Posible causa Dato crudo mostrando lnea base demasiado elevada junto con los otros colores, tal vez debido a contaminacin resultante de la mala calidad de la extraccin de DNA.

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39. BigDye Blobs: Purificacin

Posible causa Restos de etanol (de la purificacin) que disuelven y arrastran molculas fluorescentes

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40. Degradacin del Primer (-1bp)

Se observa un pico ms pequeo que es idntico al pico verdadero inmediatamente a la derecha de el. Se deben resintetizar los primers; se recomienda purificacin con HPLC Posible causa Posible solucin Secuencias bajas, cortas o Alto Evitar contaminantes como: sal, RNA, Background debido a baja calidad protenas, Polisacridos del del DNA. hospedero bacteriano.

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