REVISION BIBLIOGRAFICA DE PRODUCCION IN VITRO DE

EMBRIONES BOVINOS.

1. Estudiante de Biotecnología, Universidad de Córdoba, Departamento de Ciencias Basicas, Facultad de Quimica. Montería, Colombia.

La producción in vitro de embriones bovinos es el procedimiento para

producir embriones en 3 etapas, maduración in vitro (MIV),

fecundación in vitro (FIV) y cultivo in vitro (CIV) de los posibles

cigotos.

El desarrollo in vitro de los ovocitos está íntimamente relacionado con

la aptitud que adquieren durante su etapa folicular previa. Para una

mayor comprensión de los eventos que ocurren in vitro y de los

factores que los afectan se considerará resumidamente el desarrollo

folicular y ovocitario in vivo e in vitro.

El folículo es una estructura ovárica con dos funciones, producción de

hormonas y de ovocitos aptos para ser fecundados. Las mismas son

llevadas a cabo por los folículos antrales, los cuales poseen una pared

interna de células de la granulosa que se apoyan sobre la membrana

basal. Esta matriz extracelular separa las capas epiteliales del

mesénquima y afecta la migración celular, proliferación y

diferenciación de las células que se apoyan en ella. (1)

A pesar de que cada ovario posee cientos de miles de oocitos al

momento del nacimiento de una hembra, la mayoría se pierden por

atresia en un proceso que comienza después del nacimiento.

Esta tremenda perdida de material genético puede ser reducida por la

recuperación de oocitos desde los ovarios y el uso de la técnica de

producción in vitro de embriones –PIVE

La PIVE es una técnica que bien manejada puede conducir a un

aprovechamiento mucho más significativo del material genético de una

hembra de alto merito. Los rasgos deseables en los animales pueden

ser potenciados con la escogencia adecuada del origen de los oocitos y

el semen para el proceso, tal como en un esquema de selección y

apareamientos dirigidos para mejoramiento genético. Además

mediante procedimientos de ingeniería genética, es factible realizar

manipulaciones sobre gametos y embriones conducentes a establecer

rasgos deseables en una población animal.

Para Colombia el hecho de establecer una biotecnología con la

magnitud e importancia mundial de la PIVE en sus procedimientos de

mejora genética y reproductiva, puede ser vital para la competitividad

futura del sector. La PIVE no sólo puede ser beneficiosa para el país en

éstos sentidos, sino que puede y debe representar, como en otros

países, una base para el desarrollo de actividades investigativas y

comerciales, y para el desarrollo de otras biotecnologías

Asociadas (2)

DESARROLLO DE EL FOLICULO EN LA HEMBRA

El folículo es una estructura que se compone originalmente del ovocito

cubierto de células pre-granulosas (folículo primordial, foto 1). El

número de los mismos es diferente según la especie y depende

también en forma directa del peso de los animales (3).

Al nacimiento las terneras poseen 105 aproximadamente. Ese número

tiene la particularidad de no aumentar, por el contrario el mismo

disminuye con la edad. Una ternera sana cuenta con 120 000 a 150

000 folículos primordiales y primarios (foto2), 200 a 500 folículos

secundarios (foto 3) en crecimiento y 20 a 50 antrales (foto 4)

Los folículos antrales tienen la particularidad de mantener el arresto

meiótico de ovocito (fotos 4 y 5). La segunda división meiótica del

ovocito se detiene durante el crecimiento folicular y se reinicia recién

después de la liberación (ovulación) o fecundación. In vitro, la división

meiótica puede continuar en forma espontánea cuando después que el

ovocito abandona el folículo (4)

Los folículos antrales de bovinos y ovinos, de 0,20 mm de diámetro,

requieren aproximadamente 40 días para alcanzar el estado

preovulatorio (5).

Su crecimiento depende de un coordinado proceso de replicación y

diferenciación de sus células y se puede dividir en 2 fases. La primera,

hasta un tamaño de 4 mm, depende de la proliferación de las células

de la granulosa y no es estrictamente dependiente delestado

hormonal. Su desarrollo podría depender de factores de crecimiento

(growth factors) a través de una regulación parácrina (6)

La segunda fase es la que comprende el desarrollo final del folículo

hasta su estado preovulatorio. En ese proceso la hormonas LH y FSH

juegan un rol preponderante. Los factores de crecimiento también

participan ejerciendo la modulación local del crecimiento del folículo

antral (7), estimulando la proliferación, diferenciación y

esteroideogénesis de la pared del folículo. (8)

Los folículos pueden sufrir la atresia en cualquier momento de su

desarrollo. En la dinámica folicular, unos forman parte del pool de

crecimiento mientras otros ovulan o se atresian. Durante el

crecimiento, la mayor parte de ellos continuarán con atresia, sin

embargo los folículos que no se encuentran en crecimiento también se

atresian.

RECOLECCIÓN Y TRANSPORTE DE LOS OVARIOS

La obtención de ovarios después de el sacrificio es la forma más

común y económica de obtener los ovocitos con fines experimentales y

comerciales. Es la que permitió el desarrollo de la producción in vitro

de embriones bovinos y la que dio comienzo a la producción de

embriones en gran escala (9)

La recolección de ovarios en matadero se realiza removiendo los

ovarios del tracto reproductivo de la vaca inmediatamente o máximo

10 minutos después de retirado de la canal. Los ovarios son puestos

en un contenedor con solución salina fisiológica (0.9% NaCl) con 100

µm/ml de estreptomicina y 100 IU/ml de penicilina, dentro de un

termo, a una temperatura cercana a 37°C. Una cuidadosa observación

de la temperatura de la solución salina es importante para mantener la

viabilidad de los ovarios. Pueden emplearse dos contenedores

utilizando uno de ellos para el lavado de los ovarios y el segundo para

su almacenamiento. Los ovarios deben transportarse inmediatamente

al laboratorio. Es recomendable que los oocitos sean recolectados

desde los ovarios dentro de un periodo de 6 horas de recolectados los

ovarios, después de este tiempo su potencial de desarrollo se ve

altamente comprometido (10, 11).

Los CCO’s se clasifican de acuerdo con la cantidad y calidad de capas

de células del cúmulus y la apariencia de su ooplasma. De estas

categorías en general se considera que solamente los oocitos tipo 1 y

2 poseen un elevado potencial para desarrollarse en embriones por

FIV (12) Categorías de complejos cumulus oocito (CCO) para procedimientos de PIVE.

Fuente: Lindner y Wright (1983)

MADURACIÓN IN VITRO DE LOS OVOCITOS

Cuando los ovocitos son retirados de los folículos terciarios y

cultivados in vitro, la maduración ocurre tanto en el núcleo como en su

citoplasma. La maduración nuclear ocurre en forma espontánea

(12,13,14).

La primera modificación visible del núcleo es la condensación de la

cromatina y la disolución de la membrana nuclear, proceso conocido

como ruptura de la vesícula germinativa (Geminal Vesicle Breakdown,

GVBD).

El medio usado para la maduración invitro de oocitos varía entre

laboratorios. Estos medios pueden clasificarse en simples y complejos.

Los medios simples son usualmente sistemas buferados con

bicarbonato, contienen sales fisiológicas básicas con piruvato, lactato y

glucosa. El medio es generalmente suplementado con suero o

albúmina, y con cantidades traza de antibióticos como penicilina,

estreptomicina, anfotericina y gentamicina. Los medios complejos

contienen principalmente a los niveles en que son encontradas en el

suero. El medio más ampliamente usado para MIV en ganado y búfalos

es el medio de cultivo de tejidos 199 (TCM 199) con sales Earle’s,

glutamina y 25mM de Hepes, suplementado con 10 a 20% de suero

inactivado por calor (suero de ternero fetal, suero de ternero, o suero

de vaca en estro). Otros medios usados son Ham’s F10,MEM, IVMD

101, RPMI, y fluido oviductal bovino sintético (SOF), entre otros.

Algunas hormonas son suplementadas, incluyendo FSH, LH, estradiol y

prolactina. La acción directa de estas hormonas en la MIV y el

desarrollo temprano de embriones no esta totalmente establecida,

pero su adición al medio de cultivo mejora el desarrollo de embriones

preimplantatorios.

La preparación de cajas (petri de 30mm) de medio de maduración se

realiza con microgotas de 50µl de medio, cubiertas con

aproximadamente 3 ml de aceite mineral (ver imagen 5), colocando 10

oocitos por gota (15).

El uso de microgotas bajo aceite mineral para la MIV, tiene como

ventajas que previene o reduce la evaporación del agua, protege

contra la contaminación, atenúa las fluctuaciones de gases y

temperatura, y facilita la evaluación durante el cultivo. Hay una

diferencia significativa en producción de blastocistos a favor de la MIV

por un periodo de 24 horas. Otras consideraciones son que los oocitos

y embriones no deben ser expuestos a periodos prolongados de luz, la

temperatura benéfica para el desarrollo está entre 38 y 39®¨C, al

igual que el mejor ambiente gaseoso es 5% CO2, 5% O2 y 90% N2

El desarrollo de blastocistos se reduce después de la MIV de oocitos

bajo una atmósfera de cultivo de 5% CO2, 7% O2, y 88% N2,

comparado con una atmósfera de 5% CO2 en aire.(16)

Microgotas para PIVE bajo aceite mineral

PREPARACIÓN DE LOS ESPERMATOZOIDES

Capacitación espermática (CE) y reacción acrosómica (RA): Es la

condición fisiológica que deben cumplir los espermatozoides para

adquirir su capacidad fecundante in vivo (17,18).

Ello se cumple a través de remoción de los factores decapacitantes,

derivados de las vías genitales masculinas y de la interacción de las

células espermáticas con los llamados "factores capacitantes", que se

encuentran en el tracto genital femenino. Esa capacidad se

desencadena a partir de la eyaculación en el tracto genital femenino y

en el curso de la migración espermática, razón por la cual depende del

ciclo estral y en consecuencia de la regulación hormonal

El proceso de FIV implica la preparación de un gradiente percoll, PHE

(mezcla de hipotaurina, penicilamina y epinefrina), heparina, medio de

fertilización y la preparación del semen (19).

.

La preparación del semen para la FIV usualmente involucra

procedimientos para separar los espermatozoides del plasma seminal,

diluyentes y/o crioprotectores. También pueden mejorar el porcentaje

de espermatozoides motiles y/o normales usados para FIV. Las

técnicas usadas para estos propósitos incluyen swimup, gradiente

percoll y glass wool. El procedimiento percoll es más rápido y produce

hasta 6 veces una mayor recolección de espermatozoides motiles que

elmétodo swimup (20), percoll es superior en la selección de es

permatozoides con morfología normal, por lo que puede incrementar

las tasas de fertilización (21).

Semen + gradiente percoll para la selección de espermatozoides

FERTILIZACION IN VITRO (FIV)

El medio de fertilización puede ser preparado mediante un medio stock

compuesto por una combinación de sales más lactato, con

suplementación por albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos

(BSAFAF), piruvato y antibióticos . En ganado y búfalos la FIV de

oocitos madurados in vitro, es usualmente comenzada después de 22

a 24 horas de MIV porque el pico de oocitos en etapa de metafase II

se da en este periodo. Para facilitar la penetración espermática en la

FIV, los oocitos pueden ser parcialmente denudados de células del

cumulus . Como procedimiento para la FIV se preparan cajas de petri

con gotas de 44µl de medio de fertilización, cubiertas con

aproximadamente 3 ml de aceite mineral para luego de un periodo de

preincubación de las gotas de mínimo de 2 horas, pasar 10 oocitos a

cada gota, previamente retirados del medio de maduración y lavados

en Hepes. Luego se adiciona 2µl de heparina, PHE y semen

previamente preparados, para completar gotas de medio para FIV de

50µl. Los oocitos

deberán permanecer en incubación durante 18 horas para lograr la

FIV.

CULTIVO IN VITRO (CIV)

El cocultivo de oocitos y semen para FIV debe hacerse en un ambiente

de 5% CO2, 38.9ºC de temperatura, y humedad maxima por 18 horas

(15).

Los cigotos bovinos madurados y fertilizados in vitro, fueron

inicialmente cultivados con células del cúmulus, células epiteliales

oviductales, células de la granulosa, células del amnios, y células de

hígado de rata búfalo en TCM199 suplementado con suero bovino,

produciendo embriones con citoplasma oscuro y baja densidad. El

medio CR1aa fue luego desarrollado para el cultivo in vitro y según

varios estudios, CR1aa es superior a TCM199 para el desarrollo

potencial a blastocistos, con o sin cocultivo con células de la granulosa

(22).

El fluido oviductal sintético (SOF) ha sido utilizado para la PIVE y

principalmente para el CIV.

Gandhi et al. (23), utilizaron medios de cultivo a partir de SOF con

albúmina sérica bovina (BSA) o suero de ternero bovino (BCS) como

medios únicos para MIV, FIV y CIV, concluyendo que un medio simple

puede ser usado satisfactoriamente durante la maduración,

fertilización y desarrollo embrionario pre implantación.

El CIV se realiza preparando el medio de desarrollo (Ej. CR1 AA,

SOFaa) con gotas de 50 µl bajo aceite mineral en cajas de petri de

30mm, a las cuales son transferidos 10 presuntos cigotos por gota,

una vez retirados del medio para FIV y lavados en Hepes. El cultivo de

embriones es realizado en una incubadora con aire humidificado, con

5% CO2 a 38ªC. La observación de la tasa de clivaje es realizada

aproximadamente 32 horas después del inicio del CIV, mientras la

observación del desarrollo de embriones preimplantatorios es hecha a

los 7 a 10 días de CIV (15).

Aproximadamente el 80% de los oocitos quedan fertilizados y clivan

hasta el estado de dos células después de MIV, FIV, y de éstos solo

llegan el 40% de los embriones al estado de blastocisto después de

CIV

.

REFERENCIAS

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