Toxicidad y bioacumulación del plomo en Macrobrachium ...

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN

PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA

“Toxicidad y bioacumulación del plomo en

Macrobrachium americanum”

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRÍA EN RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE

PRESENTA

JOAQUÍN REYES CHÁVEZ

GUASAVE, SINALOA; MÉXICO DICIEMBRE 2012

V

Este trabajo de tesis se llevó a cabo en el Departamento de Acuacultura del

Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR)

Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (IPN). Bajo la dirección del Dr. Juan

Carlos Sainz Hernández y M.C. Juan Pablo Apún Molina. El presente trabajo recibió

financiamiento del IPN a través del proyecto SIP, con número de registro 20121065.

El autor agradece el apoyo brindado por el IPN como becario PIFI y del programa de

becas posgrado, así como al Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología

(CONACYT) por la beca otorgada con clave 366434 durante la realización de la

presente investigación.

VI

DEDICATORIA.

A mi familia: Con toda la fuerza de mi corazón. …

Les pido perdón por todo el tiempo que les falte, para culminar esta tesis

VII

AGRADECIMIENTOS.

Al creador de la vida, por darme la oportunidad de vivir y poder alcanzar mis metas. A mi director de tesis, el Dr. Juan Carlos Sainz Hernández, agradezco infinitamente todo su apoyo, por compartir desinteresadamente sus conocimiento, experiencias, consejos y su amistad, más que un profesor y director; un gran amigo. Mi compa ya estas “misión cumplida”. A mi Co-director M.C. Juan Pablo Apún Molina, por el apoyo brindado. Al equipo de trabajo que colaboró de alguna forma en el trabajo de campo, laboratorio y bioensayos: Genaro, Jazz, Arturo, Ely Sara, Polanco, Daniel. A los señores; “El che” y don “Jesús” del poblado El Opochi, Sinaloa de Leyva por la captura de los organismos. A mis compañeros y amigos de generación; oh-John, Che-luís, Magnolia, José Pedro, Tomas, Lizet, Lalo, shio, Styl, José, Samuel, Jorge, Juan Carlos, Porfirio †, Sheila, Liz, Fátima, Eli, Irene, Alfredo; y Abraham, Carlos, Viri, Carmen, Judith, Dámaris. A Dorín, Don Roberto, Ricardo y Celestino; por ser nuestros centinelas en la vida estudiantil. A la Secretaría de Marina-Armada de México, por darme la oportunidad de superarme profesionalmente. A la empresa CLARVI Lideres en Tratamientos de Agua, en la Ciudad de Los Mochis, Sinaloa. Por abrirme sus puertas al realizar una estancia de investigación; en el asesoramiento y uso de técnicas de AAG. ¡Muchas gracias a todos!

VIII

ÍNDICE GENERAL

CONTENIDO PÁGINAS

ÍNDICE GENERAL……………………………………………………………..

VIII

ABREVIATURAS………………………………………………………………. X

GLOSARIO……………………………………………………………………… XII

ÍNDICE DE FIGURAS…………………………………………………………. XIV

ÍNDICE DE CUADROS………………………………………………………... XVI

RESUMEN………………………………………………………………………. XVII

ABSTRACT……………………………………………………………………... XVIII

I.

INTRODUCCIÓN………………………………………………………...

1

II. ANTECEDENTES………………………………………………………. 5

II.1 Toxicidad…………………………………………………………. 5

II.2 Bioacumulación………………………………………………….. 5

II.3 Expresión de proteínas quelantes (metalotioneínas)……….. 6

II.4 Sistema de secuestro y detoxificación de metales………….. 7

III. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………... 8

IV. HIPÓTESIS………………………………………………………………. 9

V. OBJETIVOS……………………………………………………………... 10

V.1 Objetivo general…………………………………………………. 10

V.2 Objetivos específicos…………………………………………… 10

VI. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………... 11

VI.1 Colecta, transporte y aclimatación de los animales…………. 11

VI.2 Diseño experimental…...……………………………………….. 12

VI.2.1 Laboratorio…….………………………………………. 12

VI.2.2 Determinación de parámetros fisicoquímicos….….. 12

VI.2.3 Bioensayo I (Exposición aguda)…………………….. 12

VI.2.4 Bioensayo II (Exposición crónica)…………………... 13

VI.3 Cuantificación de plomo……………...………………………… 13

IX

VI.4 Ingesta……………………………………………………………. 15

VI.5 Análisis del sistema inmunológico…………………………...... 15

VI.5.1 Obtención de la hemolinfa….……………..………… 15

VI.5.2 Coagulación…………………………………...………. 16

VI.5.3 Cuantificación de proteína…………………………... 16

VI.5.4 Hemocitos totales………………………………..…… 16

VI.5.5 Medición de fenoloxidasa (FO) y profenoloxidasa

(proFO)….……..……………………………………….

17

VI.6 Método estadístico……………………………………………… 18

VII. RESULTADOS………………………………………………………….. 20

VII.1 Bioensayo I………………………………………………………. 20

VII.1.1 Concentración letal (CL50)……………………...……. 20

VII.1.2 Concentración Sub-letal (CSL)………………...……. 22

VII.2 Bioensayo II……………………………………………………… 23

VII.2.1 Bioacumulación de plomo…………………………… 24

VII.2.2 Ingesta…………………………………………………. 28

VII.2.3 Sistema inmunológico………………………………... 29

VII.3 Parámetros fisicoquímicos……………………………………... 34

VIII. DISCUSIONES………………………………………………………….. 36

IX. CONCLUSIONES……………………………………………………….. 41

X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................ 43

XI. ANEXOS…………………………………………………………………. 49

X

ABREVIATURAS

APDC Dihidrógeno de Fosfato-Tritón X-100-Triclorometano

AAG Absorción atómica de gases

Ca2+ Calcio ionizado

°C Grado centígrado

CL50 Concentración letal que provoca la muerte al 50% de la

población

CSL Concentración sub-letal

CSL11 Concentración sub-letal que provoca la muerte al 11% de

la población

Cd2+ Cadmio ionizado

Cr2+ Cromo ionizado

Cu2+ Cobre ionizado

(CH3COO)2·Pb·3H2O Acetato de plomo

EE Error estándar

EDTA Etilendiaminotetracetato (agente quelante)

FO Fenoloxidasa (activa)

Fe2+ Hierro ionizado

g Gramo

g Gravedades (9.81 m·s-2)

h Hora

HCl Ácido clorhídrico

HNO3 Ácido nítrico

kDa Kilogramo por Unidad de un Dalton

L-Dopa L-dihidroxifenilalanina

min Minutos

mM Milimolar

mL Mililitro

mg g-1 Miligramo de soluto por gramo

mg mL-1 Miligramo de soluto por mililitro de solución

Mn2+ Manganeso ionizado

XI

MT Metalotioneínas

Ni2+ Níquel ionizado

nm Nanómetro

µg mL-1 Microgramo de soluto por mililitro de solución

µL Microlitro

UpH Unidades de Potencial de iones de hidrogeno

proFO Fenoloxidasa (inactiva)

% Porcentaje

SLH Sobrenadante de lisado de hemocitos

Pb2+ Plomo ionizado

TCA Tasa de conversión alimenticia

V/V Volumen de solución por volumen de solvente

Zn2+ Zinc ionizado

XII

GLOSARIO

Ad libitum: (Expresión en latín que significa “a placer, a voluntad”). En biología se

aplica, cuando no se ha impuesto ningún control a su alimentación.

Apoptosis: Muerte celular programada por reacciones bioquímicas de una forma

ordenada y ejercidas bajo funciones normales.

Bentónico: Animal que se mueve regularmente sobre la superficie del sustrato,

recorriendo.

Bioacumulación: Efecto biológico pertinente con la capacidad que tiene un tejido

vivo para acumular contaminantes, estos pueden ser eliminados o magnificados.

Bioindicador biológico: Es una especie cuya presencia en un ambiente

determinado da información sobre las características ecológicas o del impacto al

medio ambiente (efecto antropogénico).

Contaminación: La presencia de una sustancia en el ambiente que debido a su

composición química o cantidad retarda el funcionamiento de procesos naturales y

produce efectos ambientales indeseables.

Circadiano: (Del latín circa, que significa “alrededor de” y dies que significa “día”).

Oscilaciones de las variables biológicas en intervalos regulares de tiempo.

Dosis: Cantidad de substancia a la que se expone el organismo por una unidad de

tiempo.

Dosis sub-letal: Se refiere a una cantidad de sustancia tóxica, pero no lo suficiente

para producir la muerte a un organismo.

Desintoxicación: Eliminación de sustancias tóxicas.

Encapsulación: Respuesta multicelular para eliminar partículas extrañas que no

pueden ser destruidas por los mecanismos humorales.

Exposición aguda: Exposición única de una sustancia tóxica que puede causar

daños severos o la muerte; en un periodo corto de tiempo (minutos u horas).

Exposición crónica: Exposición continúa de una sustancia tóxica durante un

periodo prolongado (meses o años).

Homeostasis: (Del griego homo que significa “similar” y estasis “posición”

“estabilidad”). Característica de un organismo vivo, regular las funciones dentro de él

para mantener una condición estable absorción de nutrientes (metabolismo).

XIII

Fagocitosis: Capacidad de algunas células de destruir las bacterias o agentes

nocivos para el organismo.

Hemocito: Son células fagocíticas circulantes en la hemolinfa, se han considerado

análogos a los leucocitos de mamíferos debido a las funciones que realizan en el

mecanismo de defensa como parte de la respuesta inmune innata.

Hemolinfa: Líquido circulatorio de los artrópodos, moluscos, etc. Análogo de la

sangre en invertebrados. Su composición varía mucho de una especie a otra. Puede

ser de diferentes colores o incluso incolora; los pigmentos pueden proceder de la

alimentación o de los procesos metabólicos y no tienen ninguna función biológica, ya

que en el transporte de gases es independiente del aparato circulatorio.

Organismo Centinela: Cualquier organismo no-humano que pueda reaccionar ante

un contaminante ambiental antes de que el contaminante impacte sobre los

humanos.

Sistema inmune innato: (Del latín immunitas, que significa “no atacable” y del latín

innatus, que significa “nacer con el mismo”). Se conoce como el conjunto de

mecanismos y células que actúan como defensa de un organismo ante posibles

infecciones y sustancias extrañas, esto quiere decir que el sistema logra reconocer

de manera genérica a los patógenos y sustancias que no son propias de los tejidos.

Metales pesados: Se refiere aquellos elementos que tienen una densidad mayor a

4.5 g cm-3.

Tóxico: Es una sustancia química que, administrada a un organismo vivo, tiene

efectos nocivos.

Toxicidad: Es la medida usada para evaluar el grado de tóxico de alguna sustancia.

XIV

ÍNDICE DE FIGURAS

CONTENIDO PÁGINA

Figura 1 Río Sinaloa, zona de colecta de Macrobrachium

americanum………………………………………………………..

11

Figura 2 Curva de mortalidad de M americanum. Cinco grados de

libertad y un 95% de confianza…….........................................

23

Figura 3 Control (condiciones óptimas). Dosis de plomo expuesto

(0.186 µg mL-1). Concentración promedio de plomo

experimental (expuestos). No existe diferencias significativas

(p˃0.05).Barras de error = promedio EE……………………..

24

Figura 4 Concentración de plomo en exosqueleto (plomo µg g-1).

Control (Condiciones óptima). Dosis de plomo expuesto

(0.186 µg mL-1). Superíndices distintos indican diferencias

significativas (p<0.05). Barras de error = promedio EE…….

25

Figura 5 Concentración de plomo en hepatopáncreas (plomo µg g-1).




26

Figura 6 Concentración de plomo en hemolinfa (plomo µg mL-1).




27

Figura 7 Concentración de plomo en músculo (plomo µg g-1). Control

(Condiciones óptima). Dosis de plomo expuesto (0.186 µg

mL-1). Superíndices distintos indican diferencias


28

Figura 8 Ingesta (gr alimento consumido · gr peso del organismo-1).




29

XV

Figura 9 Tiempo de coagulación. Control (Condiciones óptima). Dosis

de plomo expuesto (0.186 µg mL-1). Superíndices distintos

indican diferencias significativas (p<0.05). Barras de error =

promedio EE…………………………………………………….

30

Figura 10 Proteína en plasma. Control (Condiciones óptima). Dosis de

plomo expuesto (0.186 µg mL-1). Superíndices distintos


promedio EE…………………………………………………….

31

Figura 11 Proteína en SLH. Control (Condiciones óptima). Dosis de

plomo expuestos (0.186 µg mL-1). Superíndices distintos


promedio EE…………………………………………………….

32

Figura 12 Cantidad de hemocitos totales. Control (Condiciones

óptima). Dosis de plomo expuesta (0.186 µg mL-1).

Superíndices distintos indican diferencias significativas

(p<0.05). Barras de error = promedio EE…………………….

32

Figura 13 Actividad de la profenoloxidasa en SLH. Control

(Condiciones óptima). Dosis de plomo expuestos (0.186 µg



33

Figura 14 Actividad de la profenoloxidasa en plasma. Control

(Condiciones óptima). Dosis de plomo expuesta (0.186 µg



34

XVI

ÍNDICE DE CUADROS

CONTENIDO PÁGINA

Cuadro 1 Método establecido según INSHT 1990, para determinar

plomo en sangre. Para horno de grafito

AAG………………….……………………………………………..

14

Cuadro 2 Mortalidad de M. americanum, dosis expuestas a diferentes

concentraciones de plomo, bioensayo (presuntivo)…………..

20


concentraciones de plomo, bioensayo (confirmativo)…………

21


concentraciones de plomo, por triplicado y promedio………...

22

Cuadro 5 Cálculo numérico de la CL50 por el método de Probits………. 22

Cuadro 6 Parámetros fisicoquímicos del bioensayo I y II. Dosis de

plomo expuesto (0.186 µg mL-1), temperatura, oxígeno

disuelto y potencial de hidrógeno. Promedio EE……………

35

XVII

RESUMEN

La evolución tecnológica ha hecho que el plomo (Pb) sea uno de los

contaminantes antropogénicos más importante a nivel mundial al incorporarse

fácilmente a los ciclos biogeoquímicos, resultando tóxicos para la biota y la salud

humana. El plomo se considera un elemento no esencial y tóxico para las células,

teniendo la capacidad para unirse al azufre de los aminoácidos y desplazar al Calcio

(Ca+2). En este trabajo se propuso analizar y entender el proceso de acumulación y

desintoxicación de plomo en el langostino Macrobrachium americanum para lo cual

se determinó la concentración letal 50 % y una dosis sub-letal que permitiera

observar el desarrollo de la intoxicación y desintoxicación. Los resultados muestran

una acción tóxica del plomo; con efectos letales a CL50 de 0.389 µg mL-1 a 96 hrs y

sub-letal CSL11 de 0.186 µg mL-1 a 24 h, concentraciones cercanas a los límites

puestos por la norma oficial mexicana (NMX-001-ECOL-1996). La distribución del

plomo en los tejidos presentó un orden cumulativo: hepatopáncreas (2.150 µg g-1) ˃

exosqueleto (0.335 µg g-1) ˃ músculo (0.056 µg g-1) ˃ hemolinfa (0.039 µg mL-1),

formándose 2 grupos de tejidos: el grupo I comprendido por el hepatopáncreas y

exosqueleto, los cuales desarrollaron una acumulación y grupo II comprendido por el

músculo y hemolinfa, los cuales desarrollaron una depuración. Los resultados de

acumulación y desintoxicación en función de la actividad del sistema

profenoloxidasa, número de hemocitos y el contenido de proteína, sugieren dos

procesos de desintoxicación. El primer proceso comienza desde el primer contacto

con el plomo y hasta la tercera semana después de la exposición. Actúa un proceso

mediado por metalotioneínas (ricas en cisteínas) proteínas quelantes de metales que

después son fagocitadas por los hemocitos. El segundo proceso comienza a partir de

la cuarta semana después de la exposición. Aquí el plomo es directamente absorbido

por las células de la glándula digestiva y precipitado en vacuolas dentro de las

mitocondrias y lisosomas. Los tejidos donde parece no haber depuración son la

glándula digestiva y el exoesqueleto. La especie M. americanum puede funcionar

como centinela debido a que tiene susceptibilidad al plomo en concentraciones por

debajo de la norma oficial.

XVIII

ABSTRACT

Technological development have made the lead (Pb) one of the most important

anthropogenic pollutants worldwide wich is easily incorporated into the

biogeochemical cycles, resulting toxic to biota and human health. Lead is non

essential and a toxic element for cells, it links to sulfur-containing amino acids and it

has the ability to displace divalent elements like Ca+2. In this research the goal was to

analyze and to understand lead detoxication in the prawn Macrobrachium

americanum. It was necessary to define the lethal dose 50 (LD50) and a subletal dose

(SLD) that allow us to observe the progress of the intoxication and detoxication.

Results showed a toxic action of lead over M. americanum with a LD50 of 0.389 µg

mL-1 to 96 hrs and SLD11 of 0.186 µg mL-1 to 24 h. These concentrations are close to

the proposed limits by Mexican regulation (NMX-001-ECOL-1996). Lead distribution

in the tissues showed different levels of concentration: Digestive gland (2.150 µg g-1)˃

Exoskeleton (0.335 µg g-1)˃ Mussels (0.056 µg g-1)˃ Haemolynph (0.039 µg mL-1).

Two groups of tissue were clearly separated: group 1 comprised by the digestive

gland and exoskeleton, which developed an accumulation y group 2 comprised by

haemolymph and mussel which developed debugging. Accumulation and detoxication

in function of the prophenoloxidase system activity, number of haemocytes and

protein concentration suggest two detoxication processes: first process begins since

the first contact with lead until third week after exposure. Process in mediated by

Metallotioneine which is a metal chelate protein that is phagocyted by hemocytes.

Second process start on the forth week after exposure, this process consists in a

direct absorption oh lead by the cells of the digestive gland and precipitated into

vacuoles inside of mitochondria or lysosome. No depuration appears to occur in the

digestive gland and exoskeleton. The species M. americanum can function as

sentinel because the susceptibility and concentration of lead below the official

standard.

1

I. INTRODUCCIÓN

La evolución tecnológica está basada en la capacidad para tomar y modificar

diversos elementos del entorno y utilizarlos para satisfacer nuestras necesidades

básicas. El proceso de nuevas tecnologías aplica poco conocimiento de interés

relacionados con el desarrollo sustentable y en consecuencia, gran parte de la

industria emplea y libera al ambiente en forma sistemática, elementos que pueden

resultar tóxicos para los organismos. Un buen ejemplo de las consecuencias de este

enfoque, es la actual problemática ambiental relacionada con los metales pesados

empleados por distintas ramas de la industria (Garza, 2004).

Todos los ecosistemas terrestres y acuáticos, tienen la capacidad de adquirir y

de acumular metales esenciales (Fe2+, Mn2+, Zn2+ y Cu2+) y no esenciales (Hg2+, Cr2+,

Pb2+, Cd2+ y Ni2+) para el desarrollo de las plantas y animales. En ambos casos una

exposición por encima de una concentración crítica puede ser nociva para los

organismos (Camacho y Gamboa, 2003).

De estos elementos, el plomo es la materia prima o componente fundamental

en diversos procesos tecnológicos debido a sus propiedades fisicoquímicas como

ductilidad, alta densidad y resistencia química, así como, su fácil extracción, relativa

abundancia y bajo costo (ATSDR, 2007). Se le ha usado en la elaboración de

medicinas, pinturas, tuberías, municiones, vitrificado de cerámicas, aleaciones para

soldaduras, baterías eléctricas, protección contra radiaciones ionizantes y como

aditivo antidetonante en las gasolinas. Es por ello que, no resulta sorprendente que a

raíz de la actividad humana la concentración de este metal en el medio ambiente se

haya incrementado de forma importante, así como, la exposición al mismo (Tong et

al., 2000).

El plomo puede ser extremadamente tóxico para las células por la tendencia a

competir por lugares específicos dentro de la célula (el azufre de las proteínas) y

además tiene la capacidad de desplazar al calcio (Ca+2), lo cual se debe al radio

iónico muy similar (Reyes-Gil, 1999).

En México, el langostino de río (Macrobrachium americanum) llamado

localmente como “cauque”, es una de las especies de crustáceos de mayor tamaño.

2

Su distribución se encuentra en la mayoría de los ríos y arroyos desde el Estado de

Sonora hasta Chiapas (Díaz, 2001). Su clasificación taxonómica lo coloca en el

orden Decapoda, de la familia Palaemonidae, del género Macrobrachium y de la

especie americanum (Bate, 1986). En las zonas altas del Estado de Sinaloa, se

captura el M. americanum por la gente nativa y en su estadio juvenil se traslada al

fondo del río donde viven bajo piedras, varas y vegetación sumergida, por lo que se

considera un organismo bentónico y omnívoro el resto de su ciclo de vida (Sainz,

2006).

Organismos acuáticos como la especie M. americanum pueden ser utilizados

como bioindicador de contaminación, que incluye la medición de metales pesados en

el organismo y/o en determinados órganos. Esto nos ofrece información sobre el

estado fisiológico a nivel sub-celular de los crustáceos (Fatemeh y Shahab, 2011).

El concepto de organismo centinela fue definido por Stahl en 1997, como

“cualquier organismo no-humano que pueda reaccionar ante un contaminante

ambiental antes de que el contaminante impacte sobre los humanos”. De este modo

las respuestas endógenas del organismo proveen una señal de alerta temprana

sobre potenciales riesgos para la salud humana y de los ecosistemas. Para llevar a

cabo el monitoreo medioambiental, se utilizan especies especialmente susceptibles.

En caso de estudiar efectos a corto plazo, buscando una acción aguda, el organismo

centinela debe tener una alta sensibilidad al agente de interés y mostrar una pronta

respuesta (Poletta, 2011).

Llevar a cabo estudios controlados en laboratorio, son útiles para determinar

las relaciones dosis-respuesta y para estudiar los mecanismos moleculares de

regulación de una respuesta tóxica (Suarez, 2003).

El sistema inmune de los crustáceos, comprende mecanismos celulares y

humorales (inmunidad innata o no específica) que contribuyen a la defensa del

organismo, evitando invasiones microbianas, virales y de materiales extraños (Díaz,

2005), que son eliminados de la hemolinfa y tejidos (Söderhall y Cerenius, 1992;

Vázquez et al., 1998). Su función es mantener la individualidad biológica del

organismo mediante, la diferenciación y eliminar todo material extraño de sus tejidos

(Vargas-Albores, 1996).

3

En particular, los crustáceos decápodos poseen un sistema circulatorio abierto

en el cual la hemolinfa distribuye nutrientes, hemocianina (proteína involucrada en la

respiración), hormonas y células (Hernández et al., 1996).

La respuesta celular del sistema inmune de los crustáceos, se expresa en

varios tipos de células que están involucradas en la eliminación de partículas

extrañas que llegan al hemocele de los crustáceos (Johnson, 1987):

a) Los podocitos o nefrocitos, Se localizan en branquias y están especializados en

la pinocitosis de proteínas y virus.

b) Las células fagocíticas fijas, se presentan en el corazón de los crustáceos y son

derivadas del tejido hematopoyético, las cuales están involucradas en la filtración

de sustancias virales.

c) El órgano linfoide, es considerado como parte integral del sistema circulatorio

que funciona como filtro de la hemolinfa, eliminando y capturando partículas

virales (Van de Braak et al., 2002).

d) Los hemocitos, son células fagocíticas circulantes en la hemolinfa. Se han

considerado análogos a los leucocitos de mamíferos debido a las funciones que

realizan en el mecanismo de defensa como parte de la respuesta inmune innata,

participando en el reconocimiento, destrucción de partículas extrañas y agentes

infecciosos (Raa, 1996). Estas células llevan a cabo reacciones inmunes como

fagocitosis, encapsulación, nodulación, citotoxicidad (Söderhäll y Cerenius, 1992)

y coagulación de la hemolinfa. Se han descrito tres tipos de hemocitos, utilizado

criterios morfológicos, antigénicos y funcionales (Johansson et al., 2000):

Hemocitos hialinos, los cuales no poseen gránulos, tienen capacidad

fagocítica e intervienen en la coagulación (Raa, 1996).

Hemocitos semigranulosos, los cuales poseen abundantes gránulos,

intervienen en la fagocitosis, encapsulación y en la liberación del sistema

profenoloxidasa (proFO) encargado y responsable de la melanización

(Destoumieux et al., 2000).

Hemocitos granulosos, estos hemocitos están cargados de gránulos y

almacenan las enzimas que constituyen el sistema proFO en los crustáceos a

4

una concentración más elevada que los hemocitos semigranulosos (Smith y

Söderhäll, 1983).

Cuando el organismo es invadido por un gran número de microorganismos

nocivos y este no puede fagocitarlos, el sistema celular lleva a cabo la

formación de nódulos. Este es un mecanismo muy eficiente para la

eliminación de partículas extrañas en invertebrados, incluyendo a los

crustáceos (Söderhäll y Cerenius, 1992).

Las metalotioneínas (MT); fueron descritas por primera vez por Kagi y Vallee

(1960), para designar proteínas ricas en azufre que contenían Cd, Zn y Cu. Estas

proteínas fueron caracterizadas como; pequeñas proteínas (6-7 kDa) citosólicas

implicadas en la homeostasis en las células y los procesos de desintoxicación por

metales, contienen alrededor de 60 aminoácidos (ninguno aromático) y un alto

contenido de residuos de cisteína. Las MT tienen dos subunidades globulares, cada

una comprende aproximadamente diez residuos de cisteína que no forma enlaces

disulfuro y son responsables del secuestro de metales con su grupos sulfhídrilo

(tiólico) (Fatemeh y Shahab, 2011).

Las MTs se producen principalmente en el citosol y también están presentes en el

núcleo y los lisosomas (Decataldo et al., 2004). Las MTs están involucradas en

muchos procesos fisiopatológicos como la homeostasis de las células y

desintoxicación por iones metálicos, la proliferación celular y la apoptosis (Doki y

Monden, 2004). Enfocándose en la importancia de desintoxicación por los metales

pesados, estas proteínas pueden servir como biomarcadores de contaminación por

metales pesados, que constituyen una relación de 5-7 moles de metales pesados por

mol de proteína (Fatemeh y Shahab, 2011).

5

II. ANTECEDENTES

II.1.-Toxicidad.

Suarez Álvarez (2003) realizó un experimento para medir la toxicidad aguda

del plomo en camarón rosado Farfantepenaeus notialis, provocando la mortalidad por

dos vías 1) coagulación de la hemolinfa y 2) formación de mucus en las branquias.

Las concentraciones de seguridad o umbral para el plomo fue de 50 µg L-1, valor que

no debe ser superado en las aguas receptoras para no causar daños a las

poblaciones del crustáceo.

Con el fin de evaluar la toxicidad de metales pesados en organismos

acuáticos, Qing Wang et al., (2009) investigaron el efecto de Hg, Cd y Pb en larvas

de almeja Meretrix meretrix. El resultado de la CL50 para la etapa de embriogénesis

fue de 5.4 µg L-1 para Hg, 1014 µg L-1 para Cd y 297 µg L-1 para Pb. Mientras que

para la etapa larvaria fue de 14.0 µg L-1 para Hg, 68.0 µg L-1 para Cd y 353 µg L-1

para Pb, respectivamente. Estos resultados demostraron que las etapas tempranas

del desarrollo de M. meretrix es altamente sensible a metales pesados y puede ser

utilizado como un organismo centinela.

Benediet et al., (2008) realizaron un estudio para determinar los límites de

toxicidad del plomo en los invertebrados Daphnia magna y Cyclop sp, especies

importantes en la cadena trófica de los peces del Río Cross, Nigeria. Los resultados

mostraron que las concentraciones tóxicas de plomo para estas especies fueron 190

µg L-1 y 300 µg L-1, respectivamente.

II.2.- Bioacumulación.

Camacho y Gamboa (2003) expusieron postlarvas de Macrobrachium

rosenbergii a cinco concentraciones diferentes de metales pesados (Pb, Ni, Cd y Cu)

durante 48 horas. Los resultados de la CL50 fueron de 165.6, 242, 0.079 y 1.12 µg L-

1, respectivamente; demostrando que la sensibilidad del langostino a los metales

pesados fue Cd ˃ Pb ˃ Cu ˃ Ni.

Boada et al., (2007) estudiaron contenido de metales pesados en camarones

peneidos silvestres L. schmitti, F. subtilis, F. notialis y F. brasiliensis en el Golfo de

Cariaco, Venezuela. Se determino la concentración de Cu, Cd, Pb y Zn, en músculo

6

y cefalotórax mediante la técnica de espectrofotometría de absorción atómica. El

orden decreciente de acumulación del contenido de metales fue el siguiente:

cefalotórax: Zn >Cu > Pb > Cd. Músculo: Zn >Pb > Cu > Cd. Sin embargo, dichas

concentraciones estuvieron dentro de los límites internacionales máximos

permisibles para cada metal en camarones.

Nguyen (2008) observó una acumulación de elementos traza en el langostino

gigante de río M. rosenbergii. La acumulación de metales tuvieron el siguiente orden

decreciente músculo (Se >Cr >Cs >Pb), exosqueleto (Sr >Mo >Sb) y hepatopáncreas

(Cd >Se >Mo >Hg). Las concentraciones encontradas de plomo fueron; músculo

(0.002 - 0.033 µg g-1), exosqueleto (0.026 – 0.134 µg g-1) y hepatopáncreas (0.032 –

0.109 µg g-1). Estas concentraciones de elementos traza reflejan el aporte de

contaminantes en siete zonas industrializadas y urbanas en la región sur de Vietnam.

Ayala Rodríguez (2009). Encontró metales pesados asociados a la erosión de

las rocas (proceso litogenético) y arrastres de fertilizantes de los campos agrícolas

del valle de Guasave, Sinaloa. Las concentraciones de los metales en el Río Sinaloa

para marzo del 2009 presentaron la siguiente secuencia de concentración: Fe > Mn >

Pb > Zn > Ni > Cd. Las concentraciones máximas se encontraron en la parte media

del Río Sinaloa (Quemazones) con 130 µg L-1. El autor recomendó el uso de

organismos bioindicadores para estudiar los cambios asociados con las actividades

antropogénicas.

Soto-Jiménez et al., (2011). Evaluaron la transferencia del plomo en 4 niveles

de la cadena trófica; Tetraselmis suecica, Artemia franciscana, Litopenaeus

vannamei y Haemulon scudderi. Encontrando que el plomo produce una red de

bioacumulación principalmente en los peces (3.4 µg g-1) y camarones (3.5 µg g-1).

II.3.- Expresión de proteínas quelantes (metalotioneínas).

Pedersen et al. (1997) reportaron una clara inducción de MT en las branquias

y hepatopáncreas del cangrejo Carcinus maenas relacionados con la presencia de

cobre tanto en el campo y en el laboratorio. De hecho, señalan que los aumentos en

las concentraciones de MT están asociados con la disminución de la sensibilidad de

un organismo a los metales.

7

Reyes-Gil (1999) realizó un estudio con la exposición de diferentes metales

pesados en organismo acuáticos. El trabajo encontró la expresión de unas proteínas

llamadas metalotioneínas. Estas proteínas tienen la capacidad de unir iones

metálicos en su estructura molecular. Debido a esta particularidad pueden

considerarse como biomarcadores moleculares específicos.

Amiard et al., (2006) utilizaron organismos acuáticos como bioindicadores de

contaminación estudiando la presencia de metalotioneínas, así como, el proceso de

desintoxicación por metales pesados. Concluyeron que las especies acuáticas que

viven en un medio contaminado por metales pesados expresan altas

concentraciones de MTs.

II.4.- Sistema de secuestro de metales.

Ahearn et al., (2004) realizaron un estudio sobre la fisiología celular y

mecanismos moleculares de desintoxicación por metales pesados en el crustáceo

Homarus americanus. Los resultados mostraron que el secuestro de metales se

origina en la síntesis de proteínas en las células epiteliales de la hemolinfa, que

posteriormente son transportados a las vacuolas de las células de las membranas

lisosomales hasta llegar a las células hepatopancreaticas. Concluyeron que la

fijación de los metales es llevado a cabo por los hemocitos que funcionan como

sumideros de metales.

8

III. JUSTIFICACIÓN

El plomo es un importante contaminante ambiental con peligrosos efectos

sobre la salud humana. Su amplia distribución en el medio ambiente se han

convertido en un problema de salud pública en el mundo. Por ello, se han realizado

diversos estudios e investigaciones sobre la calidad del agua de los ríos y en

especies sensibles a sustancias tóxicas (metales pesados), con la analogía de

relacionarlo con indicadores de contaminación. Por tal motivo, es necesario realizar

estudios de toxicidad con bioensayos controlados empleando organismos acuáticos

presentes en el Río Sinaloa tales como Macrobrachium americanum, para evaluar la

concentración letal 50 % (CL50) y el comportamiento celular (expresión del sistema

inmunológico y bioacumulación) por el efecto tóxico del plomo. Por esta razón el uso

de este organismo podría ser útil en estudios de campo para conocer el estado

ambiental.

9

IV. HIPÓTESIS

La toxicidad del plomo sobre el langostino Macrobrachium americanum tendrá

un efecto letal en los límites que marca la norma oficial mexicana (NMX-001-ECOL-

1996) y a una dosis sub-letal ocasionará una bioacumulación en los tejidos del

animal alterando el sistema inmunológico.

10

V. OBJETIVO

V.1. OBJETIVO GENERAL.

Determinar la toxicidad y bioacumulación del plomo en Macrobrachium americanum.

V.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS.

1. Determinar la toxicidad del plomo evaluando la concentración letal 50% de la

población (CL50) y determinar la concentración sub-letal (CSL).

2. Determinar la bioacumulación de plomo en los tejidos del M. americanum

(exoesqueleto, hepatopáncreas, hemolinfa y músculo) expuestos a una

concentración sub-letal de plomo (CSL).

3. Evaluar el efecto de la ingesta y las variables inmunológicas (tiempo de

coagulación, Cantidad de proteína total, Cantidad de proteína SLH, Cantidad

de hemocitos, Cuantificación de la actividad de la profenoloxidasa y

Cuantificación de la actividad de la fenoloxidasa) en M. americanum,

expuestos a una concentración sub-letal de plomo (CSL).

11

VI. MATERIALES Y MÉTODOS

VI.1. Colecta, transporte y aclimatación de los animales.

Durante el año 2011, los especímenes de Macrobrachium americanum se

capturó en el Río Sinaloa, en el poblado el Opochi, municipio de Sinaloa de Leyva,

estado de Sinaloa, entre las coordenadas geográficas 25º49´20´´ latitud N -

108º12´37´´ longitud O y 25º49´25´´ latitud N - 108º12´20´´ longitud O (Figura 1) . Los

organismos se colectaron durante la noche mediante el uso de trampas llamadas

nasas con ayuda de carnada en el interior de las jaulas que sirvieron para atraer a

los organismos. Una vez atrapados se seleccionó 128 organismos machos de 42.6 ±

4.5 g de peso corporal para realizar el bioensayo I (presuntiva y confirmativa) y

bioensayo II. Para evitar el estrés se trasladaron inmediatamente a las instalaciones

de CIIDIR-Sinaloa a una razón de 10 organismos en tanques de 50 L utilizando la

misma agua del río con aireación constante.

En el laboratorio se mantuvieron en tanques de aclimatación; en tinas de

plástico ovaladas de 120 L con 50 L de agua de Río filtrada (20 µm), durante 10 días

con una circulación continua de agua, aireación constante y alimentación ad libitum

para garantizar la supervivencia en condiciones de cautiverio.

Figura 1. Río Sinaloa, zona de captura de M. americanum.

12

VI.2. Diseño experimental.

VI.2.1. Laboratorio.

Para trabajar con la detección de metales pesados se tomó en cuenta lo

siguiente: todo el material que se utilizó en los bioensayos se lavó previamente con

HNO3 y HCl al 30%, para evitar la contaminación del medio exterior se implementó

un invernadero en el área de acuacultura donde se realizaron los bioensayos y la

oxigenación de los estanques se acondicionó con un filtro catalítico de eliminación de

partículas de 0.2 micras (Moody y Lindstrom, 1977).

Los bioensayos de toxicidad se fundamentó según con los procedimientos

estandarizados descritos por APHA (1992) el cual se incluyó una solución

experimental tóxica con acetato de plomo ((CH3COO)2·Pb·3H2O) con la finalidad de

evitar variaciones del potencial de hidrógeno (pH) en cada uno de los tratamiento con

plomo. La ruta de intoxicación que se implementó fue por las vías de respiración y

por contacto mediante inmersión total del animal en una solución tóxica del plomo,

además se consideró como un animal muerto cuando tenía movimientos letárgicos.

VI.2.2. Determinación de los parámetros fisicoquímicos.

Cada tres horas se tomaron datos de temperatura, potencial de hidrogeno

(pH) y oxígeno disuelto, tanto en el agua experimental de plomo como el agua

control. Estos parámetros se midieron por medio de un termómetro de mercurio, un

potenciómetro marca Hanna® Instruments modelo HI-98128 y un oxímetro marca

YSI® modelo 55-12 FT, respectivamente.

VI.2.3. Bioensayo I (Exposición aguda).

Para determinar la concentración letal 50% de la población (CL50), se llevó a

cabo un bioensayo presuntivo, donde se utilizaron cuatro concentraciones de plomo

por triplicado: 400, 500, 1000 y 2000 µg L-1 y un control sin plomo como blanco,

durante 96 h. Se colocaron cinco organismos por cada tina de 100 L con 50 L de

agua experimental. Las concentraciones iniciales se tomaron en cuenta como

antecedentes lo que han estudiado Benediet et al., (2008) y Qing Wang et al., (2009),

y concentraciones encontradas en el Rio Sinaloa (Ayala Rodríguez, 2009).

13

Posteriormente se llevó a cabo un bioensayo confirmativo donde se utilizaron

siete concentraciones de plomo; 187, 355, 389, 419, 432, 1037 y 1336 µg L-1 (en

referencia al bioensayo presuntivo) y un control sin plomo. Se colocaron 10 animales

por cada tratamiento por triplicado y un control de referencia. En ambos bioensayos

(presuntivo y confirmativo) se siguió el método estadístico de Bliss (1935) y Stora

(1974) descritos detalladamente en el apartado VI.3 del presente escrito. De este

bioensayo también se obtuvó la concentración sub-letal (CSL) como la dosis cuando

resultó el mínimo efecto (primera mortalidad).

VI.2.4. Bioensayo II (Exposición crónica).

Para determinar el efecto inmunológico y la bioacumulación de plomo en cada

órgano (exoesqueleto, músculo, hepatopáncreas y hemolinfa) de M. americanum se

realizó un experimento a una concentración conocida de plomo, la cual fue

determinada a partir del bioensayo I, que resultó ser la concentración sub-letal (CSL).

Se colocaron nueve organismos en cada tratamiento y un control de referencia

durante seis semanas. Cada tratamiento se realizó por triplicado. En cada semana se

sacrificó un animal para su análisis.

Los organismos se alimentaron una vez al día (18:00 h) ad libitum, en tinas

independientes.

VI.3. Cuantificación de plomo.

Para conocer las concentraciones reales empleadas en cada tratamiento, se

cuantificó la concentración de plomo (Pb) en agua experimental. La muestra se

aciduló a pH 2 con ácido nítrico concentrado grado ultra-puro la muestra se inyectó al

equipo por aspersión directa. La absorbancia del elemento se analizó en un

espectrofotómetro de Absorción Atómica de Gases (AAG) Marca Varian® Modelo

Spectro AA-220, con lámparas de cátodo hueco mono elementales a una longitud de

onda de 217 nm aplicando el método de flama con quemador aire/acetileno. La

cuantificación de plomo se realizó previa construcción de curvas de calibración con

estándares certificados Perkin Elmer (NMX-AA-051-SCFI 2001; Varian instruments

1989).

14

Para cuantificar el plomo en hemolinfa se siguió el protocolo establecido por

INSHT (1990), el fundamento del método se basó en utilizar un tensoactivo o

modificador de matriz que funcionará como quelante. La hemolinfa se trató con

anticoagulantes isotónicos. Esta se homogenizó con un agitador, posteriormente se

mezcló con 600 µL del modificador de matriz (Dihidrógeno de Fosfato-Triton X-100-

APDC-Triclorometano) y con una alícuota de 50 µL de hemolinfa con anticoagulante.

La muestra preparada se introdujo directamente en el horno de grafito del AAG. El

análisis se efectuó con un programa de temperaturas y tiempos (Cuadro 1):

Cuadro 1. Método establecido según INSHT 1990, para determinar

plomo en hemolinfa. Para horno de grafito AAG.

ETAPA TEMPERATURA

(°C)

RAMPAS

(Seg)

ISOTERMAS

(Seg) ESPECIFICACIONES

1 110 10 10 SECADO

2 200 10 10 SECADO

3 800 10 10 MINERILIZACIÓN

4 850 5 5 MINERILIZACIÓN

5 1700 0 3 ATOMIZACIÓN

6 2600 1 3 LIMPIEZA

7 20 1 4 RECUPERACIÓN

Para la determinación de la bioacumulación del plomo (Pb) en los diferentes

tejidos (exoesqueleto, músculo, hepatopáncreas y hemolinfa), se llevó a cabo por la

técnica de AAG. Para ello se realizó el siguiente procedimiento químico que consistió

en secar en un horno a una temperatura de 60°C., un peso aproximadamente de 0.5

gr de cada tejidos el cual fue colocado en frascos de teflón de alta temperatura y

presión de 250 ml de capacidad posteriormente se efectuó una digestión ácida el

cual se añadió 10 ml de ácido nítrico concentrado grado ultra-puro, teniendo cuidado

de evitar pérdidas de muestras. Para la digestión total del tejido se empleó una

plancha de calentamiento a 85±5ºC para su digestión total aproximadamente durante

3 a 4 horas.

La solución resultante se dejó enfriar y se aforó a 20 ml con agua desionizada

ultra-pura. La absorbancia del elemento se analizó en un equipo de AAG Marca

15

Varian Modelo SpectrAA-220, con lámparas de cátodo hueco mono elementales de

plomo a una longitud de onda de 217 nm aplicando el método de flama con

quemador aire/acetileno. La cuantificación de plomo se realizó previa construcción de

curvas de calibración con estándares certificados Perkin Elmer (NMX-AA-051-SCFI

2001; Varian instruments 1989). La validación de la calidad de los análisis se realizó

empleando material de referencia certificado de tejido de molusco SRM 1566b

(Tejido de ostra 1566b, Departamento de Comercio, E.U.A., Instituto Nacional de

Estándares y Tecnología. Gaithersburg, M. D. 20899).

VI.4. Ingesta.

Se alimentó ad libitum (pesando la ración suministrada) todos los días a las

18:00 hrs (noche). Posteriormente al día siguiente a las 07:00 hrs (mañana) se

recolectó y se peso el alimento no consumido. La diferencia de pesos dio la ingesta

que el organismo asimiló. Además se realizaron biometrías y se relacionó con la

ingesta para calcular la Tasa de Conversión Alimenticia (TCA). Se empleó este

procedimiento ya que esta especie en particular tiene hábitos nocturnos

(alimentación, apareamiento, etc.) y durante el día están escondidos en sus refugios.

VI.5. Análisis del sistema inmunológico.

El sistema inmune de cada uno de los langostinos y el control, se analizó

semanalmente en cada uno de los tratamientos con muestras de hemolinfa en el

bioensayo II.

VI.5.1. Obtención de la hemolinfa.

La extracción de la hemolinfa se realizó entre las 8:00 y 9:00 hrs tiempo que

los organismos se encontraban en ayunas para evitar diferencias debidas al ritmo

circadiano. La hemolinfa se extrajó con una jeringa para insulina (1 mL, 27G x 13

mm) de la parte ventral que comprende el primer segmento de los pleópodos,

ligeramente anterior al poro genital. La jeringa se cargó con una solución isotónica

para invertebrados dulce acuícolas y EDTA como anticoagulante (SIC-EDTA, Na2)

previamente enfriado a 4 °C (Vargas-Albores et al., 1996) en una proporción 2:1 (2

16

volúmenes de anticoagulante por cada volumen extraído de hemolinfa). Al extraer la

hemolinfa, se evitó la formación de burbujas en la jeringa ya que estas podrían

acelerar el proceso de coagulación. Inmediatamente después de ser extraída la

muestra de hemolinfa, se tomaron sub-muestras en tubos Eppendorf colocados a 4

°C, las cuales se utilizaron posteriormente para las determinaciones de los siguientes

parámetros; conteo total de hemocitos, fenoloxidasa (FO), pro-fenoloxidasa (proFO),

proteína total y metales pesados.

VI.5.2. Coagulación.

Semanalmente se tomaron muestras de tres organismos expuestos y

controles. Se utilizó una jeringa de insulina de 1 ml, la muestra de hemolinfa se

colocó en un portaobjetos donde se friccionó para detectar el tiempo de coagulación

se registró el tiempo transcurrido desde el sangrado hasta la coagulación.

VI.5.3. Cuantificación de proteínas.

Para evaluar la concentración de proteína total en hemolinfa, se determinó la

concentración de proteína en plasma y SLH utilizando la técnica de Bradford (1976)

utilizando albúmina de suero bovino para construir una curva estándar. La técnica se

basa en la unión del colorante Comassie azul brillante G-250 a las proteínas, cuyo

color puede ser medido la absorbancia con un espectrofotómetro Thermo Spectronic

Genesys 2 (Thermo Scientific®) a 595 nm. Para evaluar su concentración se realizó

una dilución 1:100 en las muestras de proteína en plasma, se tomó 20 µL de plasma

(diluido) y se colocó en la microplaca. Posteriormente, se adicionaron 200 µL de la

solución de Bradford, la mezcla se incubó por 10 min y se tomó la lectura en el lector

de microplacas a 595 nm.

VI.5.4. hemocitos totales.

El conteo de los hemocitos se realizó con una cámara de Neubauer con la

retícula de 0.01 mm. Para ello, se tomaron 50 µL de hemolinfa y se diluyeron (1:5,

v/v) en una solución de formol al 4%. A partir de esta dilución se realizaron dos

conteos en el microscopio, (sin diferenciar hemocitos hialinos, semi-granulares y

17

granulares) en cada segmento. El promedio de la cuantificación de las células por

cada sector de la cámara se multiplicó por 10,000 y por la dilución de la solución

anticoagulante para obtener el total de hemocitos x 100 mL-1 hemolinfa.

VI.5.5. Medición de fenoloxidasa (FO) y profenoloxidasa (proFO).

Primeramente se separó la fracción de hemocitos y del plasma centrifugando

la hemolinfa a 800 x g por 5 min a 4 C. El plasma se recuperó sin arrastrar la pastilla

que se formó en el fondo, posteriormente se preservó a 4 C. El paquete celular se

lavó con 1 mL de anticoagulante. La muestra lavada se centrifugó nuevamente a 800

x g por 5 min a 4 C y el sobrenadante se desechó. Al paquete celular se adicionó 1

mL de cacodilato al 10 mM pH 7.0 a 4°C y se centrifugó a 14,000 x g durante 10 min

a 4 C, para romper las células y liberar el contenido celular, a este extracto se le

conoce como sobrenadante del lisado de hemocitos (SLH). El SLH y el plasma se

mantuvieron a 4 C para los análisis de profenoloxidasa (proFO) y fenoloxidasa (FO).

Para el análisis posterior de proteína en SLH y plasma, se preservaron a ultra

congelación (-70 C).

La medición de la proFO y la FO se realizó con la técnica descrita por

Hernández-López et al., (1996). La actividad de la FO presente en el plasma se midió

como la formación de dopacromo a partir de L-dihidroxifenilalanina (L-Dopa). A 50 µL

de muestra, se le adicionaron 50 µL de búfer de cacodilato 10 mM, pH 7 y 50 µL de

L-Dopa (3 mg mL-1 en agua destilada). Se incubó durante 10 min a temperatura

ambiente (aproximadamente a 25 °C), después se le adicionaron 100 µL de búfer de

cacodilato y se determinó la absorbancia a 492 nm en un espectrofotómetro Thermo

Spectronic Genesys 2 (Thermo Scientific®). En todos los ensayos se utilizó cacodilato

como control negativo. Para la actividad de la proFO presente en el SLH se activó

previamente como sigue: a 50 L de SLH y se le añadió 50 L de tripsina (0.1 mg

mL-1) para convertirla en FO incubando por 10 min a 25 ºC y a continuación se

adicionó 50 L de L-dihidroxifenilalanina (L-Dopa) (3 mg mL-1). Se realizó una

segunda incubación por 5 minutos a 25 °C finalmente se adicionaron 100 L de

cacodilato, y se leyó la absorbancia a 492 nm. La actividad total se expresó como el

18

cambio en la absorbancia a 492 nm/min/mg de proteína de cada langostino. La

cantidad de proFO disponible en la muestra se calculó de la siguiente forma:

FO + FO activada con tripsina = FO total

FO total - FO = proFO

VI.6. Método estadístico.

Para calcular la CL50 se utilizó el método estadístico de Bliss (1935) el cual se

basa en la relación dosis-efecto. Este método tiene una variación lineal de los Probits

de mortalidad en función de los logaritmos de las concentraciones. Además minimiza

los extremos y maximiza las concentraciones. Para este método se realizaron una

serie de transformaciones hasta llegar una recta de regresión, considerada como

información válida estadísticamente.

Se transcribe de este método de la siguiente manera:

1.- Convertir las concentraciones (d) de exposición a logaritmo natural (X).

2.- Convertir el número de organismos muertos (r) a porcentajes (% de efecto).

3.- Establecer los Probits empíricos (PE) de las tablas de Bliss (anexo 1), en

función de los organismos muertos.

4.- Graficar una curva provisional, probits empíricos que serán interpolados

frente al logaritmo natural de las concentraciones (X).

5.- Se estiman los Probits calculados (Y), para establecer la curva de

mortalidad.

donde:

m= Probit 5 de la (curva provisional).

S= diferencia (máximo y mínimo) de (X) / diferencia (máximo y mínimo) de

(PE).

X= Logaritmo natural de la concentración.

6.- Se grafica una nueva curva de mortalidad con los logaritmos de las

concentraciones y los Probits calculados (Y), así la CL50 se lee a 50% o

Probit 5 con respecto a los logaritmo de las concentraciones.

19

7.- Se calcula el antilogaritmo del logaritmo (X) y se obtiene el resultado.

8.- Se calcula los grados de libertad n-2 y se hace la prueba de normalidad y

linealidad de la recta.

Para analizar las posibles significancias entre las diferentes replicas con

respecto al control se realizó una prueba t de student con un α=0.05 de 2 colas.

20

VII. RESULTADOS.

VII.1. Bioensayo I

VII.1.1. Concentración letal (CL50).

Se realizó un bioensayo (presuntivo) para determinar la concentración que

causa el 50% de mortalidad (CL50) de la población de cauques, durante una

exposición aguda. Grupos de animales se expusieron a cuatro dosis de plomo

disuelto en el agua. Los resultados de las distintas dosis experimentales evaluadas

por AAG fueron 419, 1037, 1336, 1667 µgL-1 (concentraciones reales). Se obtuvo

que; las dosis empleadas no fueron las adecuadas ya que se obtuvieron altas

mortalidades y no se puede observar el efecto de la mortalidad del 50% de la

población (Tabla 2), la concentración letal (CL50) se ubicó entre 419 y 1037 µg L-1 a

las 96 hrs de exposición. Por lo que fue necesario realizar un segundo bioensayo

(confirmativo) considerando el resultado anterior ajustando las concentraciones más

cercanas al 50% de mortalidad.

Cuadro 2. Mortalidad de M. americanum, dosis expuestas a

diferentes concentraciones de plomo, bioensayo (presuntivo).

CONCENTRACIÓN DE PLOMO µg L-1

HORAS/MORTALIDAD.

24 48 72 96

419 0 1 2 3

1037 1 2 3 4

1336 4 5 5 5

1667 5 5 5 5

El Bioensayo (confirmativo), siguió el mismo procedimiento que en el

bioensayo anterior solo se ajustó las concentraciones con una mayor cercanía a la

mortalidad del 50%, la CL50 dando intervalos de concentración por arriba y abajo

entre (419 y 1037 µg L-1). Se formaron siete dosis de plomo experimental, los

resultados obtenidos de las lecturas por AAG al evaluar las distintas dosis fueron

187, 355, 389, 419, 432, 1037 y 1336 µg L-1. Se realizó por triplicado y con un control

de observación, los datos obtenidos se obtuvieron la media aritmética y se

consideraron números enteros ya que se cuantifica como organismos muertos.

21

Se observó en las concentraciones más altas una mortalidad total en las

primeras 24 horas de exposición con el contaminante, posteriormente en las

concentraciones medias mortalidades de 3 a 4 organismos a las 72 horas con una

mejor resistencia y en las concentraciones más bajas una mortalidad de 1 organismo

(Tabla 3).


diferentes concentraciones de plomo, bioensayo (confirmativo).

CONCENTRACIÓN DE PLOMO µg mL-1

HORAS/MORTALIDAD.

24 48 72 96

0.187 0 0 0 1 0.355 0 0 1 2 0.389 0 1 2 4 0.419 1 3 4 6

0.432 3 4 5 7

1.037 5 6 7 8

1.336 9 9 9 9

En esta segunda prueba (confirmativa), se le aplico el método estadístico de

Bliss, en el Cuadro 4, se muestra los promedio de las mortalidades para cada dosis

experimental observándose una mortalidad gradual ascendente conforme aumenta

las dosis experimentales, posteriormente fue necesario transformación los números

Probit empíricos a números Probit calculado (Cuadro 5). Con esta información se

elaboró una gráfica donde se relacionó los números probit calculados y el logaritmo

natural de cada concentración experimentales, obteniendo una curva lineal (Figura 2)

de esta gráfica se tomó el valor de 5 probit (como valor del 50% de efecto) y se

calculó mediante la ecuación lineal de la recta (Figura 2), que dio un resultado de 2.6

logaritmo natural de la concentración a este valor se le calcula el antilogaritmo y ese

es el resultado final de la concentración letal al 50% CL50, se obtuvo como resultado

que la CL50 a 96 horas fue de 0.398 µg mL-1, con 5 grados de libertad y un 95% de

confianza.

22

VII.1.2. Concentración sub-letal (CSL11).

Para determinar la concentración sub-letal (CSL), se tomaron los datos del

mismo procedimiento anterior, solo que se tomó como resultado la primera

mortalidad registrada del bioensayo (confirmativo), ya que es la primera respuesta

que expresa el organismo en relación a la mínima dosis (Cuadro 5), la primer

mortalidad se reflejo con un efecto del 11.11 %. Se tomó este valor de referencia y la

ecuación lineal de la recta (Figura 2), que dio un resultado de 2.27 logaritmo natural

de la concentración a este valor se le calcula el antilogaritmo y ese es el resultado

final de la concentración sub-letal al 11% de mortalidad de la población (CSL11) a las

96 horas fue de 0.186 µg mL-1, con 5 grados de libertad y un 95% de confianza.


diferentes concentraciones de plomo, por triplicado y promedio.

CONCENTRACIÓN DE PLOMO µg mL-1

MORTALIDAD 1RA. REPLICA

MORTALIDAD 2DA. REPLICA

MORTALIDAD 3RA. REPLICA

PROMEDIO

0.187 1 1 1 1

0.355 1 2 2 2 0.389 4 4 3 4 0.419 6 5 6 6 0.432 7 7 7 7 1.037 8 8 8 8

1.336 9 9 9 9

Cuadro 5. Cálculo numérico de la CL50 por el método de Probits.

CONCENTRACIÓN DE PLOMO

µg mL-1

MORTALIDAD % DE

EFECTO LOGARITMO DE LAS CONCENTRACIONES

PROBIT EMPIRICO

PROBIT CALCULADO

0.187 1 11.11 2.27 3.77 2.94 0.355 2 22.22 2.55 4.23 4.69 0.389 4 44.44 2.59 4.85 4.94 0.419 6 66.66 2.62 5.41 5.13 0.432 7 77.77 2.64 5.74 5.22 1.037 8 88.88 3.02 6.18 7.60 1.336 9 100 3.13 9.09 8.29

23

Figura 2. Curva de mortalidad de M americanum. Con cinco grados

de libertad y un 95% de confianza.

VII.2. Bioensayo II.

Para llevar a cabo el bioensayo II se tomó en cuenta la concentración sub-letal

al 11% de mortalidad de la población (CSL11), con base al resultado del bioensayo I

(0.186 µg mL-1). Se prepararon 3 réplicas de las dosis experimentales y un control

como blanco con 10 organismos en cada estanque, procurando de manera constante

tener siempre la misma concentración de 0.186 µg mL-1. Las concentraciones reales

de las dosis experimentales tuvieron una variación cercana a la dosis experimental

(0.195 ± 0.011 µg mL-1), sin diferencia significativa. La figura 3 muestra la

reproducibilidad de las dosis de plomo usadas en el bioensayo II con una exposición

crónica de los organismos.

y = 6.263x - 11.28 R² = 0.999

2

3

4

5

6

7

8

9

2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4

Pro

bit

cal

cula

do

s

Logaritmo de las concentraciones de "Pb"

CL50 y CSL11 M. americanum

24

Figura 3. Control (condiciones óptimas). Dosis de plomo expuesto

(0.186 µg mL-1). Concentración promedio de plomo experimental

(expuestos). No existe diferencias significativas (p˃0.05). Barras de

error = promedio EE.

VII.2.1. Bioacumulación de plomo en M. americanum.

Exosqueleto.

La cantidad de plomo fijado en el exosqueleto en los animales del tratamiento

control presentó una oscilación de 0.002 hasta 0.018 µg g-1. Sin embargo, en el

tratamiento con la dosis de plomo tuvo una tendencia a bioacumular en este tejido,

donde a partir de la semana dos aumentó considerablemente con respecto al control

de 0.154 hasta 0.335 µg g-1; presentando diferencias significativas con respecto al

control (Figura 4).

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0 1 2 3 4 5 6

Plo

mo

(µ

g m

l-1)

Tiempo (semanas)

CONTROL

DOSIS REAL

25

Figura 4. Concentración de plomo en exosqueleto (plomo µg g-1).

Control (Condiciones óptima). Dosis de plomo expuestos (0.186 µg

mL-1). Superíndices distintos indican diferencias significativas

(p<0.05). Barras de error = promedio EE.

Hepatopáncreas.

La concentración de plomo en el control no fue detectable, mientras que el

tratamiento con plomo presentó un comportamiento de acumulación durante las seis

semanas. Sin embargo se observa que a partir de la semana tres aumentó

considerablemente de 0.499 hasta 2.150 µg g-1 (Figura 5), estadísticamente se

observaron diferencias significativas con respecto al control. Con referencia a los

demás tejidos (exosqueleto, musculo y hemolinfa) el hepatopáncreas presentó la

mayor concentración de bioacumulación.

26

Figura 5. Concentración de plomo en hepatopáncreas (plomo µg g-1).




Hemolinfa.

Los resultados muestran (Figura 6) que el control presentó concentraciones no

detectables, de igual forma en el tratamiento con las dosis de plomo al inicio del

bioensayo II y la semana 1 arrojo concentraciones no detectables, en la semana 4

expresó un comportamiento con una baja acumulación hasta 0.039 µg mL-1.

Consecutivamente se generó una depuración en la semana 5 hasta no detectar

plomo, en la semana seis se normalizó con respecto al control de referencia.

Estadísticamente se observó diferencias significativas con respecto al control solo en

las semanas 2, 3, 4 y 6.

27

Figura 6. Concentración de plomo en hemolinfa (plomo µg mL-1).




Músculo.

El control presentó concentraciones no detectables, de la misma

manera en el tratamiento con plomo al inicio del bioensayo II y la semana 1

mostró concentraciones no detectables, en la semana cuatro obtuvo un

comportamiento con una baja acumulación hasta 0.056 µg g-1.

Posteriormente surgió una depuración en la semana cinco hasta no detectar

plomo, en la semana 6 se normalizó la presencia de plomo en referencia con

el control. (Figura 7). Estadísticamente se observó diferencias significativas

con respecto al control solo en las semanas tres y cuatro.

28

Figura 7. Concentración de plomo en músculo (plomo µg g-1).

Control (Condiciones óptima). Dosis de plomo (0.186 µg mL-1).

Superíndices distintos indican diferencias significativas (p<0.05).

Barras de error = promedio EE.

VII.2.2. Ingesta.

La alimentación de los organismos durante el desarrollo del bioensayo II fue a

libre demanda con hábitos nocturnos, por ende se garantizó que siempre estuvieron

alimentados. El control tuvo un ligero incremento en su ingesta que osciló desde la

semana uno con 3.60 TCA hasta la semana seis con 4.93 TCA. No obstante el

tratamiento con la dosis de plomo a una CSL11 (0.186 µg mL-1) se vio afectado

siempre por debajo del control a partir de la semana tres hasta seis con 3.34 hasta

3.94 TCA, en todos los casos mencionados presentó diferencias significativas con

respecto al control (Figura 8). A pesar de presentar un bajo consumo de alimento los

organismos presentaban condiciones favorables para seguir sobreviviendo aun en

condiciones de toxicidad con plomo.

29

Figura 8. Ingesta (gr. alimento consumido. gr. peso del organismo-

1). Control (Condiciones óptima). Dosis de plomo expuesta (0.186 µg



VII.2.3. Sistema inmunológico.

Tiempo de coagulación.

Los resultados del bioensayo II en lo que respecta con el tiempo de

coagulación de la hemolinfa, se encontró que en el control de referencia se mantuvo

durante la transición de las 6 semanas entre 20 a 35 segundos que tardo en

coagular, sin embargo, se observó que en el tratamiento con la concentración CSL11

osciló de 21 hasta 100 segundos. Estadísticamente se observó diferencias

significativas del control con respecto al concentración CSL11 de plomo a partir de la

semana 2 y aumentando considerablemente hasta la semana seis (Figura 9).

30

Figura 9. Tiempo de coagulación. Control (Condiciones óptima).

Dosis de plomo expuesto (0.186 µg mL-1). Superíndices distintos

indican diferencias significativas (p<0.05). Barras de error = promedio

EE.

Cantidad de proteína en plasma.

En lo que respecta a la cantidad de proteína en el plasma de la hemolinfa,

este resultó tener una mayor concentración en referencia con el SLH. El control

presentó a lo largo de las seis semanas una distribución similar que fluctuó de

141.122 hasta 150.222 mg ml-1; sin embargo en el tratamiento con la dosis de plomo

a una CSL11 (0.186 µg mL-1) presentó afectaciones en la concentración de este

parámetro, en la semana 0 a la tres bajo, desde 147.367 hasta 108.784 mg ml-1. En

todos los casos mencionados presentó diferencias significativas con respecto al

control. Posteriormente, en la semana 4 a la 6, se normalizó su concentración con

respecto al control (Figura 10).

31

Figura 10. Proteína en plasma. Control (Condiciones óptima). Dosis

de plomo expuesto (0.186 µg mL-1). Superíndices distintos indican

diferencias significativas (p<0.05). Barras de error = promedio EE.

Proteína en SLH.

La cantidad de proteína que presentó el SLH en el control a lo largo

del bioensayo II, resultó tener una concentración bien definida el cual osciló

de 0.822 hasta 0.996 mg/ml; sin embargo, en el tratamiento con la dosis de

plomo a una CSL11 (0.186 µg mL-1) se vio afectado este parámetro, en la

semana dos y tres subió considerablemente hasta 1.866 mg ml-1.

Posteriormente, en las semanas cuatro y cinco disminuyó gradualmente

hasta 1.051 mg ml-1; en todos los casos mencionados presentó diferencias

significativas con respecto al control (Figura 11).

32

Figura 11. Proteína en SLH. Control (Condiciones óptima). Dosis de

plomo expuestos (0.186 µg mL-1). Superíndices distintos indican

diferencias significativas (p<0.05). Barras de error = promedio EE.

Conteo de hemocitos.

La cantidad de hemocitos totales del control tuvo como promedio 0.9 millones

células ml-1., mientras que, para el tratamiento con plomo presentó desde 0.7 hasta

4.9 millones células ml-1. Estadísticamente se observaron diferencias significativas

del control con respecto a la concentración CSL11 de plomo a partir de la semana uno

y aumentando considerablemente hasta la semana seis (Figura 12).

Figura 12. Cantidad de hemocitos totales. Control (Condiciones

óptima). Dosis de plomo expuesta (0.186 µg mL-1). Superíndices

distintos indican diferencias significativas (p<0.05). Barras de error =

promedio EE.

33

Actividad de fenoloxidasa (SLH).

Los resultados de la actividad de la fenoloxidasa en SLH mostró que el control

presentó una actividad de 0.77 hasta 1.18 [(Abs min-1 mL-1 de muestra) × 10-3]. Sin

embargo, en el tratamiento con la dosis de plomo a una CSL11 (0.186 µg mL-1)

presentó un aumento a partir de la semana uno con 4.58 [(Abs min-1 mL-1 de

muestra) × 10-3] hasta una máxima en la semana tres con 10.00 [(Abs min-1 mL-1 de

muestra) × 10-3]. A partir de la semana dos hasta la semana 3 presentó diferencias

significativas con respecto al control (Figura 13).

Figura 13. Actividad de la profenoloxidasa (SLH). Control

(Condiciones óptima), Dosis de plomo expuestos (0.186 µg mL-1).



Actividad de fenoloxidasa (plasma).

La actividad de la fenoloxidasa en el plasma, en el tratamiento control presentó una

distribución desde 3.17 hasta 3.77 [(Abs min-1 mL-1 de muestra) × 10-3]. El

tratamiento expuesto al plomo en la semana uno registró 1.66 [(Abs min-1 mL-1 de

muestra) × 10-3] por debajo al control y en la semana tres y seis aumento hasta 5.39

y 5.91 [(Abs min-1 mL-1 de muestra) × 10-3] respectivamente. (Figura 14).

34

Figura 14. Actividad de la profenoloxidasa en plasma. Control

(Condiciones óptima). Dosis de plomo expuesta (0.186 µg mL-1).



VII.3. Parámetros fisicoquímicos.

Según Díaz 2001 los intervalos óptimos para el cultivo de langostino en

ambientes controlados son: oxígeno disuelto de 5.0 a 6.0 mg L-1; pH de 7.5 a 8.5 y

temperatura de 26 a 32 °C.

Los parámetros fisicoquímicos (Cuadro 6) en el bioensayo I presentó los

siguientes valores promedios, la temperatura (29.84 ± 2.29 °C), oxigeno disuelto

(5.53 ± 0.46 mg L-1) y pH (8.16 ± 0.06 UpH). En el bioensayo II registró los siguientes

valores promedios, la temperatura (24.11 ± 2.09 °C), oxigeno disuelto (5.81 ± 0.86

mg L-1) y pH (8.10 ± 0.04 UpH).

35

Cuadro 6. Parámetros fisicoquímicos del bioensayo I y II. Dosis de

plomo expuesto (0.186 µg mL-1), temperatura, oxígeno disuelto y

potencial de hidrógeno. Promedio EE.

TRATAMIENTOS TEMPERATURA

(° C) OXÍGENO DISUELTO

(mg L-1) pH

(UpH)

Bioensayo I Control 28.08±1.67 5.98±0.38 8.21±0.07

Dosis de plomo replica 1 30.41±2.19 5.44±0.33 8.14±0.05 Dosis de plomo replica 2 31.03±1.94 5.17±0.22 8.13±0.05

Dosis de plomo replica 3 28.41±2.83 5.28±0.22 8.10±0.05 Bioensayo II

Control 25.91±0.61 6.82±0.27 8.10±0.01

Dosis de plomo replica 1 25.01±2.70 6.08±0.55 8.10±0.01



36

VIII. DISCUSIONES

Explorar, comprender e identificar las dosis necesarias para llevar a cabo los

experimentos fueron las bases más solidas para desarrollar los bioensayos tóxicos in

vitro. De acuerdo con Bliss (1935), estadísticamente se puede calcular la

concentración letal al 50% (CL50). En el presente trabajo se emplearon diferentes

dosis de plomo (acetato de plomo) empleando a un organismo biológico como

centinela “Macrobrachium americanum” dando como respuesta un efecto de

mortalidad a las 96 hrs. Estos resultados fueron calculados obteniendo una CL50 de

0.398 µg mL-1 a 96 horas, demostrando que M. americanum es altamente sensible al

plomo. Aquí cabe señalar que la NMX-001-ECOL-1996 de la Calidad del Agua para

la Protección de la Vida Acuática en ríos, el grado máximo permitido es de 0.400 µg

mL-1 promedio mensual, por lo que se sugiere una revisión de la norma para una

protección real de la vida acuática.

Se encontraron resultados similares en trabajos reportados por Qing Wang et

al., (2009), en un estudio con la almeja M. meretrix evaluaron la toxicidad con plomo

encontrando una CL50 de 0.353 µg mL-1 en etapa larvaria. Así mismo, Benediet et al.,

(2008) realizaron un estudio para determinar los límites de toxicidad de plomo donde

también se encontró una similitud en Cyclop sp, con 0.300 µg mL-1. Camacho y

Gamboa (2003), trabajando con postlarvas de M. rosenbergii encontraron una CL50

de 0.165 µg mL-1 a 48 horas con plomo.

Los resultados de la prueba estadística de Bliss (1935), indican que la

concentración sub-letal del mínimo efecto fue al 11% (CSL11), con una concentración

de 0.186 µg mL-1 a 24 horas. Este parámetro presentó resultados muy similares a lo

recomendado en la NOM-001-ECOL-1996 de la calidad del agua en el uso y

aprovechamiento del agua en ríos para la protección de la vida acuática, cuya

concentración es de 0.200 µg mL-1 como promedio diario. Además Benediet et al.,

(2008) también encontraron límites de toxicidad del plomo en Daphnia magna

mostrando una concentración de 0.190 µg mL-1. Bajo este mismo criterio,

37

recientemente Ayala Rodríguez (2009) encontró en el Río Sinaloa concentraciones

máximas de 0.130 µg mL-1 en la sindicatura de Los Quemazones, Guasave.

La CSL11 calculada y empleada en este trabajo resultó ser apropiada para la

descripción del comportamiento de algunas variables que intervienen en la toxicidad

del plomo en M. americanum.

Uno de los primeros signos observados en los organismos expuestos fue la

disminución de la ingesta hasta un 12% con respecto a la semana uno. Conforme los

organismos controles iban creciendo, la ingesta aumentó de forma continua hasta

llegar a un aumento del 36% al final del experimento.

Las moléculas de plomo tienen la capacidad de unirse a sitios específicos de

aminoácidos que tienen en su cadena azufre (cisteínas). Además son altamente

inhibidoras de enzimas que necesitan un co-factor (Zn, Fe, Cu, Ca) para activarse

(Castillo-Rodríguez, 2005). De acuerdo con Sritunyalucksana y Söderhäll (2000) la

coagulación de la hemolinfa es una respuesta de defensa en los crustáceos, para

sellar sus heridas evitando la entrada de partículas extrañas. Ellos describen que el

ion calcio (Ca++) es un factor limitante para que se lleve a cabo con mayor eficiencia

la coagulación, por lo que podemos relacionar en este estudio los organismos

tratados con plomo resultaron afectados ya que resultó que disminuyó la capacidad

de coagulación de 21 a 100 segundos, conforme aumentaba el tiempo de explosión

del plomo. Debido a la acción tóxica del plomo impidió que se llevará a cabo una

serie de reacciones enzimáticas proteolíticas en el plasma de la hemolinfa donde se

sustituyo el Calcio por el Plomo. Por lo tanto se infiere que el plomo tuvo la

capacidad de desplazar al Calcio (Ca+2) y la afinidad para sustituirlo por tener un

radio iónico muy similar (Pb+2), cambiando la funcionalidad de la moléculas y

haciéndola menos efectiva ya que el tiempo de coagulación se prolongó hasta los

100 segundos (Reyes-Gil 1999, Boada et al., 2007).

38

Los hemocitos forman parte importante de la coagulación de la hemolinfa,

gracias a la enzima Transglutaminasa (TGasa) que se encuentra en el interior de las

células hialinas (hemocitos), el cual solo es liberada al plasma en presencia de

alguna herida (Yeh et al., 1998). En el presente trabajo, los hemocitos aumentaron

paulatinamente durante todo el experimento, lo cual hace pensar que había

suficiente TGasa y que el mal funcionamiento de la coagulación fue dada por la

sustitución del calcio por el plomo.

La distribución del plomo en los tres tejidos y en la hemolinfa del organismo

presentó un orden cumulativo decreciente de la siguiente manera: Hepatopáncreas˃

Exosqueleto˃ Músculo˃ Hemolinfa. Observándose dos grupos con comportamientos

diferentes: Grupo I.- El hepatopáncreas y exosqueleto, desarrollaron una

acumulación creciente durante las seis semanas. Grupo II.- El músculo y hemolinfa

desarrollaron una baja acumulación durante las cuatro semanas que posteriormente

se origino una depuración en la semana cinco5.

Según lo reportado por Soto-Jiménez et al., (2011), encontraron que el plomo

dentro de la cadena trófica produce una red de bioacumulación donde principalmente

recae en dos niveles tróficos; en los peces hasta 3.4 µg g-1 y en camarones hasta 3.5

µg g-1. En el presente trabajo se relaciona de igual manera la bioacumulación del

plomo en el hepatopáncreas de M. americanum iniciando desde una concentración

no detectable hasta 2.15 µg g-1.

Por otra parte se han reportado valores de plomo en organismos silvestres.

Según Nguyen (2008) en hepatopáncreas, exosqueleto y músculo de M. rosenbergii,

en un rango de 0.011 a 0.109 µg g-1, 0.026 a 0.134 µg g-1 y 0.002 a 0.025 µg g-1,

respectivamente. Además, Ala et al., (2010) encontraron concentraciones en hígado

y músculo de Clarias gariepinus desde 5.51 a 20.73 µg g-1 y 5.89 a 14.51 µg g-1,

respectivamente. Resultados similares se encontraron en el presente estudio en el

exosqueleto y musculo de M. americanum, según Nguyen (2008) y por debajo según

lo reportado por Ala et al., (2010).

39

El sistema ProFO actúa ante la presencia de materiales extraños (Vargas-

Albores; 1996), sin embargo, para la eliminación de materiales tóxicos que no son

reconocidos directamente por el sistema ProFO como los metales pesados, existen

varias vías de desintoxicación entre las que destaca la quelación de los metales

divalentes como el plomo por una proteína llamada Metalotioneína (Roesijadi 1992),

la cual después de atrapar el plomo expone un sitio que es reconocido por la FO. La

Metalotioneína una vez reconocida u opsonizada por la FO, es fagocitada por los

hemocitos, los cuales forman vacuolas y desintoxican al organismo (Ahearn et al.,

2004). La metalotioneína puede remover hasta 5-7 moles de metales pesados por

mol de proteína (Fatemeh y Shahab 2011).

En el presente trabajo, los hemocitos aumentaron continuamente de manera

significativa hasta el final del experimento, al mismo tiempo la proteína del plasma

disminuyó regularizándose en la cuarta semana, mientras que la proteína aumento

en los hemocitos. La cantidad de proteína en el plasma es 100 veces mayor que en

los hemocitos y la disminución puede estar relacionada con la disminución en la

ingesta, por lo que no se detecta una relación con la generación o consumo de

proteína ligada al plomo. Sin embargo, el aumento de proteína en los hemocitos

concuerda con la fagocitosis de la metalotioneína que queló el plomo hasta la tercera

semana. Esta explicación concuerda con los niveles de actividad de la FO y proFO,

la primera semana se consumió la FO de manera significativa aunque también hubo

un aumento de su producción en la ProFO. La tercera semana es clave en el proceso

de desintoxicación, aquí se encontraron las máximas concentraciones de proFO y

FO y proteína dentro de las células y en la cuarta semana también las máximas

concentraciones de plomo en hemolinfa y músculo. Para la quinta semana los niveles

de plomo en hemolinfa y musculo descendieron a cero, lo que significa que el

proceso de desintoxicación vía metalotioneína funcionó adecuadamente.

A partir de la cuarta semana, los datos sugieren que se detuvo el proceso de

desintoxicación por metalotioneína y se activó otro proceso diferente. Ahearn et al.,

(2004) hace referencia a diferentes procesos de secuestro y desintoxicación por

metales pesados en crustáceos. Ellos proponen un mecanismo de transporte de

40

cationes en la glándula digestiva en donde los metales pesados se absorben por el

epitelio de la glándula digestiva para secuestrarlas en las mitocondrias o en

lisosomas como un precipitado insoluble. En el presente trabajo no se tiene evidencia

clara del proceso que siguió después de la desintoxicación en la tercer semana,

únicamente se tiene el dato de un aumento progresivo de plomo en la glándula

digestiva, lo cual nos da indicios de la participación de esta glándula en el secuestro

del plomo. Como dato adicional, las glándulas digestivas de los langostinos

expuestos, se melanizaron (tornando una apariencia más obscura) y fueron de

menor tamaño que los controles (Anexo 3).

En el exoesqueleto también se detectó hasta 10 veces más plomo que en la

hemolinfa y se concentró en forma continua hasta la sexta semana, esto nos dice

que el plomo que se inserta en el exoesqueleto, tomando el lugar del calcio, no se

retira sino hasta que el organismo muda, quedando el plomo disponible para ser

ingerido por el mismo langostino u otros organismos que ingieren el exoesqueleto

(Soto-Jiménez et al., 2010).

41

IX. CONCLUSIONES

OBJETIVO 1.

La CL50 y CSL11 obtenidas por el método estadístico de Bliss fueron de 0.398

µg mL-1 y 0.186 µg mL-1 respectivamente, estas concentraciones son menores

que las concentración marca en la NMX-001-ECOL-1996 tanto para el máximo

promedio mensual y máximo promedio diario.

M. americanum puede utilizarse como organismo centinela por tener

sensibilidad al plomo al expresar una CL50 y CSL11 más bajo que las normas

ambientales mexicanas (NMX-001-ECOL-1996).

OBJETIVO 2.

El hepatopáncreas desarrolló la mayor bioacumulación de plomo.

En el músculo y hemolinfa se desarrolló la menor bioacumulación de plomo.

OBJETIVO 3.

La CSL11 de plomo (0.186 µg mL-1) tuvo un efecto crónico sin mortalidad en M.

americanum lo cual permitió el estudio del efecto de la ingesta y las variables

inmunológicas.

Los organismos expuestos al plomo tuvo una disminución de la TCA hasta un

36% con respecto al control.

Los organismos expuestos al plomo disminuyo su capacidad de coagulación

retardándose hasta 100 segundos.

El sistema de inmunológico innato del M. americanum no reconoció y eliminó

el material tóxico del plomo, por lo que la desintoxicación fue por la vía de la

quelación del plomo por la Metalotioneína que expone un sitio específico para

42

poder ser reconocida y opsonizada por la FO y posteriormente fagocitada por

los hemocitos y almacenada en las vacuolas.

43

X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Ala G., Osman M., and Werner K. (2010). “Water quality and heavy metal monitoring

in wáter, sediments and tissues of the Africa catfish Clarias gariepinus from the River Nile, Egypt”. Scientific research. Journal of environmental protection 1:389-400 p.

Adachi, K., Hirata T., Nishioka, and M. Sakaguchi. (2003). “Hemocyte components in

crustaceans convert hemocyanin into a phenoloxidase-like enzyme”. Comparative Biochemistry and Physiology Part B 134: 135-14 p.

Ahearn G., Mandal P., and Mandal A. (2004). “Mechanisms of heavy-metal

sequestration and detoxification in crustaceans”. Springer-Verlag. Comp physiol 174: 439-452 p.

Alba-Tercerdo J. (1996). “Macroinvertebrados acuáticos y calidad de los aguas de los

ríos”. IV Simposio del agua en Andalucía, Almeria. Vol. II: 203-213. ISBN: 84-7840-262-4 p.

Amiard J.C, Amiard C, Barka S, Pellerin J. and Rainbow S. (2006). “Metallothioneins

in aquatic invertebrates: their role in metal detoxification and their use as biomarkers”. Aquat Toxicol 76:160-202 p.

APHA, AWWA Y WPCF. (1992). “Métodos estandarizados para el análisis de agua y

aguas residuales”. Asociación Americana de salud pública, ciudad de Washington.

ATSDR. (2007). “Agencia para Sustancias Tóxicas y el Registro de Enfermedades”.

Departamento de Salud de los EEUU. Resumen de salud pública por Plomo. Publicación CAS núm. 7439-92, 15 p.

Ayala Rodríguez. (2009). “Metales pesados en agua y sedimento del Río Sinaloa”.

Tesis de maestría. CIIDIR-SIN. IPN. 88 p. Bate, S. (1868). “Un Nuevo género con cuatro nuevas especies de langostino de

agua dulce”. Desarrollo de la sociedad zoológica de Londres. 363-368 pp. Benediet O., Offem, Ezekiel O., and Ayotunde. (2008). “Toxicity of lead to freshwater

invertebrates (water fleas; Daphnia magna and Cyclop sp) in fish ponds in a tropical floodplain”. Springer science. Water air soil pollut 192:39-46.

Berg y Granmo A. (1976). “Procedimiento para las pruebas de toxicidad en un

sistema de flujo continuos”. Curso de capacitación sobre contaminación marina en relación con la protección de los recursos vivos. FAO/SIDA/TF-108.

44

Bliss C. L. (1935). “El cálculo de la curva dosis-mortalidad”. Análisis y aplicación de biología. Volumen (22), paginas 134-167.

Boada M., Moreno Ma., y Gil H. (2007). “Metales Pesados (Cu+2, Cd+2, Pb+2, Zn+2) en

músculo y cefalotórax de camarones silvestres Litopenaeus schmitti, Farfantepenaeus subtilis, F. notialis y F. brasiliensis de la Región Oriental de Venezuela.” RC, vol.17, No.2, p.186-192. ISSN 0798-2259.

Bradford, M. (1976). “A rapid and sensitive method for the quantification of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein–dye binding”. Anal. Biochem. 72: 248–54.

Castillo Rodríguez F. (2005). “Biotecnología ambiental”. Editorial TEBAR, Madrid,

España. 616 p. Camacho S., Gamboa D. (2003). “Biodisponibilidad de metales en agua salobre y su

efecto tóxico en el langostino Macrobrachium rosenbergii” Instituto de ecología, Universidad del mar, puerto ángel, Oaxaca, Méx. Revista de toxicología.

Contreras E. (1994). “Manual de técnicas hidrológicas”. Editorial Trillas. Primera

edición, ISBN 968-24-4110-2. 141 pp. Destomieux, D.; M. Muñoz, C. Cosseau, J. Rodriguez, P. Bulet, M. Comps and E.

Bachère. (2000). “Penaeidins, antimicrobial peptides with chitin-binding activity, are produced and stored in shrimp granulocytes and realesed after microbial challenge”. Journal of Cell Science, 113:461-469 p.

Decataldo A, Di Leo A, Giandomenico S., and Cardellicchio N. (2004). “Association of metals (mercury, cadmium and zinc) with metallothionein-like proteins in storage organs of stranded dolphins from the Mediterranean Sea (Southern Italy)”. Environ Monit 6:361–367 p.

Díaz F. (2001). “Producción de larva de camarón de río nativo Macrobrachium americanum, en laboratorio”. Universidad de San Carlos de Guatemala. Dirección general de investigación, DIGI-PUIRNA-CEMA. 78 pp.

Díaz M. (2005). “Efecto de cadmio y zinc en Procambarus clarkia: del accidente minero de aznalcollar”. Revista Ciencias marinas, 31(1B):197-202 p.

Doki Y., and Monden M. (2004). “Can metallothionein be a useful molecular marker for selecting hepatocellular carcinoma patients for platinum-based chemotherapy” Gastroenterol 39:1228–1229 p.

Fatemeh Shariati and Shahab Shariati (2011). ”Review on methods for determination of metallothioneins in aquatic organisms” Springer Science, Biol Trace Elem Res 141:340–366 p.

45

Garza Carbajal A. (2004). “Efecto del plomo sobre la transmisión sináptica y la actividad aferente en el sistema vesticular”. Tesis de doctorado “Biomedicina”

Hernández-López J., Gollas-Galvan T. y Vargas-Albores F. (1996). “Activación del

sistema profenoloxidasa del camarón café (Penaeus californiensis)”. Compañía bioquímica y fisiológica, 113C: 61-66 p.

Homblad, T. and K. Söderhäll. (1999). “Cell adhesion molecules and antioxidate

enzymes in a crustacean, possible role in immunity”. Aquaculture 172: 111-123 p.

INEGI. (2005). “Instituto Nacional de Estadística y Geografía”. Anuario estadístico. INSHT. (1990). “Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo” Protocolo

para determinar plomo en sangre – Método Espectrofotometría de absorción atómica. Ministerio de trabajo y asuntos sociales, Madrid España. MTA/PV-III/90.

Johnson, P. T. (1987). “A review of fixed phagocytic and pinocytotic cells of decapods

crustaceans, whit remarks on hemocytes”. Development the immunology. 11: 679-704 p.

Johansson, M.; P. Keyser; K. Sritunyalucksana and K. Söderhäll. (2000).”Crustacean

haemocytes and haematopoiesis”. Aquaculture.191:45-52 p. Kagi J., and Valle B., (1960). “Metallothionein: a cadmium and zinc containing protein

from quine renal cortex”. Biol. Chem. 235:3460-3465 p. Litchfield y Wilcoxon, (1949). “Método monográfico para obtener el valor CL50 y sus

límites de confianza”. Manual de operaciones del Envirotox Flow-thru Dilotor Sytem, Easley. USA. 25-35 p.

Martín, G.G., J.E. Hose, S. Omori, C. Clong, T. Hoodbhoy and N. Mcbrell. (1991).

“Localization and roles of coagulation and transglutaminase in hemolymph coagulation in decapods crustaceans”. Comparative Biochemistry and Physiology. 100B: 517-522 p.

Mercier L., Palacios E., Angel I., Campa-Córdova, Tovar-Ramírez, Hernández-

Herrera y Racotta S. (2006). “Metabolic and immune responses in Pacific whiteleg shrimp L. vannamei exposed to a repeated handling stress”. Elsevier-Aquaculture 258 633-640 p.

Moody J. y Lindstrom R. (1977). “Selección y limpieza de contenedores de plástico

para el almacenamiento de elementos traza”. Química analítica. 49, 2264-2267 p.

46

Montaño-Perez, K., T. Reyes-Izquierdo y F. Vargas-Albores. (1999). “El proceso de coagulación en camarones penaeidos”. Ciencia. 50, 23-28 p.

Nguyen Phuc Cam Tu. (2008). “Bioacumulación y la distribución de elementos traza

en los tejidos de langostino de río Macrobrachium rosenbergii (Decapoda: Palaemonidae) en el sur de Vietnam.” Fisheries science. 74: 109–119 p.

Nappi, A., and E. Ottaviani. (2000). “Cytotoxicity and cytotoxic molecules in

invertebrates”. BioEssays 22: 469-480 p. Norma oficial mexicana NMX-001-ECOL-1996. Límites máximos permisibles de

contaminantes en las descargas de aguas residuales en aguas y bienes nacionales. SEMARNAT. Diario Oficial de la Federación, publicado el 24 de junio de 1996. 33 pp.

Norma oficial mexicana NMX-AA-051-SCFI-2001. Determinación de metales –

método espectrofotométrico de absorción atómica. Diario Oficial de la federación, publicado el 22 de Febrero de 1982. 13 pp.

Pavé P., y Marchese M. (2005). “Invertebrados bentónicos como indicadores de

calidad del agua en ríos urbanos (Paraná-Entre Ríos, Argentina)”. Asociación Argentina de Ecología y ecología Austra 5:183-197 p.

Patterson, W. J. (1985). “Industrial wastewater treatment technology”. Second edition.

Butterwort-Heinerman. 37-40,91-100,217-220 pp. Pedersen S.N., Lundebye AK, and Depledge M. (1997). “Field application of

metallothionein and stressmprotein biomarkers in the shore crab (Carcinus maenas) exposed to trace metals. Aquat Toxicol 37:183–200 p.

Ponce Palafox. (2001). “Enfermedades del camarón de agua dulce” Macrobrachium

tenellun y M. rosenbergii durante el cultivo comercial en estanques rustico”. Revista electrónica de veterinaria.

Poletta, G. L., (2011). “Monitoreo de daño inducido por plaguicidas en Caimán

Latirostris (Yacara overo) como organismo centinela de los humedales de Argentina”. Tesis Doctoral. Facultad de ciencias exactas y naturales. Universidad de Buenos Aires, Argentina. 229 p.

Qing Wang, Baozhong Liu, Hongsheng Yang, Xiaoyu Wang y Zhihua Lin. (2009). “La

toxicidad del plomo, el cadmio y el mercurio en la embriogénesis, supervivencia, el crecimiento y la metamorfosis de las larvas Meretrix meretriz”. Springer Science, Ecotoxicológica 18:829-837.

Raa, J. (1996). “The use of immunostimulatory substances in fish and shellfish

farming”. Reviews in Fisberies Science, 4:229-288.

47

Rameswara Reddy. (2005). “Bioacumulación de Cobre en post-larvas y juveniles en camarón de agua dulce Macrobrachium rosenbergii, expuestos a niveles sub-letales de sulfato de Cobre”. Revista Elsevier. Aqua 5:626-634 p.

Reyes-Gil, R. (1999). “Las metalotioneínas como biomarcadores moleculares de la

contaminación por metales pesados en organismos acuáticos” revista INTERCIENCIAS Nov-Dic 1999, vol. 24, No. 6. 366-371 p.

Roesijadi G. (1992). “Metallothiothioneins in metal regulation and toxicity in aquatie

animal”. Aquat Toxicol 22:81 114 p. Sainz Hernández J.C. (2006). “Impulsar el cultivo de langostinos de ríos en Sinaloa”.

Revista Boletín del Instituto Politécnico Nacional (IPN), Núm. 6. Smith, V.J., and K. Söderhäll. (1983). Induction of degranulation and lysis of

hemocytes in the freswater crayfish Astacus astacus by components of the prophenoloxidase activating system in vitro. Cell and tissue research, 233: 295-303 p.

Söderhäll, K., and L. Cerenius. (1992). “Crustacean Inmunity”. Annual Reviev Fish

Diseases., Vol. 1. 2- 21 p. Song, Y.L., and C.C. Huang. (1999). “Application of Immunostimulants to Prevent

Diseases”. Recent Advances in Marine Biotechnology. 5: 173-187 p. Song, Y.L., J.J. Liu, L.C. Chan and H.H. Sung. (1997). “Glucan induced disease

resistence in tiger shrimp Penaeus monodon. Fish Vaccional” 90: 413-421p. Soto-Jiménez, Arellano-Fiore, Rocha-Velarde, Jara-Marini, Ruelas-Inzunza and

Páez-Osuna. (2010). “Trophic transfer of lead through a model marine four-level food chain: Tetraselmis suecica, Artemia franciscana, Litopenaeus vannamei y Haemulon scudderi.”. Springer Science. Arch environ contam toxicol 61:280-291 p.

Sritunyalucksana K., and Söderhäll, K. (2000) “The proPO and clotting system in

crustaceans”. Elsevier-Acuaculture 191 53.69 p. Suarez álvarez G. (2003). “Toxicidad del plomo sobre el camarón Rosado

Farfantepenaeus notialis”. Centro de investigaciones pesqueras, La Habana Cuba. II Congreso iberoamericano virtual de acuicultura. 371-377 pp.

Sung, H.; Y. Yang and Y. Song. (1996). “Enhancement of microbicid activity in the

tiger shrimp Penaeus monodon via immunostimulation.” J. Crustacean Biology 16: 278-284 p.

48

Stahl, R.G. (1997). “Sentinel species” Can mammalian and non-mammalian data be used to evaluate the human health implications of environmental contaminants. Hum. Ecol. Risk Assess Vol. 3; 329-335 pp.

Stora, G., (1974). “Computation of letal concentrations”. Mar. Biol. Bull. 5(5): 69-71

pp. Strickland J. y Parson T. (1972). “Manual de prácticas de análisis de agua” 2da.

Edición, boletín 167. Fisheries researech board of canada o hawa. Tong S, von Schirnding YE, Prapamontol T., (2000). “Environmental lead exposure: a

public health problem of global dimensions”. Bull World Health Organ.78(9):1068-1077 p.

Van de Braak, C. B., M.H. Botterblom, E.A. Huisman, J.H. Rombout and W.P. Van

der Knaap. (2002). “Preliminary study on haemocyte response to white spot syndrome virus infection in black tiger shrimp Penaeus monodon”. Diseases of Aquatic Organisms. 51: 149-155 p.

Vargas Albores, F. (1996). Sistemas de defensa del camarón café (Penaeus

californiensis). Science. 46: 33-45 p. Varian instruments. (1989). “Analytical methods the flame atomic adsorption

spectrometry”. Varian autralia, publication No. 85-100009-00, vol. AA-38. 46 pp.

Vázquez L., Zavala A., y Zenteno E. (1998) “Mecanismos de inmunidad en

crustaceos”. Universidad Autónoma del Estado de Morelos. Revista INTERCIENCIA.,Vol. 23, Núm. 6. 344-348 pp.

Velásquez O. (2005). “Estudio de etapas larvales, determinación de concentraciones

de salinidad y alimento para la producción artificial de larvas de camarón de agua dulce Macrobrachium carcinus l. en ixcán, quiché.”. Tesis de licenciatura. Universidad De San Carlos De Guatemala. 77 pp.

Villanueva F., Botello V., Paez-Ozuna F. (1988). “Evaluación de algunos metales

pesados en organismos del Rio Coatzacualcos y de la Laguna de Ostión, Veracruz, México”. Revista de contaminación ambiental 4, 19-31 p.

Villamar F. (1990). “Bioensayo para calcular el CL50 del dispersante de petróleo BP

1100-WD con larvas de camarón Penaeus Vannamei” Oceanografía del Pacífico, INOCAR, Ecuador, 6(1). 73-78 p.

Yeh, M.S., Y.L. Chen and I.H. Tsia. (1998). “The Hemolymph clottable proteins of

tiger shrimp, Penaeus monodon, and related species”. Comparative Biochemistry and Physiology. 121B: 169-176 p.

49

XI ANEXOS

Anexo1. Tabla. Relación entre el Probit empírico y el porcentaje de mortalidad (Bliss, 1935).

% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0 - 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66

10 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12

20 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,45

30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72

40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97

50 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23

60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50

70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81

80 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23

90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33

% 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

99a 7,33 7,37 7,41 7,46 7,51 7,58 7,65 7,75 7,88 9,09

a Valores entre 99,0 y 99,9.

50

An

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