4 o M B R E : Ramón Arista Reyes Matricula 88339877 Tel. particular: 5 47 47 97

LICENCIATURA: Universidad’Autónoma Metropolitana-lztapalapa División de Ciencias - Biológicas y de la Salud Licenciatura en Biología Experimental

TRIMESTRE LECTIVO: 97-1

TIEMPO DE DEDICAC16N: 40 hrs a la semana

TITULO DEL TRABAJO: ““PREPARACION DE CONJUGADOS COUMESTROL-BSA1 J LUGAR DEL DESARROLLO: Universidad Autónoma Metropolitana-lztapalapa Departamento de Biología de la Reproducción Laboratorio de Síntesis de Neurofármacos (R-022)

ASESOR: M. en C. Jorge Armando Haro Castellanos Profesor titular C Area de Investigación Aplicada Departamento de Biología de la Reproducción

DURACION: Inicio: Abril lo, 1995 Terminación: Marzo 25, 1996

FIRMA DEL ASESOR

M. en C. Jorge A. Haro Castellanos Ramd

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA IZTAPALAPA

CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD DEPTO. CIENCIAS DE LA SALUD

SfMlNARlO D f INVfSTlGAClON INFORM€ FINAL

Presentado por: Ramón Arista Reyes

88339877 Marzo, 1997

INDICE

INDICE 2

INTRODUCCION 4

LAS FITOALEXINAS Los FITOESTR~GENOS LA ALFALFA, EL COUMESTROL Y SU POTENCIA ELEFECTOENLOSVERTEBRADOS E L ANTI-FITOESTR~GENO

OBJETIVO GENERAL 9

OBJETIVOS P A R T I C U L A R E S 9

METODOLOGIA U T I L I Z A D A 10

REACTIVOS 10 CROMATOGRAF~A DE CAPA FINA 10 S~NTESIS DE A N H ~ D R I D O s u c c f ~ ~ c o 10

' PURIFICACI6N DEL COUMESTROL 11 CROMATOGRAF~A EN COLUMNA 11 ESPECTRO DE ABSORCI6N EN UV 11 S~NTESIS DE LOS DERIVADOS: 6-HEMISUCCINOI[L-COUMESTROL Y 7'-

HEMISUCCINOIL-COUMESTROL 12

ACTIVIDADES R E A L I Z A D A S 14

ADQUISICION DE REACTIVOS SEMINARIOS D I V U L G A C I ~ N

14 14 14

OBJETIVOS Y M E T A S A L C A N Z A D A S 15

2

RESULTADOS 16

PURIFICACI6N DEL COUMESTROL S~NTESIS DE LOS DERIVADOS DE COUMESTROL,

16 17

CONCLUSIONES 19

RECOMENDACIONES 20

LAS CONDICIONES LAS PERSPECTIVAS

20 20

LITERATURA CONSULTADA 22

3

INTRODUCCION

En diversos vegetales como la soya (Glycine max), el frijol (Phaseolus vulgaris), la alfalfa (Medicago sativa) y el trébol (Ladino clover) la producción de fitoalexinas (del griego, phyton, "planta" y alexina, "defender"; compuestos orgánicos de las familias de los flavonoides e isoflavonoides que poseen una considerable actividad antibiótica[ll) responde a diversas causas como son la presencia de agentes patógenos o parasitarios en tallos y hojas, la existencia de metales pesados contaminantes en el suelo, y a la exposición a luz ultravioleta.

La función primaria de las fitoalexinas es proveer de protección inespecifica a las plantas contra algunos tipos de infección como los provocados por: Pseudopeziza trifolii[2], Phoma medicaginid31, Pseudoplusia includens[4], Colletotrichum lindernuthianum[51, Phytophthora , rnegasperma[61 y Bradyrhizobium japonicum[7] adicionalmente, a nivel de raíz, poseen actividad como compuestos que promueven asociaciones simbióticas[7,8].

I ISOFLAVONA ISOFLAVANONA

R 3 HR2 O

ISOFLAVANOL

R2":aoH R1

COUMESTANO PTEROCARPANO

Esquema 1. Familias de isoflavonoides y análogos.

I

4

Aun cuando la producción y liberación de estas fitoalexinas al medio es causada por infección de bacterias o presencia de parásitos, también se encuentran otros agentes causales que inducen su producción y liberación, como ciertas clases de daños físicos: la exposición a luz UV[gI 11, altas concentraciones de sales de metales pesados en el suelo[gl 10, 1 12, 13, 14], presencia de ozono [ I s ] , que someten a la planta a condiciones de estrés continuo.

Las familias de moléculas que se üncluyen dentro de los isoflavonoides, son principalmente las isoflawonas, las isoflavanonas, los isoflavonoles, los pterocarpanos, los coumestanos. (esquema 1). La mayoría de estos compuestos están involucrados en una compleja red metabólica de biosíntesis[161.

Los fifoestrúgenos

Los isoflavonoides guardan semejanza estructural con los estrógenos animales (esquema 2), como el estradiol, provocando diversos efectos a los organismos (p.ej. ganado vacuno, ovino, incluido el ser humano, etc.) que los consumen, puesto que están contenidos en los alimentos de consumo diario. En general, semejan la actividad hormonal normal de la fisiología del vertebrado, por lo que se les conoce como estrógenos no esteroideos derivados de vegetales (o fitoestrógenos).

, 2H

I CoumEsnw. T.4'QIHIDROXIISOFLAVONA DAlDZElNA

1 Esquema 2. Comparación estructural de los fitoestrógenos coumestroi y daidzeina con un estrógeno, el 17 P-estradiol

5

El efecto biológico que producen los isoflavonoides está determinado por la interacción directa que t h e n con los receptores a estrógenos presentes en el citosol. La rel~ación causa-efecto esta determinada por la disposición espacial de l a molécula sus grupos sustituyentes. En un estudio realizado en 1995 M i k s i c e k d

determinó que se requería de la estructura común de todos los isoflavonoides: un par de anillos aromáticos sustituidos con al menos un grupo hidroxilo. Adicionalmente, Anstead, G.M. y Kym, P.R.[181 (1995) determinaron que la compatibilidad electrónica de una molécula que es susceptible de unirse a un receptor de estrógenos depende en primera instancia de la presencia de un grupo fenólico, cuyo grupo hidroxilo interactúa con el receptor a estrógenos generando un puente de hidrógeno y el anillo aromático genera enlaces débiles con algunos residuos aminoacídicos del receptor[l81.

La affaffa, ef coumesfrof y su pofench

El coumestrol (esquema 3) fue por primera vez aislado y caracterizado por E. M. Bickoff y coautores en 1957[191. En 1958 realizaron bioensayos determinar su actividad fisiológica extrayéndolo de trébol d f r a D u r a n t e el mismo año Emerson y Bickoff realizaron la síntesis [211 de esta molécula, con el fin de confirmar la estructura propuesta en estudios previos, así como tenerla disponible para estudios farmacológicos.

\ OH

Esquema 3. Coumestrol -

6

En 1961 Livingston y cols. realizan la determinación cuantitativa de coumestrol en alfalfa fresca y seca[22], encontrando entre 89 hasta 1 lOmg de coumestrol por Kilogramo de alfalfa. En estudios recientes realizados en el laboratorio del M. en C. Carlos Romero del Departamento de Biología de la Reproducción de la Universidad Autónoma Metropolitana-lztapalapa se ha encontrado que las concentraciones de coumestrol en alfalfa, se encuentran el orden de los 70 mg/kg de alfalfa y que estos valores pueden representar concentraciones plasmáticas de aproximadamente 13 ng/mL del fitoestrógeno, que representan aproximadamente 130 veces las concentraciones de la hormona animal equivalente (estradiol)[23].

La disponibilidad total de las concentración del coumestrol, causada por la incapacidad de ésta para unirse a proteinas plasmáticas (Martin et. al. citado en[2ol), incrementa la actividad estrogénica de la molécula.

El efectu en los vertebradus

Bickoff y colaboradores demostraron la actividad estrogénica del coumestrol, sobre útero de ratÓn[201. Posteriormente ha sido demostrada en diversos animales (ovejas, Shutt, 1976; codorniz, Leopold y cols., 1976; ratas, Drane y cols., 1975; gatos, Setchell y cols., 1987; humano, Setchell y cols., 1984, citados enI241).

Esta actividad provoca diversos efectos biológicos: incremento en glándulas .mamarias, disminución en los tiempos de gestación, aumento en el peso uterino, así como vagina. útero. cervix y recto prolapsados (Bradbury y White, 1954; Bickoff y cols., 1960; 1962; Magge, 1963; Braden y cols.; 1964; Cox y Braden, 1974; Trenkle y Borroughs, 197g1 citados en

Las sustancias con peso molecular menor a las 1000uma, como el coumestrol cuyo peso molecular es de 268.2luma, ordinariamente no son consideradas como antígenos susceptibles de provocar respuesta inmunológica. Sin embargo, un organismo puede generar anticuerpos por inmunización contra agentes que alteran e1 metabolismo si se les acopla con moléculas de bajo peso molecular, formando así el ha teno, y finalmente este es unido covalentemente a proteínas o péptidosl $51.

7

Hasta 1980, probablemente el Único intento por aprovechar esta metodología y obtener un antigen0 capaz de provocar una respuesta anti-fitoestrogénica fue realizado por Bauminger y cols[26] en 1969.

Sus experimentos estuvieron enfocados a un isoflavonoide que esta involucrado en trama metabólica de las fitoalexinas y los coumestanos, la genisteína.

Las concentraciones de fitoestrógenos que se encuentran en el plasma de los organismos que consumen este tipo de forrajes pueden ser controladas con anticuerpos dirigidos contra estas moléculas, independientemente de las pruebas de radioinmunoensayo que pueden ser desarrolladas para fitoestrógenos en plasma sanguíneo.

8

OBJETIVO GENERAL

1. Síntesis de conjugados fitoestrógeno-BSA. Determinación de condiciones.

OBJETIVOS PARTICULARES

1.1 Sintetizar haptenos de coumestrol en presencia de DCCl

1.2 Sintetizar haptenos de coumestrol en medial básico.

1.3 Separación de los derivados de coumestrol

1.4 Preparación de los conjugados:

7'-hemisuccinoilcoumestroI-BSA y

6-hemisuccinoilcoumestrol-BSA

1.5 Determinación del contenido de determinantes antigénicos

9

METODOLOGIA UTIL.IZADA

El coumestrol fue obtenido de Acros Organics, New Jersey, USA a través de Bioselec, S.A. de C.V.; los siguientes reactivos fueron obtenidos de Merck México: piridina, ácido acético, éter etílico, cloroformo (CHC13), metano1 (MetOH), etanol (EtOH). La diciclohexilcarbodiimida, la piridina y la ldimetilformamida fueron obtenidas de J.T. Baker, México.

Análisis de reactivos y productos de reacción

Para el análisis de todos los reactivos y productos de reacción se utilizaron los siguientes sistemas de disolventes orgánicos:

A) Cloroformo,

B) CHC13-MetOH (9: 1)

C) CHC13-MetOH (1 9: 1)

D) CH2C12-MetOH (9: I )

Se prepararon soluciones stock de los reactivos para ser utilizada como patrón durante el desarrollo del protocolo. De estas soluciones se tomaron alicuotas de 10 pL para ser aplicadas en las placas cromatográficas (5x1 Ocm y10 2 . 5 ~ 1 Ocm, Merck Silica-gel F254).

Una masa de 17.79 de ácido succínico elquivalentes a 1.5 X 10-1 moles fueron mezcladas con 47 mL de ácido acético (equivalentes’a 8.24 X 10-1 moles), se reflujaron en las siguientes condiciones: temperatura de 90°C y presión de 1 atm por dos horas. La mezcla de reacción fue enfriada hasta temperatura ambiente y posteriormente se redujo la temperatura hasta 4OC en un baño de hielo. El producto así precipitado se filtró al vacío en un embudo Buchner y se le realizaron lavados 4 X 40 mL con éter etílico anhídro, finalmente se le hizo pasar un corriente de aire a temperatura ambiente. Los cristales del anhídrido succínico fueron colocados y mantenidos en un desecador al vacío y libre de humedad.

10

Se determinó el punto de fusión (Fisher-Jones) del producto siendo este de 1 l9-12O0C, comparable al de la literatura (1 18-12OoC.)

La muestra fue adsorbida en silica-gel de la siguiente manera: en un matráz bola se colocaron 0.29 de coumestrol y 49 de silica-gel (Merck 37-70 mesh ASTM) adicionandosele EtOH hasta disolución total, posteriormente se eliminó el EtOH mediante presión reducida a temperatura de aproximadamente 8OOC.

Se preparó una columna cromatográfica con dimensiones de 30mm de diámetro por 400mm de altura, en la que se empacó la silica-gel 60 (Merck 37-70 mesh ASTM). El sistema de disolventes utilizado para el empacamiento de la silica-gel y para la purificación del coumestrol fue CH2C12-MetOH (9:l) . La columna cromatográfica fue mantenida a temperatura constante de 4OC.

Una vez empacada la columna la muestra fue colocada en la parte superior de la columna. La purificación del coumestrol inicio al hacerse pasar una corriente continua de la mezcla de disolventes; se colectaron 135 fracciones de eluyente de la columna cromatográfica en volúmenes de aproximadamente 9 mL.

Las fracciones así colectadas se analizaron por barrido de espectrofotometría de UV (Spectronic 700 Ultrascan) en un rango de 200-400nm de longitud de onda. El coumestrol fue aislado en las fracciones 24 a la 11 O.

11

Síntesis de fus derivados: 6 - ~ e ~ ~ s u c c i n u ~ f - c u u ~ e s t ~ u f y 7'- hem~succi~~~f-cuumestfuf

Serie A. Esterificación ácido dicarboxl'lico-fenol en presencia de DCCl

Experimento 7

Derivados hemisuccinoil-coumestrol por la técnica de Bodanzki et. aI.[281. Se colocaron 0.01 86 x 10-3 M de coumestrol y 0.0259 de anhídrido succínico en un tubo de reacción, donde fueron disueltos en la mínima cantidad de CHC131 posteriormente se agregó una cantidad equimolar de DCCl respecto al anhídrido succínico. La reacción procedió por 4hrs a temperatura ambiente y con agitación continua. La mezcla de reacción se analizó por cromatografía de capa fina.

€xperimento 2.

Derivados hemisuccinoil-coumestrol por la técnica de Bodanzki et. a1.[281 modificando la variable de tiempo a 8 hrs. La mezcla de reacción se analizó por cromatografía de capa fina.

Experimento 3

Derivados hemisuccinoil-coumestrol por la1 técnica de Bodanzki et. a1.[281 modificando la variable de tiempo a 24 hrs y utilizando dimetilformamida como solvente para la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se analizó por cromatografía de capa fina.

Serie B. Esterificación ácido dicarboxílico-fenol en medio básico

Experimento 7

Derivados hemisuccinoil-coumestrol por la técnica de Hollander et. aI.[291. Se colocaron 2.61 1 x 10-4 M de coumestrol y en O. l g de anhidrido succínico en presencia de una base débil (piridina) y la mezcla fue sometida a calentamiento por reflujo (aproximadamente 100°C) con agitación constante por 2 hrs. La piridina fue removida por evaporación con presión reducida a una temperatura de aproximadamente 40OC; el sólido obtenido fue lavado con EtOH ( ImL x 3). De este se tomó una muestra que fue disuelta en EtOH y de esta disolución se tomó una alicuota para realizar el análisis de la mezcla de reacción por cromatografía de capa fina.

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Experimento 2

Derivados hemisuccinoil-coumestrol por la técnica de Hollander et. a1.[281 con modificación en la variable de tiempo de reacción, aument,ándose hasta 6hrs de reflujo en presencia de piridina. Del sólido así obtenido se tomó una muestra que fue disuelta en EtOH y de esta disolución se tomó una alicuota para realizar el análisis de la mezcla de reacción por cromatografía de capa fina.

Experimento 3

Derivados hemisuccinoil-coumestrol por la técnica de Hollander et. a1.[281 con modificación en la variable de tiempo de reacción, aumentándose hasta 60 hrs de reflujo en presencia de piridina. Del sólido así obtenido se tomó una muestra que fue disuelta en EtOH y de esta disolución se tomó una alicuota para realizar el análisis de la mezcla de reacción por cromatografía de capa fina.

13

ACTIVIDADES REALlZADAS

Coumestrol

Durante el proceso de búsqueda de un proveedor de dicho reactivo, se tuvo estrecho contacto con diversos proveedores personalmente y vía telefónica. El producto existía en algunos catálogos, pero ningún proveedor estaba capacitado para traerlo a México. En un nuevo intento se localizó el catálogo de Eastman Kodak, Inc.(aparentemente, el Único proveedor a nivel del continente americano), compañía con la cuál se mantuvieron diversas pláticas tanto en México como con las oficinas centrales en Nueva York, U.S.A. obteniéndose como resultado una contestación negativa a la posible adquisición1 del reactivo puesto que este era ya un producto descontinuado.

Este reactivo fue adquirido como artículo de importación a través de Bioselec, S.A. de C.V. (proveedor especializado).

Anhídrido succínico

Este reactivo fue sintetizado en el laboratorio de Síntesis de Neurofármacos del M. en C. Jorge Haro bajo el protocolo establecido por ~ o g e W 1

Se llevaron a cabo seminarios dentro de los laboratorios de Síntesis de Fármacos a cargo del M. en C. .Jorge Haro Castellanos y Fisioendocrinología del Desarrollo y la Adaptación del M. en C. Carlos Romero.

Los seminarios incluyeron reportes de avances así como tópicos relacionados al proyecto, durante los cuales SE? discutieron y analizaron metodologías y procedimientos a seguir de los diversos aspectos del protocolo experimental en el servicio social.

Adicionalmente se colaboró en la preparación del manuscrito para la revista Veterinaria México [23l(Ver anexo A),, así como exposición del tema en diversos foros académicos, como los; Seminarios de Biología Experimental.

14

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS

Durante el desarrollo del servicio social se logró montar una metodología de purificación del coumestrol tanto a nivel reactivo como de extractos vegetales a partir de alfalfa por t6cnicas de cromatografía en columna y capa fina. Estos compuestos purificados fueron utilizados en el laboratorio de Fisioendocrinología del Desarrollo y la Adaptación del M. en C. Carlos Romero para el desarrollo de diversas líneas de investigación.

La determinación de las condiciones de reacción para la condensación del hapten0 que fueron probadas demostró que éstas deben ser más drásticas o bien utilizarse otro tipo de agentes que permitan llevar a cabo la reacción de condensación entre el isoflavonoide coumestrol y la molécula acoplante anhídrido succínico, como algunas carbodiimídas solubles en agua.

En particular, las metodologías demostraron que el proceso de reacción de condensación bajo condiciones bilsicas y en presencia de diciclohexilcarbodiimida (DCCI, insoluble en agua) resultaron insuficientes y demasiado suaves para que se llevara a cabo, de tal manera que, aún el las condiciones más extremas ensayadas (temperatura de reflujo 100°C o tiempo de reacción de 24hrs, ver metodología) no se logró detectar compuestos de nueva formación por los análisis de cromatografía en capa fina.

La colaboración entre los dos laboratorios en los cuales fue llevado a cabo el servicio social permitió que parte de este resultara como un apoyo en la determinación y cuantificación del compuesto isoflavonoide coumestrol en forraje vacuno de la zona de Clhalco y en consecuencia su publicación en la revista de la Facultad de Medicina Veterinaria de la U.N.A.M. (ver referencia 23), así como su presentación en diversos foros académicos (Ver anexo A).

I

15

RESULTADOS

Purificaciún de/ coumestro/

El análisis de los barridos espectroscópicos en luz UV de todas las fracciones recolectadas en la cromatografía de columna reveló que el coumestrol se encontraba en las fracciones 25 a la 110. El patrón característico de estas fracciones se muestra en la figura 4, donde se observan los picos de absorción máxima típicos del coumestrol a 244, 304 y 343 nm de longitud de onda.

El seguimiento realizado a estas fracciones mediante cromatografía de capa fina reveló que la impureza persistía aún cuando en revelado por absorción de luz UV se encontró evidentemente disminuida con respecto al patrón. No se cualifico la concentración de la impureza en el reactivo.

L A S T A C " . M " D ( 2 c o . c - r O 0 . O ) p u r i f i c a c i o n p a t r c n c o u m e s t r o l

I O . 6 6 9

1 2 0 7 . 3

I

0 . 8 1

0 . 3 1 2 O . 3 4 4

2 4 4 . 2 3 4 3 . 6

0 . 2 1

i

I I I

\- I I I I I I

2 0 0 220 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 0 360 3 8 0 i'

N a n o m e t e r s

16

Sintesis de /os derivados de coumestro/

Serie A. Esterificacibn Bcido dicarboxilico-fenol en presencia de DCCl

. . "

I

I

, .. 1 -7

d.

Fig. 5. Cromatograma típico de las reacciones en la serie A

Se muestra un cromatograma típico de la slerie A en la figura 5 Las cromatografías de capa en el análisis de los tres experimentos de esta serie son todas similares y se observan los carriles correspondientes a las materias primas y la mezcla de reacción. El cromatograma fue eluido en el sistema B (ver metodología). De izquierda a derecha, 1. Coumestrol, 2. Anhídrido succínico, 3. DCCl y 4. Mezcla de realcción.

La comparación de los patrones de corrimient'o de las bandas en los carriles de las materias primas respecto al de mezcla de reacción muestra que en este no se encuentra ninguna banda adicional, con lo que se demuestra que en ninguno de los tres experimentos de la serie se formo producto alguno durante la reacción.

Resulta importante remarcar que dentro de estla serie de experimentos, el coumesltrol bajo ninguna circunstancia fue modificado y presentó siempre el mismo patrón de corrimiento en todos los sistemas de elección y el mismo espectro de absorción en Ibarrido de UV (ver figura 4).

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Serie B. Esterificacidn ácido dicarboxílico-fenol en medio básico

-ig. 6. Cromatograma ípico de las reacciones ?n la serie B

Las cromatografías de capa fina en las que se basó el análisis de los tres experimentos de esta serie son todas similares y se muestra un cromatograma típico en la figura 6. Como en la serie Al se observan los carriles correspondientes a las materias primas y la mezcla de reacción, adicionalmente se encuentra el carril de la piridina. El cromatograma fue eluido en el sistema

Coumestrol, 2.. Anhidrido succínico, 3. Piridina y 4. Mezcla de reacción.

B. De izquierda a derecha, l .

La comparación de los patrones de corrimiento de las bandas muestra que, en el carril 4, existen materias primas y no se encuentra ninguna banda adicional que indique formación de producto alguno durante la reacción o bien degradacich de las materias primas

Como en el caso anterior es importante remarcar que no solo no hubo reacción alguna dentro de esta serie de experimentos, sino que, el coumestrol bajo ninguna circunstancia fue modificado y presentó siempre el mismo patrón #de corrimiento en todos los sistemas de elección.

18

CONCLUSIONES

Los experimentos de la serie A fueron basados en una modificación a la metodología utilizada por Bodanzki [281

1) La polaridad de los solventes utilizados (cloroformo y dimetilformamida) que resultó adecuada para la disolución de los reactivos, no influyó en el proceso de la reacci6n.

2) La presencia de un agente condensante (por deshidratación), como la diciclohexilcarbodiimida (DCCI), tampoco tuvo efecto alguno sobre la reacción esperada.

3) La condición de reacción libre de agua para favorecer la formación del éster ésta no favoreció la formación de producto.

Los experimentos de la serie B fueron basados en una modificación a la metodología utilizada por Hollander[29]

1) La variable tiempo mostró no tener ninguna influencia sobre la formación del producto.

2) La piridina (medio básico débil, con dos electrones deslocalizados) que en las condiciones establecidas (no mostradas por Hollander) reporta la formación de un producto secundario de esterificación ácid0 carboxílico-fenol no tuvo efecto sobre la formación de producto.

En general:

1) Las condiciones de reacción que fueron puestas a prueba no son, de ninguna manera, las ideales para llevar a cabo la esterificación deseada.

2) En ningún caso, la impureza que presentó el coumestrol fue determinante para que este no reaccionara, en consideración a su poca masa (relativa a las cantidades las materias primas) y a que siempre apareció como banda bien definida en todos los cromatogramas.

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RECOMENDACIONES

Este protocolo de investigación debe servir como base para continuar en la búsqueda de un procedimiento de síntesis que permita obtener el producto esperado con altos rendimientos y a un bajo costo. La experiencia transmitida en este trabajo debe también servir como fundamento para realizar un análisis más profundo que conduzca a la realización del objetivo.

Se recomienda, particularmente, realizar una búsqueda de condiciones de reacción en condiciones más severas que forcen la inducción del éster ácido dicarboxílico-fenol énfasis.

Otra alternativa de síntesis que debe ser /probada corresponde con el uso de otros agentes condensantes como son algunas carbodiimídas, que por poseer diferentes características moleculares, como son sus cadenas laterales o solubilidad, pueden influir de manera determinante en la condensación esperada.

Una estrategia alternativa y posibilidad interesante es la de cambiar de molécula "puente" para la formación del hapteno. Podría ser utilizado un azocompuesto altamente reactivo dirigido contra algún átomo de carbono susceptible.

Por otra parte, se debe tener especial cuidado en el diseño del protocolo a seguir, procurando sistematizar los experimentos de tal manera que solo se modifique una sola de las variables involucradas en la reacción.

Las perspecfivas

El coumestrol que es una sustancia poderosamente activa como agente mimético de los estrógenos endógenos puede ser neutralizado mediante la inmunización activa de un organisrno contra esta molécula. El diseño y la preparación de un inmunógeno para el coumestrol requiere de especial atención pues es un compuesto altamente estable que debe ser localizado en el organismo por los anticuerpos como agente libre y como determinante hapténico.

20

En el campo la inmunofarmacoterapia se han logrado avances espectaculares en un intento por neutramlizar de modo efectivo sustancias orgánicas que de alguna manera llegan hasta el plasma sanguíneo para luego interactuar de modo adverso con receptores proteicos del organismo, como un ejemplo reciente se encuentran los resultados obtenidos por Carrera y colaboradores [3'1 en el Instituto de Investigación Scripps en La Jolla, California, donde logran la supresión de los efectos psicoactivos de la cocaína por inmunización activa.

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24

ANEXO A

Síndrome estrogénico en vacas lecheras por consumo de alfalfas con grandes cantidades de coumestrol

Carlos M. Rornero-R.' M' del Rosario Tarragó Castellanos'

Ramiro Munoz Mendoza" Ramón Arista Reyes'

Adolfo Rosado Garcia-

. Resumen

Se describe un síndrome que se caracteriza por aumento en el porcentaje de vacas que repiten celo, de abortos, de meuiosis y metritis, y de quistes olaricos, así como esuos falsos y útero turgente (UT) a la palpación aun con diagnóstico de gestación positivo (40-60 días de preñez) asociado con consumo de alfalfa con grandes cantidades de coumesuol. El estudio se realizó en 608 vacas en riesgo, a l a s que se les practicaron 1264 inseminaciones en el curso de un año, observándose sólo 376 gestaciones (29.75%), de l a s cuales 102 cursaron con UT y moco cérvico vaginal (MCV) fluido, 36 terminaron en abortos y 238 fueron normales. La resistencia eléctrica del MCV en las vacas gestantes con DX de UT fue significativamente menor que el medido en l a s vacas gestantes normales (68.8 I 15.17 contra 114.03 f 17.05 SZ, n = 30) ysemejan- re al encontrado en las vacas en estro (63.16 2 10.56 f2 n = 30). En 10 vacas gestantes con UT y MCV fluido se determinó la concentración plasmática de estradiol por radioinmunoanálisis; se encontraron valores normales (12.9 t 10.04 pg/ml) en seis de los diez animales, que no explican la presencia del síndrome esuogénico. De la alfalfa que consumen los animales se extrajo el coumestrol, se purificó por cromatografia de capa fina y se determinó su concentración por espectrofotomem'a W a 243 nm. Las grandes Cantidades de coumesuol encontradas en la alfalfa consumida por los animales estudiados (663 mg/ kg alfalfa seca, sin considerar las pérdidas durante el proceso de extracción y purificayión) pueden ser l a s responsables del síndrome estrogénico descrito y su importancia económica justifica la valoración de los resultados de este estudio y la búsqueda de soluciones apropiadas al problema.

Recibido para su publicación ci 22 de febrero de 1996. * Departamento de Biología de la Reproducción. Univenidad Au-

tónoma Metropolitana - Iztapalapa. Av. Purísima y Michoacán, Col. Vicenuna. Iztapalapa, 09340. México, D. F.

** Dcpartamcnto de Producción Agrícola y Animal. Universidad Autónoma Mctropolicana-Xochimilco. Calzada del Hueso 1100. Col. Villa Qurctud. 04960. México, D. F.

Introducción

La zona de Chako, Estado de México, se ha caracteriza- do por tener una gran actividad pecuaria principalmente en la producción de leche y sus derivados. En esta zona se encue~ntran varias explotaciones de bovinos de leche, que por el número de cabezas que suman, representan una cantidad importante de producción de leche para el consu- mo local y de la ciudad de México.

Desde hace Varos años se han realizado obsemciones en hatos de las zonas lecheras del altiplano, l a s cuales dan cuenta de un problema importante que redunda en la disminución de la fertilidad, manifestada por el aumento en los porcentajes de vacas repetidoras, de abortos, de meuiosis, metritis y quistes ováricos. Estas observaciones ademki del diagnóstico de útero turgente (DxUT) a la palpación, aun con diagnóstico de gestación positivo enve los 40 y 60 días de preiiez, estros falsos y disminución de la viscosid.ad del moco cérvicevaginal ( M 0 en un elevado porcentaje de l a s vacas gestantes, hacen pensar en la pre- sencia de un factor estrogénico anómalo que afecta esras explotaciones pecuarias. La importancia del estudio se refleja sen el hecho de que el síndrome estrogénico ha llegado a alterar la fisiología de los machos. En el hato en estudio, dos de los sementales debieron ser sustituidos por presentar baja fertilidad, hipospermia, ginecomastia e incluso, en uno de ellos, verdadera galactorrea.

La base de la alimentación de los bovinos lecheros en esta región 1:s la alfalfa; estas plantas, así como los tréboles, contienen Btoesuógenos tales como l a s coumarinas e isoflavonas, sustancias que tienen la capacidad de unirse a los receptores de esuógenos, provocando en los animales que los ingieren en grandes cantidades, alteraciones reproductiw por hiperesuogenización." El fitoestrógeno que se encuentra presente en mayor cantidad en la alfalfa es el coumestrol, el cual es de 30 a 100 veces más potente que oucbs fitoestrógenos presentes como l a s isoflavonas.z Todas estas sustancias estrogénicas de origen vegetal se encuenuan en pequeñas cantidades de manem natural en e! forraje y tienen efectos antimicrobianos' y fungicidas." Sin embargo, la síntesis de ellasse incrementa notablemente bajo condiciones adversas para el crecimiento de las plan-

Ver. Méx.. 28 ( I ) I997 25

us, tales como temperanua y luminosidad inadecuadas,20 invasiones por hongos, particularmente Pseudopesisa medicag'nis, o coleÓpterosl2

En términos generales se ha visto que la ingesta de forrajes con cantidades elevadas de fitoestrógenos provo- ca irregularidad del ciclo estral y baja tasa de concepción en vacas,I4 además de ninfomanía, hiperemia vulvar, quis- tes ováricos, hiperplasia de mamayútero, prolapso vaginal, relajación de ligamentos pelvianos y esterilidad.'O En los toros provocan metaplasia glandular y epitelial, tanto prostática como bulbo ureual, y dificultad en la maduración y movilidad de los espermatozoides.'" En ovejas se ha descrito Fracaso parcial en la primera fecunda~ión,~ dis- minución del número de corderos,S reducción de la tasa de ovulación,'6 crecimiento uterino y disminución del desarrollo folicular en ovejas imp6beres.l' En este trabajo se describe un síndrome de estrogenización

en vacas lecheras por consumo de alfalfas en l a s que se aislaron grandes cantidades de coumestrol.

Material y métodos

Detenninacih de/ síndrome estrogénico

Se estudiaron las vacas en producción (n = 608), pene- necientes a un hato de 1040 bovinos Holstein Frissean, localizado en la zona de Chalco en el altiplano de Méxi- co, la base de la alimentación del hato es la alfalfa. El análisis se realizó entre agosto de 1993 y julio de 1994, e incluyó los parámetros reproductivos más afectados en la explotación, como el índice anual de gestación (LAG) y el porcentaje de abortos, incluyendo, como un signo adicio- nal para la caracterización del síndrome, el porcentaje de =cas que cursan con diagnóstico de gestación positivo por palpación rectal con DX UT y fluidez anormal del MCV. Se determinó la resistencia eléctrica del MCV en 30 vacas

gestanres con Dx UT, 30 vacas en estro y 30 vacas gestantes normales como testigo. La determinación se realizó utili- zando un Ohmómetro* y los resultados se compararon mediante un análisis de varianza y prueba de Tukey.B

Identificación de 17@stradiol en suero de vacas con sindrome estrogdnico

A diez vacas con diagnóstico de gestación positivo entre los 40 y 60 días de preñez y en las que se encontró el útero turgente a la palpación, se les tomó una muesua sanguí- nea para la determinación de l ' l ~ s t r a d i o l en suero. La determinación de estradiol se realizrj por radioinmuno- análisis con anticuerpos de alta especificidad, que permi-

* Esvogenix modelo Estron. ** Backer Allen de Mtxico. *** Menk-MCxico. S A ' Eaatmanbdak.

ten cuanltificar de 10 a 640 pg/ml de suero.8 Se utilizaron 0.5 m1 de suero, la extracción se realizó con éter eulico en una proporción l : l O , el éter se evaporó y el extracto se resuspendió en una solución amortiguadora de fosfatos pH 7.0, las pérdidas durante el procedimiento seguido se calcularon de sueros agregados de 3H-17kstradio1, el promedio de recuperación fue de 94.6%. La curva estindar se construyó con ocho concentraciones (0.5 a 64 pg/ tubo), los esdndares se prepararon mediante diluciones apropiadas de una solución de 17&estradiol recristalizado de 100 mg/ml y verificada por absorción ultravioleta a 280 nm, la variación intraensayo fue de 2.62 %.

Extracción y purificacibn del coumestrol

Se colectaron durante el invierno varias muestras de la alfalfa utilizada como fuente de forraje para el hato en estudio en diferentes parcelas. Todas las muestras se encontraron infestadas por Pseudopaisa mdicaginis. Las muestras de alfalfa se mezclaron, y una porción repre- sentativa se secó y molió finamente para su extracción.

Todos los solventes utilizados se obtuvieron grado analítico*:* y heron bidestilados en el laboratorio antes de su uso. La exuacaón del coumeml se r e W por el método de Le Bars d con algunas modificaciones. Un kilo de alfalfa seca y molida fue sometido a extracción %Met con 2600 m1 cle metanol. A este extracto se le agregaron 8.0 litros de ulna solución de carbonato de sodio 0.5 M pH 12.0. Esta mezcla se lavó seis veces en foxma sucesiva en embudos de separación con diclorometano (2 con 2.6 litros, 2 con 1.5 litros y 2 con 1.0 litros). Posteriormente, la fase acuosa se acidificti con ácido sulfiirico al 50% hasta un pH de 4.5 y el coumesltrol fue exuaído con éter eulico anhidro en tres lavados sucesivos de 2.6 1 cada uno; esta última Ease se con- centró por evaporación para obtener una masa final de 4.8 g de exmcto que se resuspendió en 96 m1 de metanol. Para la p-ifícación e identificación del coumestrol, se

tomó una fracción de la solución metanólica, se le agregó una parte igual de una solución Saturada de EDTA, se agitó y posteriormente se extrajo nuevamente con éter eulico. La fase orgánica se evaporó a sequedad y se resuspendió en 2 m1 de metanol; de éSta se tomaron fracciones de 2.5 ml, que se aplicaron en placas cromatogr;ificas*** de gel de silica en ca.pa fina de 5 x 20 cm. Todas las muestras se c e rrieron por duplicado y se comparó la relación de migración de la banda (RJ contra un patrón incluido de coumestroli.' En el sistema de commiento se utilizó como fase móvil una mezcla de clorofon%o: metanol (4 : 1 v/v) I'

Los compuestos fueron observados como bandas que fluorecen al ser estimulados con la luz ultravioleta de onda

Para comprobar la identificación del coumestrol se de- terminaron. los espectros de absorci6n de cada banda, de la siguiente manera: la placa cromatográfica fue revelada en luzultravioleta, se raspá cada banda y el gel de silica obteni- do se lavó con éter eulico que se evaporó, posteriormente la muestm fue diluida n u e m e n t e en 2 m1 de metanol. En

cona.

26

Abortos 36 10% Gestantes DX U T

""".""- _ _ _ " " " " ~ " " " 102 2 7 %

No gestantes 888 7 0 % Gestantes normales

238 63%

Figura 1. Distribución del indice de gestación anual. De 1264 inseminaciones, sólo el 30% de las vacas quedaron gestantes de las cuales 10% abortaron, 63% fueron gestantes normales y 27% gestantes con DX UT.

esta solución se determinó el espectro de absorción en un espectrómetro W visible.*

Resultados

De 1264 inseminaciones a lo largo del aIio de estudio en un hato de 608 vacas, sólo se lograron 376 gestaciones (IAG = 29.75%), de las cuales 36 (9.57%) resultaron en abortos, en 102 (27.13%) se encontró el útero turgente a la palpación al momento del diagnóstico de gestación (50 k 10 días) y 238 (63.3%) fueron gestaciones normales. Este resultado representa un índice de 3.36 servicios por concepción y sólo el 27% de éxito sobre el total de inseminaciones (Figura 1) . La resistencia eléctrica del moco cérvico mginal en l a s

vacas gestantes con DX UT (68.6 * 15.17 a) fue semejan-

140 I

Ohms

1 ** I I

Estro El DX UT Gestantes

Figura 2. Resistencia eltctrica del moco c h i c o vaginal. Se com- para la resistencia eltctrica del moco c&vico vaginal entre vacas en esm, gestantes con DX UT y gestantes normales. En todos los casos la n = 30, y ** indican diferencia a F < 0.01. El moco ckwico uterino de l a s vacas gestantes con DX UT presenta l a s caracteristi- cas del moco de vacas en estro.

Spectronic 3000 Array de Milton Roy.

:e a la que presentan l a s vacas en celo (63.16 rt: 10.0 R ) y diferente (P < 0.01) de la que presentan las vacas gestantes normales (114.03 i: 17.05 Q ) (Figura 2).

Las 10 \atas# gestantes con DxUT a las que se les deter- minó el estrad.io1, mostraron dos intervalos de concentra- ciones; un grupo de seis presentó valores normales de estradiol de 12.9 rt: 10.04 pg/ml, y un segundo grupo de cuatro, manifestó valores altos de 106.0 i: 27.68 pg/rnl (Figura 3).

La cromatografia del extracto de alfalfa mostró un patrón de conimiento con cuatro manchas, de las cuales la principal mostró el mismo &que el patrón de coumestrol (Figura 4). El espectro de absorción en luz ultravioleta de una solución en metano1 de este compuesto fue semejan- te al del patrón purifkado de coumestrol (Figura 5 ) . El cálculo espectrométrico de la concentración de coumestrol obtenido del extracto de alfalfa por su absorbencia a 243

200 ""----- Estradiol (pgjml) -

Estradiol normal Estradiol alto

Figura 3. Valores de esbadiol en vacas gestantes con DX UT. La distribucibn de loe valores de estradiol sanguine0 en las vacas estu- diadas, se dio en dos grupos, uno con niveles normales (n = 6 ) y om con niveles altos (n = 4). Estos valores se comparan con las concentraciones normales durante la gestación (----), y de vacas con ninfomania por qluistes foliculares (-). La cantidad de estradiol encontrado en l a s .primeras, no es suficiente para producir los signos de estrogenizaciónl descritos en estos animales.

Vet. M&., 28 ( I ) 1997 27

Figura 4. Cromatografia de punticación del extracto de alfalfa. En los carriles externos se muestra el patron de cohestrol y en los carrlles centrales el extracto de alfalfa. Nótese un compuesto que corre paralelo al patron. Gel de silica; cloroformo: metanol, 4 : 1 v/v.

nm, reveló que se obtuvieron 66.8 mg de coumestrol por kg de alfalfa seca, sin considerar l a s pérdidas durante el proceso de extracción y purificación.

Discusión

Se describe un síndrome estrogénico en vacas lecheras, que se asocia con la ingestión de alfalfa en la que se aisló coumestrol. En los animales se manifiesta como estros falsos, quistes ováricos y DX UT y moco cérvico v a p a l fluido durante la gestación; mientras que en el hato, se aprecia un aumento en el porcentaje de abortos, un incremento de los días abiertos, de los servicios por con- cepción y disminución del IAG. La media ponderada de servicios por concepción de l a s 47 ganaderías en el país de vacas Holstein con una producción mayor de 7500 kg de leche,' que incluye a 18,471 animales, es de 2.53 con un intenalo de 1.69 a 3.17, mientras que el índice obtenido en este estudio es de 3.36 servicios por concepción. Esta disminución en la eficiencia de los servicios por concep ción en el ambiente de este estudio, zona de Chalco, en donde se encuenuan aproximadamente 20,000 vacas, implica una cuantiosa pérdida económica y requiere de una atención inmediata para la solución del problema. Las manifestaciones clínicas encontradas en el hato estudiado, han sido descritas en forma aislada por otros a u t ~ r e s ' ~ J ~ y atribuidas al consumo de fitoestrógenos. Sin embargo, aquí fueron encontradas en conjunto y se describen como características de un claro síndrome estrogénico provoca- do por el consumo de alfalfas con grandes cantidades de coumestrol, que repercute entre otros factores en un bajo IAG y un éxito de sólo el 27% sobre el total de inseminaciones, lo que incide negativamente en la eficien- cia reproductiva y productiva del hato.

Los primeros estudios sobre consumo de plantas con fitoestrógenos y sus efectos sobre la reproducción se realizaron en ovinos de Australia. Los rebafios que consu- mían praderas naturales con trébol subterráneo presen- taron alteraciones tales como disminución de la concep- ción e hiperplasia glandular cística del uacto reproductor, desarrollo de mama en ovejas no prefiadas y de pezones en machos, a este tipo de síndrome de esterilidad se le ha denominado enfermedad del trébol.'

Puesto que se han descrito en l a s vacas varias de l a s alteraciones reproductivasmencionadas anteri~rmente,'~J~ que son indistintamente inducidas por estradiol o

I

Figura S. Espectro de absorción en luz ultravioleta de coumestrol. Se presentan los espectros de absorcion con metanol en luz ultravioleta del patr6n de coumestrol (línea gruesa), y del punticado a partir del extracto de alfalfa (línea delgada). Los picos de absorbancia maxima característicos del coumestrol disuelto en metanol son a 243 y 343 nm. La sustancia aislada muestra el mlsmo espectro que el patr6n de coumestrol.

fitoestrólgenos y clínicamente indistinguibles, para carac- terizar el síndrome propuesto, se decidió obtener parámevos cuantitativos de la estrogenización y descartar la presencia de estradiol endógeno como inductor de los efectos observados.

La resistencia eléctrica del MCV es inversamente pro- porcional a su contenido de sales, particularmente de NaCI. La secreción de NaCl en el moco cervical es inducida por los estrógenos, de modo que una característica del estro en l a s vacas es la presencia de altas concentraciones de NaC:l, poca viscosidad y baja resistencia del moco cervical al paso de la corriente eléctrica. Durante la fase lútea o durante la gestación, la resistencia eléctrica del MCV se incrementa, coincidiendo con una mayor viscosidad y un menor contenido de sales. El hecho de que l a s vacas gestantes presenten útero turgente y una baja resistencia eléctrica del moco cervical, es signo típico de actividad estrogénica. Sin embargo, l a s concenuaciones de estradiol en el suero de seis de l a s diez vacas estudiadas con estos signos, se encuentran alrededor de los valores descritos para vacas gestantes,8 y las cuatro restantes, aunque pre- sentaron una concentración alta, su valor no alcanza el descrito en vacas con ninfomanía por quistes foliculares.'9 Lo anterior permite proponer la presencia de otro factor con actividad estrogénica responsable del conjunto de signos olbservados, que puede ser el coumestrol aislado de la alfalfa que consumen estos animales.

Se ha seiialado que la actividad biológica del coumestrol, Mioradal por su capacidad para aumentar el peso uterino, es 160 veces menor que la del 17fkstradi01,~~ y su afinidad de unión relativa al receptor uterino de estrógenos es alrededor de 70 veces menor que la del estradiol;18 por lo tanto, la! concentración plasmática que debe alcanzar el compuesto para tener efectos estrogénicos importantes de&

28

ser notablemente alta. La cantidad de coumestrol aislado en este estudio a partir de muestras de alfalfa seleccionana fue de 66.8 mg/kg de alfalfa seca. Este valor se encuentra dentro del intervalo sexiaiado por Le Bars et d." para alfalfas con infestación por hongos (50 a 200 mg/kg) y contrasta notablemente con los valores de 1 .5 a 2.5 mg/kg encontrados en alfalfas sanas por los mismos autores.

Tanto Le Bars et al.12 como Valdernbano2' han indicado que concentraciones de 20 a 50 mg de coumestrol por kg de alfalfa son suficientes para inducir la presencia de manifestaciones estrogénicas en los animales; la concen- tración encontrada en el presente estudio, podria ser entonces considerada suficiente parajustificar el síndrome descrito. Según los cálculos realizados, el consumo de esta alfalfa contaminada equivale a la ingestión de aproxi- madamente 500 mg diarios de coumestrol por vaca; por estudios realizados en cabras2' es posible calcular que la ingestión de esta cantidad de coumestrol puede producir concentraciones plasmáticas de 13 ng/ml de este com- puesto, que resulta ser 1000 veces mayor a la concentra- ción de 1 7 ~ s t r a d i o l encontrada durante el estro. Aún considerando una actividad biológica 160 veces menor en el coumestrol que en el 17hstradio1, la cantidad equiva- le a seis veces la concentración de estrógenos que ocurre durante el estro, y por lo tanto, suficiente para inducir cambios estrogénicos semejantes a los encontrados en la vaca normal durante esta fase del ciclo estral.

De esta forma, son explicables los efectos estrogénicos que manifiestan las vacas aún gestantes, cuando consu- men diariamente coumestrol de alfalfas contaminadas en cantidades biológicamente equivalentes a las del 17p estradiol endógeno durante el estro. Una situación adi- cional que no ha sido considerada, es el probable paso del coumestrol a la leche y su consumo por esta vía en el humano; los efectos por consumo de vegetales que lo contienen como la soya son fuentes de estudio y preocu- pación." Actualmente se está determinando la concen- tración de coumestrol en plasma y en leche de vacas que presentan el síndrome estrogénico descrito.

Abstract

An oestrogenic syndrome caused in dairy cows after ingesting important concentrations of coumestrol is des- cribed. The syndrome is characterized by increased levels of repeat-breeding cows, abortions, metritis and ovarian c y s t s , as well as other estrogenic manifestations like: In- creased cervical mucus (CM) fluidity and turgent uterus (TU) at the palpation with positive diagnosis of gestation between 40 and 60 days of pregnancy. This study was performed for one year in 608 cows in risk, in which 1264 inseminations achieved only 376 gestations. Of th i s , 102 cursed with TU and CM fluid; 36 ended in abortion and only 238 had normal pregnancies. Electrical resistance measurements in CM of pregnant cows (68.8 f 15.17 vs. 114.03 t 17.05 ZT, n = 30) and are similar to those ob- served in non-pregnant estrous animals (63.16 * 10.56 f2,

n = 30). Radioimmunoanalysis determination of estradiol in 10 pregnant cows with TU and fluid CM proportioned normal values, of plasma estradiol (12.9 r 10.04 pg/ml) in 6/10 animals!, levels which did not explain the presence of the estrogenic syndrome. Measurement of coumestrol concentration in the alfalfa ingested by the animals de- monstrated the presence of important quantities of this compound (66.8 mg/kg dry alfalfa, without considering the losses during the extraction and purification proce- dures), which will undoubtedly explain the occurrence of the described syndrome. Economic and biological impor- tance of the presence of this estrogenic pathology in Mexico is discussed.

Agradecimientos

Los autores agradecen l a s facilidades y sugerencias otor- gadas por el M. en C. Jorge Haro C. para la extracción y purificación d.el coumestrol, así como la espontánea y valiosa colaboración durante la extracción del coumestrol del técnico laboratorista Miguel Herrera Campos.

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