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TRABAJO FIN DE ESTUDIOS

Evaluación del cultivo "in vitro" de variedades devid cultivadas en la DOCA Rioja

Ana Ruiz Lorente

PROYECTO FIN DE CARRERA

Tutores: María Elena Martínez Villar y Cristina Menéndez Menéndez

Curso 2011-2012

© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2012

publicaciones.unirioja.esE-mail: [email protected]

Evaluación del cultivo "in vitro" de variedades de vid cultivadas en la DOCARioja, trabajo fin de estudios

de Ana Ruiz Lorente, dirigido por María Elena Martínez Villar y Cristina MenéndezMenéndez (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una LicenciaCreative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.Permisos que vayan más allá de lo cubierto por esta licencia pueden solicitarse a los

titulares del copyright.

Evaluación del cultivo in vitro de variedades de vid cultivadas en la D.O.Ca. Rioja

ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y Jardinería 1

RESUMEN

La vid es el cultivo más extendido en el mundo y el más importante en términos

económicos. España es el país con mayor superficie dedicada al cultivo de la vid,

extendiéndose por todas las provincias españolas. En La Rioja, se registra una superficie de

cultivo de 44.230 ha. por lo que el cultivo de Vitis vinífera en la Comunidad Autónoma

de La Rioja (C.A.R) adquiere gran importancia, siendo numerosos los estudios realizados

respecto a diferentes ámbitos de las variedades admitidas en dicha comunidad. Si hay

estudios de tipo económico, fisiológico, fenológico, etc., sin embargo son escasos los

estudios relacionados con la respuesta que las diferentes variedades tienen ante su manejo

en condiciones propias del cultivo in vitro.

Por su parte, el cultivo in vitro ofrece una serie de ventajas que no están presentes en

el cultivo tradicional, citando, entre otras, la obtención de material libre de virus o

permitir la rápida propagación del material vegetal, aspecto este último muy importante en

los procesos de obtención de nuevos genotipos.

En este trabajo evalúa la respuesta de las variedades Graciano, Tempranillo Blanco,

Tempranillo y Mazuelo cultivadas en condiciones in vitro. Los resultados obtenidos

podrán utilizarse posteriormente en alguno de los objetivos concretos, reseñados

anteriormente.

Para el estudio se han utilizado explantos de yema, segmentos nodales, hojas y

pecíolos de las diferentes variedades utilizando como base el medio MS variando el

procedimiento seguido para su preparación según el tipo de explanto.

Para explantos de yema y segmentos nodales se utilizó el medio MS sin reguladores

de crecimiento. Para el caso de explantos de hoja y pecíolo al medio MS se le añadieron

concentraciones de 0; 0,5; 1; 2; 4 mg/l de BA y 0,5 mg/l de IBA.

Solo los datos obtenidos a partir de explantos de pecíolos se sometieron a trato

estadístico. Para este estudio se comparan los datos obtenidos entre variedades y entre los

protocolos de cultivo seguidos, encontrando los mejores resultados en la adicción al medio

de 1 mg/l de BA y para la variedad Tempranillo Blanco.



ÍNDICE

ABREVIACIONES Y EQUIVALENCIAS ............................................................................. 3

1. INTRODUCCIÓN................................................................................................................ 4

1.1. EL CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOS VEGETALES ........................................ 4

1.2. EVOLUCIÓN HISTÓRICA DEL CULTIVO IN VITRO ...................................... 9

1.3. EL CULTIVO DE VID EN LA RIOJA. CARACTERÍSTICAS DE LAS

VARIEDADES DE ESTUDIO ............................................................................. 11

1.4. CULTIVO IN VITRO APLICADO A Vitis vinifera L ......................................... 14

1.5. INTERÉS DEL TEMA ......................................................................................... 16

2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 17

3. MATERIALES Y MÉTODOS........................................................................................... 18

3.1. MATERIAL VEGETAL ...................................................................................... 18

3.2. MEDIOS DE CULTIVO ...................................................................................... 19

3.3. DESINFECCIÓN ................................................................................................. 24

3.4. MANEJO IN VITRO ............................................................................................ 25

3.5. CONTROL DE LA EVOLUCIÓN DE LOS EXPLANTOS ............................... 27

3.6. ESTUDIO ESTADÍSTICO .................................................................................. 27

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................ 28

4.1. ASEPSIA DEL EXPLANTO INICIAL ............................................................... 28

4.2. EVOLUCIÓN Y CRECIMIENTO DEL EXPLANTO INICIAL ........................ 33

5. CONCLUSIONES.............................................................................................................. 51

6. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................ 53

7. AGRADECIMIENTOS...................................................................................................... 57

ANEJO I: EQUIPO UTILIZADO .......................................................................................... 58

ANEJO II: IMÁGENES DE EXPLANTOS DE YEMA ....................................................... 60

ANEJO III-. IMÁGENES DE EXPLANTOS DE HOJA ...................................................... 61

ANEJO VI-. IMÁGENES DE EXPLANTOS DE PECIOLO ............................................... 65



ABREVIACIONES Y EQUIVALENCIAS

BA-Benciladenina = Bencilaminopurina

IAA- Ácido indolacético

IBA- Ácido indolbutírico

MS- Murashige and

Skoog

NAA- Ácido naftalenacético

TDZ-Thidiazuron

1mg/l BA = 1 ppm BA = 4,48 µmol BA

1 mg/l IBA = 1 ppm IBA = 50 µmol IBA



1. INTRODUCCIÓN

Los avances desarrollados en el campo de la biología experimental en los últimos

años han permitido el estudio detallado de las plantas tanto a nivel celular como molecular;

y han traído consigo que actualmente sea posible reproducir todos los factores que pueden

incidir en el crecimiento y desarrollo de las plantas, en condiciones de laboratorio.

1.1. EL CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOS VEGETALES

La expresión cultivo in vitro de plantas significa cultivar plantas dentro de un frasco

de vidrio (inicialmente se usó este material, en la actualidad es frecuente utilizar recipientes

de diversos tipos de plásticos) en un ambiente artificial. Esta forma de cultivar las plantas

tiene dos características fundamentales: la asepsia (ausencia de gérmenes) y el control de los

factores que afectan al crecimiento.

La técnica del cultivo in vitro es una técnica extremadamente útil para una

rápida introducción de nuevos clones, propagación y mantenimiento de plantas libres de

virus, para la conservación de germoplasma, obtención de nuevas variedades y la realización

de estudios fisiológicos.

El fundamento del cultivo in vitro es la capacidad que poseen las células vegetales de

volver a un estado indiferenciado, a la etapa de célula meristemática proliferante, es decir,

devuelven la célula adulta a la etapa juvenil siendo ésta capaz de orientarse a la formación

de casi cualquier órgano. Tejidos compactos, normales o tumorales, meristemos, yemas,

raíces y células aisladas se han convertido, gracias a las técnicas de cultivo in vitro, en el

material de elección para llevar a cabo el cultivo de tejidos vegetales.

Hay varios tipos de cultivo in vitro, de la misma forma que se encuentran materiales

diferentes en la constitución de las plantas (figura 1).

El origen del explanto inicial varía en función del objetivo perseguido durante

el cultivo: propagación de yemas axilares u obtención de brotes adventicios.

Para la propagación de yemas axilares hay dos vías posibles:

1- A partir de yemas apicales o meristemos para la proliferación de brotes

axilares de los cuales se obtendrán nuevos individuos.



2- A partir de porciones de uno o más nudos que desarrollarán nuevos nudos de los

cuales se harán nuevas porciones para obtener nuevos individuos.

Para la obtención de brotes y/o embriones adventicios se pueden seleccionar los explantos

de varios tejidos (hojas, raíces, flores, etc.) con los que se pueden seguir dos vías:

1- La morfogénesis directa, de la que se pueden obtener brotes adventicios que darán

lugar a nuevas plantas, o también se pueden obtener embriones somáticos para la

obtención de individuos.

2- La morfogénesis indirecta, en la que se produce en el explanto la proliferación de

un callo, es decir, un tejido tumoral más o menos organizado, que generalmente

surge sobre heridas de órganos y tejidos diferenciados (Pierik 1990).

Posteriormente los callos se cultivan en un medio diferente con el propósito de

obtener subcultivos de callo de los que se pueden obtener brotes adventicios, que

darán lugar a nuevos individuos, o se obtienen embriones somáticos de forma

directa o mediante suspensiones celulares dando lugar igualmente a individuos

completos. El tipo de callo producido condiciona en gran medida su capacidad

organógena, así, callos de consistencia friables (desmenuzables) tienen tendencia

a producir embriones somáticos mientras que los no friables (duros) son mas

inestables y tienen un peor comportamiento para el subcultivo. Son varios los

autores que citan estas tendencias, se mencionan como ejemplos:

i. En el cultivo de Arachis sp. al adicionar al medio BA proliferó el

crecimiento de estos callos, produciendo así mismo caulogénesis y

embriogéneis en distintas proporciones (Pacheco et al. 2007).

ii. Los callos de consistencia friable producen embriogénesis (Taylor et al.

1996).

iii. Los callos friables tienen la capacidad para producir embriones, tallos y para

regenerar plantas (Luciani et al. 2006).

iv. La pérdida de viabilidad e inhibición del crecimiento de los callos no friables

puede ser debida a la pérdida de etileno producido por el propio callo durante

su cultivo, siendo este la causa del color marrón característico de este tipo

de callos (Mao et al. 2006).

v. En el cultivo de Solanum virginianum L. el callo friable es precursor de

organogenésis (Borgato et al. 2007).



Figura 1. Principales métodos de micropropagación. Se destacan las vías

seguidas en este ensayo.

El crecimiento y desarrollo del explanto inicial esta determinado por diversos factores

genéticos, físicos, ambientales (luz, temperatura, pH), el medio de cultivo y la presencia de

algunas sustancias orgánicas (reguladores, vitaminas etc.).

La constitución genética determina factores decisivos como, qué temperatura es

la óptima para el crecimiento y la floración, la forma de las hojas, etc.

Los factores físicos ambientales influyen prácticamente en todo tipo de procesos:

absorción de agua, evaporación, fotosíntesis, etc.

Los nutrientes son esenciales para el crecimiento y desarrollo de las plantas. Lo

conveniente sería seleccionar una composición en función del conocimiento de la fisiología

de la especie con respecto a la nutrición mineral. En la tabla 1 se recoge la

composición recopilada por Margara (1987) de los medios de cultivo más empleados.



Tabla 1. Composición mineral de algunos medios de cultivo (Marga 1987)



Dentro de las sustancias orgánicas, el grupo de los reguladores es otro factor importante.

Los reguladores, que se necesitan en mínimas concentraciones, controlan, por ejemplo, la

distribución de todo tipo de sustancias en el interior de la planta y, por consiguiente, son

responsables de la división celular, el crecimiento de las células, etc. Los reguladores de los

grupos de las auxinas y las citoquininas parecen complementarse en la división celular,

las auxinas favorecen la duplicación de los ácidos desoxirribonucleicos (ADN) y la

citoquinina hacen posible la separación de los cromosomas. En forma esquemática se puede

admitir, según Augé et al. (1984), que el comportamiento fisiológico previsible de un inoculo

en un cultivo es el siguiente (figura 2):

� Si la proporción auxina/citoquinina es alta, habrá actividad de tipo rizógena.

� Si la proporción auxina/ citoquinina es débil, el inoculo evolucionará hacia

un actividad de tipo caulógeno.

� Si la relación es equilibrada, se tendrá un comportamiento callógeno.

Figura 2. Evolución del callo en función de la relación auxina/citoquinina.

Sin embargo, las relaciones indicadas anteriormente deben tomarse con ciertas

precauciones, ya que la influencia genética puede modificar de forma significativa la

respuesta obtenida.



1.2. EVOLUCIÓN HISTÓRICA DEL CULTIVO IN VITRO

Son numerosos los tratados donde se indican, de modo cronológico, los

acontecimientos más relevantes relacionados con el cultivo in vitro, a continuación se indican

los más relevantes, que han marcado hitos en la aplicación de la técnica, extraídos a partir de

Augé et al. (1984) y Pierik (1990).

Los primeros intentos de mantener con vida órganos aislados en animales datan de hace

más de 130 años, siendo el objetivo conservar con vida fragmentos de cola de renacuajo.

Los primeros pasos del cultivo in vitro se deben al alemán Haberlandt, a principios del

siglo pasado (1902). Este investigador logró que en un medio de Knop (tabla 1) mejorado

sobrevivieran durante varios meses pequeñas masas celulares (pelos estamíneos o glandulosos,

u otros fragmentos de epidermis) aunque sin multiplicación celular. Fue necesario esperar hasta

1922 para que surgieran nuevas esperanzas para el cultivo de tejidos vegetales.

En la década de los 20, Roblins, en los Estados Unidos, y Kott, en Alemania,

enfocaron su atención en las puntas de las raíces logrando mantenerlas con vida durante casi

seis meses y consiguiendo que crecieran hasta los 5 ó 6 cm de largo. Desafortunadamente al

cesar su crecimiento estos cultivos se perdieron.

En 1932 White logró por primera vez un cultivo indefinido de raíz usando

extremidades de raíz de tomate mantenidas en un medio líquido que contenía sales minerales,

extracto de levadura y azúcar. Este éxito dio lugar a esfuerzos renovados para cultivar tejidos

vegetales.

En 1934 Gautheret obtuvo a partir de la extracción de tejidos meristemáticos de árbol

(tejidos cambiales) proliferaciones de tejidos que lamentablemente no vivieron más de ocho

meses. Cinco años más tarde este investigador publicó sus primeros resultados sobre el cultivo

indefinido de tejidos de zanahoria. Ese mismo año, 1939, Nobecourt, y White, en relación con

tejidos de tabaco tumoral, publicaron resultados análogos sobre tejidos cambiales y tejidos de

tabaco tumoral, respectivamente. Es a partir de este momento cuando tiene su origen el cultivo

in vitro de tejidos vegetales.

Se necesitarían una gran cantidad de páginas para citar todas las etapas importantes que

derivan del éxito de Gautheret, Nobecourt y White. Se citan varios ejemplos:

En 1949 Limaste y Cornuet publican sus observaciones sobre la ausencia de virus en

meristemos de tabaco virosado. A partir de estas observaciones Morel y Martin se dedicaron a



cultivar meristemos de dalia y patata afectados por enfermedades virales consiguiendo obtener

plantas completas y sanas.

El cultivo in vitro ha permitido avances considerables en el estudio de tumores, que en

parte, han hecho posible la realización de las primeras pruebas de manipulación genética en

nuestros días.

Después de la Segunda Guerra Mundial (1945) el desarrollo en este campo ha sido

especialmente rápido y se han publicado numerosos resultados interesantes para la agricultura,

silvicultura y horticultura (Pierik, 1979: Bhojwani et al., 1986).

El descubrimiento de los reguladores de crecimiento (hormonas vegetales) ofreció

grandes oportunidades para el cultivo in vitro de tejidos vegetales. El primer regulador

descubierto fue la auxina IAA (ácido 3-indolacético), pero los grandes avances vinieron con el

descubrimiento en 1955 de la sustancia reguladora kinetina (una citoquinina).

Una revisión histórica detallada, esta recogida en los libros y artículos de Gautheret

(1959, 1964, 1983), Street (1973, 1974) y Gamborg y Wetter (1975). Se mencionan a

continuación algunas fechas y hechos importantes:

- 1948 Primer trabajo de cultivo in vitro en vid (Morel). - 1952 Obtención de dalias libres de virus por cultivo de meristemos (Morel y Martin). - 1952 Primera aplicación de microinjerto (Morel). - 1954 Obtención de la primera planta a partir de una célula aislada (Muir et al.). - 1955 Descubrimiento de la kinetina, una hormona de la división celular (Miller et al.). - 1957 Descubrimiento de la regulación de la formación de órganos (raíces y vástagos),

variando la proporción citokinina/auxina (Skoog y Miller).

- 1959 Publicación del primer manual extensivo de cultivo de tejidos vegetales(Gautheret). - 1962 Desarrollo por Murashige y Skoog del medio de cultivo más utilizado. - 1974 Inducción de ramificación axilar, por citoquinina, en ápices de vástagos de Gerbera

(Murashige et al.).

-1974 Descubrimiento del plásmido-Ti, principal inductor de tumores de Agrobacterium y

primer paso hacia ingeniería genética (Zaenen et al.; Larebeke et al.).



1.3. EL CULTIVO DE VID EN LA RIOJA. CARACTERÍSTICAS DE

LAS VARIEDADES DE ESTUDIO

La vid es el cultivo más extendido en el mundo y el más importante en

términos económicos. En el año 2008, se registró en España una superficie de viñedo

1.109.049 ha, de las cuales 1.088.334 ha de viñedo son para vinificación y el resto para

uva de mesa, pasificación y viveros. Es el país con mayor superficie dedicada al cultivo de la

vid, extendiéndose ésto por todas las provincias españolas. En La Rioja, se registra una

superficie de cultivo de 44.230 ha (Anuario de estadística 2009; MARM).

La vid llega a La Rioja a través de los romanos, los fenicios y los primitivos

celtíberos. El documento conservado más antiguo que hace referencia a la existencia de vid

en La Rioja data del año 873, procede del Cartulario de San Millán.

Las variedades tradicionales autorizadas por el Consejo Regulador de la D.O.Ca. Rioja

desde su creación en 1925 han sido cuatro tintas y tres blancas:

▪ Variedades tintas: Tempranillo, Garnacha tinta, Mazuelo (también conocida como Cariñena) y Graciano. ▪ Variedades blancas: Viura (también conocida como Macabeo), Malvasía y Garnacha

blanca.

Desde el punto de vista del material vegetal, en el año 2007 se autorizan nueve

variedades de uva que se añaden a las siete que ya estaban permitidas desde 1926 y

que incluyen cinco variedades autóctonas recuperadas, una obtenida por mutación somática y

tres variedades foráneas.

En este sentido es importante poner de manifiesto la necesidad de preservar las

variedades autóctonas de cada región ya que son, por lo general, las mejor adaptadas a las

condiciones naturales de cultivo al ser portadoras de caracteres genéticos que pueden

ser necesarios en el futuro, para mejorar las variedades o hacerlas mas resistentes a

determinados ataques (Martínez de Toda, 1990).

Las variedades de nueva introducción en 2007 han sido: ▪ Variedades tintas: Maturana tinta, Maturana parda o Maturano y Monastel ▪ Variedades blancas:

o Variedades autóctonas: Maturana blanca, Tempranillo Blanco y Turruntés.

o Variedades foráneas: Chardonnay, Sauvignon blanc y Verdejo.



Para este estudio se utilizaron las variedades Graciano, Tempranillo Blanco, Mazuelo y Tempranillo.

El Tempranillo Blanco tiene su origen en La Rioja en 1988, cuando Jesús Galilea

Esteban encontró un racimo de uvas blancas en una de las vides Tempranillo de su viñedo, de

Murillo de Río Leza, La Rioja (Salical 2005; Gobierno de la Rioja). Tempranillo Blanco es una

variedad blanca originada por mutación espontánea de yema a partir de la variedad tinta.

Galilea contactó con la agencia gubernamental de La Rioja CIDA (Centro de Investigación y

Desarrollo Agrario), que se encargó de injertar los brotes en su centro de investigación en

febrero de 1989, donde se realizan las pruebas anatómicas, fisiológicas, etc. pertinentes

que ponen de manifiesto el interés de la variedad par su cultivo en la D.O. Ca. Rioja.

El racimo es de tamaño mediano y suelto con la baya también mediana y de forma

ligeramente aplastada. La brotación es tardía, y el envero y la maduración precoces.

Graciano, una variedad autóctona muy poco extendida en otras zonas, cuya demostrada

complementariedad con el Tempranillo para el envejecimiento le ha convertido en una

variedad de futuro para Rioja, donde la superficie de cultivo ha aumentado considerablemente

en los últimos años, aunque sin alcanzar el protagonismo que tuvo antes de la filoxera.

Requiere suelos arcillo-calizos de cierta frescura y presenta una cierta resistencia

a enfermedades como mildiu y oidio, siendo de baja fertilidad y de maduración tardía.

Ofrece vinos con importante acidez y contenido polifenólico, ideales para crianza, cuyo

aroma es muy peculiar, superior en intensidad al resto de las variedades de Rioja.

Actualmente ocupa casi 1000 ha en la D.O.Ca. Rioja. (http://riojawine.com).

Racimo Haz Envés Sumidad



Hay constancia del cultivo de la variedad Mazuelo en Rioja desde hace varios siglos,

pero hoy ocupa apenas un 3% de la superficie de la Denominación. Es más productiva que las

otras variedades tintas, especialmente sensible al oidio y necesita mayor integral térmica para

madurar.

Aunque corta en aromas, produce vinos con abundantes taninos, acidez elevada y color

estable, todo lo cual le convierte en un buen complemento del Tempranillo para vinos de largo

envejecimiento.

La variedad Tempranillo está considerada autóctona de Rioja, es la más característica de

esta Denominación, fundamento de la identidad de sus vinos tintos y una de las

grandes variedades nobles del mundo. Ocupa más del 75% de la superficie de cultivo

y es enológicamente muy versátil, capaz de producir vinos con largo envejecimiento, muy

equilibrados en grado alcohólico, color y acidez, y con un paladar franco, suave y afrutado,

que evoluciona a aterciopelado cuando envejece. Respecto a su comportamiento agronómico, es muy segura en el cuajado, muy sensible a

plagas y enfermedades, poco resistente a la sequía y a temperaturas altas y, como su propio

nombre indica, es "uva temprana" con ciclo corto de maduración.

Actualmente el Tempranillo se encuentra muy difundido en España por su calidad

reconocida, estando autorizado en 28 denominaciones de origen, 12 de las cuales lo consideran

una de las variedades principales o preferentes.



1.4. CULTIVO IN VITRO APLICADO A Vitis vinifera L.

A continuación se expone la revisión bibliográfica de lo investigado hasta el momento

en el ámbito del cultivo in vitro de la vid. De los artículos se destaca lo relacionado con

el ensayo de cultivo in vitro de vid en cuanto al medio de cultivo utilizado, el tejido de partida,

la composición y la concentración de los distintos reguladores utilizados.

Explantos de hoja

En el año 1990 Clog et al. cultivan in vitro porciones de hoja de la variedad Maturana

en medio MS con 0,5 mg/l de BA. Llegan a la conclusión de que el uso de BA es esencial

para la formación de callo.

También en 1990 Stamp et al. para su ensayo utilizan explantos de hoja de las

variedades de Vitis vinifera Cabernet Sauvignon, French Colombard y Garnacha cultivadas en

medio MS suplementado con 0, 1, 2 o 4 mg/l de BA. Concluyen que la organogénesis

se produce con mayor frecuencia con una concentración de BA de 2 mg/l.

Unos años mas tarde, Torregrosa y Bouquet (1996) utilizando explantos de hojas

jóvenes procedentes de híbridos de Vitis x Muscadinia obtuvieron los mejores resultados

de cultivo en medio MS suplementado con 2 mg/l de BA y 0,5 mg/l de NAA.

Años más tarde Skiada et al. (2010) a partir de hojas de los cultivares ‘Malagouzia’ y ‘Xinomavro’” afirman que el uso de 0,01 mg/l de IBA proporciona un mayor porcentaje

de enraizamiento en los dos cultivares estudiados aunque señala que la formación de raíces

sucede a diferentes temperaturas para estos cultivares (‘Malagouzia’ a 26ºC y ‘Xinomavro’ a

21ºC).

Explantos de yema

Gray y Benton (1991) cultivando yemas de vides muscadineas observan que lo más

adecuado es usar porciones de 1 cm por su baja infección y mayor supervivencia que

comparadas con materiales de longitudes inferiores o superiores. Estos autores utilizando el

medio MS suplementado con 1,2 mg/l de BA y 1,2 mg/l de TDZ obtuvieron la

mayor efectividad para la proliferación del cultivo de ápices.

En 1995 Tomás Las Heras et al. presentan los resultados del uso de diferentes sistemas

de micropropagación in vitro sobre las variedades Garnacha, Tempranillo, Viura,

Moscatel, Calagraño y Miguel de Arco. Los mejores resultados para todas las variedades se

obtuvieron con medio sólido MS suplementado con 2 mg/l de BA.



Segmentos nodales

Por otro lado, en el año 2004 Singh et al. indican que para el inicio del cultivo de las

variedades Pusa Urvashi y Pusa Navrang el uso de segmentos nodales cultivados en medio

MS suplementado con 2 mg/l de BA y 0,2 mg/l de NAA presenta los mejores resultados.

Couselo et al. (2006) también obtienen los mejores resultados de elongación con el

medio MS suplementado con 2 mg/l de BA utilizando como explanto inicial segmentos

de nudo de la variedad Albariño.

Cadavid-Labrada et al. (2009) analizan las capacidades regenerativas de los segmentos

nodales de Cabernet Sauvignon, Melisa y Thompson Seedless cultivados en medio MS

suplementado con BA. Obtienen los mejores resultados con una concentración de 3 mg/l.

Sin embargo para Laslo et al. (2010) el mayor porcentaje de regeneración se consigue

utilizando segmentos nodales cultivados en medio MS suplementado con 5 mg/l de BA y 825

mg/l de NH4NO3. Además demuestran que el uso de IBA incrementa el número y el vigor

de las raíces. Para este ensayo utilizan las variedades de vid Cabernet Sauvignon y

Riesling Italiano.

Con fines del estudio genético del fenotipo de Chardonay 96, Bertsh et al. (2005) para

la iniciación de callo embriogenico a partir de explantos nodales utilizan el medio MS

suplementado con 1 mg/l de BA y en estado de oscuridad.

En el año 2008 Jaskani et al. utilizan explantos de yema y discos de hoja procedentes de

la variedad Perlette cultivados en medio MS suplementado con BA obteniendo la mayor

inducción a callo con una concentración de 1mg/l de este regulador.

Aazami (2010) a partir de los cultivares de Vitis vinifera ̀Soltain` y `Sahebi` utilizando

los brotes apicales obtienen los mejores resultados en medio MS suplementado con 1,5 mg/l

de BA y también con el medio MS suplementado con 1,5 mg/l de BA mas 1 mg/l de IBA.

Mukherjee et al. en el estudio de la Vitis champinii Planch encuentran que el medio

óptimo para el establecimiento del cultivo es el medio MS con la concentración de nitratos

reducida a la mitad y suplementado con 2 mg/l de BA.

Orden y Karaaslan en su artículo publicado en el año 2010, indican que la combinación

de 0,1 mg/l de BA con NAA pueden jugar un papel directo en la reducción del nivel de

radicales libres y la producción fenólica asociadas con la capacidad de proliferación de

las células de vid sometidas a cultivo in vitro.

Por ultimo, Gago et al. en el año 2010 concluyen que para el éxito de la rizogénesis y

aclimatación del cultivo in vitro de vid influyen tres factores: el tipo de cultivar, la

concentración y el tiempo de exposición al IBA.



1.5. INTERÉS DEL TEMA

El cultivo in vitro ofrece una serie de posibilidades que no presenta el cultivo

tradicional (ex vitro), pudiendo citar, entre otras, la obtención de material libre de virus, la

rápida propagación del material vegetal (situación especialmente interesante en la multiplicación

de nuevos genotipos), la conservación de forma económica y a largo plazo (mediante

crioconservación) de material vegetal seleccionado y mantenimiento del cultivo en condiciones

estériles para el protección frente a las poblaciones de patógenos.

Por otra parte, ya se ha indicado la importancia que tiene el cultivo de Vitis vinífera en

la C.A. de La Rioja, siendo numerosos los estudios realizados respecto a diferentes ámbitos

de las variedades permitidas para su cultivo en dicha comunidad, de tipo económico,

fisiológico, fenológico, etc. Sin embargo son escasos los estudios relacionados con la respuesta

que las diferentes variedades tienen ante su manejo in vitro.

El interés de este trabajo se centra en la evaluación del comportamiento de cuatro

variedades de vid cultivadas en la D.O. Ca. Rioja bajo diversas condiciones de cultivo in vitro.

El conocimiento generado será fundamental para el empleo de las técnicas propias del cultivo

in vitro en futuros trabajos de investigación aplicada.



2. OBJETIVOS

Como objetivo general se puede indicar evaluar la respuesta de cuatro variedades de

Vitis vinifera cultivadas en condiciones in vitro.

En concreto, este estudio tiene como objetivos particulares:

- Identificar la naturaleza del explanto inicial más adecuado respecto a sus

posibilidades de desinfección.

- Estudiar la respuesta de las variedades Tempranillo, Tempranillo Blanco, Mazuelo y

Graciano a diversas técnicas de cultivo in vitro.

- Observar y monitorizar la evolución del cultivo de cada parte de la planta

seleccionada.

- Identificar el medio de cultivo que ofrece mejores respuestas al cultivo.



3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. MATERIAL VEGETAL

Las variedades sometidas a estudio son tres tintas: Mazuelo, Graciano (clon 103) y

Tempranillo (clon RJ-26), y una blanca: Tempranillo Blanco. La elección de los clones ha

sido al azar, en el caso del Tempranillo Blanco y el Mazuelo no existen clones comerciales

seleccionados.

El material de partida se obtuvo de la finca Experimental que la Comunidad Autónoma

de La Rioja tiene en La Grajera (Logroño), que proporcionó gavillas de sarmientos de todas

las variedades a estudio con las yemas en estado de dormición.

Tras la recepción, se procedió a cortar porciones de tres yemas (estacas) con cada

sarmiento y parafinar sus extremos para evitar la deshidratación. Para ello se calentó

parafina al baño María en un recipiente hasta los 50ºC y se fueron introduciendo los extremos

de las estacas extrayéndolos seguidamente. Se conservaron en frío (4ºC) hasta su utilización.

Para el forzado de yemas se sumergieron las estacas parafinadas de tres yemas en el

baño termoestático a 30ºC durante 24 horas. Una vez transcurrido este tiempo, las estacas

con las yemas que ya han salido de dormición fueron colocadas de tres en tres en macetas con

un sustrato a base de turba y vermiculita, en una proporción de 3:1 (turba:vermiculita). A

continuación se colocaron en una cámara de crecimiento con fotoperiodo de 16 horas de luz y

8 horas de oscuridad y termofotoperiodo de 24ºC/18ºC, a la espera de producirse la brotación

de las yemas, que se produjo en un tiempo variable de 3 a 4 semanas.

Para el estudio se usaron tres tipos de explantos iniciales:

- De yema con una porción de tallo de 0,5-1 cm. - Porciones de hoja de 1,5x1,5 cm. - Pecíolos de hoja de 1-2 cm.

También se realizó un ensayo en que se utilizaron como explantos segmentos nodales

obtenidos directamente de las estaquillas proporcionadas por la Grajera tras ser mantenidas

durante 2 meses a 4 ºC, pero sin pasar por el proceso de forzado descrito anteriormente,

por tanto con las yemas sin brotar.



3.2. MEDIOS DE CULTIVO

Para el cultivo in vitro se utilizó el medio de cultivo MS (Murashige and Skoog, 1962).

El procedimiento seguido para su preparación varió según el tipo de explanto. Se utilizó un

preparado comercial que incluía las sales minerales y los componentes orgánicos (salvo

sacarosa) de dicho medio (Murashige & Skoog basal mediumw/vitamina Phyto

Technology Laboratory) cuya composición se describe en la tabla 2.

Para la preparación de 1 l de medio se añadieron en un vaso de precipitado 4,43g del

preparado comercial, 20g de sacarosa y 600-700ml de agua destilada. La mezcla se colocó

en el agitador magnético hasta la disolución de la sacarosa. Una vez disuelta el procedimiento

a seguir se determinó en función del explanto a cultivar.



Tabla 2. Composición del medio MS. (Murashige & Skoog 1962)



3.2.1. PREPARACIÓN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO

Se utilizó la citoquinina bencilaminopurina (BA) (Sigma, 0214583) y la auxina ácido

indolbutírico (IBA) de la marca (Panreac síntesis, 0210414). Para la preparación de 50 ml se

procedió de la siguiente forma:

- Para BA: se pesaron 0,05 g del comercial al que se le añadieron 5 ml de ClH 0,2 N y

se enrasó con agua destilada hasta los 50 ml.

- Para IBA: se pesaron 0,05 g del preparado comercial al que se le añadieron 5 ml de

NaOH 0,05 N y se enrasó con agua destilada hasta los 50 ml.

En ambos casos se obtuvo una concentración de 1mg /ml.

3.2.2 MEDIO DE CULTIVO PARA EXPLANTOS DE YEMA

Se utilizó el medio MS descrito en el apartado 3.2. al que, una vez disuelta la sacarosa

se enrasaba a 1l con la ayuda de una probeta y se ajustaba el pH a 5,7. En este caso no se

añadieron reguladores de crecimiento.

A continuación se introdujo en un matraz Erlenmeyer al que previamente se habían

incorporado 6g de agar, para que proporcionara la consistencia adecuada, disolviendo y

homogeneizando el medio en una placa caliente con agitación magnética hasta quedar

translúcido.

Tras este paso el medio MS se repartía en botes de vidrio de 200 ml y de 5 cm de

diámetro en una medida aproximada de 45 ml por bote, se tapaban y se introducían en el

autoclave para esterilizar a 120ºC, 1Kg cm-2s

-1 durante 20 minutos. Transcurrido el tiempo de

esterilización se dejaban los botes en la cabina de flujo laminar con luz ultravioleta hasta que

el medio solidificara y pudiera ser utilizado.



3.2.3. MEDIO DE CULTIVO PARA EXPLANTOS DE HOJA Y PECIOLOS

Para este ensayo, al medio de cultivo MS descrito en el apartado 3.2. se le añadieron

concentraciones de 0; 0,5; 1; 2 y 4 mg/l de bencilaminopurina (BA) y de 0,5 mg/l de acido

indolbutírico (IBA) respectivamente (protocolos 0; 0,5; 1; 2; 4) (Clog et al, 1990).

Una vez disueltos los reguladores de crecimiento se añadieron al vaso de precipitado,

con la sacarosa disuelta, en las diferentes concentraciones y todo ello se enrasaba a 1l con la

ayuda de una probeta y ajustándose el pH a 5,7.

A continuación se introdujo la solución en un matraz Erlenmeyer al que previamente se

habían incorporado 6g de agar, para que proporcionara la consistencia adecuada. Se tapó con

papel de aluminio y se procedió a esterilizarlo en el autoclave a 120ºC, 1Kg cm-2s-1 durante

20 minutos.

Para el cultivo de explantos de hoja se utilizaron placas Petri estériles de 9 cm. de

diámetro. El medio MS se distribuía en las placas Petri dentro de la cabina de flujo laminar y

se dejaban allí en su bolsa correspondiente y con luz ultravioleta hasta que el medio

solidificara y pudiera ser utilizado.

Para el cultivo de explantos de pecíolos se utilizaron tubos estériles de 30 ml y de 3 cm.

de diámetro. El medio MS se distribuía en los tubos dentro de la cabina de flujo laminar, y se

dejaban cerrados en la cabina de flujo laminar con la luz ultravioleta hasta que el medio

solidificara y pudiera ser utilizado.

Tabla 3. Reguladores de crecimiento empleados en los cultivos.

Protocolo 0 Protocolo 0,5 Protocolo 1 Protocolo 2 Protocolo 4

BA (mg/l)

0,0

0,5

1

2

4

IBA (mg/l) 0,0 0,5 0,5 0,5 0,5



3.2.4. CONSERVACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

En el caso de que los medios no se usaran de forma inmediata y que fuera necesaria la

conservación del medio para su posterior utilización se procedió de la siguiente forma:

� Conservación de botes: � Para su uso 24h después de la preparación del medio se mantuvieron en la cabina

de flujo laminar con luz ultravioleta y el flujo de aire conectado.

� Para utilizaciones posteriores, se cerraron con parafilm en la cabina de flujo laminar

con el fin de evitar infecciones y se guardaron en frigorífico a 4ºC hasta dos/tres

semanas, transcurrido ese tiempo el medio era eliminado.

� Conservación tubos:

� Para su uso 24h después de la preparación del medio se mantuvieron en la cabina

de flujo laminar con luz ultravioleta y el flujo de aire conectado.

� Para utilizaciones posteriores se guardaron en frigorífico a 4ºC durante dos/tres

semanas, transcurrido ese tiempo el medio era eliminado.

� Conservación de placas Petri:

� Tras distribuir el medio se cubrieron las torres con su bolsa correspondiente y se

rociaron con etanol 75%, con el fin eliminar cualquier posible infección, dejándose

en la cámara de flujo laminar con luz ultravioleta y el flujo de aire conectado hasta que

el medio se solidificara y pudiera ser usado.

� Parar usos posteriores, se cerraron las torres con sus bolsas y se conservaron

en frigorífico a 4 ºC no más de 5 ó 6 días, transcurrido ese tiempo el medio era

eliminado.



3.3. DESINFECCIÓN

Para garantizar la asepsia de los explantos es necesario someterlos a un proceso de

desinfección antes de proceder a su cultivo.

Explantos de yema Los explantos de yema con una porción de tallo se sometieron primero a desinfección

en etanol al 70% durante 30 s, introduciéndose a continuación los explantos en una

disolución de hipoclorito sódico (lejía comercial al 20%) y unas gotas de Tween 20. Se

sumergieron los explantos en un bote con tapa y se mantuvieron en agitación durante 20 min.

Explantos de segmentos nodales Se llevó a cabo un ensayo de desinfección de segmentos nodales sometiendo las

porciones de sarmiento de un nudo a un baño fungicida con Rovral aquaflo de la

marca (BASF) durante 5 min para posteriormente mantenerlos en agitación en hipoclorito

sódico (lejía comercial al 20%) y unas gotas de Tween 20. Los tiempos a los que se

sometieron los explantos en los distintos tratamientos fueron:

1- 15 min. 2- 15 min + 5 min 24 h después. 3- 20 min. 4- 20 min con un baño previo en etanol al 70% durante 30 s. 5- 25 min. 6- 30 min + 5 min 24 h después.

Explantos de hoja y pecíolo En un ensayo preliminar se utilizó únicamente la variedad Tempranillo, procedente de

una planta ajena a nuestro estudio mantenida en cámara de cultivo, para establecer el

tratamiento menos dañino y/o más efectivo para este tipo de explantos.

Se sometieron a diferentes tiempos de desinfección utilizándose siempre hipoclorito

sódico (lejía comercial al 20%) y unas gotas de Tween 20.

La desinfección se realizó de la hoja con su pecíolo y una vez transcurrido el proceso

de desinfección se separaron los distintos explantos en la cabina de flujo laminar.

Los tiempos a los que se sometieron los explantos en los distintos tratamientos fueron:



1 -10 min.

2 - 15 min y un baño previo en etanol al 70% durante 30 s.

3 -15 min.

4 - 20 min.

Para las variedades objeto de estudio se utilizó el protocolo 1, es decir someter las hojas

a una desinfección con hipoclorito sódico durante 10 min.

3.3.1. ELIMINACION DEL DESINFECTANTE

Para eliminar el desinfectante de los explantos se decantó con cuidado la mayor parte en

un vaso de precipitado, se añadió agua estéril al tarro hasta la mitad, se tapó, se agitó

brevemente y se volvió a decantar, repitiendo este paso tantas veces como fuese necesario.

Una vez eliminado todo el desinfectante se mantenía el explanto dentro del tarro tapado

hasta su uso. Todo este proceso se llevó a cabo en la cabina de flujo laminar previamente

limpiada con etanol al 75%.

3.4. MANEJO IN VITRO

La manipulación de los explantos se realizó en cabina de flujo laminar estéril. Con los explantos desinfectados y la ayuda de pinzas, bisturí y placas Petri de cristal de

11 mm de diámetro previamente esterilizadas en el autoclave, se procedió como se explica

a continuación:

- Explantos de yema y segmentos nodales

Con la ayuda de unas pinzas se depositaron en la placa Petri y se eliminaron las partes

dañadas por el desinfectante obteniendo porciones de aproximadamente 1cm de lado. Se

colocaron en los botes con el medio de cultivo (3 explantos por tarro) se sellaron con parafilm

y se etiquetaron marcando la fecha de cultivo y la variedad.



- Explantos de hoja

Con la ayuda de unas pinzas se depositaron en la placa Petri. Cada hoja se cortó en

porciones de aproximadamente 1,5 x 1,5 cm de lado colocándolas en las placas Petri

(3 explantos por placa), se sellaron con parafilm y se etiquetaron marcando la fecha de cultivo,

la variedad y el medio empleado.

- Explantos de pecíolo Una vez separados los pecíolos de las hojas se depositaron en la placa Petri y

se cortaran en porciones de aproximadamente 2 cm de longitud. Las porciones se colocaron en

los tubos (1 explanto por tubo) y se etiquetaron marcando la fecha de cultivo, la variedad

y el medio empleado.

Todo los explantos obtenidos fueron conservados en cámara con termofotoperiodo con

16 horas de luz a 24 ºC y 8 horas de oscuridad a 18 ºC con una intensidad de luz de 2000 ± 200

lux.

3.5. CONTROL DE LA EVOLUCIÓN DE LOS EXPLANTOS

A pesar de los procesos de desinfección realizados una parte de los explantos cultivados

se infectaban. Tras el cultivo se realizaron observaciones cada 3 días para eliminar lo antes

posible los recipientes contaminados.

Para el seguimiento del crecimiento de los cultivos de hoja y peciolo se realizaron

observaciones transcurridos 21 días desde la fecha de cultivo y cada 21 días

sucesivamente desde la última fecha de observación.

Se realizaron dos observaciones en los cultivos de yema, a los 30 y a los 60 días.



3.6. ESTUDIO ESTADÍSTICO

Para el estudio estadístico se utilizó el programa informático Statistical Package for the

Social Sciences (SPSS) 10.0 (spss Inc., 1999). El estudio estadístico solo fue posible realizarlo para los explantos de pecíolo ya que

fue el material vegetal del que se pudieron obtener suficientes individuos para realizar

un mayor número de repeticiones.

Para el análisis de los resultados se realizó una comparación entre medias por medio de

pruebas paramétricas. Para determinar entre que medias existían diferencias significativas se

utilizó el análisis de la varianza (ANOVA) mediante la prueba de comparaciones múltiples

Duncan.



4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. ASEPSIA DEL EXPLANTO INICIAL

Explantos de yema

En todas las variedades la desinfección empleada fue de etanol 30s seguido de

hipoclorito sódico 20 min. La tasa de infección para explantos de yema tras 30 días de cultivo

fue superior al 50%.

Como se muestra en el figura 3 la variedad Tempranillo Blanco obtuvo el menor

porcentaje de infección y la variedad Mazuelo fue la que mayor porcentaje de

infección presentó para este tipo de explanto y tiempo de desinfección.

Figura 3. Contaminación en explantos de yema (%) a los 30 días de cultivo.

Tabla 4. Contaminación en explantos de yema.

Explantos

observados

Días de

cultivo

Explantos

contaminados

84 30 65% Graciano

29 60 100%

52 30 50% Tempranillo

Blanco 26 60 100%

92 30 73% Mazuelo

68 60 100%

40 30 61% Tempranillo

25 60 100%



A los dos meses de cultivo se produjo la contaminación del 100% de los explantos

cultivados impidiendo la obtención de material para posteriores estudios (tabla 4).

El hecho de que en el laboratorio de cultivo in vitro se realicen prácticas de

microbiología y estén presentes materiales como tierras y plantas vivas, puede haber

influido en el aumento de esporas de hongos (Vargas y Abdelnour, 2010). Por otra parte, el

uso de aplicaciones fungicidas y bactericidas en el material vegetal de partida puede

ayudar a la obtención de explantos más limpios (Debergh, 1999).

La contaminación apreciada a los 60 días de cultivo aparentemente no procedía de

la zona superficial del explanto, por lo que se puede presumir que estaba localizada en los

tejidos internos donde la desinfección superficial no es efectiva. Es posible que el cultivo de

meristemos pudiera permitir disponer de porciones suficientemente pequeñas y libres de

patógenos.

Algunos autores indican que el empleo de antibióticos como estreptomicina (Vargas

y Abdelnour, 2010) facilitan el establecimiento del cultivo estéril, otros como Kyte y Kleyn

en 1996 por el contrario, manifiestan la ineficacia de su empleo pudiendo llegar a ser tóxicos

para el material vegetal.

Explantos de segmentos nodales

En todos los ensayos de desinfección realizados con este explanto inicial se produjo una

tasa de infección del 100%, motivo por el cual se desechó el uso de explantos de segmentos

nodales para el ensayo de cultivo in vitro.

El material vegetal de partida provenía de pasar el reposo invernal en campo y

conservaba todas sus cubiertas protectoras haciendo más difícil la desinfección que si hubiese

brotado en cámara de crecimiento.

Las consideraciones realizadas en el apartado anterior respecto a la contaminación

en los explantos de yema pueden aplicarse igualmente a los explantos de segmentos nodales.



Explantos de hoja

En la tabla 5 se observan los resultados de la desinfección a los 5 días de la asepsia

obtenida en los ensayos preliminares realizados con hojas de Tempranillo para determinar el

procedimiento mas adecuado y menos lesivo.

En los ensayos en los que el tiempo de desinfección superaba los 15 min el material

vegetal quedaba excesivamente dañado. Con 10 min de desinfección el material quedaba

en mejor estado y se alcanzaba la asepsia dentro de los límites tolerables (tabla 5).

A partir de estos resultados se optó por realizar las desinfecciones de las distintas

variedades siguiendo este protocolo.

Tabla 5. Resultados del tiempo de desinfección en explantos de hoja a los 5 días de

cultivo.

Desinfección

Etanol 70% NaClO 20%

%

contaminación

% muerte

%

supervivencia

1 — 10min 30 0 70

2 30s 15min 0 100 0

3 — 15min 0 100 0

4 — 20min 0 100 0

En la figura 4 y en la tabla 6 se reflejan los porcentajes de infección obtenidos en las

distintas variedades, siguiendo el protocolo 1 de la tabla 5. En esta prueba la variedad

Tempranillo presentó la mayor tasa de asepsia mientras que la variedad Tempranillo

Blanco fue la que menor porcentaje de asepsia mostró, no obstante las diferencias

encontradas no fueron importantes.

Figura 4. Contaminación en explantos de hoja (%) a los 63 días de cultivo.



Tabla 6. Contaminación en explantos de hoja.

Explantos

observados

Días de

cultivo

Explantos

contaminados

Graciano 150 63 39,5%

Tempranillo Blanco 186 63 43,3%

Mazuelo 294 63 39,8%

Tempranillo 291 63 38,1%

Explantos de pecíolo

En la tabla 7 se observan los resultados de la desinfección a los 5 días de la asepsia

obtenida en los ensayos preliminares realizados con pecíolos de Tempranillo para

determinar el procedimiento mas adecuado y menos lesivo.

Como se observa en la tabla 7, los resultados obtenidos en cuanto a contaminación son

muy parecidos a los descritos para los explantos de hoja en el apartado anterior,

variando el porcentaje de contaminación del protocolo 1 (10 min de desinfección con

Hipoclorito sódico), que con este tipo de explanto disminuye hasta el 10 %.

A partir de estos resultados se optó por realizar las desinfecciones de las distintas

variedades siguiendo este protocolo.

Tabla 7. Resultados del tiempo de desinfección en explantos de pecíolo a los 5 días de

cultivo.

Desinfección

Etanol 70% NaClO 20%

%

contaminación

% muerte

% supervivencia

1 — 10min 10 0 90

2 30s 15min 0 100 0

3 — 15min 0 100 0

4 — 20min 0 100 0



En la figura 5 y la tabla 8 se muestran los porcentajes de infección obtenidos para las

distintas variedades, siguiendo el protocolo 1 de la tabla 7. En esta prueba la variedad

Tempranillo Blanco presentó la mayor tasa de asepsia mientras que las variedades

Tempranillo y Graciano fueron las que menor porcentaje de asepsia mostraron.

Es interesante destacar como el nivel de asepsia alcanzado con explantos de pecíolo (en

torno al 90%) es muy superior al alcanzado con las hojas (en torno al 60%), debido

posiblemente a que la pubescencia de las hojas impide que el desinfectante actué de forma tan

eficaz.

Figura 5. Contaminación en explantos de pecíolo (%) a los 63 días de cultivo.

Tabla 8. Contaminación en explantos de pecíolo.

Explantos

observados

Días de

cultivo

Explantos

contaminados

Graciano 60 63 9,7%

Tempranillo Blanco 58 63 4,8%

Mazuelo 61 63 8,1%

Tempranillo 57 63 9,7%



4.2. EVOLUCIÓN Y CRECIMIENTO DEL EXPLANTO INICIAL

Explantos de yema

Los aspectos elegidos para el control de la evolución de explantos de yema se basaron en:

- Número de hojas presentes en el explanto. - Crecimiento del explanto medido por el número de nudos presentes. - Presencia o no de raíces.

En este ensayo, el crecimiento de los explantos se produjo de forma lenta y sin avances

en la evolución de los parámetros fijados para la toma de datos, como se aprecia en Tabla 9 y

se comenta a continuación.

En la primera observación a los 30 días de cultivo y para la mayoría de los explantos de

todas las variedades no se obtuvieron individuos con más de 3 entrenudos, con más de 2

hojas y/o con la presencia de raíces.

En la segunda observación a los 60 días de cultivo los resultados decayeron aún más

produciéndose la infección de la totalidad de los explantos.

Posiblemente el escaso desarrollo y crecimiento apreciado haya sido debido a la

presencia de agentes contaminantes en los inóculos se manifiestan trascurridos dos meses de

cultivo.



Tabla 9. Cultivo de explantos de yema (%).

Graciano T. Blanco Mazuelo Tempranillo

Explantos

observados

15

0

16

0

20

0

17

0

Días de cultivo 30 60 30 60 30 60 30 60

0 58,3 — 25,0 — 65,2 — 62,5 —

1 8,3 — 12,5 — 8,7 — 20,8 —

2 33,3 — 43,8 — 21,7 — 16,7 —

N

º de

hoj

as

≥3 0 — 18,7 — 4,4 — 0 —

0 58,3 — 25,0 — 30,4 — 37,5 —

1 8,3 — 6,3 — 4,4 — 20,8 —

2 25,0 — 25,0 — 34,8 — 33,3 —

3 8,4 — 37,5 — 17,4 — 4,2 —

N

º en

tren

udos

≥4 0 — 6,2 — 4,4 — 4,2 —

Presentes 8,4 0,0 4,4 8,3

% d

e in

divi

duos

con

Raí

ces

Ausentes 91,7 100,0 95,7 91,7

A pesar de la contaminación, destaca la variedad Tempranillo Blanco por presentar en

mas del 50 % de los explantos, dos o mas hojas y/o dos o mas entrenudos y por ser la única

de las cuatro variedades en la que no proliferó el crecimiento de raíces.

En la anejo II se muestran imágenes de las variedades Mazuelo y Tempranillo de las

que se obtuvieron individuos que presentaban un número de entrenudos mayor a 3, hojas de

2-3 cm. y presencia de numerosas raíces de longitudes entre 7 - 10 cm.

Explantos de segmentos nodales

Con este tipo de explanto no se realizó ensayo de crecimiento y evolución debido a

que no fue posible alcanzar la asepsia del cultivo.

Evaluación del cultivo in vitro de variedades de vid cultivadas en la D.O.Ca. Rioja.


Explantos de hoja

La evolución de los resultados de este ensayo se realizo mediante dos tipos de

comparaciones:

1º- Cada variedad según su evolución en los diferentes medios.

2º- Cada medio según los resultados obtenidos en todas las variedades.

Los aspectos de control de explantos de hoja se basaron en un rango de números del 1

al 10 atendiendo a la aparición, crecimiento, color y posición de algún tipo de callo.

La composición de cada medio esta recogida en la tabla 3 del apartado de materiales y

métodos.

Los diferentes tipos de crecimiento establecidos para las observaciones fueron:

Tipo 1: Necrosis total del explanto.

Tipo 2: Necrosis parcial con partes en crecimiento activo. Tipo 3: Crecimiento activo representado como un cierto abultamiento del explanto.

Tipo 4: Fuerte engrosamiento de los nervios del envés de la hoja apareciendo en

algunos casos algún tipo de callo solo visible con la ayuda de la lupa binocular.

Tipo 5: Callo visible en el envés con la ayuda de la lupa binocular. Tipo 6: Callo claramente visible en el envés y algo apreciable en el haz con la ayuda

de la lupa binocular.

Tipo 7: Callo claramente visible en el envés y abundante abultamiento del explanto

en el haz.

Tipo 8: Callo visible en el envés sin la ayuda de la lupa binocular y aparición de

callo en el haz.

Tipo 9: Abundante callo visible en el envés y en el haz visibles sin la ayuda de la

lupa binocular.

Tipo 10: Abundante callo visible en el envés y en el haz sin la ayuda de la lupa

binocular y aparición de raíces.

A continuación se muestra una imagen tipo de cada uno de los estados de “crecimiento

tipo” observados.



( equivale aproximadamente a 2 cm.)



En todas las variedades y para todos los protocolos, si existió algún tipo de crecimiento

se producía en el envés de la hoja, es decir, en la zona de contacto del medio con el explanto.

En todas las variedades aparecen callos de consistencia friable (fácilmente desmenuzables)

y de consistencia no friable (duros). Los callos no friables son de color marrón y los de tipo

friable son de color blanquecino, apareciendo no obstante alguno con pigmentos verdes y

rojos, este tipo de consistencia del callo es adecuada para realizar suspensiones celulares

(Pierik, 1990).

Los resultados obtenidos se exponen en la tabla 10. En el anejo III se muestran

imágenes de algunos de los callos obtenidos para cada variedad y protocolo.

- Según el protocolo usado se observó:

Para todas las variedades en el protocolo 0 no hubo crecimiento activo y los

explantos terminaron por necrosar. Sin embargo, las variedades muestran diferencias en las

primeras semanas de cultivo. En este sentido, el Tempranillo Blanco muestra una menor

actividad a los 21 días de cultivo, ya que el 75% de los explantos se encuentraron en

ese momento en necrosis total, a diferencia del 50 % que presenta el resto de variedades.

Por otra parte, únicamente el Tempranillo mantuvo algún explanto con cierta

viabilidad (un 8,3 % con “crecimiento tipo” 2) a los 42 días de cultivo.

Para el protocolo 0,5 todas las variedades la evolución de los explantos a callo se

produjo en muy bajos porcentajes. En la primera observación a los 21 días de cultivo

ninguno de los explantos supera el “crecimiento tipo” 4. En este momento muestra una mayor

actividad la variedad Graciano que alcanza dicho estado de evolución con un 83 % de

explantos viables a diferencia del resto de variedades que no superan el 50 % de explantos

viables.

En esta misma línea se observa que a los 42 días de cultivo sigue siendo la variedad

Graciano la que destaca por su actividad con un 60 % de individuos viables y con un

“crecimiento tipo” 6, nivel que no ha sido alcanzado por ningún individuo del resto de

variedades. En esta segunda observación la totalidad de los explantos de Tempranillo Blanco

mostraban necrosis total.



La mortalidad fue muy elevada para todas las variedades pero en las observaciones

destaca que el escaso número de explantos viables de Graciano (un 20 %) muestran el

crecimiento máximo (“crecimiento tipo 10”) en que se produce rizogénesis. Este

comportamiento se explica por ser el medio donde el nivel de citoquinina es menor.

El medio utilizado para el protocolo 1 se mostró más favorable para la variedad Graciano

que para el resto de las variedades ya que no muestra individuos necrosados y los explantos

viables se observan entre los “crecimientos tipo” 7 y 8 mientras el resto de variedades

presenta una elevada mortalidad, destacando la variedad Tempranillo Blanco que

muestra un 100 % de los explantos necrosados.

De forma ocasional la variedad Tempranillo muestra rizogénesis en un 10 % de los

explantos a los 63 días de cultivo.

Para la concentración utilizada en el protocolo 2 se observa a los 63 días de cultivo que la

variedad Tempranillo Blanco presenta un 100 % de los explantos necrosados, igualmente se

produce la mortalidad del 68,7 % y del 50 % de los explantos de Tempranillo y Mazuelo,

a diferencia del 16, 7 % de los explantos necrosados de Graciano.

Respecto a la actividad la variedad Graciano alcanza un “crecimiento tipo” 8 en el 25 % de sus explantos viables y un “crecimiento tipo” 9 en el 58,3 % de sus explantos

viables, mientras que para las variedades Mazuelo y Tempranillo se produjo un “crecimiento

tipo” 8 del 50 % y del 31,3 % de sus explantos respectivamente.

Stamp et al (1990) en el estudio realizado con hojas de Vitis spp. Utilizando este mismo

medio aprecian una mayor frecuencia de organogénesis, apreciación que en este ensayo no

se ha producido apareciendo a diferencia únicamente callogénesis.

Por último, en cuanto al protocolo 4, el de mayor proporción de citoquinina,

presentó un comportamiento muy variable entre las variedades. Nuevamente es la variedad

Graciano la que presenta la mejor repuesta no produciéndose la mortalidad de ninguno de sus

individuos, mostrando a los 21 días de cultivo una actividad del 75 % de sus explantos

viables con un “crecimiento tipo” 8 y finalizando a los 63 días de cultivo con ese mismo

porcentaje peor alcanzando el “crecimiento tipo” 9.



Por el contrario la variedad Tempranillo Blanco muestra un 41,7 % de los

explantos con “crecimiento tipo” 9 a los 21 días de cultivo pero a los 63 días de cultivo

muestra una mortalidad del 90 % de sus explantos.

Las variedades Mazuelo y Tempranillo tienen un comportamiento intermedio con una

mortalidad entre el 50- 60 % de los explantos a los 63 días de cultivo y con un 37,5 % de

los explantos con un “crecimiento tipo” 8 en la variedad Mazuelo y un 45,4 % un

“crecimiento tipo” 7 en la variedad Tempranillo.

- Según cada variedad con su medio se observó:

• Graciano:

o Presenta el mayor porcentaje de individuos que alcanzaron el mayor

crecimiento en todos los protocolos ensayados.

o En el protocolo 0,5 destaca la aparición de raíces, coincidiendo con la

mayor y mas adecuada relación auxina/citokinina de las ensayadas para

conseguir rizogénesis según Augé et al. (1984), aunque esta apreciación solo

apareció en el 20% de los individuos.

o La semejanza de resultados obtenidos para los protocolos 2 y 4, así como

ser los medios que mayor proliferación de callos presentan.

o En todos los protocolo s alvo el 0, a medida que avanza el cultivo mejora

la respuesta de los explantos.

o A medida que aumenta la concentración de citoquinina en el medio

mejora la respuesta de los explantos.

o Destacar la respuesta del protocolo 4 ya que si bien no se produjo el

crecimiento máximo (no hubo emisión de raíces) mostraban un “crecimiento

tipo” 9 el 75 % de los individuos viables.

• Tempranillo Blanco:

o En todos los protocolos seguidos, salvo en el protocolo 4, la totalidad de los

explantos observados terminaron necrosándose a los 63 días de cultivo

(ver anejo III, imagen 3a), incluso la mortalidad del protocolo 4 fue

muy elevada ya que alcanzo el 90 % .

o Algunos de los callos aparecidos en el protocolo 4 muestran coloración

verde (ver anejo III).



• Mazuelo:

o Los protocolos 2 y 4 presentan un comportamiento similar, aunque con

mayor porcentaje (50 %) de explantos del “crecimiento tipo” 8 en el

protocolo 2.

o Esta variedad muestra mejor respuesta al incremento de la concentración de

citoquinina hasta el nivel 2, disminuyendo la actividad en el protocolo 4 (el

de mayor concentración de citoquinina).

• Tempranillo:

o El protocolo 4 es el medio con mejor aptitud para esta variedad con un

mayor % de explantos viables aunque el “crecimiento tipo” alcanzado no

supera en ningún caso el de los protocolos 1 y 2. Así en el protocolo 4 el 45

% de los explantos alcanzaron el “crecimiento tipo” 7 mientras que en el

protocolo 2 llegan al “crecimiento tipo” 8 un 31,3 % de los explantos y el

protocolo 1 donde el 10 % alcanza la máxima expresión de crecimiento, es

decir el “crecimiento tipo” 10 que corresponde a la aparición de raíces.

La variabilidad manifestada en la respuesta de las diferentes variedades ante el

mismo medio de cultivo, pone de manifiesto la importancia del genotipo en la

respuesta a los reguladores de crecimiento. Esta observación confirma los síntomas de

Mhatre et al. (2000) indican diferencias entre Thompson Seedless, Sonaka y Tas-e-

Ganesh, incluso los trabajos de Pinto-Sintra (2007) y Barreto et al. (2008) indican

diferencias importantes en el comportamiento no solo entre variedades de vid, sino también

entre clones de una misma variedad.



% d

e ex

plan

tos

tipo

Tabla 10. Cultivo de explantos de hoja (%).

GRACIANO BA (mg/l)

**

0

0,5

1

2

4

Días de cultivo 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63

1 50,0 100,0 100,0 16,7 20,0 80,0 16,7 16,7 16,7 2 50,0 3 4 83,3 20,0 5 50,0 6 60,0 50,0 50,0 7 50,0 60,0 83,3 25,0 25,0 8 40,0 83,3 25,0 75,0 75,0 25,0 9 58,3 75,0

* %

de

expl

anto

s tip

o

10 20,0

T. BLANCO BA (mg/l)

**

0

0,5

1

2

4

Días de cultivo 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63

1 75,0 100,0 100,0 40,0 100,0 100 50,0 100 33,3 87,5 100 33,3 60,0 90,0 2 25,0 20,0 28,6 22,2 3 10,0 14,3 50,0 12,5 4 30,0 57,1 44,5 10,0 5 6 7 20,0 8 25,0 10,0 10,0 9 41,7

* %

de

expl

anto

s tip

o

10

MAZUELO BA (mg/l)

**

0

0,5

1

2

4

Días de cultivo 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63

1 46,7 100,0 100,0 20,0 78,6 92,3 5,6 31,3 75,0 37,5 50,0 40,0 64,3 2 53,3 26,7 21,4 22,2 3 26,7 7,7 4 26,7 5,6 37,5 26,7 5 50,0 33,4 6 38,9 31,3 25 29,4 7 22,2 62,5 23,5 8 22,2 50,0 47,1 33,3 35,7 9

* %

de

expl

anto

s tip

o

10

TEMPRANILLO BA (mg/l)

**

0

0,5

1

2

4

Días de cultivo 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63

1 53,8 91,7 100,0 45,4 63,6 60,0 60,0 5,3 38,9 68,7 5,9 35,7 54,5 2 46,2 8,3 35,3 38,5 36,8 47,1 3 17,6 54,5 36,4 22,2 4 47,1 23,1 16,7 5 15,3 5,3 6 23,1 40,0 30,0 10,5 22,2 7 26,3 23,5 64,3 45,4 8 15,8 31,3 23,5 9

*

10 10,0 *La identificación de los “explantos tipo” se describe en el apartado 3.5.2.2. ** El medio esta compuesto por la cantidad citada de BA y 0,5 mg/l de IBA, excepto en el primera columna que el IBA es de 0mg/l.



Explantos de pecíolo

Se han realizado dos estudios con los resultados obtenidos de los explantos de pecíolo.

El primer análisis, similar al ya descrito para explantos de hoja, se basa en evaluar el aspecto

que mostraban los explantos a lo largo del cultivo; el segundo se realizó mediante un análisis

estadístico valorando el peso alcanzado de los explantos al final del cultivo.

1- Valoración atendiendo a los “crecimientos tipo”

Los aspectos de control de explantos de pecíolo se basaron en una escala del 1 al 10

atendiendo a la aparición, crecimiento, color y posición de algún tipo de callo.

La escala se estableció en base a la evolución del cultivo de las variedades de

estudio considerando relevantes características discordantes entre variedades y entre

protocolos.

Los diferentes tipos de crecimiento establecidos para las observaciones fueron:

Tipo 1: Necrosis total del explanto.

Tipo 2: Necrosis con cierto crecimiento en longitud y/o grosor. Tipo 3: Crecimiento activo con cierto crecimiento en longitud y/o grosor. Tipo 4: Fuerte engrosamiento de uno de los extremos del explanto en algunos

casos con proliferación de callo.

Tipo 5: Callo presente en uno de los extremos del explanto y engrosamiento del

otro extremo.

Tipo 6: Callo visible en ambos extremos del pecíolo. Tipo 7: Callo visible en ambos extremos del pecíolo y con cierta actividad en

el centro del explato en la zona de contacto con el medio

Tipo 8: Aparición de callo en los extremos y centro del explanto Tipo 9: Callo en crecimiento activo que cubre casi por totalidad el explanto inicial.

Tipo 10: Aparición de raíces en los callos.

A continuación se muestra una imagen tipo de cada uno de los estados de

“crecimiento tipo” observados.



( equivale aproximadamente a 2 cm.)



Para todos los protocolos y variedades el inicio de la actividad de crecimiento

empezó el la zona lesionada del explanto (los extremos del pecíolo) y fundamentalmente en

la zona de contacto del medio con el explanto.

En todas las variedades aparecen callos de consistencia friable (fácilmente

desmenuzables) y de consistencia no friable (duros). Los callos no friables son de color

marrón y los de tipo friable son de color blanquecino, apareciendo no obstante alguno con

pigmentos verdes y rojos, este tipo de consistencia del callo es adecuada para realizar

suspensiones celulares (Pierik, 1990).

Los resultados obtenidos se exponen en la tabla 11. En el anejo IV se

muestran imágenes de algunos de los callos obtenidos para cada variedad y protocolo.

- Según protocolo se observó:

En el protocolo 0 a los 63 días de cultivo las variedades Mazuelo y

Tempranillo presentaban necrosis en el 100 % de los explantos mientras que las

variedades Graciano y Tempranillo Blanco tuvieron un mejor comportamiento en este

medio donde la mortalidad no supero el 64 %. Sin embargo el crecimiento máximo

alcanzado por los explantos viables se limita al “crecimiento tipo” 2 en el que no hay

presencia de callo.

Estos resultados coinciden con los resultados obtenidos por Clog et al. (1990) en el

que señala que la presencia de reguladores es esencial para la obtención de callo.

En lo observado para el protocolo 0,5 las variedades Mazuelo y Tempranillo

mostraron una mejor respuesta frente a las otras dos variedades al menos en lo referente al

“crecimiento tipo” máximo alcanzado (“crecimiento tipo” 9), si bien la variedad

Tempranillo Blanco alcanzó un mayor porcentaje de explantos viables (85 %) aunque de

menor nivel de crecimiento (“crecimiento tipo” 6).

En cuanto a la actividad de los explantos cultivados en el protocolo 1 son de nuevo

las variedades Mazuelo y Tempranillo las que mejor respuesta mostraron ya que ninguno de

los explantos presento un nivel inferior al “crecimiento tipo” 4, llegando la variedad

Tempranillo a la máxima expresión de crecimiento descrita (“crecimiento tipo” 10) con un

27,3 % de los explantos que llegó a alcanzar la rizogénesis.



No obstante las variedades Graciano y Tempranillo Blanco también mostraron buena

respuesta a este medio donde la mortalidad no supero el 40 % de los individuos. De los

explantos viables la variedad Mazuelo alcanza un 33 % de individuos con “crecimiento tipo”

6 y la variedad Tempranillo Blanco un 36,4 % con “crecimiento tipo” 9.

Las variedades Tempranillo Blanco, Tempranillo y Mazuelo presentan para el protocolo

2 una respuesta similar ya que en las dos primeras alcanzaron un “crecimiento tipo” 9 entorno

al 35 % de los explantos y en la otra alcanzaron un “crecimiento tipo” 8 entorno al 50 % de los

explantos.

Se aprecia diferencia en la variedad Graciano con el resto de variedades donde si bien

no hubo mortalidad, el 70 % de los explantos no supera el “crecimiento tipo” 2.

Respecto a la mortalidad alcanzada para el protocolo 4 se observa para las variedades

Mazuelo y Tempranillo una similitud en el comportamiento ya que presentaron una

proporción sensiblemente superior a las otras variedades (44,4 % de explantos de

Tempranillo; 30,8 % de explantos de Mazuelo; 9,1 % de explantos de Graciano; 0 % de

explantos de Tempranillo Blanco).

En este protocolo el mayor desarrollo fue alcanzado por la variedad Tempranillo

Blanco donde el 7,7 % de los explantos viables alcanzaron el “crecimiento tipo” 9, mientras

que las variedades Tempranillo, Mazuelo, Graciano no superaron el “crecimiento tipo”

8, 7 y 5 respectivamente.

- Según cada variedad se observó:

• Graciano:

o En el protocolo 0 se presentó una mortalidad muy elevada (un 63,3 % de

explantos) y no se superó el “crecimiento tipo” 2.

o No se observan diferencias singulares entre el resto de protocolos, si bien se

puede mencionar que a los 63 días de cultivo no se produce mortalidad de

explantos en el protocolo 2 y que en ninguno de los protocolos se superó el

“crecimiento tipo” 6.

o Mencionar también que al inicio del cultivo (a los 21 días) el

crecimiento de los explantos en los protocolos 2 y 4 alcanzo el

“crecimiento tipo” 8 con un 20 % y un 25 % de individuos

respectivamente.



• Tempranillo Blanco:

o En el protocolo 0 se presentó una mortalidad muy elevada (un 63,6 % de

explantos) y los explantos viables no superaron el “crecimiento tipo”2.

o En los medios donde la concentración de citoquinina es superior a 1 ppm

se alcanzó el “crecimiento tipo” 9, siendo en los protocolos 1 y 2 donde esta

respuesta alcanza el mayor porcentaje (36 %) de individuos que

alcanzan este desarrollo.

o Si bien los protocolos 0,5 y 4 no muestran una actividad tan

importante cabe mencionar que presentaron un porcentaje de mortalidad

nulo.

• Mazuelo:

o En el protocolo 0 se presentó una mortalidad del 100 % de los

explantos. También mencionar que en los protocolos 2 y 4 la mortalidad de

los individuos supero en ambos casos el 30 %.

o La mejor respuesta para esta variedad se observa en los protocolos 0,5 y 1

donde el 50 % de los explantos alcanzan el “crecimiento tipo” 9 y el 72,7

% de los explantos alcanzan el “crecimiento tipo” 8 respectivamente.

• Tempranillo:

o Se produce mortalidad de explantos en los protocolos 0, 2 y 4 con un 100 %,

un 25 % y un 44,4 % de los explantos ensayados respectivamente.

o Los protocolos 0,5 y 1 mostraron una respuesta muy superior al resto de

protocolos ya que en al menos el 50 % de los explantos alcanzo un

“crecimiento tipo” 8 o superior, llegando incluso a la máxima expresión

de crecimiento en el protocolo 1 donde en un 27,3 % de los individuos se

produce rizogénesis.



Tabla 11. Porcentajes obtenidos para explantos de pecíolo

GRACIANO BA (mg/l) ** 0 0,5 1 2 4

Días de cultivo 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63

1 63,6 66,7 63,3 8,3 16,7 33,3 10,0 8,3 33,3 9,1 2 36,4 33,3 36,4 25,0 41,7 30,0 50,0 70,0 8,3 63,6 3 8,3 16,7 4 33,3 33,3 25,0 8,3 20,0 41,7 33,3 5 33,4 33,3 8,3 33,3 27,3 6 33,3 8,3 50,0 50,0 33,3 10,0 30,0 16,7 7 33,3 50,0 10,0 50,0 8 20,0 25,0 33,3 9

% d

e ex

plan

tos

tipo*

10

T. BLANCO BA (mg/l) ** 0 0,5 1 2 4

Días de cultivo 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63

1 63,6 20,0 63,6 36,4 18,2 2 36,4 80,0 36,4 18,2 15,4 25,0 9,1 7,7 3 9,1 4 9,1 8,3 14,3 18,2 16,7 23,1 23,1 5 45,4 14,3 8,3 18,2 7,7 15,4 6 18,2 84,6 36,4 23,1 14,3 7,7 7 85,7 58,4 28,8 36,4 33,3 9,1 30,8 14,3 15,4 8 42,8 27,3 50,0 18,2 15,4 71,4 23,1 9 36,4 36,4 7,7

% d

e ex

plan

tos

tipo*

10 MAZUELO

BA (mg/l) ** 0 0,5 1 2 4 Días de cultivo 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63

1 11,1 50,0 100,0 33,3 30,8 2 88,9 50,0 41,7 8,3 25,0 30,0 3 7,7 4 66,7 80,0 36,4 9,1 5 9,1 33,3 18,2 25,0 40,0 16,7 23,1 6 25,0 20,0 18,2 25,0 25,0 7 8,3 8,3 36,4 66,7 41,7 60,0 46,1 60,0 46,1 8 72,7 50,0 9 50,0

% d

e ex

plan

tos

tipo*

10

TEMPRANILLO BA (mg/l) ** 0 0,5 1 2 4

Días de cultivo 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63 21 42 63

1 75,0 100,0 100,0 16,7 10,0 25,0 18,2 22,2 44,4 2 25,0 25,0 33,3 9,1 3 20,0 10,0 11,1 4 40,0 40,0 27,3 22,2 36,4 33,3 22,2 5 40,0 37,5 27,3 22,2 33,3 6 62,5 45,4 8,3 30,0 27,3 7 55,6 45,4 33,3 8 30,0 36,4 8,3 33,3 9 20,0 33,3

% d

e ex

plan

tos

tipo*

10 27,3 *La identificación de los “explantos tipo” se describe en el apartado 3.5.2.2. ** El medio esta compuesto por la cantidad citada de BA y 0,5 mg/l de IBA, excepto en el primera columna que el IBA es de 0mg/l.



2- Valoración atendiendo al peso final del explanto.

Para determinar el aumento de peso de los explantos se consideró que el peso inicial de

las porciones de pecíolo era similar. Esta aproximación incrementa el margen de error

pero ayuda a preservar la esterilidad del explanto.

En la tabla 12 y la figura 6 se presentan los valores medios del aumento de peso de los

explantos junto con el error típico. A partir de estos datos se realizan las valoraciones

siguientes:

- Según el protocolo se observó:

o En el análisis realizado considerando todas las variedades se aprecian cuatro

niveles de significación, desde el peso mínimo proporcionado por el

protocolo 0 y que difiere significativamente de todos los demás, hasta el

mayor alcanzado por el protocolo 1 cuyas diferencias son significativas con

todos los medios salvo con el protocolo 2.

o En el protocolo 0 no se aprecian diferencias significativas entre variedades.

o La variedad Tempranillo Blanco fue la que alcanzo mayor crecimiento

en el protocolo 0,5 mostrando diferencias significativas con todas las

variedades excepto con la variedad Mazuelo.

o La variedad Graciano fue la de menor crecimiento respecto al protocolo 1.

Esta variedad muestra diferencias significativas con el resto de variedades

cultivadas.

o Para el protocolo 2 no existen diferencias significativas entre variedades,

a excepción de la variedad Graciano con la que si que existen diferencias, si

bien la variedad Tempranillo Blanco muestra mejor respuesta al cultivo que las

otras variedades.

o También es la variedad Tempranillo Blanco la que destaca en el protocolo 4

donde el peso medio alcanzado por los pecíolos supera de forma importante al

resto de variedades.

- Según la diferencia entre variedades se observó:

o La variedad que mejor respuesta al cultivo de pecíolos fue Tempranillo

Blanco, cuyo crecimiento, exceptuando a la variedad Mazuelo, fue

significativamente diferente al resto de variedades cultivadas.



o Graciano: en esta variedad es el protocolo 0 el que proporcionó menor peso en los

pecíolos cultivados aunque sin diferencias significativas con el protocolo 4. El

resto de protocolos no presentan diferencias significativas entre ellos ni con el

protocolo 4 aunque si con el protocolo 0.

o Tempranillo Blanco: presento diferencias significativas del protocolo 0 con el

resto de protocolos ensayados. Para esta variedad los resultados obtenidos, en

todos los protocolos salvo el 0, son muy similares en cuanto a que la diferencia

del peso final obtenido no fue muy dispar entre los diferentes medios.

o Mazuelo: fue la variedad que presentó el mayor aumento de peso de

pecíolo cultivado, concretamente en el protocolo 1, proporcionando diferencias

significativas con todos los protocolos salvo el 2. También se presentan

diferencias significativas del protocolo 0 con el resto de protocolos.

o Tempranillo: se encontraron diferencias significativas del protocolo 1 con todos

los protocolos salvo el 2. En cuanto al aumento de peso los pecíolos cultivados,

los obtenidos en los protocolos 1 y 2 alcanzaron un valor muy superior al del

resto de protocolos.

� Los resultados obtenidos para este tipo de explanto podrían resumirse especificando

todas las diferencias entre ellos en el siguiente cuadro:

Comparación entre

Variedades con todos los medios Variedades con el protocolo 0 Variedades con el protocolo 0,5

Variedades con el protocolo 1 Variedades con el protocolo 2 Variedades con el protocolo 4

T. Blanco ≥ Mazuelo ≥ Tempranillo > Graciano Similar para todas las variedades T. Blanco > Mazuelo; Tempranillo y Graciano Mazuelo; Tempranillo y T. Blanco > Graciano T. Blanco ≥ Mazuelo y Tempranillo ≥ Graciano T. Blanco ≥ Mazuelo; Tempranillo y Graciano

Protocolos con todas las variedades Protocolos con Graciano

Protocolos con T. Blanco

Protocolos con Mazuelo

Protocolos con Tempranillo

1 ≥ 2 ≥ 4 ≥ 0,5 > 0 1; 0,5 y 2 ≥ 4 ≥ 0 4; 1; 2 y 0,5 > 0 1 ≥ 2 ≥ 4 y 0,5 > 0 1 ≥ 2 ≥ 4 y 0,5 ≥ 0

A este tipo de explanto podría aplicársele igualmente lo citado en el explanto de hoja

respecto a que la variabilidad ante el mismo medio de cultivo, pone de manifiesto la

importancia del genotipo en la respuesta a los reguladores de crecimiento.



Protocolo (mg/L BA)*

Variedades

0 0,5 1 2 4 Media de

variedades GRACIANO T.

BLANCO

MAZUELO

TEMPRANILLO

0,074±0,019 aA 0,301± 0,092 aB 0,318± 0,081 aB 0,303±0,088 aB 0,177±0,024 aAB

0,050±0,013 aA 0,727±0,147 bB 1,026±0,247 bB 1,003±0,274 bB 1,075±0,245 bB

0,079±0,032 aA 0,582±0,116 abB 1,280±0,172 bC 0,926±0,193 abBC 0,551±0,129 aB

0,037±0,005 aA 0,297±0,098 aAB 1,096±0,226 bC 0,799±0,231 abBC 0,490±0,117 aAB

0,234±0,061 a

0,776±0,926 c

0,684±0,128 bc

0,544±0,135 b

Media de

protocolos

0,060±0,017 A 0,363±0,113 B 0,930±0,181 D 0,758±0,196 CD 0,573±0,129 BC

Tabla 12. Efecto de los diferentes medios de cultivo sobre el crecimiento de cuatro

variedades de Vitis vinifera (g). Media ± Error típico1

1Medias seguidas de una misma letra mayúscula en la línea y minúscula en la columna no difieren entre

si en el test de Duncan. (P<0,05). Media de variedades y media de protocolos se analizaran de forma

separada. *Todos los protocolos salvo el cero incluyen 0,05 mg/L de IBA.

Figura 6. Representación gráfica del efecto de los diferentes medios de cultivo sobre el

crecimiento de cuatro variedades de Vitis vinifera (g). Media ± Error típico1



5. CONCLUSIONES

El genotipo de cada variedad difiere en su respuesta ante los

mismos reguladores. Siendo la variedad Graciano la que mostró menor

reacción al cultivo en los medios empleados.

Respecto a la asepsia del material vegetal el explanto que mejor aptitud

presentó fue el de hoja, particularmente cuando la porción es tomada del

pecíolo de la misma. En el otro extremo, cuando el manejo es de yema no

activa (segmentos nodales) no se consigue explanto estéril, debido

posiblemente a la dificultad que tiene el desinfectante para llegar a los

patógenos protegidos por las escamas y brácteas. En todos los casos, la

asepsia del material vegetal a emplear posiblemente mejoraría si se utilizase

un fungicida en el cultivo.

Se recomienda trabajar mas en la etapa de selección y esterilización de

los explantos, dado que en este estudio los altos índices de

contaminación observados no permitieron el establecimiento de un estudio que

pudiera ser respaldado estadísticamente.

En el presente trabajo la inducción a la formación de callo duró aproximadamente

21 días (dependiendo del explanto inicial y el tipo de tratamiento).

La presencia de reguladores de crecimiento es esencial para la aparición de callo en todas las variedades.

La velocidad de aparición del callo, en general, fue más rápida en explantos

de pecíolo que en hoja.

Para ambos explantos (hoja y pecíolo) el crecimiento comenzó a producirse en

la zona de contacto con el medio.



Los mejores resultados se presentaron en el protocolo 1 para explantos de

pecíolo y en los protocolos 2 y 4 (con resultados muy semejantes) para

explantos de hoja.

La calidad del callo obtenido d e los diferentes explantos se observó que los

explantos de hoja formaron callos tanto friables como duros y en los explantos

de pecíolo solo aparecieron del tipo friable. Para ambos explantos los callos

friables eran de color blanquecino en algunos casos con pigmentos rojos o

verdes y los callos duros eran de color marrón.

En lo referente a obtención de masa de callo en explantos de pecíolo se

detectaron diferencias entre los protocolos usados siendo el protocolo 1 el que

mayor masa de callo produjo.



6. BIBLIOGRAFÍA

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ANA RUIZ LORENTE- I.T.A. Hortofruticultura y jardinería 57

7. AGRADECIEMIENTOS

En primer lugar, agradecer a mi directora Elena Martínez Villar la oportunidad para el

desarrollo de este trabajo fin de carrera permitiéndome entrar en el mundo del cultivo in vitro

así como la ayuda, dedicación y total disponibilidad cuando la he necesitado.

Agradecer también a Cristina Menéndez Menéndez su colaboración en este trabajo

proporcionando el material vegetal así como con su ayuda y consejos en todo lo que le fue

posible.

También a todos los asiduos al laboratorio de propagación vegetal que siempre me

han proporcionado un espacio para trabajar y han hecho más agradables mis jornadas de

análisis.

Por último, mi más sincero agradecimiento a todas aquellas personas que con su ayuda

y dedicación han conseguido que llegue hasta aquí. Familia, profesores, compañeros y

amigos. Gracias a todos.



ANEJO I: EQUIPO UTILIZADO

Placa caliente con agitación magnética Autoclave modelo prestoclave 75

modelo Agimatic-N

Cabina de flujo laminar modelo PV-100. Baño termoestático modelo Heto Holten

pH- metro modelo micro pH-2000 Balanza analítica modelo BL 3100



Balanza de precisión Luxómetro modelo Lumixarix

modelo Sartorius analitic

Cámara con termofotoperiodo Cámara con termofotoperiodo

modelo Ing-matic modelo IBERCEX



ANEJO II: IMÁGENES DE EXPLANTOS DE YEMA

Imagen 1: a) Explanto de la variedad Mazuelo en el recipiente de cultivo. b) Explanto de la variedad Mazuelo obtenido a los dos meses de cultivo. c) Explanto de la variedad Tempranillo en el recipiente de cultivo. d) Explanto de la variedad Tempranillo obtenido a los dos meses de cultivo.

a c d

b



ANEJO III: IMÁGENES DE EXPLANTOS DE HOJAS.

Imagen 2: Explantos de hoja de la variedad Graciano. a) explanto cultivado según el protocolo 0,5; aparición de raíz. a.1) detalle de la raíz. b) Detalle de callo cultivado según el protocolo 1. c) Detalle de callo cultivado según el protocolo 2. c.1) proliferación de callos en placa petri según protocolo 2. d) Cultivo según protocolo 4, detalle de crecimiento en el haz explanto. d.1) Cultivo según protocolo 4, detalle de crecimiento en el envés del explanto.

c

b

c.1

d

d.1

a a.1



Imagen 3: Explantos de hoja de la variedad T. blanco. a) aspecto general de los explantos a los 63 días de cultivo. b) cultivo según el protocolo 4. A la izquierda detalle de callo con pigmentación verde cultivado según el protocolo 4.

a

b



Imagen 4: Explantos de hoja de la variedad Mazuelo. a) Detalle de callo cultivado según el protocolo 1. a.1) Detalle de callo cultivado según el protocolo 1 en el que se aprecia pigmentación verde. . a.2) Detalle de callo no friable cultivado según el protocolo 1. b) Detalle de callo cultivado según el protocolo 2. b.1) Detalle de callo no friable cultivado según el protocolo 2. c) Detalle de callo cultivado según el protocolo 4. c.1) Detalle de callo no friable cultivado según el protocolo 4. c.2) Detalle de callo no friable cultivado según el protocolo 4.

a.1

c.1

a.2 a

c.2

a.1

b.1 b

c c.1



Imagen 5: Explantos de hoja de la variedad Tempranillo. a) Detalle de callo cultivado según el protocolo 1. a.1) Detalle de callo cultivado según el protocolo 1. . a.2) Detalle de raíz en explanto cultivado según el protocolo 1. b) Detalle de callo friable cultivado según el protocolo 2. b.1) Detalle de callo friable cultivado según el protocolo 2. c) Detalle de callo con pigmentación verde cultivado según el protocolo 4. c.1) Detalle de callo duro cultivado según el protocolo 4. c.2) Detalle de callo duro cultivado según el protocolo 4.

a.1 a

b.1

c c.1 c.2

b

a.2



ANEJO IV: IMÁGENES DE EXPLANTOS DE PECIOLO

Imagen 1: Explantos de pecíolo de la variedad Graciano. a) Diferencias en el crecimiento según el protocolo usado. a.1) Detalle de explanto cultivado según el protocolo 0. a.2) Detalle de explanto cultivado según el protocolo 0,5; aparición de callo. a.3) Detalle de explanto cultivado según el protocolo 1; aparición de callo. a.4) Detalle de explanto cultivado según el protocolo 2; aparición de callo con pigmentación roja. a.5) Detalle de explanto cultivado según el protocolo 4; aparición de callo.

a.5

a

a.3 a.1 a.2

a.5 a.4



Imagen 2: Explantos de pecíolo de la variedad T. Blanco. a) Diferencias en el crecimiento según el protocolo usado. a.1) Detalle de explanto cultivado según el protocolo 0. a.2) Detalle de explanto cultivado según el protocolo 0,5; aparición de callo. a.3) Detalle de explanto cultivado según el protocolo 1; aparición de callo. a.4) Detalle de explanto cultivado según el protocolo 2; aparición de callo. a.5) Detalle de explanto cultivado según el protocolo 4; aparición de callo con pigmentación verde

a

a.2 a.3

a.4 a.5



Imagen 3: Explantos de pecíolo de la variedad Mazuelo. a) Diferencias en el crecimiento según el protocolo usado; de izq a dcha: protocolo 0; 0,5; 1; 2; 4. a.1) Detalle de explanto cultivado según el protocolo 0. a.2) Detalle de explanto cultivado según el protocolo 0,5; aparición de callo. a.3) Detalle de explanto cultivado según el protocolo 1; aparición de callo. a.4) Detalle de explanto cultivado según el protocolo 2; aparición de callo. a.5) Detalle de explanto cultivado según el protocolo 4; aparición de callo con pigmentación verde.

a.1

a

a.2 a.3

a.4 a.5



Imagen 4: Explantos de pecíolo de la variedad Tempranillo. a) Diferencias en el crecimiento según el protocolo usado; de izq. a dcha.: protocolo 0; 0,5; 1; 2; 4. a.1) Detalle de explanto cultivado según el protocolo 0. a.2) Detalle de explanto cultivado según el protocolo 0,5; aparición de callo. a.3) Detalle de explanto cultivado según el protocolo 1; aparición de callo con pigmentación roja. a.4) Detalle de explanto cultivado según el protocolo 2; aparición de callo con pigmentación verde. a.5) Detalle de explanto cultivado según el protocolo 4; aparición de callo con pigmentación verde. b) Detalle de explantos cultivados según protocolo 1 con aparición de raíces en el callo desarrollado; izq. dentro del recipiente de cultivo, dcha. fuera del recipiente de cultivo.

a.2 a.3

a.5

a.1

a.4

a



b

b

b

TRABAJO FIN DE ESTUDIOS - biblioteca.unirioja.es · Evaluación del cultivo in vitro de variedades...

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