TEST ECOTOSSICOLOGICI - unina.it 2013_2014... · La tipologia di test e i protocolli da seguire...

TEST ECOTOSSICOLOGICITEST ECOTOSSICOLOGICITEST ECOTOSSICOLOGICITEST ECOTOSSICOLOGICI

Università degli Studi di Napoli FedericoII Master II livello REACH1Dott.ssa Teresa Verde

Proprietà CHIMICO-FISICHE delle sostanzeAllegato VII del Regolamento REACH

PROPRITA’ ECOTOSSICOLOGICHE delle sostanzeAllegati VII, VIII, IX, X del Regolamento REACH

PROPRIETA’ TOSSICOLOGICHE delle sostanzeAllegati VII, VIII, IX, X del Regolamento REACH

4. Saggi Ecotossicologici

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Proprietà CHIMICO-FISICHE delle sostanzeAllegato VII del Regolamento REACH

PROPRITA’ ECOTOSSICOLOGICHE delle sostanzeAllegati VII, VIII, IX, X del Regolamento REACH

PROPRIETA’ TOSSICOLOGICHE delle sostanzeAllegati VII, VIII, IX, X del Regolamento REACH

Metodi basati su linee guida OCSE/OECD

Allegato VII del Regolamento REACHPrescrizioni in materia di informazioni standard per sostanze fabbricate o importate in quantitativi ≥ 1 ton/y.

Allegati VIII, IX e X del Regolamento REACHPrescrizioni in materia di informazioni standard per sostanze fabbricate o importate in quantitativi ≥ 10 ton/y,100 ton/y e 1000 ton/y, rispettivamente

Università degli Studi di Napoli FedericoII Master II livello REACH

Test richiesti dal REACH

- 17 Test Chimico-Fisici

- 18 Test Tossicologici

- 26 Test Ecotossicologici

Sostanze


3

>1 t/a >10 t/a >100 t/a >1000 t/a

Chimico- Fisici 14 17

Tossicologici 5 14 16 18

Ecotossicologici 3 7 21 26

Sostanze


Il Reach divide le informazioni ecotossicologiche in quattro categorie:- tossicità acquatica- degradazione- destino e comportamento ambientale- tossicità su specie

La tipologia di test e i protocolli da seguire sono a loro volta oggetto delReg CE/440/2008 e successivi adeguamenti al progresso tecnologico in accordo

ai principi delle buone pratiche di laboratorio (BPL), un sistema dicertificazione internazionale


Il Reach divide le informazioni ecotossicologiche in quattro categorie:- tossicità acquatica- degradazione- destino e comportamento ambientale- tossicità su specie

La tipologia di test e i protocolli da seguire sono a loro volta oggetto delReg CE/440/2008 e successivi adeguamenti al progresso tecnologico in accordo

ai principi delle buone pratiche di laboratorio (BPL), un sistema dicertificazione internazionale

4Università degli Studi di Napoli FedericoII Master II livello REACH

Tossicità acquatica

Sperimentazione della tossicità a breve termine su invertebrati (specie preferitaDaphnia)

Studio dell’inibizione della crescita su piante acquatiche (specie preferita Algae) Sperimentazione della tossicità a breve termine su pesci Sperimentazione dell’inibizione respiratoria su fanghi attivi Sperimentazione della tossicità a lungo termine su invertebrati (specie preferita

Daphnia) Sperimentazione della tossicità a lungo termine su pesci Prova di tossicità su pesci nelle prime fasi di vita (fels) Prova di tossicità a breve termine su pesci nelle fasi di embrione e di avannotto Prova di crescita di pesci in fase giovanile


Tossicità acquatica

Sperimentazione della tossicità a breve termine su invertebrati (specie preferitaDaphnia)

Studio dell’inibizione della crescita su piante acquatiche (specie preferita Algae) Sperimentazione della tossicità a breve termine su pesci Sperimentazione dell’inibizione respiratoria su fanghi attivi Sperimentazione della tossicità a lungo termine su invertebrati (specie preferita

Daphnia) Sperimentazione della tossicità a lungo termine su pesci Prova di tossicità su pesci nelle prime fasi di vita (fels) Prova di tossicità a breve termine su pesci nelle fasi di embrione e di avannotto Prova di crescita di pesci in fase giovanile


Degradazione

Biotica Biodegradabilità totale Sperimentazione di simulazione sulla degradazione finale nelle acque di

superficie Sperimentazione di simulazione al suolo Sperimentazione di simulazione su sedimenti Abiotica Idrolisi come funzione del pH identificazione dei prodotti di degradazione


Degradazione

Biotica Biodegradabilità totale Sperimentazione di simulazione sulla degradazione finale nelle acque di

superficie Sperimentazione di simulazione al suolo Sperimentazione di simulazione su sedimenti Abiotica Idrolisi come funzione del pH identificazione dei prodotti di degradazione


Destino e comportamento nell’ambiente

Studio di screening dell’adsorbimento/desorbimento Bioaccumulo nelle specie acquatiche, preferibilmente pesci Informazioni supplementari sull’adsorbimento/desorbimento Informazioni supplementari sul destino e il comportamento nell’ambiente

Effetti sugli organismi terrestri

Tossicità a breve termine per gli invertebrati Effetti sui microorganismi del suolo Tossicità a breve termine per le piante Sperimentazione della tossicità a lungo termine su invertebrati Sperimentazione della tossicità a lungo termine su piante Tossicità a lungo termine per organismi che vivono in sedimenti


Destino e comportamento nell’ambiente

Studio di screening dell’adsorbimento/desorbimento Bioaccumulo nelle specie acquatiche, preferibilmente pesci Informazioni supplementari sull’adsorbimento/desorbimento Informazioni supplementari sul destino e il comportamento nell’ambiente

Effetti sugli organismi terrestri

Tossicità a breve termine per gli invertebrati Effetti sui microorganismi del suolo Tossicità a breve termine per le piante Sperimentazione della tossicità a lungo termine su invertebrati Sperimentazione della tossicità a lungo termine su piante Tossicità a lungo termine per organismi che vivono in sedimenti


Test eco-tossicologici




Quali sono le proprietà pericolose prese in considerazione?

Pericoli per la salute

•Tossicità acuta•Corrosione/irritazione cutanea•Danni rilevanti/irritazione oculare•Sensibilizzazione respiratoria e cutanea•Tossicità sistemica su organi bersaglio a seguito diesposizione singola•Tossicità sistemica su organi bersaglio a seguito diesposizione ripetuta•Mutagenicità•Cancerogenicità•Tossicità riproduttiva•Tossicità a seguito di aspirazione

Effetti sull’ambiente•Pericolosità per l’ambienteacquatico;•Pericolo per l’ozono


•Tossicità acuta•Corrosione/irritazione cutanea•Danni rilevanti/irritazione oculare•Sensibilizzazione respiratoria e cutanea•Tossicità sistemica su organi bersaglio a seguito diesposizione singola•Tossicità sistemica su organi bersaglio a seguito diesposizione ripetuta•Mutagenicità•Cancerogenicità•Tossicità riproduttiva•Tossicità a seguito di aspirazione

Prove che utilizzano un sistema biologico come bersaglio: unorganismo vivente è posto a contatto per un determinato periodo conuna sostanza in esame per osservarne la risposta

SaggiSaggi EcotossicologiciEcotossicologici ::



Tossicità acquatica, DegradazioneBiotica/Abiotica, Destino Ambientale, Effetti su Organismi

Terrestri

RELAZIONE TRA REALISMO ECOLOGICO E SEMPLICITÀ

Massima semplicitàMassima semplicità

Saggi monospecificistatici

flusso continuo

Saggi su comunitàgnotobiotiche

naturaliSaggio idealeSaggio ideale

sem

plic

ità


11

Massimo realismo ecologicoMassimo realismo ecologico

naturaliSaggi su ecosistemi

controllatiMicrocosmi di laboratorio

enclosures

Studi di campagna

Saggio idealeSaggio ideale

realismo


- Ecosistemi modelloEsempiColonizzazione di substrati artificialiComunità di protozoi in piccoli acquariComunità algali (es. peryphiton)Misure e osservazioniStruttura della comunità (composizione specifica, rapporti tra popolazioni, ecc.)Funzionamento del sistema (produzione, biomassa, ecc)

- Microcosmi, Ecosistemi di laboratorio : porzioni più o meno grandidell’ecosistema oggetto di studio, delimitate sperimentalmente e parzialmente racchiuse,in cui è più facile effettuare determinazioni fisiche, chimiche e biologiche che dianoindicazioni dello stato del sistema.Misure e osservazioni· Struttura e composizione specifica della comunità· Relazioni tra specie e livelli trofici· Funzionamento del sistemaUsati anche per studi di destino ambientale


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- Ecosistemi modelloEsempiColonizzazione di substrati artificialiComunità di protozoi in piccoli acquariComunità algali (es. peryphiton)Misure e osservazioniStruttura della comunità (composizione specifica, rapporti tra popolazioni, ecc.)Funzionamento del sistema (produzione, biomassa, ecc)

- Microcosmi, Ecosistemi di laboratorio : porzioni più o meno grandidell’ecosistema oggetto di studio, delimitate sperimentalmente e parzialmente racchiuse,in cui è più facile effettuare determinazioni fisiche, chimiche e biologiche che dianoindicazioni dello stato del sistema.Misure e osservazioni· Struttura e composizione specifica della comunità· Relazioni tra specie e livelli trofici· Funzionamento del sistemaUsati anche per studi di destino ambientale


-Mesocosmi, Enclosures : modelli in scala ridotta di ecosisteminaturali, mantenuti in laboratorio in contenitori artificiali; si differenziano daimesocosmi poiché non sono sistemi sperimentali mantenuti in natura.

Esempi• Sacche pelagiche per studio del plancton in laghi e mare• Colonne che includono ambiente pelagico e bentonico

Necessità di creare un flusso artificiale• Laghi e ponds sperimentali

Alti costiProblemi di “etica” ecologica


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-Mesocosmi, Enclosures : modelli in scala ridotta di ecosisteminaturali, mantenuti in laboratorio in contenitori artificiali; si differenziano daimesocosmi poiché non sono sistemi sperimentali mantenuti in natura.

Esempi• Sacche pelagiche per studio del plancton in laghi e mare• Colonne che includono ambiente pelagico e bentonico

Necessità di creare un flusso artificiale• Laghi e ponds sperimentali

Alti costiProblemi di “etica” ecologica

Ponds artificiali a Wageningen


Il sistema deve però contenere componenti abioticheproprie, almeno due livelli trofici e confini stabiliti secondo

il fine della ricerca.

L’uso di tali sistemi è ampiamente dibattuto: da una parte, infatti, unsistema costituito da poche specie può essere consideratoscarsamente rappresentativo dell’ambiente naturale; dall’altra,sebbene i sistemi più grandi siano più realistici, la sperimentazioneoltre che più costosa è meno riproducibile. Inoltre, sebbene moltodifficili nella messa a punto, questi metodi sono affidabili epromettenti per le previsioni ecotossicologiche.


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Il sistema deve però contenere componenti abioticheproprie, almeno due livelli trofici e confini stabiliti secondo

il fine della ricerca.

L’uso di tali sistemi è ampiamente dibattuto: da una parte, infatti, unsistema costituito da poche specie può essere consideratoscarsamente rappresentativo dell’ambiente naturale; dall’altra,sebbene i sistemi più grandi siano più realistici, la sperimentazioneoltre che più costosa è meno riproducibile. Inoltre, sebbene moltodifficili nella messa a punto, questi metodi sono affidabili epromettenti per le previsioni ecotossicologiche.


Problema posto dal lavorare su campo è la difficoltà di impostare i problemicon la procedura classica dell’esperimento e controllo

La necessità di basi sperimentali per la valutazione dei possibili effettidei contaminanti nell’ambiente ha imposto lo sviluppo di modelli dilaboratorio che approssimino il più possibile le condizioni naturali


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La necessità di basi sperimentali per la valutazione dei possibili effettidei contaminanti nell’ambiente ha imposto lo sviluppo di modelli dilaboratorio che approssimino il più possibile le condizioni naturali


Sem

plic

ità o

pera

tiva

e di

inte

rpre

tazi

one

Saggimonospecifici

Saggimonospecifici

Saggisu comunità

Saggisu comunità

Saggisu ecosistemi

controllati

Saggi a diverso livello di organizzazioneSaggi a diverso livello di organizzazione


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Sem

plic

ità o

pera

tiva

e di

inte

rpre

tazi

one

Realismo ecologico

Saggisu comunità

Saggisu ecosistemi

controllati

Saggisu ecosistemi

controllati

Studidi

campagna

Studidi

campagna


Per l’esecuzione dei test in laboratorio, si deve operare in condizioni controllatedall’operatore, utilizzando una singola specie o più specie diverse.

Lo studio può essere:

• Classificazione delle sostanze in funzione del loro effetto;• Adempimento delle norme legislative nazionali o

internazionali come:

Direttive Europee per la classificazione delle sostanze pericolose,per laregistrazione dei prodotti fitosanitari o per le normative per

l’accettabilità delle acque di scarico.

In tali saggi deve essere garantita la ripetitività dei risultati e i metodidevono essere uniformi e standardizzati.


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Per l’esecuzione dei test in laboratorio, si deve operare in condizioni controllatedall’operatore, utilizzando una singola specie o più specie diverse.

Lo studio può essere:

• Classificazione delle sostanze in funzione del loro effetto;• Adempimento delle norme legislative nazionali o

internazionali come:

Direttive Europee per la classificazione delle sostanze pericolose,per laregistrazione dei prodotti fitosanitari o per le normative per

l’accettabilità delle acque di scarico.

In tali saggi deve essere garantita la ripetitività dei risultati e i metodidevono essere uniformi e standardizzati.


Già diffusi e standardizzati sono i saggi monospecifici , che fanno uso diindividui della stessa specie, provenienti da ceppi sia naturali, sia dilaboratorio.

I saggi monospecifici costituiscono un approccio riduzionistico al problemae soddisfano solo parzialmente gli obiettivi primari dell’indagineecotossicologica, cioè la risposta a livello di popolazione e comunità, e ildestino dei contaminanti nell’ambiente.


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Già diffusi e standardizzati sono i saggi monospecifici , che fanno uso diindividui della stessa specie, provenienti da ceppi sia naturali, sia dilaboratorio.

I saggi monospecifici costituiscono un approccio riduzionistico al problemae soddisfano solo parzialmente gli obiettivi primari dell’indagineecotossicologica, cioè la risposta a livello di popolazione e comunità, e ildestino dei contaminanti nell’ambiente.


- danno precise indicazioni sulle relazioni tra dose ed effetto

- forniscono una misura diretta e quanificabile del rischio

- danno precise indicazioni sulle potenzialità tossiche, mutagene,cancerogene ecc.

-forniscono informazioni degli effetti sinergici e antagonistiche sipossono manifestare fra sostanze diverse

-metodi veloci e poco dispendiosi

Vantaggi :Vantaggi :


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- danno precise indicazioni sulle relazioni tra dose ed effetto

- forniscono una misura diretta e quanificabile del rischio

- danno precise indicazioni sulle potenzialità tossiche, mutagene,cancerogene ecc.

-forniscono informazioni degli effetti sinergici e antagonistiche sipossono manifestare fra sostanze diverse

-metodi veloci e poco dispendiosi


Limiti :Limiti :- la difficoltà di mettere in relazione i risultati ottenuti con esposizioni inlaboratorio con esposizioni in sito

- scarsa capacità predittiva di effetti reali per la popolazione e comunità

e danno informazione anche su….

- alterazioni a livello individuale di tipo comportamentale, a carico difunzioni quali attività locomotoria, fototassi, geotassi ecc.,- alterazioni a livello interindividuale, della migrazione,dell’aggregazione o della suscettibilità ai predatori ecc.


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e danno informazione anche su….

- alterazioni a livello individuale di tipo comportamentale, a carico difunzioni quali attività locomotoria, fototassi, geotassi ecc.,- alterazioni a livello interindividuale, della migrazione,dell’aggregazione o della suscettibilità ai predatori ecc.

e funzionano anche …

- per la valutazione della tossicità di campioni provenienti dalla natura, dicomposizione in sostanza tossica non nota



I saggi monospecifici operano a 3 livelli:

X 1° livello: TOSSICITA ACUTA- dosi alte- tempi di esposizione brevi (24-96 h)- numero di organismi saggiati ridotto

X 2° livello: TOSSICITA SUBCRONICA- dosi ridotte dosi ridotte- tempi di esposizione superiori (giorni)- numero di organismi saggiati elevato

Università degli Studi di Napoli FedericoII Master II livello REACH21

X 2° livello: TOSSICITA SUBCRONICA- dosi ridotte dosi ridotte- tempi di esposizione superiori (giorni)- numero di organismi saggiati elevato

X 3° livello:TOSSICITA’ CRONICA- dosi molto ridotte dosi molto ridotte- tempi di esposizione molto lunghi tempi- numero di organismi saggiati elevato

Critica è la scelta della specie che può essere effettuata sulla base didifferenti criteri:

• Ricerca di base• Scopi applicativi es. normativa• Sensibilità ai tossici• Disponibilità di laboratorio• Standardizzazione delle metodologie.

Questi test permettono di determinare una relazione di causa-effetto, ma irisultati ottenuti sono validi solo se le condizioni sperimentali utilizzatesono idonee.


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Critica è la scelta della specie che può essere effettuata sulla base didifferenti criteri:

• Ricerca di base• Scopi applicativi es. normativa• Sensibilità ai tossici• Disponibilità di laboratorio• Standardizzazione delle metodologie.

Questi test permettono di determinare una relazione di causa-effetto, ma irisultati ottenuti sono validi solo se le condizioni sperimentali utilizzatesono idonee.


Organismi usati nei saggiOrganismi usati nei saggi monospecificimonospecifici

• Sensibili• Breve ciclo vitale• Rappresentativi dell’ecosistema in ecosistema in

considerazione

Artemia salina, Danio rerio , Daphnia sp.,Onchorhynchus mykiss, Pimephales promelas


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• Sensibili• Breve ciclo vitale• Rappresentativi dell’ecosistema in ecosistema in

considerazione

Artemia salina, Danio rerio , Daphnia sp.,Onchorhynchus mykiss, Pimephales promelas


Saggi monospecifici sono impostati sulla base delle variabili:

Dose

Tempo di esposizione

Entità della popolazione influenzata


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Dose

Tempo di esposizione

Entità della popolazione influenzata


Saggi su sostanze potenzialmente pericoloseValutazione del livello (dose, concentrazione) che non produceeffetti dannosi

Stima della PNEC (Predicted No Effect Concentration)

Saggi su effluentiVerifica della possibilità che gli effluenti producano effettitossici

Saggi in ambiente naturale (acqua, suolo)Verifica dell’esistenza di fenomeni di tossicità


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Saggi su sostanze potenzialmente pericoloseValutazione del livello (dose, concentrazione) che non produceeffetti dannosi

Stima della PNEC (Predicted No Effect Concentration)

Saggi su effluentiVerifica della possibilità che gli effluenti producano effettitossici

Saggi in ambiente naturale (acqua, suolo)Verifica dell’esistenza di fenomeni di tossicità


SAGGI DI TOSSICITÀ ACQUATICA

E’ lo studio degli effetti di agenti tossici su organismi acquaticia livello di :

CellulaIndividuoPopolazioneComunità

Per gli ecosistemi acquatici, i primi ad essere stati danneggiati seriamente,sono stati sviluppati e applicati sofisticati metodi ecotossicologici oramai

standarizzati.


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E’ lo studio degli effetti di agenti tossici su organismi acquaticia livello di :

CellulaIndividuoPopolazioneComunità

Per gli ecosistemi acquatici, i primi ad essere stati danneggiati seriamente,sono stati sviluppati e applicati sofisticati metodi ecotossicologici oramai

standarizzati.



L’organismo in esame assume il contaminante , che si trova nel mezzo, perrespirazione o attraverso la membrana cellulare dell’epidermide.

Una volta assorbita, il suo destino è legato ai processi di distribuzione ,metabolizzato ed escrezione.

E’ quindi difficile stimare la concentrazione interna della molecolasaggiata

E’ convenzione quantificare la tossicità in termini di concentrazione dellasostanza nel mezzo


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L’organismo in esame assume il contaminante , che si trova nel mezzo, perrespirazione o attraverso la membrana cellulare dell’epidermide.

Una volta assorbita, il suo destino è legato ai processi di distribuzione ,metabolizzato ed escrezione.

E’ quindi difficile stimare la concentrazione interna della molecolasaggiata

E’ convenzione quantificare la tossicità in termini di concentrazione dellasostanza nel mezzo



La condizione fondamentale è che……il contaminante in esame si mantenga nelmezzo. A tal fine esistono due tecniche diesposizione:


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…il contaminante in esame si mantenga nelmezzo. A tal fine esistono due tecniche diesposizione:

1) STATICO1) STATICO2) A FLUSSO CONTINUO2) A FLUSSO CONTINUO



Di norma si opera effettuando saggi su organismi rappresentativi dei principalianelli della catene trofiche

Saggi acuti su alghe,alghe, DaphniaDaphnia ee pescipesci rappresentano il requisito minimo per levalutazioni ecotossicologiche previste per le varie normative.


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Di norma si opera effettuando saggi su organismi rappresentativi dei principalianelli della catene trofiche

Saggi acuti su alghe,alghe, DaphniaDaphnia ee pescipesci rappresentano il requisito minimo per levalutazioni ecotossicologiche previste per le varie normative.



-- STATICASTATICA::

Il mezzo contenente la sostanza viene preparato all’iniziodell’esperimento e non più modificato fino al terminedell’esperimento stesso.

-- FLUSSOFLUSSO CONTINUOCONTINUO::

Il mezzo viene rinnovato di continuo. Questo metodo è dapreferire per saggiare gli effetti cronici di sostanze pocopersistenti es. acque di scarico


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-- STATICASTATICA::

Il mezzo contenente la sostanza viene preparato all’iniziodell’esperimento e non più modificato fino al terminedell’esperimento stesso.

-- FLUSSOFLUSSO CONTINUOCONTINUO::

Il mezzo viene rinnovato di continuo. Questo metodo è dapreferire per saggiare gli effetti cronici di sostanze pocopersistenti es. acque di scarico


Saggi a breve e lungo termine

Saggi a breve termine sono quelli che coprono un arco temporale ridotto rispetto alciclo di vita dell’organismo saggiato

Esempi96 ore per pesci48 ore per crostacei planctonici15-30 minuti per microrganismi

Saggi a lungo termine sono quelli che coprono una parte significativa del ciclo vitaleo l’intero ciclo vitale o più cicli vitali dell’organismo saggiato

Esempi96 ore per alghe21-28 giorni per crostacei planctoniciFeed trials fino a 2 anni per vertebrati

In funzione degli obiettivi e del tipo di informazione che si vuole ottenere è possibileeffettuare saggi a qualunque livello intermedio


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Saggi a breve e lungo termine

Saggi a breve termine sono quelli che coprono un arco temporale ridotto rispetto alciclo di vita dell’organismo saggiato

Esempi96 ore per pesci48 ore per crostacei planctonici15-30 minuti per microrganismi

Saggi a lungo termine sono quelli che coprono una parte significativa del ciclo vitaleo l’intero ciclo vitale o più cicli vitali dell’organismo saggiato

Esempi96 ore per alghe21-28 giorni per crostacei planctoniciFeed trials fino a 2 anni per vertebrati

In funzione degli obiettivi e del tipo di informazione che si vuole ottenere è possibileeffettuare saggi a qualunque livello intermedio


Esempi di diversi end points:

Mortalità Immobilizzazione Effetti sulla riproduzione Effetti sulla crescita degli individui Effetti sulla crescita di una popolazione Alterazione di parametri metabolici o fisiologici Alterazione di caratteristiche comportamentali


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Esempi di diversi end points:

Mortalità Immobilizzazione Effetti sulla riproduzione Effetti sulla crescita degli individui Effetti sulla crescita di una popolazione Alterazione di parametri metabolici o fisiologici Alterazione di caratteristiche comportamentali

Per “end point” si intende il tipo di effetto che viene misurato in unsaggio tossicologico.


Test di tossicità acuta su animali acquaticiTest di tossicità acuta su animali acquatici

Concettualmente, sono molto semplici.

Un numero adeguato di individui di vertebrati (es: una specie selezionata dipesci) o di invertebrati (es: Daphnia) è esposto a differenti concentrazioni dellasostanza da saggiare in un adeguato volume di acqua e in condizionicontrollate.

- La mortalità (o un end-point comparabile) viene registrata a tempi fissi.

- L’effetto (mortalità) a ciascuna concentrazione aumenta all’aumentare deltempo.


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Test di tossicità acuta su animali acquaticiTest di tossicità acuta su animali acquatici

Concettualmente, sono molto semplici.

Un numero adeguato di individui di vertebrati (es: una specie selezionata dipesci) o di invertebrati (es: Daphnia) è esposto a differenti concentrazioni dellasostanza da saggiare in un adeguato volume di acqua e in condizionicontrollate.

- La mortalità (o un end-point comparabile) viene registrata a tempi fissi.

- L’effetto (mortalità) a ciascuna concentrazione aumenta all’aumentare deltempo.

In realtà, i saggi sono solo apparentemente semplici. Per la loro validità leprocedure devono essere seguite attentamente e molti dettagli devono

essere controllati con cura, descrivendo le procedure dei Metodi UfficialiEuropei.


Esistono una serie di saggi standardizzati secondoprocedure ufficiali accettate a livello Europeo:

•Tossicità acuta su pesci•Tossicità acuta su Daphnia•Inibizione della crescita algale•Saggio a breve termine su embrioni di pesci•Saggio di crescita su stadi giovanili di pesci•Saggio di riproduzione su Daphnia•Saggio di bioaccumulo in flusso continuo su pesci


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Esistono una serie di saggi standardizzati secondoprocedure ufficiali accettate a livello Europeo:

•Tossicità acuta su pesci•Tossicità acuta su Daphnia•Inibizione della crescita algale•Saggio a breve termine su embrioni di pesci•Saggio di crescita su stadi giovanili di pesci•Saggio di riproduzione su Daphnia•Saggio di bioaccumulo in flusso continuo su pesci


SAGGI SU CONSUMATORI PRIMARI (ACQUE DOLCI):DAPHNIA MAGNA ISO 6341/1999 -OECD 202/211

Classe: Crustacea

Sottoclasse: Brachiopoda

Ordine : Cladocero

Sottordine: Calyptomera

Famiglia: Daphnidae


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- E’ l’ organismo ufficiale dell’ ecotossicologia acquatica- Si alleva in laboratorio o in alternativa è disponibile in commercio

sottoforma di efippi

Classe: Crustacea

Sottoclasse: Brachiopoda

Ordine : Cladocero

Sottordine: Calyptomera

Famiglia: Daphnidae


•Crostaceo d’acqua dolce

•Dimensioni: 5mm

•Forma ovalare

•Struttura bivalve saldata dorsalmente (carapace), che racchiude, ad eccezione del capo, l’interoorganismo, compresa la camera incubatrice, proteggendo le uova e la crescita iniziale deineonati.

•Un paio di occhi composti, fortemente pigmentato

•Due paia di antenne di cui la seconda ha funzione natatoria

• Un apparato boccale filtratore, di tipo rudimentale.

• Sono tutti FILTRATORI e si nutrono di alghe, batteri, protozoi.

•Tra maschi e femmine esistono differenze di forma (dimorfismo sessuale): le femmine hannodimensioni maggiori, 4-5mm di lunghezza corporea, mentre i maschi non superano i 2-3mm.

DaphniaDaphnia magnamagna


Università degli Studi di Napoli FedericoII Master II livello REACH36

•Crostaceo d’acqua dolce

•Dimensioni: 5mm

•Forma ovalare

•Struttura bivalve saldata dorsalmente (carapace), che racchiude, ad eccezione del capo, l’interoorganismo, compresa la camera incubatrice, proteggendo le uova e la crescita iniziale deineonati.

•Un paio di occhi composti, fortemente pigmentato

•Due paia di antenne di cui la seconda ha funzione natatoria

• Un apparato boccale filtratore, di tipo rudimentale.

• Sono tutti FILTRATORI e si nutrono di alghe, batteri, protozoi.

•Tra maschi e femmine esistono differenze di forma (dimorfismo sessuale): le femmine hannodimensioni maggiori, 4-5mm di lunghezza corporea, mentre i maschi non superano i 2-3mm.

RiproduzioneRiproduzione DaphniaDaphnia magnamagna

Nel ciclo vitale della Daphnia (60-100 gg a 20°C) ci sono duemodalità riproduttive:

1. Riproduzione partenogenetica

2. Riproduzione sessuata


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Nel ciclo vitale della Daphnia (60-100 gg a 20°C) ci sono duemodalità riproduttive:

1. Riproduzione partenogenetica

2. Riproduzione sessuata


Riproduzione partenogenetica

Le uova maturate nei due ovari, uova diploidi dette asessuali,passano nella camera incubatrice dove iniziano a sviluppare (uovapartenogenetiche) dando origine ad altre femmine.

Dopo la liberazione delle giovani figlie, la madre muta e subito dopo leuova partenogenetiche maturate nell’ovario passano nella cameraincubatrice.

Questi processi si ripetono ogni 3-4gg.

Una popolazione di daphnidi è quindi composta in toto da femmineadulte e giovani di varia età, il cui corredo genetico è uguale, inquanto madri-sorelle le une delle altre.


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Le uova maturate nei due ovari, uova diploidi dette asessuali,passano nella camera incubatrice dove iniziano a sviluppare (uovapartenogenetiche) dando origine ad altre femmine.

Dopo la liberazione delle giovani figlie, la madre muta e subito dopo leuova partenogenetiche maturate nell’ovario passano nella cameraincubatrice.

Questi processi si ripetono ogni 3-4gg.

Una popolazione di daphnidi è quindi composta in toto da femmineadulte e giovani di varia età, il cui corredo genetico è uguale, inquanto madri-sorelle le une delle altre.


Riproduzione partenogenetica

Le uova partenogenetiche subiscono una sola divisione maturativa mitotica, senzascambi di geni,e senza riduzione del numero di cromosomi.

Pertanto:

La partenogenesi in Daphnia è

AMEIOTICA detta anche APOMITTICA

Ciò porta alla formazione di cloni.

Entro 9gg dalla nascita, la Daphnia dà luogo alla prima schiusa, composta da unadecina di individui.


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Le uova partenogenetiche subiscono una sola divisione maturativa mitotica, senzascambi di geni,e senza riduzione del numero di cromosomi.

Pertanto:

La partenogenesi in Daphnia è

AMEIOTICA detta anche APOMITTICA

Ciò porta alla formazione di cloni.

Entro 9gg dalla nascita, la Daphnia dà luogo alla prima schiusa, composta da unadecina di individui.


In determinate condizioni ambientali dette “sfavorevoli”, interviene la riproduzionesessuata (si tenga presente che biologicamente parlando significa possibilità di scambiodi informazioni genetiche).

Alcuni organismi neonati (sotto influsso ormonale) diventano maschi (morfologicamentesimili ma di dimensioni molto ridotte) che si accoppiano con le femmine adulte.

Queste, che in condizioni di stress ambientale reagiscono riassorbendo le uova dallacamera incubatrice, una volta accoppiatesi producono una forma di resistenza, l'efippio,composta da due sole uova che non si sviluppano, ma, avvolte da uno spesso strato dicarapace, tipicamente di colore nero rimangono latenti. L'efippio viene rilasciato e sisvilupperà solo a condizioni ambientali mutate e favorevoli.

Riproduzione sessuata


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In determinate condizioni ambientali dette “sfavorevoli”, interviene la riproduzionesessuata (si tenga presente che biologicamente parlando significa possibilità di scambiodi informazioni genetiche).

Alcuni organismi neonati (sotto influsso ormonale) diventano maschi (morfologicamentesimili ma di dimensioni molto ridotte) che si accoppiano con le femmine adulte.

Queste, che in condizioni di stress ambientale reagiscono riassorbendo le uova dallacamera incubatrice, una volta accoppiatesi producono una forma di resistenza, l'efippio,composta da due sole uova che non si sviluppano, ma, avvolte da uno spesso strato dicarapace, tipicamente di colore nero rimangono latenti. L'efippio viene rilasciato e sisvilupperà solo a condizioni ambientali mutate e favorevoli.


Riproduzione sessuata

Se sono state fecondate, esse completano la meiosi nell’efippio e dopo laricostituzione del corredo diploide (dalla fusione dei due nuclei),sisviluppano.

Quando la femmina muta, l’efippio contenente le due uova fecondate, vienerilasciato nell’ambiente.

Se la situazione ambientale lo consente,si può tornare ad una riproduzioneper partenogenesi.


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Se sono state fecondate, esse completano la meiosi nell’efippio e dopo laricostituzione del corredo diploide (dalla fusione dei due nuclei),sisviluppano.

Quando la femmina muta, l’efippio contenente le due uova fecondate, vienerilasciato nell’ambiente.

Se la situazione ambientale lo consente,si può tornare ad una riproduzioneper partenogenesi.


SAGGI SU CONSUMATORI PRIMARI (ACQUE DOLCI):DAPHNIA MAGNA

• Organismi < 24 h• Il metodo si basa sull’esposizione degli organismi a diverse

concentrazioni del campione• Condizioni controllate di cibo (per il saggio cronico), luce e

temperatura• DURATA: 24-48 h per il saggio acuto 21 giorni per il saggio

subcronico• ENDPOINT: % immobilizzazione degli organismi esposti rispetto al

controllo e % inibizione crescita e riproduzione (saggio subcronico)calcolo EC50 mediante diluizioni del campione


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• Organismi < 24 h• Il metodo si basa sull’esposizione degli organismi a diverse

concentrazioni del campione• Condizioni controllate di cibo (per il saggio cronico), luce e

temperatura• DURATA: 24-48 h per il saggio acuto 21 giorni per il saggio

subcronico• ENDPOINT: % immobilizzazione degli organismi esposti rispetto al

controllo e % inibizione crescita e riproduzione (saggio subcronico)calcolo EC50 mediante diluizioni del campione


SAGGI SU CONSUMATORI PRIMARI (ACQUE DOLCI): DAPHNIA MAGNA



% IMMOBILIZZAZIONE DEGLI ORGANISMI ESPOSTI RISPETTO ALCONTROLLO


44

Tre repliche campione tal quale


CALCOLO EC50 MEDIANTE DILUIZIONI DEL CAMPIONE



CONDIZIONI DEL TEST

- A trasferimento avvenuto, si registra l’ora e l’inizio della prova;

- Durante le 24 ore della prova, gli animali non vengono alimentati;

- Al termine del saggio si contano gli organismi immobili anche dopo leggeraagitazione del contenitore;

- Il saggio va ripetuto se nelle soluzioni di controllo gli organismi immobilisuperano il 10%;


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- A trasferimento avvenuto, si registra l’ora e l’inizio della prova;

- Durante le 24 ore della prova, gli animali non vengono alimentati;

- Al termine del saggio si contano gli organismi immobili anche dopo leggeraagitazione del contenitore;

- Il saggio va ripetuto se nelle soluzioni di controllo gli organismi immobilisuperano il 10%;


ESPRESSIONE RISULTATI

% Immobilizzazione degli organismi esposti rispetto al controllo :

n° organismi morti / n° totale degli organismi x 100

Il giudizio di accettabilità del campione in esame viene dato quando altermine delle 24 ore la somma degli organismi immobili dei tre recipienticontenenti il campione in esame, risulta inferiore al 50%


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Il giudizio di accettabilità del campione in esame viene dato quando altermine delle 24 ore la somma degli organismi immobili dei tre recipienticontenenti il campione in esame, risulta inferiore al 50%

EC50 col metodo dei Probit

Il metodo dei probits è un metodo di analisi delle curvesigmoididose-azione,una procedura statistica parametrica per stimare la LC50 (o EC50) e l’intervallodi confidenza associato. Il metodo consiste nel trasformare le proporzioni dieffetto osservate inprobitse le concentrazioni in log.

IIQ EC50 VERDE Probfis.exe


SAGGI SU BATTERI ACQUATICITEST MICROTOX ISO

11348/1998Recentemente il D.L.152/99 e succ. consiglia il test con i batteri bioluminescenticome complementare al saggio con Daphnia magna

ll sistema per la rilevazione della tossicità Microtox è stato messo a punto negliUSA alla fine degli anni '70 ed è da tempo diventato una valida alternativa aitest convenzionali con pesci ed invertebrati, quale strumento di screening per ilcontrollo della qualità di campioni liquidi.


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ll sistema per la rilevazione della tossicità Microtox è stato messo a punto negliUSA alla fine degli anni '70 ed è da tempo diventato una valida alternativa aitest convenzionali con pesci ed invertebrati, quale strumento di screening per ilcontrollo della qualità di campioni liquidi.

Il metodo Microtox è una procedura di saggio ecotossicologico che utilizzabatteri bioluminescenti di ambiente marino della specie Vibrio fisheri(Eubacteria, Vibrionacea; già commercializzato come Photobacteriumphosphoreum).


SAGGI SU BATTERI ACQUATICITEST MICROTOX

Vibrio fisheri : batterio Gram negativo, aerobio-anaerobio facoltativo.

I batteri bioluminescenti hanno la particolarità di emettere luce come sottoprodotto dellarespirazione cellulare. Il V. fisheri, infatti, può emettere luce di colore blu-verde con unalunghezza d'onda massima pari a 430 nm., purchè sia presente ossigeno. L’emissione diluminescenza è direttamente legata al metabolismo cellulare e dunque allo stato disalutedell’organismo. Questa caratteristica viene sfruttata nei test di tossicità .

Si può quindi correlare l’effetto della sostanza tossica a cui vengono esposti i batteri adun valore di emissione luminosa che può essere misurato in modo quantitativo tramitefotometro.

La procedura consente di effettuare saggi a tempi brevi, con esposizione da 5 a 30 minuti


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Vibrio fisheri : batterio Gram negativo, aerobio-anaerobio facoltativo.

I batteri bioluminescenti hanno la particolarità di emettere luce come sottoprodotto dellarespirazione cellulare. Il V. fisheri, infatti, può emettere luce di colore blu-verde con unalunghezza d'onda massima pari a 430 nm., purchè sia presente ossigeno. L’emissione diluminescenza è direttamente legata al metabolismo cellulare e dunque allo stato disalutedell’organismo. Questa caratteristica viene sfruttata nei test di tossicità .

Si può quindi correlare l’effetto della sostanza tossica a cui vengono esposti i batteri adun valore di emissione luminosa che può essere misurato in modo quantitativo tramitefotometro.

La procedura consente di effettuare saggi a tempi brevi, con esposizione da 5 a 30 minuti



Il principio del test si basa sulla quantità di energia luminosa sviluppata da questibatteri.

La produzione di luce è il risultato di un processo metabolico delle cellule ed è ilriflesso del loro”stato di salute”.


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Il principio del test si basa sulla quantità di energia luminosa sviluppata da questibatteri.

La produzione di luce è il risultato di un processo metabolico delle cellule ed è ilriflesso del loro”stato di salute”.

La sequenza di reazioni che provoca l'emissione di luce è associata alla catenarespiratoria di trasporto degli elettroni ed è catalizzata dall'enzima luciferasi(ossigenasi a funzione mista connessa alla membrana cellulare) per ossidaresimultaneamente la luciferina (un'aldeide ciclica contenente più di Otto atomi dicarbonio) e la riboflavina 5-P.



LUCIFERASI


51

FMNH2 + RC-OH + O2

luciferina

FMN + RC-OOH + H2O + fotone

luciferina ossidata

Dalla reazione tra luciferasi e il coenzima flavina, assieme con l'ossigeno e laluciferina si forma un complesso attivato che si degrada ed emette protoniresponsabili della bioluminescenza.



L’inibizione ad opera di un tossico, di uno degli enzimi coinvolti nel processo dibioluminescenza, conduce ad una diminuzione di luce.

La quantità di luce persa da una sospensione di batteri luminescenti dopol’esposizione del campione è una misura della tossicità delle sostanze.

Il meccanismo d’azione non è ancora del tutto chiaro.


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L’inibizione ad opera di un tossico, di uno degli enzimi coinvolti nel processo dibioluminescenza, conduce ad una diminuzione di luce.

La quantità di luce persa da una sospensione di batteri luminescenti dopol’esposizione del campione è una misura della tossicità delle sostanze.

Il meccanismo d’azione non è ancora del tutto chiaro.

Probabilmente le sostanze tossiche provocano l'inibizione di qualche enzima ointervengono nei processi di trasporto della membrana, portando ad unrallentamento delle reazioni di produzione di energia della cellula e quindi unariduzione dell'emissione di bioluminescenza.

Tuttavia la natura diversa delle sostanze che determinano una diminuzione della lucefa pensare ad una molteplicità di siti d'azione dei tossici sui batteri, nell'ambitocomunque della membrana cellulare e della catena di trasporto degli elettroni.



Il sistema Microtox fornisce:

• batteri in fase liofila

• Un luminometro termostatato, col quale si misura l’intensità luminosa emessa daibatteri;

• Un programma di gestione dati per il calcolo dell’eventuale EC50: percentuale dicampione che provoca una riduzione del 50% dell’intensità di luce emessa rispettoa quella fatta registrare dai batteri sospesi in una soluzione di controllo esente datossicità.


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Il sistema Microtox fornisce:

• batteri in fase liofila

• Un luminometro termostatato, col quale si misura l’intensità luminosa emessa daibatteri;

• Un programma di gestione dati per il calcolo dell’eventuale EC50: percentuale dicampione che provoca una riduzione del 50% dell’intensità di luce emessa rispettoa quella fatta registrare dai batteri sospesi in una soluzione di controllo esente datossicità.



Nel test con i batteri bioluminescenti, ciascuna diluizione scalare del campione daesaminare viene messa a contatto con una popolazione di microrganismi, 106

individui.

Si misura l’intensità luminosa al tempo 0 (t0) e al tempo t (tt) per esposti e nonesposti.

Alla fine del test non c’è stata una crescita, ma gli individui sono gli stessi dall’inizioalla fine del test.

La curva dose - risposta costruita, consente di individuare la EC50.


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Nel test con i batteri bioluminescenti, ciascuna diluizione scalare del campione daesaminare viene messa a contatto con una popolazione di microrganismi, 106

individui.

Si misura l’intensità luminosa al tempo 0 (t0) e al tempo t (tt) per esposti e nonesposti.

Alla fine del test non c’è stata una crescita, ma gli individui sono gli stessi dall’inizioalla fine del test.

La curva dose - risposta costruita, consente di individuare la EC50.



• Batteri bioluminescenti : Vibrio Fisceri• Screening veloce e semplice• Costi abbastanza contenuti


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La metodologia MICROTOX è:Rapida e standardizzata con risultati riproducibili e confrontabili



il sistema Microtox fornisce:

- batteri in fase liofila- luminometro termostatato- un programma di gestionidati

56Università degli Studi di Napoli Federico II Master II livello REACH


Il test Microtox, grazie al suo ampio spettro di sensibilità a diversi composti siaorganici che inorganici, è stato ampiamente utilizzato come strumento discreening atto ad accertare la tossicità di campioni di svariata natura: effluentidi scarico domestici ed industriali, acque di fiumi, sedimenti e di suoli.

Negli ultimi anni inoltre ha trovato una larga diffusione nell'ambito deltrattamento dei rifiuti pericolosi. Il test Microtox, infatti, è consigliato dall'EPAper valutare l'impatto di questi sull'attività microbica del suolo e per stimare laquantità di materiale da smaltire a terra senza provocare l'inibizione delladegradazione.


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Il test Microtox, grazie al suo ampio spettro di sensibilità a diversi composti siaorganici che inorganici, è stato ampiamente utilizzato come strumento discreening atto ad accertare la tossicità di campioni di svariata natura: effluentidi scarico domestici ed industriali, acque di fiumi, sedimenti e di suoli.

Negli ultimi anni inoltre ha trovato una larga diffusione nell'ambito deltrattamento dei rifiuti pericolosi. Il test Microtox, infatti, è consigliato dall'EPAper valutare l'impatto di questi sull'attività microbica del suolo e per stimare laquantità di materiale da smaltire a terra senza provocare l'inibizione delladegradazione.

Università degli Studi di Napoli Federico II Master II livello REACH

ESEMPIO REPORT TEST VIBRIO FISCERI

Plot of Gamma vs Concentration

5 15 30 Fit

Gamm

a

Concentration

2# 5#

6# 7# 8#

9#

0.01

0.1

1

10

100

0.1 1 10 100

Plot of %Effect vs Concentration

5 15 30

% effec

t

Concentration

1* 2# 3* 4* 5#

6# 7#

8#

9#

-25

0

25

50

75

100

20 40 60 80 100

Test Protocol: Zinc sulfate StandarTest name: interconfronto 3Database file: C:\Programmi\MicrotoxOmni\db.mdb


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Plot of Gamma vs Concentration

5 15 30 Fit

Gamm

a

Concentration

2# 5#

6# 7# 8#

9#

0.01

0.1

1

10

100

0.1 1 10 100

Plot of %Effect vs Concentration

5 15 30

% effec

t

Concentration

1* 2# 3* 4* 5#

6# 7#

8#

9#

-25

0

25

50

75

100

20 40 60 80 100

5 Mins Data: 15 Mins Data: 30 Mins Data:Sample Conc Io It Gamma % effect It Gamma % effect It Gamma % effectControl 0.000 53.45 44.940.8408 # 37.590.7033 # 35.020.6552 #Control 0.000 48.41 42.390.8756 # 37.290.7703 * 33.360.6891 *Control 0.000 52.77 40.380.7652 * 36.320.6883 # 33.180.6288 #

1 0.1934 48.11 39.520.0447 * 4.284% 34.41-0.0272 * -2.797% 30.97-0.0027 * -0.2732%2 0.3867 49.59 39.540.0763 # 7.093% 35.97-0.0407 * -4.251% 30.100.0576 # 5.452%3 0.7734 53.50 44.300.0364 * 3.516% 36.840.0104 * 1.031% 28.540.2034 # 16.90%4 1.547 46.45 38.770.0282 * 2.745% 28.890.1187 # 10.61% 18.350.6251 # 38.46%5 3.094 45.74 34.760.1293 # 11.45% 23.120.3765 # 27.35% 11.48 1.558 # 60.90%6 6.188 33.83 20.840.3932 # 28.22% 9.99 1.356 # 57.56% 4.00 4.430 # 81.58%7 12.38 40.28 25.290.3669 # 26.84% 12.75 1.198 # 54.51% 4.84 4.343 # 81.28%8 24.75 41.15 16.24 1.175 # 54.01% 6.02 3.756 # 78.97% 2.01 12.14 # 92.39%9 49.50 33.41 5.85 3.901 # 79.60% 2.00 10.62 # 91.40% 0.12 177.7 * 99.44%


REPORT TEST VIBRIO FISCERICalculations on 5 Mins data:EC50 Concentration:17.64mg/L (95% confidence range: 6.748 to 46.12)95% Confidence Factor: 2.614Estimating Equation:LOG C =1.112 x LOG G +1.247Coeff. of Determination (R²):0.8621Slope: 0.7756Correction Factor: 0.8582Toxicity units (TU50): 5.669 (3.025 to 10.62)

Calculations on 15 Mins data:EC50 Concentration:7.602mg/L (95% confidence range: 5.395 to 10.71)95% Confidence Factor: 1.409Estimating Equation:LOG C =0.7939 x LOG G +0.8809Coeff. of Determination (R²):0.9571Slope: 1.206Correction Factor: 0.6958Toxicity units (TU50): 13.15 (10.62 to 16.30)



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95% Confidence Factor: 2.614Estimating Equation:LOG C =1.112 x LOG G +1.247Coeff. of Determination (R²):0.8621Slope: 0.7756Correction Factor: 0.8582Toxicity units (TU50): 5.669 (3.025 to 10.62)




SAGGI ALGALI

Le prime metodologie di riferimento che descrivono la prova di crescita algale per ilcontrollo delle acque di scarico risalgono alla seconda metà degli anni 80.

Recentemente il D.L.152/98 e succ. consiglia il test algale come complementare al saggiocon Daphnia magna insieme a quello che utilizza i batteri bioluminescenti.

Le alghe unicellulari sono organismi ubiquitari negli ecosistemi acquatici; essetrasformano energia solare in biomassa, producono ossigeno, che viene poi utilizzatodagli altri organismi acquatici, svolgono una funzione importante nella trasformazione emineralizzazione di sostanze chimiche e costituiscono nutrimento per i successivi anellidella catena alimentare.

Alla fine del loro ciclo vitale, gli organismi vengono degradati attraverso una serie diprocessi chimici e microbici e le sostanze chimiche in essi contenute vengono di nuovoimmesse nel ciclo nutritivo.


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Le alghe unicellulari sono organismi ubiquitari negli ecosistemi acquatici; essetrasformano energia solare in biomassa, producono ossigeno, che viene poi utilizzatodagli altri organismi acquatici, svolgono una funzione importante nella trasformazione emineralizzazione di sostanze chimiche e costituiscono nutrimento per i successivi anellidella catena alimentare.

Alla fine del loro ciclo vitale, gli organismi vengono degradati attraverso una serie diprocessi chimici e microbici e le sostanze chimiche in essi contenute vengono di nuovoimmesse nel ciclo nutritivo.


SAGGI ALGALI

Nel momento in cui la qualità dell'acqua viene modificata tramitel'immissione di sostanze tossiche o anche stimolanti per la crescita algale(un esempio di stimolazione é l'aumento della crescita algale in unecosistema acquatico dovuto ad un incremento della concentrazione dinutrienti), siano esse derivanti dall'industria o dall'agricoltura (vedifertilizzanti), si realizza uno squilibrio delle normali funzioni fisiologichedelle alghe; questo può portare a sua volta a mutamenti della struttura edella funzione di un intero ecosistema.


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Nel momento in cui la qualità dell'acqua viene modificata tramitel'immissione di sostanze tossiche o anche stimolanti per la crescita algale(un esempio di stimolazione é l'aumento della crescita algale in unecosistema acquatico dovuto ad un incremento della concentrazione dinutrienti), siano esse derivanti dall'industria o dall'agricoltura (vedifertilizzanti), si realizza uno squilibrio delle normali funzioni fisiologichedelle alghe; questo può portare a sua volta a mutamenti della struttura edella funzione di un intero ecosistema.

L'importanza quindi di questo tipo di test si rivela nell'informazioneche ci fornisce sul tipo di risposta di un organismo ad un dato fattore

o sostanza.

SAGGI ALGALI

•I saggi standard misurano l’inibizione della crescita algale in un tempodeterminato (generalmente 96 ore).

•Sono talvolta erroneamente inclusi tra i saggi a breve termine anchese esaminano vari cicli vitali.

•I veri saggi a breve termine (es.: inibizione della produzione primariain 30’) richiedono metodi più complessi e costosi.


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•I saggi standard misurano l’inibizione della crescita algale in un tempodeterminato (generalmente 96 ore).

•Sono talvolta erroneamente inclusi tra i saggi a breve termine anchese esaminano vari cicli vitali.

•I veri saggi a breve termine (es.: inibizione della produzione primariain 30’) richiedono metodi più complessi e costosi.


SAGGI ALGALI

Dal confronto delle curve di crescita delle alghe nelle soluzioni da saggiare conquelle del campione di controllo ("bianco": alghe con il solo terreno nutritivo) sipossono trarre le seguenti valutazioni sull'azione di un composto da saggiare:

1 - effetto tossico acuto: questo si verifica quando l'accrescimento algale nellabottiglia test non avviene affatto;

2 - effetto di inibizione: le alghe nella soluzione test subiscono solo un inizialerallentamento della crescita, per poi riprodursi normalmente o quasi;

3 - effetto stimolante: in questo caso si può riscontrare nella soluzione test unaccrescimento algale superiore a quello del campione di controllo.

E' da tener presente che ogni deviazione dalla cosiddetta curva di crescita"normale" è indesiderata, perché in ogni caso indice di distrofia del sistema.


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Dal confronto delle curve di crescita delle alghe nelle soluzioni da saggiare conquelle del campione di controllo ("bianco": alghe con il solo terreno nutritivo) sipossono trarre le seguenti valutazioni sull'azione di un composto da saggiare:

1 - effetto tossico acuto: questo si verifica quando l'accrescimento algale nellabottiglia test non avviene affatto;

2 - effetto di inibizione: le alghe nella soluzione test subiscono solo un inizialerallentamento della crescita, per poi riprodursi normalmente o quasi;

3 - effetto stimolante: in questo caso si può riscontrare nella soluzione test unaccrescimento algale superiore a quello del campione di controllo.

E' da tener presente che ogni deviazione dalla cosiddetta curva di crescita"normale" è indesiderata, perché in ogni caso indice di distrofia del sistema.


SAGGI ALGALICONFRONTO TRA CURVE DI CRESCITA


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Confronto tra la crescita nel controllo (A) e in quattro trattamenti (B-E) a concentrazionicrescenti.I numeri indicano la percentuale di inibizione rispetto al controllo a due diversi tempi diesposizione.I trattamenti B, C e D hanno un effetto “algistatico”, il trattamento E ha un effetto “algicida”.


SAGGI ALGALI

Si possono distinguere i seguenti tipi di sistemi di crescita delle colture algali:

1) Sistema statico: all'inizio delle prove, alghe e nutrienti vengono portati in uncontenitore; successivamente non viene effettuata nessuna aggiunta dinutrienti, viene però garantito lo scambio gassoso con l'ambiente.

2) Sistema a flusso continuo (Continuous Flow Stirred Tank Reactor CFSTR): inquesto caso il sistema é aperto ed omogeneo nel tempo e nello spazio. Ilreattore consiste in un contenitore con agitatore, nel quale il terreno di colturaè immesso con un flusso costante e la soluzione parzialmente consumata e labiomassa prodotta vengono eliminate con continuità.

Le condizioni fisiologiche delle alghe in un tal sistema sono mantenute ad unlivello costante.


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Si possono distinguere i seguenti tipi di sistemi di crescita delle colture algali:

1) Sistema statico: all'inizio delle prove, alghe e nutrienti vengono portati in uncontenitore; successivamente non viene effettuata nessuna aggiunta dinutrienti, viene però garantito lo scambio gassoso con l'ambiente.

2) Sistema a flusso continuo (Continuous Flow Stirred Tank Reactor CFSTR): inquesto caso il sistema é aperto ed omogeneo nel tempo e nello spazio. Ilreattore consiste in un contenitore con agitatore, nel quale il terreno di colturaè immesso con un flusso costante e la soluzione parzialmente consumata e labiomassa prodotta vengono eliminate con continuità.

Le condizioni fisiologiche delle alghe in un tal sistema sono mantenute ad unlivello costante.


SAGGI ALGALI :TEST STATICI (COLTURE IN BATCH)

Nel bioassay vengono usate colture pure d’alghe axeniche (cioè diuna sola specie) e asettiche (prive d’altri organismi viventi). Le provesi svolgono in ambiente termostatato a 20°C±2 con illuminazioneprogrammata (16 ore luce, 8 buio) in contenitori sterili (beute) con osenza insufflazione di aria sterile e filtrata su carbone attivo perstrippare la anidride carbonica che si forma nella fermentazione.

In alternativa l’eccesso di tale anidride può essere eliminatosemplicemente agitando periodicamente le beute con un agitatoreplanetario orbitale o con agitazione manuale.


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Nel bioassay vengono usate colture pure d’alghe axeniche (cioè diuna sola specie) e asettiche (prive d’altri organismi viventi). Le provesi svolgono in ambiente termostatato a 20°C±2 con illuminazioneprogrammata (16 ore luce, 8 buio) in contenitori sterili (beute) con osenza insufflazione di aria sterile e filtrata su carbone attivo perstrippare la anidride carbonica che si forma nella fermentazione.

In alternativa l’eccesso di tale anidride può essere eliminatosemplicemente agitando periodicamente le beute con un agitatoreplanetario orbitale o con agitazione manuale.


SAGGI ALGALITEST STATICI (COLTURE IN BATCH)



SAGGI ALGALITEST STATICI (COLTURE IN BATCH)

La crescita algale viene seguita per 3-12 giorni; ogni 24 ore viene eseguitoun prelievo della soluzione, prima agitata per renderla omogenea, perpoter determinare il numero di cellule presenti per unità di volumetramite conteggio al microscopio.

Alla fine dell'esperimento vengono calcolate, in base ai dati ottenuti emediante una regressione polinomiale, le curve di crescita algalestatisticamente più probabili sia per la soluzione da saggiare, sia per ilcampione di riferimento (bianco).


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La crescita algale viene seguita per 3-12 giorni; ogni 24 ore viene eseguitoun prelievo della soluzione, prima agitata per renderla omogenea, perpoter determinare il numero di cellule presenti per unità di volumetramite conteggio al microscopio.

Alla fine dell'esperimento vengono calcolate, in base ai dati ottenuti emediante una regressione polinomiale, le curve di crescita algalestatisticamente più probabili sia per la soluzione da saggiare, sia per ilcampione di riferimento (bianco).


SAGGI ALGALI :CURVA DI CRESCITA ALGALE

La curva di crescita ideale delle alghe unicellulari in condizioni di laboratoriostatiche, quando cioé la concentrazione iniziale di sali nutritivi nella soluzione vienesempre più diminuendo, perché é consumata e non viene reintegrata) si puòquindi così schematizzare come indicato in figura:

La curva di crescita é caratterizzata da tre fasi:

1- fase di adattamento (lag-phase);2- fase di crescita logaritmica (log-phase);3- fase stazionaria.


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La curva di crescita ideale delle alghe unicellulari in condizioni di laboratoriostatiche, quando cioé la concentrazione iniziale di sali nutritivi nella soluzione vienesempre più diminuendo, perché é consumata e non viene reintegrata) si puòquindi così schematizzare come indicato in figura:





Lag-phase

La lunghezza di questo periodo dipende dalla fase di crescita in cui si trovala coltura algale da cui viene prelevato l'inoculo e dalle caratteristiche dellasoluzione. La massa delle cellule aumenta notevolmente, senza che siverifichi però una divisione cellulare. Questa fase viene chiamata"physiological youth" della coltura.


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Lag-phase

La lunghezza di questo periodo dipende dalla fase di crescita in cui si trovala coltura algale da cui viene prelevato l'inoculo e dalle caratteristiche dellasoluzione. La massa delle cellule aumenta notevolmente, senza che siverifichi però una divisione cellulare. Questa fase viene chiamata"physiological youth" della coltura.



Poiché la crescita rappresenta un incremento sul totale della biomassa, essa porta adun incremento in organismi autoduplicanti.In conseguenza, in condizioni ideali di crescita e di riproduzione, la quantità della

biomassa algale cresce non in proporzione diretta nel tempo, bensì secondo unaprogressione geometrica.

Ogni singola cellula cresce e, dopo aver raggiunto una certa dimensione, si divideper produrre due o più individui completi.Il tempo necessario per ogni riproduzione viene chiamato "tempo di generazione

(g)".

Tempo di generazione e velocità di crescita (growth rate)


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Poiché la crescita rappresenta un incremento sul totale della biomassa, essa porta adun incremento in organismi autoduplicanti.In conseguenza, in condizioni ideali di crescita e di riproduzione, la quantità della

biomassa algale cresce non in proporzione diretta nel tempo, bensì secondo unaprogressione geometrica.

Ogni singola cellula cresce e, dopo aver raggiunto una certa dimensione, si divideper produrre due o più individui completi.Il tempo necessario per ogni riproduzione viene chiamato "tempo di generazione

(g)".



La curva di crescita ideale delle alghe unicellulari in condizioni di laboratoriostatiche, quando cioé la concentrazione iniziale di sali nutritivi nella soluzioneviene sempre più diminuendo, perché é consumata e non viene reintegrata) si puòquindi così schematizzare come indicato in figura:




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La curva di crescita ideale delle alghe unicellulari in condizioni di laboratoriostatiche, quando cioé la concentrazione iniziale di sali nutritivi nella soluzioneviene sempre più diminuendo, perché é consumata e non viene reintegrata) si puòquindi così schematizzare come indicato in figura:




LAG-PHASE

La lunghezza di questo periodo dipende dalla fase dicrescita in cui si trova la coltura algale da cui vieneprelevato l'inoculo e dalle caratteristiche della soluzione.La massa delle cellule aumenta notevolmente, senza che siverifichi però una divisione cellulare. Questa fase vienechiamata "physiological youth" della coltura.


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La lunghezza di questo periodo dipende dalla fase dicrescita in cui si trova la coltura algale da cui vieneprelevato l'inoculo e dalle caratteristiche della soluzione.La massa delle cellule aumenta notevolmente, senza che siverifichi però una divisione cellulare. Questa fase vienechiamata "physiological youth" della coltura.


TEMPO DI GENERAZIONE E VELOCITÀ DI CRESCITA(GROWTH RATE)

Poiché la crescita rappresenta un incremento sul totale dellabiomassa, essa porta ad un incremento in organismi autoduplicanti.

In conseguenza, in condizioni ideali di crescita e di riproduzione, laquantità della biomassa algale cresce non in proporzione diretta neltempo, bensì secondo una progressione geometrica.

Ogni singola cellula cresce e, dopo aver raggiunto una certadimensione, si divide per produrre due o più individui completi.

Il tempo necessario per ogni riproduzione viene chiamato "tempo digenerazione (g)".


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Poiché la crescita rappresenta un incremento sul totale dellabiomassa, essa porta ad un incremento in organismi autoduplicanti.

In conseguenza, in condizioni ideali di crescita e di riproduzione, laquantità della biomassa algale cresce non in proporzione diretta neltempo, bensì secondo una progressione geometrica.

Ogni singola cellula cresce e, dopo aver raggiunto una certadimensione, si divide per produrre due o più individui completi.

Il tempo necessario per ogni riproduzione viene chiamato "tempo digenerazione (g)".


TEST DINAMICI

Colture algali in flusso continuo possono essere caratterizzatecome un sistema complesso aperto, di volume costante, conconcentrazioni costanti di tutti i nutrienti e della biomassaalgale. Le colture in flusso continuo consentono di mantenereuna coltura algale in fase di crescita esponenziale per unperiodo di tempo indeterminato, con un tasso diaccrescimento costante e controllato, in uno stato fisiologicospecifico e costante e in condizioni ambientali costanti.


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Colture algali in flusso continuo possono essere caratterizzatecome un sistema complesso aperto, di volume costante, conconcentrazioni costanti di tutti i nutrienti e della biomassaalgale. Le colture in flusso continuo consentono di mantenereuna coltura algale in fase di crescita esponenziale per unperiodo di tempo indeterminato, con un tasso diaccrescimento costante e controllato, in uno stato fisiologicospecifico e costante e in condizioni ambientali costanti.


LOG-PHASE

Fase di crescita logaritmica: le alghe si moltiplicano in maniera uniforme ecostante. Il tasso specifico di accrescimento durante questa fase écaratteristico per una determinata alga in determinate condizioniambientali e rappresenta il potenziale massimo di riproduzione di questaalga in questo determinato ambiente. I fattori ambientali che influenzanoil tasso di accrescimento sono, oltre ai nutrienti, il pH, la temperatura, laluce e altre variabili chimiche e fisiche.

La durata della fase di crescita logaritmica dipende dalla quantità deinutrienti essenziali disponibili.


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Fase di crescita logaritmica: le alghe si moltiplicano in maniera uniforme ecostante. Il tasso specifico di accrescimento durante questa fase écaratteristico per una determinata alga in determinate condizioniambientali e rappresenta il potenziale massimo di riproduzione di questaalga in questo determinato ambiente. I fattori ambientali che influenzanoil tasso di accrescimento sono, oltre ai nutrienti, il pH, la temperatura, laluce e altre variabili chimiche e fisiche.

La durata della fase di crescita logaritmica dipende dalla quantità deinutrienti essenziali disponibili.


FASE STAZIONARIA

Quando la biomassa algale ha raggiunto una certa massa, essa influiscenotevolmente sulla composizione della soluzione: i nutrienti vannoesaurendosi, l'ambiente comincia ad essere meno adatto alla crescita dellealghe, a causa dei prodotti del metabolismo; si passa così alla fasestazionaria. Man mano che si esaurisce il substrato, si verifica un calo dellacurva di crescita, dovuto al prevalere della mortalità delle alghe sulla loronatalità.


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Quando la biomassa algale ha raggiunto una certa massa, essa influiscenotevolmente sulla composizione della soluzione: i nutrienti vannoesaurendosi, l'ambiente comincia ad essere meno adatto alla crescita dellealghe, a causa dei prodotti del metabolismo; si passa così alla fasestazionaria. Man mano che si esaurisce il substrato, si verifica un calo dellacurva di crescita, dovuto al prevalere della mortalità delle alghe sulla loronatalità.


VALUTAZIONE DELLA CRESCITA ALGALE

In senso biologico, la crescita viene intesa come un gradualeincremento di tutti i componenti un individuo. In tutti gli organismiunicellulari, la moltiplicazione cellulare é una conseguenza dellacrescita. Nelle alghe unicellulari, la moltiplicazione cellulare portaad un incremento sia nel numero che nella massa delle cellule.

I parametri che consentono la valutazione della crescita algalesono:

A) Tempo di generazione e velocità di crescitaB) Concentrazione massima di celluleC) Velocità di crescita massima


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In senso biologico, la crescita viene intesa come un gradualeincremento di tutti i componenti un individuo. In tutti gli organismiunicellulari, la moltiplicazione cellulare é una conseguenza dellacrescita. Nelle alghe unicellulari, la moltiplicazione cellulare portaad un incremento sia nel numero che nella massa delle cellule.

I parametri che consentono la valutazione della crescita algalesono:

A) Tempo di generazione e velocità di crescitaB) Concentrazione massima di celluleC) Velocità di crescita massima


SPECIE UTILIZZATE

Le prove di crescita algale costituiscono uno strumento di indagineambientale di semplice esecuzione, ma contemporaneamente, capace difornire importanti informazioni sullo stato dei corpi idrici e delle acque discarico.

In base alla concentrazione salina dell’acqua da esaminare, le proveutilizzeranno alghe di acqua dolce oppure di acqua marina, pertanto lespecie algali indicate sono: Selenastrum capricornutum per le acque dolci,Dunaliella tertiolecta e Pheodactilum tricornutum per le acque marine esalmastre.


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Le prove di crescita algale costituiscono uno strumento di indagineambientale di semplice esecuzione, ma contemporaneamente, capace difornire importanti informazioni sullo stato dei corpi idrici e delle acque discarico.

In base alla concentrazione salina dell’acqua da esaminare, le proveutilizzeranno alghe di acqua dolce oppure di acqua marina, pertanto lespecie algali indicate sono: Selenastrum capricornutum per le acque dolci,Dunaliella tertiolecta e Pheodactilum tricornutum per le acque marine esalmastre.


SALINITÀ

Secondo indicazioni EPA (1991), il valore di salinità chepermette di discriminare le acque dolci da quelle salate è paria 1000mg/L.

E’ necessario utilizzare organismi di acqua dolce quando lasalinità del corpo idrico è inferiore a 1000mg/L.

Si utilizzano invece organismi marini quando la salinità supera i1000mg/L.


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Secondo indicazioni EPA (1991), il valore di salinità chepermette di discriminare le acque dolci da quelle salate è paria 1000mg/L.

E’ necessario utilizzare organismi di acqua dolce quando lasalinità del corpo idrico è inferiore a 1000mg/L.

Si utilizzano invece organismi marini quando la salinità supera i1000mg/L.


SELENASTRUM CAPRICORNUTUM

Classe: Cloroficee

Ordine: Clorococcales

Famiglia: Volvocaceae

Genere: Selenastrum


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Classe: Cloroficee

Ordine: Clorococcales

Famiglia: Volvocaceae

Genere: Selenastrum

E’ un’alga immobile, di diametro 6-7 m, avente volumedi 40-60 m3


Tassonomia di Selenastrum capricornutum

•NIVA-CHL1 è denominato Selenastrum capricornutum

•Il “World catalague of algae” ne annovera 25 ceppi

•Nel 1986 viene inserita nel genere Raphidocelis col nome di R. subcapitata

•Nel 1988 Hindak definisce il nuovo genere Kirchneria

•Nel 1990 Hindak distingue ulteriormente cambiandone il nome inPseudokirchneriella Hindak

•La denominazione attuale per NIVA-CHL1 è quindi Pseudokirchneriellasubcapitata hindak


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Tassonomia di Selenastrum capricornutum

•NIVA-CHL1 è denominato Selenastrum capricornutum

•Il “World catalague of algae” ne annovera 25 ceppi

•Nel 1986 viene inserita nel genere Raphidocelis col nome di R. subcapitata

•Nel 1988 Hindak definisce il nuovo genere Kirchneria

•Nel 1990 Hindak distingue ulteriormente cambiandone il nome inPseudokirchneriella Hindak

•La denominazione attuale per NIVA-CHL1 è quindi Pseudokirchneriellasubcapitata hindak


PRINCIPIO DEL METODO

Il saggio di tossicità algale, condotto su numerose generazioni di unapopolazione di organismi unicellulari, può essere definito come test cronico, abreve termine, di tipo statico.

Numerosa è la bibliografia che attesta la maggiore sensibilità del test rispettoad altri test di tossicità a breve termine.

Molti sostengono che esso è meno sensibile rispetto a quello con invertebrati opesci nel determinare la tossicità di singole sostanze organiche, ma dimostramaggiore capacità di rilevare tossicità in effluenti complessi.


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Il saggio di tossicità algale, condotto su numerose generazioni di unapopolazione di organismi unicellulari, può essere definito come test cronico, abreve termine, di tipo statico.

Numerosa è la bibliografia che attesta la maggiore sensibilità del test rispettoad altri test di tossicità a breve termine.

Molti sostengono che esso è meno sensibile rispetto a quello con invertebrati opesci nel determinare la tossicità di singole sostanze organiche, ma dimostramaggiore capacità di rilevare tossicità in effluenti complessi.


TEST ALGALE

Preparazione del campione

Si preparano diluizioni scalari del campione da esaminare : 100%;10% ; 1%; 0,1%; 0,01%, con acqua di allevamento o acqua di marea seconda del tipo di alga .

Contemporaneamente si prepara una soluzione controllo diriferimento.

(Saggio preliminare)


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Preparazione del campione

Si preparano diluizioni scalari del campione da esaminare : 100%;10% ; 1%; 0,1%; 0,01%, con acqua di allevamento o acqua di marea seconda del tipo di alga .

Contemporaneamente si prepara una soluzione controllo diriferimento.

(Saggio preliminare)


TEST ALGALE-SAGGIO DEFINITIVO

Se il saggio preliminare ha indicato un intervallo di lavorocompreso entro due diluizioni, occorre individuare una seriedi cinque diluizioni partendo da quella più bassa.

Es. se la diluizione più bassa è 10%, le diluizione nel saggiodefinitivo saranno:10%- 7,5%-5%-2,5%-1,25%.


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Se il saggio preliminare ha indicato un intervallo di lavorocompreso entro due diluizioni, occorre individuare una seriedi cinque diluizioni partendo da quella più bassa.

Es. se la diluizione più bassa è 10%, le diluizione nel saggiodefinitivo saranno:10%- 7,5%-5%-2,5%-1,25%.


DISTRIBUZIONE DEL CAMPIONE E CONTROLLONELLE BEUTE

Si preparano le diluizioni del campione con acqua diallevamento o acqua di mare, contemporaneamente alcontrollo si arricchiscono di sali e si distribuiscono nellepiastre che saranno contraddistinte con il valore dellaconcentrazione percentuale e con la sigla C se si tratta delcampione e K se si tratta del controllo.


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Si preparano le diluizioni del campione con acqua diallevamento o acqua di mare, contemporaneamente alcontrollo si arricchiscono di sali e si distribuiscono nellepiastre che saranno contraddistinte con il valore dellaconcentrazione percentuale e con la sigla C se si tratta delcampione e K se si tratta del controllo.


AGGIUNTA DELL’INOCULO

Ad ogni piastra viene aggiunto l’inoculo algale chedeve essere preparata 24h prima dell’inizio delsaggio. La concentrazione iniziale di ciascuna coltura

algale sarà di 2x10³cellule/mL


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Ad ogni piastra viene aggiunto l’inoculo algale chedeve essere preparata 24h prima dell’inizio delsaggio. La concentrazione iniziale di ciascuna coltura

algale sarà di 2x10³cellule/mL


INCUBAZIONE DELLE BEUTE

T= 20/21C° I= continua con intensità non inferiore a 4300 Lux Agitazione continua se possibile oppure due volte

al giorno.


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T= 20/21C° I= continua con intensità non inferiore a 4300 Lux Agitazione continua se possibile oppure due volte

al giorno.


PROCEDURA PER IL SAGGIO:



MISURA DELLA CRESCITA ALGALE

Dopo 72h di incubazione in ogni beuta verràmisurata la crescita algale.

La misurazione può essere fatta o con camera diBurker o con contaparticelle.


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Dopo 72h di incubazione in ogni beuta verràmisurata la crescita algale.

La misurazione può essere fatta o con camera diBurker o con contaparticelle.


RISPOSTE DEL SAGGIO ALGALE

Tre sono i tipi di risposta:

• Stimolazione della crescita algale

• Inibizione della crescita algale

• Stimolazione della crescita algale da parte dellealte diluizioni del campione e inibizione dellacrescita da parte della basse diluizioni.


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Tre sono i tipi di risposta:

• Stimolazione della crescita algale

• Inibizione della crescita algale

• Stimolazione della crescita algale da parte dellealte diluizioni del campione e inibizione dellacrescita da parte della basse diluizioni.


STIMOLAZIONE DELLA CRESCITA ALGALE

Un campione stimola la crescita algale quando contiene unaquantità di sostanze nutrienti tale da determinare unincremento della crescita statisticamente significativorispetto al controllo.

Tutto ciò indica un possibile effetto eutrofizzante deldell’effluente nei confronti del corpo idrico ricettore.


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Un campione stimola la crescita algale quando contiene unaquantità di sostanze nutrienti tale da determinare unincremento della crescita statisticamente significativorispetto al controllo.

Tutto ciò indica un possibile effetto eutrofizzante deldell’effluente nei confronti del corpo idrico ricettore.


INIBIZIONE DELLA CRESCITA ALGALE

Un campione presenta effetto tossico quando inibisce la crescitaalgale in misura significativa rispetto al controllo.

Se si considera un intervallo di diluizioni in cui alti livelliinibiscono la crescita rispetto alle diluizioni più basse, si puòdeterminare l’EC50.

Al fine di rendere più facilmente comprensibile la misura dellatossicità è opportuno affiancare al valore di EC50 anche quellodi Unità Tossiche (U.T.)


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Un campione presenta effetto tossico quando inibisce la crescitaalgale in misura significativa rispetto al controllo.

Se si considera un intervallo di diluizioni in cui alti livelliinibiscono la crescita rispetto alle diluizioni più basse, si puòdeterminare l’EC50.

Al fine di rendere più facilmente comprensibile la misura dellatossicità è opportuno affiancare al valore di EC50 anche quellodi Unità Tossiche (U.T.)


UNITÀ TOSSICA

U.T. = 100 / EC50

Il valore di U.T. tende ad aumentare con la tossicitàdel campione.

Oltre alla EC50, è opportuno considerare anche ilvalore di NOEC e LOEC


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U.T. = 100 / EC50

Il valore di U.T. tende ad aumentare con la tossicitàdel campione.

Oltre alla EC50, è opportuno considerare anche ilvalore di NOEC e LOEC


SCALA DI TOSSICITÀ



SCALA DI TOSSICITÀ PER VIBRIO FISCHERI (SPT)



SAGGI DI ECOTOSSICITÀ TERRESTRE

Gli studi ecotossicologici terrestre sono quelli effettuati sugli Artropodi utili,Api, organismi del suolo,Lombrichi, e sulle piante non bersaglio.

Riguardano sia indagini connesse con l'effetto di sostanze attivesull'ambiente sia la valutazione del loro impatto sul numero relativo e / o la

biomassa di elementi del ecosistema.

Obiettivo principale è quello di valutare i prodotti per la protezione dell’ecosistema sia in termini di efficacia che di tossicità.


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Gli studi ecotossicologici terrestre sono quelli effettuati sugli Artropodi utili,Api, organismi del suolo,Lombrichi, e sulle piante non bersaglio.

Riguardano sia indagini connesse con l'effetto di sostanze attivesull'ambiente sia la valutazione del loro impatto sul numero relativo e / o la

biomassa di elementi del ecosistema.

Obiettivo principale è quello di valutare i prodotti per la protezione dell’ecosistema sia in termini di efficacia che di tossicità.



Possono essere effettuati mediante esposizione a concentrazioni di tossico nel mezzo(aria, suolo), ma più frequentemente l’esposizione è alimentare.

Sebbene le direttive Europee richiedano diversi tipi di saggi terrestri, le procedureufficiali standard, accettate a livello Europeo sono relativamentepoche:•Tossicità acuta orale su api•Tossicità acuta per contatto su api•Tossicità su lombrichi

Per molti importanti gruppi di organismi(piante, uccelli,microrganismi del suolo, ecc.)

non esistono ancora metodi codificati e standardizzati


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Possono essere effettuati mediante esposizione a concentrazioni di tossico nel mezzo(aria, suolo), ma più frequentemente l’esposizione è alimentare.

Sebbene le direttive Europee richiedano diversi tipi di saggi terrestri, le procedureufficiali standard, accettate a livello Europeo sono relativamentepoche:•Tossicità acuta orale su api•Tossicità acuta per contatto su api•Tossicità su lombrichi

Per molti importanti gruppi di organismi(piante, uccelli,microrganismi del suolo, ecc.)

non esistono ancora metodi codificati e standardizzati



I test possono essere espressi come :EC50 (mg/kg peso corporeo o mg/kg dieta).

Nel primo caso, mg/kg peso corporeo ,la tossicità è espressa come quantità di tossicoassunta dall’organismo, rapportata al peso corporeo (di norma questa è l’unità usatanei saggi di tossicità acuta per assunzione singola).

Nel secondo, mg/kg dieta, invece è espressa come concentrazione di tossico(peso/peso) nel cibo somministrato (di norma questa unità è usata nei saggi a lungotermine, “feed trials”, e richiede l’espressione del tempo di esposizione).

Possono essere effettuati su molte specie.

Nelle note a corredo del dato sono state previste una serie di informazioni: condizionitest (pH, temperatura, modalità di somministrazione, ecc.)


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I test possono essere espressi come :EC50 (mg/kg peso corporeo o mg/kg dieta).

Nel primo caso, mg/kg peso corporeo ,la tossicità è espressa come quantità di tossicoassunta dall’organismo, rapportata al peso corporeo (di norma questa è l’unità usatanei saggi di tossicità acuta per assunzione singola).

Nel secondo, mg/kg dieta, invece è espressa come concentrazione di tossico(peso/peso) nel cibo somministrato (di norma questa unità è usata nei saggi a lungotermine, “feed trials”, e richiede l’espressione del tempo di esposizione).

Possono essere effettuati su molte specie.

Nelle note a corredo del dato sono state previste una serie di informazioni: condizionitest (pH, temperatura, modalità di somministrazione, ecc.)


SAGGI DI TOSSICITÀ TERRESTRE

Invertebrati terrestri - Lombrichi (consumatore primario): la specie diAnellide Eisenia fetida, è generalmente la più utilizzata, ma vi sono test anche conaltre specie di Eisenia o di lombrichi; la mortalità è espressa come LC50 (14 giornimg/kg suolo) mentre il NOEC è generalmente calcolato a 21 giorni e si valutanogli effetti sulla riproduzione.

Nelle note a corredo del campo relativo alla tossicità su lombrichi sono riportateuna serie di informazioni:

- durata del test nel caso in cui sia differente da 21 giorni,- stadio di sviluppo dell’organismo utilizzato per il test,- condizioni del test ( pH, temperatura, ecc).


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Invertebrati terrestri - Lombrichi (consumatore primario): la specie diAnellide Eisenia fetida, è generalmente la più utilizzata, ma vi sono test anche conaltre specie di Eisenia o di lombrichi; la mortalità è espressa come LC50 (14 giornimg/kg suolo) mentre il NOEC è generalmente calcolato a 21 giorni e si valutanogli effetti sulla riproduzione.

Nelle note a corredo del campo relativo alla tossicità su lombrichi sono riportateuna serie di informazioni:

- durata del test nel caso in cui sia differente da 21 giorni,- stadio di sviluppo dell’organismo utilizzato per il test,- condizioni del test ( pH, temperatura, ecc).



Altri invertebrati terrestri: esistono dati su specie diverse. Es. per i fitofarmaci vi sonospesso test acuti e cronici su Insetti es. Aphidius rhopalosiphi o Aracnidies. Typhlodromus pyri, o su altre specie rilevanti per le condizioni di uso dellasostanza.

Insetti – Api: valore di LD50 acuta orale o per contatto della sostanza attiva espressacome µg/ape (48h). Dati scarsi per i prodotti fitosanitari, quasi del tutto assenti peraltre tipologie di inquinanti. Nelle note a corredo del dato si esplicita se trattasi di testorale o contatto.

Microrganismi: dati su specie diverse di batteri, microfunghi e più raramente protozoi,test poco standardizzati. Informazioni scarse. Esistono batteri autotrofi che sonoproduttori primari.

Piante superiori: dati su specie diverse (in genere sono saggi di fitotossicità legati allagerminabilità dei semi o accrescimento).Test poco standardizzati. Informazioni scarse.


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Altri invertebrati terrestri: esistono dati su specie diverse. Es. per i fitofarmaci vi sonospesso test acuti e cronici su Insetti es. Aphidius rhopalosiphi o Aracnidies. Typhlodromus pyri, o su altre specie rilevanti per le condizioni di uso dellasostanza.

Insetti – Api: valore di LD50 acuta orale o per contatto della sostanza attiva espressacome µg/ape (48h). Dati scarsi per i prodotti fitosanitari, quasi del tutto assenti peraltre tipologie di inquinanti. Nelle note a corredo del dato si esplicita se trattasi di testorale o contatto.

Microrganismi: dati su specie diverse di batteri, microfunghi e più raramente protozoi,test poco standardizzati. Informazioni scarse. Esistono batteri autotrofi che sonoproduttori primari.

Piante superiori: dati su specie diverse (in genere sono saggi di fitotossicità legati allagerminabilità dei semi o accrescimento).Test poco standardizzati. Informazioni scarse.



•Aphidius rhopalosiphi•Typhlodromus pyri•Aleochara bilineata•Poecillus cupreus•Pardosa spp.•Chrysoperla carnea•Coccinella septempunctata•Orius laevigatus

Test di Laboratorioa) Limit test (1 dose)b) Rate response test (5 dosi) – (test per individuare l'intervallo )

Antropodi utili


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•Aphidius rhopalosiphi•Typhlodromus pyri•Aleochara bilineata•Poecillus cupreus•Pardosa spp.•Chrysoperla carnea•Coccinella septempunctata•Orius laevigatus

Test di Laboratorioa) Limit test (1 dose)b) Rate response test (5 dosi) – (test per individuare l'intervallo )



PIANTE

Insetticidi e FungicidiLimit test (21 giorni, 20 piante per concentrazione):OECD 208 Aa) Test di germinazione (6 specie di piante) registrazione europeab) Test di germinazione (10 specie di piante) registrazione USA EPA

Limit test (28 giorni, 20 piante per concentrazione):OECD 208 Aa) Test di vigore vegetativo (6 specie di piante) registrazione europeab) Test di vigore vegetativo (10 specie di piante) registrazione USA EPA

ErbicidiTest dose response di germinazione (21 giorni - 20 piante per concentrazione):OECD 208 Aa) 6 specie di piante -registrazione europeab) 10 specie di piante - registrazione USA EPA

Test dose response di vigore vegetativo (21 giorni - 20 piante per concentrazione):OECD 227a) 6 specie di piante -registrazione europeab) 10 specie di piante - registrazione USA EPA


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PIANTE

Insetticidi e FungicidiLimit test (21 giorni, 20 piante per concentrazione):OECD 208 Aa) Test di germinazione (6 specie di piante) registrazione europeab) Test di germinazione (10 specie di piante) registrazione USA EPA

Limit test (28 giorni, 20 piante per concentrazione):OECD 208 Aa) Test di vigore vegetativo (6 specie di piante) registrazione europeab) Test di vigore vegetativo (10 specie di piante) registrazione USA EPA

ErbicidiTest dose response di germinazione (21 giorni - 20 piante per concentrazione):OECD 208 Aa) 6 specie di piante -registrazione europeab) 10 specie di piante - registrazione USA EPA

Test dose response di vigore vegetativo (21 giorni - 20 piante per concentrazione):OECD 227a) 6 specie di piante -registrazione europeab) 10 specie di piante - registrazione USA EPA


La strategia delle linee guida nell’identificazione delle sostanze PBT e vPvB siorganizza su due fasi.

Test biodegradabilità


Nella prima fase, di screening assessment, si valuta la biodegradabilità intrinseca dellamolecola (OECD TG302 A-C-C, test di mineralizzazione), la bioaccumulabilità (attraverso ilcoefficiente di ripartizione ottanolo/acqua) e la tossicità (attraverso la tossicità acquatica abreve termine LC50 EC50).


Nella prima fase, di screening assessment, si valuta la biodegradabilità intrinseca dellamolecola (OECD TG302 A-C-C, test di mineralizzazione), la bioaccumulabilità (attraverso ilcoefficiente di ripartizione ottanolo/acqua) e la tossicità (attraverso la tossicità acquatica abreve termine LC50 EC50).

In caso di esito positivo si procede o considerando le sostanze come potenziali PBT/vPvB oaffinando l’indagine con i test convenzionali (allegato XIII) di persistenza (simulazioneambiente marino OECD 307,308,309), di bioaccumulabilità (calcolo del fattore dibioconcentrazione OECD 305A-E) e di tossicità cronica (OECD 201)

Al fine di minimizzare il numero di indagini in entrambe le fasi sipredilige gerarchizzare i test ed eseguirli in sequenza (nell’ordinepersistenza, bioaccumulo, tossicità) solo se necessario, ossia in caso dirisposta positiva del test precedente.

Test biodegradabilità


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Questo approccio acuisce l’interesse verso test di persistenza ebioaccumulo (i più eseguiti) che siano rapidi e significativirispetto ai criteri.

In relazione agli esiti dei test occorrerà poi produrre unavalutazione dell’esposizione ed una caratterizzazione del rischioche non sono tutt’altro che scontati a causa della difficoltà direalizzare una valutazione quantitativa di sintesi dei tre criterianche in virtù dell’incertezza legata ad effetti a lungo termine.


Un esempio è rappresentato dal test di (eco)persistenza basato su proposte di fotosensori di permanenzaambientale che consentono di determinare un indice di persistenza ambientale seguendo la degradazione dellematrici.

Il biossido di titanio (TiO2) per esempio, attivato da radiazione UV, agisce, sia come fotocatalizzatore delladegradazione delle sostanze organiche, sia come materiale indicatore del pH e consente pertanto di misurare iltempo necessario ad innescare l’acidificazione corrispondente alla produzione degradativa di CO2, consideratocome la conclusione del periodo di induzione alla mineralizzazione; considerando come parametro la velocità divariazione del pH nel tempo, quanto più essa è elevata, tanto maggiore è la concentrazione di ambiente carbonicoe di acidi inorganici prodotti dalla mineralizzazione nell’unità di tempo.

Molto interessanti risultano i test dipersistenza basati su fotosensori.


Il biossido di titanio (TiO2) per esempio, attivato da radiazione UV, agisce, sia come fotocatalizzatore delladegradazione delle sostanze organiche, sia come materiale indicatore del pH e consente pertanto di misurare iltempo necessario ad innescare l’acidificazione corrispondente alla produzione degradativa di CO2, consideratocome la conclusione del periodo di induzione alla mineralizzazione; considerando come parametro la velocità divariazione del pH nel tempo, quanto più essa è elevata, tanto maggiore è la concentrazione di ambiente carbonicoe di acidi inorganici prodotti dalla mineralizzazione nell’unità di tempo.

Infine, dato che l’ecopersistenza è riferita all’azione sia chimica (interazione con altri composti smaltitinell’ambiente), sia fisica (interazione con la luce solare), sia biologica (interazione con microrganismi), proprio sullabase di questo, le esperienze di biomonitoraggio costituiscono un importante contributo alla valutazione delpotenziale di rischio dei chemicals.


Strategia di test approccio indicato dalle guide tecnichePreliminary Technical Guidance Document (RIP 3.2)

L’approccio indicato dalle guidetecniche tende a semplificare eottimizzare la procedura divalutazione e procede con leseguenti fasi:

screening iniziale (screeningassessment) si possonoconsiderare tutti i datidisponibili ed effettuare unavalutazione preliminare contest rapidi e dati facilmentereperibili

La valutazione termina qui selo screening assessmentpermette di escludere che lasostanza è PBTo vPvB



L’approccio indicato dalle guidetecniche tende a semplificare eottimizzare la procedura divalutazione e procede con leseguenti fasi:

screening iniziale (screeningassessment) si possonoconsiderare tutti i datidisponibili ed effettuare unavalutazione preliminare contest rapidi e dati facilmentereperibili

La valutazione termina qui selo screening assessmentpermette di escludere che lasostanza è PBTo vPvB

Altrimenti le sostanze vanno consideratepotenzialmente PBT o vPvB per verificare lavalutazione effettuata con lo screeningassessment, è quindi indicato impostare unastrategia di test attraverso l’utilizzo di datiAggiuntivi

Le technical guidancespropongono delle strategie ditest e indicazioni sui test el’interpretazione dei risultati

Valutazione preliminare(screening assessment)

Le sostanze, quindi, siconsiderano potenzialmente

PBT :

se non risultano rapidamentebiodegradabili con il criteriodella Ready Biodegradability”o “inherent biodegradability”(potenzialmente persistenti)

se Log Kow > 4,5(potenzialmentebioaccumulanti)



Le sostanze, quindi, siconsiderano potenzialmente

PBT :

se non risultano rapidamentebiodegradabili con il criteriodella Ready Biodegradability”o “inherent biodegradability”(potenzialmente persistenti)

se Log Kow > 4,5(potenzialmentebioaccumulanti)

se LC50 o EC50 (tossicitàbreve termine acquatica) <0,1 mg/L(potenzialmente

tossiche)

Valutazione preliminarecriterio generale

Utilizzo di dati facilmente reperibili e facilmente interpretabili



• test di biodegradabilità rapida e completa o Ready Biodegradability (OECD guidelines 301 A-F)

# test di Biodegradabilità intrinseca o Inherent Biodegradability mineralizzazione >70% entro7-14giorni (OECD TG 302 A-C)

Conclusioni della valutazione preliminare


Valutazione definitivastrategia di test

Per verificare la valutazione preliminare serve fornire altre informazioni sulle sostanze; sideve procedere innanzitutto in modo da evitare il più possibile test non necessari suanimali.


Per verificare la valutazione preliminare serve fornire altre informazioni sulle sostanze; sideve procedere innanzitutto in modo da evitare il più possibile test non necessari suanimali.

A tal fine la valutazionedovrebbe iniziare con la

“persistenza”.

Se la sostanza risultapersistente, allora si valuta

la “bioaccumulabilità”

Solo in ultima analisi siprocede con la valutazione

della “tossicità”.

Valutazione della Persistenzadati sperimentali sulla persistenza in ambiente marino

Emivita: Test di simulazione in ambiente marino (OECD guidelines 307,308,309)

Dovrebbe essere effettuata anche la valutazione PBT/vPvB dei prodotti didegradazione quando si osserva una degradazione non completa dellasostanza


Dovrebbe essere effettuata anche la valutazione PBT/vPvB dei prodotti didegradazione quando si osserva una degradazione non completa dellasostanza

Valutazione della Persistenzaaltri dati sperimentali

Se non sono disponibili dati sull’emivita in acqua di mare, ci si basa su altridati, come ad es. dati di test di simulazione della degradazione in acquedolci, o altri parametri che permettono di escludere che la sostanza èpersistente



Valutazione della Persistenzamodelli di stima della biodegradabilità

Se non ci sono informazioni disponibili o sono di difficile interpretazione:

Modelli QSAR

Valutazione preliminare tramite BIOWIN :programma per valutare labiodegradabilità aerobica delle sostanze organiche in ambiente marino usando 6modelli differenti.

Disponibile sul sito web USEPAhttp://www.epa.gov/oppt/exposure/pubs/episuite.htm



Se non ci sono informazioni disponibili o sono di difficile interpretazione:

Modelli QSAR

Valutazione preliminare tramite BIOWIN :programma per valutare labiodegradabilità aerobica delle sostanze organiche in ambiente marino usando 6modelli differenti.

Disponibile sul sito web USEPAhttp://www.epa.gov/oppt/exposure/pubs/episuite.htm

Valutazione della BioaccumulabilitàValutazione della Bioaccumulabilità

Il Fattore di bioconcentrazione (BCF) è il rapporto tra le concentrazioni della sostanza nelbiota e nell’acqua, all’equilibrio.

E’ usato come primo indicatore della bioaccumulabilità (OECD guidelines 305A-E,1994)

Se non ci sono misure disponibili, il BCF può essere stimato dal log Kow attraversomodelli QSAR, per valori di logKow tra 1-6 (ECETOC,1995).



Il Fattore di bioconcentrazione (BCF) è il rapporto tra le concentrazioni della sostanza nelbiota e nell’acqua, all’equilibrio.

E’ usato come primo indicatore della bioaccumulabilità (OECD guidelines 305A-E,1994)

Se non ci sono misure disponibili, il BCF può essere stimato dal log Kow attraversomodelli QSAR, per valori di logKow tra 1-6 (ECETOC,1995).

Valutazione della Bioaccumulabilità KowValutazione della Bioaccumulabilità Kow

Inoltre, i valori di Kow (coefficiente di ripartizione n-ottanolo/acqua) possonoessere direttamente usati per la valutazione della potenziale bioaccumulabilità

Kow indicatore della capacità di una sostanza di accumularsi nel biota

Si assume che l’assorbimento di una sostanza organica è influenzata dalla suaidrofofobicità per analogia tra il processo di ripartizione strato lipidico deipesci/acqua, e il processo di ripartizione n-ottanolo/acqua

Per i composti organici con un log Kow < 4,5



Inoltre, i valori di Kow (coefficiente di ripartizione n-ottanolo/acqua) possonoessere direttamente usati per la valutazione della potenziale bioaccumulabilità

Kow indicatore della capacità di una sostanza di accumularsi nel biota

Si assume che l’assorbimento di una sostanza organica è influenzata dalla suaidrofofobicità per analogia tra il processo di ripartizione strato lipidico deipesci/acqua, e il processo di ripartizione n-ottanolo/acqua

Per i composti organici con un log Kow < 4,5

Si considera che l’affinità per lo strato lipidico di un organismo è tale per cui lasostanza non è considerata Bioaccumulante (dallo screening assessment)

Valutazione della TossicitàNOEC

Valutazione della TossicitàNOEC

Il parametro considerato è la tossicità a lungo termine per valutare ilpotenziale tossico delle sostanze su organismi acquatici marini o di acquedolci.

Il NOEC (No observed effect concentration) è la concentrazione massima dinon effetto osservato, uno dei parametri con cui si esprime la tossicità cronica(OECD 201,1984a).



Il parametro considerato è la tossicità a lungo termine per valutare ilpotenziale tossico delle sostanze su organismi acquatici marini o di acquedolci.

Il NOEC (No observed effect concentration) è la concentrazione massima dinon effetto osservato, uno dei parametri con cui si esprime la tossicità cronica(OECD 201,1984a).

Tossicità: strategia di testTossicità: strategia di test



(*) l’approccio dovrebbe innanzitutto considerare studi su organismi acquatici non-vertebratislide 21

Conclusioni della valutazione PBT/vPvBConclusioni della valutazione PBT/vPvB



I FATTORI DI VARIABILITÀ NEI SAGGI ECOTOSSICOLOGICI

Solubilità in acqua

Volatilità (tensione di vapore)


Principali caratteristiche di una sostanza chimica rilevanti ai fini dei saggi ecotossicologici

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Costante di dissociazione

Polarità

Costante di ripartizione ottanolo-acqua (Kow)

Persistenza



Variabilità individuale nella popolazione


Caratteristiche degli organismi : possibili fattori di variabilità

125

Differenze nelle varie fasi del ciclo vitale

Stato di salute e condizioni fisiologiche della popolazione

Adattamento genetico, particolarmente importante permicroorganismi (alghe, protozoi, batteri)

Necessità di controllare lo stato della popolazione o del ceppoutilizzato mediante saggi con sostanze di riferimento



Caratteristichedegli organismi

Variabilitàintraspecifica


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Variazione dell’effetto tossico del rame in funzione dei diversi stadidel ciclo vitale di trota



pH : Aumenta la solubilità e biodisponibilità dei metalli.Determina il grado didissociazione delle sostanze ionizzabili modificandone il comportamento chimico e l’attivitàbiologica


Parametri ambientali

Esempi di parametri ambientali che possono interferire con l’attività biologica e loropossibili effetti sulle sostanze potenzialmente tossiche in ambiente acquatico

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pH : Aumenta la solubilità e biodisponibilità dei metalli.Determina il grado didissociazione delle sostanze ionizzabili modificandone il comportamento chimico e l’attivitàbiologica

Durezza: I sali di Ca e Mg interferiscono con metalli pesanti e con sostanze organiche polaririducendone la tossicità Le acque dure possono stimolare le capacità escretorie di alcuniorganismi (in particolare pesci) favorendo l’eliminazione di alcune sostanze potenzialmentepericolose

Sostanza organica : La sostanza organica può formare complessi con metalli pesanti o conaltre sostanze modificandone la biodisponibilità. In genere si ha una riduzione dell’effettotossico.


I FATTORI DI VARIABILITÀ NEI SAGGIECOTOSSICOLOGICI

Dissociazione e tossicità di ammoniaca in funzione del pH


128

L’ammoniaca ionizzata (NH4+) è praticamente non tossica.L’ammoniaca non ionizzata (NH3) è molto tossica per gli organismi acquatici(livello di sicurezza 20 mg/L)


RIPETIBILITÀ E PRECISIONE NEI SAGGI ECOTOSSICOLOGICI

I numerosi fattori che possono influenzare l’esito di un saggio ecotossicologico, a cui si devonoaggiungere i normali fattori di possibile imprecisione che accompagnano qualunque misurasperimentale (accuratezza nella preparazione, accuratezza nella misura, ecc.), fanno si che i risultatidei saggi siano sempre caratterizzati da un certo margine di variabilità.


129

D’altro canto è necessario che i saggi ecotossicologici possano fornire garanzie di accuratezza eripetibilità, per consentire valutazioni non erronee sui possibili rischi determinati da sostanzepotenzialmente pericolose.

Qual è il livello di variabilità e ripetibilità che possiamo considerare accettabile per i risultati di unsaggio ecotossicologico?


Ripetibilità e precisione nei saggiRipetibilità e precisione nei saggi ecotossicologiciecotossicologici

Per rispondere alladomanda bisogna ricordare

che, potenzialmente, unasostanza sconosciuta

potrebbe esplicare il proprioeffetto entro un ambito

estremamente ampio (finoa 8 – 10 ordini di

grandezza).

Ne consegue chedifferenze anche

rilevanti tra risultati disaggi ripetuti (ad

esempio uno il doppiodell’altro) coprono unaparte assolutamente

trascurabile diquest’ambito.

Per la maggior parte dellefinalità dei saggi

ecotossicologici (classificazionedelle sostanze, definizione diPNEC o di criteri di qualità,

ecc.) risultati che differisconotra loro per meno di un fattore

2 (100%) sono consideratimolto buoni.

Differenze per unfattore 3 o 4 (300-

400%) sonoconsiderate non

certo ottimali ma inalcuni casiaccettabili.


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Per rispondere alladomanda bisogna ricordare

che, potenzialmente, unasostanza sconosciuta

potrebbe esplicare il proprioeffetto entro un ambito

estremamente ampio (finoa 8 – 10 ordini di

grandezza).

Ne consegue chedifferenze anche

rilevanti tra risultati disaggi ripetuti (ad

esempio uno il doppiodell’altro) coprono unaparte assolutamente

trascurabile diquest’ambito.

Per la maggior parte dellefinalità dei saggi

ecotossicologici (classificazionedelle sostanze, definizione diPNEC o di criteri di qualità,

ecc.) risultati che differisconotra loro per meno di un fattore

2 (100%) sono consideratimolto buoni.

Differenze per unfattore 3 o 4 (300-

400%) sonoconsiderate non

certo ottimali ma inalcuni casiaccettabili.



La necessità di maggiore precisione

Esistono casi, in genere connessi con specifiche esigenze di ricerca, in cui ènecessario determinare i livelli di tossicità con precisione maggiore (ad

esempio ridurre la variabilità a meno del 50%).Per ottenere risultati del genere è necessario:

• Ampliare il piano sperimentale• Aumentare il numero di individui saggiati• Aumentare il numero delle repliche• Usare rigorosi metodi statistici per l’elaborazione dei dati


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La necessità di maggiore precisione

Esistono casi, in genere connessi con specifiche esigenze di ricerca, in cui ènecessario determinare i livelli di tossicità con precisione maggiore (ad

esempio ridurre la variabilità a meno del 50%).Per ottenere risultati del genere è necessario:

• Ampliare il piano sperimentale• Aumentare il numero di individui saggiati• Aumentare il numero delle repliche• Usare rigorosi metodi statistici per l’elaborazione dei dati


IL PASSAGGIO DAI DATI SPERIMENTALI ALLA PNEC


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La NEC (No Effect Concentration) non può essere misurata sperimentalmente.Il massimo risultato fornito dalla sperimentazione è un livello di non effetto osservato (NOEL).Quindi si può solo tentare di stimare una prevedibile NEC (PNEC)Il passaggio da NOEL a PNEC richiede metodi teorici di estrapolazione.

La NEC (No Effect Concentration) non può essere misurata sperimentalmente.Il massimo risultato fornito dalla sperimentazione è un livello di non effetto osservato (NOEL).Quindi si può solo tentare di stimare una prevedibile NEC (PNEC)Il passaggio da NOEL a PNEC richiede metodi teorici di estrapolazione.


ESISTE VERAMENTE UNA PNEC?

Il problema dell’esistenza di una soglia di tossicità, cioè di un livello al di sotto del quale unasostanza non esplica il benchè minimo effetto dannoso, è uno dei più controversi dellatossicologia.

Per le sostanze genotossiche, cioè quelle che danneggiano la catena del DNA, si può ipotizzareche anche una sola molecola entrata nell’organismo potrebbe determinare un effetto negativoqualora andasse a colpire il DNA di cellule particolari (es. cellule riproduttive). Sebbene laprobabilità dell’evento sia estremamente bassa, in questo caso è difficile parlare di soglia ditossicità.


Il problema delle soglie di tossicitàIl problema delle soglie di tossicità

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Per le sostanze genotossiche, cioè quelle che danneggiano la catena del DNA, si può ipotizzareche anche una sola molecola entrata nell’organismo potrebbe determinare un effetto negativoqualora andasse a colpire il DNA di cellule particolari (es. cellule riproduttive). Sebbene laprobabilità dell’evento sia estremamente bassa, in questo caso è difficile parlare di soglia ditossicità.

Per sostanze che agiscono da micronutrienti (es. molti metalli pesanti), un certo livello diesposizione è indispensabile all’organismo. Al di sotto di questo livello si possono manifestarefenomeni di carenza, mentre fenomeni tossici si verificano solo a concentrazioni relativamentealte. Per queste sostanze è quindi certa la presenza di una soglia.

Per tutte le altre sostanze, e in particolare per le sostanze xenobiotiche,l’esistenza di una soglia è difficile da dimostrare


IL CALCOLO DELLE PNECSECONDO IL

TECHNICAL GUIDANCE DOCUMENT ON RISK ASSESSMENT (TGD)DELLA COMMISSIONE EUROPEA



ESEMPI DI CALCOLO DI PNEC


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Nel caso del rame il metodo per il calcolo della PNEC non è applicabile.

Il rame è un elemento naturale ed un nutriente essenziale.

La concentrazione di 0.03 mg/L è inferiore al background naturale(generalmente dell’ordine di pochi mg/L) ed ailivelli necessari come nutriente.

Nel caso degli elementi essenziali una possibilità è quella di applicare il concetto di “PNEC aggiunta”che rappresenta la quantità che dovrebbe essere aggiunta al background naturale per determinareeffetti negativi.

Inoltre è necessario tener conto di possibili fenomeni di adattamento determinati da elevati livelli naturali.Università degli Studi di Napoli FedericoII Master II livello REACH

TEST ECOTOSSICOLOGICI - unina.it 2013_2014... · La tipologia di test e i protocolli da seguire...

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