Transferencia de embriones en Porcino - Inicio · objetivo de obtener una mejora constante en los...

Transferencia de embriones en Porcino.

Una alternativa real

Dr. Jonatan Sánchez-Osorio

El sector porcino está sometido a un proceso de evolución continuo con el objetivo de obtener una mejora constante en los rendimientos reproductivos en conjunción con una más eficiente conversión de las materias primas para finalmente obtener un producto que satisfaga las demandas del consumidor.

La mejora genética obtenida a través de los programas de selección son el motor que impulsa la evolución productiva en nuestros cerdos.

Intercambio de material genético

Núcleos Originales Núcleos Selección Multiplicadores

Métodos de Intercambio de material genético

• Vía Animales Vivos

• Vía Semen

• Vía Animales Vivos Permite una mejora genética completa

Acarrea Riesgos Sanitarios Elevados Costes Económicos Compromete el bienestar animal


Riesgos Sanitarios

Estatus Sanitario en Riesgo

Entrada de nuevos patógenos

Desestabilización del equilibrio patogénico

Exige una adecuada adaptación y manejo sanitario de los animales así como un correcto uso de las cuarentenas

La mejora del estatus sanitario la sanidad a través de la aplicación de programas estrictos de bioseguridad y un mejor manejo sanitario son requisitos esenciales para alcanzar una producción rentable y eficiente.

Pérdidas en las granjas afectadas (US$/cerdo comercializado)

Enfermedad Reproducción Transición Engorde

PRRSV 7,29 2,86 4,34

M hyo 1,52 1,92 5,84

Influenza 1,65 1,62 3,37

PRRS + Mhyo 6,69

Holtkamp y cols, 2013

• Vía Semen Más seguro y económico

La mejora es sólo vía macho por lo que solo intervienen 50% genes

Pueden existir algunos riesgos sanitarios


La Alternativa TRANSFERENCIA DE EMBRIONES

• Minimiza los riesgos sanitarios

• Permite introducir el genotipo completo

• Reduce los costes derivados del transporte

• Permite superar restricciones fronterizas






• Evita los problemas de bienestar animal asociados al trannsporte de animales vivos

Lavado de los embriones en medio con antibióticos

(3-10 lavados)

La zona pelúcida es una barrera eficiente contra los patógenos

Los embriones intactos están libres de enfermedades

Intercambio de Material Genético

Bisabuela (GGP)

Abuela (GP)

Madre (F1)

Transferencia Embrionaria

Núcleos de Selección Multiplicadores Granjas con núcleo cerrado

Obtención y transferencia de embriones porcinos

Obtención de los embriones

Evaluación de los embriones

Conservación de los embriones

Transferencia No quirúrgica de los embriones

Donantes

(Large White x Landrace)

Animales de alto valor genético

Preferiblemente con fertilidad probada (Multíparas)

Pueden ser superovuladas para aumentar el rendimiento de la obtención de embriones

hCG (750 ui)

eCG (1250 ui)

Destete Ovulación

56 – 96 h

40 - 44 h

1 2 3 4 5 6

Angel y cols, 2014

Correlación entre tratamiento superovulación y obtención embriones

Angel y cols, 2014

Angel y cols, 2014

Los embriones obtenidos de cerdas donantes superovuladas no ven comprometida su viabilidad y permiten obtener similares tasas de gestación tras su transferencia no quirúrgica

La respuesta al tratamiento de superovulación puede ser muy variable dependiendo de:

• Raza / Línea Genética

• Granja (manejo)

• Individuo

• Estación

Es recomendable evaluar y ajustar el tratamiento a las condiciones particulares de las donantes

Detección del estro e Inseminación

1ª

Inseminación

Dosis seminal:

3000 x 10 sptz / 100 ml.

2ª

Inseminación

6

Inicio de celo

Día 0 Día 1 Día 2

D0= COMIENZO DEL ESTRO D0= hCG D0= PRIMERA INSEMINACIÓN D0= OVULACIÓN

CRONOLOGÍA DEL DESARROLLO EMBRIONARIO

Cronología: Tipo de embrión

Día 0

Inicio celo Día 1

Día 2 2-4 céls

Día 3 Día 4 Día 5

mórulas Día 6

blastocistos Día 7 Fín CIV

Existe cierta variabilidad dependiente de:

• Raza / Línea Genética

• Granja (manejo)

• Estación

Obtención quirúrgica de los embriones

NCSU-HEPES TL-HEPES-

PVA

• Azaperona • 2mg/kg body weight, im

Sedación

• Tiopental Sódico • 7 mg/kg body weight, iv

Inducción Anestesia

• Isofluorano • 3,5-5%, Inhalatorio

Mantenimiento anestesia

Anestesia

ba

e

dc

h

f

g

1. Se realiza una incisión el la línea media,

a través de la cual, se exterioriza parte

del aparato reproductor de la cerda. Se

realiza el recuento de cuerpos lúteos en

los ovarios.

2. Los embriones se recogen mediante el

lavado de la porción final de cada cuerno

uterino con 30 mL de protein-free embryo

recovery medium consisting of Tyrode's

lactate (TL)-HEPES-polyvinyl alcohol

(PVA)-modified medium (TL-HEPES-

PVA)

3. Tras la recogida, la incisión es suturada.

El procedimiento completo requiere

aprox. 15 min. La recuperación es total a

los 30-40 min.

Obtención de embriones

Valoración de los embriones Clasificación de los embriones según su estado de desarrollo

Día 2 Día 5 Día 6 Día 7

Valoración de los embriones

Clasificación de los embriones según la calidad embrionaria

Ovocitos no fecundados y embriones degenerados

Embriones de 2 células

Embriones de 4 células

Mórulas

BLASTOCISTOS TEMPRANOS

BLASTOCISTOS

BLASTOCISTOS EXPANDIDOS

BLASTOCISTOS ECLOSIONANDO Y ECLOSIONADOS

Lavado de los embriones en medio con antibióticos

(3-10 lavados)

La zona pelúcida es una barrera eficiente contra los patógenos

Los embriones intactos están libres de enfermedades

Receptoras

(Large White x Landrace)

Multíparas

Nulíparas

No importa el valor genético de los animales

Preferiblemente con fertilidad probada (al menos 1-2 partos)

Procedentes del destete, con celo natural y buena condición corporal

(Martínez y cols.,2004)

Catéter de transferencia no quirúrgica de embriones (Deep Blue® ET Catéter, Minitube)

Firme

Flexible

Longitud: 1’60 m

Diámetro externo: 4 mm

Canal de trabajo: 0’7 mm

Receptoras No sedadas

Martínez y cols., 2002, 2004

Disposición del cateter de transferencia No quirúrgica

Martínez y cols, 2013

La dificultad de la inserción del catéter puede variar en función de las características de la cerda receptora:

• Raza / Línea Genética Hemos observado mayor dificultad en razas blancas (Large White) en comparación con cerdas Duroc


• Ciclo / Nº Partos Hemos observado mayor dificultad en nulíparas y cerdas con muchos partos.

Lo ideal son cerdas con un número de partos comprendido entre 1-4.


• Individuo

Diferencias entre receptoras Se han observado particularidades anatómicas en cérvix y cuernos uterinos en diferentes razas e individuos que pueden explicar las diferencias en dificultad durante la inserción de la sonda de transferencia no quirúrgica.

Influencia del grado de Asincronia Donante-Receptora Diferencia entre el momento de inicio de celo en donante y receptora. 30 embriones (mórulas y/o blastocistos) transferidos por receptora

- 24 h 0 h + 24 h + 48 h

Receptoras (n) 9 31 74 18

Tasa Gestación (%) 11.1 % 61.3 % 85.1 % 50.0 %

Tasa de Parto (%) 0 % 61.3 % 81.1 % 50.0 %

LNT 10.5 ± 0.8 9.6 ± 0.4 9.2 ± 1.0

LNV 10.1 ± 0.8 8.9 ± 0.4 8.6 ± 0.9

Peso al nacimiento (Kg)

1.2 ± 0.1 1.7 ± 0.1 1.6 ± 0.1

Eficiencia Productiva de lechones (%)

20,6 % 24 % 14.3 %

Angel y cols, 2014

Preparación de la cerda receptora La cerda receptora en día 5-6 de ciclo (metaestro) carece de protección natural frente a una posible contaminación por lo que es crucial extremar las medidas higiénicas. • Disponer al animal en jaula de gestación, intentando garantizar la máxima

limpieza de la sala donde se realice la transferencia.

• Cuidar la limpieza y desinfección (clorhexidina) de la zona vulvar de la receptora

• Administrar dosis única de antibiótico (amoxicilina) • Utilización de material estéril exclusivamente.

TRANSFERENCIA NO QUIRÚRGICA

1. Llenar la sonda con medio de transferencia usando una jeringa de 1 ml

2. Insertar la sonda a través del cervix mientras se realiza una ligera presión positiva con medio utilizando la jeringa

3. Una vez pasado el cervix, introducir un volumen de medio de 0.3 ml para eliminar los posibles restos de mucus

4. Insertar la sonda totalmente 5. Introducir mediante una jeringa de 1 ml los embriones

contenidos en 0.1 ml de medio 6. Introducir un volumen de 0.3 ml de medio para arrastrar a

los embriones fuera de la sonda

Obtención y transferencia NO quirúrgica de embriones

CONSERVACIÓN DE LOS EMBRIONES: ALTERNATIVAS

1. Conservación 0-6 h. Transferencia en la propia granja de obtención de

los embriones

2. Conservación 6-24 h. Transporte de los embriones en las horas

siguientes a la obtención hasta su llegada a la granja receptora

3. Conservación Indefinida. Criopreservación y almacenamiento de los

embriones en N2 líquido hasta la transferencia.

1. Conservación 0-6 h.

Transferencia en la propia granja de obtención de los embriones Los embriones se conservan en el propio medio de recogida a 37ºC hasta el momento de la transferencia.

2. Conservación 6-24 h.

Transporte de los embriones en las horas siguientes a la obtención hasta su llegada a la granja receptora. Permite el transporte por tierra o aire a distancias considerables dentro del territorio nacional o países vecinos

Evaluación de diferentes medios y condiciones para el transporte y conservación de embriones hasta 24 h


Resultados reproductivos tras la transferencia No quirúrgica de embriones cultivados 24 h a 37ºC en TL-Hepes-PVA


La posibilidad de transportar y conservar los embriones por periodos de hasta 24 h resulta fundamental para puesta en práctica de esta tecnología en un contexto real de granjas comerciales. En la actualidad se trabaja en evaluar alternativas y resultados que permitan la conservación por periodos de tiempo mayores , hasta 72 h , que prácticamente permitirían la distribución global de los embriones.

3. Conservación Indefinida. Criopreservación y almacenamiento de los embriones en N2

líquido hasta la transferencia. Situación ideal pues permite el transporte a cualquier lugar del planeta y simplifica la logística tanto en la granja donante como en la receptora.

Altas velocidades de enfriamiento

Elevadas concentraciones de crioprotectores

Vitrificación

Rall y Fahy (1985)

Solidificación de una solución viscosa a bajas temperaturas sin

la formación de cristales de hielo. El líquido se transforma en un

vidrio amorfo, como resultado del rápido enfriamiento,

conservando las propiedades físico-químicas de un líquido.

Ventajas

Se evita la formación de cristales de hielo

Reduce el tiempo de exposición al intervalo crítico de temperatura

Pajuela Super-OPS

•Contacto drecto con el N2 líquido •Mínimo volumen de medio

(Vajta y cols., 1997)

Tiempo

Temperatura

-196

-30

0

20

OPS Vitrificación (20,000°C / min) SOPS Vitrificación (36,000°C / min)

Vitrificación TCMm

TCM 199 Hepes + 20% NBCS

V1 (3 min) TCMm + 7,5% Me2SO + 7,5% EG

TCMm

TCM 199 Hepes + 20% NBCS

V2 (1 min) TCMm + % Me2SO + % EG

TCMm TCMm

V1

V2

(Vajta y cols.,1997)

Calentamiento directo

Medio de Cultivo TCM 199 + 10% FBS

D1 (5 min) TCMm + 0.13M Sacarosa

Pese a la excelente supervivencia in vitro de embriones vitrificados y calentados (> 90% en Blastocistos y alrededor del 80% en Mórulas) y los buenos resultados tras la transferencia quirúrgica de estos embriones, su utilización en conjunción con la técnica de transferencia No quirúrgica no había permitido alcanzar los resultados esperados.

Resultados reproductivos tras la transferencia de embriones vitrificados 1. S-30. Transferencia quirúrgica de 30

embriones vitrificados

2. NsDU-30. Transferencia No quirúrgica de 30 embriones vitrifcados

3. NsDU-40. Transferencia No quirúrgica de 40 embriones vitrificados.

Martínez y col, 2015

La transferencia No quirúrgica de al menos 40 embriones vitrificados permite la obtención de resultados muy prometedores

La transferencia de embriones es una alternativa real para el intercambio de material genético que ha de desempeñar un papel decisivo en los programas de mejora genética en los próximos años

Es necesario seguir trabajando para superar las dificultades que aún limitan la aplicación de esta tecnología

En la actualidad ya se están poniendo en marcha las primeras iniciativas para el uso comercial de esta tecnología

Transferencia de embriones en Porcino - Inicio · objetivo de obtener una mejora constante en los...

Documents

Transcript of Transferencia de embriones en Porcino - Inicio · objetivo de obtener una mejora constante en los...