AUTO-BIORREMEDIACION DE AGUAS

RESIDUALES DEL PROCESAMIENTO DEL

CORCHO POR BACTERIAS DEGRADADORAS DE

FENOLES Y CLOROFENOLES INMOVILIZADAS

EN PARTICULAS DE CORCHO

PAOLA HERNANDEZ GALVIS

Sevilla, Diciembre de 2011

Bacterias inmovilizadas en

partículas de corcho

Agua residual del

lavado del corcho

Aislamiento e identificación

de bacterias

Resistencia a fenol

AUTO-BIORREMEDIACION DE AGUAS RESIDUALES DEL PROCESAMIENTO

DEL CORCHO POR BACTERIAS DEGRADADORAS DE FENOLES Y

CLOROFENOLES INMOVILIZADAS EN PARTICULAS DE CORCHO

Trabajo Fin de Máster

Máster en Genética y Biotecnología Microbiana

Este trabajo ha sido realizado en el Departamento de Microbiología y Parasitología de la

Facultad de Farmacia (Universidad de Sevilla)

TUTORA AUTORA

Eloísa Pajuelo Domínguez Paola Yamile Hernández Galvis

Sevilla, 12 de Diciembre de 2011

A mis padres

Quiero expresar mi agradecimiento a aquellas personas que me han ayudado en la

realización de este trabajo.

Especialmente quiero agradecer a mi tutora, Eloísa Pajuelo, la formación científica que de

Ella he recibido, siendo para mí un punto de referencia no solo por su alto nivel académico

sino también por la comprensión y el respeto con el que trata a las personas que la rodean.

Realmente me siento afortunada por haber tenido la oportunidad de trabajar con Ella

durante estos meses.

Quisiera mostrar mi más profundo agradecimiento al Dr. Miguel Ángel Caviedes por

haberme aceptado en su laboratorio.

De manera especial, agradezco sinceramente a todos mis compañeros de laboratorio con los

que he compartido mis buenos y malos momentos, la amistad, comprensión y a veces

paciencia que siempre, han demostrado hacia mí, a Nacho, a Julián Delgadillo, a Bouchra, a

Alejandro, a Ana Marí y a Pati. Gracias por haberme creado un ambiente de amistad y

compañerismo a mí alrededor, facilitándome la integración en el grupo.

También quisiera agradecer a mis amigos de Marchena y en particular a Marielita y a Don

José por Haberme acogido en su hogar como una hija, por haberme brindado todo el amor y

el calor de unos verdaderos padres, sin ellos no hubiera sido posible mi estancia en España.

Quisiera agradecer a mis padres y hermanos, por el constante apoyo y comprensión que

siempre me han ofrecido y el estar lejos de Ellos me hizo comprender cuanto los amaba y lo

importante que son en mi vida.; en los momentos de tristeza y soledad fueron el motor que

me impulsaba a seguir adelante y hoy me siento muy feliz por el resultado obtenido en este

trabajo, porque es el fruto del esfuerzo propio y el de muchas personas que me quieren.

Por ultimo quiero agradecer a Sergio, por su comprensión y apoyo, por demostrarme que su

amor es más fuerte de lo que pensaba y estar lejos de El me hizo comprender lo mucho que lo

amo.

Este trabajo es financiado por el MEC (proyecto BIO-2009-7766). Agradezco al Servicio de

Microscopía del CITIUS (Universidad de Sevilla) por la ayuda técnica.

ABREVIATURAS

API 20: Sistema estandarizado para la identificación de bacterias

ATSDR: Agency for Toxic Substances & Disease Registry

BA: Balsa de Almacenamiento

BAE: Balsa de Almacenamiento Enriquecida

BC: Balsa de Cocción

BCE: Balsa de Cocción Enriquecida

Benzoil-CoA: Benzoil – Coenzima A

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

C 1,2O: Catecol 1,2-dioxigenasa

C 2,3O: Catecol 2,3-dioxigenasa

CWAO: Oxidación de aire húmedo catalítico

dNTP: Deoxiribonucleótidos trifosfato

DTT: 1, 4 Ditio – 1 – treitol

EHD: Descargas Electro – Hidráulicas

EPA: Environmental Protection Agency

FC: Folin` Ciocalteau

G1, 2O: Gentisato 1, 2-dioxigenasa

IARC: Agencia Internacional para la investigación del Cáncer

KPa: KiloPascal

mM: miliMolar

MTBE: metil-terbutil-éter

MMS: Medio Mínimo Suplementado

MTC: Concentration Maxima Tolerable

NCBI: National Center for Bioinformatics

NADH: Nicotinamin – Adenín Dinucleótido Reducido

PCR: Polymerase Chain Reaction

PMSF: Fluoruro de fenil-metano-sulfonilo

P3, 4O: Protocatecuato 3,4-dioxigenasa

P4, 5O: Protocatecuato 4,5-dioxigenasa

RDP: Ribosomal Database Project

rpm: revoluciones por minuto

SEM: Microscopia Electrónica de Barrido

TSA: Agar Tripticasa Soja

TSB: Caldo Tripticasa Soja

UV: Ultravioleta

1. Título: Self-Bioremediation of cork-processing wastewaters by (chloro) phenol-

degrading bacteria immobilized onto cork particles.

Autores: I. Del Castillo; P. Hernández, I.D. Rodríguez-Llorente; M.A. Caviedes; E. Pajuelo.

Artículo aceptado en la revista “WATER RESEARCH” con revisión moderada. Nº de

referencia: WR18785. Índice de impacto: 4.546.

Ranking de esta revista según el índice de impacto:

Category Name Total Journals

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ENGINEERING, ENVIRONMENTAL 45 4 Q1

ENVIRONMENTAL SCIENCES 193 11 Q1

WATER RESOURCES 76 1 Q1

2. Comunicación en congreso

Autores: I. Del Castillo; P. Hernández, I.D. Rodríguez-Llorente; M.A. Caviedes; E. Pajuelo.

Título: Diseño de un sistema para la Auto – Biorremediación de aguas residuales del hervido

del corcho.

Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia de la Universidad de

Sevilla.

Congreso Nacional de la Sociedad Española de Microbiología. Junio 2011.

Tipo de comunicación: Póster.

ÍNDICE

1. ANTECEDENTES………………..………………………………………………............1

1.1 Generalidades de la industria productora del corcho…….……..………………........1

1.2 Aguas residuales de la industria del corcho ...…………………….……..………......2

1.3 Tratamientos para la depuración de aguas residuales……………….………….…....4

1.3.1 Métodos físico-químicos………………...…….……...…………..….…..........4

1.3.1.1 Separación de fenol en soluciones acuosas….....…..………....…........4

1.3.1.2 Destrucción de fenol en soluciones acuosas……..………...…..…….4

1.3.2 Métodos biológicos………....………………………..…………...……...…....6

1.3.2.1 Biodegradación en condiciones aerobias……….…………………….7

1.3.2.2 Biodegradación en condiciones anaerobias….…….……….…….......8

2. Objetivos………………………………………………………………………………...10

2.1 Objetivos específicos……………………….………………………………………10

3. MATERIALES Y METODOS………………………………………………………….10

3.1 Determinación de polifenoles totales en aguas residuales del corcho…………..….10

3.2 Material biológico……………..………………………………………………........11

3.3 Aislamiento e identificación de microorganismos…...………………….….……...12

3.3.1 Pruebas bioquímicas........................................................................................12

3.3.2 Extracción de ADN..........................................................................................12

3.3.3 PCR 16S...........................................................................................................12

3.4 Resistencia a fenol y clorofenoles…………….....…………..………….………......13

3.5 Degradación de fenol……………………………………………………………….13

3.6 Actividades enzimáticas de la ruta aerobia de degradación del fenol........................14

3.6.1 Fenol hidroxilasa……………..…………………………………….….……..14

3.6.2 Catecol 1,2–dioxigenasa………..………………………...……………….....14

3.6.3 Catecol 2,3-dioxigenasa…………...………………………...……………….15

3.7 Formación de “biofilms” en partículas de corcho……….……....…...………….…15

3.8 Optimización de condiciones para la biodegradación del fenol................................15

4. RESULTADOS OBTENIDOS………….………………………………......……..…....16

4.1 Cuantificación de polifenoles totales en aguas residuales del hervido del corcho....16

4.2 Aislamiento e identificación de microorganismos………………………………….17

4.2.1 Caracterización bioquímica………………………………..………...……….19

4.3 Resistencia a fenol y clorofenoles…………………………………………………..20

4.4 Consumo de fenol en medio líquido......…………………………………………....22

4.5 Degradación de fenol……………………………………..…………………….…..22

4.6 Actividades enzimáticas de la vía aerobia de la degradación del fenol…………….24

4.7 Capacidad de formación de “biofilms” sobre partículas de corcho…………...…..26

4.8 Optimización de condiciones para la degradación del fenol………………………..28

5. DISCUSIÓN………………………………………………………………………….....31

6. CONCLUSIONES………………….………………………………………………...…34

7. BIBLIOGRAFIA……….……………………………………………………..………...35

Probablemente no va en contra de la ciencia

sugerir que en un lugar u otro existe algún

organismo que, bajo las condiciones

adecuadas, pueda oxidar cualquier sustancia.

(Gale, 1952)

1

Auto-biorremediación de aguas residuales del procesamiento del corcho por bacterias

degradadoras de fenoles y clorofenoles inmovilizadas en partículas de corcho.

1. Antecedentes

La inadecuada utilización del agua y la contaminación proveniente de la industria es uno de

los principales problemas medioambientales de la actualidad. El agua es un componente

esencial en la vida del hombre que se encuentra en cantidades abundantes en la naturaleza y

ocupa grandes extensiones, pero el crecimiento poblacional y la industrialización han

aumentado la demanda y la contaminación de este recurso natural. La mayor fuente de

contaminación de las aguas superficiales y subterráneas se debe principalmente al vertido de

residuos derivados de actividades industriales.

1.1 Generalidades de la industria productora del corcho

El aprovechamiento principal del Quercus suber o alcornoque es el corcho; el alcornoque

tiene una limitada distribución geográfica. En Portugal se encuentra la masa alcornocal más

grande y mejor conservada (803.000 Has); en segundo lugar se encuentra España (725.000

Has) y detrás Argelia (463.000 Has), Marruecos (350.000 Has), Italia (150.000 Has), Francia

(65.000 Has) y Túnez (45.500 Has) (Fuente: Feria de Montado Portel, 2005). En España en

cuanto a superficie alcornocal, Andalucía es la comunidad con mayor superficie, con un 50%

del total; Extremadura ocupa el segundo lugar con un 30% de la superficie; Cataluña ocupa el

tercer lugar con 8% y el resto de comunidades representan el 11,7% de los alcornoques de

España. (Consejería de Medio Ambiente, Junta de Andalucía, 2006). Dentro de la producción

mundial de corcho, Portugal y España son los países con mayor producción anual de corcho

con un 50,5% y 22,7%, respectivamente.

La naturaleza química del corcho está dada por la suberina (40%), lignina (22%) y

polisacáridos (celulosa y hemicelulosa, 20%); a su vez está compuesto por ceras, taninos y

otros componentes extraíbles, (Gil, 1997). Actualmente se sabe que la suberina es una

combinación de ácidos grasos, aunque todavía se desconoce la composición de los mismos; se

han identificado algunos como el felogénico, esteárico, floiónico y subérico; siendo el

primero el más abundante. La suberina es inflamable e insoluble en agua, éter, cloroformo,

ácido sulfúrico, ácido clorhídrico y amoniaco, y es el mayor determinante de las numerosas

cualidades del corcho. Las células del corcho son impermeables a líquidos y gases; por lo cual

el corcho es un material idóneo para la elaboración de utensilios de pesca y flotadores en

general. Otra propiedad del corcho es la elasticidad, en virtud de la flexibilidad de sus

2

membranas celulares, el tejido suberoso posee una gran capacidad para soportar presiones

fuertes. El corcho como aislante puede ser usado en diferentes situaciones por ejemplo, posee

un coeficiente de conductividad térmica de 0,035 Kcal.m/m2 para una densidad de 110Kg/m

3,

lo que sitúa a la corteza suberosa entre las sustancias más adecuadas para el aislamiento

térmico (Góngora y Benítez de Lugo, 1980). Así mismo por el efecto de elasticidad

mencionada, el corcho es un excelente aislante acústico y amortiguador de vibraciones, otras

cualidades que le permiten ser usado en la técnica de aislamiento, son la capacidad de

absorber humedad, ser inodoro, higiénico, compacto y resistente. Gracias a las propiedades

del corcho se usa en diversas áreas como: construcción, aislamiento térmico, corrección

acústica, aislamiento de vibraciones, tabiques prefabricados, revestimientos, decoración; en

la industria del frío, la industria naval, la automoción; transportes, maquinaria en general, la

industria textil, la industria química-farmacéutica y la industria pesquera, etc. El polvo o

serrín producido en el procesamiento del corcho puede ser usado como combustible o como

agente de llenado (mezclado con cola) para tapones de corcho con menor calidad y para la

producción de linóleo, producto que puede usarse en la fabricación de explosivos y en la

agricultura.

1.2 Aguas residuales de la industria del corcho

Esta industria se destaca como el grupo industrial más importante de todo el sector forestal

gracias a la fabricación de tapones para el vino y de accesorios como calzado, bolsos y demás

artículos elaborados con corcho; a pesar de que la industria corchera es considerada una

industria ecológica, ya que el corcho es un producto natural no contaminante y en la mayoría

de sus procesos de transformación el impacto ambiental puede considerarse casi nulo. Hay

que tener en cuenta que el corcho natural contiene una estructura lignificada, una serie de

compuestos tánicos o clorados que durante el proceso de cocción se hidrolizan,

transformándose en sustancias como el pentaclorofenol, el 2, 4,6–tricloroanisol y los ácidos

polifenólicos. Estos compuestos además de conferir mal sabor al vino y otros licores; por su

carácter toxico están siendo objeto de control de sus niveles en tapones de corcho y en las

aguas residuales usadas para el procesamiento de dicho material. El procesamiento del

corcho requiere un lavado a 95° C para limpiar y ablandar el material. Generalmente con la

misma agua se suelen lavar 15-20 partidas de corcho, hasta que el agua residual se vuelve de

un color negruzco y es preciso desecharla. Estas aguas en ocasiones son vertidas directamente

3

a los afluentes de aguas naturales, ocasionando graves problemas medioambientales por la

elevada contaminación.

Entre los contaminantes más abundantes en el agua que afectan los diversos sistemas

biológicos encontramos los compuestos fenólicos, los cuales se caracterizan por tener un

núcleo aromático unido a un grupo hidroxil. Bajo esta definición quedan incluidos el fenol,

los fenoles di y trihídricos, los ácidos hidrobenzoicos, nitrofenoles, clorofenoles,

aminofenoles, metoxifenoles, fenoxifenoles, alquilfenoles y derivados de núcleos aromáticos

condensados (naftofenoles). Del total de los compuestos fenólicos conocidos

aproximadamente el 4% son producidos naturalmente y el 96% son de origen sintético. De los

fenoles sintéticos, los clorofenoles son los más comunes, son altamente tóxicos y persistentes

en el medio ambiente. La contaminación del medio marino por fenoles es causada

principalmente por las descarga de aguas residuales, destacando las aguas procedentes del

procesamiento de fármacos, papel, carbón, refinerías, explosivos, producción de celulosa y

madera, tintorerías, manufactura de plaguicidas y herbicidas, plásticos y resinas, entre otros

(Moussavi et al., 2009; Patel & Rajkumar, 2009; Varma & Gaikwad, 2009). Adicionalmente,

las aguas de desechos industriales son tratadas con cloro, proceso mediante el cual se forman

otros fenoles como el clorofenol, di y triclorofenol. Una vez que los compuestos fenólicos se

localizan en el agua, se pueden diluir con la misma o dispersarse en función de la fuerza y

dirección de las corrientes marinas, de igual forma son susceptibles de experimentar un

proceso de foto-oxidación cerca de la superficie acuática. Dicho proceso incluye la

hidroxilación del anillo, su condensación y dimerización, y por último, una eliminación

fotoinducida (Bianchi, T. S., M. Argyrou & H. F. Chippett, 1999).

Los fenoles pueden adsorberse en las partículas suspendidas y precipitarse posteriormente.

El comportamiento de los compuestos fenólicos en el ecosistema marino abarca también su

absorción por diversos organismos; o bien al acumularse, en los sedimentos están sujetos a la

degradación por microorganismos.

Los compuestos fenólicos en los seres humanos pueden entrar por inhalación, contacto por la

piel o ingestión, ya sea por medio de alimentos o agua contaminada; vía por la cual el fenol

ingresa rápidamente al cuerpo a través del tubo digestivo. Dicha ingestión de productos

líquidos que contienen fenol pueden producir daño intestinal grave y aun causar la muerte.

Según análisis toxicológicos realizados en animales de laboratorio beber agua con niveles de

fenol extremadamente altos puede ocasionar temblores musculares, dificultad para caminar,

alteraciones en hígado y sistema inmunológico y llevar a la muerte (ATSDR, 2008abc). No

hay ninguna evidencia que indique que la exposición al fenol produce cáncer en seres

4

humanos, la IARC y la EPA han determinado que el fenol no es clasificable en cuanto a

carcinogenicidad en seres humanos (ATSDR, 2008abc). Sin embargo, existen normativas a

nivel mundial que fijan el valor máximo permisible de compuestos fenólicos en el agua. La

EPA en Estados Unidos ha fijado una concentración de una parte por millón (1 mg.L-1

) de

fenol en aguas superficiales. Por otro lado, la Unión Europea acuerda que el límite de fenoles

en agua potable y mineral es de 0,5 g.L-1

. El límite de emisiones de fenol en agua residual

son de 0,5 mg.L-1

para aguas de superficie y 1 mg.L-1

para sistemas de alcantarillado.

1.3 Tratamientos para la depuración de aguas residuales

1.3.1 Métodos físico–químicos

1.3.1.1 Separación de fenol de soluciones acuosas

- La destilación se basa en la volatilidad del fenol, este proceso demanda alta cantidad de

energía, puesto que el fenol destila a 180ºC. Se puede emplear otros procesos como la

extracción de fenol del agua con la ayuda de algunos solventes orgánicos como

hidrocarburos, compuestos oxigenados, n-hexano, ciclohexanol, benceno, tolueno, entre

otros; los cuales pueden ser más tóxicos que el fenol como es el caso del tolueno.

- La adsorción es ampliamente usada en la purificación de pequeños ríos contaminados y

aguas residuales. Algunos adsorbentes usados son el carbón activado o resinas

poliméricas. También se pueden emplear membranas de polipropileno y solventes

orgánicos tales como MTBE, cumeno y una mezcla de hidrocarburos, con una sobre

presión de 31–38 kPa, para la extracción de fenol.

1.3.1.2 Destrucción de fenol en soluciones acuosas

- Oxidación con aire húmedo no catalítico se basa en las propiedades oxidativas del

oxígeno del aire, es aplicado en tratamiento de aguas residuales, en especial cuando son

muy diluidas para incinerar y demasiado tóxicas para tratamientos biológicos. Una

mineralización completa de aguas residuales es imposible con este método, debido a que

algunos compuestos de bajo peso molecular son resistentes a la oxidación.

- Oxidación con aire húmedo catalítico (CWAO): las catálisis homogéneas de CWAO

son usualmente la transición catiónica de un metal (iones Cu y Fe). El carbón activado

también puede actuar como catalizador aunque pueda ser consumido por la oxidación.

- Polimerización oxidativa con oxígeno en presencia de enzimas: la tirosina polifenol

oxidasa y lacasa convierten los fenoles usando oxígeno en o-quinonas. (Amjad & Qay

2007). Estos compuestos también pueden ser fácilmente filtrados y/o adsorbidos en

sólidos.

5

Otro tipo de oxidación puede ser la oxidación húmeda con químicos oxidantes los cuales

incluyen:

- Oxidación con ozono: consiste en que el ozono molecular actúa directamente en los

sitios nucleofílicos y radicales insaturados de los compuestos orgánicos. Sus principales

intermediarios son hidroquinona, benzoquinona y catecol, pero el principal producto es el

ácido oxálico.

- Oxidación con peróxido de hidrógeno: el H2O2 tiene una cantidad de oxígeno

efectiva, su costo es bajo, de fácil almacenamiento, manejo y sobre todo, amigable con el

ambiente. Sin embargo, la reactividad del H2O2 es generalmente baja y en gran parte

incompleta debido a su cinética.

Otra forma de empleo del H2O2 es en conjunto con una sal de hierro II (reactivo de

Fenton) para producir radicales hidroxilos, los cuales pueden oxidar compuestos

orgánicos en solución. Sin embargo, el monitoreo de la reacción de Fenton hace de éste un

proceso costoso e inhibe su uso común; además pueden producirse intermediarios mucho

más tóxicos que el propio fenol.

También existe la posibilidad de usar una polimerización oxidativa con H2O2 catalizada

por peroxidasas; sin embargo, el costo elevado de las enzimas limita su uso.

- Oxidación con otros químicos oxidantes: incluyen la oxidación con clorina, dióxido

de cloro y permanganato de potasio. Estos métodos no son amigables con el ambiente

debido a la formación de compuestos orgánicos clorados y a la dispersión de compuestos

como el Mn. Además de ser costoso, también requieren un control preciso de pH.

También se puede usar el ión ferrato (VI), el cual es un oxidante fuerte amigable con el

ambiente, pero su potencial redox decrece fuertemente por incremento de pH.

- La oxidación electroquímica: Es un proceso indirecto de electro-oxidación incluyendo

“electro-Fenton” (Mohan et al. 2007). Esta técnica puede oxidar efectivamente muchos

contaminantes orgánicos e inorgánicos en concentraciones altas de cloro. Es posible la

formación de compuestos intermediarios orgánicos clorados. El ozono también puede ser

usado como electro-oxidación, con la ayuda de mediadores (iones metálicos). Tanto la

electroxidación como la oxidación mediada por electro-Fenton, necesitan operar en medio

ácido para evitar la precipitación de los hidróxidos metálicos. Este método se ve limitado

por la adición de metales pesados que pueden formar contaminantes secundarios.

- La oxidación directa anódica por “oxígeno activo": Se basa en la electro-oxidación

de contaminantes aplicada directamente en ánodos por “oxígeno activo”. La adsorción

física del “oxígeno activo” puede causar una completa combustión de compuestos

6

orgánicos. La oxidación directa no necesita añadir una alta cantidad de químicos para

aguas residuales o colocar O2 para los cátodos. No tienden a producir contaminantes

secundarios y requiere muy pocos accesorios. Lo importante de una oxidación directa

(oxidación anódica) es el material del ánodo. Sin embargo, ninguno tiene suficiente

actividad y al mismo tiempo estabilidad.

- Oxidación fotocatalítica. También se puede destruir el fenol mediante la oxidación

catalítica, se han reportado conversiones de fenol significativas por luz UV sola. Sin

embargo, la actividad en la oxidación de fenol sobre la irradiación UV puede ser

fuertemente mejorada en presencia de fotocatálisis. El TiO2 tiene actividad fotocatalítica

y ha sido usado en la destrucción de contaminantes tóxicos del ambiente. Este es

económico, no tóxico, resistente a la foto-corrosión y tiene un alto poder oxidativo. Por

otro lado, permite la adsorción de contaminantes pero también la desorción de

intermediarios y productos. Existen otros métodos de destrucción de fenol que no son

oxidativos, como por ejemplo la gasificación de fenol en agua superficial, que consiste

en la conversión de material orgánico en productos gaseosos como el H2, CO, CO2 y

CH4. La aplicación de descargas electro-hidráulicas (EHD) y electrólisis también son

empleadas para la degradación de compuestos fenólicos.

La sonicación y cavitación hidrodinámica son sistemas que proveen energía para

destruir fenol en soluciones acuosas; sin embargo, son pobremente eficientes si son

empleadas solas, sin la co-presencia de oxidantes químicos.

Según la literatura existente, se han desarrollado pocas tecnologías basadas en la

utilización de organismos vivos para el tratamiento de aguas residuales procedentes de la

fabricación del corcho, a pesar que es una industria importante en Andalucía y

Extremadura. Adicionalmente, existen otras industrias importantes como, la extracción del

aceite a partir de la aceituna, que también son generadoras de gran cantidad de

compuestos fenólicos (Cabrera y col., 1996). La existencia de bacterias capaces de

degradar el fenol en soluciones puras e incluso en las aguas procedentes del hervido del

corcho sugiere una importante aplicación de estos microorganismos en la remediación de

estos residuos.

1.3.2. Métodos biológicos

Los procesos biológicos, como la biorremediación han recibido mayor atención debido a que

son amigables con el medio ambiente (Agarry & Solomon, 2008). Además, al trabajar con

7

tratamientos biológicos se evitan problemas secundarios en los efluentes, como es el caso de

los tratamientos físico-químicos, en los que se generan compuestos secundarios

potencialmente más tóxicos que el propio contaminante (Hidalgo et al., 2002; Suárez et al.,

2007; Saravanan et al., 2008). Actualmente, existen varios estudios relacionados con la

biodegradabilidad de fenol, aplicando tanto procesos aerobios como anaerobios (Bajaj et al.,

2008a; Lin et al., 2009). La biorremediación permite que los microorganismos transformen o

degraden compuestos peligrosos en agua y suelos (Muñoz et al., 2001). Muchas bacterias son

capaces de usar los compuestos aromáticos como única fuente de carbono y energía (Jiang et

al., 2004). Sin embargo, uno de los problemas que representa trabajar con fenol como única

fuente de carbono, es que el crecimiento microbiano puede sufrir una inhibición con el

sustrato, debido a que es usado en altas concentraciones; para combatir este problema se

puede colocar una fuente convencional de carbono, como la glucosa, extracto de levadura o

glutamato de sodio. Este tipo de compuestos incrementan la tolerancia celular al sustrato,

mejorando además la biodegradación de fenol. Muchos de los cultivos analizados son capaces

de degradar fenol en bajas concentraciones. Sin embargo, el fenol es tóxico para muchos tipos

de microorganismos en altas concentraciones y puede ser un inhibidor para su crecimiento.

Por lo tanto, para obtener mejores resultados, la concentración de fenol necesita ser mantenida

bajo los límites de toxicidad y se requiere de una aclimatación de los microorganismos en el

ambiente del agua residual. En el ecosistema las bacterias pueden eliminar rápidamente el

fenol, generalmente es eliminado en aire (1–2 días), en agua (9 días) y en suelo (2–5 días)

(Busca et al., 2008). Existen varias géneros bacterianos capaces de degradar fenol, entre ellos

podemos nombrar, Pseudomonas, Acinetobacter, Bacillus, Serratia, Alcaligenes,

Burkholderia, Geobacillus entre otros (Adrian y col., 2000. Hidalgo et al., 2002;

Arutchelvan, 2006; Agarry & Solomon, 2008; Van der Meer, 2008; Cordova, 2009). Sin

embargo, los compuestos haloaromáticos como los clorofenoles y pentaclorofenoles son

mucho más difíciles de degradar, aunque se conocen algunos microorganismos capaces de

realizar este proceso, tanto en condiciones aerobias como anaerobias, tales como

Sphingobium chlorophenolicum, Dechloromonas y Dehalococcoides (Smidt y de Vos, 2004;

Janssen y col., 2005; Van der Meer, 2008).

1.3.2.1 Biodegradación bajo condiciones aerobias

El primer paso de esta ruta consiste en la incorporación de grupos hidroxilos en el anillo

bencénico para lo cual los microorganismos han desarrollado una serie de rutas de oxidación,

8

deshalogenación, desnitración o desulfuración, que dan lugar a un intermediario dihidroxilado

susceptible a la acción de dioxigenasas específicas que provocan la apertura del anillo. Estos

derivados dihidroxilados serán canalizados por la ruta del catecol, en la que los intermediarios

(muchos derivados aromáticos se transforman en catecol) son metabolizados mediante la ruta

orto o meta, dependiendo de la posición en la que se efectué la apertura del anillo, o por la

ruta del gentisato. Los metabolitos finales entran directamente en el metabolismo

intermediario de la célula (Figura 1). El gentisato es un metabolito dihidroxilado

intermediario de compuestos aromáticos como el antranilato (Ladd, 1962) B-naftol (Walker y

Lippert, 1965), 3- y 4-hidroxibenzoato, salicilato (Crawford y cols., 1975),

nafialenodisulfonato (Whittich y cols., 1988), m-cresol, 2,5- y 3,5-xilenol (Hopper y

Chapman, 1970). En el primer paso de esta ruta catabólica interviene la gentisato 1,2-

dioxigenasa que provoca la apertura del anillo aromático dando lugar a maleilpiruvato que

puede degradarse directamente por el metabolismo microbiano o transformarse previamente

en flimarilpiruvato mediante isomerización.

Figura 1. Rutas aerobias de biodegradación de compuestos fenólicos (de Lorenzo y Rojo,

1994).

1.3.2.2 Biodegradación bajo condiciones anaerobias: Este tipo de biorremediación es la

preferida, debido al ahorro de energía usada en la aireación con producción de menores

cantidades de lodos (Fang et al., 2006).

Existen varias vías metabólicas de degradación de fenol bajo condiciones anaerobias, en este

caso el anillo aromático no es oxidado, pero sí reducido (Rigo & Alegre, 2004). En

condiciones mesófilas se han sugerido las siguientes vías, el fenol es convertido primero a

9

través de carboxilación para producir benzoato; después, es desaromatizado para formar

cicloheanocarboxilato, el cual es fraccionado para formar heptanoato y este es posteriormente

degradado a través de β-oxidación para formar valerato, propionato y acetato, o directamente

formar propionato y butirato, los cuales más tarde pueden ser degradados en acetato. Estas

vías metabólicas se basan en la presencia de enzimas que realizan reacciones de

carboxilación, descarboxilación y dehidroxilación durante la degradación anaerobia (Fang et

al., 2006).

En otra vía metabólica de degradación, el fenol es reducido en presencia de nitrato a

ciclohexanona y después a n-caproato, el cual subsecuentemente sufre una β-oxidación para

formar ácidos grasos volátiles (Figura 2. Fang et al., 2006). También, el fenol puede ser

transformado a benzoato por vía de carboxilación reductiva y después a través de la vía del

benzoil-CoA producir acetato e hidrógeno (Bell, J., Young, e., Stephens, S., 2011; Lob &

Tar, 2000).

Figura 2. Biodegradación anaerobia del fenol, vía del benzoato (Bell, J., Young, e.,

Stephens, S., 2011).

10

Figura 3. Biodegradación anaerobia del fenol a través de la vía de la ciclohexanona

2. Objetivos

El objetivo general de este trabajo es la realización de un estudio de la población bacteriana

aislada en las dos balsas presentes en el proceso de tratamiento del corcho: la balsa de

cocción, donde se sumergen las planchas de corcho para sucesivos hervidos, donde se

acumulan progresivamente compuestos fenólicos, y las balsas de almacenamiento, donde se

conservan las aguas residuales procedentes del proceso hasta alcanzar un volumen suficiente

para enviar a la planta de depuración. Así mismo hemos realizado aislamientos de

microorganismos aerobios, presentes en ambas balsas, entre los cuales hemos seleccionado

aquellos con mayor capacidad de crecimiento en presencia de fenol y clorofenoles, con los

que pretendemos diseñar un inoculante que permita la eliminación de los compuestos

fenólicos hasta niveles permitidos por la normatividad vigente, para que estas aguas

residuales tratadas puedan ser vertidas en las cuencas hidrológicas.

2.1 Objetivos Específicos

- Cuantificar fenoles totales en aguas residuales del hervido del corcho a través de métodos

espectrofotométricos.

- Aislar e identificar bacterias procedentes de aguas del hervido del corcho.

- Selección de un inoculo con capacidad de degradación de fenol.

- Optimización de las condiciones para la biodegradación del fenol, con el fin de diseñar un

sistema piloto de biorremediación, como alternativa al tratamiento físico–químico de las

aguas residuales del procesamiento del corcho.

3. MATERIALES Y METODOS

3.1 Determinación de polifenoles totales en aguas residuales del corcho

Se obtuvieron muestras de aguas residuales procedentes del procesamiento del corcho de la

empresa Aglomerados Morell, S.A (Villanueva del Río, Sevilla), para determinar la

11

concentración de fenoles totales. Estas muestras fueron esterilizadas por filtración y calor

húmedo para su posterior almacenamiento a -20ºC.

Se realizaron varias curvas de calibración para determinar la concentración de fenoles totales,

a partir de soluciones “stock” de 1000 ppm; de ácido tánico, ácido cafeico y fenol

(compuestos químicos que se encuentran en altas concentraciones en las aguas residuales del

procesamiento del corcho). La determinación de fenoles totales se realizó por dos métodos

espectrofotométricos: El método de Folin Ciocalteau (Box JD., 1983) y 4-aminoantipirina

(Lacoste et al. 1959).

- Método de Folin Ciocalteau: Se tomaron 10 mL de muestra: 1,5 ml de NaCO3 0,1 M: 0,5

mL de reactivo FC, se homogenizó y se esperó una hora para medir las absorbancias a 750

nm.

- Método 4-aminoantipirina: Se tomó 0,4 mL de cada muestra y se colocó 10 L de

hidróxido de potasio (KOH 0,1 M), 10 L de H2O2 30%; se homogenizó. Se añadió 0,5

mL de tampón fosfato potásico y se homogenizó. A continuación, en oscuridad se

adicionó 0,5 mL de solución de 4-aminoantipirina, se mezcló bien y posteriormente se

añadió 0,5 mL de solución de ferricianuro de potasio (K3Fe (CN)6), se homogenizó. Se

esperó 15 min y finalmente se tomó las lecturas de absorbancia de cada muestra a una

longitud de onda de 540 nm.

Las absorbancias obtenidas se extrapolaron en las curvas estándar preparadas y se determinó

la concentración de fenol presente.

3.2 Material biológico: Se utilizaron bacterias aisladas de las balsas de aguas residuales del

procesamiento del corcho procedentes de la empresa Aglomerados Morell, S.A (Villanueva

del Río, Sevilla). Las bacterias objeto de estudio se clasificaron según la balsa de

procesamiento de la siguiente manera:

a. Balsa de Cocción (BC), donde se mantienen las planchas de corcho a temperatura de 95ºC

hasta su reblandecimiento. A partir de esta balsa se aislaron las bacterias denominadas BC3,

BC4 y BC6.

b. Balsa de Almacenamiento (BA), donde se acumula el agua procedente del procesado del

corcho. A partir de este residuo se aislaron las bacterias denominadas BA3, BAC2, BAC4,

BAC5, BAC6 y BASTAF.

A si mismo parte de las muestras obtenidas de estas balsas se enriquecieron con medio TSB

en una proporción de 9:1 (muestra: TSB). El agua residual enriquecida con medio TSB se

incubó durante 48 horas a 28ºC, transcurrido este periodo se aislaron las siguientes bacterias.

12

c. Balsa de Cocción Enriquecida (BCE): A partir de este residuo se aisló la cepa bacteriana

BCE5A.

d. Balsa de Almacenamiento Enriquecida (BAE): Se aislaron dos bacterias denominadas

BAE9A y BAE5A.

e. Adicionalmente se estudiaron otras cepas bacterianas, VN2, VN10, VN20, VH1 y VH2,

provenientes de sedimentos de balsas de cocción de Villanueva del Río.

3.3 Aislamiento e identificación de microorganismos

Se hizo recuento de microorganismos en todas las muestras, tanto de BC y BA como de BCE

y BAE. De estas muestras se aislaron aquellos microorganismos que mostraban morfología

de las colonias diferente, tras incubarse 24 horas a 28 ºC en placas de TSA, identificándose

con las iniciales correspondientes a la balsa de la que procedían y un número. Los organismos

aislados se caracterizaron de forma preliminar mediante tinción de Gram. (Bergey, Holt,

Krieg, & Sneath, 1994).

3.3.1 Pruebas Bioquímicas

La caracterización bioquímica de los microorganismos en estudio se realizó mediante el

sistema de identificación comercial API (API20E, API20NE, API20STAPH de Biomérieux,

Rap ID de Oxoid), siguiendo la metodología recomendada por el fabricante.

3.3.2 Extracción de ADN: para realizar este procedimiento se empleó el kit de extracción

i.genomic CTB DNA Extraction mini kit, siguiendo las instrucciones del fabricante.

3.3.3 PCR 16S

Se amplificó la región ribosómica 16S. Para cada bacteria la reacción se preparó con las

siguientes concentraciones de reactivos en un volumen final de 25l: buffer a una

concentración final de 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 M de cada dNTP, 0,4 M de cada uno de

los primers específicos, 0,5 U/reacción de la enzima Taq polimerasa y 1 L de ADN a una

concentración aproximada de 40 ng/L. La reacción en el termociclador fue de 2 minutos a

95ºC, seguido de 31 ciclos de 45 segundos a 95ºC, 45 segundos a 58ºC y 45 segundos a 72ºC,

con un periodo de elongación final de 10 minutos a 72ºC. El resultado obtenido se observó en

gel de agarosa 1%, 100V, 30 minutos. El producto de la PCR se secuenció para determinar el

género y posible especie. Las secuencias obtenidas se compararon con las bases de datos de

13

secuencias disponibles, Ez – Taxon, RDP y también se utilizó la herramienta BLAST de la

página WEB del NCBI, de este modo se buscaron las secuencias altamente homologas de la

base de datos de nucleótidos no redundante (nr).

3.4 Resistencia a fenol y clorofenoles

La resistencia de los aislamientos a fenoles y clorofenoles se determinó en el medio TSA

suplementado con concentraciones crecientes de estos compuestos, que van desde 0-15 mM

(fenol), 0-4 mM (4-clorofenol) y 0-3 mM (2,4-diclorofenol). Las placas fueron incubadas a 28

ºC durante 3 a 4 días. La resistencia se expresa según el índice MTC, que es la máxima

concentración del tóxico que permite el crecimiento bacteriano.

3.5 Degradación de fenol

La capacidad de degradación de fenol se probó en medios de cultivo que contenían este

compuesto como única fuente de carbono.

- Protocolo 1: Degradación de fenol en solución acuosa. Las bacterias se cultivaron en

medio mínimo (Foght et al. 1989) durante 72 h a 28ºC en agitación constante a 200 rpm.

25 mL de medio mínimo suplementado (MMS) con fenol (2,5 mM), se inoculó con 100

L de las cepas bacterianas (aprox. 108 C.F.U. /mL), alícuotas de 2 mL fueron tomadas en

intervalos de 2 horas para medir la D.O a 600 nm y determinar el crecimiento bacteriano.

Las alícuotas fueron centrifugadas a 10.000 rpm durante 10 minutos y la concentración de

fenol se determinó en el sobrenadante por el método colorimétrico de la 4-aminoantipirina

(Lacoste et al. 1959).

- Protocolo 2: Degradación de fenol por bacterias inmovilizadas en partículas de

corcho. Una colonia bacteriana fue inoculada en 2 mL de TSB y se incubo a 28ºC por 24

horas en agitación. Luego en un tubo ependorf se tomó 60 L de la suspensión bacteriana

en medio TSB y se mezcló con 1 mL de medio mínimo, 150 L de fenol (1 mM) y

partículas de corcho estériles y se incubó a 28 ° C en agitación constante a 200rpm. Como

control se usó 150 L de fenol en 1 mL de medio mínimo estéril. Después de 12 días de

incubación las partículas de corcho se pasaron por un colador y se extrajo el sobrenadante

de cada tubo mediante centrifugación a 10000 rpm por 15 minutos para obtener un

sobrenadante libre de bacterias y así evitar interferencias en la determinación del fenol

mediante el método colorimétrico 4-aminoantipirina (Lacoste et al. 1959).

14

3.6 Actividades Enzimáticas de la ruta aerobia de degradación del fenol

La actividad fenol hidroxilasa, catecol 1,2-dioxigenasa y catecol 2,3-dioxigenasa se midieron

de la siguiente manera:

Cada cepa bacteriana se inoculó en medio de cultivo líquido TSB y tras 24 horas de

incubación, se adicionó 1,5 mL del medio TSB con crecimiento bacteriano en un matraz con

medio MMS suplementado con fenol 2,5 mM como única fuente de carbono. Los matraces

se mantuvieron a una temperatura de 28ºC en agitación constante a 200 rpm durante 12 días.

Posteriormente se centrifugaron las muestras a 10000 rpm por 5 minutos y se realizaron 5

lavados con tampón fosfato-potásico 50 mM pH 7 y cada bacteria se resuspendió en 1,6 mL

del mismo tampón conteniendo 1mM de PMSF y 100 M de DTT. Se realizó el rompimiento

de las células mediante sonicación (ultrasonido), las muestras se transfirieron a tubos de 5 mL

de volumen sumergidos en hielo y se sometieron a 5 ciclos de sonicación de 30 segundos,

separados por ciclos de 30 segundos de reposo. Luego se centrifugaron a 10000 rpm por 10

minutos y el sobrenadante correspondiente al extracto crudo de proteínas solubles se transfirió

a tubos limpios. Los ensayos enzimáticos se realizaron a una temperatura de 28ºC usando un

espectrofotómetro MARCA Pharmacia – LKB modelo Ultrospec III.

3.6.1 Fenol hidroxilasa: la oxidación de NADH en presencia del fenol en los extractos

celulares fue monitoreada a 340 nm. La mezcla de reacción contenía 250 L de tampón

fosfato-potásico 50 mM pH 7, 100 L de NADH (1 mM) y 500 L de extracto de proteína

(la reacción se equilibró a 55ºC durante una hora después de la adición de la muestra), se

midieron las absorbancias en el tiempo 0, a los 5, 10 y 15 minutos. Esta medida refleja las

actividades reductasas dependientes de NADH inespecíficas del extracto crudo.

Posteriormente se adicionaron 100 L de Fenol (10mM) y se midieron las absorbancias desde

el tiempo 0, y cada 10 minutos, hasta completar 3 horas. Una unidad de actividad es definida

como la cantidad de enzima que cataliza la oxidación de 1 mol de NADH por minuto

(Gibson et al. 1990).

3.6.2 Catecol 1,2-dioxigenasa: Para esta determinación se mezclaron 500 L de tampón

fosfato-potásico 50 mM pH 7, 100 L de catecol (10mM) y se equilibró la reacción a 55ºC

durante una hora después de la adición de 400 L de extracto de proteína. La formación de un

producto llamado ácido cis, cis-mucónico, se determinó mediante la absorbancia a 260 nm

15

(Ornston, et al. 1966). A través de mediciones seriadas desde el tiempo 0, y cada 5 minutos,

hasta completar una hora desde el inicio de la reacción. Una unidad de actividad es definida

como la cantidad de enzima que cataliza la producción de 1 mol de cis, cis-ácido mucónico

por minuto a 55 ºC.

3.6.3 Catecol 2,3-dioxigenasa: Las condiciones de reacción son idénticas al ensayo de la

catecol 1,2-dioxigenasa, excepto por la formación del 2-semialdehidohidroximucónico que

puede ser monitoreado a 375 nm (Masai, et al. 1995).

3.7 Formación de “biofilms” en partículas de corcho

La partículas de corcho fueron recogidas en terrenos de la industria del corcho (residuos de la

industria) se homogenizaron con una maquina moledora de café y fueron tamizadas para

lograr un tamiz de 0,5 mm, estas fueron lavadas con 25 mL de HCl (10 mM) por 10 minutos y

neutralizado con un volumen apropiado de NaOH (1M), se realizaron 5 lavados con agua

estéril y se secaron al aire. Se tomaron 15 ml de medio mínimo suplementado con 2,5 mM de

fenol y 0,15 gramos de partículas de corcho fueron inoculados con las bacterias que

mostraron mayor porcentaje de degradación de fenol y se incubaron por 12 días a 28ºC en

agitación constante a 200 rpm. Posteriormente las partículas fueron transferidas a cajas de

petri y lavadas 5 veces con agua destilada estéril y se secaron al aire para luego ser teñidas

con naranja de acridina (Johansson et al., 2008). La adhesión bacteriana a la superficie del

corcho se examinó con un microscopio de epifluorescencia (Olympus BX61) usando lente de

objetivo 100X y filtro verde TRITC.

La fijación bacteriana de todas las cepas fueron analizadas por SEM (Microscopia

Electrónica de Barrido), las partículas de corcho (0,01 gr) se inocularon con 1 mL de medio

mínimo, 150 L de fenol (1 mM) y 60 L de medio TSB con inoculo bacteriano (incubado

por 24 horas), esta mezcla se mantuvo a 28ºC por 12 días y en agitación constante de 200

rpm. Transcurrido este tiempo las partículas de corcho se lavaron 5 veces con agua destilada

estéril y se fijaron durante la noche en presencia de OsO4 y luego fueron tratadas con Au para

ser observadas en un microscopio electrónico de barrido Jeol 6460LV.

3.8 Optimización de las condiciones para la biodegradación del fenol

En base a los resultados obtenidos de la resistencia y degradación de fenol, así como la

capacidad de formación de “biofilms” en la superficie del corcho se seleccionó la cepa

16

BAE9A para determinar las condiciones óptimas en el proceso de biodegradación de fenol en

aguas residuales del corcho.

Se usaron dos tipos de controles, agua de corcho estéril, agua de corcho con medio TSB en

proporción (25mL: 2,5mL), agua de corcho con 250 L de H2O2, agua de corcho con 250 L

de H2O2 y 2,5 mL de TSB. La cepa BAE9A (200 L) fue inoculada con diferentes

cantidades de H2O2 (100, 150, 200, 250 y 1000 L), adición o no de medio liquido TSB (2,5

mL), y las muestras se mantuvieron en distintas condiciones de temperatura (25ºC, 28ºC y

37ºC), luz y oscuridad y en agitación constante a 200 rpm. Transcurridos 17 días de

incubación se cuantificó la cantidad de fenoles totales por los métodos de FC y 4–

aminoantipirina, usando como estándar el ácido tánico y el fenol, respectivamente. Después

de definir las condiciones ideales de incubación se realizó el mismo procedimiento con VN2,

VH1 y VH2. También se utilizaron dos consorcios bacterianos (BAE9A/BC4 y BAE9A/

BASTAF), que fueron incubados en un periodo de tiempo de 12 días.

4. RESULTADOS

4.1 Cuantificación de polifenoles totales en aguas residuales del hervido del corcho

La determinación de fenoles totales en las muestras obtenidas de las balsas del hervido de

corcho de la empresa Aglomerados Morell, S.A (Villanueva del Río), se realizó mediante los

métodos de Folin-Ciocalteau para el cual se usó como estándar el ácido tánico (el mayor

acido fenólico presente en aguas residuales del corcho) y 4–aminoantipirina, cuyo patrón de

calibración fue fenol y los resultados de la Tabla 1 muestran que el método FC es más

eficiente en la determinación de fenoles totales. El reactivo contiene fosfomolibdato y

fosfofungstato, sustancias que se usan para determinar compuestos polifenólicos (Polvoledo

& Gerletti, 1968; Berk & Schroeder, 1942; Pro, 1952; Englis et al., 1955; Swain & Hillis,

1959; Kloster, 1974; Chian, 1977). Es un método de estandarización para la determinación de

taninos y derivados de la lignina (APHA, 1971, 1976), lo cual lo hace específico para el

análisis de compuestos fenólicos en aguas residuales del corcho donde se encuentran un alto

porcentaje de sustancias derivadas de la lignina (componente principal del corcho) y de

compuestos tánicos. Sin embargo el método de la 4–aminoantipirina es muy sensible en la

determinación de fenoles (APHA, 1976), exceptuando los compuestos fenólicos que tienen

como sustituyente un grupo halógeno, carboxilo o metoxilo. En el caso de los nitrofenoles,

el grupo nitro en la posición meta inhibe la reacción y en la posición orto la bloquea (Faust &

17

Mikulewiez, 1967a), por lo cual usamos los dos métodos estándar para la determinación de

compuestos fenólicos, el FC y 4-aminoantipirina (APHA, 1971, 1976) en aguas residuales del

lavado del corcho.

Tabla 1. Cuantificación de polifenoles totales (mg.L-1

) en muestras de aguas residuales del

hervido de corcho de la empresa Aglomerados Morell, S.A (Villanueva del Río).

4.2 Aislamiento e identificación de bacterias procedentes de aguas residuales del

procesamiento del corcho:

Se analizaron 17 cepas bacterianas en total, de las muestras de las balsas de almacenamiento

(BA y BAE) y cocción (BC y BCE) se aislaron bacterias Gram negativas y Gram positivas, a

diferencia de las muestras obtenidas de sedimentos donde se identificaron solamente bacterias

Gram positivas. Entre los microorganismos presentes en aguas residuales del procesamiento

del corcho se encontraron bacterias Gram positivas como Bacillus, Arthrobacter y

Staphylococcus y Gram negativas como Stenotrophomonas, Acinetobacter, Serratia y

Enterobacter. La Tabla 2 muestra la identificación de los microorganismos mediante tinción

de Gram (Bergey, Holt, Krieg, & Sneath, 1994), sistema comercial API (API20E, API20 NE,

API STAPH de Biomérieux, Rap ID de Oxoid) y 16S, las secuencias obtenidas se compararon

con las bases de datos de secuencias disponibles, Ez–Taxón, RDP y también se utilizó la

herramienta BLAST de la página WEB del NCBI, los datos obtenidos en esta última base de

datos fueron los de mayor porcentaje de identidad.

Muestra agua de

corcho

FC –acido tánico

(mg.L-1

)

4 –aminoantipirina - fenol (mg.L

-1)

AC # 1 0,85 0,91

AC # 2 0,82 0,90

AC # 3 0,85 0,84

AC # 4 0,84 0,83

AC # 5 0,78 0,75

AC # 6 0,81 0,76

AC # 7 0,80 0,82

AC # 8 0,76 0,74

MEDIA 0,814 0,819

R2 0.9883 0.9865

18

Tabla 2. Resultados de las pruebas de tinción de Gram, API y 16S de bacterias aisladas de

aguas residuales del procesamiento del corcho

Figura 4. Tinción de Gram y API20NE de la cepa bacteriana BAE5A

CEPA GRAM Identificación presuntiva (API) 16 s (NCBI/ Ez – Taxón - RDP)

BA3 Bacilos Gram - Stenotrophomonas maltophila

Stenotrophomonas maltophila 100%

BAE5A Bacilos Gram - Acinetobacter baumannii/

calcoaceticus

Acinetobacter 98%

BAE9A Bacilos Gram - Acinetobacter baumannii/

calcoaceticus

Acinetobacter soli 99%

BASTAF Cocos Gram + Staphylococcus chromogenes Staphylococcus Warneri 99%

BAC2 Bacilos Gram + ND Bacillus cereus 99%

BAC4 Cocos Gram + Staphylococcus xylosus Staphylococcus saprophyticus 99%

BAC5 Bacilos Gram + ND Bacillus cereus 99%

BAC6 Cocos Gram + Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus sp. 98%

BC3 Cocobacilos Gram - Serratia marcescens Serratia sp. 98%

BC4 Cocobacilos Gram - Enterobacter cloacae Enterobacter sp. 98%

BC6 Bacilos Gram + ND Bacillus cereus / thuriengiensis 99%

BCE5A Bacilos Gram + ND Arthrobacter arilaitensis 99%

VN2 Bacilos Gram + ND Bacillus benzoevorans 98%

VN10 Bacilos Gram + ND Staphylococcus pasteuri 99%

VN20 Cocobacilos Gram + ND Microbacterium hydrocarbonoxydans/

carbonoxydans 99% VH1 Bacilos Gram + ND Bacillus weihenstephanensis 93%

VH2 Bacilos Gram + ND Pseudomonas putida 98%

API20NE

19

4.2.1 Caracterización bioquímica de bacterias procedentes de aguas residuales del

procesamiento del corcho.

Tabla 3. Resultados de las pruebas bioquímicas de la galería API20NE y API20E para las

bacterias Gram negativas

Figura 5. Imagen de los resultados del API20NE y API20E para bacterias Gram negativas

API20NE API20E

NO –ENTEROBACTERIAS BAE5A BAE9A BA3 ENTEROBACTERIAS BC3 BC4

REDUC. DE NITRATOS A NITRITOS + + + B – GALACTOSIDASA + +

REDUC. NITRATOS – NITROGENO - - - ARGININA –

DIHIDROXILASA

- +

FORMACION DE INDOL - - - LISINA –

DesCARBOXILASA

+ -

FERMENTACION DE GLUCOSA + + - ORNITINA-

DesCARBOXILASA

+ +

ARGINININA DIHIDROLSA - - - CITRATO + +

UREASA - + - PRODUCCION DE H2S - -

HIDROLASA - - + UREASA - -

B – GLUCOSIDASA - - - TRIPTOFANO

DEAMINASA

- -

PROTEASA - - + PRODUCCION- INDOL - -

ASIMILACION DE GLUCOSA - - - PROD. DE ACETOINA + +

ARABINOSA - - - GELATINASA + -

MANOSA - - - FER. GLUCOSA + +

MANITOL - - - MANITOL + +

N – ACETIL GLUCOSAMINA - - - INOSITOL + -

MALTOSA - - + SORBITOL + +

GLUCONATO POTASICO - - - RHAMNOSA - +

ACIDO CAPRICO - - - SACAROSA + +

ACIDO ADIPICO - + - MELIBIOSA + +

MALATO - + - AMYGDALINA + +

CITRATO SODICO - + - ARABINOSA - +

AC. FENILACETICO - + - OXIDASA - -

OXIDASA - - - CATALASA + +

CATALASA

+ + + - - -

20

Tabla 4. Resultados de las pruebas bioquímicas de la galería API STAPH para cocos Gram

positivos/catalasa +

4.3 Resistencia a fenoles y clorofenoles

En todas las bacterias aisladas se probó su resistencia a compuestos fenólicos. Los resultados

se muestran en la Tabla 5. La resistencia a fenol fue variable que va desde una concentración

de 5 a 15 mM. Dos cepas fueron capaces de crecer en la concentración máxima probada

(BAE9A y VN10). La resistencia a los clorofenoles se determinó en las 17 cepas. Las cepas

más resistentes al 4–clorofenol fueron BC4, BC6, BCE5A y VH2 y al 2,4–diclorofenol fueron

VN2, VN10 y VH2.

APISTHAP

BASTAF

BAC4

BAC6

VN10

D – GLUCOSA + + + +

FRUCTOSA + + + -

MANOSA + + - -

MALTOSA + + + -

LACTOSA + + + -

TREHALOSA + + + -

MANITOL - + + -

XILITOL - - - -

MELIBIOSA - - - -

REDUCCION DE NITRATOS A

NITRITOS

- + - -

FOSFATASA ALCALINA + + - +

ACETIL- METIL-CARBINOL - + + -

RAFINOSA - - - -

XYLOSA - + - -

SACAROSA + + + -

METIL – GLUCOPIRANOSIDA - - - -

N – ACETIL - GLUCOSAMINA - + + -

ARGININA DiHIDROLASA + - - +

UREASA + + - -

OXIDASA - - - -

CATALASA + + + +

21

Tabla 5. Resistencia al fenol de bacterias aisladas de aguas residuales del lavado del corcho

Figura 6. Imagen de placas control y bacterias resistentes a una concentración de 15 mM de

Fenol

CEPA

Máxima identidad ( 16S r DNA)

CMT (mM)

fenol 4–clorofenol 2,4–diclorofenol

BA3 Stenotrophomonas maltophila 100% 5,0 1,0 1,0

BAE5A Acinetobacter sp. 100% 7,5 1,0 1,0

BAE9A Acinetobacter soli 100% 15,0 2,0 1,5

BC3 Serratia spp. 98% 7,5 1,0 1,0

BC4 Enterobacter sp. 98% 7,5 2,5 2,0

BC6 Bacillus cereus/ thuriengiensis 99% 10,0 2,5 2,0

BCE5A Arthrobacter arilaitensis 99% 5,0 2,5 1,0

BASTAF Staphylococcus warneri 99% 7,5 1,0 1,5

BAC2 Bacillus cereus 99% 10,0 2,0 1,0

BAC4 Staphylococcus saprophyticus 98% 7,5 1,5 2,0

BAC6 Staphylococcus sp. 98% 10,0 1,5 2,0

VN2 Bacillus benzoevorans 99% 12,5 2,0 2,5

VN10 Staphylococcus pasteuri 99% 15,0 2,0 2,5

VN20 M. hydrocarbonoxydans/carbonoxydans 99% 7,5 1,5 1,0

VH1 Bacillus weihenstephanensis 93% 5,0 1,0 1,0

VH2 Pseudomonas putida 98% 12,5 2,5 2,5

22

4.4 Consumo de fenol en medio líquido

La habilidad bacteriana para degradar fenoles se investigó en dos niveles, primero se analizó

la capacidad de las 17 cepas de utilizar el fenol como única fuente de carbono y energía (Fig.

7) y en segundo lugar se determinó las actividades de las primeras enzimas implicadas en la

degradación de fenol, la fenol hidroxilasa, las catecol 1,2 dioxigenasa y la catecol 2,3

dioxigenasa, con el fin de conocer si la ruptura del anillo aromático se produce en la posición

orto o meta.

4.5 Degradación de fenol

Las cepas fueron cultivadas en medio mínimo suplementado con 2,5 mM de fenol como

única fuente de carbono y energía. La densidad óptica a 600 nm se midió como un parámetro

de crecimiento bacteriano. Por otro lado, se evaluó la desaparición de fenol en el medio de

cultivo. Los resultados se muestran en la Figura 8. La capacidad de crecer en fenol como

única fuente de carbono varía entre cepas. En la mayoría de cepas se observó un retraso del

crecimiento de 2h-4h aproximadamente, Después de este período algunas cepas como:

BAE9A, VN2, VN10, VN20, VH1 y VH2 mostraron una tasa de crecimiento rápido en

presencia de fenol. Por el contrario, BA3, BAE5A, BASTAF, BAC2, BAC4, BAC5, BAC6,

BC3, BC4, BC6 y BCE5A mostraron una fase de latencia más larga (6 horas) y una tasa de

crecimiento más lento en comparación con las cepas anteriores. BAE9A, VN2, VH1 y VH2

parecen ser las bacterias degradadoras de fenol más eficientes. Una disminución significativa

de fenol se detectó después de 8 horas con las otras cepas bacterianas (Fig. 8).

Figura 7. Concentración final de fenol en medio liquido expresado en (%) de cepas

bacterianas aisladas de aguas residuales del corcho

23

Figura 8. Degradación de fenol por bacterias aisladas de aguas residuales del procesamiento

del corcho

CRECIMIENTO

BACTERIANO D.O 600

FENOL EN EL

SOBRENADANTE D.O 540

24

4.6 Determinación de actividades enzimáticas de la vía aerobia de la degradación del fenol

En todas las bacterias capaces de crecer en presencia del fenol se midió la actividad de la

fenol hidroxilasa. Las cepas que tienen el nivel más alto de actividad enzimática fueron VH1

y BAE9A (Fig. 9), coincidiendo con las de mayor consumo de fenol y tolerancia, seguidas por

BC3 y BC4 que son bacterias capaces de crecer en un medio con fenol como única fuente de

carbono y energía (Figura 8). La menor actividad fenol hidroxilasa se observó en las cepas

VN10, VN20, BAE5A y BCE5A, mientras que BA3 y BC6 muestran niveles casi

indetectables (Fig.9). No se observó actividad fenol hidroxilasa utilizando NADPH como

donante de electrones en ninguna de las cepas.

Las actividades enzimáticas catecol 1,2 y 2,3 dioxigenasas también fueron mediadas en todas

las cepas para saber si la ruptura del anillo ocurría en la posición orto o meta. La actividad de

la catecol 2,3 dioxigenasa mostró un valor superior respecto a la a la catecol 1,2 dioxigenasa

(Tabla 6). Sin embargo, en algunas cepas como BC6, BA3, BAE5A y BASTAF, la diferencia

de valores entre la vía meta y orto es muy alta, lo que indica que la degradación de fenol se da

principalmente por la vía meta. Por el contrario, cepas como (BAC2, VN20 y VH2) parecen

llevar a cabo la degradación de fenol por las dos vías, de forma simultánea. La cepa BAE9A

mostró los niveles más altos de degradación de fenol en medio de cultivo. Estos datos

fueron confirmados con la determinación de la concentración final de fenol que queda en el

sobrenadante de los cultivos, evidenciando que BAE9A es una bacteria degradadora de fenol

muy eficiente, ya que sólo el 20% de fenol se mantuvo en el sobrenadante después de 5 días

de incubación (Figura 7).

25

Figura 9. Actividad fenol hidroxilasa de bacterias aisladas del agua residual del hervido del

corcho.

NADH – FENOL

HIDROXILASA

26

Tabla 6. Actividades enzimáticas de la vía de degradación del fenol en extracto crudo de

bacterias procedentes de aguas residuales del procesamiento del corcho.

Bacteria Fenol

hidroxilasa

(mU. mL-1

)

Catecol 1,2–

dioxigenasa

(mU. mL-1

)

Catecol 2,3-

dioxigenasa

(mU. mL-1

)

Relación

meta/orto

BA3 0,20 0,05 1,90 38,0

BAE5A 1,80 0,11 4,60 42,0

BAE9A 4,75 1,43 37,5 27,0

BC3 2,20 0,40 2,10 5,3

BC4 3,50 0,43 2,00 4,7

BC6 0,07 0,10 5,70 57,0

BCE5A 1,50 0,40 2,50 6,3

BASTAF 2,11 0,05 2,6 52,0

BAC2 2,00 1,52 2,30 1,5

BAC4 2,30 0,60 2,40 4,0

BAC5 2,30 0,50 2,00 4,0

BAC6 2,20 0,30 1,90 6,3

VN2 2,30 0,30 5,20 17,3

VN10 1,40 0,80 4,00 5,0

VN20 1,00 0,80 1,80 2,3

VH1 6,10 1,00 4,80 4,8

VH2 2,00 0,80 1,30 1,6

4.7 Formación de “biofilms” sobre partículas de corcho

En las industrias del corcho, por lo general hay una capa residual de partículas de corcho

pequeñas en el suelo, que son residuos del proceso de fabricación. También hay algunas

piezas de corcho de baja calidad, espesor inadecuado u otros defectos, estas partículas

podrían ser utilizadas como soporte para la inmovilización de las bacterias. La capacidad de

formar “biofilms” en la superficie de las partículas de corcho fue evaluada. Las cepas

bacterianas se incubaron con pequeñas partículas de corcho y crecieron en presencia de fenol

2,5 mM como única fuente de carbono, con el fin de evaluar el efecto de este compuesto en la

fijación de las bacterias a las partículas de corcho. Cuando se observó bajo el microscopio de

fluorescencia, las partículas control incubadas sin bacterias mostraron un nivel de fondo de

autofluorescencia (Figura 10.A), con zonas verdes oscuras. Sin embargo, cuando las

27

partículas de corcho se incubaron en presencia de bacterias, se observó una intensa

fluorescencia verde (Fig. 10.B). En la figura 10 C.D. Podemos observar la adhesión de un

gran número de bacterias a la superficie del corcho.

También hemos confirmado la inmovilización bacteriana en las partículas de corcho residual

por medio de microscopia electrónica de barrido (Fig. 11). La estructura del corcho contiene

una gran superficie de pared celular vegetal que parece ser un material adecuado para

inmovilización bacteriana (Fig. 11 A, B). De hecho, hemos observado que la cepa BAE9A,

que es una degradadora de fenol eficiente, es capaz de colonizar y crecer sobre las de

partículas de corcho, con una cobertura superficial muy alta (Fig. 11C). Otra cepa bacteriana

con resistencia y capacidad de degradación de fenol intermedia, como BC6 mostró una menor

densidad sobre la superficie del corcho (Fig. 11D). Estos resultados indican que las partículas

de corcho son un soporte adecuado para inmovilizar las bacterias aisladas de aguas residuales

del procesamiento de dicho material. (Fig.12).

Figura 10. Evaluación de formación de “biofilms” sobre partículas de corcho incubadas con

bacterias en MMS suplementado con fenol 2,5 mM. La fijación bacteriana se observó

mediante tinción de naranja de acridina. A. Control; partículas de corcho incubadas con

medio sin bacterias, que muestra el nivel de autotofluorescencia de las partículas, B.

partículas de corcho incubadas con la cepa BCE5A, C y D. adhesión bacteriana en la

superficie del corcho; C (BC6) y D (BC4).

C C

A B

D

28

Figura 11. Evaluación de la formación de “biofilms” sobre la superficie del corcho por SEM.

A. Estructura de partícula de corcho. B. Control sin bacterias. C. Colonización de la superficie

del corcho por la cepa BAE9 A. D. Colonización de la superficie del corcho por la cepa BC6.

Figura 12. Capacidad de colonización y adhesión sobre la superficie de partículas de corcho

4.8 Optimización de condiciones para la degradación del fenol

Por medio de los métodos de FC y 4–aminoantipirina se determinó la concentración de

fenoles totales en muestras de agua de corcho inoculadas con BAE9A, VN2, VH1 y VH2

(cepas de estudio con mayor resistencia y degradación de fenol), bajo diferentes condiciones

VN10

A B

C D

VN10

29

de temperatura, luz, adición de glucosa (TSB), H2O2 y con un periodo de incubación de 17

días. Los resultados obtenidos mostraron que las condiciones ideales que le permiten a las

cepas BAE9A, VN2, VH1 y VH2 degradar con mayor eficiencia compuestos fenólicos son:

- Adición de una fuente mínima de glucosa a la muestra de agua de corcho en una

proporción de (1:10), ya que al aumentar la cantidad de glucosa adicional se puede

inhibir la utilización del fenol como fuente de carbono y energía.

- Adición de H2O2 (250 L) para potenciar la reacción enzimática microbiana, pero al

aumentar la cantidad de H2O2 hasta 1 mL se observa una disminución en la degradación

de compuestos fenólicos por parte de las cepas bacterianas analizadas. Esta disminución

se puede deber al efecto tóxico del H2O2 a ésta concentración.

- Las condiciones de temperatura de 28ºC y luz constante durante el periodo de incubación,

fueron las que mostraron mejores resultados de degradación en las cepas BAE9A, VN2,

VH1 y VH2 (Fig. 13).

Figura 13. Optimización de condiciones de incubación para bacterias degradadoras de

fenol aisladas del agua residual del hervido del corcho

Matraz A. Control de agua de corcho estéril

Matraz B. Temperatura 28ºC, luz, TSB, H2O2 y BAE9A.

Matraz C. Temperatura 28ºC, oscuridad, H2O2, TSB y

BAE9A.

Matraz D. Temperatura 37ºC, luz, H2O2, TSB y BAE9A.

Matraz E. Temperatura 25ºC, luz/ oscuridad, H2O2, TSB,

y BAE9A.

A B C D E

30

Por el método FC (estándar: acido tánico) y bajo las condiciones óptimas mencionadas

anteriormente BAE9A degradó el 76% (0,19 mg/L), VN2 el 70% (0,24 mg/L), VH1 el 60%

(0,32 mg/L) y VH2 el 62% (0,31 mg/L) y por el método 4–aminoantipirina (estándar: fenol),

BAE9A degradó el 61% (0,32 mg/L), VN2 el 54% (0,37 mg/L), VH1 el 47% (0,43 mg/L) y

VH2 el 51% (0,39 mg/L) de fenoles totales presentes en las muestras de agua de corcho

analizadas ( Fig. 14).

Figura 14. Determinación de polifenoles totales en las cepas BAE9A, VN2, VH1 y VH2

El uso de dos consorcios bacterianos (BAE9A/BC4 y BAE9A/BASTAF) mostró un aumento

de la degradación de compuestos fenólicos, ya que bajo las mismas condiciones de incubación

(excepto el tiempo: 12 días) y por el método de FC, BAE9A degrada 53% (0,38 mg/L), el

consorcio BAE9A/BC4 degrada el 73% (0,23 mg/L) y BAE9A/BASTAF degrada el 72%

(0,24 mg/L). Por el método de la 4–aminoantipirina BAE9A degrada 41% (0,48 mg/L),

BAE9A/BC4 degradan el 52% (0,40 mg/L) y BAE9A/BASTAF degradan el 44% (0,46 mg/L)

de fenoles totales presentes en el agua residual del lavado del corcho.

Figura 15. Determinación de polifenoles totales en agua de corcho inoculada con dos

consorcios bacterianos (BAE9A/BC4 y BAE9A/BASTAF)

31

DISCUSIÓN

La producción del corcho es una industria muy importante en Extremadura y Andalucía, y

está constituida por pequeñas empresas. El hervido del corcho genera residuos tóxicos que

contienen altas concentraciones de fenoles y clorofenoles (Benítez et al., 2006; Domínguez et

al., 2007; Pintor et al., 2011). Las aguas residuales se almacenan en grandes tanques cerca de

las industrias del corcho y se transportan en contenedores a una estación de depuración

común. La remediación de las aguas residuales antes de verterlas en los afluentes naturales se

encuentra estipulada en las leyes ambientales. Los procedimientos físico–químicos para el

tratamiento de aguas residuales son de alto consumo energético y son muy costosos,

especialmente para las pequeñas empresas.

La biorremediación permite el uso de microorganismos para la recuperación del suelo y el

agua como una alternativa frente a los métodos físico-químicos tradicionales (Singh y Ward,

2004; Stapleton y Singh, 2002). La biorremediación es un método con una aceptación cada

vez mayor, tanto a nivel científico como público, siendo rentable, efectiva y amigable con el

medio ambiente. Muchos microorganismos con capacidad para degradar compuestos

fenólicos han sido descritos, tanto en condiciones aeróbicas (Pseudomonas, Burkholderia,

Sphingomonas, Ralstonia, Arthrobacter, Acinetobacter, Alcaligenes, Microbacterium), como

anaeróbicas (Desulfitebacterium, Dehalomonas, Dehalococcoides, Dehalobacter) (Bunge,

2003; Chan et al, 2003; Díaz, 2004; Furukawa, 2003; Parvanov y Topalova de 2008, Van der

Meer, 2008; Wang et al, 2005).

A pesar de esto, hay poca información disponible sobre el uso de microorganismos para la

remediación de las aguas residuales del procesamiento de corcho. Algunos estudios

preliminares han llevado a cabo el aislamiento de bacterias Gram negativas como

Pseudomonas, Klebsiella, Stenotrophomonas y Burkholderia de este residuo (Días-Machado

et al., 2006). Estas bacterias se han utilizado, en combinación con ozono y se ha logrado la

eliminación de hasta un 90% de carbono orgánico total de las aguas residuales de corcho.

En este trabajo, se han aislado bacterias aerobias cultivables a partir de aguas residuales de la

industria del corcho. Todas las cepas fueron analizadas en cuanto a su capacidad de resistir y

degradar fenol. Las cepas fueron identificadas y se encontraron bacterias Gram negativas

como Acinetobacter, Enterobacter, Serratia y Stenotrophomonas y algunas bacterias Gram

positivas como Arthrobacter y Bacillus. Se ha descrito que estos géneros bacterianos son

degradadores de fenol y clorofenoles (Solyanikova y Golovleva, 2004).

32

La resistencia al fenol en estas bacterias es variable, entre 2,5 y 15 mM; dos cepas fueron

capaces de tolerar 15 mM fenol. Varias cepas fueron capaces de crecer en presencia de fenol

como única fuente de carbono. Para saber, si las bacterias eran capaces de degradar el fenol

además de tolerarlo, se han llevado a cabo experimentos de consumo de fenol, determinando

el fenol residual que queda tras la incubación. Algunos microorganismos como VN20

degradan bajas concentraciones de fenol (88% de fenol queda en la disolución), mientras

BAE9A es capaz de degradar eficientemente el fenol (reduce la concentración de fenol al

20%). La presencia de actividad fenol hidroxilasa, la primera enzima en la ruta de

degradación aerobia del fenol, se confirmó en todas las cepas en estudio. Un análisis

preliminar también se realizó con el fin de saber si la vía de degradación siguió la ruta orto o

meta. Algunas de las cepas parecen degradar fenol, principalmente por la vía meta como

(BA3, BAE5A, BC6 Y BASTAF), mientras que algunas otras como (BAC2,VN20 y VH2),

parecen usar las dos vías simultáneamente.

La capacidad de formar “biofilms” es una característica importante para una cepa bacteriana

que va ser usada en la biorremediación de aguas residuales. Bacterias inmovilizadas son más

estables que las bacterias de vida libre, y son capaces de realizar la degradación de

contaminantes por períodos más largos y de una manera más eficiente. La Inmovilización

mejora la viabilidad, la durabilidad y la estabilidad de los cultivos microbianos para la

biorremediación (Fantroussi y Agathos, 2005; Tavares dos Passos et al 2010). Diferentes

productos residuales han sido utilizados como soportes para inmovilizar cultivos, tales como

tuberías, columnas de relleno, carbón activado granulado, cáscara de coco, etc. (Amuda e

Ibrahim, 2006; Carvalho et al 2001; Chan et al, 2003; Eker y Kargi, 2006; Shieh et al, 1990;

Wobus et al, 1995). Por lo tanto, la capacidad de formar biofilms se puso a prueba, sobre la

superficie del corcho. Las partículas de corcho que tienen una distribución de tamaño

insuficiente para ser utilizadas en la fabricación de aglomerados son quemadas para producir

energía (Gil, 1996), por lo cual, planteamos la posibilidad de usar estas partículas como

soporte de inmovilización bacteriana, puesto que varias cepas fueron capaces de multiplicarse

y colonizar la superficie del corcho en presencia de fenol como única fuente de carbono y

energía.

Teniendo en cuenta todos los resultados anteriores (resistencia y capacidad de degradación de

fenol y clorofenoles, y la formación de “biofilms” en la superficie del corcho), finalmente,

cuatro cepas bacterianas (BAE9A, VN2, VH1 y VH2) fueron consideradas como las mejores

candidatas para diseñar un sistema de auto-biorremediación, basado en la degradación de

fenoles y clorofenoles por bacterias inmovilizadas en partículas de corcho.

33

Cuando un procedimiento de biorremediación se va a diseñar, es importante la obtención de

una ganancia económica adicional. En nuestro trabajo es posible lograr este objetivo, porque

existe gran cantidad de partículas de corcho en el suelo de dicha industria, que son el

resultado de los diferentes tratamientos de este material, siendo un producto residual. En

nuestro caso, el sistema de auto-biorremediación propuesto tiene ventajas como, el uso de

bacterias nativas de las balsas de procesamiento del corcho y la utilización de partículas

residuales, como soporte para la inmovilización bacteriana. Las condiciones para mejorar la

detoxificación de fenol (temperatura, luz, consorcio bacteriano y adición de nutrientes, etc)

fueron optimizadas y se ha constatado que las mejores condiciones son:

- Consorcio bacteriano compuesto por BAE9A/BC4 inmovilizados en partículas de corcho

- Adición de medio de cultivo (10%V:V)

- Temperatura de 28 ºC y luz constante

- H2O2 (3,3 g/mL)

Por otra parte, es importante resaltar que existen otras actividades industriales en nuestra

región que también generan aguas residuales con un alto contenido de compuestos fenólicos,

tales como la extracción de aceite de oliva (Cabrera et al, 1996) o la fabricación de fármacos,

papel, carbón, refinerías, explosivos, producción de celulosa y madera, tintorerías,

manufactura de plaguicidas y herbicidas, plásticos y resinas, entre otros (Moussavi et al.,

2009; Patel & Rajkumar, 2009; Varma & Gaikwad, 2009). Se podría suponer que un sistema

similar al propuesto en este trabajo podría ser diseñado para aguas residuales de diferentes

industrias.

34

CONCLUSIONES

1. Se han aislado e identificado bacterias del agua residual del hervido del corcho.

Corresponden a géneros/especies conocidos como degradadores de compuestos fenólicos.

2. Algunas de estas bacterias presentan elevada resistencia a fenol y clorofenoles, y pueden

utilizar el fenol como única fuente de carbono y energía.

3. La inmovilización de bacterias en partículas residuales de corcho ha demostrado ser un

método adecuado y de bajo coste para la auto-biorremediación de este residuo.

4. Se han optimizado las condiciones de degradación: consorcio bacteriano inmovilizado en

partículas de corcho, adicionando al agua residual una mínima cantidad de medio de

cultivo y agua oxigenada en presencia de luz y a 28 ºC.

35

BIBLIOGRAFIA

Adrian, L., Szewzyk, U., Wecke, J. and Görisch, H. 2000

Bacterial dehalorespiration with chlorinated

benzenes. Nature, 408, 580–583

Agarry, S. & Solomon, B. (2008). Kinetics of batch

microbial degradation of phenols by indigenous

Pseudomonas fluorescence. Int. J. Environ. Sci. Tech.

5(2). 223-232

Agency for Toxic Substances and Disease Registry

(2008abc). Public health statement. Phenol. CAS #

108-95-2. Department of Health and Human Services.

Public Health Service. Unites States

Amjad, A. & Qay Y. (2007). Potential of plant

polyphenol oxidases in the decolorization and

removal of textile and non-textile dyes. Journal of

Environmental Sciences. 19. 396-402.

Amuda, O.S. and Ibrahim, A.O. 2006 Industrial

wastewater treatment using natural material as

adsorbent. African Journal of Biotechnology 5 (16),

1483-1487.

Arutchelvan, V., Kanakasabai, V., Elangovan, R.,

Nagarajan, S. & Muralikrishnan, V. (2006). Kinetics of

high strength phenol degradation using Bacillus

brevis. Journal of Hazardous Materials. B129. 216-

222.

Bajaj, M., Gallert, C., & Winter, J. (2008) Phenol

degradation kinetics of an aerobic mixed cultures.

Biochemical Engineering Journal, 46, 205-209.

Bell, J., Young, e., Stephens, S., (2011). The anaerobic

phenol degradation of toluene and phenol.

Biocatalysis/ Biodegradation Datebase. University of

Minnesota.

Beltrán de Heredia, J., Domínguez, J.R. y Lopez R.,

“Treatment of Cork Process Wastewater by a

Successive Chemica Physica Method”.J. Agric. Food

Chem. 52 (14), 4501 – 4507 (2004).

Benitez, F.J., Acero, J.L., Garcia, J. and Leal, A.I. 2003

Purification of cork processing wastewaters by ozone,

by activated sludge, and by their two sequential

applications. Water Research, 37, 4081–4090.

Benitez, F.J., Acero, J.L., and Leal A. I. 2006 Application

of microfiltration and ultrafiltration processes to cork

processing wastewaters and assessment of the

membrane fouling. Separation and Purification

Technology, 50, 354–364.

Benitez, F.J., Leal, A. I, Real. F .J., Acero, J. L and

Roldan G. 2008 Elimination of organic matter present

in wastewaters from the cork industry by membrane

filtration. Journal of Chemical Technology and

Biotechnoogy, 83, 309–316.

Bergey, D., Holt, J., Krieg, N., & Sneath, P. H. (1994).

Bergey's.Manual of Determinative Bacteriology (9ª

ed. ed.).

Berk A. A & Schoeder W. C. (1942) Determination of

tannin subtances in boiler waters. Ind. Engng. Chem.

14, 456-459.

Bianchi, T. S., M. Argyrou & H. F. Chippett. 1999.

Contribution of vascular-plant carbon to surface

sediments across the coastal margin of Cyprus

(eastern Mediterranean). Organic Chem. 30(5): 287-

297.

Box JD. Investigation of the Folin-Ciocalteau phenol

reagent for the determination of polyphenolic

substances in natural waters. Water Res 1983;

17:511-25.

Busca, G., Berardinelli, S., Resini, C. & Arrighi, L.

(2008). Review Technologies for the removal of

phenol from fluid streams: A short review of recent

developments. Journal of Hazardous Materials 160,

265-288.

Cabrera, F., Lopez, R. Martinez - Bordiú., A., Dupuy de

Lome, E. and Murillo, J.M. 1996. Land treatment of

olive oil mill wastewater. International

Biodeterioration and Biodegradation, 38, 215 - 225

Carvalho, M. F., Vasconcelos, I., Bull, A. T. and Castro,

P. M. L. 2001. A GAC biofilm reactor for the

continuous degradation of 4-chlorophenol: treatment

efficiency and microbial analysis. Applied

Microbiology and Biotechnology 57, 419–426.

Chang, C. C., Tseng, S. K., Chang C. C. and Ho, C. M.

2003 Reductive dechlorination of 2 - chlorophenol in

a hydrogenotrophic, gas - permeable, silicone

membrane biorreactor Bioresource Technology 90,

323–328.

Chen, C., Wu, J. & Liu, W. (2008). Identification of

important microbiol populations in the mesophilic

36

and thermophilic phenol-degrading methanogenic

consortia. Water Research. 42. 1963-1976.

Chian E. S. K. (1977) Stability of organic matter in

landfill leachates. W.ater Res 11, 225-232.

Cordova, S., Dams, R., Cordova, E., Radetski, M.

Corrêa, A., & Radetski, C. (2009). Remediation of

phenol-contaminated soil by a bacterial consortium

and Acinetobacter calcoaceticus isolated from an

industrial wastewater treatment plant.

Crawford, R.L. Hutton, S.W y Chapman, P.J. 1975

J. Bacteriology. 121, 794 – 799. Madrid,

Días - Machado, M., Madeira, L.M., Nogales B. Nunes,

O.C., Manaia, C.M., “Treatment of cork boiling

wastewater using chemical Oxidation and

Biodegradation”

Dominguez, J. R., González T., García H. M., Sánchez-

Lavado F. and Beltrán De Heredia J. 2007

Aluminium sulfate as coagulant for highly polluted

cork processing wastewaters: removal of organic

matter. Journal of Hazardous Materials, 148, 15-21

Dong, Q. H., He, L., Jiang, X. and Li, S. 2008

Characterization of phenol-degrading bacterial strains

isolated from natural soil. International

Biodeterioration & Biodegradation, 62, 257–262.

Eker, S., Kargi, F. (2006) Impacts of COD and DCP

loading rates on biological treatment of 2,4-

dichlorophenol (DCP) containing wastewater in a

perforated tubes biofilm reactor. Chemosphere, 64

(9), pp. 1609-1617.

Englis D.T. & Miles J. W. (1949) Determination of

levulose: Colorimetric determination in presence of

dextros. Analyt. Chem. 21, 583-584.

Englis D.T. & Miles J. W. & Wollerman L.A. (1955).

Some observations of the colorimetric determination

of vanillin. J. Ass. Off. Agric. Chem. 38, 519-523.

Fang, H., Liang, D., Zhang, T. & Liu, Y. (2006)

Anaerobic treatment of phenol in wastewater under

thermophilic condition. Water Research. 40. 427-434.

Fantroussi, S. and Agathos, S. N. 2005. Is

bioaugmentation a feasible strategy for pollutant

removal and site remediation? Current Opinion in

Microbiology, 8(3), 268-275.

Fauts S.D. & Anderson P. W. (1968) Factors influencing

the condensantion of 4 – Aminoantipyrine with

derivaties of hydroxybenzene –III. A study of phenol

content of surface waters. Water. Res. 2, 515-525.

Foght, J. Gutnick D. and Westlake, D. 1989 Effect of

emulsan on biodegradation of crude oil by pure and

mixed bacterial cultures. Applied and Environmental

Microbiology 55, 36-42

Folin O. & CiocalteauV.(1912) On phosphotungstic -

phosphomolybdic compounds as colour reagents. J.

biol. Chem. 12, 239-240.

Furukawa, K. 2006 Oxygenases and dehalogenases:

Molecular approaches to efficient degradation of

chlorinated environmental pollutants. Bioscience,

Biotechnology and Biochemistry, 70 (10), 2335-

2348.

Gibson, D.T., Zylstra, G.J., Chauhan, S., (1990),

Biotransformations catalyzed by toluene dioxygenase

from Pesudomonas putida F1. In: Silver, S.,

Chakrabarty, A.M., Iglewiski, B., Kaplan, S. (Eds.),

Pseudomonas: Biotransformations, Pathogenesis, and

Emerging Biotecnology, American Society for

Microbiology Press, Washington,pp. 121-132.

Gil, L. 1996 Cortiça: Produção Tecnologia e Aplicação,

Instituto Nacional de Engenharia, Tecnologia e

Inovação, Lisbon.

Gil, L cork powder waste. And overview”. Biomass., “&

Bioenergy 13 (1/2) ,59 – 61 /1997)

Góngora y Benítez de Lugo, E., “El corcho en las

instalaciones industriales”. Convención Mundial del

Corcho, Madrid (1980).

Harayama, 5. y Timmis, K.N. 1992. En Aerabic

biadegradatian of arama/ics hydracarbons by bacteria.

Ed. Sigel H. y Sigel A., Marcel Dekker Inc., New

York. vol. 28, Pp 99-15

Hidalgo, A., Jaureguibeitia, A., & Prieto, M. (2002).

Biological treatment of phenolic industrial

wastewaters by Rhodococcus erythropolis UPV-1.

Enzyme and Microbial Technology. 31. 221-226.

Hopper, D. J. y Chapman, P.J. 1970. BiacJiem. J. 122,

19-28.

Janssen, D.B., Drinkla, I.J.T., Poelarends, G.J. and

Terpstra P. 2005 Bacterial degradation of xenobiotic

compounds: evolution and distribution of novel

enzyme activities. Environmental Microbiology, 7,

1868-1882.

37

Jiang, H., Tay, J., & Tay, S. (2004). Changes in structure,

activity and metabolism of aerobic granules as a

microbial response to high phenol loading. Appl

Microbiol Biotechnol. 63. 602-608.

Kloster M. B. (1974). The determination of tannin and

lignin. J. Am. Wat. Wks Ass. 66, 44-46.

Lacoste, R.J., Venable, S.H. and Stone, J.C. 1959

Modified 4-aminoantipyrine colorimetric method for

phenols. Analytical Chemistry 31, 1246-1249.

Ladd, J.N. 1962. Nature 194, 1099-1100.

Lan, B. Y., Nigmatullin, R. and Puma, G. L. 2008

Ozonation kinetics of cork-processing water in a

bubble column reactor. Water Research, 42, 2473 –

2482.

Lin, Y., Wu, C., Hsu, C., & Li, H. (2009). Biodegradation

of phenol with chromium (VI) reduction in anaerobic

fixed-biofilm process-Kinetic model and reactor

performance. Journal of Hazardous Materials.

Lob, K. & Tar, C. (2000). Effect of Additional Carbon

Sources on Biodegradation of Phenol. Bull. Environ.

Contam. Toxicol. 64. 756-763.

Martinez de Toda Fernandez, Fernando. (2002).

Viticultura de calidad: factores que afectan al

contenido de compuestos fenólicos. ACE.

Masai, E., Yamada, A., Healy, J. M., Hatta, T., Kimbara,

K., Fukuda, M. & Yano, K. (1995) Characterization

of biphenyl catabolic genes of gram-positive

polychlorinated biphenyl degrader rhodococcus sp.

Strain RHA1 Appl Environt Microbiol., 61(6), 2079-

2085.

Mohan, N., Balasubramanian, N. & Ahmed Basha, C.

(2007). Electrochemical oxidation of textile

wastewater and its reuse. Journal of Hazardous

Materials. 147. 644-651

Moussavi, G., Mahmoudi, M. & Barikbin B. (2009).

Biological removal of phenol from strong

wastewaters using a novel MSBR. Water research.

43. 1295 - 1302.

Muñoz, J., Pérez, B., Esteban, M., De la Escalera, S.,

Gómez, M., Martinez, M., & González, J. (2001).

Growth of Moderately Halophilic Bacteria Isolated

from Sea Water using Phenol as the Sole Carbon

Source. Folia Microbial.

Ornston L.N. and Stainer R.Y. (1996). The conversion of

catechol and protocatechuate to B-ketoadipate by

Pseudomonas putida. Journal of biological chemistry,

241.3776-3786.

Parvanov, D. and Topalova, Y. 2008 Biodegradation

potential of phenol-resistant bacteria localized in

different stream habitats. Biotechnology &

Biotechnology Eq., 22, 709-715.

Patel, R., & Rajkumar, S. (2009). Isolation and

characterization of phenol degrading yeast. Journal of

Basic Microbiology. 49. 216-219.

Pintor, A.M.A., Vilar, V.J.P. and Boaventura, R.A.R.

2011 Decontamination of cork wastewaters by solar-

photo-Fenton process using cork bleaching

wastewater as H2O2 source. Solar Energy, 85 579–

587.

Polovedo D. & Gerletti M. (1968) Recent studies on the

sedimentary organic matter fron Lake Maggiore

(Norther Italy). Mit int.Verein. theor. Angew.

Limnol.14, 145-154.

Rigo, M. & Alegre, R. (2004). Isolation and selection of

phenol-degrading

Saravanan, P., Pakshirajan,K. & Saha, P. (2008a).

Kinetics of phenol and m-cresol biodegradation by an

indigenous mixed microbial culture isolated from a

sewage treatment plant. Journal of Environmental

Sciences. 20. 1508-1513.

Saravanan, P., Pakshirajan,K. & Saha, P. (2008b). growth

kinetics of an indigenous mixed microbial consortium

during phenol degradation in a batch reactor.

Bioresource Technology. 99. 205-209.

Shieh, W.K., Puhakka, J. A., Melin, E. and Tuhkanen T.

1990. Immobilized-Cell Degradation of

Chlorophenols. Journal of Environmental

Engineering, 116(4), 683-687.

Singh, A. and Ward, O.P. (Eds). 2004 Biodegradation

and Bioremediation, Soil Biology Series, Volume 2,

Springer-Verlag, Germany.

Smidt, H. and De Vos, W.M. 2004 Anaerobic microbial

dehalogenation. Annual Review of Microbiology, 58,

43-73.

Solyanikova, I.P. and Golovleva, L.A. 2004. Bacterial

Degradation of chlorophenols: pathways, biochemica,

and genetic aspects. Journal of Environmental

Science and Health, B39 (3), 333 – 351.

Standard Methods for the Examination of Water and

Wastewater. 20th Edition. (1998). 5530 phenols.

38

Stapleton, R.D. and Singh, V.P. (Eds.) 2002.

Biotransformations: Bioremediation technology for

health and environmental protection. Elsevier

Science, ISBN: 978 -0444509970.

Suárez, M., Fernández, S., Gómez J. & Martínez, J.

(2007). Cultivos bacterianos autóctonos con

capacidad de degradar altas concentraciones de

fenoles.

Swain T. & Hillis W.E. (1959) The phenolic constituents

of Prunus domestica. I. The quantitative analysis of

phenolics constituents. J. Sci. Fd Agric. 10, 63-68.

Tavares, C., Michelon, M., Fernandes de Medeiros, J.,

Juliano, S. and Veiga C. A. 2010. Biodegradation of

phenol by free and encapsulated cells of a new

Aspergillus sp. isolated from a contaminated site in

southern Brazil. African Journal of Biotechnology,

9(40), 6716-6720.

Van der Meer, J.R. 2008 A genomic view on the

evolution of catabolic pathways and bacterial

adaptation to xenobiotic compounds. In “Microbial

Biodegradation: genomics and molecular biology”. E.

Diaz, ed. I.S.B.N. 978-1-904455-17-2. p. 219-267.

Varma, R.J., & Gaikwad, B.G. (2009). Biodegradation

and phenol tolerance by recycled cells of Candida

tropicalis NCIM 3556. International Biodeterioration

& Biodegradation. 63. 539-542.

Walker, N. y Lippert, K D. 1965. Biocbem. Ji. 95, Sc-6c.

Watanabe, K., Teramoto, M., Futamata, H.

and Harayama, S. 1998. Molecular detection,

isolation, and physiological characterization of

functionally dominant phenol-degrading bacteria in

activated sludge. Applied and Environmental

Microbiology, 64 (11), 4396-4402.

Wang YD, Dong XJ, Wang X, Hong Q, Jiang X, Li SP.

2007. Isolation of phenol-degrading bacteria from

natural soil and their phylogenetic analysis.

Whittich, R., Rast, HG. y Knackmuss, FIS. 1988. Appl.

Enviran. Microbiol. 54, 1842-1847.

Wobus, A., Ulrich, S. and Röske, I. 1995. Degradation of

chlorophenols by biofilms on semi - permeable

membranes in two types of fixed bed reactor.

Zaky S.,“Detection of meta - and ortho- cleavaje

dioxygenases in bacterial phenol- degraders.”J. Appl.

Sci. Environ. Mgt. September, 2006