TRÁMITE DE LIBERACIÓN DEL SERVICIO SOCIAL

a) Datos personales:

Nombre: León Irán Razo Juárez. Matricula: 97334991. Teléfono: 56-13-22-61. Licenciatura: Biología Experimental. División: Ciencias Biológicas y de la Salud. Unidad: Iztapalapa.

b) Trimestre lectivo: 06-I.

c) Título del Proyecto de Investigación: “Efecto anticonvulsivo de la vitamina C en las crisis convulsivas inducidas por el “kindling” químico con pentilentetrazol en ratas en desarrollo”.

d) Título del trabajo de Servicio Social:

“Estandarización del método de cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) para determinar aminoácidos inhibitorios y excitatorios”. e) Asesora Interna:

Dra. Anabel Jiménez Anguiano.

f) Asesor Externo: Dr. Misael González Ramírez.

g) Lugar de Realización: Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Neurológicas, Hospital de

Especialidades. Centro Médico Nacional Siglo XXI, IMSS.

Clave de Registro: BE.017.05.

1

TÍTULO DEL TRABAJO DEL SEVICIO SOCIAL. Estandarización del método de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para determinar aminoácidos inhibitorios y excitatorios.

Lugar y periodo de realización. Este trabajo se llevo acabo en la Unidad de Investigación Médica en

Enfermedades Neurológicas, Hospital de Especialidades. Centro Médico

Nacional Siglo XXI, IMSS.

El periodo de duración fue del 12 de mayo del 2005 al 31 de marzo del 2006.

Asesora Interna: Dra. Anabel Jiménez Anguiano.

Asesor Externo: Dr. Misael González Ramírez

INTRODUCCIÓN.

La epilepsia es un desorden recurrente y paroxístico de la función

cerebral de origen multifactorial, caracterizado por cambios conductuales y

electrofisiológicos causados por una descarga neuronal anormal, excesiva,

hipersincrónica y autolimitada (Commission on Clasification, 1989, Rubio,

1997).

La Liga Internacional Contra la Epilepsia ha adoptado la Clasificación

Internacional de las Epilepsias y de los Síndromes Epilépticos (Commission

on Clasification, 1989) Esta clasificación ha dividido a los síndromes en 4

grupos. El primero es el que esta relacionado con su localización y se define

como desordenes epilépticos en los cuales la semiología, los hallazgos y la

investigación de ellos muestran un origen localizado de la crisis. Esto incluye

no solamente pacientes con pequeñas lesiones epileptogénicas circunscritas

(anatómica y funcionalmente), epilepsia del lóbulo temporal, si no también

pacientes con lesiones menos definidas, cuya crisis puede originarse de un loci

variable, el tipo de crisis puede ser local, focal o parcial. El segundo son;

síndromes con crisis generalizadas y se denominan síndromes generalizados,

2

el primer cambio clínico indica una participación de ambos hemisferios, con

patrones electroencefalográficos ictales inicialmente bilaterales. El tercer grupo

se relaciona con los síndromes indeterminados que son desordenes epilépticos

en los que no esta bien definida la crisis, no se conoce si es focal o

generalizada, el paciente tiene tanto crisis focales como generalizadas juntas o

en sucesión, crisis parcial de ausencia. El cuarto grupo corresponde a los

síndromes especiales y son aquellas crisis relacionadas con alguna situación,

dentro de los cuales se incluyen las crisis febriles así como a aquellas que

ocurren cuando hay un evento tóxico metabólico agudo debido a factores como

el alcohol, las drogas, la eclampsia y la hiperglicemia (Commission on

Clasification, 1989). Todo lo anterior debe analizarse junto con los hallazgos

neurológicos y psicológicos, confirmados con datos de laboratorio como la

electroencefalografía y a neuroimagenología.

La epilepsia del lóbulo temporal (ELT) es un cuadro de los llamados

epilepsia sintomática relacionada a la localización", y frecuentemente es

refractaria al tratamiento farmacológico (Engel y cols., 1996, 1997). Puede

presentarse a cualquier edad y las crisis son parciales simples, parciales

complejas o secundariamente generalizadas.

Dado que la crisis se origina en un sistema íntimamente ligado a las

emociones, el sistema límbico (amígdala, hipocampo, corteza temporal), las

manifestaciones clínicas de las crisis incluyen componentes afectivos y

autonómicos o una generalización secundaria, con pérdida del conocimiento,

aunque en algunos pacientes con este síndrome la lesión epileptogénica se

localiza fuera del lóbulo temporal (Engel, 1989; 1996).

Existen varias formas de la ELT sintomática y puede dividirse de manera

general en tres categorías: 1) ELT mesial caracterizada por esclerosis

hipócampal; 2) ELT por lesión ocupatíva debida a alteraciones estructurales

como tumores, malformaciones vasculares, quistes y displasias en estructuras

del lóbulo temporal o áreas corticales distantes cuya actividad se propaga

preferentemente a estructuras temporales mesíales; 3) ELT criptogénica no

asociada con alguna anormalidad estructural identificable (McNamara, 1994;

Engel y cols., 1996).

3

El "kindling" es un modelo experimental que tiene similitud con la

epilepsia del lóbulo temporal en los humanos, lo que indica que muy

probablemente algunos mecanismos electrofisiológicos y bioquímicos son

comunes para ambos procesos (Fitz y cols., 1979; Ito y col., 1977), entre los

cuales se ha asociado al desbalance entre los sistemas excitatorio e inhibitorio

(Rocha y col., 1996).

Es claro que los aminoácidos están entre los neurotransmisores más

abundantes en el SNC, y que la mayoría de las neuronas utilizan ácido γ-amino

butírico GABA y Glutámato como neurotransmisores inhibitorio y excictatorio

respectivamente, y por tanto están implicados en importantes procesos

fisiológicos, así como en eventos patofisiológicos. Los fármacos que aumentan

los eventos inhibitorios de GABA disminuyen los eventos excitatorios regulados

por Glutámato (Somervillae, 1997).

Las dosis repetidas de 40 mg/kg/día de PTZ induce crisis clónicas, las

cuales progresan en severidad hasta llegar a convulsiones violentas (Ito y col.,

1977).

Se ha demostrado que las alteraciones en la función GABAérgica esta

involucrada en la patología de la epilepsia (Janine y cols., 2004). Tal es el caso

del agente convulsivo pentilentetrazol, antagonista no específico del receptor

GABAA (Cilio y cols., 2002; Kulkarni y col., 1995).

Por otro lado, se ha descrito numerosas y variadas relaciones entre el

sistema del GABA y las hormonas sexuales. La alopregnanolona pertenece a

un grupo de hormonas neuroesteroides que actúan en el cerebro como

potentes moduladores positivos del complejo del receptor GABAA y que la

administración de alopregnanolona protege a las ratas contra las crisis

convulsivas producidas por el pentilentetrazol (PTZ), la bicuculina, el ácido

kaínico y la picrotoxina (Frye y Scalise, 2000; Grosso y cols., 2003).

En el sistema nervioso central, la progesterona es catalizada

rápidamente a 5α-dihidroprogesterona por acción de la 5α-reductasa y su

subsiguiente reducción a 5α-3α-dihidroprogesterona por acción de la enzima

3αHSD a su metabolito la alopregnanolona teniendo como cofactores a la

vitamina C y al ácido dihidroascórbico.

4

Actualmente, la evidencia clínica y experimental de que las hormonas

sexuales tienen efecto sobre la excitabilidad neuronal y otras funciones del

cerebro va en aumento. El termino neuroesteroide se ha acuñado para los

esteroides que actúan recíprocamente con una variedad de diversos receptores

de la membrana tanto excitatorios como inhibitorios, ellos pueden tener un

impacto en la excitabilidad de ciertas regiones especificas del cerebro. La

excitabilidad de las neuronas mejora por los estrógenos, mientras que la

progesterona y sus metabolitos ejercen efectos anticonvulsivantes. Además de

sus propiedades particulares, los neuroesteroides pueden regular la expresión

génica por la vía de los receptores de la progesterona. Y en base a sus

propiedades moleculares, estos compuestos parecen tener un perfil terapéutico

prometedor para el tratamiento de diferentes enfermedades neuropsiquiátricas

incluso la epilepsia (Beyenburg y cols., 2001).

5

OBJETIVO GENERAL.

• Estandarización de la técnica de Cromatografía Líquida de Alta

Resolución (HPLC).

• Determinar el efecto de la vitamina C en ratas que durante el periodo de

inmadurez presentaron crisis convulsivas inducidas por kindling químico

con pentilentetrazol y en las concentraciones de aminoácidos excitatorios

e inhibitorios.

OBJETIVOS ESPECIFICOS.

• Evaluar los efectos anticonvulsivantes del ácido ascórbico mediante el

registro de la latencia, número, tipo y duración de las crisis inducidas por

“kindling” químico.

• Cuantificar la concentración tisular de los aminoácidos glutámico,

aspártico, glutamina y GABA en corteza, amígdala e hipocampo de ratas

de 10 días de edad a los 30 min. y 24 h después de las crisis convulsivas

con “kindling” químico.

6

METODOLOGÍA.

Animales.

Se utilizarán ratas Sprague Dawley de 10 días de edad, las cuales estarán en

condiciones estándar de bioterio con temperatura de 22°C ± 2°C, períodos de

luz-oscuridad de 12 hrs y con acceso libre al agua y alimento. La camada será

de 10 animales y estarán puestas con sus madres. El día del nacimiento se

considerará el día cero de vida.

Grupos experimentales. A la edad de 10, 11 días después de la producción de crisis por “kindling”

químico con pentilentetrazol o su manipulación control, se formarán dos grupos

con una “n” igual a 5 animales por edad.

El grupo cría control (C30min y C24hrs) al cual no se le hará ninguna maniobra

experimental.

El grupo cría experimental tratado con Vitamina C + PTZ, (Exp30min y

Exp24hrs).

Tratamiento. La vitamina C se preparará 1 g/ml en una solución amortiguadora de

acetato de sodio y bicarbonato de sodio, pH 5.5. A los animales se les darán

500 mg/kg de peso corporal vía intraperitoneal (i.p.), 5 días antes de inducirles

las crisis con PTZ (Huang y cols., 2001).

Modelo de crisis convulsivas inducidas por "kindling" químico con

pentilentetrazol.

Los animales recibieron la administración i.p. de una dosis subconvulsiva de

pentilentetrazol (80 mg/kg de peso corporal). Las ratas se observaron por 1

hora durante la cual se les tomó el registro de la manifestación conductual que

consistió de alguna de las fases descritas por Meter y col., 1981, fase 0 para

conducta no observable; fase 1 disminución de la actividad motora; fase 2

7

movimientos del cuerpo o localizados, fase 3 convulsión clónica resultado en la

perdida de la postura y fase 4 convulsión clónico-tónica.

Obtención de muestras biológicas.

Los animales se sacrificaron por decapitación, se disecaron las regiones:

corteza, amígdala e hipocampo, todo se llevó a cabo a 4°C.

Preparación de los homogenizados tisulares.

Se pesó a cada una de las regiones extraídas por disección (amígdala, corteza

e hipocampo) y se colocaron en tubos Ependorff. A las muestras por cada 10

mg de tejido se le adicionó 30 ml de una mezcla de ácido perclórico (HClO4

0.05M) con metabisulfito de sodio (4nM). Las muestras se maceraron con un

homogenizador Thomas de embolo te teflón una vez obtenido los

homogenizados, se procedió a centrifugar a 12000 rpm por 15 minutos a una

temperatura de 4ºC. Se retiró el sobrenadante con una jeringa de insulina y se

filtro (Nalgene-Naylon 0.45µm, 4 mm F2604). El filtrado se utilizó para la

determinación de aminoácidos por CLAR mientras que la pastilla se utilizó para

la determinación de proteínas. Tanto el filtrado como la pastilla se mantuvieron

en congelación a –70 ºC hasta su procesamiento.

Determinación de proteínas por el método de Lowry.

La pastilla obtenida del tejido cerebral se resuspendió con 250 µL de la mezcla

de HClO4/metabisulfito Las proteínas se cuantificaron mediante el método

espectrofotométrico descrito por Lowry y cols. en 1951, se utilizó albúmina

bovina como estándar. Con la pastilla resuspendida se hicieron diluciones para

cada una de las regiones: amígala e hipotálamo (1:100), mientras que para la

corteza una dilución de 1:200. De dichas diluciones, se tomaron 100 µL y se le

adicionaron 500 µL del reactivo A (CuSO4 1%, tartrato de sodio y potasio 2%,

en 50 ml de NaCO3 al 2%) diluido en NaOH (1N). Esta mezcla obtenida se

agito y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 10 min. Enseguida se

le adicionaron 500 µL del reactivo B (reactivo de Folín, dilución 1:2 con agua

destilada), se agito y se dejó reposar durante 30min. en total oscuridad.

8

Inmediatamente después se midió la reacción colorimétrica de cada una de las

muestras empleando un espectrofotómetro UV-visible a una longitud de onda

de 700 nm. Para obtener la concentración de proteínas cerebrales en mg/ml de

tejido húmedo se realizó una curva de calibración de albúmina conocida con

10, 20 30 40 y 50 mg/ml, este resultado nos sirvió para calcular la

concentración de los aminoácidos por mg de proteína.

Determinación del contenido tisular de los aminoácidos por Cromatografía líquida de Alta Resolución (CLAR).

Para la determinación tisular de los aminoácidos se utilizó el sistema

cromatográfico HPLC o CLAR que consiste de un detector fluorométrico

(modelo 474) con un programa computacional MilleniumTM, ambos de Waters.

La cromatografía utilizada fue de fase reversa en la cual la fase estacionaria es

no polar y la fase móvil es polar. La fase móvil consistió en una mezcla de

solución A (acetato de sodio 39.74 mM/metanol 10%, pH 5.7) y solución B

(solución A al 20% metanol 80%, pH 6.7), mientras que la fase estacionaria

consistió de una precolumna y una columna de sílica gel. El proceso

cromatográfico incluye un programa de gradientes que permite la separación

de los aminoácidos presentes en la muestra, los cuales fueron comparados con

muestras estándar para cada uno de los aminoácidos antes mencionados. La

columna cromatográfica de alta resolución (Waters Nona-pack C18, 4µm, 3.9 k

150 mm) se mantuvo con un flujo de 1.0 ml/min y a una temperatura de 37 ºC

controlada por un horno. El sistema de detección de los aminoácidos se realizó

mediante derivatización adicionando orto-ftaldehído (OPA). Cada aminoácido

forma un isoindol como producto de la reacción entre el OPA, 2-β-

mercaptoetanol y el grupo amino del aminoácido (Figura 1). El isoindol es

detectado por fluorescencia. La longitud de onda de excitación fue de 360 nm y

la de emisión de 450 nm. La corrida de cada muestra fue de 12 min. por

muestra.

Para la evaluación de los niveles de aminoácidos, los filtrados obtenidos se

diluyeron con HClO4 (0.1 M). Se tomaron 20 µL de esta dilución y se le

adicionaron 6 µL de una mezcla de OPA (3 mg), metanol (60 µL), tetraborato

9

de potasio (0.4 M, 0.56 ml) y 2-β-mercaptoetanol (0.116M, 5 µL). Se dejó

reaccionar por 2 min. y enseguida se inyecto al equipo de CLAR. La

concentración final de aminoácidos se expreso como ng/mg de proteína. Este

procedimiento nos permitió detectar los diversos aminoácidos: áspartico (Asp),

glutámato (Glu), glutamina (Gln) y ácido γ-amino butírico (GABA). Se realizó

una curva de estándar por cada corrida, que se obtuvo con el empleo de una

mezcla con cada uno de los aminoácidos analizados (Asp, Glu, Gln y GABA),

de una concentración de 10 ng/mg. De esta se tomaron 10, 30 y 50 µL y se

aforaron a 1 ml con HClO4 (0.1 M). De cada dilución se tomaron 20 µL que se

mezclaron con 6 µL de OPA, siendo las concentraciones finales detectadas de

1, 3 y 5 ng/10µL, respectivamente.

Isoildol

2-β-Mercaptoetanol

Aminoácido OPA

Figura 1. Reacción de derivatización. La OPA reacciona con el 2-β-mercaptoetanol y el grupo

amino del aminoácido correspondiente formando un isoindol, producto que es detectado por

fluorescencia.

ACTIVIDADES REALIZADAS.

Primeros dos meses los dedique a la revisión bibliográfica de la técnica

de HPLC, en los siguientes meses cuide a las ratas a las cuales posteriormente

inicie el tratamiento con ácido ascórbico, posteriormente obtuve las muestras

biológicas cerebrales (amígdala, corteza e hipocampo); siguiendo con el

10

montaje de la técnica y realización de la misma y por último realice el análisis y

discusión de los resultados igualmente la realización del reporte final.

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS.

Es la de haber comprobado que efectivamente el ácido ascórbico si

presenta una actividad anticonvulsiva ante las crisis inducidas por PTZ; y por

otro lado haber aprendido a manejar la técnica del HPLC la cual me ayudo a

realizar correctamente la cuantificación de los aminoácidos en los diferentes

grupos experimentales.

RESULTADOS. Efectos del PTZ después de la administración del ácido ascórbico.

La administración de PTZ en animales del grupo control 30 min.

(C30min.), indujo que las crisis de temblor iniciaran a los 0.41 ± 0.07 min, las

crisis mioclónicas a los 1.24 ± 0.29 min, mientras que las crisis clónicas a los

4.94 ± 1.29 min y la crisis tónica a los 24.24 ± 10.27 min. La muerte se produjo

a los 55.4 ± 0.40 min.; este grupo presentó el 100% de las crisis. La mortalidad

fue del 60%. Figura 2 y 3.

El grupo experimental PTZ-30min (Exp30min) presentó una disminución

significativa en la latencia al presentar temblor en un 14.29%; crisis mioclónica

con un 100%; crisis clónica con 57.14%, mientras que la tónica con un 71.43%.

La muerte se produjo a los 4.08 ± 0.41 min, muriendo el 14.29% de los

animales, siendo significativamente diferente al grupo C30min (Figura 3).

Efectos a las 24 h después de las crisis inducidas con PTZ.

La administración de PTZ en los animales del grupo control-PTZ-24 hrs.

(C24hrs), mostraron el registro de temblor a los 0.55 ± 0.13 min, y la

presentaron el 100% de los animales, las crisis mioclónicas a los 1.588 ± 0.36

min, presentando la crisis el 100% de los animales, las clónicas a los 14.198±

11.11 min, también con un 100% de animales con las crisis; mientras que las

11

tónicas al 4.62 ± 2.05 min, y con un 40% que la padecieron. La muerte no se

produjo en ninguno de los animales. (Figuras 4 y 5).

El grupo experimental PTZ-24 hrs. (Exp24hrs), mostró un aumento

significativo en la latencia al presentar temblor el 100% de los animales, crisis

mioclónica el 100%, crisis clónica el 40%, mientras que la crisis tónica el 80%

de los animales. No se presentó muerte alguna en ninguna de las crisis,

viviendo el 100% de los animales. (Figuras 4).

0.0

0.5

1.0

TEMBLOR

0

2

4

6

CRISIS MIOCLÓNICA

C30min Exp30min0

5

10

15

C. CLÓNICA

C30min Exp30min0

20

40

**

CRISIS TÓNICA

Figura 2.- Latencia en min a las conductas inducidas por PTZ (80 mg/kg i.p.) en ratas inmaduras de 10 días de edad, a las cuales se les administró PTZ 30min después de haber sido tratadas cinco días antes con ácido ascórbico. Tiempo de observación de 1 hora. Los valores representan la media ± EE de n=5 animales. t Student´s, **p<0.001.

12

0

50

100

TEMBLOR CRISIS MICLÓNICAS

0

50

100

C30min Exp30min0

50

100

CRISIS CLÓNICAS

C30min Exp30min0

50

100

CRISIS TÓNICA

MORTALIDAD

C30min Exp30min0

25

50

75

Figura 3.- Porcentaje de animales que presentaron cambios conductuales inducidos por PTZ (80 mg/kg i.p.), 30min después de haber sido sometidos a las crisis por PTZ (grupo C30min) o de su manipulación (grupo Exp30min). X2 , *p<0.05.

13

0.0

2.5

5.0

7.5

TEMBLOR

0

5

10

15

CRISIS MIOCLÓNICAS

C24hrs Exp24hrs0

10

20

30

*

CRISIS CLÓNICAS

C24hrs Exp24hrs0.0

2.5

5.0

7.5

CRISIS TÓNICA

Muerte

C24hrs Exp24hrs0.0

0.5

1.0

NP NP

Figura 4.- Latencia en min a las conductas inducidas por PTZ (80 mg/kg i.p.) en ratas inmaduras sacrificadas 24hrs después de haber sido sometidas a tratamiento con ácido ascórbico durante 5 días antes (grupo C24hrs) o de su manipulación (Exp24hrs). Los valores presentan la media ± EE de 5 animales para cada grupo. T Student´s, *p<0.05.

14

0

50

100

TEMBLOR

0

50

100

CRISIS MIOCLÓNICAS

C24hrs Exp24hrs0

50

100CRISIS TÓNICA

C24hrs Exp24hrs0

50

100

CRISIS CLÓNICAS MORTALIDAD

C24hrs Exp24hrs0.0

0.5

1.0

NP NP

Figura 5.- Porcentaje de animales que presentaron cambios conductuales inducidos por PTZ (80 mg/kg i.p.), 24hrs después de haber sido sometidos a las crisis con PTZ (grupo C24h). X2 , *p<0.05. En cuanto al contenido tisular de los aminoácidos en las diferentes

regiones límbicas (corteza, amígdala e hipocampo) (Figura 6),mostró al realizar

el análisis cromatográfico, que el cambio en cuanto al aminoácidos Glutámico

en los grupos 30min y 24hrs fue de un aumento no significativo

estadísticamente en el de 30min mientras que en el de 24hrs hubo una

disminución pero mostrando un cambio significativo con respecto al control que

fue tomado como el 100% no mostrado en la gráfica, en cuanto al hipocampo

no encontramos diferencia significativa en su disminución, en corteza hubo una

disminución no significativa del aminoácido en 30min en tanto que en 24hrs se

muestra un aumento significativo estadísticamente; en cuanto al cambio de la

concentración de la Glutamina tanto en la amígdala como en el hipocampo no

encontramos diferencia significativa alguna, mientras que en 24hrs

encontramos un aumento significativo del aminoácido. Con respecto al cambio

de la concentración del aspártico observamos un aumento o una disminución

en las diferentes regiones y grupos, encontrando solo una diferencia

significativa en el hipocampo con una disminución, mientras que en corteza un

aumento significativo estadísticamente. La gráfica de GABA en todas se

presento un cambio ya sea disminuyendo o aumentado pero solo en el grupo

24hrs pudimos observar un cambio significativo, en amígdala hubo una

15

disminución, mientras que en hipocampo también encontramos una

disminución, solo en corteza encontramos un aumento del aminoácido; esta

última gráfica lo que nos dice es que como los Glutámico, Glutamina y

aspártico son aminoácidos excitatorios y GABA es inhibitorio, encontramos que

los niveles de este último en el caso de la amígdala e hipocampo disminuyeron

mientras que en el de corteza aumentaron esto pudiera deberse a que GABA

esta funcionando como un mecanismo en la cual de alguna manera esta

tratando de compensar o de anular los efectos de los aminoácidos excitatorios;

el que solo corteza tenga un comportamiento de aumento en todos los

aminoácidos podría indicarnos que está región cerebral sea la causante de las

crisis convulsivas en un organismo y que la amígdala e hipocampo no tengan

nada que ver en esta patología.

Amíg Hipoc Cx-100

0

100

200

30min 24 hrs.

*

*

Áspartico

Amíg Hipoc Cx-100

0

100

200

*

*

Glutámico

Amíg Hipoc Cx-100

0

100

200

30min 24h

* *

*

GABA

Amíg Hipoc Cx-100

0

100

200 *

Glutámina

Figura 6.- Porcentaje de cambio con respecto a su grupo control; tomado como el 100 % en la concentración del contenido tisular de aminoácidos en diferentes regiones del cerebro de ratas inmaduras sacrificadas a los 30min y 24hrs después de ser sometidas a crisis epilépticas con PTZ. Los valores representan la media ± EE. T Student´s *p<0.05.

16

CONCLUSIONES.

• El efecto neuroprotector del ácido ascórbico se comprobó al disminuir el

porcentaje de animales que presentaron alguno de los eventos en 30

min y 24 h después de la aplicación del PTZ.

• En cuanto a la concentración tisular de los aminoácidos del grupo

experimental 24 h después de la última aplicación de la vitamina C, los

niveles del GABA se vieron disminuidos significativamente en las

regiones de la amígdala e hipocampo como un mecanismo protector, lo

cual nos indica que el ácido ascórbico si tiene un efecto como

neuroprotector.

RECOMENDACIONES.

Para la técnica del HPLC es de gran importancia tomar la cantidad

adecuada de cada uno de los aminoácidos para hacer la mezcla, de esta

manera obtener la solución madre con una concentración de 10 ng/mg, y es

muy recomendable meter todos los estándares para los cuales se toma para

cada uno las cantidades siguientes: (E1 (5µl), E3 (15µl), E5 (25µl) y el E7

(35µl)), se llevan a 1 ml con ácido perclórico 0.1 M, de esta manera

obtendremos una curva estándar adecuada para empezar a meter las muestras

y compararlas en el cromatógrama del HPLC.

17

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Asesor Externo: Asesora Interna:

Dr. Misael González Ramírez Dra. Anabel Jiménez Anguiano Prof. Titular C. Tiempo Completo.

Jefa del Área de Neurociencias, Depto. de Biol. de la Reproducción.

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