TRABAJO PRÁCTICO N 2: TÉCNICAS DE...
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TRABAJO PRÁCTICO N° 2: TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y
CULTIVO DE MICROORGANISMOS
Objetivos:
-Conocer las metodologías actuales de control y eliminación demicroorganismos.
-Obtener dominio de los métodos básicos de esterilización y desinfección.
-Conocer los medios de cultivo más utilizados en el laboratorio y lasdiferentes metodologías para el cultivo de microorganismos.
-Adquirir habilidades y/o destrezas para la siembra y cultivo demicroorganismos de interés agropecuario.
-Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto a fin defomentar una eficiente labor grupal.
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CULTIVO DE MICROORGANISMOS
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Definición: mezcla balanceada de los requerimientosnutritivos que tienen los microorganismos aconcentraciones tales que permiten el buencrecimiento de los mismos.
Composición química: base mineral, fuente decarbono, fuente de energía, fuente de nitrógeno yfactores de crecimiento si son necesarios.
Medios de cultivo
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• Líquido (caldo)
• Semisólido (0,2 % agar)
• Sólido (1- 2 % agar) Por el estado físico:
• Sintético o químicamente definido
• Complejo o químicamente indefinido
Por su composición química:
• Generales
• Selectivos o inhibitorios
• Diferenciales
Por su uso en el laboratorio (función):
Clasificación de los medios de cultivos
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Medio general Medios diferenciales y selectivos
Ejemplos de tipos de medios de cultivos
Medio líquido Medio sólido Medio semisólido
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FUENTE COMPUESTO CANTIDAD
Fuente de
C y
energíaSucrosa 20 g
Base
mineral
Fosfato di potásico 0,05 g
Fosfato
monopotásico
0,15 g
Cloruro de calcio 0,01 g
Sulfato de
magnesio
0,2 g
Molibdato de sodio 0,002 g
Cloruro férrico 0,01 g
Carbonato de
calcio
0,1 g
Agua Agua destilada 1000 mL
pH = 7
FUENTE COMPUESTO CANTIDAD
Fuente de C
y energía
Almidón 12 g
Fuente de N NaNO3 0,5 g
Base
mineral
K2HPO4 1,0 g
MgSO4 7 H2O 0,5 g
Agente
solidificante
Agar 15 g
Agua Agua destilada 1000 mL
pH = 7
Medio selectivo: Fijadores de NitrógenoMedio general
Medios de cultivo: composición
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encendercolocar recipiente
para pesartarar
colocar el componente a pesarregistrar la lectura
Preparación de un medio de cultivo:1. pesar los componentes sólidos
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componentes sólidos agregar agua destilada
Preparación de un medio de cultivo:2. hidratar
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soluciones reguladoras encendido y lavado lectura
lavado del electrodoprotección del electrodo
Preparación de un medio de cultivo :3. Regular pH
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agregar agar fundir al calormedio líquido
medio agarizado
Preparación de un medio decultivo sólido: clarificación
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Preparación de un medio de cultivo:Fraccionar en tubos, acondicionar y esterilizar
Fraccionamiento y acondicionamiento
Esterilización en autoclave
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Medios de cultivo estériles
Medio líquido Medio sólido en
caja de petri
Tubo pico de
flauta
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ESTERILIZACIÓN
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Esterilización es el proceso por el cual se destruyen o remueven las células vivas, esporas de hongos,
endosporas bacterianas, virus y viroides mediante el uso de agentes físicos o químicos.
Desinfección es un proceso que destruye o inhibe solo los microorganismos más sensibles.
Esterilización y desinfección
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Métodos de esterilización más comunes:
• Calor húmedo
• Calor seco
• Filtración
• Radiaciones
Métodos físicos
• Sustancias líquidas y gaseosasMétodos químicos
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Métodos físicos: Calor húmedo
• Vapor de agua a presiones superiores a la atmosférica
• Vapor de agua a presión atmosférica
Calor húmedo
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Vapor de agua a presiones superiores a la atmosférica
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Vapor de agua a presiones superiores a la atmosférica
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Vapor de agua a presión atmosférica (Tindalización)
Funcionamiento:
Consiste en exponer el material aesterilizar, a los vapores del agua enebullición. Este proceso se puede llevar alcabo en el autoclave dejando la válvula deescape abierta (espita).
Combinación temperatura-tiempo:
80-90ºC / 30 minutos durante tres díasconsecutivos. Se incuba a 37ºC durante 24hs entre cada calentamiento.
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Métodos físicos: Calor seco
• Hornos o estufas de esterilización
• Flameado
• Calor al rojoCalor seco
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Hornos o estufas de esterilización
Combinación temperatura-tiempo:
160ºC / 2 horas o 180 ºC / 1 hora
Características:
Recipiente rectangular, de doble pared,entre las cuales puede haber aireestático u otro material aislante como lalana de vidrio.
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Hornos o estufas de esterilización
Material que se puede esterilizar:
Cajas de petri, pinzas, material deporcelana, material de vidrio resistente alcalor, etc.
Funcionamiento:
Convección. La acción letal es resultadodel calor conducido por el material quetoma contacto con los microorganismos.
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Flameado
Consiste en sumergir en alcohol el material a esterilizar(puntas de bisturís, varillas de vidrio, espátulas de vidrio,cucharas, etc.) y luego pasarlo por la llama de mecheros.
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Calor al rojo
Consiste en colocar materiales metálicos sobre la llama deun mechero hasta que alcancen color rojo vivo. Se utilizapara esterilizar instrumental metálico (puntas de ansas,agujas, pinzas, etc.).
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Métodos físicos: Filtración
logra en base al pequeño tamaño de los
poros del filtro y en parte a la adsorción de
las paredes del poro debido a la carga
eléctrica del mismo y de losmicroorganismos.
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Métodos físicos: Radiación
- Porción UV del espectro (200 y 300 nm).
- Se utilizan lámparas de vapor de mercurio.
- Radiaciones con escasa capacidad para poder penetrar
los materiales.
- Mecanismo de esterilización: formación de dímeros de
timina, causando alteraciones importantes en la transcripción
y replicación del ADN.
- Rayos gamma: radiaciones emitidas por isótopos
radiactivos, como el cobalto (60Co) o el Cesio (137Cs), ambos
productos colaterales de la fisión nuclear.
- Mecanismo de esterilización mediante acción letal contra los
microorganismos al alterar el ADN.
- Se utiliza para esterilizar y descontaminar materiales de uso
médico y de la industria alimentaria.
Radiaciones no ionizantes Radiaciones ionizantes
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Métodos químicos
• Modo de acción: a) lesión de la membrana celular (detergentes), b) desnaturalización de proteínas (alcohol), c) modificación de grupos funcionales de las proteínas (agua oxigenada) y / o daño en los ácidos nucleicos, entre otros.
Productos químicos
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Cada grupo de alumnos deberá realizar las siguientes
actividades:
1. Preparación de medios de cultivo generales
- preparar 50 mL de medio de cultivo sólido general (agar
nutritivo) y 25 mL de medio de cultivo general líquido (caldo
nutritivo).
- fraccionar el medio de cultivo sólido: 15 mL de medio en cada
tubo de ensayo (para cajas de petri) y 5 mL en cada tubo de
ensayo (para tubos pico de flauta).
- rotular
- acondicionar para esterilizar
- esterilizar
Trabajo de Laboratorio:
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2. Preparación de cajas de petri y picos de flauta
- Colocar el medio de cultivo sólido preparado en cajas de petri
y colocar los tubos para pico de flauta inclinados sobre la
mesada hasta su solidificación.
3. Siembra de microorganismos del suelo
Trabajando en condiciones de asepsia:
- colocar un gramo de suelo (utilizando el suelo oreado y
tamizado en el práctico anterior) en 25 mL de medio de cultivo
líquido general (preparado en el práctico) y en 25 mL de medio
diferencial líquido (para fijadores de nitrógeno) provisto por el
profesor.
- rotular
- Incubar a 28-30°C.
Trabajo de Laboratorio:
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3. Actividad extra para trabajar en el Práctico Nº 3
Utilizando el suelo oreado y tamizado en el práctico anterior
realizar la siguiente actividad:
- Colocar la muestra de suelo en un vaso de plástico.
- Regar al 60% de la capacidad de campo (es el contenido de
agua o humedad que es capaz de retener el suelo luego de
saturación).
- Colocar dos portaobjetos dentro del vaso, dejando dos
centímetros libres (sin enterrar) por encima de la muestra de
suelo y con una separación de 3 centímetros entre ellos.
- Cerrar el vaso con polietileno (lo más herméticamente
posible) para evitar la pérdida de humedad.
- Incubar a 28-30ºC.
Trabajo de Laboratorio: