Tipo 1 receptor de rianodina ronda en la mutación que causa la enfermedad del núcleo central de los músculos esqueléticos también muestra un fenotipo neuronal.De Crescenzo V , Fogarty KE , Lefkowitz JJ , Bellvé KD , Zvaritch E , MacLennan DH , Walsh JV Jr .

Fuente

Departamento de Microbiología y Fisiología de Sistemas de la Universidad de Massachusetts Medical School, Worcester, MA 01655, EE.UU.. valerie.decrescenzo @ umassmed.edu

AbstractoEl receptor de rianodina tipo 1 (RyR1) se expresa ampliamente en el cerebro, con altos niveles en el cerebelo, hipocampo y el hipotálamo. Hemos demostrado que (2 +) canales de tipo L de Ca en las terminales de las neuronas hipotalámico magnocelular se acoplan a RyRs, como lo son en el músculo esquelético, permitiendo tensión inducida por Ca (2 +) de liberación (Vicario) de Ca interna (2 + ) tiendas sin Ca (2 +) afluencia. Aquí demostramos que RyR1 juega un papel en Vícar en las terminales nerviosas. Por otra parte, en los heterocigotos de la RYR1 (I4895T/WT) (TI / +) línea de ratón, que lleva una mutación knock-in correspondiente a uno que causa una forma grave de enfermedad del núcleo central humano, Vicario está ausente, lo que demuestra que el Tipo 1 media RyR Vicario y que estos ratones tienen un fenotipo neuronal. La ausencia de Vícar se muestra de dos formas: en primer lugar, la despolarización en ausencia de Ca (2 +) afluencia provocada Ca (2 +) syntillas (chispa, chispa, en una terminación nerviosa, una estructura sináptica) en WT, pero no en terminales de mutantes; segundo, en presencia de Ca extracelular (2 +), terminales de TI / + mostraron una doble disminución de la mundial Ca (2 +) transitorios, sin ningún cambio en plasmalemmal Ca (2 +) actual. A partir de estos estudios nos acercamos a dos conclusiones: (i) RyR1 juega un papel en Vícar en las terminales nerviosas del hipotálamo, y (ii) una alteración neuronal acompaña a la miopatía en IT / + ratones, y, posiblemente, en los seres humanos que llevan la mutación correspondiente RyR1.

Palabras clave: microdominio, exocitosis, oxitocina, vasopresina

En los últimos años se ha acumulado evidencia de un papel para el Ca 2

+ tiendas en las terminales nerviosas ( 1 , 2 ). En terminales magnocelulares aislados, encontramos, espontáneos, Ca focales, rianodina sensibles citosólicas 2 + transitorios (Ca 2 + syntillas). Inesperadamente, también encontramos que la despolarización de la membrana plasmática, en ausencia de Ca externa 2 + y, por lo tanto, en ausencia de Ca 2

+ afluencia, aumentamos syntilla frecuencia y mundial [Ca 2 + ] ( 3 ).Hemos designado este proceso, que sólo se había observado previamente en el músculo esquelético, como Ca tensión inducida 2 + de liberación (Vícar). Casi al mismo tiempo, también se encontró evidencia de Vicario en los axones columna dorsal ( 4 ) y, más recientemente, en las neuronas piramidales del hipocampo ( 5 ). Además hemos demostrado que Vicario en terminales nerviosas está mediada por receptores de rianodina (RyRs) y

los receptores de dihidropiridina (DHPRs) como en el músculo esquelético ( 6 ).

RyRs son grandes homotetramers (2,2 MDA) que se encuentran en las membranas del retículo endoplásmico y sarcoplásmico o funcionan como Ca 2 + canales de liberación, la realización de Ca 2 +en el citosol. Todas las tres isoformas de RyR están presentes en el cerebro de los mamíferos ( 7 ). A pesar de Ca 2 + inducida por Ca 2 + liberación (CICR) a través de RyR2 se ha implicado en la amplificación de Ca 2 + transitorios en las neuronas, ningún papel aún no se ha asignado a RyR1.Anteriormente, hemos presentado pruebas de inmuno que en las terminales nerviosas hipotalámico magnocelular RyR1 se encuentra cerca de la membrana plasmática, colocándolo en la posición para mediar en Vícar, pero hasta ahora no ha habido ninguna prueba funcional para un papel de RyR1 en los terminales. En contraste con su papel incierta en el sistema nervioso, RyR1 se sabe que juega un papel clave en la excitación-contracción (CE) de acoplamiento en el músculo esquelético ( 8 ).

Un número creciente de trastornos del músculo esquelético se han asociado con mutaciones en RyR1 , la hipertermia maligna siendo más frecuente (MH) y miopatías básicos, tales como enfermedad del núcleo central (CCD) y la enfermedad de multi y. Por ahora, más de 300 mutaciones causantes de la enfermedad han sido identificados en RyR1 ( 9 ). RYR1 mutaciones que causan MH y CCD se producen en toda la molécula, pero hay tres puntos de acceso en la que se incrementa la frecuencia de mutaciones ( 9 ). Algunas mutaciones en la tercera región de punto de acceso, cerca de la terminal C, perturban la estructura de la Ca 2 + poros y por lo tanto interfiere directamente con la función intrínseca de Ca 2 + en libertad. Estas mutaciones se han asociado predominantemente con miopatías núcleo. Uno de ellos es el humano Ryr I4898T mutación, que se encuentra entre la más frecuente de esos ryr1 mutaciones que están asociadas con CCD y otras miopatías de núcleo ( 10- 12 ). La mutación se encuentra en el filtro de selectividad del Ca 2 + poros ( 13 ) e interrumpe Ca 2 + permeación sin afectar a la organización estructural y supramoleculares general de RyR1 ( 14- 16 ).

Hemos generado una línea de ratón knock-in, ryr1 I4895T/WT (en adelante denominado como TI / +), que lleva el análogo murino de la mutación I4898T humana ( 16 ). En el estado homocigótico, esta mutación es neonatal letal debido a que los ratones han muy poco desarrollado músculo esquelético, incluyendo que la formación de la membrana, y no son capaces de respirar ( 16 ). En el estado heterocigoto, dependiendo en el

fondo, la mutación del ratón hace que un núcleo de miopatía progresiva con núcleos y varillas, lo que perjudica significativamente la movilidad en alrededor de 1 año de edad (14 , 17 , 18 ).

Miopatías congénitas principales son un grupo de trastornos neuromusculares de la patología altamente variable que normalmente presente en la infancia con la debilidad del esqueleto muscular, hipotonía y retraso del desarrollo motor ( 19 ). La existencia de un componente neural en la etiología de las miopatías núcleo mucho tiempo se ha debatido ( 20- 22 ). La idea se basa en la sorprendente similitud entre las lesiones fundamentales observados en el músculo esquelético de pacientes con miopatías centrales y las lesiones Targetoid reportados en el músculo denervado ( 20- 23 ) y después de tenotomía ( 17 ). Una anomalía en la función motora neuronal se propone, por tanto, pero nunca demostró experimentalmente. Por otra parte, la participación de los distintos componentes del sistema nervioso central en la etiología de las miopatías centrales también ha sido abordado nunca. Debido a que los investigadores han debatido durante mucho tiempo la posibilidad de que las miopatías congénitas tienen un componente neural, que razonó que los ratones / TI + pueden proporcionar un modelo útil para la investigación de un posible defecto de los nervios que acompaña a las manifestaciones de miopatías núcleo. Aquí se demuestra que los ratones / TI + hacen, de hecho, tener un fenotipo neuronal. Por otra parte, el enfoque genético ha aportado pruebas funcional directa que RYR1 media Vicario en las terminales nerviosas.

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RESULTADOSCa 2 + Syntilla frecuencia aumenta a -80 mV en IT / + En comparación con WT.

Nuestros primeros experimentos fueron diseñados para examinar si Ca 2

+ syntillas estaban presentes en TI / terminales nerviosas hipotalámico magnocelular + + en condiciones que se aproximan estrechamente el estado de reposo fisiológico (es decir, en presencia de 2,2 mM de Ca extracelular 2 + ) con el potencial plasmalemmal celebrada en -80 mV ( Fig.. 1   A  ). En estas condiciones, las terminales nerviosas muestran espontáneos Ca 2 + syntillas y, sorprendentemente, la frecuencia se incrementó más de tres veces en el IT / + mutante, de 0,23 ± 0,06 s -1 ( n = 22) en el WT a 0,87 ± 0,18 s -1 ( n terminales en TI = 21) / + nerviosas ( P = 0,001) ( . Fig. 1   A   y   B1  y Tabla 1 ). La masa de señal para WT fue 44,20 ± 10,28 × 10 -

20 moles de Ca 2 + ( N = 6) y el IT / + mutante fue 73,39 ± 8,07 × 10 -

20 moles de Ca 2 + (N = 43), P = 0,193 ( Fig.. 1   B2  y Tabla 1 ). Vale la pena señalar que el aumento de la frecuencia syntilla no planteó la citosólica de descanso [Ca 2 + ] (31,77 ± 8,20 nM en IT / + terminales frente a 51,32 ± 12,90 nM en WT, P = 0,380). Por lo tanto, en el nivel de la actividad espontánea, la TI / + mutante exhibe un fenotipo neuronal a nivel de la fisiología celular.

Tabla 1.

Resumen de datos

. Figura   1.

Espontáneas Ca 2 + syntillas se incrementan en las terminales nerviosas de TI / +. Los terminales son tensión-sujetada a -80 mV en presencia de 2,2 mM extracelular Ca 2 + , con fluo-3 en la pipeta de parche. ( A ) registros representativos de syntillas en WT (superior ) y ...

Tensión inducida por Ca 2 + Release, presente en el WT, se bloquea en IT / +.

A continuación se examinó el efecto de la mutación en Vícar. Para observar Vicario, que exige la despolarización de la terminal, se utilizó una solución sin extracelular [Ca 2 + ]. Ese proceso nos permitió evitar la posible interferencia debido a Ca 2 + afluencia y para asegurarnos de que no hay CICR que es evocado por Ca 2 + afluencia. Por otra parte, sólo en este Ca 2

+ libre de condiciones se puede ver un aumento en la frecuencia de syntillas, porque syntillas no queden ocultas por un aumento global de la [Ca 2 + ]. La despolarización de las terminales nerviosas desde -80 hasta 0 mV indujo un aumento en la frecuencia de syntilla de 0,98 ± 0,24 s -1 ( n = 14) a -80 mV a 2,75 ± 0,56 s -1 a 0 mV ( n = 7), P = 0,003 ( Fig.. 2   A   y   B1  y Tabla 1 ), lo que demuestra Vicario en los terminales de la cepa de ratón WT SV129. El aumento de la frecuencia fue similar a nuestros

hallazgos anteriores en ratones Swiss Webster ( 6 ). Sin embargo, con las terminales nerviosas del SV129 IT / + compañeros de camada, frecuencia syntilla no fue cambiado de manera significativa en la despolarización (1,78 ± 0,25 s -1 ( n = 8) a -80 mV y 1,00 ± 0,60 s -1 ( n = 7) a 0 mV). Debido a que la cantidad de señal de syntillas registrado en WT y IT / bornes + a 0 mV fue similar [79,3 ± 6,6 × 10 -20 moles de Ca 2 + ( N = 68) en el WT vs 98,0 ± 16,1 × 10 -20moles de Ca 2 + ( N = 28) en IT / +] ( Fig. 1   B2  y Tabla 1 ), la ausencia de Vícar en el mutante no podía ser debido a syntillas no detectados. Llegamos a la conclusión de que el TI / + mutación induce una pérdida de Vicario, tal como se mide por la frecuencia syntilla.

. Figura   2.

Vícar se bloquea en el IT / + mutante. ( A ) Imágenes representativas de Ca 2 + syntillas durante 4 s grabaciones a -80 mV y 0 mV en ausencia de Ca extracelular 2 + y el uso de fluo-3 como Ca 2 + indicador. En WT, la despolarización de 0 mV aumenta el número ...

También se observó una inusual cantidad de señal de los syntillas en el WT SV129 a -80 mV [220,6 ± 30,1 × 10 -20 moles de Ca 2 + ( N = 40)] ( . Fig. 2   B2  y Tabla 1 ) en el Ca 2 + condición libre, que no se ve en Swiss Webster ( 3 ) y puede representar una mayor susceptibilidad de las terminales nerviosas SV129 a las condiciones no fisiológicas de la Ca 2 + -medio ambiente libre.

Global Ca 2 + transitorios En la despolarización es reducido Twofold en IT / + En comparación con WT.

A continuación examinó el efecto de la ausencia de Vícar en las terminales nerviosas de TI / + en presencia de 2,2 mM externa Ca 2 + durante la despolarización, que elevó mundial [Ca 2 + ].Comparamos IT / + y WT llevar y terminales nerviosas sobre la despolarización a 0 mV utilizando ratiometric fura-2 mediciones ( Fig.. 3   A  ). El aumento de fura-2 en relación TI / + fue de dos tercios del valor en WT (1,29 en TI / + vs 1,92 en WT, P = 0,009). En este potencial (0 mV), la magnitud del pico de plasmalemmal Ca 2 + actual ( Fig.. 3   B  ) no fue significativamente diferente en WT y terminales + / TI -34,27 ± 7,18 pA ( n = 10) en TI / + vs . -44,95 ±

10,85 pA ( n = 6) en WT ( P = 0,375). Por lo tanto, la diferencia en los transitorios globales no parece ser causada por cambios en Ca 2 + afluencia, sino más bien indica un defecto en Ca 2 + liberación de los almacenes intracelulares. Debido a que estos experimentos se llevaron a cabo en las mismas condiciones en las que se estudió el mutante en el músculo esquelético, una comparación es posible, y los resultados en la terminal nerviosa son comparables a las de las fibras esqueléticas ( 15 ).

. Figura   3.

La despolarización cambios inducidos por citosólica mundial [Ca 2 +] son más pequeños en TI terminales / + que en WT. ( A ) Cinética de los cambios en la fura-2 en relación WT (azul) y / + terminales informáticos (rojo) sobre la despolarización de -80 mV a 0 mV de 500 ms. Traces ( Izquierda ...

IT / + y WT responden diferentemente a los protocolos de estimulación fisiológica.

Luego preguntamos si un mutante RyR1 fenotipo era evidente en las terminales nerviosas durante protocolos utilizados para simular la activación fisiológica. Las terminales nerviosas fueron estimuladas ya sea por una despolarización prolongada para imitar la despolarización causada por K + acumulación fuera de las terminales nerviosas ( Fig.. 4   A  ) ( 24 ) o un tren de despolarizaciones cortas para imitar una ráfaga de potenciales de acción (NS80 en la figura. 4   C  ) ( 24 , 25 ). Global Ca 2 + transitorios se midieron con fluo-3, que es suficientemente rápida para dar una indicación de la velocidad de aumento de los transitorios ( 26 ). Con el paradigma de la despolarización a largo ( Fig.. 4   A  ), el Ca 2 + transitorios en TI / + [huella roja, 1,46 ± 0,11 ( n = 9)] fue significativamente menor que en WT [trazo azul, 2,51 ± 0,13 ( n = 12)], como se espera de los datos de fura-2 en la figura.   3   A  que se registraron en las mismas condiciones (es decir, con 2,2 mM externa Ca 2 + y la despolarización prolongada).

. Figura   4.

Vicario es provocado por un plasmalemmal prolongada no despolarizante por un tren de breves despolarizaciones. Terminales nerviosas se patch-sujetados a fisiológica 2,2 mM extracelular [Ca 2 + ] con fluo-3 en el parche pipeta. F 0 es la media de fluorescencia en el ...

En la presencia de Cd 2 + para bloquear Ca 2 + actual, el Ca 2 + transitorios en WT disminuyó de 2,51 ± 0,13 ( n = 12) a 1,52 ± 0,17 ( n = 12), p = 0,00013; la magnitud de la restante transitoria puede ser tomado como el componente provocada por Vícar. Por lo tanto, en consonancia con nuestros resultados anteriores, despolarizaciones largas fueron capaces de inducir Vicario en WT. Sin embargo, en terminales de TI / +, en presencia de Cd 2 + , se observó un aumento muy lento y pequeño en Ca mundial 2

+ [1,21 ± 0,05 ( n = 9), en comparación con 1,52 ± 0,17 ( n = 12, P = 0,05), en ausencia de Cd 2 + ], lo que indica que en IT / + terminales Vicario es bastante pequeño. En cada caso, el aumento mundial en [Ca 2 + ] hecho que dificulta el seguimiento syntillas debido al aumento de la fluorescencia de fondo.

Loy et al. ( 15 ) demostraron que las fibras musculares individuales de IT / + ratones mostraron una reducción significativa en la magnitud y la velocidad máxima de RyR1 mediada por Ca 2 + liberación durante el acoplamiento CE. Para determinar si existe una disminución similar en los terminales nerviosos, se comparó la cinética de Ca 2 + liberación en WT y IT / terminales + durante el tiempo de despolarización que fue capaz de provocar Vicario en WT ( Fig. 4.   B  ). Hemos demostrado previamente que el fluo-3 era lo suficientemente rápido para estudiar el curso de tiempo de chispas en el músculo liso ( 27 ) y syntillas en terminales nerviosas ( 3 ). La cinética de unión de fluo-3 ( 26 ) también son suficientes para revelar diferencias en la Ca 2 + curso de tiempo transitorio, que aparece más lento en este sistema que en el músculo esquelético. El porcentaje máximo de Ca 2 + liberación se aproxima desde el pico de la primera derivada de la fluo-3 fluorescencia (d [Δ F / F ] / dt) ( . Fig. 4   B  ). El porcentaje máximo de Ca 2 + liberación se redujo significativamente en los terminales nerviosos de

TI / + (0,8 ± 0,3) en comparación con el WT (2,7 ± 0,3, P = 0,0014). Por otra parte, en la presencia de Cd 2 + , donde se registra sólo Vicario, sin aumento de Ca 2 + liberación fue evidente en los terminales de TI / +.

Con el protocolo NS80 ( Fig. 4   C  ), no se observó una diferencia en la F / F 0 incremento entre el TE y TI / +. Por otra parte, en la presencia de Cd 2 + , no había ninguna indicación de Vicario en WT o TI / + mediante el control global de Ca 2 + . Sin embargo, como no hubo un aumento global en Ca 2 + cuando Cd 2 + estaba presente, hemos sido capaces de controlar syntillas, que no era posible con el protocolo de la despolarización de largo ( Fig.. 4   A  ). En la presencia de Cd 2 + , se observó un aumento significativo en la frecuencia syntilla en terminales WT (de 0,36 ± 0,08 s -1 a -80 mV a 0,85 ± 0,13 s -1 bajo NS80, P= 0,019). Por lo tanto, parece que el protocolo de la despolarización prolongada es más efectivo que el protocolo de NS80 en la obtención de Vicario. Con el protocolo de despolarización prolongada, Vicario provoca un aumento en global de [Ca 2 + ], mientras que con el protocolo NS80 el aumento en la frecuencia syntilla no se unen en un aumento mundial en [Ca 2 + ]. En los terminales + / TI en la presencia de Cd 2 + , Vicario no era demostrable (frecuencias syntilla fueron 0,48 ± 0,11 a -80 mV y 0,69 ± 0,16 en virtud NS80 en TI / +).

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DISCUSIÓN

Dos conclusiones principales se derivan del trabajo presentado aquí en IT / + ratones. En primer lugar, la mutación del CCD I4895T, que hemos encontrado para dar lugar a los cambios miopáticos en el músculo esquelético, también tiene un fenotipo neuronal, una demostración única de un fenotipo neuronal para un RyR1 mutación. En segundo lugar, RyR1 media Vicario en las terminales nerviosas hipotalámico magnocelular, como lo hace en el músculo esquelético.

Hemos demostrado previamente que DHPRs y RyRs proporcionan la base molecular de Vícar en las terminales nerviosas ( 6 ). Aquí nos implicamos el 1 RyR tipo definitivamente, mostrando un efecto de laRyR1 IT / + mutación en Vícar. En sí mismo, este hallazgo no descarta un papel adicional para RyR2 también, porque ambos son abundantes en estas terminales nerviosas ( 6 ). Puede ser que las obras Vicario través de la activación de DHPR RyR1 y Ca 2 + liberación del RYR1 activa RyR2 por CICR para producir la amplificación y un syntilla visible. El RyR1 IT / Se propone + mutación que se encuentra en la región del poro y esa es la razón por la cual se manifiesta disminución de la permeabilidad. Baja la

conductancia en la RyR1 TI / + mutante podría entonces resultar en insuficiente Ca 2 + liberación para activar RyR2, por lo que la frecuencia de syntillas visibles gotas. Este proceso es análogo al mecanismo en el músculo esquelético de anfibios, donde el DHPR activa RyR1 directamente y la resultante Ca 2 +liberación, a su vez, activa a través de RyR3 CIcR ( 28 ).

La principal conclusión es que el IT / + mutante muestra un fenotipo neuronal. Este hallazgo es una demostración funcional y fisiológica única que el 1 RyR tipo juega un papel en las células nerviosas. Es interesante que las células cromafines, que, al igual que las neuronas magnocelular, se utilizan a menudo como un sistema modelo para estudiar la exocitosis, no tienen RyR1s y tampoco Vícar ( 29 ).Por lo tanto, en donde se encuentra RyR1, Vicario también puede ser encontrado. Por lo menos, que ya no se puede suponer que CIcR ( 30 ) es el único mecanismo de vinculación de la actividad eléctrica en las neuronas para liberar de intracelular de Ca 2

+ tiendas.

Nuestros datos son consistentes con aquellos en el músculo esquelético, donde la mutación reduce RyR1 Ca 2 + ion de permeación de una manera que conduce a una reducción paralela en tanto la magnitud ( Fig.. 4   A  ) y la velocidad ( . Fig. 4   B  ) de RyR1 mediada Ca 2 + liberación durante el acoplamiento EC (15 ). Aunque el RyR1 mutación I4895T CCD causa una miopatía central en nuestra línea de ratón ( 14), que todavía no tenemos evidencia de una neuropatía en estos mismos ratones.

Espontánea Ca 2 + Release interior de las tiendas de IT / +.

Nuestros resultados ( . Fig. 1 ) muestran que la frecuencia es mayor en syntilla TI / + que en WT a -80 mV en presencia de fisiológica [Ca 2 + ].A primera vista, esta conclusión puede parecer estar en contradicción con la disminución de Ca 2 + de liberación de la despolarización, aunque implica claramente de tipo 1 RyR en que descansa la liberación, así como vicario. Sin embargo, un doble efecto de la mutación tal no es necesariamente contradictoria.Por ejemplo, la mutación, además de afectar la conductancia, puede simplemente cambiar la inducción de voltaje de Ca 2 + liberación de los potenciales negativos, causando menos libertad bajo despolarización y más en reposo. O puede ser que el DHPR ejerce una acción inhibidora sobre RyR1 en reposo y la despolarización elimina la inhibición y provoca la activación. El RyR1 mutación puede debilitar ambas interacciones, lo que resulta en más syntillas en reposo y menos Ca 2 + de liberación de la despolarización. Tendrá que hacer para resolver estas posibilidades de trabajo adicional.

En los miocitos cardíacos, la presencia de Ca 2 + chispas en reposo se utiliza como un índice de descansar Ca 2 + fuga desde el retículo sarcoplásmico a través RyR2 ( 31 ). Sin embargo, como se estudian en bicapas y en miotubos en cultivo de IT / + ratones mutantes, la mutación que no es una mutación fugas: la presencia de más de dos subunidades de TI mutantes en un tetrámero se ha demostrado que hacer RyR1 nonpermeant de Ca 2

+ ( 15 ). No encontramos aumento mundial en [Ca 2 + ] en reposo, por lo que el aumento en la frecuencia syntilla no es suficiente para afectar a la detectable global de [Ca 2 + ] ( . Fig. 3 ).

Papel de RyR1 en la exocitosis.

Una característica especial de neuronas hipotalámico magnocelular es su participación directa en la secreción de neuropéptidos. Hemos demostrado que un syntilla no provoca un evento exocítica en las terminales nerviosas de estas células ( 32 ). La misma conclusión es cierto en las células cromafines, a pesar de que hay suficiente Ca 2 + a hacerlo si el Ca 2 + de un syntilla fueron puestos en libertad en el lugar de la etapa de exocytic final ( 29 ). Estos hallazgos sugieren que el Ca 2 +de syntillas provocada por cualquiera de 1 RyRs tipo (en terminales nerviosas) o tipo 2 (en las células cromafines) se libera en un microdominio diferente de aquel en el que se produce el paso exocítica final.Por otra parte, en las células cromafines, se ha encontrado que syntillas que surgen de RyR2s suprimen la exocitosis monitoreado amperométrica ( 33 ). Un estudio sobre el síndrome de estrés porcino indica que un mecanismo similar puede estar presente en las neuronas parvocelulares. En este caso, los verracos que tienen una condición cerca de MH exhiben menor de ACTH en plasma basal ( 34 ). Debido a que el RyR1 mutación R615C que causa MH en estas porcina tiene una ganancia de función, las neuronas parvocelulares pueden tener un aumento en la frecuencia syntilla que a su vez podría bloquear la liberación de hormonas. Esta capacidad de Ca 2 + a tiene divergente o incluso acciones antagónicas puede entenderse si los diferentes objetivos de la Ca 2 + liberado tener baja afinidad y se encuentran en diferentes microdominios de modo que sólo se activan por una fuente cercana de Ca 2 + . En los cuerpos celulares de las neuronas ganglionares de la raíz dorsal, sin embargo, focal Ca 2 + transitorios derivados de RyR3s hacer causa exocitosis, por lo que es posible para tales transitorios tener diversos efectos, dependiendo del tipo de célula y la localización dentro de la célula ( 35 ).

Por último, las neuronas magnocelular utilizados en este estudio como modelo son responsables para el nivel de las hormonas oxitocina y la

vasopresina que se han asociado con el comportamiento social ( 36). Por lo tanto, podría valer la pena investigar si miopatías RyR1 relacionados también pueden estar asociados con variaciones en el comportamiento social.

Estos resultados también señalan la importancia de microdominios focales y breves Ca 2 + transitorios.Entre otras cosas, los microdominios permiten una única señal, Ca 2 + , que tienen una amplia gama de efectos ( 31 ). Transitorios de Ca Focales mediadas por RyRs se encontraron por primera vez como "chispas" en las células cardíacas ( 37 ), en el que están mediadas por RyR2, y luego bajo condiciones de estrés osmótico en el músculo esquelético ( 38 ), en el que están mediadas por RyR1. En cada uno de estos casos, las chispas que sirven como bloques de construcción elementales para aumentos globales de Ca 2 + , lo que proporciona una acción fisiológica clara. A continuación, se encuentran las chispas en el músculo liso ( 39 celdas en las que se ha añadido una nueva dimensión a su importancia). En el músculo liso el resultado chispas en la activación de la cercana gran Ca 2 + -activated K + (BK) canales, dando lugar a espontáneos corrientes hacia el exterior transitorios que hiperpolarizan el músculo y por lo tanto causan relajación, el efecto contrario de un aumento de la citosólica mundial [Ca 2 + ] ( 39 ). La clave para esta dualidad es la relativa falta de sensibilidad de los canales BK a Ca 2 + y su localización en el microdominio chispa, donde están expuestos a altas concentraciones de Ca 2 + en el orden de 10 mM, un nivel no alcanzado por global de [Ca 2 + ] ( 40- 42 ). Por lo tanto, la microdominios en el músculo liso es la base para el Ca 2 + para ejercer múltiples, incluso opuesta, efectos y proporciona un precedente para su acción inesperada en las células cromafines ( 33 ).

Terminales nerviosas de la neurohipófisis segregan oxitocina o vasopresina en respuesta a las ráfagas de potenciales de acción ( 25 ). In situ, los terminales neurohypophysial están muy juntos, con los espacios intersticiales apretados que la difusión límite, dando como resultado la remoción de iones externa retardada. La estimulación de la neurohipófisis intacto se ha demostrado que aumenta externa K +dentro de los primeros 3 s ( 24 ). Este aumento en K externa + induce una despolarización constante de los terminales de los nervios durante la ráfaga de potenciales de acción. Por lo tanto, en los terminales aisladas sin restricciones en la situ sobre la difusión, la despolarización a largo es necesaria para imitar la situación fisiológica ( 43 ).

Nuestros datos muestran que a largo despolarización es más eficaz que un tren de potenciales de acción en la activación de Vícar. Por lo tanto, se propone un modelo en el que cada potencial de acción permite a Ca 2

+ entrada a través de la N-tipo Ca 2 + canales, provocando la secreción ( 44 , 45 ), pero, además, el tiempo de despolarización activa también vicario a través de una interacción entre la L- tipo Ca 2 +canales y RYR1. Por lo tanto, Ca 2 + de los espacios extracelulares que activan la exocitosis y Ca 2 +intracelular de las tiendas liberadas a través RyRs puede entrar en diferentes microdominios. Por ejemplo, una ráfaga de potenciales de acción desencadenaría exocitosis, pero la eventual acumulación de K + y la despolarización sostenida favorecería Vicario, la generación syntilla, y tal vez la supresión de la exocitosis, que podría actuar como un freno a la exocitosis. Es evidente a partir de estas consideraciones que el efecto preciso de Vicario y syntillas en la exocitosis es potencialmente muy complejo y necesita ser cuidadosamente, se separan.

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MATERIALES Y MÉTODOSManejo Animal.

Protocolos experimentales para la investigación con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y Comités uso tanto en la Universidad de Massachusetts Medical School y la Universidad de Toronto. La generación y determinación del genotipo de ratones A / TI + se describió previamente ( 16 ). Para los experimentos, IT / + ratones, generados sobre un fondo SV129, se cruzaron con ratones WT 129S2/SvPasCrl (Charles River).

Parches Whole-Terminal.

Para los experimentos, los ratones de ambos sexos y 10-12 semanas de edad murieron rápidamente por dislocación cervical, de conformidad con el Cuidado de Animales institucional local y utilizar las directrices del Comité (protocolo A-124 a JVW y A-1964 a VCC). Las terminales nerviosas hipotalámico magnocelular estaban recién preparados como se ha descrito previamente ( 3 ). Tight-seal, grabación de "Todo-terminal" en las terminaciones nerviosas, se hizo con un amplificador HEKA EPC10. Solución de la pipeta era: 0,05 mM de K 5 fluo-3 o K5fura-2 (Molecular Probes), 135 mM de KCl, 2 mM de MgCl 2 , 30 mM de Hepes, 4 mM de MgATP, 0.3 mM de Na-GTP, pH 7,2. Solución del baño fue: 135 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 10 mM de Hepes, glucosa 10 mM, 1 mM de

MgCl 2 , y 2,2 mM CaCl 2 , pH 7,2. Para el Ca 2 + sin solución de baño de CaCl 2 se retira y se añade 0,2 mM EGTA. Para evitar el agotamiento de Ca 2 + a partir de depósitos internos, los terminales se mantuvieron en solución de normal Locke (2,2 mM Ca 2 + ) hasta el comienzo del experimento, y la duración de la Ca 2 + protocolo-libre fue de ~ 15 min ( 40 ) .

Para medir la magnitud de la plasmalemmal Ca 2 + actual en la figura.   3   B  en la configuración de célula completa, la solución interna se cambió para bloquear corriente hacia el exterior y aislar el Ca 2 +actual: 130 mM de NMG-Cl, 10 mM de CsCl, 30 HEPES, 2 mM de Mg-ATP, y 0,3 mM de Tris-GTP .Por otra parte, se añadió TTX (1 M) en la solución externa para bloquear Na + actual. A partir de un potencial de mantenimiento de -80 mV, se utilizó 100-ms pasos positivos desde -70 mV hasta +50 mV en incrementos de 10 mV y 60 s entre cada paso. Después de un protocolo de control, que Cd "hinchado"2 + durante 2 min y luego se construyó un nuevo protocolo de trama voltaje de corriente mientras Cd 2

+ fue todavía está hinchado. No hay corriente de entrada se podría registrar en presencia de Cd 2 + . Sólo se informó el valor de la corriente a 0 mV.

Reactivos (de Sigma, a menos que se indique lo contrario) eran baño de perfundido o entregado por un "Picospritzer" (Válvula general). Terminales fueron suspendidos de la punta de la pipeta, fuera de contacto con el suelo de la cámara.

Grabaciones de fluorescencia.

Se utilizó el indicador radiométrica fura-2. Los datos presentados representa la relación de excitación de 340/380 nm para fura-2 que es representativa de mundial citosólico [Ca 2 + ] ( 46 , 47 ). Para Fluo-3, imágenes de fluorescencia se obtuvieron con un sistema de imagen digital de gran campo hecha a la medida a 50 Hz (exposición de 10 ms) ( 40 ). Los terminales se obtuvieron imágenes como se ha descrito previamente ( 3 ). Procesamiento de imágenes y análisis posterior se llevó a cabo fuera de línea usando un paquete de software de diseño personalizado. Dos medidas de Ca 2 + se utilizaron: uno para evaluar las propiedades de los aumentos transitorios de coordinación en Ca 2 + (es decir, Ca 2 + syntillas) de forma cuantitativa, y otro para evaluar los aumentos globales de Ca 2 + .

Señal Misa

Para evaluar las propiedades de Ca 2 + syntillas y no lo cuantitativo, se utilizó el método de señal de masa. En resumen, con esta técnica la

cantidad total de Ca 2 + liberado en un syntilla se mide con el Ca 2 + tinte sensible, fluo-3. El método de la masa de señal se describe en detalle en ZHUGE et al.( 27 ) y una adaptación a las terminales nerviosas magnocelulares en De Crescenzo et al. ( 3 ), donde la calibración para relacionar aumento medido en la fluorescencia a la cantidad total de Ca 2

+ liberado en una sola syntilla también se describe.

Análisis de los datos.

En todos los casos, los datos se presentan como media ± SEM; N es el número de syntillas que se utilizan en el análisis de la masa de la señal y n es el número de observaciones. El análisis estadístico de las diferencias se hace con unpaired, dos colas t de prueba y los P -valores se han ajustado Bonferroni estado (indicado por **), según proceda, con P <0,05 consideró significativo (marcadas con *).

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AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a los Dres. R. Dirksen (Universidad de Rochester Facultad de Medicina y Odontología) y R. Zhuge (University of Massachusetts Medical School) para discusiones interesantes y útiles. Este estudio fue financiado por el subsidio HL21697 (a JVW) de los Institutos Nacionales de Salud; Subvención 0835580D (a VDC) de la Asociación Americana del Corazón, y Grant RP-3399 (a DHM) de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud.

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NOTAS AL PIE

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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