º

Noemí García Fernández

Trabajo ObligatorioBIOTECNOLOGÍA E INGENIERÍA GENÉTICA

Mes y AñoEnero 2012

UNIVERSIDAD CATÓLICA “SANTA TERESA DE JESÚS DE ÁVILA”

PROPUESTA DE TRABAJO OBLIGATORIO PÁG.: 3/28

. Constraints to virus infection in Nicotiana benthamiana plants transformed with a potyvirus amplicon.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20604920

ÍNDICE

RESUMEN DEL ARTÍCULO

1. IDENTIFICACION DEL PROBLEMA

El creciente interés en el uso de plantas como biofábricas para la producción de proteínas extrañas de importancia farmacéutica e industrial ha llevado al desarrollo de sistemas de expresión nuevos para obtener altos rendimientos de los productos deseados [ 1 ]. Algunas estrategias se han centrado en el desarrollo de vectores virales de plantas, teniendo en cuenta su capacidad de replicación como una característica positiva para alcanzar los rendimientos esperados [ 2 - 4 ].

A pesar de que su rapidez a veces puede hacer que la expresión transitoria sea un método conveniente para obtener el producto de interés, uno de los objetivos de la agricultura molecular es el desarrollo de sistemas estables para evitar la inoculación de los procesos manuales que pueden dificultar y aumentar en gran escala los costos de producción. Con este propósito, los genomas de plantas han sido transformadas con copias de larga duración cDNA del genoma de los vectores virales, dando lugar a lo que se ha llamado sistemas de expresión "amplicón" [ 5 - 11]. Por lo tanto, los amplificados, que son derivados de virus transgénicos, fueron diseñados para combinar la estabilidad genética de las plantas transgénicas con la elevada tasa de replicación del virus de las plantas, escapando de la necesidad de un proceso de inoculación. Sin embargo, el rendimiento de los amplificados en las líneas transgénicas obtenidas por transformación de los diferentes genomas virales, como un todo, ha sido muy variable, independientemente de que el virus de los que se basan. Esto ha impulsado un mayor interés en la comprensión de los mecanismos subyacentes que causan estas diferencias de comportamiento, y en el desarrollo de estrategias para controlar la expresión de amplificación.

ResultadosPlantas de Nicotiana benthamiana  fueron transformadas con una amplificación

que consiste en un ADNc de longitud completa del potyvirus Plum pox virus (PPV) del genoma modificado para incluir un gen reportero GFP. La expresión de amplificación mostró una gran variabilidad entre las diferentes líneas transgénicas, e incluso entre diferentes plantas de la misma línea. Las plantas de la línea de 10,6 inicialmente se desarrollaron sin signos de expresión de amplificación, pero en diferentes momentos algunos de ellos comenzó a mostrar focos de infección esporádica en las hojas de la madurez. La infección sistémica progreso, pero al final, se recuperaron las plantas infectadas y volvió a un estado inactivo-amplificación. La falta de detección de virus específicos de siRNAs en 10,6 plantas antes de la inducción de amplificación y después de la recuperación sugiere que una fuerte amplificación de silenciamiento de ARN específico no se ha establecido en estas plantas. Sin embargo, la co-expresión de los supresores de silenciamiento viral adicional causado cierta activación de amplificación, lo que sugiere que un bajo nivel de silenciamiento de ARN podría estar contribuyendo a

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mantener la represión de amplificación en el 10,6 plantas. Los mecanismos de resistencia que impiden amplicón derivados de infección por el virus también se activa frente a PPV exógenos introducidos por inoculación mecánica o injerto, pero no afectará a otros virus. Amplicón derivados de PPV fue capaz de extenderse a los vástagos de tipo silvestre injertada en el 10,6 patrones que no muestra signos de expresión de amplificación, lo que sugiere que la resistencia tiene poco efecto en el movimiento del virus.La mayoría de virus son capaces de inducir en las plantas a las que infectan una

respuesta de silenciamiento génico, que sirve en la planta huésped como mecanismo

natural de defensa frente al virus. A la vez, muchos virus con capaces de contraatacar

produciendo proteínas que interfieren con el mecanismo de silenciamiento génico. El

balance entre la inducción de la defensa antiviral de la planta, basada en

silenciamiento génico, y la supresión de esta defensa por parte de los virus, es

probablemente uno de los factores que determinan el curso de una infección viral.

ConclusionesLos resultados sugieren que la amplificación de derivados de la infección por virus

es limitado en esta línea transgénica en particular por una combinación de factores, incluyendo la supuesta eficiencia de baja de la conversión de la transcripción del transgén a replicar el ARN viral, y también por la activación de silenciamiento de ARN y otros defensivos las respuestas de la planta, que no son totalmente neutralizados por los supresores virales.

2. IDENTIFICACION DE LA SOLUCION PLANTEADA MEDIANTE INGENIERÍA GENÉTICA

El silenciamiento de ARN es usado por las plantas como un mecanismo de defensa contra las infecciones de virus [ 12 ], y también contribuye a limitar la replicación de los amplicones virales [ 5 , 13 - 16 ]. Sin embargo, el silenciamiento de ARN puede no ser el único factor que limita la expresión de amplificación en muchas ocasiones, por ejemplo, se ha informado de que una versión mutante del virus del mosaico del pepino (CMV) que carecen de su 2b supresor de silenciamiento fue capaz de aliviar la represión de un enrollamiento de la hoja de papa virus (PLRV) amplificación [ 17 ].Por lo tanto, los amplificados se pueden utilizar no sólo para fines de cría molecular, pero también pueden servir como sistemas modelo para el análisis de la expresión transgénica y los procesos de infección por el virus, así como los mecanismos de defensa antiviral.Plum pox virus (PPV) es un miembro del género Potyvirus [ 18 ]. Potyvirus tienen un genoma de ARN monocatenario de polaridad mensajero ~ 10 kb de longitud. Este ARN genómico se traduce en una poliproteína grande y un producto del marco de lectura truncada, que son procesadas proteolíticamente por tres proteasas codificadas por el virus [ 19 , 20 ]. De larga duración clones de cDNA que son capaces de iniciar las infecciones PPV se han construido y utilizado para la caracterización genética de este virus y el diseño eficiente de vectores de expresión de plantas [ 21 ].Coexpresión de la HCPro silenciar supresor potyviral se ha demostrado para mejorar fuertemente la actividad de un virus de papa X amplificación [ 16 ], sin embargo, no se

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sabe si su propia expresión HCPro podría asegurar altos niveles de expresión de un amplicón potyviral. En este trabajo se han transformado Nicotiana benthamiana plantas con una copia de ADNc de longitud completa del potyvirus Plum pox virus (PPV) . N. benthamiana , un huésped experimental de PPV, fue elegido debido a sus peculiaridades que la convierten en una especie de modelo en los estudios virológicos en las plantas [ 22 ]. Hemos observado una gran variabilidad en los patrones de expresión de las líneas transgénicas resultantes, y se ha caracterizado en detalle la expresión de amplificación de una de estas líneas. Las plantas de N. benthamiana  fueron transformadas con la secuencia completa de ADNc del PPV potyvirus para llevar la secuencia de codificación de la proteína verde fluorescente (GFP) como gen reportero (PPV-NK-GFP, fig. Fig. 1 1  ).

3. HERRAMIENTAS BIOTECNOLÓGICAS EMPLEADAS

Para la producción de líneas de amplificación de PPV-NK-GFP., se ha transformado la N. benthamiana con la secuencia completa de ADNc de una expresión de GFP-PPV recombinantes, dando lugar a diferentes líneas de amplificación de PPV, que muestra la variabilidad gran expresión (Fig. (Fig. 1). 1  ). En informes anteriores se demostró que una amplificación de represión pueden ser activadas por la coexpresión de un supresor de silenciamiento fuerte [ 16 ]. Los resultados muestran que la expresión de amplificación puede ser reprimida aún cuando la amplificación lleva un supresor de silenciamiento fuertes como P1-HCPro.

Una vez detectada la solución biotecnológica al problema, se debe trabajar en las técnicas empleadas, éstas se describen principalmente en el apartado de materiales y métodos del artículo, (más adelante se aporta un ejemplo de índice a seguir).

3.1. MATERIAL BIOLÓGICO

3.1.1. HUÉSPEDES HERBÁCEOS EXPERIMENTALES:

Para la comprobación de la infectividad de los vectores basados en PPV donde se desarrollan infecciones a nivel sistémico, y para la transformación genética de planta con secuencias derivadas del genoma viral se utilizaron plantas de Nicotiana benthamiana.

Las semillas de plantas no transgénicas se germinaron sobre vermiculita estéril.

Las semillas de plantas transgénicas se germinaron in vitro, en un medio de agar solidificado con Kanamicina (100mg/ml) para realizar la selección mediante resistencia a antibiótico.

Transformación de Nicotiana benthamiana y cultivo de plantas

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. N. benthamiana discos de hojas se transformaron con esta construcción con A. tumefaciens de la inoculación, básicamente de acuerdo con Horsh et al. [ 37 ] y las plantas fueron regeneradas en un medio que contenía kanamicina (100 mg / ml). 

Las plántulas enraizadas se transfirieron al suelo y después de la aclimatación en cámara de crecimiento a 22 ºC y 70 % de humedad con un ciclo de 14 h/10 h luz/oscuridad. Las plantas transgénicas fueron transladadas a un invernadero.

después a una mezcla 3:1 de tierra: vermiculita cuando alcanzaron un tamaño de 1 cm y posteriormente se mantuvieron en invernadero o en fitotron, en este último caso con la humedad relativa del 70 %y un fotoperiodo de 16 h de luz + 8 h de oscuridad, a una temperatura de 22 ºC ó de 30ºC..........comprobar.

En general, las semillas de las plantas transgénicas fueron germinadas in vitro en un medio de agar solidificado con kanamicina (100 mg/ml) a 23ºc con un ciclo de 16h de luz/8h. de oscuridadLas plántulas en la hoja 2 se transfirieron al suelo y se cultivaron en cámara de crecimiento a 22 ºC y 60 % de humedad, con un fotoperiodo se 14 h/10 luz/oscuridad.

Las plantas transgénicas de 10.6.1 fueron infiltradas con Agrobacterium tumefaciens cepa C58C1 llevar pBIN61:P19, p35SP1B, p35S-NTAP-P1B,P35S-P1/HC-pro o el vector vacío pBin19. Se aplicaron alrededor de 250 l de acetosiringona inducida por Agrocbacterium cultura con una jeringa en la parte inferior de tres hojas cuando las plantas estaban en la etapa de ocho hojas. Como control de la actividad de los supresores de silenciamiento, las mezclas de cultivos de cepas de Agrobacterium con p35S: GFP y el plásmido que codifica el supresor del silenciamiento, se coinfiltraron en el tipo natural N. bentahmiana.

3.1.2. MICROORGANISMOS EXPERIMENTALES: En este trabajo se han transformado  plantas de N. benthamiana  con una copia de ADNc de longitud completa del potyvirus PPV., un huésped experimental de Plum pox virus (PPV), fue elegido debido a sus peculiaridades que la convierten en una especie de modelo en los estudios virológicos en las plantas.Aislados originales de PPV y clones cDNA Se han empleado vectores virales basados en un clon cDNA infeccioso denominado pIC-PPV desarrollado en el laboratorio (López-Moya and García 2000), y que deriva de un aislado original PPV-R3 cuya secuencia completa del genoma viral de PPV entre un promotor derivado del 35Sde CaMV (con la secuencia potenciadora duplicada) y el terminador NOS. La utilización de ese promotor facilita la inoculación directa de plantas con dicho cDNA para generar transcritos in vivo. Así mismo, tiene insertado un intrón que interrumpe la ORF en la región P3 para mejorar el crecimiento de este clon en las bacterias. Bacterias Para los distintos clonajes se he utilizado la cepa DH5 de E. Coli, tanto para la propagación como para la propagación como para la purificación de plásmidos.

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Para los experimentos de expresión transitoria así como para la obtención de plantas trasnsgénicas, se ha utilizado la cepa C58C1 de A. tumefaciens.

3.1.3. MANTENIMIENTO Y MANIPULACIÓN DEL MATERIAL BIOLÓGICO

MICROORGANISMOS:

Bacterias:

Escherichia coliMantenimiento: se cultivó a 37 ºC en medio LB (bacto-triptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l, para los medios sólidos se añadía agar 18 g/l)Transformación: las células DH5 competentes se transformaron con plásmidos mediante choque térmico o electropropagación, utilizando procedimientos habituales (Sambrook y col, 1989). En ambos casos los clones deseados se identificaron por análisis de restricción de su DNA plasmídico. Agrobacterium tumefaciensTransformación: los plásmidos que portaban el T-DNA que se pretende transferir e la planta se purificaron a partir de células E.coli en las que se habían multiplicado, y se introdujeron por choque térmico en células se A. tumefaciens que portaban el plásmido auxiliar que suministra las funciones VIR (cepa c58c1).

En ambos casos los clones deseados se identificaron por análisis de restricción de su DNA plasmídico.Para conservar las cepas originales y los transformantes de E. Coli y A. tumefaciens durante periodos cortos de tiempo se mantuvieron a 4º C en placas de medio sólido. La conservación por largos periodos de tiempo se realizó resuspendiendo las células en una solución de glicerol al 20 % y manteniéndolas a – 70 ºC.

Virus:

Se conservan en extractos de plantas infectadas, fresco o congelado en N2 líquido y mantenido posteriormente a -70ºC.

Material vegetal:

Inoculación de plantas

Inoculación manual de plantas Para las inoculaciones con extracto de planta infectada, se homogenizaron hojas generalmente en morteros mantenidos en hielo, con tampón fosfato sódico 5mM pH 7,5 (1 gr/2ml). Los restos de tejido se eliminaron centrifugando brevemente las muestras en una microcentrífuga de mesa. Se inocularon tres hojas de cada planta (N. benthamiana ) previamente tratadas con Carborundo, con 15-30 l de extracto.

Las lesiones locales de C. phoetidum ....La usamos? Pagina 60

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Para la inoculación directa con DNA plasmídico (obtenido como se describe en el apartado II.2.4.1.1. se aplicaron entre 10-20 l de DNA a una concentración de 0,1 mg/ml sobre tres hojas de planta. +

Inoculación biolísticaPara inoculación directa con DNA plasmídico de plantas usando el aparato “Helios-Gene Gun” (Bio Rad) se ha seguido el protocolo descrito por el fabricante, tras precipitación del DNA sobre partículas de oro que eran posteriormente proyectadas contra el tejido folir (López –Moya y García, 2000).

Inoculación mediante agrofiltraciónPara la inoculación de clones cDNA introducidos en la cepa C58C1 de A. tumefaciens, se cultivaron estas bacterias a 28 º C, hasta alcanzar una densidad óptica de 600 nm de 0,6, en medio LB, con acetosisyingona 150 M, 10 mN MgSO4, y se introdujeron aproximadamente 1 ml del cultivo en los espacios intercelulares de 2-3 hojas del huésped presionando con una jeringa de 1 ml sobre el envés de la hoja.

Inoculación de virus:Dos o tres hojas fueron espolvoreadas con Carborunum y se inocularon con el dedo , frotando con 15 I de ADN o de pICPPV (42), (O,7 mg/ml) o de extractos de hojas infectadas de tipo salvaje de N benthamiana plantas de suelo con 5 mM tampón fosfato (ph 7,4) (1 g en 2 ml).

Platas de injerto Las plantas de aproximadamente 10 hojas de la etapa de desarrollo fueron injertados por el método tradicional de hendidura. Para el tipo I de injertos, portainjertos 10.6.1 se prepararon mediante la eliminación de la sesión por encima de dos hojas basales sanos y en hacer un corte vertical, de 1,5 a 2 cm de largo, en el centro del tallo. Se injertaron vástagos de unos 4 cms de longitud, después de la eliminación de todas las hojas excepto los dos más pequeños y el recorte de su base a una “V” de cuña. Tipo II de injertos 10.6.1 vástagos en patrones de tipo salvaje se prepararon de la misma manera, pero se dejaron tres hojas en lo patrones para facilitar la inoculación con el tipo salvaje de PPV. Las uniones de stock con el vástago se aseguraron con Parafilm y las plantas injertadas se cubrieron con una bolsa de plástico durante una semana para evitar deshidrtación.

Las imágenes de GFP Las hojas de las plantas fueron seleccionadas para la expresión de las buenas prácticas agrarias con un flii MZ (Leica microsystems) estereoscópico de fluorescencia, utilizando filtros de excitación y de barrera de 480/40 nmy 510 nm, respectivamente. Las imágenes se obtuvieron con una cámara Olympus DP70 digital DP controlador y el software del administrador de DP.

Mantenimiento y manipulación de plantas en cultivo in vitro

MATERIAL VEGETAL /ANIMAL

INOCULACIÓN DE PLANTAS: MANUAL, BIOLÍSTICA, AGROINFILTRACION

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MANTENIMIENTO Y MANIPULACIÓN DE PLANTAS EN CULTIVO IN VITRO.

TRANSFORMACIÓN DE PLANTAS. DESARROLLO DE PLANTAS A

PARTIR DE DISC

REGENERACIÓN DE PLANTAS A PARTIR DE TEJIDO: OBTENCIÓN DE

CLONES.

Los restos de tejido se eliminaron centrifugando brevemente las muestras en una microcentrífuga de mesa. Se inocularon tres hojas de cada planta (N. benthamiana ) previamente tratadas con Carborundo, con 15-30 l de extracto.

Para las inoculaciones con extracto de planta infectada, se homogenizaron hojas generalmente en morteros mantenidos en hielo, con tampón fosfato sódico 5mM pH 7,5 (1 gr/2ml). Los restos de tejido se eliminaron centrifugando brevemente las muestras en una microcentrífuga de mesa. Se inocularon tres hojas de cada planta (N. benthamiana ) previamente tratadas con Carborundo, con 15-30 l de extracto.

3.2. PREPARACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS La extracion de RNA y análisis de northern blot

Tejido de las hojas era un terreno en nitrógeno líquido con mortero y se almacenó a -80

ºC. Los ácidos nucléicos se extrajeron como se ha descrito previamente (43). Para el

análisis de transferencia de Northern de siRNAs, se resolvieron aproximadamente 2 g

de ARN total con un gel de policrilamida al 15 % de desnaturalización (con 7 M urea) y

se transfiere a una bolsa de nylon Hybond-N + membrana por transferencia capilar

(44).Tinción con bromuro de etidio de la tinción con azul de metileno y el gel de la

membrana se utiliza para verificar la igualdad de carga y transferencia. Después de UV

entrecruzamiento y prehibridación en UltraHyb buffer (applied Biosystems/Ambion),

blots se hibridó en la misma solución con un 32 P-etiquetados sonda de ARN

antisentido correspondiente a la P1 de PPV o NIB secuencia de codificación,

previamente hidrolizados con tampón carbonato a una duración media de

aproximadamente 50 nt. Las señales de hibridación se detectaron con un sistema

molecular Imager FX.

3.2.1. OBTENCIÓN DE DNA.

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PREPARACIÓN DE DNA DE PLÁSMIDOS

El plásmido P35S-PPV-NK-GFP-NOST se construyó mediante la inserción en pBin19 [35 ] digerido con SmaI y XbaI, el fragmento PvuII-XbaI de pIC-PPV-NK-GFP [ 36 ] que contiene la secuencia de longitud completa de cDNA de PPV.

PREPARACIÓN DE DNA GENÓMICO DE PLANTAS/ANIMALES/MICROORGANISMOS

3.2.2. MANIPULACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS

TRATAMIENTOS ENZIMÁTICOS

TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS.

ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA.

ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA .

MARCAJE E HIBRIDACIONES DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

MARCAJE RADIACTIVO DE OLIGONUCLEÓTIDOS.

HIBRIDACIÓN DE OLIGONUCLEÓTIDOS. ESCRUTINIO DE PLÁSMIDOS

RECOMBINANTES.

AMPLIFICACIÓN DE DNA MEDIANTE PCR.

AMPLIFICACIÓN DE RNA VIRAL MEDIANTE INMUNOCAPTURA Y RT-PCR

(IC-PCR)

Las hojas se homogenizaron en 5 mM de tampón fosfato de sodio, Ph 7,4 (2 ml

por gramo) y se incubaron 2 horas a 37 ºC y durante la noche a 4ºC en tubos

previamente recubiertos con IgG anti-PPV CP. Después de dos etapas de lavado con 16

mM de tampón fosfato de sodio, 0,1 M NaCl, 0,5 g/l de Tween 20, ph 7,2, RT-PCR se

realizó en tubos de revestimiento con el Titán de RT-PCR System (Roche).

Oligodesoxinucleotidos 5’-TTGGGTTCTTGAACAAGC-3’ Y 5’-TGGCACTGTAAAAGTTCC-3’

se utilizaron para amplificar fragmentos de cDNA de 1255 nt nt p 511, de PPV-NK-GFP o

de tipo salvaje de pago, respectivamente.

3.3.3. MANIPULACION DE PROTEÍNAS: ANÁLISIS Y DETECCIÓN.

DETECCIÓN DE PROTEÍNAS El tejido de la hoja se homogenizó con mortero en nitrógeno líquido y se

almacenan a -80 ºC. Los extractos proteicos fueron preparados por el deshielo del polvo en tampón de extracción,(150mMT Tris HCl, pH 7,5, 6 M urea, 2 % SDS, y el 5 % β – mercaptoetanol) (1 ml por gramo de tejido). Los extractos fueron hervidos y los restos celulares se eliminaron por centrifugación. Las muestras fueron resueltas en geles de poliacrilamida al 12 % de sds y electro blotted a una membrana de nitrocelulosa. Proteínas específicas fueron detectados

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utilizando anti PPV CP o CNV contra o viriones tvmv sueros policlonales como reactivo de primaria, y conjugando con peróxidasa de cabra anti-conejo IgG (Jackson Immuno Research Laboratories) como reactivo secundario, o con un mezcla de dos anti GPF anticuerpos monoclonales (Roche) como reactivo de primaria, y conjugando con peroxidasa de oveja anti- ratón IgG ( Sigma-Aldrich) como reactivo secundario. Las proteínas se visualizaron immunostaine con un kit de Lite Ablot (Euroclone).Ponceau tinción con rojo se utiliza para comprobar el contenido global de proteína en las muestras.

ELISA (ENZYME LINKED-IMMUNOSORBENT ASSAY).

ENSAYO DE ACTIVIDAD DE UNA PROTEINA DETERMINADA

ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA DE PROTEÍNAS DE

PLANTAS/ANIMALES/MICROORGANISMOS Y ANÁLISIS DE WESTERN

(INMUNOELECTROTRANSFERENCIA)

3.4. ANTIBIÓTICOS EMPLEADOS Kanamicina (100mg/ml) para realizar la selección mediante resistencia a

antibiótico.

3.5. CONSTRUCCION DE PLÁSMIDOS

3.6. CONSTRUCCIÓN DE CLONES

4.-BIBLIOGRAFÍA

22. Goodin MM, Zaitlin D, Naidu RA, SA Lommel. Nicotiana benthamiana: Su historia

y su futuro como modelo de las interacciones planta-patógeno. Mol planta-

microbio Interact. 2008; 21:1015-1026. doi:. 10.1094/MPMI-21-8-

1015 [ PubMed ] [ Cruz Ref. ]

Objetivos del trabajo

1. Consolidación de los conocimientos adquiridos durante la asignatura.

2. Desarrollo de capacidad de análisis y síntesis del alumno.

3. Desarrollo práctico de las aplicaciones biotecnológicas y la ingeniería genética.

4. Dominio de los conceptos básicos relacionados con la asignatura.

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Criterios de evaluación

La evaluación, es una componente fundamental de la formación. Este trabajo obligatorio formará parte de tu calificación final. En esta tabla, se resumen los aspectos a valorar y el porcentaje que representa cada unos de los mismos.

Total Ob.

Contenidos generales 2,00

Estructuración, exposición, orden, limpieza y presentación

Claridad en los conceptos2,00

Temas de especialidad 7,00

Planteamiento y coherencia del problema 1,00

Planteamiento y coherencia de la solución biotecnológica 1,00

Definición detallada de las herramientas biotecnológicas empleadas en el artículo

3,00

Definición detallada de la bibliografía 1,00

Coherencia de la bibliografía con el artículo 1,00

Otras aportaciones 1,00

Conclusiones 1,00

TOTAL 10,00

Fecha límite de recepción de trabajos

Están disponibles en el apartado “Fechas de Examen” de la plataforma informática.

Ficha de Corrección del Trabajo (Espacio reservado para anotaciones del profesor)

Profesor:

Alumno (Código / Nombre):

Fecha de Entrega: Fecha de Calificación:

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Observaciones sobre el trabajo:

Fecha y Firma:

Formato de presentación

1. La extensión del trabajo no deberá superar las 50 páginas

Se presentará en formato informático toda la información del trabajo.

Las normas de presentación serán las siguientes:

Procesador: Microsoft WORD.

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PROPUESTA DE TRABAJO OBLIGATORIO PÁG.: 14/28

Tamaño de letra: 12 ptos.

Tipo de letra: serán aconsejables letras como “Arial” o “Times New Roman”.

Espaciado entre líneas: 1,5

Márgenes:

Lateral izquierdo: 3 cm.

Lateral derecho: 2 cm.

Margen superior: 3,5 cm.

Margen inferior: 2,5 cm.

2. En caso de que el trabajo requiera archivos externos (dibujos Autocad, Catia, Excel, Power Point, programación, etc…) éstos deberán entregarse junto al trabajo. Es posible que algunos trabajos solo consten de estos ficheros, por lo cual no tendrá validez lo indicado en el punto 3.

3. Si el trabajo consta de varios archivos deberá enviarse en un solo fichero comprimido.

4. Si el tamaño del archivo a enviar excede de 5Mb, en lugar de enviarse por correo electrónico deberá entregarse en CD.

5. Reseñar referencias bibliográficas cuando se incluyan frases o textos de otros autores, de lo contrario podrá interpretarse como plaggio.

6. La fecha de entrega será la misma para todos los trabajos de todas las asignaturas y se comunicará al principio de cursar dicha asignatura. Según las regulaciones académicas de la Universidad

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PROPUESTA DE TRABAJO OBLIGATORIO PÁG.: 15/28

Desarrollo de trabajo

Espacio reservado para el desarrollo del trabajo por parte del alumno.

Restricciones a la infección por el virus en Nicotiana benthamiana plantas transformadas con una amplificación de potyvirusMaría Calvo, un Dujovny Gabriela, una Cristina Lucini, 1, 2 Jesús Ortuño, unJosefa M Alamillo, 1, 3 Carmen Simón, Mateo, un Juan José López-Moya, 1,4 y Juan Antonio García 1

Un Centro Nacional de Biotecnología-CSIC, Campus de la Universidad Autónoma de Madrid, 28049 Madrid, España2 Facultad de Ciencias y Artes, Universidad Católica de Ávila, Ávila, España3 Departamento de Fisiología Vegetal, Facultad de Ciencias, Universidad de Córdoba, Córdoba, España4 Centro de Investigación en Genómica Agrícola CRAG, CSIC-IRTA-UAB, Barcelona, EspañaAutor correspondiente.

María Calvo: mcalvo@cnb.csic.es ; Gabriela Dujovny: gdujovny@hotmail.com , Cristina Lucini: cristina.lucini @ ucavila.es , Jesús Ortuño: j_ortuno_sanchez@hotmail.com , Josefa M Alamillo: bv1munaj@uco.es ; Carmen Simón-Mateo: csimon@cnb.csic.es , Juan José López-Moya: jlmgmy@cid.csic.es , Juan Antonio García:jagarcia@cnb.csic.esRecibió 16 de abril 2010; Aceptado 06 de julio 2010.Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0 ), que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original es debidamente citados.

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AbstractoFondoGenoma de las plantas han sido transformadas con copias de larga duración cDNA de genomas virales, dando lugar a lo que se ha llamado "amplificación" de sistemas, tratando de combinar la estabilidad genética de las plantas transgénicas con la elevada tasa de replicación del virus de las plantas. Sin embargo, el

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rendimiento amplicones 'ha sido muy variable, independientemente de que el virus de los que se basan.  Esto ha impulsado un mayor interés en la comprensión de los mecanismos subyacentes que causan estas diferencias de comportamiento, y en el desarrollo de estrategias para controlar la expresión de amplificación.ResultadosNicotiana benthamiana plantas fueron transformadas con una amplificación que consiste en un ADNc de longitud completa del potyvirus Plum pox virus (PPV) del genoma modificado para incluir un gen reportero GFP. Expresión de amplificación mostraron una gran variabilidad entre las diferentes líneas transgénicas, e incluso entre diferentes plantas de la misma línea. Las plantas de la línea de 10,6 inicialmente desarrollado sin signos de expresión de amplificación, pero en diferentes momentos algunos de ellos comenzó a mostrar focos de infección esporádica en las hojas de la madurez. La infección sistémica progresado, pero en los últimos tiempos las plantas infectadas se recuperó y volvió a un estado inactivo-amplificación.  La falta de detección de virus específicos de siRNAs en 10,6 plantas antes de la inducción de amplificación y después de la recuperación sugiere que una fuerte amplificación de silenciamiento de ARN específico no se ha establecido en estas plantas. Sin embargo, la co-expresión de los supresores de silenciamiento viral adicional causado cierta activación de amplificación, lo que sugiere que un bajo nivel de silenciamiento de ARN podría estar contribuyendo a mantener la represión de amplificación en el 10,6 plantas. Los mecanismos de resistencia que impiden amplicón derivados de infección por el virus también se activa frente a PPV exógenos introducidos por inoculación mecánica o el injerto, pero no afectará a otros virus. Amplicón derivados de PPV fue capaz de extenderse a los vástagos de tipo silvestre injertada en el 10,6 patrones que no muestra signos de expresión de amplificación, lo que sugiere que la resistencia tiene poco efecto en el movimiento del virus.ConclusionesNuestros resultados sugieren que la amplificación de derivados de la infección por virus es limitado en esta línea transgénica en particular por una combinación de factores, incluyendo la supuesta eficiencia de baja de la conversión de la transcripción del transgén a replicar el ARN viral, y también por la activación de silenciamiento de ARN y otros defensivos las respuestas de la planta, que no son totalmente neutralizados por los supresores virales.

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FondoEl creciente interés en el uso de plantas como biofábricas para la producción de proteínas extrañas de importancia farmacéutica e industrial ha llevado al desarrollo de sistemas de expresión nuevos para obtener altos rendimientos de los productos deseados [ 1 ]. Algunas estrategias se han centrado en el desarrollo de vectores virales de plantas, teniendo en cuenta su capacidad de replicación como una característica positiva para alcanzar los rendimientos esperados [ 2 - 4 ].A pesar de que su rapidez a veces puede hacer que la expresión transitoria de un método conveniente para obtener el producto de interés, uno de los objetivos de la agricultura molecular es el desarrollo de sistemas estables para evitar la inoculación de los procesos manuales que pueden dificultar en gran escala los costos de producción y aumentar la . Con este propósito, los genomas de plantas han sido transformadas con copias de larga duración cDNA del genoma de los vectores virales, dando lugar a lo que se ha llamado "amplicón" sistemas de expresión [ 5 - 11]. Por lo tanto, los amplificados, que son derivados de virus transgénicos, fueron diseñados para combinar la estabilidad genética de las plantas transgénicas con la elevada tasa de replicación del virus de las plantas, escapando de la necesidad de un proceso de inoculación. Sin embargo, el rendimiento de los amplificados en las líneas transgénicas obtenidas por transformación de los diferentes genomas virales, como un todo, ha sido muy variable, independientemente de que el virus de los que se basan. Esto ha impulsado un mayor interés en la comprensión de los mecanismos subyacentes que causan estas diferencias de comportamiento, y en el desarrollo de estrategias para controlar la expresión de amplificación.Silenciamiento de ARN es usado por las plantas como un mecanismo de defensa contra las infecciones de virus [ 12 ], y también contribuye a limitar la replicación de los amplicones virales [ 5 , 13 - 16 ]. Sin embargo, el silenciamiento de ARN puede no ser el único factor que limita la expresión de amplificación en muchas ocasiones, por ejemplo, se ha informado de que una versión mutante del  virus del mosaico del pepino (CMV) que carecen de su 2b supresor de silenciamiento fue capaz de aliviar la represión de un enrollamiento de la hoja de papa virus (PLRV) amplificación [ 17 ].Por lo tanto, los amplificados se pueden utilizar no sólo para fines de cría molecular, pero también pueden servir como sistemas modelo para el análisis de la expresión transgénica y los procesos de infección por el virus, así como los mecanismos de defensa antiviral.Plum pox virus (PPV) es un miembro del género Potyvirus [ 18 ]. Potyvirus tienen un genoma de ARN monocatenario de polaridad mensajero ~ 10 kb de longitud. Este ARN genómico se traduce en una poliproteína grande y un producto del marco de lectura truncada, que son procesadas proteolíticamente por tres proteasas codificadas por el virus [ 19 , 20 ]. De larga duración clones de cDNA que son capaces de iniciar las infecciones PPV se han construido y utilizado para la caracterización genética de este virus y el diseño eficiente de vectores de expresión de plantas [ 21 ].

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Coexpresión de la HCPro silenciar supresor potyviral se ha demostrado para mejorar fuertemente la actividad de un virus de papa X amplificación [ 16 ], sin embargo, no se sabe si su propia expresión HCPro podría asegurar altos niveles de expresión de un amplicón potyviral. En este trabajo se han transformado Nicotiana benthamiana plantas con una copia de ADNc de longitud completa del potyvirus PPV. N. benthamiana , un huésped experimental de PPV, fue elegido debido a sus peculiaridades que la convierten en una especie de modelo en los estudios virológicos en las plantas [ 22 ]. Hemos observado una gran variabilidad en los patrones de expresión de las líneas transgénicas resultantes, y se ha caracterizado en detalle la expresión de amplificación de una de estas líneas.

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ResultadosLa producción de PPV-NK-GFP líneas de amplificaciónN. benthamiana plantas fueron transformadas con la secuencia completa de ADNc del PPV potyvirus llevar la secuencia de codificación de la proteína verde fluorescente (GFP) como gen reportero (PPV-NK-GFP, fig.  Fig.

1 1  ).Figura 1PPV-NK-GFP plantas de amplificación . A: representación esquemática de p35S-PPV-NK-GFP-NOST. Cajas grises representan las secuencias que codifican las proteínas de la indicada PPV. La caja verde representa el gen reportero GFP clonado entre el NIB y la CP secuencias de codificación. Negro (más ...)

Desarrollo de la planta, la acumulación viral y la expresión de GFP fueron muy variables entre los transformantes primarios. En particular, dos plantas eran estériles, y otro (10,2) dio muy pocas semillas, la mayoría de los cuales no eran viables. Semillas de transformantes fértiles fueron germinadas in vitro y las plántulas resultantes se analizaron para la expresión de GFP. Curiosamente, GFP se detectó en las únicas dos plantas de la línea de 10.2 que se podrían obtener, y en todas las plantas de la línea de 10,1, pero en el resto de las líneas de otras fértiles, la acumulación de GFP se observó sólo en algunas de las plántulas.  Sin embargo, aunque en teoría todas las células de las plantas transformadas contienen el transgén viral, incluso en las plántulas de la línea 10.1 de la expresión de GFP observada no fue uniforme en los cotiledones y las hojas (Fig. (Fig.1b). 1B  ). Los datos de la segregación de resistencia a kanamicina de las líneas transgénicas diferentes eran compatibles con uno o dos loci de inserción, pero no hemos encontrado correlación entre el número loci y los patrones de expresión GFP (datos no mostrados). Las plántulas de algunas de las líneas fueron transferidas al suelo y se cultivaron en una cámara de crecimiento. Patrones de expresión de GFP fueron muy variables, no sólo entre las líneas, sino también entre las plantas en la misma línea (datos no mostrados).Expresión de la amplificación de PPV-NK-GFP en el 10,1 y 10,6 líneas10.1 de la línea transgénica que mostró la expresión de amplificación más eficiente.Las plantas de esta línea acumularon altos niveles de virus, ya que brotan, aunque, incluso en este caso, la expresión de GFP no fue igual en los cotiledones de cada planta, y la alta variabilidad también se observó a partir de plántulas de semilla (Fig. (Fig. 1B). 1B  ). Sin embargo, a medida que crecían, todas las plantas muestran síntomas 10,1 fuerte infección que causaban alteraciones graves del desarrollo, y persistió durante la vida de la planta completa (Fig. (Fig.2a). 2A  ). Este patrón de infección es similar a la de una infección causada por PPV

normales-NK-GFP en el medio silvestre de tipo N.benthamiana plantas.Figura 2Los patrones de expresión de la amplificación de PPV-NK-GFP en plantas transgénicas 10.1.7 (A) y 10.6.1 plantas (B) .Posiciones de la hoja (de la parte inferior de la planta) se indican.Fotos fueron tomadas bajo la luz ultravioleta a los 42 DPT (10.1.7 y 10.6.1 de las hojas 8-10) y 50 dioptrías (hojas (más ...)

En contraste con la línea 10.1, ninguna de las plántulas de la línea de 10,6 GFP expresado inicialmente.  Sin embargo, cuando estas plantas se transfirieron a suelo, una serie de plantas comenzaron a expresar GFP después de algunos días en la cultura. Expresión de amplificación exitosa y la infección viral posterior que parecía ser un evento estocástico en la línea de 10,6, y este fenotipo se mantuvo en diferentes progenies F2 de esta línea. La descendencia de las plantas 10.6.1 (F2) fue utilizado para los experimentos siguientes.A pesar de la inducción de amplificación se llevó a cabo en diferentes plantas en diferentes días después del trasplante (DPT), la expresión de las buenas prácticas agrarias siempre se inicia en la expansión de las hojas sometidas a la madurez (Fig.(Fig.2C 2C  muestra los resultados de 5 experimentos independientes). En la

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primera amplificación que expresan las hojas, la fluorescencia verde fue detectado en focos aislados, que no progresó ampliamente. GFP expresión se expande a cubrir la base de las hojas sólo en la parte superior de los primeros que expresan GFP de la hoja, mientras que las buenas prácticas agrarias se ha detectado a lo largo de la lámina completa de las hojas más jóvenes (Fig. . (Fig.2b). 2B  ). Sin embargo, aproximadamente 10 días después de la aparición de las primeras manchas de color verde fluorescente, islas verdes oscuros típicos de la recuperación de virus [ 23 ] se han observado en las hojas de reciente desarrollo. La inducción del fenotipo de recuperación confirmado por la aparición posterior de las hojas que no mostraron síntomas de la infección o la expresión de GFP.Debido a los patrones de expresión anormal observado en la línea 10.6, nos hemos centrado más estudios en esta línea específica.La acumulación de virus específicos de siRNAs en el PPV-NK-GFP 10,6 amplificación de líneaSilenciamiento de ARN se ha demostrado que median la resistencia a virus y constitutiva inducida por el virus derivados de los transgenes virales [ 24 - 26 ], y para reprimir la expresión de los amplicones virales [ 5 ]. A fin de evaluar la posible contribución de silenciamiento de ARN a la represión de la expresión inicial de amplificación, y la inducción de la eventual recuperación de virus en el 10,6 plantas, se analizó la acumulación de siRNAs específicos del transgén viral, la principal seña de identidad de procesos de silenciamiento de ARN .Semillas de plantas 10.6.1 fueron germinadas in vitro y las plántulas resultantes fueron trasplantadas y cultivadas en el suelo. En este experimento, 13 de las 64 plantas desarrollaron una infección derivada de amplificación. Pequeños RNAs fueron extraídos de tres tipos de hojas de las plantas infectadas: las hojas por debajo de la primera hoja que expresan GFP (R1), las hojas sometidas a PPV-NK-GFP infección (G), y recuperado por completo las hojas jóvenes (R3). Muestras equivalentes, R1, R2 (de la misma edad que deja G) y R3, se obtuvieron de plantas 10.6.1 no muestra síntomas de la infección, y que se han mantenido en idénticas condiciones de crecimiento (Fig. (Fig.3a). 3A  ). Los pequeños RNA de muestras fueron sometidas a análisis de Northern con sondas derivadas ya sea de la P1 o la secuencia de codificación de NIB PPV (Fig. (Fig.3b). 3B  ). PPV-siRNAs específicos sólo se detectaron en las muestras de las buenas prácticas agrarias-que expresa las hojas (G). SiRNAs viral se detectó ni en las hojas desarrolladas antes de la inducción

de amplificación (R1) ni en las hojas superiores se recuperó (R3) de los infectados 10.6.1 plantas.  SiRNAs virales tampoco se detectaron en ninguna de las muestras recogidas de las plantas de control no infectados.

Figura 3siRNA acumulación en las plantas de amplificación 10.6.1 . A:representación esquemática de los dos tipos de plantas 10.6.1. Los patrones de color verde y el rojo indica la expresión y la falta de expresión de la GFP, respectivamente. B : se extrajo el ARN de las muestras de hoja se indica en (más ...)

Efecto de los supresores de silenciamiento de ARN en la expresión de los 10,6 PPV-NK-GFP amplicónLa ausencia de siRNAs detectable en el tejido de las plantas 10.6.1 que no se expresa la amplificación PPV sugiere que silenciamiento de ARN no se activa en estas plantas. Para confirmar que el silenciamiento de ARN no estaba jugando un papel en la represión de la amplificación, 10.6.1 plantas que no mostraron signos de PPV-NK-GFP infección se infiltraron con cultivos de Agrobacterium tumefaciensexpresar diferentes supresores de silenciamiento viral.Expresión de los supresores de silenciamiento P1B (intacto o con una etiqueta TAP N-terminal) de la vena del pepino amarillo virus (CVYV) dio lugar en algunas hojas de fluorescencia de GFP difundido en todo el tejido infiltrado, con algunas manchas verdes dispersos más intenso (Fig. (Fig.4a). 4a  ). Sólo manchas verde fluorescente fueron detectados en otras hojas agroinfiltradas con este supresor de silenciamiento (Fig. (Fig.4b) 4b  ) y en un bajo porcentaje de hojas agroinfiltradas con el P19 supresores de silenciamiento de tomate Bush truco virus (TBSV) (Fig. (Fig.4d) 4d  ) o P1-HCPro del virus del grabado del tabaco (TEV) (Fig. (Fig.4f). 4f  ). Sin embargo, la fluorescencia de GFP no se detectó en la mayoría de las hojas que manifieste su TBSV p19 o TEV P1-HCPro (Fig. (Fig.4c 4c  y and4e). 4e  ). TBSV P19 tiende a causar fluorescencia amarilla, probablemente indicativa de la inducción de la necrosis (Fig. (Fig.4d). 4d  ). La aparición de la fluorescencia de GFP correlaciona con la detección de buenas prácticas agrarias y los CP de PPV en el análisis occidental (datos no mostrados). Fluorescencia de la GFP no se detectó en el tejido infiltrado

con Agrobacterium culturas llevar un control del vector vacío (Fig. 4g-h ), lo que indica que la inducción de amplificación es el resultado de la expresión del supresor de silenciamiento.

Figura 4

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Efecto de silenciamiento de los supresores de plantas 10.6.1 .Tres hojas (posiciones 3-5 desde la parte inferior) de 10.6.1 plantas fueron infiltrados con Agrobacterium cepas que expresan diferentes ARN silenciador supresores o con un control de Agrobacterium que contiene un vacío (más ...)

La expresión sistémica de la amplificación no parece ser mayor en las plantas agroinfiltradas con los supresores de silenciamiento con respecto a las plantas agroinfiltradas con el vector vacío o agroinfiltradas no, lo que sugiere que la supresión de locales de silenciamiento de ARN no es suficiente para el alivio PPV de los mecanismos de defensa que evitar su propagación en el 10,6 plantas de amplificación.La susceptibilidad de los 10,6 PPV-NK-GFP plantas amplicón a la infección viral exógenoDesde los 10,6 plantas parecen tener mecanismos de defensa que limitan la expresión de la amplificación del transgen, se pregunta si estas actividades antivirales fueron capaces de interferir con las infecciones exógenas y si estas infecciones podrían afectar a la expresión endógena de la amplificación de PPV.Para responder a estas preguntas, 10.6.1 plantas que no mostraron signos de PPV-NK-GFP infección de tipo salvaje y N. benthamiana plantas fueron inoculadas de forma manual, ya sea con el tipo salvaje PPV, un potyvirus en segundo lugar, la vena del tabaco virus moteado (TVMV), o un virus heterólogo, el CMV cucumovirus, burlarse de inoculados.Todas las plantas inoculadas con TVMV desarrollado una infección sistémica (tabla (Tabla 1). 1  ). 10.6.1 La plantas transgénicas no mostraron una mayor resistencia a CMV sea, aunque algunos de tipo salvaje y las plantas 10.6.1 no estaban infectados, probablemente como consecuencia de una baja infectividad del inóculo utilizado por CMV (tabla (Tabla 1). 1  ) . La falta de resistencia de las plantas 10.6.1 contra estos virus fue confirmado por el análisis occidental (Fig. (Fig. 5). 5  ). En contraste, mientras que todas las plantas de tipo salvaje eran susceptibles a la infección por PPV tipo salvaje, sólo 5 de cada 8 10.6.1 plantas inoculadas con el virus muestra síntomas de la enfermedad (tabla (Tabla 1). 1  ). La resistencia parcial de 10,6 plantas de PPV fue apoyada por el análisis occidental que muestra la acumulación de mucho menor de PPV CP en las hojas inoculadas y en las hojas inmediatamente por encima de la 10.6.1 plantas infectadas con respecto a la de los de tipo salvaje (Fig. . (Fig. 5). 5  ). Curiosamente, esta resistencia parece que hay que superar con el progreso de la infección, ya que los niveles de acumulación de PPV fueron similares en la cuarta hoja por encima de

los inoculados de 10.6.1 y plantas silvestres infectadas (Fig. (Fig. 5 5  ).Tabla 1Infectividad del virus en diferentes 10.6.1 PPV-NK-GFP plantas de amplificación.

Figura 5Virus y las buenas prácticas agrarias de acumulación de tipo salvaje y 10.6.1 transgénicos N. benthamiana plantas inoculadas con el virus diferentes . Los extractos de las hojas inoculadas (inoc.), la hoja inmediatamente por encima de los inoculados (+ 1 hoja), y la cuarta hoja encima de la inoculados (más ...)

En este experimento, sólo un simulacro de inoculados 10.6.1 planta desarrollaron infección de la endógena PPV-NK-GFP amplificación. El hecho de que ninguno de los 10.6.1 plantas inoculadas con PPV tipo salvaje muestran la fluorescencia de GFP (no se muestra) o GFP acumulación (Fig. (Fig.5A), 5A  ), indicó que la propagación sistémica de forma exógena PPV aplicada no es capaz de suprimir la represión de la amplificación endógeno.No fluorescencia de GFP o la acumulación de buenas prácticas agrarias en el western blot se observaron en TVMV plantas infectadas, mostrando que TVMV, como la exógena de tipo salvaje de pago, no fue capaz de derepress la amplificación de PPV de la línea de 10,6 (Fig. (Fig.5B). 5B  ). Por el contrario, todas las plantas 10.6.1 infectados con CMV mostró la expresión de GFP en algunas hojas infectadas. GFP aparece como pequeñas manchas al parecer, situado en las hojas al azar, aproximadamente siete días después de estas hojas desarrollaron síntomas CMV (no mostrado), y nunca se muestra el patrón de buenas prácticas agrarias expresión típica de la infección sistémica amplicón derivados de estas plantas (figura (Fig. 2B). 2B  ).Expresión

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de amplificación en las plantas infectadas con CMV fue confirmado por las buenas prácticas agrarias y la detección de PPV CP por el análisis occidental (Fig. (Fig.5C 5C  ).Una característica típica de la infección por PPV deriva de la expresión de amplificación en el 10,6 plantas es la recuperación a veces tardías de la infección (Fig. (Fig.2b). 2B  ). Análisis de Western demostró que las plantas podrían 10.6.1 recuperarse de la infección producida por una exógena PPV en la misma forma en que se recuperó de una infección endógena de amplificación (Fig. (Fig.6A): 6A  ): CP no se detectó en las hojas jóvenes que no mostraban síntomas o expresión de las buenas prácticas agrarias más. En cambio, ni de tipo salvaje N. benthamiana recuperado de la infección por PPV (Fig. (Fig.6A), 6A  ), ni los transgénicos 10.6.1 plantas recuperadas de TVMV o infección por CMV (Fig. (Fig.6B 6B  y and6C). 6C  ). Además, la esporádica CMV inducida por desrepresión de la amplificación de PPV-NK-GFP aún se llevó a cabo en jóvenes infectados por CMV sale a veces tarde en la que 10.6.1 plantas infectadas con PPV endógenos o exógenos se han

recuperado ya (Fig. (Fig. 0.6 A 6A  y and6C 6C  ).Figura 6La recuperación de la infección por el virus en las plantas transgénicas 10.6.1 . Los extractos de madurez (M) o joven (Y) las hojas de tipo transgénico 10.6.1 o silvestres N. benthamiana plantas inoculadas con PPV (panel A ), TVMV (panel B ) o CMV (panel C ) recogidos en 32 días post inoculación (más ...)

Virus movimiento desde y hacia PPV-NK-GFP 10,6 tejido transgénicoPara conocer el paso de infección a la que se impide la expresión sistémica de la amplificación de 10,6, hemos hecho injertos recíprocos entre 10.6.1 y de tipo salvajeN. benthamiana plantas.Tipo I injertos consistió en un patrón 10.6.1 y un vástago de tipo salvaje (abreviado Rx / SWT, donde x es el número de plantas 10.6.1). Tipo de injertos II consistió en un patrón de tipo salvaje y un vástago 10.6.1 derivados de las mismas plantas utilizadas para el tipo de injerto recíproco I (abreviado ERP / Sx).  Ninguna de las plantas 10.6.1 expresó GFP en el momento del injerto.Expresión de amplificación se observó sólo en dos de las ocho plantas injertadas de tipo I (R1/Swt y R11/Swt). Sorprendentemente, en estas plantas injertadas, los síntomas de la enfermedad y la fluorescencia de GFP se detectó en los vástagos de tipo salvaje, cuando todavía no había señales de expresión de amplificación en los portainjertos transgénicos (Fig. (Fig.7A 7A  y datos no presentados). Una de estas portainjertos (R1/Swt) GFP muestra y síntomas de la enfermedad de reciente aparición en las hojas laterales sucursal, en los últimos tiempos. GFP no podía ser detectado por el análisis occidental en el tejido patrón que no mostraron fluorescencia verde. En el caso de R11/Swt, viral ARN se amplificó por IC-PCR y una banda débil CP se detectó en un análisis occidental del rizoma asintomático (Fig. (Fig. 8). 8  ). infección progresó en los vástagos de tipo salvaje de la R1/Swt y / R11 swt plantas de una manera similar a las plantas de tipo salvaje intacta, y no se recuperó de la infección derivada de amplificación (datos no mostrados). amplicón expresión no se observó en ninguno de los otros tipos I injertado plantas y productos virales no podía ser detectado por

el oeste o el análisis de IC-PCR (Fig. (Fig. 8 8  y datos no presentados).Figura 7Movimiento de 10,6 amplicón derivados del virus a través de uniones de injerto . Injertos recíprocos se realizaron con el tipo salvaje N. benthamiana y 10.6.1 plantas transgénicas. Patrón y el injerto hojas de las plantas injertadas que consta de un vástago de tipo salvaje en un patrón 10.6.1 (más ...)

Figura 8Virus y las buenas prácticas agrarias en la acumulación de 10,6 plantas injertadas . Los extractos de hojas de la púa (S) y portainjertos (R) las secciones de las plantas injertadas que consta de un vástago de tipo salvaje en un patrón 10.6.1 o 10.6.1 de un vástago en un patrón de tipo salvaje que fue inoculado (más ... )

Los patrones de tipo salvaje de ocho plantas de tipo II injertadas fueron inoculados con una infecciosas ADNc de longitud completa de PPV tipo salvaje a los 4 días después del trasplante (DPG). Cuatro plantas (Rwt/S1, Rwt/S2, Rwt/S4 y Rwt/S10) muestra un tipo salvaje infección de PPV en los patrones de tipo salvaje y dos de ellos (Rwt/S4 y Rwt/S10) mostraron síntomas leves de PPV en una pocas hojas vástago, que no se extendió

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en todo el resto de la púa (datos no mostrados). PPV CP, pero no las buenas prácticas agrarias, fue detectado por el análisis occidental de los portainjertos y los injertos mostrar síntomas (Fig. (Fig. 8 8  y datos no presentados). Una banda muy débil CP se detectó en el análisis occidental de la púa asintomáticos de la planta Rwt/S2 (no mostrado). A pesar de PPV CP no fue detectado por el análisis occidental en el vástago de la planta asintomática Rwt/S1 (Fig. (Fig.8A), 8A  ), un fragmento de diagnóstico de tipo salvaje PPV ARN se amplificó por IC-PCR a partir de este vástago, y el mismo fragmento se amplificó también en las muestras del patrón sintomático de esta planta y el vástago sintomático de Rwt/S10 (Fig. (Fig.8B). 8B  ). Los cuatro tipo de plantas injertadas II que no estaban infectados con la primera inoculación PPV cDNA se inoculó con un extracto crudo de PPV hojas infectadas a 25 dpg, cuando todavía no ha dado muestras de expresión de amplificación. Tres de ellos (Rwt/S6, ERP / S7, y Rwt/S22) se parecía a la Rwt/S1 plantas que muestran la acumulación de la enfermedad y la CP sólo en el rizoma (Fig. (Fig.8A 8A  y datos no presentados), aunque un fragmento de cDNA de PPV tipo salvaje se amplificó a partir de los dos los patrones sintomáticos y asintomáticos, el vástago de la planta Rwt/S6 (Fig. (Fig.8B). 8B  ). fluorescencia de GFP o la acumulación de la proteína GFP no fue detectado en ninguna de estas tres plantas (Fig. (Fig.8A 8A  y datos no presentados).En contraste con el resto de las plantas injertadas de tipo II, la planta Rwt/S11 desarrollado un expresan GFP amplicón derivados de la infección en las hojas jóvenes de los patrones de tipo salvaje, mostrando sólo una pequeña mancha GFP en una hoja del vástago transgénicos (Fig. . (Fig.7B). 7B  ). Grandes cantidades de GFP y CP de PPV fueron detectados por el análisis occidental en el patrón que expresan GFP sintomática, pero no en el vástago asintomáticos de esta planta (Fig. (Fig.8A). 8A  ). Un fragmento de cDNA de PPV tipo salvaje se amplificó por IC-PCR del rizoma de la planta Rwt/S11, demostrando que la planta está coinfectado por el que expresan GFP amplicón derivados del virus y la exógena PPV tipo salvaje (Fig. (Fig. 0.8 B). 8B  ). IC-PCR de extractos de los asintomáticos Rwt/S11 vástago transgénicos principalmente amplificó el fragmento de cDNA del virus de la amplificación de origen, pero también produjo una cantidad muy baja de los fragmentos de PPV tipo salvaje (Fig. (Fig.8B), 8B  ), lo que sugiere que el virus exógenos también podría haber invadido el tejido de la planta transgénica.

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DiscusiónHemos transformado N. benthamiana con la secuencia completa de ADNc de una expresión de GFP-PPV recombinantes, dando lugar a diferentes líneas de amplificación de PPV, que muestra la variabilidad gran expresión (Fig. (Fig. 1). 1  ). En informes anteriores se demostró que una amplificación de represión pueden ser activadas por la coexpresión de un supresor de silenciamiento fuerte [ 16 ]. Nuestros resultados muestran que la expresión de amplificación pueden ser reprimidos aún cuando la amplificación lleva un supresor de silenciamiento fuertes como P1-HCPro.Aunque todas las células de las plantas de amplificación llevar el ADNc de longitud completa del genoma del virus, incluso en las plantas de 10,1 líneas, que siempre se muestra señales de expresión de amplificación, amplificación de origen infección por el virus no fue uniforme en toda la planta (Fig. ( Fig.1b). 1B  ). No es posible discernir si la infección en un lugar determinado de la planta es el resultado de la expresión endógena de los transgenes o de propagación del virus de las regiones previamente infectadas de la planta. En las plantas de la línea 10.6, amplicón derivados de la infección se observó por primera vez en discretas y esporádicas focos (Fig. (Fig.2b). 2B  ).Esto sugiere que el proceso de "transgenes nucleares de transcripción de mRNA de procesamiento de ARNm de exportación al citoplasma-ARNm traducción de ARNm de replicación" es ineficiente, ya que se ha sugerido anteriormente [ 27 , 28 ], sino también que un estado de resistencia de las plantas impide la progresión de la infección de las células de raro en que la transcripción del transgén ha sido capaz de iniciar la replicación del virus. El establecimiento de una infección sistémica posterior, con un patrón similar al de las infecciones normales de pago, en la gran mayoría de las plantas de la línea que muestra el 10,6 localizado focos de infección (Fig. (Fig.2b), 2B  ), sugiere que infección por el virus en las hojas superiores se deriva del movimiento del virus a partir de las hojas inferiores y que, en estas plantas, la resistencia a la difusión de locales es una restricción más fuerte en la progresión de la infección que la resistencia al movimiento sistémico. Otra pieza de evidencia de que la resistencia al movimiento sistémico del virus es débil en el 10,6 plantas fue el inicio de la amplificación de origen infección por el virus en el vástago de tipo salvaje de las plantas injertadas antes de que pudiera ser detectada en el tejido portainjertos transgénicos (Fig. (Fig. 7). 7  ). Este hecho también sugiere que los virus infecciosos podrían acumularse en niveles muy bajos (por debajo del límite occidental de detección de análisis) en al menos aproximadamente 10,6 plantas que no presentan fluorescencia verde visible, sin embargo, no hemos sido capaces de infectar a las plantas como indicadores de tipo salvaje N. benthamiana , N. clevelandii o foetidum Chenopodiumcon extractos de las hojas que no mostraban fluorescencia verde de 10,6 plantas, incluso cuando las hojas superiores de estas plantas se expresa la amplificación (datos no mostrados).Todavía no sé qué factor desencadena la expresión de amplificación en las plantas de la línea 10.6.  Esto se llevó a cabo en tan sólo un pequeño número de plantas de 10,6, y la capacidad para apoyar la activación de amplificación no parece ser un rasgo hereditario ya que todas las plantas de la descendencia de las plantas que 10.6.1 ya sea expresa o no expresa la amplificación recuperado de las personas inactivas estado, y el porcentaje de plantas con inducción de la expresión de amplificación fue similar en ambos tipos de progenies (datos no mostrados).Taliansky et al. [ 17 ] demostró que un estrés abiótico, la expresión de un supresor de

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silenciamiento, o la infección con diferentes virus activa un amplicón de PLRV.Sin embargo, la activación de la amplificación de PPV de la línea de 10,6 aparentemente espontánea, a pesar de que no se puede descartar un efecto desencadenante, por ejemplo, un tipo de estrés desapercibido. La activación de la amplificación de TMV descrito por Siddiqui et al. [ 29 ] También fue espontánea, pero mientras que la resistencia limita la expresión de la amplificación de TMV se rompió en una etapa específica del desarrollo de la planta (aproximadamente 7 a 8 semanas después de la germinación), la expresión de la amplificación de PPV parece depender menos de la edad de la planta (que se activó entre 2 y 6 semanas después del trasplante) que en la etapa de desarrollo de las hojas en particular (Fig. (Fig.2C). 2C  ). No sabemos si fue en estas hojas una mejora del proceso que conduce desde la transcripción del transgén en el núcleo de iniciar la replicación del virus en el citoplasma, o un debilitamiento de los mecanismos de resistencia que impide el establecimiento de una infección por PPV desde el ARN viral producto de esta cascada.¿Cuál es la naturaleza del mecanismo de resistencia a limitar la expresión de amplificación en el 10,6 plantas? La resistencia parcial de estas plantas inoculadas exógena PPV tipo salvaje, mientras que son totalmente susceptibles a TVMV y CMV (Figs. (Figs.5B 5B  y y 6) 6  ) indica que la resistencia es específica para el virus. La falta de detección de virus específicos de siRNAs en 10,6 plantas antes de la activación de amplificación (Fig. (Fig. 3), 3  ), como se ha informado de represión amplicón TMV [ 29 ], sugiere que la fuerte amplificación específica de silenciamiento de ARN es postranscripcional no establecidos en estas plantas.  Sin embargo, el hecho de que agroinfiltración con supresores de silenciamiento causado cierta limitada amplificación PPV (Fig. (Fig. 4) 4  ) podría indicar que un bajo perfil silenciamiento de ARN podría estar contribuyendo a mantener la amplificación PPV inactivos en el 10,6 plantas. La replicación del virus moderado observado en las áreas agroinfiltradas con supresores de silenciamiento no fue capaz de facilitar el establecimiento de una infección sistémica. Teniendo en cuenta que el 10,6 plantas no parecen plantear una fuerte restricción a la circulación del virus (ver arriba), este hecho implica que estas plantas presentan algún nivel de resistencia no sólo contra la transcripción endógena derivada de la infección por el virus inoculado o mecánicamente (Fig. (Fig.5A) 5A  ), sino también a la salida del virus al tejido vascular. De acuerdo con esta sugerencia, sólo un bajo porcentaje de 10,6 vástagos fueron infectados de infectados patrones de tipo salvaje en las plantas injertadas (Fig. (Fig. 8). 8  ). Por lo tanto, la infección espontánea de 10.6 plantas que requieren no sólo de una entrada de más de la transcripción de ARN de origen infeccioso o un deterioro en la resistencia de las hojas que muestran los primeros focos del virus, sino también un debilitamiento de la protección antivirus en las hojas superiores que posteriormente fueron sistemáticamente infectados.Aunque la infección por potyvirus se ha demostrado para suprimir el silenciamiento de ARN [  30 ], la activación de amplificación no se detectó en el 10,6 plantas infectadas con PPV tipo salvaje o TVMV (Fig. (Fig.5A 5A  y and5B). 5B  ). En contraste, la infección por CMV causó la expresión de amplificación esporádicos en algunas hojas de las plantas de 10,6 (Fig. (Fig.5C). 5C  ). Estos resultados están de acuerdo con un informe anterior muestra que tanto TVMV y la infección por CMV volvió inducida por el virus silenciamiento de N. benthamiana plantas transformadas con un transgén PPV derivados, pero la susceptibilidad a PPV fue restaurada sólo en las plantas transgénicas infectadas con CMV, lo que sugiere que la infección podría ser TVMV provocar una interpotyvirus protección cruzada mecanismo [ 31 ]. Una posible contribución de la naturaleza PPV tipo de infección o TVMV a la supresión del silenciamiento de amplificación en el 10,6 plantas podría haber sido enmascarado por esta caracterizado protección cruzada mecanismo. Por otra parte, el CMV puede suprimir un mecanismo de resistencia a limitar la expresión de amplificación del 10,6 por diferentes plantas de silenciamiento de ARN. En este sentido, el 2b del CMV se ha demostrado que interfiere no sólo con el silenciamiento de ARN, sino también con la resistencia salicílico virus mediada por el ácido [ 32 ]. Por otro lado, el hecho de que un mutante que carecen de la CMV 2b silenciar supresor fue capaz de facilitar el escape del virus de un silencio de amplificación PLRV, sugiere que la CMV también puede suprimir un mecanismo de resistencia a los virus por una vía independiente-2b [ 17 ]. En cualquier caso, el patrón irregular de expresión amplificación observada en el 10,6 infectados por CMV plantas indica que la infección por CMV no es capaz de suprimir todas las barreras defensivas que se levantaron durante la inducción aparentemente espontánea de la amplificación de PPV-NK-GFP.Una vez que la amplificación de una planta de 10,6 se activa, la infección sistémica progresa en esta planta del mismo modo como en una planta de tipo salvaje (Fig. (Fig.2b). 2B ). Sin embargo, a veces más tarde, el 10,6 plantas infectadas, pero no los transgénicos 10.1 o las plantas de tipo salvaje infectado, aparece islas de color verde oscuro, que son típicos de la recuperación de silenciamiento de ARN mediada [ 23 , 25 , 33 ]. Entonces, la recuperación progresó y hojas recién en desarrollo libres de virus (Fig. (Fig.6A). 6A  ). El fenotipo de recuperación del 10,6 por plantas era específico de canales de pago, ya que también se observó en el 10,6 exógena plantas infectadas con el tipo salvaje PPV, pero no en las plantas infectadas con el 10,6 TVMV o CMV (Fig. (Fig.6B 6B  y and6C). 6C  ). Nuestros resultados no revelan si la represión de la expresión de amplificación en el tejido recuperado es similar a la que el mantenimiento de la amplificación inactivo antes de su inducción espontánea. La ausencia de grandes cantidades de virus específicos de siRNAs en el tejido recuperado, al igual que en el tejido que no ha sufrido la activación de amplificación (Fig. (Fig.3b), 3B  ), sugiere que el mantenimiento de la represión de amplificación después de la recuperación no se basan también en un estado de silenciamiento de ARN fuerte. Sin embargo, existe la posibilidad de que el silenciamiento débil, el ARN transitoria o espacio localizado, podría ser el detonante de

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la recuperación de 10,6 plantas. Esto estaría de acuerdo con otro informe que muestra que antiviral silenciamiento de ARN se limitó a la zona marginal del virus libre de tejido de color verde oscuro en plantas de tabaco infectadas con el virus del mosaico del tomate [ 34 ].

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ConclusionesEn este estudio, se han construido varias líneas amplicón derivados del PPV potyvirus y caracterizado en detalle uno de ellos, la línea 10.6. A pesar de la producción de los fuertes supresores de silenciamiento HCPro, los patrones temporales y espaciales de expresión de la amplificación de PPV son muy variables entre las diferentes líneas transgénicas y plantas individuales de estas líneas.Restricciones a la amplificación del virus y locales difusión, en lugar de movimiento sistémico, parecen ser los principales factores que restringen la infección por virus de la línea transgénica 10.6. Resistencia a los virus en esta línea transgénica es específica para el virus y afecta no sólo a partir de la amplificación del virus del transgén endógeno, sino también en la infección de virus exógenos, introducidos por inoculación mecánica o por injerto.  Además, los dispositivos de amplificación de antivirales derivados desplegados en el 10,6 plantas tienen un efecto retardado que resulta en un fenotipo de recuperación tardía. Nuestros resultados sugieren que la expresión de amplificación pueden ser restringidos por una combinación de factores, incluyendo probablemente una conversión eficiente de la transcripción de los transgenes nucleares a citoplasma replicable ARN viral, silenciamiento de ARN y otras respuestas defensivas de la planta que no puede ser totalmente contrarrestado por los supresores virales.

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MétodosConstrucción de p35S-PPV-NK-GFP-NOST, Nicotiana benthamianatransformación y cultivo de plantasP35S-PPV-NK-GFP-NOST plásmido se construyó mediante la inserción en pBin19 [35 ] digerido con SmaI y XbaI, el fragmento PvuII-XbaI de pIC-PPV-NK-GFP [ 36 ] que contiene la secuencia de longitud completa de cDNA de PPV. N. benthamianadiscos de hojas se transformaron con esta construcción con A. tumefaciens de la inoculación, básicamente de acuerdo con Horsh et al. [ 37 ] y las plantas fueron regeneradas en un medio que contenía kanamicina (100 mg / ml). Plántulas enraizadas fueron trasplantadas al suelo y después de la aclimatación en cámara de crecimiento a 22 ° C y 70% de humedad con un 14 h/10 h luz / oscuridad ciclo, las plantas transgénicas fueron trasladados a un invernadero.En general, las semillas de las plantas transgénicas fueron germinadas in vitro en agar solidificado medio con kanamicina (100 mg / ml) a 23 ° C con 16 h / 8 h luz / oscuridad ciclo.  Plántulas en la etapa de la hoja 2 (aproximadamente 10 días después de la germinación) se transfirieron al suelo y se cultivaron en una cámara de crecimiento a 22 ° C y 60% de humedad, con un 14 h/10 h luz / oscuridad fotoperíodo.Expresión de los supresores de silenciamiento por agroinoculation10.6.1 plantas transgénicas fueron infiltrados con A. tumefaciens cepa C58C1 llevar pBIN61: P19 [ 38 ], p35S-P1B, p35S-NTAP-P1B [ 39 ], p35S-P1/HC-pro [ 40 ] o el vector vacío pBin19. Alrededor de 250 l de acetosiringona inducida porAgrobacterium cultura (OD 600 = 0,6) se aplicaron con una jeringa en la parte inferior de tres hojas cuando las plantas estaban en la etapa de ocho hojas. Como control de la actividad de los supresores de silenciamiento, las mezclas de cultivos deAgrobacterium cepas con p35S: GFP [ 41 ] y el plásmido que codifica el supresor de silenciamiento, se coinfiltrated en el tipo natural N. benthamiana .Virus inoculaciónDos o tres hojas fueron espolvoreadas con carborundum y se inocularon con el dedo, frotando con 15 l de ADN o de pICPPV [ 42 ] (0,7 mg / ml) o de extractos de hojas infectadas de tipo salvaje N. benthamiana plantas de suelo con 5 mM tampón fosfato (pH 7,4) (1 g en 2 ml).Planta de injertoLas plantas de aproximadamente 10 hojas de la etapa de desarrollo fueron injertados por el método tradicional de hendidura. Para el tipo I injertos, portainjertos 10.6.1 se prepararon mediante la eliminación de la sesión por encima de dos hojas basales sanos y en hacer un corte vertical, de 1,5 a 2 cm de largo, en el centro del tallo.Vástagos de unos 4 cm de longitud fueron injertados después de la eliminación de todas las hojas excepto los dos más pequeños y el recorte de su base a una "V" de cuña.  Tipo II de injertos 10.6.1 vástagos en patrones de tipo salvaje se prepararon de la misma manera, pero tres hojas fueron dejados en los patrones para facilitar la inoculación con el tipo salvaje PPV. Las uniones de stock / vástago fueron asegurados con Parafilm y las plantas injertadas se cubrieron con una bolsa de plástico durante una semana para evitar la deshidratación.GFP imágenesHojas de las plantas fueron seleccionadas para la expresión de las buenas prácticas agrarias con un flii MZ (Leica Microsystems) estereoscópico de fluorescencia, utilizando filtros de excitación y de barrera de 480/40 nm y 510 nm, respectivamente.Las imágenes se obtuvieron con una cámara Olympus DP70 digital DP controlador y el software de administrador de DP.Detección de proteínas

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Tejido de la hoja se baja con mortero en nitrógeno líquido y almacenadas a -80 ° C.Extractos proteicos fueron preparados por el deshielo del polvo en tampón de extracción (150 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6 M urea, 2% SDS, y el 5% β-mercaptoetanol) (1 ml por gramo de tejido). Los extractos fueron hervidos y los restos celulares se eliminaron por centrifugación. Las muestras fueron resueltas en geles de poliacrilamida al 12% de SDS y electroblotted a una membrana de nitrocelulosa.Proteínas específicas fueron detectados utilizando anti PPV CP o CMV contra o viriones TVMV sueros policlonales como reactivo de primaria, y conjugado con peroxidasa de cabra anti-conejo IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) como reactivo secundario, o una mezcla de dos anti-GFP anticuerpos monoclonales (Roche ) como reactivo de primaria, y conjugado con peroxidasa de oveja anti-ratón IgG (Sigma-Aldrich) como reactivo secundario. Las proteínas se visualizaron immunostained con un kit de LiteAbLot (Euroclone). Ponceau tinción con rojo se utiliza para comprobar el contenido global de proteína de las muestras.La extracción de RNA y análisis de Northern blotTejido de las hojas era un terreno en nitrógeno líquido con mortero y se almacenó a -80 ° C.  Los ácidos nucleicos se extrajeron como se ha descrito previamente [ 43 ].Para el análisis de transferencia de Northern de siRNAs, aproximadamente 2 g de ARN total se resolvieron en un gel de poliacrilamida al 15% de desnaturalización (con 7 M urea) y se transfiere a una bolsa de nylon Hybond-N + membrana por transferencia capilar [ 44 ]. Tinción con bromuro de etidio de la tinción con azul de metileno y el gel de la membrana se utiliza para verificar la igualdad de carga y transferencia. Después de UV entrecruzamiento y prehibridación en UltraHyb buffer (Applied Biosystems / Ambion), blots se hibridó en la misma solución con un 32 P-etiquetados sonda de ARN antisentido correspondiente a la P1 de PPV o NIB secuencia de codificación, previamente hidrolizados con tampón carbonato a un duración media de aproximadamente 50 nt. Señales de hibridación se detectaron con un sistema molecular Imager FX.RT-PCR después de inmunocaptura (IC-PCR)Las hojas se homogeneizaron en 5 mM de tampón fosfato de sodio, pH 7,4 (2 ml por gramo) y se incubaron 2 horas a 37 ° C y durante la noche a 4 ° C en tubos previamente recubiertas con IgG anti-PPV CP. Después de dos etapas de lavado con 16 mM de tampón fosfato de sodio, 0,1 M NaCl, 0,5 g / l de Tween 20, pH 7,2, RT-PCR se realizó en los tubos de revestimiento con el Titán de RT-PCR System (Roche). Oligodesoxinucleótidos 5'-TTGGGTTCTTGAACAAGC-3 'y 5'-TGGCACTGTAAAAGTTCC-3' se utilizaron para amplificar fragmentos de cDNA de 1255 nt nt o 511, de PPV-NK-GFP o de tipo salvaje de pago, respectivamente.Autores de las contribucionesMC hecho todos los experimentos con la línea de 10.6 se muestra en este artículo, con la supervisión científica de la GD en los primeros pasos de la obra. CL construyó el plásmido e hizo la transformación de la planta y la caracterización de los transformantes primarios, con la JMA y supervisión JLM. JO y Di-s hizo los primeros análisis fenotípico de las plántulas de las diferentes líneas transgénicas.CSM colaboró en el análisis de siRNA. JAG coordinó el trabajo, participaron en la discusión de todos los experimentos y escribió el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.AgradecimientosDamos las gracias a Elvira Domínguez de apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por becas BIO2007-67283 del MEC español, CPE03-022-C5-3 de INIA, SAL/0185/2006 de la Comunidad de Madrid, y KBBE-204429 de la Unión Europea.GD fue apoyado por la Fundación Carolina. CL fue beneficiario de una beca de la Comunidad de Madrid. MC fue beneficiario de una beca I3P del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)-Fondo Social Europeo. CSM fue apoyada por un contrato Ramón y Cajal.

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