Transaminacion Informe Final

11
5/16/2018 TransaminacionInformeFinal-slidepdf.com http://slidepdf.com/reader/full/transaminacion-informe-final 1/11  TRANSAMINACIÓN Baltazar González Chávez (1025715), Kimberly Navarro Vélez (1025088), Jezir Valencia Gómez (1023851) Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Universidad del Valle, Cali – Colombia - 2011 RESUMEN La transaminación es una de las reacciones más importantes del catabolismo y de la biosíntesis de los aminoácidos, en donde el grupo amino de un aminoácido es transferido a la enzima, produciendo el correspondiente a-ceto ácido y la enzima aminada y finalmente el grupo amino es transferido al a-ceto ácido aceptor (ej. Alfa-cetoglutarato) formando el producto aminoácido ( ej. Glutamato) y regenerando la enzima. En la práctica se quiso colocar en prueba la reacción de transaminacion, usando como sustratos alanina- α-cetoglutarato y a partir de la preparación de un extracto enzimático de corazón de res, la formación de los productos piruvato y glutamato; para lograr la máxima eficacia de la actividad enzimática, se le brindo a la enzima todas las condiciones necesarias para que funcionara y diera los productos esperados comprobando por medio de cromatografía de papel que la enzima era la alanina aminotransferasa por el desplazamiento de los aminoácidos al ser revelado con ninhidrina. Se observó una transaminación efectiva por parte de la alanina aminotransferasa presente en el extracto enzimático, esto se evidencia con la cromatografía de papel. Concluyendo a partir de los resultados que la enzima efectivamente convierte un a-cetoácido en un aminoácido en presencia de otro (a.g. Alanina- a-cetoglutarato Piruvato – Glutamato). Palabras Claves: Transaminación, Alanina Aminotransferasa, Fosfato de piridoxal, Cromatografía, Metabolismo. INTRODUCCIÓN: El catabolismo de los aminoácidos ocurre de manera diferente en plantas y animales. En las plantas, la capacidad de fijar el nitrógeno atmosférico hace posible la síntesis de aminoácidos, y ante una alta concentración de estos, el almacenaje en proteínas de reserva, que de acuerdo a las necesidades metabólicas de la planta se usaran o acumularan más; sin embargo, en los animales tales macromoléculas de reserva no

Transcript of Transaminacion Informe Final

Page 1: Transaminacion Informe Final

5/16/2018 Transaminacion Informe Final - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/transaminacion-informe-final 1/11

 

TRANSAMINACIÓN

Baltazar González Chávez (1025715), Kimberly Navarro Vélez (1025088), JezirValencia Gómez (1023851)

Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Universidad delValle, Cali – Colombia - 2011

RESUMENLa transaminación es una de las reacciones más importantes del catabolismo y de labiosíntesis de los aminoácidos, en donde el grupo amino de un aminoácido estransferido a la enzima, produciendo el correspondiente a-ceto ácido y la enzima aminaday finalmente el grupo amino es transferido al a-ceto ácido aceptor (ej. Alfa-cetoglutarato)formando el producto aminoácido (ej. Glutamato) y regenerando la enzima. En la prácticase quiso colocar en prueba la reacción de transaminacion, usando como sustratosalanina-α-cetoglutarato y a partir de la preparación de un extracto enzimático de corazónde res, la formación de los productos piruvato y glutamato; para lograr la máximaeficacia de la actividad enzimática, se le brindo a la enzima todas las condiciones

necesarias para que funcionara y diera los productos esperados comprobando por mediode cromatografía de papel que la enzima era la alanina aminotransferasa por eldesplazamiento de los aminoácidos al ser revelado con ninhidrina. Se observó unatransaminación efectiva por parte de la alanina aminotransferasa presente en el extractoenzimático, esto se evidencia con la cromatografía de papel. Concluyendo a partir de losresultados que la enzima efectivamente convierte un a-cetoácido en un aminoácido enpresencia de otro (a.g. Alanina- a-cetoglutarato Piruvato – Glutamato).

Palabras Claves: Transaminación, Alanina Aminotransferasa, Fosfato de piridoxal,Cromatografía, Metabolismo.

INTRODUCCIÓN:

El catabolismo de los aminoácidos ocurre de manera diferente en plantas y animales.En las plantas, la capacidad de fijar el nitrógeno atmosférico hace posible la síntesis deaminoácidos, y ante una alta concentración de estos, el almacenaje en proteínas dereserva, que de acuerdo a las necesidades metabólicas de la planta se usaran oacumularan más; sin embargo, en los animales tales macromoléculas de reserva no

Page 2: Transaminacion Informe Final

5/16/2018 Transaminacion Informe Final - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/transaminacion-informe-final 2/11

existen, de modo que continuamente se deben sintetizar o ingerir a través de la dieta enforma de proteínas (Peretó et al , 2007). Cuando los aminoácidos obtenidos ya hancumplido su objetivo en el organismo, y hay un exceso de estos, son degradados.

La degradación requiere inicialmente la eliminación del grupo α-amino; pero esta no esuna reacción fortuita, por tanto, debe realizarse mediante moléculas intermediariascomo las transaminasas, que transfieren el grupo amino al α-cetoglutarato para formarglutamato que en la mayoría de animales, será posteriormente desaminado mediante laenzima glutamato deshidrogenasa que utilizando NAD+ o NADP+ como agentesoxidantes libera amonio (NH4

+), que a través del ciclo de la urea se eliminará delorganismo (Berg et al , 2004); al extraer el grupo amino solo queda la estructuracarbonada del aminoácido inicial que consecutivamente será transformada en glucosa oen acetylCoA, que intervendrán en reacciones glucogénicas o cetogénicasrespectivamente (Peretó et al , 2007).

Las transaminasas, también denominadas amino-transferasas o enzimas anapleróticasson las encargadas de las reacciones de transaminación (anapleróticas) que fuerondescritas por primera vez por Braunstein & Kritzmann en 1938 que a su vezdeterminaron su carácter reversible. Todas las aminotransferasas contienen unacoenzima de gran versatilidad, denominada fosfato de piridoxal (PLP por sus siglas eningles); esta coenzima se enlaza a la enzima y al sustrato formando una base de Schiff.Este enlace es posible gracias al grupo aldehído que presenta, el cual acepta el grupoα-amino de los aminoácidos y se convierte en fosfato de piridoxamina (PMP) quetransferirá el grupo amino a un 2-oxoácido y con esto se regenerará el PLP y se

producirá un nuevo aminoácido (Nelson & Cox, 2005).

Esta práctica de laboratorio tuvo como principal finalidad la demostración cualitativa dela transaminación entre alanina (Ala, A) y glutamato (GLU, Q) así como la identificacióndel ácido acético como inhibidor de la reacción y la comprensión de la importanciametabólica de este proceso.

METODOLOGÍA

Se siguió el procedimiento mencionado en la guía de laboratorio de Biología Celular yBioquímica II. Observada en el anexo 1.

RESULTADOS

El corazón de res del cual se dispuso fue licuado y posteriormente llevado acentrifugación. El líquido resultante tenía una textura espesa y de color rojizo salmón.

Page 3: Transaminacion Informe Final

5/16/2018 Transaminacion Informe Final - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/transaminacion-informe-final 3/11

 (a) (b)

Figura 1.Observacion del licuado y trasvaso de la preparación enzimática cruda. (a)Seobserva la coloración rojo-salmón del preparado mientras se trasvasa en un tubo de

centrifuga de 50 mL, (b) Medición del peso del tubo para centrifugación.

Luego de haber pesado los tubos de centrífuga con su respectivo licuado de corazón deres se procedió a centrifugar los tubos a 3000 rpm durante 15 minutos. Pasado estetiempo, la sustancia de los tubos se estratificó en dos fases lo cual se puede observaren la Figura 2, una fase superior acuosa (sobrenadante) que contenía el extractoenzimático crudo y una inferior (precipitado). El extracto enzimático fue decantado enun tubo de ensayo y los sedimentos desechados.

.Figura 2. Resultado obtenido luego de centrifugar el licuado de corazón. Se observa lasdos fases resultantes de la centrifugación del licuado de corazón de res, arriba la fase

líquida que corresponde al extracto enzimático crudo, y abajo el sobrante que fuedesechado.

Al realizar el punto 2 de los métodos, los tubos 1 y 2 presentaron unas particulas decolor café claro flotando, a diferencia del tubo 3 que se mostró hialino (ver figura 3). Acontinuación se muestra el sobrenadante y el resultado de los tubos 1, 2 y 3, del punto2 de la guÍa.

Page 4: Transaminacion Informe Final

5/16/2018 Transaminacion Informe Final - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/transaminacion-informe-final 4/11

 (a) (b)

Figura 3. (a) Aspecto del tubo 1 luego del baño en ebullición, antes de la filtración, quemuestra sedimentos café claro (b) Apariencia del tubo 2 (izquierda) que presenta

partículas de coloración café claro, el tubo 3 (derecha) es incoloro y sin partículassuspendidas.

Al haber terminado los puntos 1 y 2 de la guía de métodos se procedió a realizar lacromatografía que duró 41:54 (min) los resultados obtenidos se pueden apreciar en laFigura 4, donde en la primera columna (izquierda a derecha), correspondiente alfiltrado libre de proteínas del tubo 1, se observó una mancha oscura superior y otra muyleve por debajo de la primera, en la columna 2 (filtrado libre de proteínas del tubo 2) seobservan dos manchas oscuras, en la columna 3 (Blanco) se observa una únicamancha superior y por último, en la columna 4 (sustancia patrón) se observan dosmanchas.

Figura 4. Cromatografía de los tubos 1, 2 y 3 con un patrón para comparación. Seobserva las manchas correspondientes a la cromatografía, 1, 2, 3 y P corresponden a

tubo 1, tubo 2, tubo 3 y Patrón respectivamente.

Page 5: Transaminacion Informe Final

5/16/2018 Transaminacion Informe Final - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/transaminacion-informe-final 5/11

Posterior a esto se realizaron los cálculos del Rf (Formula I) de las manchas de los tubos 2 yPatrón para comparar, la Tabla 1 ilustra los datos recogidos.

  Formula I 

Tabla 1. Valores de los Rf obtenidos a partir de la cromatografía. La distancia recorridapor el solvente fue de 8.1 cm.

# TuboDistancia

Recorrida Ala(cm)

DistanciaRecorridaGlu (cm)

Rf Ala Rf Glu

Tubo 2 3,3 1,1 0,407 0,135Patrón 2,4 1,5 0,419 0,185

DISCUSIÓN

Para la práctica de transaminación, se preparó un extracto enzimático a partir decorazón de res. Inicialmente el corazón fue partido en pequeños trozos y se procedió arealizar el licuado agregando amortiguador de fosfatos que es de gran importancia yaque mantiene un pH estable para las proteínas globulares que son muy sensibles a loscambios brucos de pH. Posteriormente la mezcla homogenizada se centrifugó durante15 minutos para obtener el extracto enzimático crudo (sobrenadante) y se descartaron

los sedimentos celulares. Se prepararon 3 tubos de acuerdo a la metodología ( anexo1). En el tubo 1 se quiso inhibir la función enzimática de modo que se evitase laformación de piruvato y glutamato, para ello antes de agregar el extracto enzimático, secolocó el tubo en un baño de agua en ebullición durante 3 minutos, donde latemperatura modificó la estructura tridimensional de la enzima y junto con la adición deácido acético que modifica el pH de la solución, y cambia la estructura de la proteína aldesprotonar el grupo R de la cadena lateral, se logra una desnaturalización de laenzima y al ocurrirle esto, no se puede llevar a cabo la catálisis enzimática. (Badui1999). Para el tubo No.2, se quería hacer que el extracto enzimático que contenía laenzima especifica de transaminacion, funcionara correctamente; para ello se le brindó

los sustratos (alanina-α-cetoglutarato) y temperatura adecuada (37ºC) sabiendo que lasenzimas son extremadamente selectivas y solo funcionaría la que cataliza la producciónde piruvato y glutamato, conocida como alanina aminotransferasa o transaminasaglutamicopirúvica (GPT) (Bergmeyer & Horder, 1980). Después de 30 minutos deposible acción enzimática durante la incubación a 37ᵒC, al igual que en el tubo 1 seinhibe la acción enzimática mediante la adición de acido acético y la exposición a unbaño en ebullición durante 3 minutos. Esto hace que las proteínas precipiten y puedan

Page 6: Transaminacion Informe Final

5/16/2018 Transaminacion Informe Final - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/transaminacion-informe-final 6/11

ser filtradas quedando solo una solución libre de proteínas y posibles productos por laacción de la enzima.

Por otra parte el tubo No. 3 fue tomado como blanco; pues éste fue sometido a las

mismas condiciones que el tubo No. 2, pero sin contener el extracto enzimático, y envez de este 1 mL de agua destilada, y aunque tenía los mismos sustratos que los otrosdos tubos y también se obtuvo una solución libre de proteínas, el comportamiento fuediferente.

Posteriormente se realizó una cromatografía como método para determinarcualitativamente la presencia de Acido Glutámico (Glu, E) como producto de la reacciónentre el ácido α-cetoglutarato y la Alanina. Específicamente, se realizó unacromatografía de reparto en capa fina (TLC “Thin-Layer chromatography”) la cualconsiste a groso modo en la distribución de los solutos (aminoácidos) sobre la fase

estática de acuerdo a la afinidad con la fase móvil (Smith & Feinberg , 1966); para estapráctica, la fase estática fue papel Whatman que está hecho a base de celulosa; ycomo fase móvil se usó etanol, agua y amoniaco (80:10:10 respectivamente); tambiénse utilizaron las sustancias citadas en la metodología (Anexo 1), realizando tresaplicaciones por cada punto para tener una concentración de aminoácidos adecuada, yse realizó el revelado con ninhidrina al 0,2% en acetona; que debido a su fuerte poderoxidante decarboxila y desamina al aminoácido, esta ninhidrina reducida reacciona conotra molécula de ninhidrina no reducida y con el amoniaco resultante de ladesaminación formando un complejo violeta (Teijón,2005). En la Figura 4, las manchascorrespondientes a la sustancia patrón indican la presencia de dos aminoácidos

diferentes. La Alanina, un aminoácido no polar (hidrofóbico), esta característica leconfiere una muy poca afinidad por el solvente de la cromatografía, lo que provoca unlargo recorrido en el cromatograma (Smith & Feinberg, 1966); de modo que, la marcasuperior corresponde a este aminoácido. Por deducción, la marca inferiorcorrespondería al Ácido Glutámico, sin embargo esta afirmación se apoya en el hechode que este aminoácido es polar y debido a su gran afinidad con el solvente, recorrerápoca distancia y tendrá un Rf menor que el de la alanina, estos valores se confirman enla Tabla 1. En todas las columnas del cromatograma se pudo observar una manchasuperior a la misma altura de la mancha de Alanina de la columna 4(P), de modo que

las manchas de las columnas 1, 2 y 3 corresponden a la porción de Alanina que no fuetransaminada. La columna 1 que contenía el filtrado libre de proteínas con control atiempo 0, presentó una ligera mancha inferior que demuestra la formación de una levetransaminación; aunque se intento detener a tiempo 0 la reacción mediante la adiciónde ácido acético, se llevó a cabo; lo que nos dice que esta reacción tiende a suceder demanera espontánea; pues es una de las reacciones más comunes de un organismovivo. En la columna 2 que corresponde al filtrado libre de proteínas sin inhibicióninmediata, se observó una mancha inferior de coloración púrpura oscura que tiene un

Page 7: Transaminacion Informe Final

5/16/2018 Transaminacion Informe Final - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/transaminacion-informe-final 7/11

Rf cercano al del Ácido Glutámico obtenido en la columna 4(P) (Tabla 1); por tanto, sepuede afirmar que hubo una transaminación entre la Alanina y el Ác.  Α-cetoglutárico,por medio de la alanina aminotransferasa, cuyo producto observado fue el ÁcidoGlutámico. En la columna 3 se aplicó una preparación sin extracto enzimático, lo cual

claramente se comprueba al observar en la Figura 4 la ausencia de una manchapúrpura inferior y por ende la no realización de una transaminación.

La reacción de Alanina + Ácido α-cetoglutárico no solo tiene como producto el ÁcidoGlutámico, sino también, Piruvato (Anexo 2). Este último no tuvo comprobación en lapráctica de laboratorio, sin embargo, para detectar el Ácido Pirúvico existen variaspruebas; las más utilizadas son la prueba del Nitroprusiato de Sodio y la prueba del 2,4Dinitrofenilhidracina, que dan positivo al reaccionar con el carbonilo 7 etonico delpiruvato mostrando un anillo verde o azul y una coloración café-rojiza oscurarespectivamente. Estas pruebas requieren que la preparación se encuentre a un pH

ligeramente alcalino de 7.4, pues a este pH se inactiva la enzima piruvatodescarboxilasa (Lozano & Campos, 2007 ) y se evita la formación oxalacetato, unintermediario implicado en la gluconeogenesis.

El proceso de la transaminación es un proceso llevado a cabo por el metabolismo, másespecíficamente por el catabolismo del nitrógeno (de los aminoácidos).Este se da en elcitosol de algunas células en algunas regiones de los animales, es llevado acabo parala síntesis de aminoácidos a partir de otros aminoácidos o de proteínas. Se basa en eltransporte del grupo amino de un aminoácido a un α-cetoácido, así el aminoácido departida se transforma en un α-cetoácido y el α-cetoácido de partida en un aminoácido.

Esto se puede demostrar mediante la aparición de Glutamato a partir del α-cetoglutarato presente en el sustrato ofrecido a la enzima transaminasa, para este casola alanina aminotransferasa, que transporta mediante el piridoxal fosfato (derivado de lavitamina B6) que se encuentra en el sitio activo de la enzima (Muñoz y García. 1997), elgrupo amino de la alanina a el α-cetoglutarato. Esta enzima es abundante en el hígado,corazón y músculo (Fuentes, 2003) por esto se utilizó el corazón de res. En algunasenfermedades a estos órganos, los procesos patológicos crean injuria tisular yliberación de estas enzimas al plasma, aumentando la concentración de las mismas,siendo utilizado esta medición de concentración de la enzima como indicador para

diagnóstico y pronostico.Además de que la transaminación se da para la obtención de distintos aminoácidos,con unas excepciones como lo son lisina, prolina, hidrixiprolina y treonina, ocurretambién como participante en los procesos de la obtención de energía, el ciclo deKrebs. Un ejemplo de esto es la valina, la cual al ser metabolizada da α-cetoisovalerato, este a continuación es rápidamente convertido en succinil-CoA yutilizado en el ciclo de Krebs, sin posibilidad de volver a transaminarse.

Page 8: Transaminacion Informe Final

5/16/2018 Transaminacion Informe Final - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/transaminacion-informe-final 8/11

En conclusión, la transaminación es una de las reacciones celulares más importantes ycomúnmente realizadas en organismos animales, ya que a través de ella se puedenoriginar aminoácidos de los cuales haya deficiencia en el organismo y sean requeridosen alguna ruta metabólica; sin embargo, para que haya un proceso de transaminación

efectivo, es necesario que el medio cumpla con la temperatura y acidez apropiadas a laenzima catalizadora. Además, como se observó en la práctica, la cromatografía es unexcelente método para detectar una transaminación positiva.

BIBLIOGRAFIA

Badui S. 1999. Quimica de los Alimentos. 3 ed. 5 reimpresión. EditorialAlhambra Mexicana. México. 

Berg J., Tymoczko J., Stryer L. Biochemistry. Sexta edición. Estados Unidos. W.H. Freeman and Company. 2004. Páginas: 656 – 661 Bergmeyer, H.U., and Horder, M. IFCC Methods for the Measurement of Catalytic

Concentration of Enzymes, Part 3 IFCC Method For Alanine Aminotransferase, J.Clin. Chem. Clin. Biochem. 18, 521

Fuentes X. 2003. Codex de Ciencias de Laboratorio Clínico. Elsevier España. pp740

Lozano A., Campos A., Guía No5: Reconocimiento de aldehídos y cetonas. Guíade Laboratorio de Química Orgánica. Bogotá, Colombia. Universidad JorgeTadeo Lozano. 2007. Páginas : 3-6

Nelson D. and Cox M., Lehninger Principles of biochemistry Quinta edición.Madrid. W.H and Co, 2005. Páginas:

Peretó J., Sendra R., Pamblanco M., Bañó, C. Fundamentos de Bioquímica.Primera edición. España. Universidad de Valencia, 2007. Paginas: 249, 296-297

Teijón J.M., Garrido A. Fundamentos de bioquímica structural. Primera edición.Argentina. Grupo editor Alfaomega, 2005. Páginas 67-68

Smith I., Feinberg J. Paper and thin layer chromatography and electrophoresis.En Journal of Chromatography. [En línea], 1966, Volumen 23, Pagina 185.[Citado Octubre 1 de 2011]. En línea: http://www.sciencedirect.com.bd.univalle.edu.co/science/article/pii/S0021967301986728

Page 9: Transaminacion Informe Final

5/16/2018 Transaminacion Informe Final - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/transaminacion-informe-final 9/11

Anexos

Anexo 1: Guía de laboratorio de biología celular y bioquímica II, práctica número2, transaminación

 

Page 10: Transaminacion Informe Final

5/16/2018 Transaminacion Informe Final - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/transaminacion-informe-final 10/11

 

Page 11: Transaminacion Informe Final

5/16/2018 Transaminacion Informe Final - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/transaminacion-informe-final 11/11

Anexo 2. Reacción de la Alanina transaminasa como catalizador de la reacción entrealanina y ácido α-cetoglutárico produciendo Piruvato y Acido glutámico.

Alanina