INTRODUCCIN

En la actualidad, la crianza de perros es una aficin de distribucin mundial; consecuentemente, la conservacin de semen y la inseminacin artificial se han constituido en temas de alta relevancia en la actividad mdico veterinaria. Si bien la inseminacin artificial en las especies de inters zootcnico representa una tcnica fundamental para la mejora gentica, en la especie canina presenta, adems, aplicaciones clnicas para solucionar problemas de apareamiento; por lo que la adecuada preservacin, con la consiguiente posibilidad de transportar el semen, resultan de gran utilidad en la prctica de la medicina veterinaria orientada hacia el rea de reproduccin canina (Linde-Forsberg, 2006).

La preservacin de semen canino se ha constituido en una actividad importante para los veterinarios. En las razas caninas la criopreservacin de semen es utilizada bsicamente para optimizar la accesibilidad de semen a largo plazo (Dennis y Milanes, 1999), inseminacin artificial y el almacenamiento de muestras seminales de perros de alto valor gentico (Olaya, et al, 2003).

Uno de los componentes que juega un papel determinante en el xito de la congelacin de espermatozoides es el crioprotector, ya que este es esencial para la supervivencia del espermatozoide durante el proceso de congelacin y descongelacin (Linde-Forsberg, ob cit). Ellos pueden tener una accin extracelular (azcares como la lactosa, protenas y polivinyl pirrolidona) o intracelular (glicerol, DMSO y metanol) (Silva et al., 2006). En la actualidad, el glicerol es el crioprotector que se usa con mayor frecuencia para congelar semen en caninos.

Existen una gran variedad de pruebas de laboratorio que han sido desarrolladas para evaluar la calidad del semen (integridad espermtica y capacidad fecundante) usado para IA, y predecir as la capacidad fecundante del mismo. El uso de estas pruebas en forma combinada puede aumentar la exactitud en la estimacin de la uncin espermtica. Por tal motivo es de gran inters, para estimar los daos ocurridos con la criopreservacin y evaluar aquellos espermatozoides cuya capacidad fecundante se mantenga y de esta forma garantizar la fecundacin del oocito.

CAPITULO I

EL PROBLEMA

Planteamiento del problema

En la actualidad el campo de la biotecnologa ha obtenido un incremento importante a nivel mundial, en la cual, diversas ramas se han orientado a la conservacin de gametos caninos genticamente valiosos, convirtindose esta prctica en la piedra angular de este campo (Gobello y Olivera, 2005). Por esta razn, investigadores y mdicos veterinarios se han enfocado en la seleccin de ejemplares con excelentes caractersticas fenotpicas, y han dirigido sus acciones al uso de tcnicas especiales para garantizar la perpetuacin de caracteres valiosos en la progenie de los individuos. En tal sentido, la inseminacin artificial con semen criopreservado constituye una de las actividades que ha presentado un notable crecimiento en las ltimas dos dcadas y actualmente se han desarrollado diversos protocolos con la finalidad de lograr la congelacin y uso de dilutores del material seminal (Bohrquez et al, 2005).

La conservacin de los espermatozoides y de su capacidad fecundante exige la reduccin o interrupcin del metabolismo celular. Este objetivo se consigue por medio de la refrigeracin, o de la congelacin, utilizando temperaturas reducidas que depriman el metabolismo. La refrigeracin permite mantener la longevidad y la capacidad fecundante de los espermatozoides por algunos das, sin que su metabolismo sea completamente abolido (Maxweell y Stojanov, 1996).

Linde-Forsberg y Forsberg (1989) mencionan que a diferencia de la refrigeracin, el uso de semen congelado permite preservar el material gentico por tiempo indefinido, permitiendo que propietarios y mdicos veterinarios tengan la posibilidad de envo a largas distancias del material seminal, con un costo reducido y por perodos largos de conservacin, evitndose las dificultades inherentes al transporte de los animales o de mltiples envos de semen refrigerado. Adems, en pases con leyes de cuarentena, esta opcin les permite obtener material gentico proveniente de los mejores ejemplares a nivel mundial facilitando la reproduccin.

Si bien es cierto que la congelacin provee muchas ventajas en la reproduccin, este procedimiento de criopreservacin induce una serie de efectos de estrs osmtico sobre las clulas espermticas, afectando su longevidad y capacidad fecundante, la cual se manifiesta en la disminucin en las tasas de preez (Linde-Forsberg y Forsberg, 1993). Generalmente, los espermatozoides se exponen a un medio hiperosmtico lo que genera cambios morfolgicos en ellos. Este efecto genera contraccin celular inicial, la cual puede revertirse al aadir criopotectores que ingresan o recubren las clulas favoreciendo la proteccin de las mismas (Soares, et al. 2002). Estos solutos protegen la clula contra el enfriamiento extremo, algunos tienen la capacidad de penetrar la clula y su citotoxicidad depende directamente de la temperatura y el tiempo de exposicin de los espermatozoides a ellos (Silva, et al. 2006).

A pesar de que los crioprotectores proveen proteccin celular, estas sustancias y sumado a los severos cambios trmicos y osmticos propios de la tcnica de congelacin, pueden tener otros efectos adversos sobre los espermatozoides, como las alteraciones en el ADN, la actividad mitocondrial, el rompimiento de membranas por la peroxidacin de los lpidos; en los acrosomas por daos como la edematizacin, la distribucin no uniforme de su contenido y la vesiculacin de la membrana externa acrosomal. Dichas alteraciones han sido directamente relacionadas con la reduccin en la capacidad fecundante del semen canino criopreservado, principalmente cuando involucran daos de la estructura y funcin de la membrana plasmtica (Restrepo, et al. 2009).

Watson (1995) observ que la supervivencia post-descongelacin se encontraba limitada al 50% de la poblacin inicialmente viable, incluso en la presencia de las mejores tcnicas de preservacin. De ah la necesidad de desarrollar tcnicas de criopreservacin ms eficaces y de mejores metodologas sistemticas para evaluar el semen criopreservado, tomando en cuenta el uso de diferentes composiciones de diluyentes con molculas distintas, concentracin y naturaleza de los crioprotectores empleados (Restrepo, et al. 2009).

Cabe destacar que los procesos de refrigeracin, congelacin y descongelacin resultan un desafo para los espermatozoides, los cuales deben sobrevivir a los cambios de temperatura ocurridos en estas fases tanto por encima como por debajo de los 0C (Linde-Forsberg, 2006). Dichos mtodos de conservacin inducen fases de transicin lipdica en la membrana plasmtica del espermatozoide, causando alteraciones en su estabilidad y estructura que pueden lesionar a la clula y disminuir su capacidad fecundante (Concannon y Battista, 1989).

La refrigeracin y la congelacin inducen una reduccin en la proporcin de clulas que se no se capacitaran una vez que lleguen al oviducto, pues solo en ese lugar deben capacitarse y, pese a que sea preservada su viabilidad y motilidad, se trata de una poblacin que est desestabilizada por el proceso de preservacin y que in vivo puede perder su capacidad fecundante antes de alcanzar el lugar de fecundacin (Rota, et al, 1999).

Actualmente, se emplean diversas tcnicas para evaluar y predecir la capacidad fecundante del semen canino, mediante la determinacin de variables espermticas como: la integridad de la membrana plasmtica, integridad del acrosoma, la morfologa y motilidad de los espermatozoides, siendo estas variables las utilizadas para establecer los efectos de la criopreservacin sobre el eyaculado canino (Eilts, 2005). Adems, existen pruebas in vitro para determinar la capacidad del espermatozoide para realizar el proceso de capacitacin, de tal modo que luego se pueda efectuar la fecundacin.

En consecuencia, con este trabajo se evaluara la calidad seminal a travs de las tcnicas convencionales y pruebas especiales antes del proceso de congelacin as como evaluar el efecto que ejerce la misma sobre la calidad espermtica cuando el semen es sometido a fase de descongelacin.

Objetivos

GeneralEvaluar losefectos de la criopreservacin sobre la calidad espermtica del semen canino en la raza Golden Retriever con edades comprendidas entre 2 y 4 aos.

Especficos1. Determinar las caractersticas macroscpicas (volumen, color, pH) del semen fresco en caninos de raza Golden Retriever con edades comprendidas entre 2 y 4 aos.

2. Determinar las caractersticas microscpicas (% de espermatozoides mviles, concentracin, morfologa, vitalidad e integridad acrosmica) del semen fresco, en caninos de raza Golden Retriever con edades comprendidas entre 2 y 4 aos.

3. Determinar las caractersticas microscpicas (% espermatozoides reanimables post congelacin, morfologa, vitalidad e integridad acrosmica) del semen descongelado, en caninos de raza Golden Retriever con edades comprendidas entre 2 y 4 aos.

4. Determinar la integridad de la membrana plasmtica del espermatozoide a travs de la prueba hipo-osmtica del eyaculado fresco/descongelado, en caninos de raza Golden Retriever con edades comprendidas entre 2 y 4 aos.

5. Evaluar la calidad espermtica del semen de canino fresco/descongelado, con el empleo de pruebas especiales de seleccin espermtica (swim up) en caninos de raza Golden Retriever con edades comprendidas entre 2 y 4 aos.Justificacin e importancia

El creciente inters por parte de los Mdicos Veterinarios que se desempean en el rea de la medicina de pequeos animales, especficamente en el rea de reproduccin animal, ha motivado a nivel mundial la realizacin de numerosas investigaciones para desarrollar y mejorar las tcnicas relacionadas con la inseminacin artificial, criopreservacin del semen de caninos y los efectos que produce esta tcnica sobre la capacidad fecundante del mismo. Por esta razn, la relevancia que este tema ha suscitado y su limitada aplicacin, ha generado la necesidad de creacin procedimientos de vanguardia en la reproduccin asistida para la especie canina en el rea de medicina veterinaria, la cual ha tenido un auge en los ltimos aos.

Por otro lado, en Venezuela constituye un estudio base para la elaboracin de otras investigaciones que permitirn introducir esta prctica poco conocida y poco llevada a cabo por parte de los Mdicos Veterinarios dedicados a la prctica de reproduccin en caninos y felinos.

CAPITULO II

MARCO TEORIO

Antecedentes

Dentro del campo de la reproduccin en animales domsticos, especficamente los caninos, el impacto de la bsqueda de una progenie con buen pedigree ha incrementado notablemente. Esto ha generado inters por parte de los mdicos veterinarios, quienes se han encargado de desarrollar diferentes estudios cientficos enfocados hacia la mejora de los ejemplares de diferentes razas caninas. En tal sentido, las investigaciones se orientan a la descripcin de mtodos para preservar gametos provenientes de caninos seleccionados eficientemente, una de ellas es la criopreservacin del material seminal. Por tal motivo, se mencionan a continuacin estudios relacionados con el tema del presente trabajo.

Existen pruebas especficas que determinan la calidad espermtica, una de ellas es la prueba hipo-osmtica. En relacin a ella, Snchez et al (2002), realizaron un estudio del eyaculado de 12 caninos de raza Beagle y Fox Terrier, para evaluar la integridad de la membrana espermtica de espermatozoides caninos en semen fresco y en semen congelado y descongelado, relacionando esta con algunos parmetros de evaluacin usados de rutina en el estudio de semen del perro en 20 eyaculados. Realizaron espermiograma convencional obteniendo un volumen promedio 1,9 0,9 ml (1 y 2 fracciones), 83,8% de motilidad progresiva, 92 % de espermatozoides vivos, y 83,5% de espermatozoides normales. La concentracin espermtica fue de 325 x 106 espermatozoides por ml. Para evaluar la funcionalidad de la membrana espermtica se us una solucin hipo-osmtica de 55 mOsm/l, obtenindose un 87,9 8,1% de espermatozoides con colas curvadas en el semen fresco. Se congelaron 18 eyaculados con un diluyente en base a TRIS Fructosa cido ctrico, 20% yema de huevo y 8% de glicerol, diluyendo hasta alcanzar una concentracin promedio de 150 x 106 espermatozoides por ml, el semen fue envasado y posteriormente congelado en nitrgeno lquido. La descongelacin de las pajuelas fue hecha en agua a 40C por 15 segundos, y el semen congelado/descongelado fue evaluado en base a su motilidad progresiva y respuesta a la prueba hipo-osmtica, dando como resultados 47,4 + 17,6% de motilidad y un porcentaje promedio de espermatozoides con colas curvadas de 53.7 + 13%. La correlacin obtenida para las variables de motilidad progresiva y respuesta a la prueba hipo-osmtica fue alta y significativa (p