Transferencia de Embriones en El Ganado Bovino

Manual de Transferencia de Embriones en el Ganado B

Octubre de 2006

Gobierno del Estado de Chiapas

Lic. Pablo Salazar Mendiguchia Gobernador Constitucional del Estado

Ing. Javier Antonio Ruiz Morales Secretario de Desarrollo Rural

Dr. Fidelfo Rodriguez Fernandez Subsecretario de Ganaderia

MVZ. Rafael Gonzalez Castellanos Director de Fomento Ganadero

MVZ. Oscar Moguel Delarbre Jefe de Departamento de Vinculaci6n

Ing. Napoleon Orantes Solorzano Coordinador General D.P.A.I.

Secretaria de Agricultura, Ganaderia, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentacion

MVZ. Jose Angel Del Valle Molina Delegado Estatal

Ing. Israel de Jes6s G6mez Torres Subdelegado Agropecuario

Ing. Carlos Antonio Toledo Culebro Jefe de Fomento Pecuario

Fundacidn Produce Chiapas A.C.

Sr. Hipolito Pedrero Alegria Presidente Ejecutivo

Dr. Jorge Luis Zuarth Macias Secretario

C.P. Araceli Ramirez Martinez Tesorera

Universidad Aut6noma de Chiapas

MC. Jorge Ordofiez Ruiz Rector

Dr. Hugo GuillCn Trujillo Secretario General

Dr. Carlos Eugenio Ruiz Hernandez Secretario Academico

Dr. Jos6 Alfredo Medina Melendez Director General de Extension

MVZ. Adizain Alegria C6rdova Director de la FMVZ

MVZ. Alfredo Castellanos Coutifio Secretario Acaddmico

MC. Roberto R. Coutifio Ruiz Director de la Facultad de Ciencias Agron6micas

Dr. Ramiro Ruiz Najera Secretario Academico

MVZ. EPA Oscar Leon Velasco Coordinador General de Vinculacibn

y Extensibn Universitaria

Coordinadores y Responsables del Curso Cuerpo AcadCmico

"BIOTECNOLOG~A Y MEJORAMIENTO GENETICO ANIMAL"

Dr. Horacio Lebn Velasco MC. Horacio Ruiz Hernandez MVZ. Alfonso Ruiz Moreno

MVZ. Alfonso Villalobos Enciso

Colaboradores en la elaboraci6n del material didactic0

MVZ. Oscar Miguel Dominguez Galdimez Juan Luis Orantes Arrazate

William Esponda Hernandez

I.. INTRODUCCION .................................................................................... 1

........... 11.. ANTECEDENTES DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES 3 2.1 .. Fisiologia de la reproduccion ....................................................... 6 2.2.. Mecanismo de selection ......................................................... 13 2.3.. Agentes superovulatorios .................................................... 16 2.4.. Metodos de sincronizacion de estros ......................................... 17 2.5.- Tecnicas de Superovulacion .................................................... 21 2.6.- Deteccion de Estro .................................................................... 24

............ 2.7.. Insemination de las vacas donadoras y superovuladas 24

Ill.. MEDIOS PARA LA COLECCION DE EMBRIONES .............................. 26 3.1 .. Congelacion ............................................................................... 27 3.1 . 1 .- Molaridad .................................................................................. 28 3.1.2.- Funcion de 10s crioprotectores ................................................. 29 3.1.3.- Velocidad de enfriamiento ....................................................... 30

......................................... 3.1.4.- Clasificacion de 10s crioprotectores 31 .................................................................. 3.1.5.- Funcion del glicerol 33

............................................................ 3.1.6.- Funcion del etilenglicol 33 ................................... 3.1.7.- Congelacion de embriones con glicerol 34

.............................. 3.1 .8.- Congelacion de embriones con etilenglicol 36 .... ..................... 3.1.9.- Descongelacion de embriones con glicerol .. 38

...................... 3.1.10.- Descongelacion de embriones con etilenglicol 41 .......................................................... 3.1 . 11 .- Preparacion de medios 42

IV.. COLECCION DE EMBRIONES .......................................................... 43 .............................................................. 4.1 .. Evaluacion Embrionaria 44

4.1 . 1 .. Embriones transferibles ........................................................... 45 ............................................................ 4.1.2.. Lavado de 10s embriones 47

........................................................ 4.1.3.- Transferencia de embriones 47 4.1.4.- Bipartition de embriones ............................................................. 49

......................................................................... 4.1.5.- Micromanipulador 49 ............................................... 4.1.6.- Division artificial de 10s embriones 49

...................................... 4.1.7.- Ventajas de la biparticion de embriones 51 ........................................................................................ 4.1 .8.- Mellizos 52

.......................................................... 4.1.9.- Mecanismo de gemelacion 52 .................................. 4.1.10.- Tasas de gemelacion en ganado lechero 53

4.1 . 11 .- Freemartinismo .......................................................................... 54

V.. LITERATURA CITADA .............................................................................. 57

La reproduccion en 10s animales domesticos se ha incrementado su desarrollo gracias

a la manipulacion de biotecnologias como la inseminacion artificial (IA) y la

transferencia de embriones (TE). La eficiencia de estos procedimientos y de la

posibilidad de mantener viables las celulas germinativas desde el momento de la

coleccion hasta su aplicacion, desde el punto de vista cientifico cobra gran

importancia. En este sentido, la congelacion de estas celulas ofrece una solucion

practica para el almacenamiento prolongado de las mismas sin perder su viabilidad.

La criobiologia tiene como objetivo el estudio de las causas de dafios celular durante la

congelacion y descongelacion, asi como la implementacion de metodos disefiados

para reducir o evitar ese dafio; de tal forma, que las celulas Sean capaces de continuar

en forma normal su desarrollo completo despues de la descongelacion.

La transferencia de embriones es una herramienta para el mejoramiento genetico del

ganado y tiene como objetivo incrementar la tasa reproductiva de las hembras de alto

valor genetico. La transferencia de embriones consiste en inducir un embrion en etapa

de preimplantacion en el utero de la hembra denominada receptora, la cual se

encargara de gestarlo y llevarlo al nacimiento. El embrion transferido puede ser fresco

o congelado. Esta tecnica consiste en un tratamiento hormonal que se aplica a las

hembras donadoras para inducir la maduracion y ovulation de un gran numero de

ovulos (superovulacion).

La congelacion de celulas embrionarias tiene por objeto interrumpir el metabolismo de

forma reversible permitiendo de ese modo, su conservation durante un tiempo

indefinido en estado solido, manteniendose la viabilidad del embrion despues de la

descongelacion. La supervivencia depende esencialmente de las condiciones de

cambio de fase del agua celular y de la eficacia de 10s crioprotectores.

Con el uso de crioprotectores como el etilenglicol y el glicerol se podran definir nuevas

estrategias, tanto en la congelacion de embriones como en el programa de

transferencia de embriones en el ganado bovino.

OBJETIVOS.

1 .- Actualizar y capacitar a 10s profesionales y estudiantes de la Medicina Veterinaria en

Biotecnologia Reproductiva especificamente en transferencia de embriones en el

ganado bovino como una herramienta para el mejoramiento genetic0 de la ganaderia.

2.-Promover la transferencia de tecnologia en materia de transferencia de embriones a

10s productores pecuarios y vincular la Universidad Autonoma de Chiapas con el

subsector agropecuario del pais.

11.-ANTECEDENTES DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES

La historia de la transferencia de embriones se remonta a 1890 cuando el ingles Walter Heape, realizo con exito la primera transferencia embrionaria en conejos. A partir de entonces se han informado transferencias embrionarias exitosas en todo tip0 de animales de granja. La comercializacion de tecnologia para la transferencia embrionaria

comenzo en America del Norte.

Una hembra (donadora) puede aumentar su numero de crias durante su vida al concebir de manera repetida y mediante la recuperacion de embriones al inicio de la gestacion y

la transferencia de estos a 10s aparatos reproductores de otras hembras (receptoras) para completar la gestacion. Este procedimiento depende por completo de la disponibilidad de una fuente de embriones de calidad adecuada y el medio uterino propicio de la receptora al momento de la transferencia embrionaria (sincronia) (Hafez, 2000). El principal objetivo del transplante de embriones es incrementar la tasa reproductiva de una hembra de excelentes caracteristicas, fecundada con un tor0 de

alta genetica (Aspron, 1992).

La transferencia embrionaria se ha aplicado muy extensamente en la vaca; en

consecuencia, la tecnologia ha avanzado con mas rapidez en esta especie. En 10s arios

60, la anestesia general y la laparotomia eran necesarias para la coleccion y

transferencia de embriones bovinos, y en el Reino Unido y America del Norte esta tecnica se utilizo sobre todo para la rapida multiplication razas exoticas de carne importadas (Palomino eta/., 1998).

La utilization de embriones junto a la inseminacion artificial en 10s programas de mejora

genetica es una practica que ha venido difundiendose en forma creciente en 10s ultimos

20 aiios. Sin embargo, esta tecnologia que tiene un enorme potencial de mejora

genetica, no ha tenido la difusion masiva que debiera en funcion de tal potencialidad.

Las limitantes han sido tanto 10s altos costos de la misma, como la enorme variabilidad

en la respuesta de 10s animales destinados a producir tales embriones. Lo anterior

parece marcar limites economicos y biologicos en la tecnologia que no han podido ser

superados en 10s ultimos 20 atios y que limitan su desarrollo.

La transferencia de embriones es una tecnica de rnanipulacion genetica y dentro del

campo de la reproduccion tiene como proposito servir como herramienta en el

mejoramiento genetic0 del ganado e incrementar el potencial reproductivo de hembras

sobresalientes en lineas especificas de la reproduccion.

Estro

I 1 1 Transferencia

ESQUEMA 1.- SELECCI~N DE DONADORAS Y RECEPTORAS PARA LA

TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN EL GANADO BOVINO.

El utilizar embriones congelados permite aprovechar al maximo el potencial de una hembra; en virtud, que es posible congelar todos 10s embriones de excelente y buena calidad, ser transportados a cualquier pace del mundo en forma facil y economica. Por esto, la TE ha tenido un impact0 considerable sobre 10s programas de reproduccion en paises desarrollados desde 10s aAos 70's, esta influencia ha sido principalmente dentro del sector de razas puras con el objeto de aumentar el potencial reproductivo de hembras superiores y donde el alto valor comercial de sus crias ha justificado el gasto involucrado.

Existen tres metodos de coleccion de embriones, dos quirurgicos y uno no quirurgico, el

primer0 requiere de medicos, anestesistas y cirujanos, lo cual hace de esta tecnica algo

impractico quedando en desuso. El segundo metodo consiste en una laparotomia por uno

de 10s flancos usando anestesia regional y local. El tercer metodo es el no quirljrgico o

transcervical, que actualmente es el mas usado. Con el desarrollo del metodo de coleccion de embriones no quirurgico, existe la posibilidad de la dispersion de esta tecnologia dentro

de paises desarrollados. Una de las principales razones para el uso de la TE es el mejoramiento genetico y se puede superar algunas formas de infertilidad que puede surgir

a consecuencia de fallas de fertilization debido a altas temperaturas. Este proceso puede

ser usado para establecer bancos de embriones congelados y permitir la importancia de

10s mismos y por lo tanto la introduccion y transferencia del nuevo material genetico.

LAVADO DE VACAS DONADORAS PARA LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES (METODO NO QUIRURGICO 0

TRANSCERVICAL).

Ciclo estral del ganado bovino.

El ciclo estral es una serie de eventos hormonales que ocurren desde un period0 de estro

hasta la manifestacion del siguiente. El estro es comunmente referido con el dia cero en el ciclo estral de la vaca, momento en el cual la vaca es sexualmente receptiva al toro. El ciclo

estral en el ganado bovino tiene una duracion aproximada de 21 dias, con un interval0 de 17 a 24 dias para que sea considerado como normal. En el caso de las vaquillas el ciclo

estral dura menos que en las vacas.

El ciclo estral puede ser dividido en dos fases: la primera, llamada fase folicular que se

caracteriza por que durante este tiempo ocurren las fases finales de desarrollo folicular.

Esta fase es relativamente corta y dura aproximadamente de 4 a 5 dias, iniciandose con la

regresion del cuerpo luteo (CL) y culminando con la ovulacion. La segunda o fase Iutea, es

caracterizada por el desarrollo del CLy tiene una duracion de 16 a 17 dias.

Los cambios anatomicos y fisiologicos que sufren 10s organos reproductivos durante estas

fases son regulados por hormonas entre las que se encuentran.

a) GnRH. Hormona liberadora de gonadotropinas que es producida a nivel

hipotalamico.

b) LH y FSH. Hormona luteinizante y foliculo estimulante respectivamente sintetizadas a nivel hipofisiario.

c) Inhibina, estrogenos y progesterona que son producidos por el ovario. d) PGF, . Prostaglandina F, alfa-sintetizados en el endometrio.

e) IGF-I. Factor de crecimiento parecido a la insulina numero 1 sintetizado en el higado.

La duracion del estro en el ganado cebu es alrededor de 10 horas (h) per0 tiene un amplio

rango de variacion que va de 2.2 a 18.4 h. Es conveniente mencionar que la duracion del ciclo estral puede verse alterada debido a ciertos factores como son; 10s cuerpos luteos de

vida corta que son precedidos por foliculos deficientes en su desarrollo, asi como a las fallas que ocurren por muerte embrionaria temprana.

Caracteristicas de la conducta estral

Ademas de 10s tratamientos y tecnicas utilizados en la sincronizacion de estros, es

importante considerar tambien que existen problemas para detectar con precision la

manifestacion de conducta estral, debido a la composicion, tamafio y orden social que se

tenga en un grupo de hembras bovinas.

Se ha observado que existe una relacion entre conducta estral y jerarquia en las hembras, cuando se encuentran en estro dentro de un grupo. Ademas del nljmero de estas que presentan estro al mismo tiempo. En efecto, una o varias hembras pueden presentar una conducta de dominancia sexual ante el grupo; es decir, presentar comportamiento activo, que consiste en conductas estrales hacia otras hembras.

En un hato con vacas Indubrasil, se observo que el 60% de montas fueron realizadas por hembras que presentaban mayor jerarquia; sin embargo, aunque en menor proporcion, las hembras dominantes pueden ser montadas por hembras consideradas como

inferiores dentro del orden social.

De acuerdo a investigaciones realizadas, se ha observado que la vaca que monta,

generalmente domina a la que es montada, encontrando que se pueden presentar 5.3

montas por una hora en vacas que se encuentran en pastoreo; en contraste, con 8.7

montas en promedio que presentaron hembras que se encontraban en condiciones de estabulacion. Esto puede ser un efecto de que al tener una alteracion de las condiciones ambientales en hembras que se encuentran en pastoreo, estas pueden suprimir la manifestacion de conducta estral.

Asimismo, se ha observado que las hembras con una mayor dominancia dentro del grupo,

inhiben el comportamiento sexual de sus compaAeras, dando como resultado que las

primeras presenten mayor indice de comportamiento estral y social; ademas de

interactuar con sus compafieras que son racialmente semejantes.

Las variaciones que se pueden presentar en el comportamiento social y jerarquico,

dependen de la hora en que se aplique el tratamiento para sincronizar, la hora en que se

manifieste la mayor actividad sexual y de la observacion de estro. Ademas, existen efectos que controlan la forrnacion de grupos homosexuales, en donde una hembra podria dejarse montar por una de sus compafieras y no por la presencia de un macho.

Otra variacion que se puede presentar en ganado Cebll cuando se encuentra en etapa estral, es un comportamiento de agresividad en algunas vacas, manifestando con topeteo, el cual puede ser de tipo no agresivo con la presentacion de caracteristicas como

bramido, lamer los genitales, roce corporal u oler otras regiones corporales de su compaAera que en ese momento tambien presenta estro. Ademas, las hembras tienden a

presentar signos como inflamacion de vulva, hiperemia del vestibulo vaginal, eliminacion de moco filamentoso y arborizacion del moco cervical.

Por otra parte, algunos investigadores tambien describen un efecto de bioestimulacion,

dada por feromonas que se encuentran en el moco cervico-vaginal de las hembras que se

encuentran en estro y que pueden estimular a otras hembras anestricas. Esto se corrobora

con un posterior estudio realizado por Wright et a/. (1992) quienes demuestran que al

manifestarse estro un grupo de hembras sincronizadas, estas pueden estimular la

actividad ovarica de hembras no tratadas, acortando la duracion de anestro posparto.

Efecto ambiental en la conducta de estro.

Se ha observado que se presenta un alto indice de estros en hembras lndubrasil durante el

transcurso de horas oscuridad, que en las primeras horas de luz. Sin embargo, la presencia de comportamiento estral en Bos taurus, es mas frecuente durante las horas de

oscuridad y las primeras horas de luz, entre 1.30 y 7:00 horas.

Por otra parte, las condiciones climatologicas elevadas al tropico, se pueden presentar en

el ciclo estral con mayor regularidad en primavera que en otras estaciones del aAo,

observando que la determinacion de estros, solo puede presentarse alrededor del 30%. Esto se confirma con lo observado por Lozano et a/. (1 987) quienes indican un porcentaje

similar en la deteccion de estros en 10s meses en que se incrementa el fotoperiodo.

Particularmente en el ganado de tip0 Bos indicus y Bos taurus, se ha observado una

actividad reproductiva continua durante todo el aAo; aunque 10s cambios fisiologicos

parecen alterarse, al efecto climatic0 de la estacion y fotoperiodo del aAo. En cambio, Rice

(1 988) menciona que vaquillas de la raza 60s indicus, son mas afectadas por el clima que

el ganado de tip0 Bos taurus. Ciclos estrales cortos

Al reanudar la actividad ciclica despues del parto, 10s animales presentan uno o dos ciclos cortos, 10s cuales contribuyen a problemas de infertilidad durante 30 a 40 dias despues del

parto. Cuando 10s ciclos estrales cortos ocurren, el cuerpo luteo regresa erroneamente antes de que se pueda enviar la seiial de que la gestacion ha comenzado. Esta regresion

prematura del cuerpo luteo, aparentemente se debe a que durante este tiempo se

presentan niveles altos de prostaglandinas F, alfa (PGF, ) producidos por el ljtero como

parte de 10s mecanismos normales de la involuciisn uterina, por lo que la presencia de ciclos cortos y la involution uterina se encuentran intimamente ligados.

Desarrollo folicular durante el ciclo estral.

Dentro de un ovario, 10s foliculos se encuentran en diferentes estadios de desarrollo y han

sido clasificados acorde al nllmero de capas de celulas que rodean al oocito, asi como por la presencia del antro.

La clasificacion mas comljn divide a 10s foliculos en:

a) Foliculo primordial. Estos foliculos se encuentran en gran numero en el ovario antes del nacimiento. En estos foliculos el oocito se encuentra rodeado por u n a

capa de celulas foliculares aplanadas, llamadas tambien celulas de epitelio

folicular escamoso. El diametro de 10s oocitos en la vaca varia entre 79 y 120

micrometros.

b) Foliculo primario. El oocito se encuentra rodeado por una simple capa de celula

cuboidales o poliedricas. Este foliculo, tiene un diametro aproximado de 150 micras.

c) Foliculo secundario. El oocito esta rodeado por varias capas de celulas

poliedricas o cuboidales, momento en el cual, las celulas de la granulosa

desarrollan receptores para FSH y estrogenos. d) Foliculo terciario. El oocito esta rodeado por varias capas de celulas granulosas y

el antro folicular esta formado. En vacas, la formacion antral inicia cuando el foliculo

tiene un diametro aproximado de 0.5 mm.

e) Foliculo de Graff. Este tip0 de foliculo se forma como resultado de la acumulacion

de fluido folicular y hace que se extienda el antro, el oocito se ubica en la periferia

del foliculo y se rodea por una acumulacion de celulas de la granulosa. El foliculo

preovulatorio corresponde a esta clasificacion folicular. Debido a su talla, el foliculo

grafiano maduro, emerge desde el ovario a la superficie en forma de ampula.

Etapas del ciclo estral

Estro. En esta etapa la hembra acepta la monta del macho o de una compariera de hato. Esta

conducta es determinada por un increment0 significativo de las concentraciones de estradiol, que es consecuencia del desarrollo de un foliculo y por la ausencia de un cuerpo

Iuteo. En este momento las concentraciones de progesterona se encuentran en niveles basales ya que tuvo que haber ocurrido la regresion del cuerpo Iuteo.

Durante el estro la hembra esta inquieta e interactua con sus comparieras (conducta homosexual). Por efecto de 10s estrogenos 10s genitales externos se edematizan y hay

produccion de moco cervical. La duracion del estro es variable fluctuando de 8 a 18 h y es afectada por el tip0 de ganado y por las condiciones ambientales. El ganado tipo Bos taurus la conducta estral es muy repetible; sin embargo, factores ambientales tales como

instalaciones con pisos de cement0 provocan que el estro se acorte y sea menos intenso.

En contraste el piso de tierra permite una mayor actividad estral. En el ganado tip0 Bos

indicus es mas variable la conducta y la duracion del estro.

SIGNOS Y CONDUCTA ESTRAL EN EL GANADO BOVINO

Metaestro

Durante del metaestro ocurre la ovulation y se desarrolla el cuerpo luteo pasando por el

estadio intermedio conocido como cuerpo hemorragico, el cual es un estado de transicion

entre el foliculo recien ovulado y el cuerpo Iuteo. En esta etapa las concentraciones de progesterona comienzan a incrementarse hasta que alcanzan concentraciones mayores de 1 nglml, momento a partir del cual se considera que termina el metaestro y comienza el diestro. La duracion del metaestro es de 4 - 5 dias. Un evento hormonal que se destaca en este period0 consiste en la presentacion del segundo pic0 de secrecion de FSH que 1 10

mantiene una relacion directa con el inicio de la primera onda de desarrollo folicular Algunas vacas presentan un sangrado conocido como sangrado metaestral.

PROCESO DE O V U L A C I ~ N (METAESTRO).

Diestro

El diestro es la etapa de mayor duracion del ciclo estral, en promedio de 12 -14 dias.

Durante esta etapa el cuerpo lljteo mantiene su plena funcionalidad, 10s niveles de

progesterona se mantienen arriba de 1 nglml. Concomitantemente a la funcion lljtea se

observa una dinamica folicular intensa, ya que durante esta etapa se presentan ondas de

desarrollo folicular con sus caracteristicas fases (reclutamiento, selection y dominancia);

por este motivo durante el diestro se observan foliculos de diferente tamafio. Despues de

12 - 14 dias de exposicion a progesterona el endometrio comienza a secretar PGF, alfa en

un patrori luteolitico, el cual termina con la vida del cuerpo luteo y con la etapa de diestro.

En terminos endocrinos cuando el cuerpo luteo pierde su funcionabilidad, es decir, cuando

las concentraciones de progesterona disminuyen por debajo de 1 nglml termina el diestro y

comienza el proestro. Cabe mencionar que durante esta etapa la LH se secreta con una

frecuencia muy baja, y la FSH tiene incrementos que coinciden con el inicio de las ondas de

desarrollo folicular. :.,;e". , -

DIFERENTES ESTRUCTURAS OVARICAS (CUERPO HEMORRAGICO Y CUERPO LUTEO)

El

Proestro:

Etapa cuya duracion es de 3 a 4 dias, llamada tambien fase de crecimiento folicular, etapa

en la que un nuevo foliculo empieza a madurar y con ello inicia el crecimiento de

produccion de hormonas FSH y LH, que al actuar nuevamente a nivel del ovario ocasiona

el desarrollo de un nuevo foliculo, este a su vez produce 10s estrogenos para

desencadenar un nuevo estro.

ESTRO METAESTRO DIESTRO PROESTRO ESTRO

0 , 6 & Q Q 8 B @ @ Foliculo

Foliculo ovulaclon Cuwpo Cuerpo luteo y foliculos Foliculo y cuerpo ovulatorio hernorragico luteo en

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0 DlAS DEL ClCLO

Progcstcrona - FSH - PCF2 alfa 0 Foliculos subordinadus Foliculos atr6sicos - Estradiul - 1.H - Olcada folicular a) Foliculo don~inante

ESQUEMA 2.- CAMBlOS OVARICOS Y HORMONALES DURANTE EL ClCLO ESTRAL DE LA VACA

2.2.- SELECCION DONADORAS

Es el principal paso a dar para el inicio del programa de transferencia de embriones y para

esto se utilizan dos criterios intimamente ligados. El primero, el cual desea el productor es

la eficiencia productiva del animal seglln su finalidad zootecnica y ligado a su capacidad genetica; per0 el mas importante es el criterio elegido por el tecnico el cual consiste en que el animal donante provenga de lineas fertiles, tenga un aparato reproductor y ciclo estral

normal, sin antecedentes de partos distocicos y retenciones placentarias, no mas de dos servicios por concepcion y tener una edad de 3 a 10 atios (Elsden, 1980).

En el aspect0 sanitario deberan de estar libres de enfermedades, especialmente aquellas

que afectan la funcion reproductiva; segun la region deberan estar sometidas a un estricto

programa de vacunacion y desparasitacion para garantizar un buen estado de salud.

En el caso de las receptoras, practicamente seguimos 10s mismos puntos que en las

donadoras, per0 se pueden emplear animales de cualquier raza o cruza (el cruzamiento

aumenta la fertilidad), sin importar su procedencia, per0 teniendo en cuenta que se traten

de animales jovenes, sanos con buen desarrollo corporal, especialmente la pelvis (ya que

muchas veces tendran que parir becerros muy pesados), en perfecto estado nutricional,

dociles y faciles de manejar y con una produccion de leche suficiente para criar hasta el

destete su becerro (Aspron, 1992).

La donadora puede ser una vaca o vaquilla, si se escoge una vaca esta debe de tener por

lo menos 3 a 4 meses posparto. Si la futura donadora no se encuentra ciclando, se le

puede inducir al estro con un implante de Norgestomet por 7 -1 0 dias y aplicandole400 U.I.

de gonadotropina serica de la yegua pretiada (eCG) al momento del retiro del implante. El

primer ciclo de este tratamiento generalmente es de corta duracion, per0 el siguiente ciclo

es de duracion normal. Una buena decision es que la vaca tenga por lo menos dos ciclos

normales antes de comenzar el programa de superovulacion.

En el caso de que se desee superovular una vaquilla, es necesario que esta tenga un peso

vivo por lo menos de 350 kg, y que ya este ciclando normalmente. No es recomendable

utilizar implantes de norgestomet en vaquillas de por lo menos de 350 kg. que aun no

hayan empezado a ciclar, ya que cabe la posibilidad de que entre en anestro prolongado

(Canseco, 1999).

C; ,

S E L E C C I ~ N DE DONADORAS

Seleccion y manejo de Receptoras

Las hembras receptoras deben de cumplir con determinadas caracteristicas sanitarias,

nutricionales y reproductivas. Para la selection de esta se requiere de un balance entre las

caracteristicas raciales y de factibilidad economica. La raza parece no tener una consideracibn significativa aunque 10s animales cruzados son mas fertiles (Elsden et a/.,

1 986).

La receptora debe ser una vaca con uno a tres partos o vaquillas bien desarrolladas de la

raza y tip0 que se disponga, fertilidad probada capacidad materna, preferentemente de

buena talla y con una historia de partos normales, de facil manejo, con condiciones de

desarrollo corporal aceptables, deben de estar ciclando y por lo menos de 80 dias despues

del parto (Reagan, 1993), control de sanidad y programas de concentraciones de

receptoras de diversas explotaciones; es necesario establecer una cuarentena o en

programas en particular en una explotacion es necesario examinar cada animal para algunas enfermedades como la Tuberculosis, Brucelosis, Anaplasmosis, Lengua Azul, y

vacunar 10s animales nuevos contra Rinotraqueitis lnfecciosa Bovina, Diarrea Viral

bovina, Leptospirosis y Clostridiasis. Ademas de controles de parasitos internos y

externos (Elsden eta/. , 1986).

En el aspect0 nutricional las receptoras deberan estar sometidas a un regimen alimenticio que permita el increment0 gradual de 500 a 900 g al dia y sales minerales a libre acceso (

Elsden eta/., 1986; Reagan, 1993).

Las vacas receptoras preseleccionadas se determina su estado de salud y reproductiva, deben para lo cual es necesario una identificacion visible y permanente en el animal (arete,

fierro marcador o tatuaje). Para posteriormente levantar controles por medio de tarjetas individuates de sus eventos reproductivos (Reagan, 1993).

La palpacion rectal de las hembras se realiza para determinar su estado reproductivo, preferentemente anormalidades del cervix, cuernos uterinos, ovarios y diagnosticos de

gestaciones tempranas y tomar decisiones del metodo para implementar el programa.

En resumen Elsden y Seidel(1986), Reagan (1 993) citan que una receptora debe cumplir

con 10s siguientes criterios. Buena condicion corporal. Vacas jovenes de 1 a 3 partos 6 vaquillas bien

desarrolladas. Cruzas de Bos indicus y Bos taurus (FI), esta ultima de preferencia de razas

lecheras. Fertilidad probada y el cervix debe ser pasable facilmente.

Habilidad materna y que tengan un diagnostico previo de no preAez.

Suficiente aporte de nutrientes, minerales y vitaminas liposolubles principalmente

ADE. Deben ser identificadas con arete, fierro quemador o tatuaje.

Programa de vacunacion y de desparasitacion con fundamento a 10s resultados del

laboratorio de diagnostico.

Libre de enfermedades infectocontagiosas Brucelosis, Tuberculosis,

Leptospirosis, Tricomoniasis, Campilobacteriosis, Rinotraqueitis lnfecciosa Bovina

(IBR) y DiarreaViral Bovina (DVB).

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S E L E C C I ~ N DE RECEPTORAS E5

2.3.-Agentes superovulatorios

La superovulacion es la induction de ovulaciones multiples mediante la disminucion de la

atresia folicular con el uso de hormonas. Existen varios productos comerciales que se

pueden usar en 10s programas de superovulacion, la mayoria estan basados en la de

estimulacion folicular (Mombiela, 2000).

En 10s bovinos la superovulacion puede ser provocada por diferentes preparados de actividad gonadotropica siendo 10s principales: la gonadotropina corionica equina (eCG) y

la hormona foliculo estimulante de origen porcino (FSH-P) (Caral eta/., 1986).

Segun Elsden (1 980) el tratamiento mas utilizado en la actualidad es el de la aplicacion

decreciente de FSH-P durante cuatro dias a una dosis de 280 mg. a 400 mg tomando

como primer dia, el decimo a partir de la aparicion de estro y aplicando prostaglandinas

sinteticas (PGF, alfa) el tercer dia de superovulacion (Cuadro 1).

CUADRO 1.- SlSTEMA DE SUPEROVULACI~N CON FSH EN DOSlS DE CRECIENTE

Dia

0 = ESTRO

10

11

12

13

14

14

Actividades

am Pm

ESTRO

FSH FSH

FSH FSH

FSH + PGF2x FSH + PGIS:!

FSH FSH

ESTRO ESTRO

I .A I .A

La hormona FSH-P induce una respuesta superovulatoria mas uniforme y preferible que la lograda con la eCG(Elsden, 1978).

2.4.- Metodos de sincronizacion de estros

Como se menciono las inyecciones exogenas de FSH (eCG o FSH) tiene uso difundido en 10s programas de superovulacion multiple y transferencia embrionaria para incrementar la

disponibilidad de embriones provenientes de animales de merito genetic0 superior. Las inyecciones subcutaneas o intramusculares de eCG o FSH por lo general estimula el

crecimiento adicional de foliculos 10s cuales ovularan de manera espontanea sin

necesidad de LH o hCG exogena en el ganado bovino.

En virtud de que la FSH tiene una vida media mas corta (2 a 2.5 horas) que la eCG (24-72

horas). Por lo general es necesario dividir la dosis total, inyectar a intervalos de 12 horas

durante tres a cuatro dias para estimular la misma cantidad de crecimiento folicular que

resultaria de una sola inyeccion de eCG. Pese a la superioridad de la FSH, la eCG

continlja utilizandose sola o combinada con antisueros, 10s cuales se unen y bloquean a

cualquier exceso de eCG en la circulacion despues del inicio del estro. Sin embargo, el

suero anti-eCG no tuvo ningun efecto importante en las cantidades de cuerpos luteos ode

embriones (Hafez, 2000).

Durante 10s ljltimos 10 aAos la Prostaglandina F, alfa y su analogo el Cloprostenol han

contribuido de manera importante a la superovulacion, ya que la PGF, alfa no solo

aumenta la flexibilidad para programar la superovulacion sino tambien representa un

tratamiento excelente para la produccion de gran nljmero de embriones normales. El

tratamiento superovulatorio puede iniciarse en cualquier momento entre el dia 6 del ciclo

estral y la regresion natural del cuerpo lirteo; sin embargo, el mejor momento para el

tratamiento en el ganado bovino es entre 10s dias 8 y 12 del ciclo estral (Hafez y Hafez,

2004).

Prostaglandinas

Las prostaglandinas derivan de 10s acidos grasos esenciales por oxidacion catalizada por enzimas, son agentes paracrinos de vida corta cuyas acciones estan mediadas por receptores especificos de la membrana plasmatica. Estas hormonas median la secrecion

de GnRH, ovulacion, regresion del cuerpo Iuteo, maduracion del cuello uterino y el parto.

Las prostaglandinas derivan del acido araquidonico, presentan 20 atomos de carbon0 y un

anillo ciclopentano, las que se encuentran mas relacionadas con la reproduccion es la

PGF2a y prostaglandina E,. Son transportadas en la sangre para actuar en un tejido

blanco lejos del lugar de su produccion, ademas es el agente luteolitico natural que finaliza

la fase lutea del ciclo estral y permite el inicio de un nuevo ciclo estral en ausencia de fertilization.

PROSTAGLANDINA NATURAL (DINOPROST TROMETAMINA)

El proceso de luteolisis inicia con 10s estrogenos, estos preparan receptores para oxitocina

en la mucosa del endometrio, evento que se da en la etapa del del diestro del ciclo, el cuerpo luteo (CL) en el dia 16 y 17 comienza a liberar oxitocina, esta se dirige a la

membrana celular localiza su receptor y se lleva a cab0 el proceso de reacciones enzimaticas como la fosfolipasa A, para la sintesis de PGF,a e inician 10s pulsos que van de

6 a 8, 10s cuales llegan por via local o general y destruyen (lisis) al CL disminuyendo la concentracion de progesterona hasta hacerlo desaparecer.

Existen prostaglandinas naturales y sintetica, las naturales son aquellas que tienen su

estructura quimica y biologica parecidas a las que se producen en un ser vivo, ejemplo de

esto se tiene (Lutalyse, Lab. Pfizer) las sinteticas su estructura quimica y biologica son

modificadas a las que se produce en el organism0 animal Luprostiol (Prosolvin, Lab,

Intervet). Esta hormona solo funciona cuando existe un cuerpo luteo funcional. Es

importante realizar un diagnostic0 por palpacion o ultrasonografia para detectar la estructura y poder aplicar la PGF,a.

LUPROSTIOL (ANALOGO SINTETlCO DE LA PROSTAGLANDINA F,ALFA)

Progesterona natural y progestagenos

Ireland y Roche (1982), citado por Montiel (1996) indican que la progesterona y 10s progestagenos sinteticos suprimen el estro y la ovulacion, actuando a traves de un mecanismo de retroalimentacion negativa sobre la liberacion de la hormona luteinizante (LH), por lo mismo probablemente se reduce la frecuencia de 10s pulsos de esta hormona y se impide que algljn foliculo ovarico complete su desarrollo y ovule. Al retirar la hormona 10s foliculos de todas aquellas vacas tratadas completaran su desarrollo al mismo tiempo lo que provoca el estro sincronizado.

lnicialmente la progesterona se aplicaba en inyecciones diarias haciendo poco practico el sistema. Mas tarde, Christian y Casida (1980) demostraron que las inyecciones de

progesterona prolongaban la etapa del diestro por tanto tiempo como fueran aplicadas, al

termino las hembras entraban en estro y ovulaban en forma sincronizada. Posteriormente

se descubre 10s progestagenos via oral administrados en el alimento, el inconveniente es

que no existe control precis0 del consumo de las dosis diaria para cada animal, lo que

ocasiona respuestas variables en la sincronizacion.

Aplicacion via oral

El uso de progestagenos en el alimento como acetato de flurogestona (FGA): 30 6 45 mg

por dosis total, acetato de melengestrol (MGA): 11 a 60 mgldia, simplifica la

administracion de la hormona, pudiendo controlar el final del tratamiento mediante el retiro

del progestageno de la mezcla del alimento. La duracion puede ser de 7 a 14 dias de

aplicacion. La desventaja seria que no todos 10s animales comen la misma cantidad de

alimento y como consecuencia de la hormona.

Dispositivos intravaginales

En el mercado se encuentran dos productos: uno de ellos es el dispositivo en forma de espiral de acero inoxidable de liberacion controlada (PRID) con el 9% de progesterona del

laboratorio Sanofi Animal Helt y el dispositivo liberador de droga interna (CIDR) con 1.9 g de

progesterona del laboratorio Pfizer., ambos se aplican por periodos de 9 a 10 dias.

PROGESTERONA NATURAL - CIDR. LAB-PFIZER

El porcentaje de vacas que entran en estro despues del tratamiento con el CIDR, depende

de la etapa del ciclo estral en que se encuentre. Asi, el porcentaje que entra en estro es

mayor si el animal se encuentra en el diestro tardio y mas bajo en el diestro temprano ya

que en el retiro del CIDR algunas vacas todavia presentan un cuerpo lljteo funcional.

lmplantes auriculares

Se coloca debajo de la piel de la oreja, entre cartilago y piel en forma subcutanea durante 9

dias. El principio activo es el Norgestomet de 3 mg por dosis total, mas valerato de

estradiol: 5 mg intramuscular (Crestar, Lab. Intervet), este llltimo se modifica, en algunos

casos se aplica en otros no.

El norgestomet ejerce un efecto sobre el aparato reproductivo y el hipotalamo, suprime la

conducta estral y la ovulacion, Al retiro del implante se presenta la conducta estral y la

ovulacion. Los animales presentan estro dentro de las 100 horas posteriores al retiro del implante.

NORGESTOMET MAS VALERATO DE ESTRADIOL

El mecanismo de accion del progestageno junto con el estradiol es el de suprimir el estro

por medio del implante de norgestomet y la inyeccion con valerato de estradiol. El valerato

de estradiol causa atresia del foliculo antral, regresion del cuerpo lute0 y provoca el

reclutamiento de un nuevo grupo de foliculos de 4-5 dias de la aplicacion del tratamiento, el

norgestomet por si solo no afecta la forrnacion y funcion del cuerpo Iuteo natural ni la

gestacion.

2.5.- Tecnicas de Superovulacion

La respuesta superovulatoria depende de muchos factores, como son: raza, condicion

corporal, epoca del aAo, produccion lactea, edad, numero de parto, hormona, dosis,

regimen de colecta, dia del ciclo, superovulaciones previas y factor de individualidad del

animal. Algunos factores pueden ser controlados, aunque parcialmente, en tanto otros no,

lo que dificulta asignar una dosis adecuada a cada animal y predecir la respuesta.

GANADO CON BUENA CONDIC16N CORPORAL PARA LA SUPEROVULACI~N.

La superovulacion consiste en inducir el crecimiento extra de foliculos ovaricos mediante

la aplicacion de gonadotropinas. La aplicacion de este tipo de hormonas permite rescatar

de la atresia a un numero determinado de foliculos ovaricos de manera que estos puedan

seguir su crecimiento y llegar a la ovulacion.

Las gonadotropinas mas utilizadas son la hormona foliculo estimulante (FSH) y la

gonadotropina corionica equina (eCG). Tambien se han utilizado en forma experimental

extractos hipofisiarios de equino (HAP).

GONADOTROPINA CORldNlCA EQUINA (eCG) CON ACTIVIDAD DE LA HORMONA FOL~CULO ESTIMULANTE (FSH).

La FSH esta compuesta por glucoproteinas, dos subunidades diferentes que contienen

carbohidratos y que se hallan asociadas por uniones no covalentes, estas subunidades se

denominan a y p, esta ultima le confiere la actividad biologica a esta hormona. La

expresion de las gonadotropinas es modulada por factores hipotalamicos como la

hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH), por factores intrahipofisiarios . . _ I . _ L - I _ _ .- <.-*!-I _ _ - _A!. .!.-A . . I-I!-L-L!-- . . - - - --*---a: ---- I--::- 1-1 L - - 1 - -I- prlnclpalrnenre 10s peprlaos acrlvlna y rollsrarlna y por rerroallrnenraclon gonaaal ranro ae

hormonas esteroides como de peptidos. Los receptores de las gonadotropinas son m i m m h r n o A n I- f -mil;- A n r n r r n n t n r n e 3 r r n n l n A n e r r n n In nrntninn f2 I n hinein+neie A n I-e

suDunlaaaes ae las gonaaorroplnas proceae ae la rraauccron ae las suDunlaaaes ae 10s

RNArn, de modificaciones postraduccionales de las subunidades precursoras y del

plegamiento y la combinacion de las subunidades, del empaquetamiento de la hormona

madura y la secrecion de la hormona (Yen et a/., 2001). La hormona tiene un peso

molecular de 33,000 daltons, actua en las celulas de la granulosa, celulas de Sertoli e

hipotalamo, su funcion es el crecimiento folicular, mitosis de las celulas de la granulosa e

interviene en la maduracion del foliculo y del ovocito.

La FSH ha sido uno de las mas hormonas ensayadas para superovular y con las que se

tienen mejores resultados. En general, se trata de extractos hipofisiarios proveniente de ovino y porcino parcialmente purificados, tiene una actividad biologica corta en el torrente

circulatorio, no mayor de 3 horas, por lo que para que ejerza su efecto se tiene que aplicar cada 12 horas durante4 6 5 dias. El Folltropin-V (Lab. Vetrepharm-Canada) es un product0

comercial que tiene una purificacion en proporcion de LHlFSH de 1 :5, con dosis de 280 a 400 mg dependiendo la talla del animal ha demostrado proporcionar buenos resultados. La FSH producida por ingenieria genetica esta exenta de contaminacion con LH y no varia

dependiendo del lote. La dosis total de FSH se divide en 8 fracciones en forma

decreciente. 77

.- u - m r - r

'OLLTROP rr 4 PA.&.

HORMONA FOLICULO ESTIMULANTE (FSH). NIH-FSH-PI

I I I I I 1 I I I I 9.10 11 0 8 9 10 11 12 13 0 0 6 7

nun plqmmpqq 00 A A A t 3 i I i i i ; I 1 i i

00 1 ( 1 1 .- l~~. F S H' F S H F S H F s H 9

53 11% mq 30 mg, 20 ma

ESTRO

i 1 -7

PGFZs

C 4 - 4 C

SIWCRONILACION S U P E R O V U ~ ~ C ~ ~ N IA COLECCI~N

DE EMBRIONES

- - UI

yh. 1111 Prescntacion dcl astro

m .-. I Duracion dcl ostro 1

1 No do cuerpo~ lr~teos I NO do embrlonos y ~ v u ~ o s I

' I l l !\L I c.1 ll 11\11 > \ I ) I l l I

l'li/i*r I

- -

ESQUEMA 3. DIAGRAMA DE LA SINCRONIZAC~~N, SUPEROVULACI~N Y COLECCldN

DE EMBRIONES EN LAS VAQUILLAS DONADORAS.

La eCG antes conocida como PMSG (Gonadotropina serica de la yegua preriada), tambien es una de las hormonas mas investigadas para superovular, esta hormona tiene

una actividad biologica larga (48 a 72 horas), por su contenido de acido sialico es metabolizado lentamente y por lo mismo se aplica una sola vez. Su dosis varia de 1,500 a

3,000 U.I. y se aplica via intramuscular durante cualquiera de 10s dias del noveno y

doceavo del ciclo estral. Esta hormona tiene la desventaja de que despues de haber

causado la superovulacion sigue promoviendo el desarrollo de foliculos ovaricos, lo que causa una elevation exagerada de estrogenos que afecta la coleccion y calidad de 10s embriones.

2.6.- Deteccion de estro

En un programa de transferencia de embriones, la deteccion de estros es uno de 10s aspectos mas importantes. Al empezar el programa podria ser suficiente observar calores de 3 6 4 veces a1 dia; sin embargo, al finalizar la superovulacion se debe realizar las 24 horas del dia, tanto para inseminar a tiempo a las donadoras como para poder seleccionar las receptoras que entraron en estro en forma mas sincronizadas con las donadoras.

MANIFESTACION DE ESTRO EN EL GANADO BOVINO.

2.7.- Inserninacion de las vacas donadoras y superovuladas

La recomendacion mas comun es inseminar las hembras donadoras 12 horas despues

del inicio del estro y reinseminar 12 horas mas tarde. Esto se debe a que el animal

superovulado las primeras ovulaciones ocurren mas temprano que en las hembras no

superovuladas y se requieren de la presencia de semen viable durante el period0 en el que

ovulan el resto de 10s foliculos ovaricos. El lapso entre la primera y la ljltima ovulation generalmente es de 12 horas.

En algunos protocolos se han usado 2 dosis de semen, en la primera o segunda inseminacion artificial con el objeto de tratar de aumentar la fertilization de 10s ovocitos, aunque frecuentemente el precio de las dosis del semen es limitante. Rivera, ( I 987) indica

tres inseminaciones con dosis dobles a interval0 de 12 horas despues de iniciado el estro. Coelho y Acevedo, (1991) mencionan utilizar en vacas superovuladas dos inseminaciones 12 y 24 horas despues de iniciando el estro

INSEMINACI~N ARTIFICIAL EN EL GANADO BOVINO

Ill.- MEDlOS PARA LA COLECCION DE EMBRIONES

La manipulacion de 10s embriones fuera del ambiente uterino significa un gran riesgo, para evitar esto, se busca eliminar 10s cambios bruscos en la constitucion de las sustancias que

entran en contact0 con 10s embriones, pretendiendo igualar a las sustancias y secreciones existentes en el ambiente uterino. Las caracteristicas mas importantes en las soluciones utilizadas para este fin son: osmolaridad, pH, esterilidad y toxicidad.

La osmolaridad es la medida de la concentracion total de sales y compuestos de peso

molecular bajo en la solucion. Debe estar entre 270 a 310 miliosmoles por kilogramo,

desviaciones a mayor o menor concentracion pueden causar dafios irreversibles al

embrion. El pH debera mantenerse entre 7.2 y 7.6, aunque 10s embriones bovinos toleran

desviaciones sustanciales del rango optimo durante cortos periodos de tiempo. La

esterilidad de la solucion es muy importante, ya que la gestacion puede verse

drasticamente disminuida dependiendo del tipo de microorganismos presentes. La

toxicidad de algunos compuestos quimicos organicos o inorganicos puede dafiar y hasta destruir 10s embriones como la presencia de pequefias cantidades de ciertos metales,

como plomo y mercurio.

MEDlOS PARA LA C O L E C C I ~ N DE EMBRIONES

El metabolismo de microorganismos contaminantes pueden alterar el medio y volverlo

toxico para 10s embriones. La filtration de millipore (0.22 - 0.45 micras), constituye el

metodo idoneo para la esterilizacion de 10s medios, utilizando tecnicas y recipientes

esteriles, ademas es importante la adicion de antibioticos y antimicoticos.

Para lograr el pH fisiologico, algunos medios son amortiguados con carbonatos, es

necesaria una atmosfera del5% de CO, para mantener la conservation de carbonatos y

con ellos el pH. La solucion Hartmann modificada y solucion buferada fosfatada (PBS) Dulbecco, son las soluciones que constituyen 10s medios mas practicos para su uso en la

transferencia de embriones en bovinos.

3.1 .- Congelacion

El agua es el constituyente principal de 10s fluidos biologicos, responsable del transporte interno de las sustancias quimicas esenciales. El agua pura se congela y forma cristales a

O°C, mientras que esta misma que contiene iones y otras sustancias en solucion lo hace a

temperaturas mas bajas, dependiendo de la concentracion de tales sustancias. Conforme

el agua de una solucion se congela, 10s cristales de agua pura que se forman van dejando mayores concentraciones liquidas de aquellas sustancias que estan en solucion. Este

hecho aumenta la presion osmotica del resto del soluto, lo que puede determinar las lesiones de las celulas.

Las principales consecuencias fisicas y quimicas de la congelacion son la separacion del

agua pura de la solucion para formar hielo y la mayor concentracion de soluto resultante en el liquido residual. Estos hechos y sus efectos sobre las celulas se hallan influidos por el

nivel y 10s tipos de agentes crioprotectores, por la osmolaridad y el pH del diluyente y por la

rapidez de congelacion.

Desde que Whittingham et a/. (1972) y Wilmut (1972) quienes usaron escalas de

velocidad de enfriamiento lento (0, l-0.3°C/min) desde temperatura ambiente hasta -60 o - 80°C, se han hecho grandes modificaciones en las curvas de enfriamiento. En casi todos

10s trabajos publicados ultimamente se colocan 10s embriones directamente a -7"C,

permanecen 10 minutos, se enfrian a 0.5-0.6"CImin hasta -35°C y se sumergen en

nitrogen0 liquido. Este avance hoy dia es aplicado por todas las empresas e

investigadores en el proceso de congelamiento de embriones el cual reduce el tiempo de congelacion a no mas de una hora.

ESQUEMA DE LOS EVENTOS F~SICOS OCURRIDOS EN EL CONGELAMIENTO (HEXAGONOS REPRESENTAN CRISTALES DE HlELO DE DIFERENTE TAMAflO SEGUN LA VELOCIDAD DE ENFRIAMIENTO).

El mol, es la unidad de medida basica del sistema internacional de unidades, definida como la cantidad de una sustancia que contiene tantas entidades elementales (atomos,

moleculas, iones, electrones u otras particulas) como atomos hay en'0.012 kg (12 g) de

carbono 12. Esa cantidad de particulas es aproximadamente de 6.0221 X 1 o * ~ , el llamado

nimero de Avogadro. Por lo tanto, un mol es la cantidad de cualquier sustancia cuya masa expresada en gramos es numericamente igual a la masa atornica de dicha

sustancia.

La molaridad se define como la cantidad de sustancia de soluto, expresada en moles,

contenida en un cierto volumen de disolucion, expresado en litros, es decir: M = nlv. El

nljmero de moles de soluto equivale a1 cociente entre la masa de soluto y la masa de un

mol (masa molar) de soluto. Por ejemplo, para conocer la molaridad de una disolucion

que se ha preparado disolviendo 70 g de cloruro de sodio (NaCI) hasta obtener 2 litros

de disolucion, hay que calcular el nirmero de moles de NaCI; como la masa molar del

cloruro de sodio es la suma de las masas atomicas de sus elementos, es decir, 23 +

35.5 = 58.5 glmol, el nljmero de moles sera 70158.5 = 1.2 por tanto, M = 1.2/2= 0.6 M.

La molaridad se define por la siguiente ecuacion:

M = Molaridad = moles de soluto

litros de disolucion

Una disolucion 1.46 molar de glucosa, escrita como 1.46 M contiene I .46 moles de

soluto de glucosa en un litro de la disolucion, una disolucion de 500 ml que contiene

0.730 moles de glucosa tambien tiene una concentracion de 1.46 M. La unidad de

molaridad es moles por litro, por lo que una disolucion de 500 ml que contiene 0.730 moles de glucosa equivale a 1.46 mollLo 1.46 M.

La disoluciones son las mezclas homogeneas de dos o mas sustancias, la sustancia

presente en mayor cantidad suele recibir el nombre de disolvente y a la de menor

cantidad se le llama soluto y es la sustancia disuelta. El soluto puede ser un gas, un

liquido o un solido y el disolvente puede ser tambien un gas, un liquido o un solido. El

agua con gases un ejemplo de un gas (dioxido de carbono) disuelto en un liquido (agua). Existen distintas formas de expresar la concentracion de una disolucion, per0 las dos mas utilizadas son: gramos por litro (gll) y molaridad (M). Los gramos por litro indican la

masa de soluto expresada en gramos, contenida en un determinado volumen de

disolucion, expresado en litros. Asi, una disolucion de cloruro de sodio con una

concentracion de 40 g/l contiene 40 g de cloruro de sodio en un litro de disolucion.

3.1.2.- Funcion de 10s crioprotectores

Estos compuestos muy hidrofilos (en general polialcoholes) tienen la capacidad de

penetrar facilmente en la celula por simple difusion (osmosis), sus moleculas retrasan la

formacion de cristales de hielo por el descenso del punto de congelacion. Por otra parte,

limitan 10s efectos de la solucion, eliminando una parte del agua intracelular por

elevacion de la presion osmotica extracelular.

En 1973 se dio a conocer la primera gestacion en bovinos producida con un embrion

congelado/descongelado. Desde entonces se han publicado miles de articulos sobre

experimentos que tratan diferentes aspectos de la criobiologia embrionaria, que han

conducido, no solo a una mejora sustancial de 10s procedimientos para la congelacion

embrionaria, sin0 aun mejor entendimiento de 10s fundamentos de la respuesta de 10s

embriones a 10s procesos de congelacion y descongelacion de embriones.

La criopreservacion y el almacenamiento de embriones a bajas temperaturas (nitrogen0

liquido) presentan numerosas ventajas, tanto desde el punto de vista biologico como

desde el comercial.

TERM0 DE NITR~GENO LIQUID0 PARA CONGELAMIENTO

YALMACENAMIENTO DE EMBRIONES.

Permite una reduccion de costos derivados de la aplicacion de las tecnologias

reproductivas.

Facilita una disociacion de todas estas tecnicas de la actividad reproductiva ciclica

que presentan las especies mamiferas de interes, consiguiendose una

independencia temporal del estado fisiologico de 10s animales (hembras

receptoras).

Elimina las patologias que normalmente se asocian a1 mantenimiento de animales

vivos.

Posibilita la conservacion de razas o especies en riesgo de extincion mediante la

creacion de bancos de embriones congelados, manteniendo intact0 el patrimonio

genetico.

La criopreservacion esta influida por un elevado nljmero de variables, de forma que

ninguna aproximacion que contemple solo uno o parte de 10s aspectos implicados

garantiza una eficacia total. A pesar de esto y con independencia del sistema utilizado, 10s

principios basicos persiguen una proteccion de las celulas frente a 10s principales efectos

perjudiciales del proceso, como la formacion de hielo intracelular, deshidratacion y efectos

toxicos de 10s crioprotectores.

3.1.3.- Velocidad de enfriamiento.

El agua atraviesa con facilidad las membranas para diluir las soluciones, per0 usualmente

es mas dificil que las sales atraviesen las membranas. El medio usado para la estancia de

10s embriones tiene una concentracion de sales de 270 a 320 mOsmIkg y la mayoria es

cloruro de sodio. A esta concentracion, las sales fuera de las celulas balancean a las

proteinas del interior, que son demasiado grandes para pasar por las membranas

semipermeables. De igual manera, las moleculas grandes de algunos aditivos

crioprotectores, incluyendo 10s azljcares, son incapaces de atravesar las membranas

celulares.

L),wio ce1111il tl111.111te el C O I I ~ J ~ ~ ~ I I I I I ~ I I ~ I ~

A

L .-.:A f , 8 % , ,a:.,

muy lenta dpilma : muy r5plda

+ Velociclacl cle e~rfrin~niemto

CURVAS DE SOBREVIVENCIA DE C~LULAS SEGUN LA VELOCIDAD DE CONGELACI~N.

Si el enfriamiento es demasiado rapido, el agua intracelular no puede salir en cantidad

suficiente, formandose en medida considerable cristales de hielo en el interior de las

celulas, cristales que aumentaran de tamaAo, durante la congelacion y la descongelacion,

con perjuicio de las estructuras celulares. Si por el contrario, el enfriamiento es muy lento, la

deshidratacion progresiva de las celulas determina una elevacion sensible de la

concentracion de electrolitos en el medio celular, modificando sus propiedades fisico-

quimicas (efecto de solucion) fenomeno que comporta la perdida de viabilidad de las

celulas.

3.1.4.- Clasificacion de 10s crioprotectores.

Los crioprotectores se clasifican en penetrantes y no penetrantes, dentro de 10s

compuestos penetrantes se encuentra el glicerol, dimetilsulfoxido (DMSO), propilenglicol,

polivinilpirrolidona, etanol, etilenglicol y otros alcoholes. En 10s no penetrantes se

encuentran la sacarosa, g lucosa, trialosa y rafinosa.

Penetrantes.

Protegen a las celulas de 10s efectos dariinos de la alta concentracion de soluto producido

en el medio exterior durante la congelacion. La cinetica de entrada y salida de estos

crioprotectores esta caracterizado por algunos factores como cociente de permeabilidad,

cociente de temperatura y cociente de reflexion.

Durante la adicion de un crioprotector penetrante las celulas se reducen transitoriamente

hasta un nivel que depende de 10s factores antes mencionados, ademas de la velocidad de

adicion. Si el crioprotector es eliminado despues de la descongelacion por dilucion, las

celulas se hidratan transitoriamente hasta un nivel que depende de la velocidad de dilucion.

La adicion al crioprotector consiste en pasar el embrion por diferentes concentraciones

crecientes de esta sustancia, partiendo de la solucion buferada fosfatada (PBS) hasta una

concentracion final del crioconservador de I .4 M mas PBS (Solano, 1988). El glicerol a 1.4

M permite obtener un elevado porcentaje de viabilidad cuando 10s embriones son

congelados a una velocidad de 0.3"Cl minuto hasta -30 o -35°C; sin embargo, tiene la

desventaja que al exponer el embrion a la solucion de glicerol para que este penetre y

tambien despues de la descongelacion para su elimination, se necesita varios pases que

consume mucho tiempo.

En un principio se empleaban 4 pases incrementando la concentracion del crioprotector, con intervalos de 10 minutos cada uno, este metodo era tan prolongado que afectaba la viabilidad de 10s embriones debido a la constante manipulacion. Posteriormente se

redujeron a 3 pases, hasta que en 1982 se demostro que 10s embriones pueden ser congelados en un solo pase al crioprotector.

Algunos estudios han descrito ventajas de 10s glicoles en la crioconservacion de

embriones porque sus moleculas son mucho mas permeables. Se utilizan de forma

exitosa, tambien en soluciones vitrificantes, debido a que su peso molecular es menor

que el del glicerol, propilenglicol y DMSO. De esta forma, la suficiente penetracion del

etilenglicol en el embrion tiene el lugar en corto tiempo y es eliminado rapidamente

durante la dilucion, resultando en una disminucion de la toxicidad embrionaria.

No penetrantes.

Son agentes que mantienen una presion osmotica alta en el medio extracelular durante

la eliminacion del crioprotector. Esto evita 10s choques osmoticos debido a la difusion del

glicerol hacia fuera despues de la descongelacion. Si se aiiade sacarosa a la solucion de

glicerol, despues de equilibrados 10s embriones, el tamatio de 10s mismos se reduce en

un 30 a 4O0/0 en comparacion con 10s equilibrados solo en glicerol.

Cuando se descongelan embriones en presencia de sacarosa, se limita el movimiento

del agua a traves de las membranas y asi se evita la lisis de las celulas embrionarias

durante la eliminacion del glicerol. Este beneficio de la sacarosa se debe a sus

propiedades osmoticas, estando involucrado tambien el transporte activo de iones a

traves de la membrana. Este proceso es controlado por el sistema Na+ y K ATPasa, el

cual es inhibido en presencia del glicerol. Si esto se aplica a embriones bovinos, la utilizacion de sacarosa en el medio de congelacion que contiene glicerol, permite restaurar el equilibrio quimico durante la congelacion.

Actualmente hay una mayor tendencia hacia la combinacion de 10s crioprotectores

penetrantes con 10s no penetrantes, brindando la oportunidad de congelar 10s embriones

en la misma explotacion ganadera y dejarlos a la disposicion del tecnico quienes pueden

transferirlos a las vacas en el momento apropiado.

3.1 5.- Funcion del glicerol

En general el glicerol, en la congelacion de embriones continua siendo el patron de

comparacion para cualquier agente crioprotector (Elsden et a/., 1986; Nljriez y Solano,

1996). Se dice que el glicerol actlja mediante un mecanismo de tamponamiento salino

(Lovelock, 1953). El glicerol se une con el agua y disminuye acentuadamente el punto de

congelacion de las soluciones, se forma en su presencia menos hielo a cualquier

temperatura dada (Stein, 1962; Farrant, 1964). En consecuencia, la concentracion de

solutos en el liquido residual se reduce correspondientemente. La influencia perjudicial de

10s solutos concentrados parece depender de la temperatura de aqui que el glicerol, al

reducir la temperatura al que se obtienen tales concentraciones de soluto, disminuye sus

efectos perjudiciales. Con base a esto, el nivel optimo de glicerol de un diluyente aumenta

conforme incrementa la tonicidad del mismo.

GLICOLES PARA LA CRlOPRESERVACldN (GLICEROL)

3.1 -6.- Funcion del etilenglicol

En algunos trabajos han descrito ventajas de 10s glicoles en la criopreservacion de

embriones porque sus moleculas son mucho mas permeables. Se utilizan de forma

exitosa tambien en soluciones vitrificantes, debido a que su peso molecular es menor que

el del glicerol, propilenglicol y DMSO. De esta forma el etilenglicol es sumamente

permeable en corto tiempo y es eliminado rapidamente durante la dilucion, resultando en

una disminucion de la toxicidad embrionaria.

GLICOLES PARA LA CRIOPRESERVACI~N (ETILENGLICOL)

3.1.7.- Congelacion de embriones con glicerol

En la actualidad existen diferentes maquinas congeladoras de embriones. Las de tipo manual o de campo y automaticas programadas para la congelacion. Tambien se

disponen de cuatro procedimientos de congelacion: 1) metodo convencional de

congelacion lenta y controlada, 2) congelacion ultrarrapida, 3) congelacion a un paso y 4) vitrification.

La congeladora de tip0 manual denominada Peter Elsden, consiste en un barril de acero donde se colocan las pajillas que contienen 10s embriones, conectado a un termocoplex

para el control de la temperatura. El embrion evaluado y lavado se pasa a una solucion que contiene PBS + alblimina serica bovina (ASB) + 10% glicerol (1.4 M), mientras tanto se

rotulan las pajillas francesas de 0.25 ml con 10s datos de la donadora y el semental, con la

ayuda de una jeringa de 1 ml se acopla a la pajilla francesa se succionan tres o cuatro

columnas de medio separadas por burbuja de aire, de manera que el embrion quede colocado en la ultima columna, inmediatamente se coloca en la congeladora de embriones

a temperatura de 0°C , se baja gradualmente 1°C por minuto hasta 10s -7°C donde se

efectua la cristalizacion, que consiste en inducir la formacion de cristales en el medio

interior de la pajilla. Esto se realiza facilmente tocando la pajilla con una pinza enfriada en

nitrogen0 liquid0 en la columna donde se encuentra el embrion. La formacion progresiva

de cristales de hielo en el medio que rodea a 10s embriones produce un aumento de la concentracion de 10s electrolitos en la fraccion todavia liquida de la solucion. A

consecuencia del aumento de la presion osmotica se produce la salida por difusion de una parte del agua intracelular y el embrion comienza a deshidratarse. Despues de la cristalizacion, el embrion permanece 10 minutos a -7 "C. A partir de esta temperatura el

enfriamiento se producira a un ritmo de 0.5 "Clminuto hasta 10s -30" C, llegando a esta

1 34

temperatura las pajillas con 10s embriones se sumer'gen directamente en el nitrogeno liquido.

TECNICA DE CONGELAMIENTO (PETER ELSDEN)

En otros estudios N~li iez y Solano (1996) mencionan que una vez colocados 10s embriones en las pajillas en un equipo programable que alcanza una temperatura de -5 a

-7 "C a una velocidad de 1 a 5"CIminuto. En este equipo se induce la formacion de

cristales de hielo en la parte superior de la pajilla durante 5 minutos, posteriormente la

temperatura es descendida a 0.3"CIminuto hasta -30°C o -35°C temperatura a la que se

sumergen las pajillas en nitrogeno liquido para su almacenamiento

Algodon + Polivinilico Aire Aire

, I I *

A

Sello Glicerol Glicerol

+ Embrion

LLENADO DE PAJILLA FRANCESAS DE 0.25 ML CON EL SlSTEMA DE GLICEROL

CUADRO 2. EMBRIONES CONGELADOS CON EL SISTEMA DE GLICEROL (ADAPTACI~N DE PETER ELSDEN, 1977).

3.1.8.- Congelacion de embriones con etilenglicol

I "C x I min. 4

1 "C x 2 min?

i , lnmediato 4

En la ultima decada del siglo XX se hizo una importante innovacion con base al

descubrimiento de que se puede congelar embriones con ciertos aditivos crioprotectores

que no necesitan extraerse al descongelamiento y permiten la transferencia directa del

embrion a la vaca receptora. El metodo utilizando es conocido como transferencia

directa, iniciado porvoelkel y Hu, 1992, haciendo que la transferencia sea muy parecida a

la inseminacion artificial.

La transferencia directa de embriones es el resultado de un avance tecnologico en la criopreservacion, que permite que la transferencia de un embrion sea como una inseminacion artificial. Esto es posible porque el agente crioprotector que se usa en 10s

embriones de transferencia directa permite que el embrion sea rehidratado dentro de la

receptora eliminando asi la necesidad del microscopio y el embriologo que se usan cuando se descongelan embriones congelados de manera tradicional.

Observaciones realizadas por varios investigadores sugieren que la permeabilidad de 10s embriones ovinos y bovinos (estadios de morulas y blastocistos) al etilenglicol y a1

0°C

-7°C

-32°C

-1960C

Se colocan las pajillas en la congeladora a 0°C

Se inicia el connelado gradual 1°C x minu

- Cristalizacion (Seeding) durante 10 minutos

Se continira el congelado gradual con escala 1 "C x 2 minutos hasta -32°C

Termina el congelado gradual

Se sumerge la pajilla a nitrogen0 liquid0 en forma inmediata a -1 96°C

propilenglicol es mayor que la permeabilidad al glicerol. Otros han referido metodos de

transferencia directa que utilizan como crioprotectores al glicerol, propilenglicol y el

etilenglicol mezclados o no con sacarosa.

Massip y Zwalmen (1 984) quienes trabajaron con glicerol 1.5 M y sacarosa 0.25 M como crioprotectores utilizando el procedimiento de un paso y transfiriendo directamente 10s

embriones en el ljtero a la receptora. Suzuki et a/. (1990) quienes utilizaron propilenglicol

1.6 M lo cual que permite que el embrion se rehidrate directamente en el medio materno,

encontrandose resultados satisfactorios de porcentajes de prefiez. No obstante, Cseh et a/. (1994) sugieren que la transferencia directa de embriones con el uso de sacarosa en la

pajilla puede ser aplicada en la practica con buenos resultados especialmente para

transferir embriones de baja calidad.

Los embriones se exponen a una solucion de etilenglicol al 1.5 M por 5 minutos a

temperatura ambiente (25 a 30°C), para estabilizarlos y se envasan en pajillas francesas

de 0.25 ml de la siguiente manera: se realizan 3 columnas de medio de mantenimiento

(PBS + 10% de ASB) de 2.5 cm cada uno, mas una columna de etilenglicol.de 2 cm donde

se coloca el embrion, las columnas van separados con espacios de aire. lnmediatamente

se coloca la pajilla francesa con el embrion en la congeladora manual a - 6"C, donde se

esperan 5 minutos para realizar la cristalizacion donde el embrion permanece 10 minutos a

esa temperatura, para luego realizar el enfriamiento a un ritmo de 0.5"C por minuto hasta

10s -32°C. Al alcanzar esta temperatura se sumerge la pajilla directamente en el nitrogen0

liquido a -1 96OC

Sol. Hartmann Sol. Hartmann

Etilenglicol + Embridn

LLENADO DE PAJlLLA FRANCESAS DE 0.25 ML CON EL METODO DE ETlLENGLlCOL

CUADRO 3. CONGELACION DE EMBRIONES BOVINOS CON EL METODO DE

ETILENGLICOL

an las F

?pose, c ultima

despue! pajilla

3.1.9.- Descongelacion de embriones con glicerol

- 6°C S ngeladora a

- Se deja

hat

Durante el proceso de congelamiento de 10s embriones a -1 96°C se forma inevitablemente

una cierta cantidad de hielo en las celulas. Para evitar un aumento destructivo del tamaAo de 10s pequefios cristales por aglomeraci6n durante la descongelacion, el proceso de recalentamiento debe ser tambien lo mas rapido posible (del orden de 2000°C/minuto).

Las pajillas extraidas del nitrogeno liquido se descongelan en agua de baAo maria a 37°C

durante 15 a 20 segundos.

lnmediatamente despues de la descongelacion es indispensable eliminar el crioprotector

para la supervivencia del embrion. No obstante, las celulas que presentan una

conservacion elevada de crioprotectores no deben ser colocadas directamente en un

medio isotonico. En tal caso, las diferencias de presion osmotica provocaria una entrada

Cristalizacion (Seeding) durante 10 minutos

Se continlia el congelado gradual con escala 1°C x 2 minutos hasta -32°C

Termina' el congelado gradual

Se sumerge la pajilla a nitrogeno liquido en forma inmediata a -1 96°C

-7°C

I "C x 2 min. 4

-

-32°C P

lnmediato

-1 96°C

demasiada rapida de agua en la celula con el riesgo de reventar. Es necesario proceder a

la eliminacion progresiva del crioprotector, de manera que 10s flujos de salida de

crioprotector y de entrada de agua Sean compatibles con la permeabilidad de la membrana

plasmatica.

La eliminacion del crioprotector por efecto de la sacarosa es por principio acelerar el flujo

de salida de este. La sacarosa de peso molecular elevado no penetra en la celula por simple difusion. Su presencia en el medio crea un aumento de la presion osmotica del

medio extracelular, favoreciendo la difusion masiva del crioprotector en el cornpartimiento

celular.

Pozo 2 I

I Sacarosa + I

I 50% Medio de .r I Transferencia ?

I

Pozo 3 Pozo 4 Medio de Se sube el

Transferencia embrion en la _. . I , Z 1 !

E L ~ M ~ N A C ~ ~ N DEL GLICEROL E H ~ D R A T A C ~ ~ N DEL E M B R ~ ~ N UTlLlZANDO LA CAJA MULTIWELDISCH.

El glicerol puede ser removido de varias formas:

1). Pasar al embrion por cuatro soluciones permitiendo una estancia de 5 minutos por

solution. a) PBS mas 10% de suero fetal bovino (SFB), con 6% de glicerol, mas 10% de sacarosa

(0.3 M).

b) PBS mas 10% SFB, con 3% de glicerol mas 10% de sacarosa (0.3 M).

c) PBS mas 10% SFB, con 0% de glicerol mas 10% de sacarosa (0.3 M).

d) PBS mas 10% SFB, sin glicerol sin sacarosa.

2). Eliminacion del crioprotector en forma inversa, se pasan 10s embriones por bafios de

concentracion decreciente, ejemplo: etilenglicol 1.5 M, despues 1.0 M, 0.5 M y por ultimo I;,

0 M. La duracion de cada baiio es de 5 a 10 minutos.

3). Retiro del crioprotector en tres pasos, por el metodo decreciente utilizando glicerol: 1.4 M, 0.93 M y 0.45 MI posteriormente medios para hidratar y transferir el embrion PBS

+ 10% SFB.

4). Saito (1994) recomienda una combinacion de 10% de sacarosa (0.3 M) con solucion

de PBS mas 20% de caseina serica bovina (CSB), con reposo de 5 a 10 minutos cada

paso. Este mismo autor realiza un proceso decreciente para esto utiliza glicerol: 10,

6.6 y 3.3% con un reposo de 5 minutos en cada paso, en el ljltimo paso PBS + 20% CSB

con un reposo de 10 minutos.

5). Concentraciones decrecientes de sacarosa: 10% de sacarosa + PBS con un reposo

de 10 minutos, 5% de sacarosa + PBS + 10% SFB con reposo de 5 minutos, 2.5% de sacarosa + PBS + 10 % SFB 5 minutos y el ultimo paso PBS + 10% SFB, quedando listo

para realizar la transferencia. Tambien hace referencia del retiro del crioprotector de un

paso utilizando soluciones de sacarosa al 10% durante 5 minutos, luego se hidrata en

PBS + 10% SFB y se trasfiere el embrion a la receptora.

Aire Aire

Medio de Embrion + Medio de Tran sferencia Medio de Transferencia

Transferencia

LLENADO DE PAJILLA FRANCESA DE 0.25 MLPARA REALIZAR LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES.

3.1 .lo.- Descongelacion de embriones con etilenglicol

En 1972, 10s cientificos descubrieron un nuevo crioprotector, el etilenglicol al 1.5 M, este

tiene una gran ventaja sobre el glicerol y es el de ser sumamente permeable. Una de las

mayores ventajas de 10s embriones congelados con etilenglicol es el de poder ser

transferidos de manera directa al utero de las receptoras, sin la necesidad de utilizar

diluyentes ni el microscopio para observar 10s embriones.

Esto representa por si misma una ventaja para la industria ganadera. Los veterinarios,

tecnicos inseminadores con experiencia son ahora candidatos para transferir embriones

en forma directa al ser estos congelados con etilenglicol. Las receptoras seran animales

sincronizados o buen trasferidos despues de la presentacion natural del estro. Todo esto

considerado dentro de la industria ganadera da un nuevo mercado para la transferencia

embrionaria representa un gran avance para el mundo cientifico en beneficio de la

ganaderia.

El protocolo para descongelar y transferir embriones de transferencia directa es el

siguiente:

La receptora debe haber sido detectada en estro siete dias antes de la

transferencia.

Debe existir un buen cuerpo luteo funcional.

Aplicar anestesia por via epidural de 4 a 6 ml de lidocaina al 2% a la altura de la

ultima vertebra sacra y la primera coccigea alrededor del cordon medular. ldentificar el embrion leyendo el rotulado en la parte superior. Sacar la pajilla del

termo de nitrogen0 Iiquido y mantenerlo al aire por 12 segundos. Sumergir la pajilla en agua a 35°C por 20 segundos.

Sacar la pajilla del agua, secarlo con servilleta, realizar el corte en la parte donde

fue sellada hermeticamente a calor o alcohol polivinilico. Colocar la pajilla en el aplicador de transferencia de embriones.

Montar la funda azul sobre la pistola, apretar firmemente para asegurarse que la

pajilla este bien colocada, usar el anillo de plastic0 para fijar la funda sobre la

pistola.

Pistola yfunda se protege dentro de la camisa sanitaria.

Una vez que la pistola este cargada, debe mantenerse en posicion horizontal. Esto

hace que el embrion se quede en el centro de la columna de liquido. Para transferir el embrion pasar la pistola suavemente por el cervix hasta el cuerno

uterino correspondiente a lado del ovario que contiene el cuerpo lirteo. El embrion se coloca a 10s 13 a 18 cm dentro del cuerno uterino. Si esto no fuera

posible, depositar el embrion lo mas profundo posibleen el cuerno.

3.1 .I1 .- Preparacion de medios

Durante la tecnica de coleccion de embriones se utilizan dos tipos de medios que son el

medio de coleccion y el medio de mantenimiento y de transferencia de embriones. El medio de coleccion es adicionado con 1% de suero sanguineo o proteina serica con la finalidad de lograr un siliconizado evitando con ello que 10s embriones se adhieran al

material con que entran en contact0 durante su coleccion, debido a la presencia de

macromoleculas como es la albljmina serica bovina.

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Para el medio de mantenimiento se adiciona el 10% de suero sanguineo o proteina serica

para dotarlo de algunos factores nutricionales, ademas de evitar con ello que 10s

embriones floten o se adhieran, pueden emplearse suero fetal bovino, suero de oveja

menor de un atio, suero de becerro recien nacido, suero de novillo de 185 a 205 dias de

edad o bien alblimina serica bovina. Si el suero se obtiene de animales sanos y procesado

en forma adecuada 10s resultados seran sirnilares con cualquiera de ellos siempre y

cuando Sean tratados con calor (56OC130 minutos) para termoinactivar o destruir el

complemento, de no ser asi daiiaria a 10s embriones ya que es embriotoxico, ademas se

debe esterilizar porfiltracion con poros de 0.45 micras.

Actualmente la tecnica. mas usada en bovinos en la coleccion no quirurgica

(transcervical). Esta consiste en la lavar varias veces el cuerno uterino con el medio de

coleccion. Esto se consigue introduciendo el cateter de Foley a traves del cervix hasta la

curvatura mayor del cuerno, lugar donde se fija inflando el globo del cateter, el cual se une

a la manguera tygon. Por un lado de la bifurcacion entra el medio al utero, cada vez que se

llena este se le da un masaje, posteriormente se extrae el medio el cual sale hacia el filtro

colector de embriones. Una vez lavado un cuerno, se saca el cateter y se repite la

operacion en el cuerno opuesto. El momento indicado para realizar la coleccion es entre

el dia 6.5 a 7 de iniciado el estro debido al tipo de estructuras que se encuentran en estos

dias considerando de que 10s embriones pasan del oviduct0 al cuerno uterino en el cuarto

o quinto dia. Despues de la coleccion embrionaria las donadoras reciben una inyeccion de

prostaglandinas F2 a (25 mg de Dinoprost trometamina) con el objeto de inducir la

regresion de 10s cuerpos Iuteos, evitar una posible gestacion, incluso multiple y acortar el

period0 entre colecciones.

LAVADO DE LAS VACAS DONADORAS Y DE COLECCI~N DE EMBRIONES.

4.1 .- Evaluacion Embrionaria

Los embriones se clasifican de acuerdo con dos criterios: gradode desarrollo y calida

La Sociedad lnternacional de Transferencia de Embriones (IETS), han designado un

numero progresivo para 10s diferentes estadios de desarrollo y para la calidad del embrion,

EVALUACI~N DE EMBRlONARlA (LABORATORIO DE B~OTECNOLOG~A

Y MEJORAMIENTO GEN~TICO ANlMAL - FMVZ- UNACH)

CUADRO 4. CRlTERlOS DE CLASIFICACION PARA EMBRIONES BOVINOS

bridn

Grado de desarrollo

6vu10

2 a 16 blastomeros

Morula temprana

Morula compacta

Blastocito temprano

Blastocito maduro

Blastocito expandido

Blastocito en eclosion

Embrion eclosionado

Clave

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Edad del I No. de celulas

2 - 4 dias

5 dias

6 dias

7 dias

7 dias

8 dias

9 dias

-

2-16

> 16

32 - 64

160

180

200

> 200

4.1.1 .- Embriones transferibles

Con base a sus caracteristicas morfologicas, cada embrion recibe una clasificacion por su

edad y calidad.

a) Morula compacta. Debido a la compactacion, las uniones de 10s blastomeros han formado una masa celular, de manera que ya no se aprecian 10s blastomeros individuates. El embrion ocupa del60 al70% del espacio perivitelino.

MORULA COMPACTA

b) Blastocito temprano. En la masa celular aparece una pequeiia cavidad llena de

liquid0 llamado blastocele. Aqui las celulas empiezan a diferenciarse. El embrion ocupa

del 70 al 8O0/0 del espacio perivitelino. La diferencia visual entre el trofoblasto y la masa

celular es apreciable.

BLASTOCITO TEMPRANO

E5

c) Blastocito maduro. Se observa las celulas del tabique embrionario (disco embrionario), que originan al embrion y a las celulas del trofoblasto. El embrion tiene apariencia de anillo

y ocupa el 90% del espacio perivitelino.

BLASTOCITO MADURO

d) Blastocito expandido. El diametro del embrion aumenta 1.2 a 1.5 veces y la zona

pelucida sufre un adelgazamiento. Estos embriones con frecuencia se colapsan sin que

se aprecie el blastocele; sin embargo, la zona pelucida permanece adelgazada.

BLASTOClTO EXPANDIDO

e) Blastocito en eclosion. El embrion tiene fisurada la zona pelljcida por donde eclosiona

paulatinamente hasta salir totalmente de ella, el embrion puede tener ya sea la forma

esferica de un blastocito expandido o bien estar colapsado.

BLASTOClTO EN ECLOSI~N

CUADRO 5.- CLASIFICACI~N DE LOS EMBRIONES DE ACUERDO A SU MORFOLOG~AY CALIDAD

4.1.2.- Lavado de 10s embriones.

Calidad del embrion

Excelente

Bueno

Pobre o regular

No transferible

Despues de evaluados 10s embriones se procede a lavarlos, lo cual consiste en 10 pases

sucesivos en medio de mantenimiento esteril, procurando tomar a 10s embriones en la

pipeta con la menor cantidad de medio de un paso al siguiente y cambiando la pipeta en

cada paso. Esto permite eliminar posibles contaminantes (impurezas, celulas, sangre,

bacterias o virus) y ofrece la garantia de poder ofrecer un embrion sano. Algunos paises

exigen este tip0 de lavados por la importacion de embriones, incluso hasta la utilizacion

de tripsina.

4.1.3.- Transferencia de embriones.

Clave ' Morfologia

El punto de evaluation de la transferencia de embriones es la formacion de un cuerpo

lllteo (CL) funcional. La aparente ausencia del CL puede significar que la receptora

estuvo en estro, per0 no existio ovulation y si ocurrio per0 el CLfracaso en su formacion

o se form6 per0 no fue detecfado. Sin embargo, las receptoras que califican en todas

estas categorias pueden ser presentadas para ser transferidas.

1

2

3

4

Esferico, simetrico, celulas uniformes, buen

color

lmperfecciones ligeras, blastomeros extruidos,

vesiculas.

Alteraciones mas severas, vesiculas, celulas

degeneradas.

Alteraciones graves, signos de degeneracion,

vesiculas.

TRANSFERENCIA DE EMBRIONES POR VIA TRANSCERVICAL

El metodo de transferencia de embriones no quirurgica es un procedimiento rapido y

relativamente barato. Es el metodo de mayor eleccion en gran parte de 10s programas de

TE en explotaciones comerciales. La evolution mas reciente en relacion a la TE, es el

almacenar embriones en pajillas congeladas con etilenglicol, que permite su transferencia

en forma directa despues del descongelamiento, haciendo este metodo como si fuera una

inseminacion artificial y es cada vez mas atractivo para 10s tecnicos y 10s productores

pecuarios. El factor determinante sobre la actividad de este metodo, es la destreza y

experiencia del profesional para determinar el sitio de la colocacion del embrion dentro del

cuerno uterino, como tambien el grado de lesion implicado durante la transferencia de

embriones.

4.1.4.- Biparticion de embriones.

La habilidad de producir muchas copias a partir de un solo individuo es algo que interesa a

10s productores pecuarios, porque constituye una poderosa herramienta de seleccion y

propagacion. Si se logran producir grandes cantidades de individuos geneticamente

identicos, se podrian usar como base en la produccion de carne, leche y en la seleccion

fenotipica que puede permitir un rapido cambio en caracteristicas especificas y muy

seleccionadas. Esta tecnologia combinada con la fertilizacion in vitro podria utilizarse para

producir grandes cantidades de embriones de alta calidad que despues serian congelados

o transplantados.

4.1 5.- Micromanipulador.

La biseccion de embriones es un procedimiento que da como resultado la produccion de

gemelos identicos al dividir el embrion usando tecnicas de microcirugia. El metodo mas

sencillo y eficiente para producir gemelos identicos es obtener embriones de 6 a 7 dias de

edad, cortarlos por la mitad y transplantar las dos mitades a igual nljmero de receptoras.

4.1.6.- Division artificial de 10s embriones.

En trabajos realizados por Leibo (1986) y Takeda (1 986) las tasas de pretiez obtenidas con

la transferencia de hemiembriones son muy variables con una media que varia de un 45 a

50 %. Asu vez la ausencia de la zona pelljcida en 10s miembros no afecta a 10s porcentajes

de pretiez para embriones transferidos frescos.

DlVlSl6N DE LOS EMBRIONES

En referencia a 10s embriones divididos, cuando son transferidos, 10s porcentajes de

preAez dependen de la calidad de 10s embriones con 10s resultados que van desde un

76,2% de fetos para mitades de calidad muy buena, hasta un 24,7% para aquellas de

calidad regular, lo cual sugiere la necesidad de destinar a la micromanipulacion solo

aquellos embriones de excelente y buena calidad. La selecci6n de 10s embriones provoca

una perdida celular embrionaria de aproximadamente lo%, que posiblemente

compromete la viabilidad de 10s embriones de calidad inferior. La tasa de preiiez obtenida

con la transferencia de hemiembriones son muy variables con una media que varia entre

50 y 60%. A su vez, la ausencia de la zona pelucida en 10s hemiembriones no afecta 10s

porcentajes de preiiez para embriones transferidos frescos.

M~CROMANIPULACI~N DE LOS EMBRIONES.

La division de embriones ha sido utilizada en diversos proyectos con la finalidad de

incrementar la eficiencia de programas de transferencia de embriones. La tecnica permite

incrementar el numero de crias obtenido por donadoras y generar pares de gemelos

identicos. El impact0 potencial de la tecnica en programas de mejoramiento genetic0 en

diversas especies de interes zootecnico ha sido ampliamente demostrado en diversos

paises del mundo. Asi mismo, diversos investigadores han reconocido 10s beneficios de

generar pares e gemelos identicos en la realizacion de investigaciones en ciencia animal.

4.1.7.-Ventajas de la bipartition de embriones

Actualmente 10s embriones bovinos son micromanipulados con el fin de obtener algunas

celulas y proceder a la identificacion del sex0 previo a su transferencia o para ser divididos

en dos partes iguales (hemiembriones) y producir mellizos identicos, lo que permite la

disponibilidad de animales identicos en 10s programas de transferencia embrionaria.

Con referencia a aquellos embriones que son destinados a la identificacion del sexo, 10s

blastomeros son abordados penetrando la zona pelucida y aspirando de 4 a 6 celulas o

cortando la zona y 10s blastomeros con una navaja. En trabajos realizados con embriones

sexados y transferidos frescos, la tasa de prefiez fue de alrededor de 45%, observandose

ademas que de 10s resultados dependieron de la calidad del embrion.

4.1.8.- Mellizos

El tener mellizos es el resultado inevitable de produccion en ganado lechero y algo

indeseable en la ganaderia lechera puesto que reduce la rentabilidad total y la eficiencia

reproductiva. Los mellizos reducen el resultado reproductivo al aumentar 10s dias abiertos

y servicios por concepcion durante la subsiguiente lactancia.

Las vacas que tienen mellizos presentan altos riesgos de nacer muertos, tendencia a

retencion placentaria, metritis y desplazamiento de abomaso. Las incidencias de aborto van desde un 12% vs. 29 %, la mortalidad neonatal de terneros 3.0 % vs. 15 %, teniendo un

bajo peso al nacer de 31 vs. 41 kg.; retencion placentaria que varia de 7 % vs. 34 %.

4.1.9.- Mecanismo de Gemelacion

El ganado es una especie monotoca, lo que significa que una preriez resulta en el nacimiento de un solo ternero. El mecanismo fisiologico responsable de regular el nllmero

de foliculos que se hacen dominantes dentro de cada curva folicular usualmente resulta

en la seleccion de un solo foliculo dominante capaz de ovular.

Sin embargo, se seleccionan dos foliculos para que continOen con su crecimiento entre el grupo de foliculos en crecimiento en cada curva folicular lo que resulta en un fenomeno que se denomina codominancia, cuando el estimulo se presenta en la ovulation ya sea en la forma natural o inducida, 10s foliculos codominantes, liberan dos oocitos uno de cada

7 foliculo. Si posteriormente son fertilizados por un esperma reciben el nombre de cigoto.

52

Por lo tanto 10s resultados de la ovulacion y fertilizacion de 10s dos oocitos se llaman mellizos dicigotos.

GEMELOS POR BIPARTICI~N DE EMBRIONES

La mayoria de 10s mellizos en el ganado son de tipo dicigoto. Los mellizos son dicigotos

pueden ser del mismo sex0 u opuesto y no son parecidos geneticamente ni

fenotipicamente que a 10s hijos nacidos de 10s mismos padres durante gestaciones

diferentes. Los mellizos que resulten de la ovulacion y fertilizacion de un solo oocito

reciben el nombre de mellizos monocigotos, el mecanismo por el cual ocurre la gemelacion

monocigota puede ser considerado una clonacion natural del cigoto original en vivo.

4.1 .lo.- Tasas de gemelacion en ganado lechero

Los factores de riesgo para la gemelacion en ganado incluyen efectos del tipo de raza

lecheras, el porcentaje de gemelos nacidos tambien varia entre las estaciones del at70 con

una tendencia hacia mas nacimientos de mellizos durante 10s meses de verano, este

efecto de las estaciones en la gemelacion ha sido atribuida a un increment0 en el plan de

nutricion durante el otofio cuando las vacas en paricion durante el verano habrian

concebido, un descenso del period0 de luz, y un descenso en la viabilidad de 10s embriones en fases tempranas concebidos durante 10s meses de verano comparados con 10s

concebidos durante 10s meses mas frios del otot7o. La alta produccion acumulativa de

leche y la gemelacion previa son factores adicionales que aumentan el riesgo de este.

En general la tasa de gemelacion para la mayoria de ganado de carne es menor de l l %. El efecto de paridad en la tasa de gemelacion no se extiende con claridad per0 se puede explicar por una habilidad incrementada devacas mayores para soportar gemelos durante la gestacion, un aumento en la tasa de doble ovulacion o una interaccion de ambos factores. Ademas, la incidencia de la doble ovulacion en las vacas lecheras en lactancia es de aproximadamente el 14 %. Tambien se sugiere que el proporcionar dietas de mayor energia metabolizable a las vacas de alta produccion puede incrementar la incidencia de doble ovulacion y por lo tanto la tasa de gemelacion. Este efecto nutricional es similar a la

Las tasas generales de gemelacion reportadas para vacas lecheras en estudios recientes

son (3%) mayores que las reportadas en muchos reportes previos, indicando que la tasa

de gemelacion puede estar aumentando en el tiempo en la poblacion de ganado lechero

como un todo. Si la gemelacion se relaciona con la nutricion ylo produccion de leche, este

aumento en gemelacion no seria inesperado considerando las tendencias recientes en

las practicas de alimentacion y 10s incrementos anuales en la produccion de leche por

vaca.

NAClMlENTO GEMELAR

4.1 .I1 .- Freemartinismo

El freemartinismo en vaquillas resulta de la gemelacion cuando las membranas

embrionicas de 10s fetos masculine y femenino se fusionan durante la gestacion lo que

causa un intercambio de sangre entre 10s fetos macho y hembra, 10s factores endocrinos o

las celulas del ternero macho causan un desarrollo anormal de 10s organos reproductivos

de la ternera hembra que causa infertilidad. El freemartinismo se presenta en

aproximadamente el 92 % de las vaquillas nacidas como resultado de preAez gemelar

heterosexual. Por lo tanto, aproximadamente 8 % de las vaquillas de prefiez gemelar

heterosexual sera fertil presumiblemente porque las membranas fetales no se fusionaron

o porque la fusion de la membrana se present6 despues del period0 critic0 de la

diferenciacion sexual (organos reproductores). El desarrollo temprano de anormalidades

del tracto reproductor femenino que resulta en freemartinismo se presenta entre los dias

49 a 52 posfertilizacion.

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Transferencia de Embriones en El Ganado Bovino

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