i

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Caracterización de la variabilidad genética e identificación de

marcadores genéticos en accesiones silvestres del Jatropha curcas

de la costa norte del Perú.

Tesis

Para optar el título Profesional de:

Licenciado en Biología

Autor

LUIS MIGUEL SERQUÉN LÓPEZ

Asesor

PEDRO CHIMOY EFFIO, Ph.D.

Lambayeque-Perú, 2010

ii

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

TESIS

(CARÁTULA)

Titulo: Caracterización de la variabilidad genética e

identificación de marcadores genéticos en

accesiones silvestres del Jatropha curcas de la

costa norte del Perú.

Autor: LUIS MIGUEL SERQUÉN LÓPEZ

Patrocinador: PEDRO CHIMOY EFFIO, Ph.D.

Co-Patrocinador: LUIS DESTÉFANO BELTRÁN, Ph.D.

Aprobado por:

……………………………….. ……………………………………

PRESIDENTE DEL JURADO MIEMBRO DEL JURADO

………………………………… ……………………………………..

MIEMBRO VOCAL JEFE CENTRO INVESTIGACIÓN

…………………………………. ………………………………….......

JEFE DEPARTAMENTO DECANO

Lambayeque,….de…………….del…...

iii

La ciencia y tecnología ayuda a construir un país con esperanza; puesta en un grupo de personas, acaso dignas, del progreso y desarrollo común. Hay mucho que hacer, ya que los avances científicos llegan tarde para muchos, justo a tiempo para pocos y temprano para nadie

Mientras más grande la prueba Más glorioso es el triunfo

AGRADECIMIENTOS

iv

Índice

A una hermosa Mujer a quien todos llaman Betty

López Vásquez -M y que tengo el gran privilegio

de decirle MAMÁ

A mi Papá Pedro, mi Hermana Jessica, y mis Sobrinos

Jonathan y Gabriel, que Junto a María Angélica me soportan y

dan vida a cambio de tiempo.

A mis amigos de la UNPRG y SJO que si comienzo a

nombrarlos temería olvidarme de un solo nombre, pero que

saben de mi respeto y estima.

Al Dr.Pedro Chimoy, Luis Destefano y Betty Millán

”Mentores”, por la confianza puesta en mi y todo su apoyo

para lograr la culminación de esta Tesis.

Financiamiento

La financiación del Proyecto de la Tesis está dada por un convenio entre la Universidad

Peruana Cayetano Heredia (UPCH) e INCAGRO mediante el subproyecto:

Caracterización de la variabilidad genética y del contenido de aceite del la semilla del

piñón blanco (Jatropha curcas L) con fines de producción de biodiesel en la costa norte y

en la región San Martín y Ucayali.

A JHWH por darme la vida y su amor;

Porque la fe ilumina la ciencia,

don del espíritu de Dios

De manera especial a: Mónica, Cecilia, Marianella, Paty,

Diana, Julio, Jerisf, Antoine, Savina, German, integrantes

del (GRU), por motivarme a seguir en todo momento y hacer

especial mi estadía en el LID-UPCH

A Giankarlos Vásquez , Ricardo Plaza Alexander

Huaman y Miguel Machahua, amigos y compañeros de

largas y entretenidas tertulias,

¡A todos ellos éxitos y bendiciones a lo largo de toda su vida!

v

I. Resumen 1

II. Introducción 2

III. Antecedentes 3

3.1 Biodiesel como fuente de energía renovable. 3

3.2 Jatropha curcas L. ―Piñón‖ 7

3.2.1 Posición taxonómica de Jatropha curcas. 9

3.2.2 Usos de Jatropha curcas L. 10

3.2.3 Toxicidad de J. curcas 10

3.2.4 Jatropha curcas como biodiesel 11

3.3 Variabilidad Genética y Caracterización de las especies vegetales 11

3.3.1 Fuentes de variabilidad genética. 12

3.3.2 Perdida de la variabilidad genética. 13

3.3.3 Polimorfismo. 14

3.3.3.1 Polimorfismo en regiones génicas codificantes. 15

3.3.3.2 Polimorfismo en regiones génicas no codificantes. 15

3.3.3.3 Polimorfismo en regiones no génicas. 16

3.4 Marcadores genéticos . 16

3.4 .1 Definición. 16

3.4.2 Clases de Marcadores genéticos. 16

3.4.3 Marcadores moleculares. 18

3.4.3.1 Ventajas de los marcadores moleculares. 18

3.4.3.2 Marcadores basados en la hibridación de sondas. 19

3.4.3.3 Marcadores basados en PCR (reacción en cadena

de la polimerasa). 19

3.4.3.4 Clasificación de los marcadores moleculares basados

en PCR. 20

3.3.4 Marcadores Inter-Secuencias Simples Repetitivas (ISSRs). 20

3.3.5 Random Amplified polimorphic DNA (RAPDS). 21

3.5 Variabilidad genética y filogenia del genero Jatropha. 22

3.6 Diversidad genética intraespecífica en J. curcas. 23

3.7 Marcadores de variedades tóxico y no tóxico de J. curcas. 24

IV. Objetivos 24

4.1 Objetivos Generales. 24

4.2 Objetivos específicos. 24

4.3 Lugar de ejecución del proyecto. 24

V. Materiales y Metodología 25

5.1 Materiales. 25

vi

5.1.1 Material biológico. 25

5.1.2 Equipos. 25

5.1.3 Reactivos. 25

5.1.4 Otros accesorios. 26

5.2 Metodología. 26

5.2.1 Colecta de las accesiones. 26

5.2.2 Extracción de ADN. 27

5.2.3 Calidad y concentración del ADN. 28

5.2.4 Selección de los individuos para el estudio. 28

5.2.5 Pre-selección de iniciadores ISSR y RAPD. 28

5.2.6 PCR con los 60 individuos del estudio. 29

5.2.6.1 Condiciones PCR – ISSR. 29

5.2.6.2 Condiciones PCR – RAPD. 29

5.2.7 Electroforesis en gel de agarosa. 30

5.2.8 Construcción de la Matriz Básica de Datos y determinación

de valores descriptivos. 30

5.2.9 Análisis Multivariado. 31

5.2.10 Validación Interna. 32

VI. Resultados 33

6.1 Colecta y conservación de los genotipos de Jatropha curcas L. 33

6.2 Extracción y Calidad de ADN. 33

6.3 Elección de los individuos. 33

6.4 Elección de los iniciadores. 35

6.5 Amplificación con los marcadores ISSR y RAPDs. 35

6.6 Análisis Multivariado. 37

6.6.1 Agrupamiento UPGMA. 37

6.6.2 Coeficiente de correlación (r). 38

VII. Discusión 39

7.1 Elección de los genotipos. 39

7.2 Condiciones del ADN y la PCR 39

7.3 Valores descriptivos de los marcadores 40

7.4 Agrupamiento 41

7.5 Validación interna 43

7.6 Análisis Poblacional 43

7.6.1 Porcentaje de loci polimórficos. 43

VIII. Conclusiones 44

IX. Recomendaciones 45

X. Referencias Bibliográficas 46

XI. Anexos 50

vii

Anexo N°1 Datos de colecta realizada en distintas localidades

de la región Lambayeque, Piura y Tumbes. 50

Anexo N° 2 Electroforesis del ADN de muestras de las regiones

Piura, Tumbes y Lambayeque. 58

Anexo N° 3 Lista de los 53 Iniciadores ISSR y 12 RAPD. 62

Anexo N° 4 Datos Binarios (presencia: 1 ó ausencia: 0) de 93 loci

(caracteres) para 60 genotipos (OTUs). 63

Anexo N° 5 Matriz de similitud de la comparación uno a uno

entre las 60 OTUs. 67

Anexo N° 6.

6.1. Fenograma UPGMA generado con los 60 individuos

usando los marcadores ISSR y el coeficiente

Simple Matching. 72

6.2. Fenograma UPGMA generado con los 60 individuos

usando los marcadores RAPD y el coeficiente

de similitud Simple Matching. 73

Anexo N° 7. 74

7.1.- Representación gráfica de la correlación entre la

Matriz de Similitud y la Matriz cofenética para

los marcadores RAPD. 74

7.2.- Representación gráfica de la correlación entre la

Matriz de Similitud y la Matriz cofenética para los

marcadores ISSR. 75

Anexo N°8. Extracción de ADN por el método cetil trimetil amonio

bromuro (CTAB). 76

LISTA DE ABREVIATURAS

viii

A Adenina

ADN Ácido desoxirribonucleico

AFLP Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (Amplified Fragment

Lenght Polymorphism)

CAPS Secuencia polimórfica amplificada y cortada. (Cut Amplified Polymorphic

Sequence)

cM centimorgan

CO2 Dióxido de carbono

CONAM Consejo Nacional del Ambiente

CTAB Bromuro de hexadeciltrimetilamonio

dATP 2’-desoxiadenosina-5’-trifosfato

dCTP 2’-desoxicitidina-5’-trifosfato

dGTP 2’-desoxiguanosina-5’-trifosfato

dTTP 2’-desoxitimidina-5’-trifosfato

dNTP 2’-desoxirribonucleósido-trifosfato

EDTA Ácido etilendiaminotetraacético

G Guanina

Gg Giga galones

GPS Sistema de Posicionamiento global (Global Positioning System)

ISSR Inter- microsatelites (Inter Simple Sequence Repeat)

MAS Selección asistida (Marker Assisted Selection)

Min Minutos

MJ Megajulio equivalente a 239 Kilo Calorias

mM Mili Molar

NOX óxidos de nitrógeno

ng Nanogramos

OTU Unidades taxonómicas operacionales (Operational taxonomic units)

PAA Poliacrilamida

pb Pares de bases

PCR Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)

PIC Índice de contenido polimórfico (Polymorphic Index Content)

PVP Polivinilpirrolidona

QTL Locus de un carácter cuantitativo

RAPD Amplificación de fragmentos de ADN usando partidores de diseño

aleatorio (Random Amplified Polymorphic DNA)

RF Frecuencia de recombinación

RFLP Polimorfismo en la longitud de fragmentos de restricción. (Restriction

Fragment Length Polymorphism)

RNA Ácido ribonucleico

RNasa RNA nucleasa

Rpm Revoluciones por minuto

SAMPL Amplificación selectiva de loci polimórficos de microsatélites. (Selective

Amplification of Microsatellite Polymorphic Loci)

SCARs Regiones amplificadas de secuencias caracterizadas (Sequence

characterized amplified region)

SNP Polimorfismo de un solo nucleótido (Single-nucleotide polymorphism)

SSR Microsatélites (Simple Sequence Repeat)

T Timina

Tris-HCl Hidrocloruro de tris(hidroximetil)-aminometano

TAE TRIS-HCl + Acido Acético Glacial + EDTA (Tris base, acetic acid and EDTA)

ix

U Unidades enzimáticas

ul Micro litros

UPGMA Sin ponderar Grupo Par Método con media aritmética (Unweighted Pair Group

Method with Arithmetic Mean)

UV Ultra violeta

GLOSARIO

x

ADN (Acido desoxirribonucleico). Base molecular de la herencia. Una molécula de ADN es

un polímero de desoxinucleótidos ordenados en una doble hélice (dos hebras) de azucares

fosfatados con bases purinas y pirimidinas proyectándose al centro. Cada hebra se mantiene

unida por enlaces fosfo diester entre los carbonos 3' y 5' de nucleótidos adyacentes. De

acuerdo al modelo de Watson y Crack, el ADN forma una doble hélice que es mantenida

unida por enlaces de hidrogeno entre pares de bases (doble enlace entre timina y adenina y

triple enlace entre citosina y guanina), por tanto cada hebra en la doble hélice es

complementaria en su secuencia.

ADN genómico. ADN que incluye toda la secuencia de nucleótidos contenida en el genoma

de un individuo. Término utilizado para referirse al ADN extraído mediante el use de

proteinasa K, detergentes (SDS) y solventes (fenol). Con este método se obtienen fragmentos

de 100 a 150 kb adecuados para la producción de genotecas mediante una digestión previa

con enzimas de restricción. A nivel práctico el ADN extraído incluirá el ADN nuclear

(cromosomal) y ADN mitocondrial.

AFLP- amplified fragment-length polymorphism. Polimorfismo de la longitud de

fragmentos amplificados. Es una variante de la técnica de la huella genética (DNA

fingerprinting) que se basa en la amplificación selectiva, mediante una reacción en cadena de

la polimerasa (PCR), de fragmentos procedentes de la digestión de un ADN genómico con un

par de enzimas de restricción.

Alelo. Cada una de las posibles formas en las que existe un gen a consecuencia de una o más

mutaciones.

Bioinformática. Informática aplicada a la recolección, al almacenamiento y al análisis de

datos biológicos

Biotecnología. Utilización de organismos vivos (usualmente microorganismos) o de algunos

de sus constituyentes (generalmente enzimas) con fines industriales; ello incluye desde las

tradicionales técnicas de fermentación industrial hasta, en los últimos tiempos, la utilización

de plantas y animales transgénicos para producir proteínas recombinadas con fines

alimentarios o terapéuticos.

Clonación de ADN. Técnica que permite que secuencias individuales de ADN en mezclas

complejas sean aisladas y copiadas permitiendo su manipulación y análisis detallado. El ADN

a clonar es recombinado con ADN de un vector e introducido en una célula hospedera donde

será copiado.

xi

Desnaturalización del ADN. Separación de las dos hebras que constituyen al ADN por

rompimiento de los enlaces de hidrogeno entre bases complementarias. El ADN se

desnaturaliza a temperaturas superiores a 90° C. Primera etapa en la PCR.

dNTPs (desoxinueleotidos). Nucleótidos cuya pentosa es una desoxirribosa y por ende son

los monómeros del ácido desoxirribonucleico (ADN).

Endogamia. Apareamiento de organismos relacionados entre si, que trae consigo un aumento

en la homocigosidad y posible expresión de genes deletéreos.

Enzima de restricción. Enzimas de origen bacteriano que cortan moléculas de ADN extraído

en sitios específicos de reconocimiento. Su nomenclatura se basa en una abreviatura de la

bacteria donde fueron aisladas, seguida por una numeración romana que da el orden

cronológico de su descubrimiento.

Extensión del ADN. Tercera etapa en la PCR. La temperatura es elevada a 72° C para

permitir que una ADN polimerasa inicie la síntesis a partir del iniciador agregando dNTPs

libres sobre la hebra que sirve de templado.

Genética. Rama de la Biología en la que se estudia la herencia y variación de los caracteres,

así coma la estructura y función del material genético (ADN).

Genética cuantitativa. Rama de la Genética en la que se analizan las características

fenotípicas que pueden ser medidas en una escala de manera continua, y que son determinadas

por la acción aditiva de múltiples genes.

Genética de poblaciones. Rama de la Genética en la que se estudia la variabilidad de las

poblaciones naturales, expresada en frecuencias genotípicas y alélicas de ciertos marcadores

moleculares, así como los mecanismos que la hacen variar en generaciones consecutivas.

Gen. Unidad hereditaria que contiene información genético (ADN) que es transcrita a ARN y

traducida a una cadena polipeptidica (proteína). En el genoma de un organismo, una secuencia

de nucleótidos a la que se le puede asignar una función especifica.

GenBank (Banco génico o genómico). Base de datos de libre acceso de secuencias

nucleotidicas y polipeptidicas, administrada por el "National Center for Biotechnology

Information" (NCBI). www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank!GenbankSearch.html

Genoma. Término utilizado para referirse a todos los genes (información genético) contenida

en un solo gameto, es decir un representativo de cada cromosoma.

Genoteca. Colección de fragmentos de ADN de una determinada especie insertados al azar en

vectores (tales como plásmidos o fagos lambda) y clonados en hospederos (ej. bacterias). La

colección debe de ser lo suficientemente grande para incluir toda la secuencia nucleotidica del

genoma.

xii

Genoteca parcial o librería subgenomica. Colección incompleta de ADN de un determinado

individuo la cual se origina al seleccionar fragmentos de ADN de un específico rango de

tamaños.

Genotipo. La constitución genética de un organismo, que estará dada por la información

heredada por ambos padres. Específicamente para un solo locus, el genotipo estará dado por

los alelos heredados por ambos padres (ver homocigoto, heterocigoto).

Haplotipo. Contracción de la expresión «genotipo haploide»; se refiere a la constitución

genética de un cromosoma individual. En el caso de organismos diploides, el haplotipo

contendrá un miembro de la pareja de alelos para cada locus. Puede referirse a un conjunto de

marcadores (p. ej., polimorfismos de un solo nucleótido − SNP) que estadísticamente están

asociados a un único cromosoma. Sabido esto, se cree que la identificación de unos cuantos

alelos de un bloque de haplotipo puede identificar de manera inequívoca el resto de loci

polimórficos de la región. Dicha información es de gran utilidad para investigar la genética de

los caracteres complejos.

Heterocigosis. Proporción de loci heterocigóticos en animales cruzados comparados con los

valores dentro de cada raza.

Heterosis. Ventaja de los animales cruzados sobre los animales de raza pura (ver sección

Razas, cruzas y VGEs de animales cruzados).

Información genómica. La información genómica se obtiene directamente de análisis de la

estructura del material genético de los animales (ADN).

Heterocigosidad. La proporción de individuos heterocigotos para un locus o en promedio

para varios loci. Es un estimador de variabilidad genética en poblaciones naturales o

domesticadas.

Heterocigosidad esperada. Proporción de organismos heterocigotos calculada a partir del

equilibrio de Hardy-Weinberg. Su cálculo implica la obtención de las frecuencias genotípicas

a partir de las frecuencias alélicas siguiendo un binomio al cuadrado (p + q)2, en donde p y q

son las frecuencias alélicas y 2pq corresponderá a la frecuencia de heterocigotos.

Heterocigosidad observada. Proporción de organismos heterocigotos calculada a partir de los

genotipos observados en una muestra poblacional.

Heterocigoto. Un individuo diploide o poliploide que ha heredado diferentes alelos en uno o

más de sus loci.

Heteroduplex. ADN de doble hebra en el cual cada cadena tiene un origen diferente y par

tanto no son completamente complementarias.

xiii

Homocigoto. Un individuo que ha heredado el mismo alelo de ambos padres para un

determinado locus.

Iniciador (del inglés Primer). Oligonucleótido (alrededor de 20 pb) de una sola hebra que se

alinea (homologa) para iniciar la replicación del ADN mediante una polimerasa. Se requieren

dos iniciadores (uno para cada hebra de ADN), los cuales flanquearan la región por

amplificar.

Loci. Plural de locus.

Locus. Lugar específico del cromosoma en el que se ubica un gene.

Mapa genético. Arreglo lineal de sitios mutables (polimórficos) sobre un cromosoma,

deducidos de experimentos de recombinación genética. Implica un ordenamiento de

marcadores y genes estableciendo distancias genéticas entre los mismos.

Marcador genético: un polimorfismo del ADN que se puede detectar fácilmente mediante

análisis fenotípico o molecular. El marcador puede hallarse dentro de un gen o en un ADN sin

función conocida. Dado que los segmentos de ADN que se encuentran próximos entre sí en

un cromosoma tienden a heredarse juntos, los marcadores se suelen utilizar como maneras

indirectas de seguir la pista del patrón de herencia de un gen que aún no se ha identificado,

pero cuya localización aproximada sí es conocida.

Marcador molecular. Genes, proteínas o fragmentos de ADN polimórficos que permiten

distinguir entre individuos, familias, poblaciones o especies.

MAS. (del inglés Marker Assisted Selection). Selección asistida por marcadores. Estrategia

para auxiliar en el mejoramiento genético seleccionando a los reproductores o progenies en

los primeros estadios de crecimiento en base a un marcador molecular que esté relacionado

con un mayor desempeño. En estos casos se eliminarán los organismos que porten marcadores

que actúen en detrimento de la producción (los mas pequeños, los menos resistentes), la

ventaja del MAS comparado con el mejoramiento tradicional es que no será necesario crecer a

los organismos para darse cuenta de si tienen buen o mal desempeño sino desde un principio

con un análisis de ADN serán seleccionados.

Microsatélite. Regiones de ADN con secuencias cortas de una a seis pares de bases (pb)

repetidas en tándem, es decir la misma secuencia una tras otra, llegando a medir toda la región

hasta 100 pb. Se analizan mediante amplificaciones por PCR, para lo cual es necesario diseñar

iniciadores flanqueantes, lo cual representa una identificaci6n previa del microsatélite en la

especie en cuestión implicando un proceso de clonación y secuenciado. También son

conocidos como SSRs (del inglés Simple Sequence Repeats), STRs (del inglés Short Tandem

xiv

Repeats) 0 VNTRs (del inglés Variable Number Tandem Repeats), esté Último término

incluyendo a los minisatélites.

Minisatelite. Los minisatelites son secuencias de 10 a 100 pb repetidas en tandem en el

genoma. El número de repeticiones normalmente es inferior a 1000, abarcando una región de

102 a 10' pb. También pueden ser referidos como VNTR (del inglés Variable Number of

Tandem Repeats). Los minisatélites usualmente son analizados al digerir el ADN con enzimas

de restricción, para posteriormente transferir a una membrana (Southern blot) y realizar una

hibridación con la sonda minisatélite marcada.

QTL: Loci de efecto cuantitativo, son genes con efectos mayores en características afectadas

por muchos loci con efectos generalmente pequeños (poligenes).

PCR (del inglés Polymerase Chain Reaction). Reacción en cadena de la polimerasa. Técnica

con la que se copian las hebras complementarias de una molécula de ADN blanco

simultáneamente a través de una serie de ciclos, que incluyen una desnaturalización del ADN,

alineamiento de iniciadores y extensión (síntesis) mediante una polimerasa (comúnmente Taq

polimerasa). 30 ciclos producirán un factor de amplificación de 100 millones. Técnica

desarrollada por Mullis y col. en 1985.

Plásmido. ADN bacteriano extracromosomal en el que se codifican genes que le confieren a

la bacteria ciertas propiedades (resistencia, fertilidad, virulencia, etc.). Mantienen una

replicación independiente al ADN cromosomal.

Población. Grupo de organismos de la misma especie que habitan una determinada área

geográfica y que por ende se entrecruzan y comparten un acervo común de genes. Ver stock.

Polimorfismo: Es la digestión de un segmento de ADN (o el genoma completo del ADNmt)

por enzimas de restricción que producen fragmentos de una longitud particular, dependiendo

de la colocación del sitio de restricción (p. ej., la enzima Msel corta todos los sitios

'TTAA').Una mutación a un sitio de restricción, impediría la digestión de la enzima y de esta

manera se generarían fragmentos de longitud diferente.

RAPD (del inglés Random Amplified Polymorphic DNA). ADN Polimórfico Amplificado al

Azar. Técnica basada en el uso de PCR, en donde un solo iniciador (de alrededor de 10 pb)

diseñado arbitrariamente puede amplificar fragmentos polimórficos de ADN flanqueados por

dos sitios complementarios de alineamiento en orientación invertida, es decir el mismo

iniciador se une a ambas hebras de ADN.

RFLPs (del ingles Restriction Fragment Length polymorphism). Polimorfismo de la

longitud de Fragmentos de Restricción. Técnica en la que originalmente se digería el ADN

genómico con enzimas de restricción para posteriormente transferir a unamembrana (Southern

xv

blotting) e hibridar con una sonda conocida (ej. minisatelite). Actualmente, existe una

variante en la que primeramente se amplifican por PCR regiones conocidas, comúnmente de

ADN mitocondrial, y posteriormente se digieren con enzimas de restricción, evaluando el

polimorfismo en cuanto al largo de los fragmentos generados.

Satélite. Grandes regiones de ADN (103 a 107 pb) con segmentos de más de 100 pb repetidos

en tándem.

Secuenciación. Establecimiento del orden de las bases nucleotidicas (secuencia) de 5' a 3' en

un fragmento de ADN de interés.

VNTR (del inglés Variable Number of Tandem Repeats). Número variable de repeticiones

en tándem. Término genérico para denotar a las secuencias repetidas en tándem de 1 a 100 pb,

incluye las regiones microsatelite y minisatelite.

1

I. Resumen La dependencia de combustibles fósiles, el aumento sostenido del precio del barril de petróleo

en el mercado internacional junto a la preocupación por los efectos del cambio climático que

ya se viene percibiendo en los últimos años ha hecho viable la propuesta de implementar el

cultivo de Jatropha curcas L. ―piñón blanco‖ en el Perú como alternativa para diversificar el

abastecimiento energético. Se propone que su cultivo contribuirá además a la recuperación de

zonas marginales, deforestadas y a la reducción de la emisión de gases con efecto

invernadero, ayudando de esa manera a mitigar el impacto del cambio climático global. Este

interés se debe a las características deseables del piñón blanco, basándose en su variabilidad

genética, que le permite resistir condiciones diversas y exigentes, sin embargo, esta cualidad,

muy probablemente se presente como dificultad cuando se desee obtener cierta uniformidad y

homogeneidad en grandes extensiones de cultivo. Para esto es necesario realizar estudios

moleculares que ayuden a establecer la situación actual de la estructura genética en las

poblaciones distribuidas en el país, identificando marcadores genéticos asociados a la calidad

del aceite del ―Piñón blanco‖, y así seleccionar genotipos específicos. La presente

investigación ha sido realizada para evaluar la medida de la variabilidad genética en un

conjunto representativo de 60 accesiones de J. curcas proveniente de la costa norte del Perú.

Como resultado se obtuvo un polimorfismo molecular de 48,35% usando 15 primers ISSR y

47,11% con 08 iniciadores RAPDs que indica niveles modestos de variabilidad genética en

las accesiones colectadas en la costa norte del Perú, también se evaluó la capacidad

informativa de estos marcadores mediante el índice de contenido polimórfico (PIC). Además

se construyó un fenograma con los datos obtenidos utilizando el coeficiente de similaridad

simple matching y el agrupamiento tipo UPGMA no encontrándose marcadores específicos

que ayuden a diferenciar las poblaciones en estudio.

2

II. Introducción El cambio climático a nivel mundial se ha visto acelerado por el incremento del efecto

invernadero, influenciado por el actual modelo energético, que es un sistema abierto, en la que

el hombre adiciona a la atmósfera elevadas cantidades de dióxido de carbono CO2 (30 mil Gg

de CO2 al año en el Perú)(CONAM 2001)debido básicamente al cambio en el uso del suelo

(principalmente por la deforestación) y a las emisiones de los combustibles fósiles,

representando el 66% de la fuente de energía primaria donde más de las ¾ partes está

sustentado por el uso de petróleo3.

Entre los años 2006-20091 el Perú importó 126.91 millones de barriles de petróleo y 24.21

millones de barriles de diesel 2 para abastecer el mercado interno, existiendo una dependencia

directa del precio del barril de petróleo en el mercado internacional75

. Esto ha llevado a un

aumento sostenido en el precio del barril de petróleo llegando a cifras record por encima de

los 140 dólares por barril en junio del 2008, manteniéndose por encima de los 80 dólares en

octubre del 201076

. Este sostenido incremento en el precio del barril de petróleo, así como el

hecho de que todos los días por 4 barriles de petróleo que se consume se descubre uno, ha

hecho viable la propuesta de producir combustibles alternativos como gasol y biodiesel para

incrementar la diversidad del abastecimiento energético, contribuyendo además a la

recuperación de zonas marginales, deforestadas y a la reducción de la emisión de gases con

efecto invernadero y mitigar así el impacto del cambio climático disminuyendo la polución

del aire en grandes ciudades afectadas por la contaminación producida por el transporte

automotor.

La producción mundial de biodiesel en el 2008 fue liderada por Alemania con una

participación del 22,2%, seguido por EE UU (18,3% del total), Francia (14,3%), Brasil (8,1%)

y Argentina (7,6%).77

En esta producción sobresalen los cultivos de soya, canola y palma

aceitera impulsados por políticas nacionales que respaldan su desarrollo. En el 2004 Brasil

autorizó la mezcla de 2% de biodiesel en el diésel convencional, la que a partir del 2008 será

obligatoria. Del mismo modo a partir del 2013, la mezcla de 5% de biodiesel en el diésel (B5)

será obligatoria.

Varios gobiernos han anunciado metas ambiciosas de producción de biodiesel en sus países,

entre los que destacan el de la India (4.500 millones de litros/año de biodiesel de piñón),

Brasil (2000 millones de litros/año de biodiesel, principalmente de palma, ricino y soya, hacia

el 2012) e Indonesia (4.700 millones de litros/año de biodiesel de palma hasta el 2025).78

En

1 Información de enero-mayo.

3

el Perú por Decreto Supremo Nº 016-2008-AG se declaró al cultivo de la higuerilla y el piñón

de interés nacional , Esto ayudará a reducir las importaciones que en el 2009 ascendieron a

469 mil barriles de biodiesel sumando US$ 52,4 millones.76

Para lograr este abastecimiento

interno y obtener una sostenibilidad en la producción de aceites vegetales para la obtención de

biodiesel es importante realizar estudios previos que permitan estimar, mantener y aumentar

la variabilidad genética del cultivo a implementar, de manera que se logren seleccionar

aquellos individuos o poblaciones más adecuados, logrando determinar en gran medida la

evolución futura de las poblaciones, su adaptación al medio y su conservación.

Bajo estos criterios, el cultivo de Jatropha curcas L. ―Piñón blanco‖ presenta grandes

ventajas debido a características deseables que se basarían en su variabilidad genética que le

permite resistir condiciones tan diversas y exigentes, como las de la costa desértica o la selva

lluviosa tropical. Sin embargo, esta cualidad, muy probablemente se presente como dificultad

cuando se desee obtener cierta uniformidad y homogeneidad en grandes extensiones de

cultivo. Para esto el Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA) ha venido desarrollando

diversos trabajos de investigación en los que se contempla la selección de germoplasma y el

manejo agronómico. Para el primero es, necesario realizar estudios moleculares que ayuden a

establecer la situación actual de la estructura genética de las poblaciones distribuidas a lo

largo del país, identificando marcadores genéticos asociados a la calidad del aceite del ―Piñón

blanco‖, y de ese modo seleccionar genotipos específicos.

Este estudio utilizó herramientas moleculares para el análisis de la variabilidad genética

natural de Jatropha curcas L. ―Piñon blanco‖ distribuidas en la costa norte del Perú, las

cuales permitirán identificar marcadores que ayuden a la conservación de su acervo genético y

su utilización en programas de mejoramiento genético escogiendo las variedades más

apropiadas para la producción de aceite a gran escala.

III. Antecedentes

3.1 Biodiesel como fuente de energía renovable.

En los últimos años el mundo se ha enfrentado a una crisis debido al agotamiento de los

recursos energéticos y al aumento de los problemas ambientales. Esta situación ha llevado a la

búsqueda de un combustible alternativo, cuya producción no sólo sea sostenible, sino también

―amigable‖ con el medio ambiente. Para los países en desarrollo, los combustibles de origen

biológico, tales como el alcohol, aceites vegetales, biomasa, biogás, combustibles sintéticos,

etc., se han convertido cada vez más en piezas importantes dentro de las estrategias

energéticas a implementar.1

4

La idea de usar aceites vegetales como combustible para los motores de combustión interna

data de 1895 cuando el Dr. Rudolf Diesel desarrollaba su motor de combustión interna. En la

presentación del motor diesel en la Exposición Mundial de París en 1900; el Ing. Diesel usó

aceite de maní como combustible. En esta presentación señaló «el uso de los aceites

vegetales como combustibles para los motores puede parecer insignificante hoy en día,

pero con el transcurso del tiempo puede ser tan importante como los derivados del petróleo y

el carbón en la actualidad» (Shay, 1993)2.citado por

3

Hoy en día con el perfeccionamiento de los motores diesel y el uso de destilados de petróleo

que poseen menor viscosidad no podría usarse aceites vegetales directamente, debido

precisamente, por su mayor viscosidad., Para solucionar este problema se usa un proceso

químico denominado transesterificación, la cual consiste en reemplazar el glicerol (alcohol

trivalente) por un alcohol monovalente («más ligero») usualmente metanol o etanol,

formando moléculas más pequeñas (ésteres monoalquílicos), a los cuales se les denomina

Biodiesel haciendo referencia a su origen biológico. Este proceso se realiza bajo la acción de

un catalizador que puede ser de origen acido o básico4.

Fig.1. Proceso de transesterificación para la producción de biodiesel. Sacado de Arpel Iica 2009

Aunque difícilmente el biodiesel pueda reemplazar totalmente al combustible diesel basado

en petróleo, hay por lo menos cinco razones que justifican su desarrollo:

1. La apertura del mercado para el exceso de aceites vegetales y grasas animales.

2. Disminuye, aunque no elimina, la dependencia del país del petróleo importado.

3. El biodiesel es renovable y no contribuye al calentamiento global debido a su cierre

del ciclo de carbono. Un análisis del ciclo de vida del biodiesel mostró que, en general

las emisiones de CO2 se redujeron en un 78% en comparación con el combustible

diesel basado en petróleo.

5

4. Las emisiones de monóxido de carbono y las emisiones de partículas del biodiesel

son más bajos que con el combustible diesel regular. Desafortunadamente, la mayoría

de las pruebas de emisiones han mostrado un ligero incremento en óxidos

de nitrógeno (NOx).

5. Cuando se añade al combustible diesel regular en una cantidad igual al 2.1%, se

puede convertir el combustible con propiedades lubricantes pobres, como el

combustible diesel ultra-moderna de bajo contenido en azufre, en un combustible

aceptable5.

Otras características importantes del biodiesel es que contiene 10-11% de oxígeno (w/w),

mejorando así el proceso de combustión en un motor. También se ha reportado que el uso de

aminas grasas y amidas terciarias pueden ser eficaces en la mejora de la calidad de ignición

del biodiesel sin tener ningún efecto negativo sobre sus propiedades de flujo en frío. Sin

embargo, persisten problemas de arranque en frío. Además, el biodiesel tiene valores bajos de

calentamiento volumétrico (alrededor del 12%), un alto índice de cetano y un alto punto de

inflamación, siendo los puntos de inflamación del biodiesel entre 15-25 °C más altas que las

del diesel (ver tabla N° 1)1.

Tabla Nº 1: Propiedades de biodiesel provenientes de diferentes fuentes vegetales1.

Ésteres metílicos de aceites

vegetales metílico (biodiesel)

La viscosidad cinemática (mm2/ s)

Cetano.

Menor poder

calorífico (MJ / kg)

Punto de

nube (°C)

El punto

de fluidez

(°C)

Punto de inflamación

(°C)

Densidad (kg / l)

Piñon 4,9252 53 47.8 0 170 0.86

Maní 4.9 54 33.6 5 - 176 0.883

soja 4.5 45 33.5 1 -7 178 0.885

Palma 5.7 62 33.5 13 - 164 0.880

Girasol 4.6 49 33.5 1 - 183 0.860

Diesel 3.06 50 43.8 - -16 76 0.855

20% de mezcla de biodiesel

3.2 51 43.2 - -16 128 0.859

Dependiendo de las condiciones climáticas y del suelo, los distintos países están buscando

diferentes tipos de aceites vegetales como sustitutos de los combustibles diesel. Por ejemplo,

el aceite de soja en los EE.UU., la colza y el girasol en Europa, el aceite de palma en el

Sudeste de Asia (principalmente Malasia e Indonesia) y el aceite de coco en las Filipinas. La

producción de semillas oleaginosas a nivel mundial y el porcentaje de recuperación de aceite

por semilla se indica en la Tabla N° 2 , lo que indica que el uso de aceites vegetales como

fuentes de biodiesel, requieren más esfuerzos para aumentar la producción de semillas

6

oleaginosas y para desarrollar nuevas especies de plantas más productivas y con alto

rendimiento de aceite.1,6

Tabla Nº 2: Producción mundial de semillas oleaginosas y porcentaje de recuperación de aceite en semilla.

Semillas oleaginosas

Producción Mundial (millones de toneladas)

% Recuperación

Soya 123.2 17 Semilla de algodón 34.3 11

Maní 19.3 40 Girasol 25.2 35 Colza 34.7 33

Sésamo 2.5 – Palma 4.8 – Copra 4.9 65 Linaza 2.6 43 Piñón 1.3 42 Níger 0.8 30

Salvado de arroz

–

15

Total 253.6 –

En Sudamérica, Brasil tienen una larga experiencia en producción de etanol a partir de caña

de azúcar para su uso como combustible alternativo a los combustibles fósiles, incluyendo el

desarrollo de motores adaptados para el uso de etanol puro. En el caso del biodiésel, en el

2004 se lanzó el Programa Nacional de Producción y Uso del Biodiésel, que busca impulsar a

este combustible como una opción para el desarrollo del agro en las zonas más pobres de ese

país. Este programa consta de un marco regulatorio, de metas físicas de uso del biodiésel, y de

una planificación de cultivos oleaginosos en todo el país. Por este motivo en el 2004 se

autorizó la mezcla de 2% de biodiésel en el diésel convencional y amparado bajo una ley, a

partir del 2008 este porcentaje de mezcla será obligatorio. Asimismo, a partir del 2013, se

promoverá la mezcla del 5% de biodiesel en el diésel (B5), destinándose como meta la

producción de 2.000 millones de litros/año de biodiesel hacia el 2012, principalmente de

palma, ricino, soya y piñón. Por su parte, el Perú estableció la mezcla obligatoria ―B2‖ en el

2009 y la del ―B5‖ a partir del 2011 por lo que se prevé una demanda nacional de biodiesel

de 215 millones de litros para el 2011 y de 250 millones para el 20167. (Ver cuadro N° 3)

Tabla Nº 3: Demanda nacional de biodiesel (en millones de litros) hasta el año 2016. Combustible (millones de

litros)

2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016

Diesel 3482.1 3540.1 3656.2 4004.4 4120.4 4294.5 4410.6 4584.7 4758.8 4874.9 4991.0

Biodiesel (2%)

80.09 82.41

Biodiesel (5%)

214.73 220.5 229.2 237.9 243.7 249.5

7

De esta manera el Perú ha puesto gran interés al cultivo de piñón para la producción de

biodiesel, impulsado particularmente por tres características de la planta que son importantes

para nuestra realidad: a) rusticidad y adaptabilidad, b) Toxicidad que le permite no competir

con otros aceites comestibles, c) Recuperación de tierras marginadas, deforestadas o utilizadas

en cultivos ilegales.

3.2 Jatropha curcas L. “Piñón”

El género Jatropha pertenece a la tribu Joannesieae de la familia Euphorbiaceae y contiene

aproximadamente 170 especies conocidas. Linneo en 1753 fue el primero en nombrar el

género Jatropha dentro de su obra "Species Plantarum", y esto sigue siendo válido hasta

hoy. El nombre del género Jatropha deriva de la palabra griega ―jatrós‖ (médico) y ―trophe‖

(alimentos), que indica los usos medicinales atribuidos8.

El piñón blanco es un árbol pequeño o arbusto grande, de hasta 5.7 m de altura, con una

madera suave y una vida útil de hasta 50 años. La planta tiene su área de distribución natural

desde México en América Central hasta Brasil, Bolivia, Perú, Argentina y Paraguay en

Sudamérica, aunque hoy en día tiene una distribución pantropical con diferentes procedencias

de semilla. La planta desarrolla una raíz pivotante profunda y en un principio cuatro raíces

laterales poco profundas 9. La raíz principal puede estabilizar el suelo contra deslizamientos

de tierra, mientras que las raíces poco profundas se distribuyen para prevenir y controlar la

erosión del suelo causada por el viento o el agua. Las hojas son lisas, con 4-6 lóbulos y de 10-

15 cm de longitud. La planta es monoica y las inflorescencias terminales contienen flores

unisexuales. La proporción de flores masculinas y flores femeninas esta en el rango de 13:01

a 29:1 10

y disminuye con la edad de la planta. Normalmente las flores de Jatropha curcas

brotan solo una vez al año durante la temporada de lluvias. En las regiones húmedas o bajo

condiciones de riego, las flores brotan de forma permanente casi todo el año. Después de la

polinización, las inflorescencias forman un racimo de frutos verdes dispuestos de manera

elipsoidal. Las semillas negruzcas de la mayoría de las procedencias contienen toxinas, como

esteres de forbol , curcina, inhibidores de tripsina, lectinas y fitatos, a niveles tales que las

semillas, el aceite y la torta de semillas no son comestibles sin una previa desintoxicación 11,12

y 13.

8

Fig.2. Partes importantes de piñón: Rama con flores (a); Corteza (b); Nervadura de la hoja (c); Pistilos de la flor

(d); Estambres de la flor (e); Corte transversal del fruto inmaduro (f); Fruto (g); Corte longitudinal del

fruto (h); semillas (i) sacado de Joachim Heller 1996.

Dependiendo de la variedad, las semillas peladas contienen un 40-60% de aceite.14 y 15

Los

productos químicos aislados de diferentes partes de la planta se muestran en la Tabla Nº4;

Estos productos químicos pueden ser utilizados en diversas aplicaciones industriales pero es

su uso tradicional ampliamente desarrollado por los pobladores donde habita esta especie

atribuyéndole desde propiedades afrodisiacas hasta anticancerígenas.79

9

Tabla Nº4: Composición química de diferentes partes de Jatropha curcas L.8

Partes de la

planta Composición química Referencias

partes aéreas Ácidos orgánicos (o y p-cumárico ácido, p-OH del ácido

benzoico, ácido protocatéquico, ácido resorsilico,

saponinas y los taninos

Hemalatha y Radhakrishnaiah

(1993)

Corteza del

tallo β-amirina, β-sitosterol y taraxerol

Mitra et al. (1970)

Hojas Triterpenos cíclicos estigmasterol, stigmast-5-en-3β, 7 β-

diol, stigmast-5-en-3β, 7α-diol, colest-5-en-3β, 7β-diol,

colest-5-en-3FL, 7α -diol, campesterol, β-sitosterol, 7-

ceto-β-sitosterol, así como el β-d-glucósido de β-

sitosterol. Los flavonoides apigenina, vitexina, isovitexin

Mitra et al. (1970), Khafagy et

al. (1977), Hufford y

Oguntimein (1987)

Las hojas también contienen el dímero de un alcohol

triterpeno (C63H117O9) y dos glucósidos flavonoidal

Khafagy et al. (1977)

Látex Curcacyclina A, un octapéptido cíclico

Van den Berg et al. (1995)

Curcina (una proteasa) Nath y Dutta (1991)

Semillas Curcina, (una lectina) Stirpe et al. (1976)

Esteres de Forbol

Adolf et al. (1984), Makkar et

al. (1997)

Esterasas (JEA) y lipasa (JEB)

Staubmann et al. (1999)

Torta de prensa

Fitatos, saponinas y un inhibidor de la tripsina

Aregheore et

al. (1997), Makkar y Becker

(1997), Wink et al. (1997)

Raíces β-sitosterol y su β-d-glucósido, marmesin, propacin, el A

y B curculathyranes y el curcusones A-D. diterpenoides

jatrophol y jatrofolona A y B, la tomentin cumarina, el-

lignanos jatrophin coumarino así como taraxerol

(Naengchomnong et al., 1986)

y (Naengchomnong et al.,

1994)

3.2.1 Posición taxonómica de Jatropha curcas.

Reino Plantae Plantas, vegetales

Subreino Tracheobionta - plantas vasculares

División Magnoliophyta Angiospermas, plantas con flores, fanerógamas.

Clase Magnoliopsida dicotiledóneas.

Subclase Rosidae

Orden Euphorbiales

Familia Euphorbiaceae - Euphorbes,

Género Jatropha L. Jatropha (jatros) médico, (trofes) alimentos.

Especies Jatropha curcas L. – Piñón blanco pagina web

10

3.2.2 Usos de Jatropha curcas L

a) En la medicina.- Los extractos de J. curcas se utilizan en remedios caseros para una

serie de desórdenes fisiológicos19

. El jugo de la hoja se utiliza como una aplicación

externa para las hemorroides, y la decocción de las hojas en la enfermedad de la

artritis y venéreas. El té de hoja se utiliza para el marasmo y la ictericia18

. El látex de

J. curcas contiene alcaloides como la jatrophine, jatropham, jatrophone y curcina la

cual se le atribuye propiedades anti-cancerígenas. El látex se utiliza también para

cubrir las llagas, úlceras y la lengua inflamada. Las semillas se utilizan para la

hidropesía, la gota, parálisis y enfermedades de la piel16

. Las raíces se utilizan en

infusiones como enjuague bucal para el sangrado de las encías y dolor de muelas.

También se han aislado compuestos antibacterianos en el tejido del tallo de J.

curcas18

. En el sur de Sudán, las semillas y los frutos se utilizan como un método

anticonceptivo17

.

b) Como fertilizante.- La torta de semilla procedente de la extracción del aceite contiene

principios tóxicos como los esteres de forbol y curcina, lo que lo hace inadecuado para

la alimentación animal. Sin embargo, las aplicaciones potenciales como fertilizante o

en la producción de biogás han sido informado.20, 21 y 22

Por ser rico en nitrógeno, la

torta de semillas es una excelente fuente de nutrientes para las plantas y también ayuda

en el mejoramiento del suelo. La aplicación de la biomasa residual exedente del

proceso de elaboración del biodiesel ha incrementado el rendimiento de muchos

cultivos demostrándose su aplicabilidad como fertilizante, además puede ser un

recurso valioso en la producción de bajo costo de muchas enzimas industriales.

c) Otros usos.- Además de su valor medicinal y como fertilizante, el aceite ha sido

utilizado para la iluminación como aceite en lámparas, y en la fabricación de jabón y

velas23

. Las nueces recogidas de una variedad mexicana que no son tóxicas se asan y

se consumen. El látex es un potente inhibidor del virus mosaico de la sandia24

, y la

corteza se utiliza como veneno para peces23

.

3.2.3 Toxicidad de J. curcas

Como ya hemos mencionado, la presencia de esteres de forbol hace a la semilla de piñón no

aptos para el consumo humano y ganado, a pesar del contenido alto en proteínas y favorable

composición de otros nutrientes25

. Los intentos para inactivar los principios tóxicos han sido

variados desde la utilización de procesos hidro-térmicos, extracción con solventes,

tratamiento con NaHCO3 y radiación ionizantes dando como resultado la reducción del

11

principio tóxico, pero estos métodos son costosos en tiempo y dinero.26

En México y América

central se reportó una variedad no tóxica de J. curcas que no contienen o sólo contienen baja

cantidad de esteres de forbol. El cultivo de variedades no tóxicas aportaría un valor añadido a

los cultivos mediante la utilización de la torta de semillas desaceitada para la alimentación

animal. Sin embargo, no hay diferencia morfológica entre las variedades tóxicas y no tóxicas.

De allí que es importante la identificación de marcadores ligados a las variedades tóxicas o no

tóxicas para la búsqueda de nuevas accesiones con características no tóxicas, esto agregaría

valor al cultivo, posibilitando su cultivo para consumo humano. 26 y 27

3.2.4 Jatropha curcas como biodiesel

La semilla de Piñón contiene un 30-40% de aceite de las cuales el 21% son ácidos grasos

saturados y el 79% son ácidos grasos insaturados. El reconocimiento de su potencialidad para

producir un biodiesel de alta calidad ha llevado a una oleada de interés en todo el mundo; más

aún, ya que debido a su toxicidad, evita el dilema "alimentos versus combustible.28, 29 y 30

Además de biodiesel, a partir de la semilla se puede obtener la torta de prensa que contiene

19.0% de proteínas, 17.0% de carbohidratos y 16.0% de fibra. La torta desaceitada es similar

al estiércol de pollo y se puede utilizar como un excelente abono orgánico.25

Su alto punto de

inflamación (160º-170°C) y el número de cetano (55-58) hace del diesel de Jatropha más

ecológico que los productos petroquímicos convencionales.28, 17

El rendimiento por hectárea

por año va desde 1,5 hasta 7,5 toneladas de semillas secas con un porcentaje de aceite de

34,4%. Partiendo de un promedio de 4,5 toneladas de semillas secas por hectárea por año, el

rendimiento es de unos 1.500 litros de aceite de piñón. Bajo estos criterios el área necesaria

para satisfacer la demanda nacional de B2 y B5 sería de 84.000 - 400.000 hectáreas con un

promedio de 144.000 hectáreas para el 2011. Siendo todo un reto que se debe asumir de

manera multisectorial para cumplir con las metas trazadas7.

3.3 Variabilidad Genética y Caracterización de las especies vegetales

La población que conforma una especie vegetal está generalmente correlacionada con la

variación que se encuentra en los factores del medio ambiente de su área de distribución

natural o de plantación en la que crece esta población32

, para ello cada especie adapta la

información contenida en el genoma de acuerdo con las necesidades de sobrevivir en su

entorno. El resultado de esta interacción adaptativa se traduce en la acumulación de la

información genética que a manera de variantes las especies van guardando entre los

miembros de su población, y que se va transmitiendo en las subsiguientes generaciones a

través del tiempo. De esta manera, aunque la población de individuos en una especie

12

comparten características comunes y se pueden cruzar entre ellos, también es cierto que en

cada uno existen muchas variantes individuales. La suma de todos los individuos con sus

respectivas variantes es de lo que se conoce como variabilidad genética de una especie, la cual

permite a dicha especie adaptarse a los cambios que se pueden presentar en su entorno32

.

Como resultado de la variabilidad producida en los procesos antes mencionados la

variabilidad genética se almacena en el genoma y pueden o no expresarse en características

que permitan ser identificadas, por lo tanto desde el punto de vista de su expresión, la

variabilidad contenida en el genoma de una especie puede ser agrupada en dos grandes clases

(1) la que se expresa en características visibles y que conforman el fenotipo, y (2) la que no se

expresa en características visibles y que en general se refiere a los procesos o productos de la

planta. Distinguir entre lo que puede o no ser expresado en forma visual es necesario para

precisar que porción de la variabilidad total de la especie se está analizando en la

caracterización. Así en la caracterización de una especie se estima la variabilidad existente en

el genoma de la población de individuos que la conforman, esas variantes se van acumulando

entre los diferentes miembros de la especie y la suma de todos los efectos de los genes y sus

variantes es lo que se denomina variabilidad genética de una especie.

Dado a las características visibles y no visibles que expresa el genoma, la caracterización

podrá medir o describir el nivel de variabilidad, utilizando diversas herramientas o métodos

estadísticos para analizar los datos resultantes de un estudio de caracterización.

La caracterización de la variabilidad detectable visualmente se pueden enfocar en las

características responsables de la morfología y la arquitectura de la planta utilizadas en la

clasificación taxonómica, las características relacionadas con aspectos de manejo agronómico

y las características que se expresan como reacción a estímulos medioambientales, este tipo

de caracterización se denomina de ―evaluación‖ y para su correcta cuantificación,

generalmente, se requieren diseños experimentales separados de la caracterización

morfológica y agronómica.33

Por otro lado la caracterización de la variabilidad no detectable visiblemente utiliza técnicas

sensibles que permiten medir y evaluar un conjunto de marcadores moleculares que reflejan la

variabilidad genética, a este tipo de caracterización se le denomina caracterización molecular.

3.3.1 Fuentes de variabilidad genética

Son diversas las causas o fuentes que pueden aumentar o disminuir la variabilidad genética las

cuales podemos resumir de la siguiente manera.

a) Fuente evolutiva.- Es producida durante los procesos evolutivos de especiación por la

que haya pasado la población, principalmente durante las etapas de aislamiento

13

reproductivo, así como a la dinámica que la especie ha tenido y sigue teniendo en

condiciones naturales. En este aspecto Ford-Lloyd y Jackson consideran que los

patrones de diversidad genética de las plantas cultivadas resultan de la interacción de

los factores como mutación, migración, recombinación, Selección y deriva genética.

En esta interacción entra a jugar un papel importante la biología reproductiva,

autógama o alógama, con sus respectivas variantes que desarrolle la especie esperando

una mayor variabilidad en las alógamas que en las autógamas34

.

b) Geográfica.- Se encarga de proporcionar características importantes como aislamiento

y distribución para crear variantes genéticas de adaptación como respuesta a

variaciones en los componentes ambientales.

c) Domesticación.- Durante el proceso de domesticación de las especies cultivadas el

hombre ha ejercido una fuerte presión de selección que ha permitido la preservación

de muchas variantes las cuales, posiblemente, hubieran desaparecido en condiciones

naturales. De la misma manera, el hombre también indujo la producción de nuevas

variantes, tanto para facilitar el manejo agronómico como para incrementar la

producción.33

3.3.2 Pérdida de la variabilidad genética

La variabilidad genética es importante porque permite a las poblaciones adaptarse a un medio

cambiante. Los individuos con ciertos alelos o ciertas combinaciones de alelos pueden poseer

precisamente aquellas características adecuadas para sobrevivir y reproducirse bajo las nuevas

condiciones. En una población, ciertos alelos pueden variar en frecuencia desde muy raros

hasta muy comunes. En las poblaciones pequeñas, las frecuencias alélicas pueden cambiar de

una generación a otra simplemente debido al azar, dependiendo de qué individuos se apareen

y produzcan descendencia, un proceso conocido como deriva genética. Cuando un alelo se

encuentra en una población con frecuencia baja tiene una probabilidad significativa de

desaparecer por azar en la siguiente generación. Para el caso teórico de una población aislada

en la que existan dos alelos por gen, Wright (1931) propuso una fórmula que expresa la

proporción de heterozigocidad (individuos que poseen los dos alelos diferentes de un mismo

gen) inicial que queda después de cada generación (H) para una población N, de adultos en

edad reproductora:

H= 1- 1/2Ne

Según esta ecuación, una población de 50 individuos retendría un 99% de su heterozigosidad

inicial al cabo de una generación debido a la perdida de alelos raros, y poseería todavía un

14

90% al cabo de 10 generaciones. En cambio una población de 10 individuos retendría tan sólo

95% de la heterozigosidad inicial al cabo de una generación y sólo el 60 % al cabo de 10

generaciones36

.

Esta fórmula demuestra que en las poblaciones pequeñas aisladas, en particular las que se

ubican en islas y paisajes fragmentados, se pueden producir pérdidas notables de variabilidad

genética. No obstante, la migración de individuos entre poblaciones y la mutación normal de

genes tienden a aumentar la variabilidad genética en una población contrarrestándose así los

efectos de la deriva genética. Basta una frecuencia baja de migración de individuos entre

poblaciones para minimizar la pérdida de la variabilidad genética asociada al pequeño tamaño

de la población.37 y 38

Es este flujo genético lo que al parecer evita la pérdida de la variabilidad

genética en poblaciones pequeñas39

y les permite adaptarse rápidamente a cambios

ambientales e incluso catastrófico. Aunque las tasa de mutación que se da en la naturaleza es

de 1 por cada 1000 y 1 por cada 10000 bases nucleotídicas por gen y generación, es suficiente

para contrarrestar la pérdida de alelos en poblaciones grandes, siendo suficientes para evitar la

deriva genética en poblaciones pequeñas de unos 100 individuos o menos.36

Hay dos tipos de variación genética que son importantes cuando se trata de poblaciones

pequeñas uno es el grado de homocigosis en los individuos en una población, es decir, la

proporción de cada uno de los loci que contienen un par de alelos homocigotos en lugar de

alelos heterocigotos y el otro es el grado de monomorfismo y polimorfismo en una población,

es decir, el número de alelos diferentes del mismo gen existente en el acervo genético de una

población. El polimorfismo puede ser particularmente importante en los loci implicados en la

respuesta a la adaptación a los cambios en el ambiente, de allí su amplio uso en el estudio de

caracterización de poblaciones.40

3.3.3 Polimorfismo

Como hemos mencionado la variabilidad genética se debe a variaciones en la secuencia del

genoma; por tanto en un sentido amplio el concepto de variabilidad genética se hace sinónimo

de polimorfismo genético.

Dentro de la cadena de ADN el polimorfismo afecta tanto a regiones codificantes del genoma

como a regiones no codificantes, en ambos casos puede consistir en la variación de un solo

par de bases del ADN o en millones de pares de bases, el primer caso se conoce como

polimorfismo de un solo nucleótido o SNP (single-nucleotide polymorphism; ―snip‖).

Cualquier variación se puede dar en células germinales o reproductoras con lo que se trasmite

a la descendencia (polimorfismo hereditario), o bien en células somaticas no reproductoras en

cuyo caso no se trasmite (polimorfismo no hereditario).41

Inicialmente la definición de

15

polimorfismo se refería a las proteínas; y luego a sus genes. Hoy en día, se debe definir como

la ―existencia simultánea en una población de genomas con distintos alelos para un locus

determinado‖.

El grado de polimorfismo en una población es tanto mayor cuanto más individuos contenga,

viene determinado por el número de alelos distintos existentes para un locus concreto y refleja

el grado de heterozigosis o proporción de individuos heterocigóticos que forman parte de la

población, lógicamente, la causa última de la existencia de polimorfismo es la mutación del

ADN. La distinción entre el uso de los términos de mutación y polimorfismo no es clara ni

unánime, pero en general se asocia el primero con situaciones excepcionales, en especial

patológicas, mientas que se habla de polimorfismo cuando la presencia de la variación

genética es razonablemente común en la población y, por tanto estable y nada o poco

perjudicial. Por convenio se dice que un locus es polimórfico cuando la variabilidad genética

afecta a más del 1% de la población42

.

3.3.3.1 Polimorfismo en regiones génicas codificantes.

Los polimorfismos en regiones codificantes reciben el nombre de «polimorfismos génicos».

Esta clase de polimorfismos pueden tener o no un efecto sobre el fenotipo. Los polimorfismos

génicos, sin efecto fenotípico, son los más comunes y son los responsables de la diversidad

genética normal entre individuos (p. ej., los polimorfismos existentes en proteínas).

Pero cuando un polimorfismo génico (es decir, que afecta a una región del ADN codificante)

da como resultado una alteración fenotípica, en la mayoría de los casos es perjudicial, ya que

puede modificar las características bioquímicas, fisiológicas e incluso morfológicas de la

célula, pudiendo originar procesos patológicos. Sólo en casos excepcionales, esta variación o

mutación puede ser beneficiosa, dando lugar a una ventaja adaptativa al individuo, siendo éste

el motor de la evolución de las especies.

Los polimorfismos con alteración del fenotipo, pero que no influyen a la susceptibilidad a

enfermedades, determinan las características diferenciales entre los individuos de una misma

especie. Los polimorfismos que generan variaciones fenotípicas pueden influir de forma leve

en la susceptibilidad a distintas enfermedades.

3.3.3.2 Polimorfismo en regiones génicas no codificantes.

Teniendo en cuenta la definición más completa del gen, se establece con un criterio funcional

existen regiones del ADN que forman parte del gen, pero no codifican su producto génico.

Tal es el caso de las regiones reguladoras (promotores), los intrones y las regiones 3’ y 5’ que

no son traducidas. Se debe considerar por ello la posibilidad de polimorfismo en estas

regiones génicas no codificantes. Evidentemente, aunque tal polimorfismo no afectara la

16

secuencia de la proteína, puede afectar su expresión, dependiendo de la función que ejerza las

secuencias no codificantes que lo sufre. Muchos polimorfismos en los intrones no tendrán

efecto alguno, y serán equivalentes al polimorfismo en las regiones no génicas, estudiado a

continuación. Otros podrán afectar al corte y empalme, resultando en un polimorfismo

proteico. Las variaciones en secuencias promotoras probablemente perturben la expresión del

gen. Por tanto, el polimorfismo en regiones génicas no codificantes pueden manifestarse o no

en un efecto fenotípico.

11.3.3.3 Polimorfismo en regiones no génicas

La mayor parte de las mutaciones del genoma ocurren en las regiones del ADN que no

codifican ningún producto, debido a su abundancia en el genoma humano y de otros

eucariotas. Por lo tanto los cambios de las bases en el ADN no tienen efecto fenotípico alguno

de esta manera no se altera la secuencia, estructura o la función de la proteína. Son, sin

embargo, polimorfismo de gran interés aplicado: principalmente, para la búsqueda de genes

relacionados con enfermedades y para la identificación genética de individuos.

La elevada cantidad de loci polimórficos que se encuentran el ADN no codificante, junto a la

falta de trascendencia funcional de sus alteraciones (que permiten que se perpetué libremente

en sucesivas generaciones), hacen que sea esta región del ADN la que más difiera de uno a

otros individuos.42

3.4 Marcadores genéticos

3.4.1 Definición

Es un fragmento de ADN, o el producto de su expresión, que presenta polimorfismo y tiene

una pauta de herencia contrastada cuyo patrón de transmisión de generación en generación

Pueden ser monitoreados, sin importar la técnica que se utilice para ser detectada. Los

marcadores se utilizan a modo de ―etiquetas‖ de una unidad genómica concreta (gen, región

cromosómica, cromosoma, complemento cromosómico) en un individuo, población o especie.

Puede ser descrito como una variante (que pueden surgir debido a la mutación o alteración en

el locus genómico) que se pueden observar.43

3.4.2 Clases de Marcadores genéticos

Los marcadores genéticos pueden dividirse en tres clases: los marcadores morfológicos, los

marcadores bioquímicos y los marcadores basados en ADN o moleculares; los dos últimos

han sido los más utilizados en estudios de mejoramiento genético forestal. Los marcadores

bioquímicos pueden ser compuestos orgánicos de los organismos (por ejemplo terpenos,

alcaloides, etc.) o bien, pueden ser proteínas (isoenzimas), las cuales son las más ampliamente

17

utilizadas en estudios de especies forestales. Los marcadores bioquímicos examinan los

productos de los genes. Este análisis puede complicarse por efectos de la expresión génica,

epistasis (interacción con otros genes) y redundancia del código genético. El surgimiento de

las enzimas de restricción y de la tecnología de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR

por sus siglas en inglés), ha permitido investigar a los organismos a través del ADN.44

a) Marcadores morfológicos

Los marcadores morfológicos son aquellos cuya expresión fenotípica es observada a

simple vista siendo generalmente asociada a caracteres como colores, formas o

dimensiones expresadas en los individuos; son caracteres influenciados por el ambiente y

por interacción génica (epistasis) por lo que es difícil diferenciar los efectos genéticos de

los efectos ambientales .Para utilizar adecuadamente estos marcadores se debe tener una

información exacta del pedigrí del organismo en estudio.

Los primeros trabajos con este tipo de marcadores fueron los realizados por mendel en

guisantes en él año 1880 y en drosophila por Morgan en 191045

, Siendo este último quien

los uso para obtener mapas.

b) Marcadores Bioquímicos

Son aquellos cuya expresión fenotípica es observada con el uso de técnicas bioquímicas

mayormente realizadas en el laboratorio por ejemplo las isoenzima, que vienen a ser

enzimas que llevan a cabo la misma función, pero tienen una diferente composición de

aminoácidos y pueden diferir en sus propiedades cinéticas. Sometidas a electroforesis y

visualizadas mediante diferentes métodos de tinción, estas bandas suministrar información

como marcadores co-dominantes. Sin embargo, las desventajas que presentan estos

marcadores son las modificaciones que sufren en los procesos post- trascripciónales, el

escaso número de isoenzimas presentes en un organismo, la necesidad de tener un tejido

fresco o debidamente conservado para obtener actividad enzimática y la poca resolución

que se obtiene.

c) Marcadores moleculares.

Son aquellos que no necesitan de expresión fenotípica, si no, usan directamente el

ADN como fuente de variabilidad y polimorfismo dentro de las poblaciones en

estudio, tienen como mayor ventaja el no estar influenciadas bajo el medio ambiente

ni epistasis, Su uso es muy extendido por sus distintas cualidades y ventajas

desarrollándose en un gran número de poblaciones en diversas especies.46

18

Tabla Nº 5 Características importantes de los diversos marcadores utilizados en la caracterización de las

especies46

Característica Proteínas Isoenzima RFLP RAPD VNTR AFLP SSR Polimorfismo Alto Bajo Bajo-alto Medio-alto Medio-alto Medio-

alto Alto

Estabilidad ambiental

Alta Moderada Alta Alta Alta Alta Alta

Número de loci Bajo Medio Alto Alto Alto Alto Alto Reproducibilidad Alta Moderada-

alta Alta Moderada-

alta Alta Alta Alta

Aplicación Rápida-barata

Rápida-barata

Lenta- cara

Rápida- cara

Intermedia Lenta- cara

Lenta- cara

RFLP: Fragmentos de restricción polimórficos

RAPD: Amplificación de ADN al azar

VNTR: Número variable de repeticiones en tandem

AFLP: Amplificación de fragmentos polimórficos

SSR: Secuencias simples repetidas

3.4.3 Marcadores moleculares.

Un marcador molecular es cualquier fenotipo molecular oriundo de la expresión de un gen

o de segmentos específicos de ADN, que pueden ser detectados y su herencia

monitoreada.45

El polimorfismo basado en proteínas ha sido de gran utilidad en las investigaciones

realizadas en plantas, pero con el desarrollo de las tecnologías basadas en ADN, la

investigación en esta área se ha visto favorecida con la disponibilidad de una mayor

cantidad de marcadores, aquellos basados en Fragmentos de Restricción Polimórficos

(RFLP) y en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Ambas técnicas han

derivado en múltiples técnicas como son la Amplificación de ADN al Azar (RAPD),

Fragmentos Polimórficos de ADN Amplificados (AFLP), minisatélites (VNTR) y

microsatélites (SSR) e inter-microsatelites (ISSR) entre otros. 47

Los avances en el campo de la biología molecular proporciona muchas herramientas para

estudiar la diversidad genética en el genoma con el fin de investigar las relaciones

filogenéticas entre diferentes especies. Herramientas moleculares basadas en el análisis

del ADN son ideales para la caracterización del germoplasma y estudios filogenéticos.

En los años recientes el uso de marcadores moleculares ha facilitado significativamente el

análisis genético, ya que ha sido posible mapear un grupo de genes relacionados a control

de caracteres cuantitativos.

19

3.4.3.1 Ventajas de los marcadores moleculares

La característica que hacen del uso de los marcadores moleculares más conveniente que el

de los marcadores morfológicos son los siguientes:

a) Neutralidad fenotípica: A diferencia de los marcadores morfológicos, la marcadores

moleculares no presentan influencia fenotípica, esto significa que la interacción entre

el medio ambiente y las regiones de ADN, empleadas como marcadores, es nula, ya

que ésta no son codificantes. Se puede hacer el estudio del fenotipo sin interferencia

alguna de locus marcador.

b) Polimorfismo: Esta característica es muy importante, ya que depende directamente de

la variación alélica del marcador, recombinación genética, mutaciones puntuales,

insertos/delecciones (indel), entre otros; además los métodos para detectar el

polimorfismo en los marcadores moleculares son más sensibles y objetivos que los

empleados para marcadores morfológicos

c) Abundancia: Esta referida a la ocurrencia de variaciones alélica, en los marcadores

moleculares, a lo largo de todo del genoma de una especie. Teóricamente es posible

cubrir todo el genoma en detectar todos los poligenes de una especie.

d) Co dominancia: En cualquier generación segregante se puede detectar los diferentes

alelos de un mismo loci sin importar el carácter dominante o recesivo que este posea.

La mayoría de estos marcadores moleculares son de naturaleza co-dominante.45

3.4.3.2 Marcadores basados en la hibridación de sondas.

Utiliza sondas marcadas que se unen a regiones especificas en fragmentos productos de

enzimas de restricción; por ejemplo tenemos los RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism), polimorfismo en la longitud de los fragmentos de Restricción, se basan en la

hibridación diferencial de una sonda como una muestra de ADN genómico digerida con una

enzima de Restricción, la cual reconoce secuencias nucleotidicas específicas (sitios de

Restricción)

El Procedimiento es el siguiente: Los fragmentos de ADN digeridos con una enzima de

Restricción son separados mediante electroforesis en un gel de Agarosa y luego transferidos a

un soporte solido, el cual puede ser una membrana de nylon o de nitrocelulosa (southern

blotting). El ADN es fijado en la membrana por acción de luz UV o calor y luego hibridizado

por una sonda de ADN marcada con un isótopo radiactivo o con una sustancia

quimioluminicente luego la detección de las bandas RFLP se puede hacer mediante auto

radiografía o quimioluminicencia.

20

Los RFLP son marcadores de naturaleza co-dominante, es decir, pueden observarse a los dos

alelos del marcador cuando están presentes en un individuo heterocigoto.48

3.4.3.3 Marcadores basados en PCR (reacción en cadena de la polimerasa)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), desarrollada por Faloona y Mullis, (1987), es

un método enzimático que permite generar millones de copias de fragmentos de ADN a partir

de unas pocas copias. Este procedimiento costa de tres etapas:

a) Denaturación del ADN: Ruptura de los enlaces de hidrógeno que mantienen la

estructura de doble hélice del ADN a altas temperaturas (92-95)ºC

b) Alineamiento o apareamiento de los iniciadores: Apareamiento de los iniciadores

con un fragmento de ADN cuya secuencia es complementaria a (35-68)ºC, dicha

temperatura es crítica.

c) La extensión de las cadenas de ADN: Elongación de la cadena de ADN resultante

del apareamiento del iniciador, añadiendo nucleotididos al extremo 3’ mediante la

acción de una ADN polimerasa resistente a altas temperaturas. La cantidad de ADN

molde se duplica luego de cada ciclo, es decir, luego de 35 ciclo de PCR se obtendrán

235 copias del molde del ADN original.49

3.4.3.4 Clasificación de los marcadores moleculares basados en PCR

En los últimos años, una variedad de técnicas basadas en el ADN (por ejemplo, RAPD,

AFLP, SSR y CAPS, entre otros) se vienen desarrollando para estudiar la variación genética

en diferentes especies (Strofar, 1996). Las cuales podemos clasificar en:

a) Técnicas basadas en PCR que usan iniciadores arbitrarios o amplifican multi-

locus: Tienen la característica de no necesitar mayor información de la secuencia del

genoma en la que se está investigándose. Se puede mencionar a los RAPDs (Random

Amplified Polymorphic DNA que presentan iniciadores arbitrarios; AFLPs (Amplified

Fragment Lengh Polymorphism), los ISSR que utilizan microsatélites como

iniciadores para amplificar las secuencias que se encuentran flanqueadas por estos

microsatélites.

b) Técnicas Basadas en PCR de secuencia específica: La cual es necesario el

conocimiento de las zonas flanqueantes para la obtención de los iniciadores, dentro de

estos tenemos a los CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence), los

microsatélites (SSR) y los SCAR (sequence characterized amplified regions).50 y 51

21

3.3.4 Marcadores Inter-Secuencias Simples Repetitivas (ISSRs)

Los marcadores ISSR es una técnica basada que utiliza el PCR mediante cebadores de

secuencias repetitivas no específicos (GCAGCAGCAGCAn) y con uno a tres nucleótidos

adiciones en el extremo 5' o 3' que anclan a uno de los extremos de las regiones inter-SSR.

Los ISSR son altamente polimórficos, determinan la diversidad genética y pueden ser

utilizados en trabajos de huella digital en individuos dentro de una población.52

Para los

estudios de población, los marcadores ISSR presentan de 3 a 5 veces mayor variabilidad que

los RAPDs y están disponibles para todos los grupos de plantas independientemente de la

disponibilidad previa de las secuencias del genoma.53

Además, los iniciadores ISSRs en

comparación con los RAPDs, permiten temperaturas más estrictas, que proporcionan una

mayor reproducibilidad de las bandas.

El procedimiento fue aplicado por primera vez en hongos55

, luego en animales.54

Utilizándose

para encontrar polimorfismo. El método proporciona resultados altamente reproducibles y

genera abundantes polimorfismos en muchos sistemas. Los amplicones son de tamaños

diferentes, desde los 100 pb hasta los 4000 pb; los productos de PCR ser observados en gel de

agarosa teñidos con bromuro de etidio56, 57

; en gel de poliacrilamida empleando tinción de

plata, o usando la detección isotópica.58

y 59

Figura 3. Amplificación con un iniciador (CA)n anclado en el extremo 5’con tres nucleótidos extras. Se

amplifica el segmento intermedio entre dos secuencias de microsatélite en orientación invertida.60

22

3.3.5 Random Amplified polimorphic DNA (RAPDS)

ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) son marcadores que provienen de la

modificación de la técnica de PCR convencional utilizando ―iniciadores‖ de secuencias

arbitrarias las cuales facilitan y aceleran los estudios de organismos de secuencias

desconocidas, combinando la utilización de un solo primer en vez de un par de iniciadores y

el corto tamaño que este posee (8 a 10 nucleotidos de longitud) siendo su secuencia blanco

desconocida.

Para que se genere un fragmento RAPD es necesario que las dos hebras del ADN en estudio

presenten sitios de hibridación con el oligonucleótido en orientaciones opuestas

suficientemente cercanas (menos de 3000bp) como para permitir la amplificación. La

secuencia del oligonucleótido es aleatoria al igual que los sitios de hibridación, por lo que la

secuencia amplificada es desconocida. El polimorfismo que se observa entre distintos

individuos consiste en la presencia o ausencia de fragmentos de ADN amplificado.

Como producto de esta amplificación se obtienen bandas de diferentes tamaños que son

visualizados en gel de electroforesis ya sea teñidos con bromuro de etidio en gel de agarosa y

en presencia de luz UV, o con tinción en nitrato de plata en gel de poliacrilamida de mas alta

resolución. La usencia de banda puede indicar una mutación puntual que evita el

apareamiento del primer observándose de esta manera polimorfismo en la población.61 y 62

3.5 Variabilidad genética y filogenia del genero Jatropha

Estudios limitados se han llevado a cabo sobre la diversidad genética y filogenia del género

Jatropha. Puangpaka y Thaya (2003)64

estudiaron el núcleo de cinco especies de Jatropha

mediante la tinción de los cromosomas de microsporocitos, e informó, que la mayoría de las

especies tenían un número cromosómico de 2n = 22. Este estudio también señalo que J. auras

y J. multifida fueron cromosómicamente similares.

La cariología de J. gossypifolia se determina a partir de las primeras células en anafase

observándose en los cromosomas separados una distribución 11:11. Así, según Puangpaka y

Thaya (2003)63

, J.curcas, J. ultifida, y J. gossypifolia parecen estar estrechamente

relacionados entre sí, en función de su configuración meiótica y la similitud

morfológica. Carvalho et al. (2008)65

estudiaron el tamaño del genoma, composición de bases

nucleotidicas y el cariotipo de J. curcas. Los resultados mostraron que el valor 2C del

genoma J. curcas fue de 0,85 pg, con una composición de bases GC promedio del 38,7%. El

cariotipo de J. curcas está formado por 22 cromosomas metacéntricos y submetacéntricos

relativamente pequeñas, cuyo tamaño varía desde 1,71 hasta 1,24 um. Con base en estudios

23

citológicos e isoenzima peroxidasa, Prabakaran y Sujatha (1999)66

informó que J. tanjorensis

es un híbrido natural interespecífico de J. curcas y J. gossypifolia.

La diversidad genética y el análisis filogenético usando RAPD, AFLP y análisis nrDNA ITS

sugirió divergencia genética interespecífica de 97,74% (RAPD), 97,25% (AFLP) y 0.419 por

nrDNA ITS secuencias67

. Arboles filogenéticos construidos usando RAPD, AFLP y datos de

secuencias nrDNA ITS apoyó la mayor similitud genética entre J. curcas y J. integerrima. La

distribución geográfica de J. glandulifera es más amplia, y esta tiene morfológicamente rasgos

distintivos que separan clados mayores y menores. La afirmación de que J. tanjorensises es

un híbrido espontáneo entre J. curcas y J. gossypifolia66

no pudo ser apoyado por datos

moleculares67

. El análisis RAPD reveló que la diversidad genética entre las diferentes

especies de Jatropha es 80,2%, y confirmó la distinción con J. glandulifera. Tambien se

reporto un conjunto de marcadores RAPD podrían ser utilizados para identificar las especies

de Jatropha de cualquier población mixta y para la caracterización de hibridos

intraespecificos. 68

3.6 Diversidad genética intraespecífica en J. curcas

Los ensayos sistemáticos para la evaluación de la procedencia de J. curcas son

limitados. Accesiones provenientes de Nicaragua y Cabo Verde provenientes de diferentes

sitios en el norte de Nicaragua demostró que el genotipo de Nicaragua tiene menos ramas,

hojas más grandes y semillas de mayor tamaño, mientras que la que proviene de Cabo Verde

presenta un alto rendimiento de semilla. En el germoplasma de Nicaragua se observó una

planta macho estéril que produce más fruto que otros tipos de hermafroditas.30

La evaluación

en el rendimiento de 13 accesiones provenientes de distintos localidades de Senegal y Cabo

Verde se observaron diferencias significativas en el crecimiento vegetativo.

Los estudios genéticos similitud de las variedades tóxicas y no tóxicas mediante RAPD indicó

96.3% de similaridad.26

En otro estudio, se reportó 84,91% y 83,59% de similitud usando

RAPD y AFLP, respectivamente63

. Estudios de inter e intrapoblaciones usando RAPD junto a

ISSR (inter secuencias simples repetitivas) donde se analizo 42 accesiones de germoplasmas

de J. curcas recogidos en diferentes regiones de la India, junto con un genotipo no tóxico de

México mostró un 42% y 37,4% de polimorfismos usando RAPD e ISSR, respectivamente. 26

Ganesh Ram et al. (2008) caracterizo cinco accesiones de una región usando 18 cebadores

RAPD68

, y Ranade et al. (2008) analizaron 22 accesiones de seis regiones usando 7 RAPD y

cuatro ―Dirigida amplificación de minisatelites de ADN‖ (DAMD) iniciadores69

. Marcadores

24

específicos para poblaciones se aislaron26

, utilizando marcadores SCAR que permiten la

identificación de poblaciones particulares mediante PCR de un solo paso. Análisis de la

diversidad intraespecífica mediante RAPD y AFLP de J. curcas recogidos de diferentes

regiones geográficas de la India indicó la existencia de baja diversidad genética, el análisis de

microsatélites dentro de una población local de J. curcas mostró un muy bajo equilibrio

Hardy-Weinberg.27

3.7 Marcadores de variedades tóxico y no tóxico de J. curcas

Una variedad no toxica de Jatropha curcas proveniente de México fue reportado, en la que

sus semillas pueden utilizarse para el consumo humano después de la torrefacción. El cultivo

de variedades no tóxicas podría proporcionar aceite para el biodiesel y la torta de semilla

servir como alimento para el ganado, y así dar valor agregado a la cosecha. No hubo

diferencias significativas morfológicas, cualitativas ni cuantitativas observadas entre

variedades tóxicas y no tóxicas, excepto por el contenido de éster de forbol.70

Los marcadores

moleculares específicos de variedades tóxicas y no tóxicas, se identificaron utilizando los

iniciadores selectivos en una única reacción de PCR utilizando las técnicas de RAPD y

AFLP. Los iniciadores IDT E-18 y OPL14, y la combinación de cebadores AFLP selectiva

E-ACC/M-CAC resultaron marcadores polimórficos para ambas variedades tóxicas y no

tóxicas. Nuevos marcadores microsatélites también fueron probados por su polimorfismo en

las variedades tóxicas y no tóxicas, y 7 de los 12 marcadores a conseguido demostrar

polimorfismo.27

Marcadores SCAR aislados confirman la especificidad y reproducibilidad en

la discriminación de genotipos tóxicos y no tóxicos.26

Estos marcadores específicos para

distinguir variedades no tóxicos a partir de variedades tóxicas de Jatropha curcas podrán ser

utilizados en la selección asistida por marcadores (MAS), análisis de caracteres cuantitativos

(QTL) y otros estudios de mejoramiento asistido con marcadores moleculares.17

IV. Objetivos 4.1 Objetivos Generales:

Caracterizar la variabilidad genética del piñón blanco, J. curcas, en la costa norte del Perú.

4.2 Objetivos específicos:

Colectar accesiones de J. curcas en la costa norte (Tumbes, Piura y Lambayeque)

Identificar marcadores genéticos que permitan diferenciar a las distintas poblaciones

naturales de J. curcas presentes en la costa norte.

25

4.3 Lugar de ejecución del proyecto: La investigación se ejecutó en la Universidad

Peruana Cayetano Heredia, en la Unidad de Genómica ubicada en la Facultad de Ciencias y

Filosofía.

V. Materiales y método 5.1 Materiales

5.1.1 Material biológico

Muestras foliares de Jatropha curcas L., extrayendo las hojas jóvenes ubicadas en los

ápices de las ramas y que no presenten daños mecánicos ni causados por insectos.

5.2 Metodología

5.2.1 Colecta de las accesiones

Las poblaciones que se utilizaron para realizar este estudio se localizan en la costa norte del

Perú en los departamentos de Piura, Tumbes y Lambayeque. De cada población se colecto

tejido foliar de 50 individuos distribuidos en 5 localidades para la región Tumbes, 100

individuos distribuidos en 10 localidades para la región Piura y 50 individuos provenientes de

4 localidades de la región Lambayeque, se tomó en cuenta que las accesiones colectadas estén

a una distancia mínima de 100 m entre ellas, los puntos fueron georeferenciados con la ayuda

de un GPS (Garmin). Se tomó de cada planta las hojas más jóvenes, evitando que estén

maltratadas ya sea por daños mecánicos o causados por insectos, virus u otros. Se colocaron

las hojas frescas en un sobre rotulado y luego se introdujo en una bolsa ziploc conteniendo

silica gel para deshidratar rápidamente la muestra y evitar la acción de polifenoles que puedan

dañar el ADN de la muestra. Se realizó el mismo procedimiento para cada muestra colectada

en las distintas localidades.

26

Figura 4. Mapa de la distribución geográfica de las poblaciones analizadas de J. curcas L.

5.2.2 Extracción de ADN

La extracción de DNA se basó en una modificación al método de Doyle y Doyle (1987).74

Se

pesó la cantidad aproximada de 100 mg de tejido (completamente deshidratados con silica

gel) para cada una de las muestras. Cada una de éstas se colocaron en un microtubo nuevo y

estéril de 2ml se lisaron las paredes celulares por medio de la pulverización con nitrógeno

líquido en un mortero y la adición de buffers de extracción CTAB 2X con mercaptoetanol al

2% y CTAB 10X que sirven como detergentes para solubilizar la membrana y eliminar

azúcares, también se añade RNAsa para digerir al RNA. Con la adición de cloroformo-octanol

se eliminan restos celulares, compuestos fenólicos y otras moléculas que permanezcan en

solución; posteriormente el ADN es precipitado con la adición de isopropanol frío, seguido de

una limpieza con etanol al 70% y finalmente es re-hidratado en agua ultra pura añadiendo

200 ul por cada muestra. Además se agregó PVP (polivinil pirrolidona) para evitar aún más la

acción de polifenoles que puedan dañar la calidad del ADN de la muestra. (Para ver

detalladamente el protocolo de extracción ver anexo N°8).

27

5.2.3 Calidad y concentración del ADN

La evaluación de la calidad e integridad del ADN se llevó a cabo mediante electroforesis en

gel de agarosa cuya concentración fue de 1% en buffer TAE. Se diluyo la agarosa en buffer

TAE para luego colocarlo al microondas hasta casi hervir, se dejó enfriar hasta

aproximadamente 60°C y luego se agregaron 2 μl de bromuro de etidio (2mg/ml) para 100 ml

de buffer. Se vertió en un molde con los peines esperando hasta que gelifique; el gel listo fue

colocado en la cámara de electroforesis conteniendo buffer TAE 1X. En los pocillos del gel se

cargaron 2 μl de la muestra previamente mezclados con 8 μl de buffer de carga. Se utilizó un

ADN control y las muestras de los genotipos se corrieron por duplicado. Se aplicó corriente a

80 voltios por una hora, transcurrido este tiempo se visualizó y capturó la imagen del ADN

con la ayuda de un fotodocumentador Fotodine ®.

La concentración fue determinado usando 3ul de muestra mediante un espectrofotómetro

Nanodroop® el mismo que proporcionó directamente la relación A 260 /A 280 (tasa de

absorbancias a 260 nm sobre 280 nm), proporcionando directamente la concentración de la

muestra (ng/μl).

5.2.4 Selección de los individuos para el estudio.

De los 200 individuos colectados en los departamentos de Piura Tumbes y Lambayeque

(Anexo Nº1) se escogieron 3 individuos por cada localidad obteniéndose de esta manera 15

individuos provenientes de 5 localidades de la región tumbes, 30 individuos provenientes de

10 localidades de la región Piura y 15 individuos provenientes de 4 localidades de la región

Lambayeque las cuales fueron seleccionados de acuerdo a la uniformidad de la calidad

concentración y distribución geográfica de la colecta realizada.

5.2.5 Pre-selección de iniciadores ISSR y RAPD

Con la finalidad de elegir los iniciadores que proporcionen una mejor respuesta en términos

de amplificación de bandas nítidas y polimórficas; se realizó una preselección de un total de

53 iniciador evaluados los cuales 15 iniciadores amplificaron con ADN genómico de Jatropha

curcas utilizando las temperaturas trabajadas por Basha et al. 2007 (comunicación personal).

Además se seleccionaron 08 iniciadores RAPD (Tabla Nº 7). Se amplificaron los ADN de 3

accesiones de piñón, cada uno con su duplicado de ADN aislado independientemente (réplica

biológica).

28

5.2.6 PCR con los 60 individuos del estudio

A partir de los resultados de la pre-selección del apartado anterior, se seleccionó un grupo de

iniciadores con los cuales se realizó la amplificación del ADN de las 60 accesiones

(previamente aisladas y purificadas)

5.2.6.1 Condiciones PCR – ISSR

Para realizar las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), se procedieron a diluir las

muestras de ADN hasta una concentración de 10 ng/μl. Se llevó a cabo en un volumen final

de 10 μl, usando las siguientes cantidades por tubo de reacción: 20 ng de ADN; 1X PCR

buffer (10 mM Tris pH 9.0, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2); 0.2 mM dNTPs; 2 mM MgCl2;

0.4 μM iniciador y 0.5 U Taq polimerasa tabla Nº6. Las reacciones se llevaron a cabo en un

termociclador My Cycler (BIO RAD®). El programa de amplificación se muestra

esquemáticamente en la Figura Nº5.

Fig.5. Programa de temperatura ingresada en el termociclador My Cycler (BIO RAD).

5.2.6.2 Condiciones PCR – RAPD

Las amplificación de los marcadores RAPD fueron realizados mediante el método de

Williams et al. 1990 descrito en el trabajo de Basha 2007. La cual se realizó en un volumen

final de 10 ul, conteniendo 2.5 ng de ADN, 1X PCR buffer (10 mM Tris pH 9.0, 50 mM KCl,

1.5 mM MgCl2), 100 uM de cada uno de los dNTPs, 0.4 uM del iniciador RAPD y 0.5 U de

Taq polimerasa. Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador My Cycler (BIO

RAD®), con una denaturación inicial de 94ºC durante 3 min seguido por 45 ciclos de 94ºC por

45s, 36ºC durante 30 s y 72ºC por 2 min con una extensión final de 72ºC por 7 min.

29

5.2.7 Electroforesis en gel de agarosa

Los productos que se obtuvieron del PCR con los diferentes iniciadores fueron separados por

medio de electroforesis en geles de agarosa al 2%, utilizando TAE 1X como buffer de corrida,

los geles se tiñeron con bromuro de etidio para poder ser visualizados bajo luz ultravioleta.

En cada corrida de los geles se colocó además de los individuos un marcador de peso

molecular (ladder) de 100 pares de bases marca Invitrogen de 250 µg (1.0 µg/µl) con el

objetivo de poder calcular el tamaño (en pares de bases) de los diferentes loci amplificados.

Cada gel fue fotografiado con un fotodocumentador FOTODINE® y las imágenes fueron

digitalizadas usando el programa FOTODINE 3.0.

5.2.8 Análisis Diversidad de la población.

Para un análisis real de la diversidad se tiene que tomar en cuenta el número de alelos

detectados y la frecuencia que estos presenten, por consiguiente un población que presente

un alto grado de diversidad será aquella donde la presencia y ausencia de alelos se

distribuyan equitativamente, es decir que la población presente un gran número de alelos de

frecuencias similares.

Construcción de la Matriz Básica de Datos

Se procedió a realizar la lectura de manera manual; esto es, identificando los patrones de los

diferentes loci amplificados y ordenándolos de acuerdo al tamaño en pares de bases que estos

presentaron y así poder armar una matriz con valores binarios de presencia (1) y ausencia (0)

de bandas para cada individuo y para cada iniciador. A los fragmentos con amplificación

tenue, se les asignó un valor de 9, consignándolos como datos perdidos o missing data. Esta

información de bandas se ingresó en hojas de cálculo de Microsoft Excel 97-2003 (Anexo Nº

4). En esta misma hoja de cálculo, se determinó el porcentaje de datos perdidos por cada

locus ingresado.71

Determinación de valores descriptivos.

Se calcularon las frecuencias de presencias (p) para cada loci. Se dividió la cantidad de

fragmentos amplificados (1) entre el total de individuos sin considerar los datos perdidos. La

frecuencia de ausencias (q) se obtuvo restando 1 menos el valor de p. Los loci con una

frecuencia de presencia de banda (p) menores a 0.05 se consideraron alelos raros. Los loci

con una frecuencia de presencia de banda (p) mayor e igual a 0.95 son considerados

monomórficos. Para conocer la utilidad de los marcadores moleculares, se cuentan con tres

medidas: riqueza de alelos, Polymorphic Index Content (PIC) y el poder discriminatorio de

los marcadores. Para este trabajo se calculó el PIC para cada locus con la siguiente fórmula72

:

30

fi: frecuencia de banda del i-ésimo alelo.

p: frecuencia de presencia de banda.

q: frecuencia de ausencia de banda.

Finalmente, se sumaron todos los valores PIC para cada iniciador ISSR, generando sus

respectivos índices informativos ISSR.

5.2.9 Análisis Multivariado

Con la finalidad de entender la diversidad molecular entre todos los miembros de la colección

estudiada se realizó un análisis multivariado de 93 loci (caracteres) y 60 OTUs (taxa),

ordenados en una ―matriz básica‖, siendo las filas los loci y las columnas las OTUs (Anexo

N° 5). Se utilizó el paquete estadístico NTSYS v2.1p (Rohlf, 2000). Mediante este software se

realizaron tres análisis: agrupamiento por UPGMA. En primer lugar, se calculó la similitud

entre cada par de genotipos usando los métodos para calcular la diversidad basada en

diferencias cualitativas.

Gracias a esto se logra la construcción de una ―Matriz de Similitud‖. En la comparación de

OTU i vs. OTU j, se pueden dar las siguientes cuatro posibilidades (Crisci y López, 1983) citado

en 60: coincidencia del carácter presencia (1,1) en ambos genotipos, presencia en el genotipo i y

no en el j (1,0); ausencia en el genotipo i y no en el j (0,1) y coincidencia de ausencias en

ambos genotipos (0,0). Esto se resume en la siguiente matriz:

Fig. Nº 6. Representación de los valores entre dos OTUs en la construcción de la matriz de similitud

Para obtener la matriz de similitud se recurren a diferentes coeficientes de asociación (o

coeficientes de similitud), que expresan de manera cuantitativa el parecido entre distintas

OTUs, existen varios coeficientes de similitud (Jaccard, Dice, Simple Matching, entre otros),

que permiten calcular las similitudes o las diferencias a través de operaciones matemáticas.

(Crisci y López, 1983; Rohlf, 2000).

SM o Simple matching: (a+d)/(a+b+c+d).

DICE: 2a/(2a+b+c) (Dice (1945), Nei and Li, 1979).

JACCARD: a /(a+b+c), Jaccard (1908).

31

Estos coeficientes pueden variar entre un valor mínimo de 0 (cuando el par de individuos no

tienen bandas en común) y un valor máximo de 1 (cuando todas las bandas presentes en un

individuo están presentes en el otro). Dependiendo de cuál de estos coeficientes se utilice se

acentúan distintos aspectos de la similitud, se ordenaron estas comparaciones uno a uno entre

las OTUs, y se generó una Matriz de Similitud (Anexo Nº 5). Obtenida ésta, se llevó a cabo

un agrupamiento UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Arithmetic Averages), que

es un algoritmo jerárquico que agrupa a los taxones en grupos similares, teniendo en cuenta

las distancias geométricas entre OTUs. El resultado de este procedimiento se grafica en un

dendograma o árbol fenético. Se dibujaron dos árboles, utilizando el coeficiente de asociación

Simple matching (SM) para cada uno de los tipos de marcadores ISSR y RAPD.

5.2.10 Validación Interna.

Con la finalidad de comprobar la independencia de la matriz y el nivel de confianza,

se realizó una validación interna, mediante la elaboración de las matrices de distancia y

cofenética, El método de ligamiento que se emplea para agrupar los individuos puede generar

distorsiones en el fenograma respecto de los datos de similitud originales. La cuantificación

de dicha distorsión se realiza mediante el cálculo de un coeficiente de correlación denominado

―cofenético‖, que consiste en correlacionar la Matriz de similitud original con una Matriz

cofenética, que surge de las similitudes observadas entre los pares de individuos comparados,

en este caso, a partir de los datos del fenograma. Así se determinó el coeficiente de

correlación cofenética o de Mantel (r). Esta es conocida como Prueba de Mantel.73

32

VI. Resultados

6.1 Colecta y conservación de los genotipos de Jatropha curcas L.

Se colectaron 200 nuestras provenientes de 20 localidades a lo largo de la costa norte del Perú

en los departamentos de Lambayeque Piura y Tumbes, entre los 3º 31´48.90´´ hasta los 6º

51´22.50´´ latitud sur y entre los 80º 44´ 12.20´´ hasta los 79º 39´ 46.10´´ longitud oeste.

Los puntos geográficos y las localidades donde se realizaron las colectas se observan en el

anexo Nº 1 donde también detallan las localidades por departamento.

En los tres departamentos donde se realizaron las colectas, las accesiones fueron encontradas

mayormente en los cercos de cultivos como plátano, arroz, Maíz, Algodón, entre otros; junto

a canales y acequias. No lográndose encontrar genotipos ―silvestres‖ en ninguna de las

localidades visitadas.

6.2 Extracción y Calidad de ADN

La extracción de ADN que se basó en una modificación al método de Doyle y Doyle (1987),

proporciono los resultados que se ven en el anexo N° 8 en la que se observan los valores de la

concentración de ADN en ng/ul de las 200 muestras extraídas provenientes de los

departamentos de Piura, Tumbes y Lambayeque, la calidad del ADN extraído se determinó

mediante corrida electroforética del ADN extraído previamente teñido con bromuro de etidio

utilizando un marcador de peso molecular en la que se determino la presencia y degradación

del ADN extraído (ver Anexo N 2). Se observo que los valores varían desde 78.2 hasta los

3740 ng/ul en su concentración, además se encontró presencia de acido ribonucleico ARN el

cual se degrado utilizando enzima ribonucleasa. La digestión con esta enzima se realizó

posteriormente de la purificación con todas las 200 muestras de ADN, y se comprobó su

efectividad mediante corridas electroforéticas.

6.3 Elección de los individuos

De las 200 muestras colectadas en los departamentos de Piura Tumbes y Lambayeque Se

seleccionaron 3 individuos por cada localidad donde se realizaron las colectas, obteniéndose

60 individuos como se muestra en la tabla N° 6. Estos individuos serán empleados para los

estudios moleculares planteados en este trabajo.

33

Tabla Nº 6. Genotipos seleccionados para el estudio con los marcadores ISSR y RAPD.

Individuos seleccionados departamento de Lambayeque

Individuos seleccionados departamento de Piura

N° Código Localidad

N° Código Localidad

1 L1-1 Túcume

16 P3-3 Sullana

2 L9-5 Túcume

17 P7-7 Sullana

3 L14-10 Olmos

18 P8-8 Sullana

4 L15-11 Olmos

19 P13-13 Sullana

5 L16-12 Olmos

20 P16-16 Sullana

6 L21-17 Olmos

21 P19-19 Sullana

7 L31-23 Motupe

22 P22-22 Sullana

8 L34-25 Motupe

23 P29-29 Sullana

9 L36-27 Motupe

24 P30-30 Sullana

10 L39-29 Motupe

25 P34-34 Buenos Aires

11 L46-36 Motupe

26 P36-35 Buenos Aires

12 L47-37 Motupe

27 P40-39 Buenos Aires

13 L57-45 Reque

28 P43-42 Morropón

14 L58-46 Reque

29 P48-47 Morropón

15 L60-48 Reque

30 P49-48 Morropón

Individuos seleccionados departamento de Tumbes

31 P52-51 Morropón

32 P54-53 Morropón

N° Código Localidad

33 P58-57 Morropón

46 T3 Zorritos

34 P62-61 Chulucanas

47 T6 Corrales

35 P66-65 Chulucanas

48 T9 Corrales

36 P69-68 Chulucanas

49 T11 Corrales

37 P73-72 Chulucanas

50 T17 Corrales

38 P78-77 Chulucanas

51 T19 Corrales

39 P80-79 Chulucanas

52 T23 Corrales

40 P85-84 Chulucanas

53 T25 Corrales

41 P87-86 Chulucanas

54 T29 Corrales

42 P89-88 Chulucanas

55 T33 San Jacinto

43 P94-93 Tambo Grande

56 T35 San Jacinto

44 P96-95 Tambo Grande

57 T37 San Jacinto

45 P97-96 Tambo Grande

58 T41 Tumbes

59 T45 Corrales

60 T49 Corrales

42 45 47 50 53 55 58 60 100bp

Fig. Nº 7. Electroforesis en gel de agarosa al 1.7% de producto de PCR

en la que se evaluó el gradiente de temperatura del iniciador 807.

34

6.4 Elección de los iniciadores

Las pruebas de amplificación de los 53 iniciadores ISSR y 12 RAPD con 3 accesiones de

prueba; lograron determinar una lista de iniciadores cuyo patrón de bandas fue satisfactorio y

reproducible. Asimismo, las pruebas de gradiente de temperatura resultaron con una

considerable cantidad de bandas polimórficas (Tabla Nº7).

Tabla Nº 7. Lista de los 15 Iniciadores ISSR y 8 RAPD que dieron

buena respuesta en la amplificación de ADN en Piñón.

Marcadores Moleculares

Marcadores ISSR Marcadores RAPD

UBC807 OPG18

UBC808 OPC 18

UBC809 OPP- 3

UBC810 OPW-17

UBC812 OPV-08

UBC816 OPQ-15

UBC823 OPO-19

UBC830 OPL- 14

UBC834

UBC835

UBC836

UBC840

UBC841

UBC842

UBC861

Con el resto de iniciadores no se logró una buena amplificación (Lista de códigos no resaltado

en el Anexo N° 3); sin embargo, no se pueden descartar en un 100%, ya que no se realizaron

adicionales pruebas de amplificación PCR.

6.5 Amplificación con los marcadores ISSR y RAPDs

Las amplificaciones del ADN con todos los individuos se realizaron utilizando 15 de los

iniciadores ISSR y 8 de los iniciadores RAPD que dieron mejor respuesta en el proceso de

preselección (Tabla Nº 7).

100bp JcL1 JcL2 JcL3 JcL4 JcL5 JcL6 JcL7 JcL8 JcL9 JcJ10 JcL11 JcL12 JcL13 JcL14 JcL15 PJc1 PJc2 PJc3

Primer UBC 807

35

100bp JcL1 JcL2 JcL3 JcL4 JcL5 JcL6 JcL7 JcL8 JcL9 JcJ10 JcL11 JcL12 JcL13 JcL14 JcL15 PJc1 PJc2 PJc3 PJc4

Figura Nº 8. Electroforesis en gel de Agarosa al 1.8% mostrando los patrones de amplificación del iniciador

ISSR UBC 807 (a) y el iniciador RAPD OPW-17 con los genotipos cuyos códigos se muestran en el

lado superior del carril, el marcador de peso molecular utilizado es de 100 bp.

6.6 Análisis Diversidad de la población.

Para un análisis real de la diversidad se tiene que tomar en cuenta el número de alelos

detectados y la frecuencia que estos presenten, por consiguiente un población que presente un

alto grado de diversidad será aquella donde la presencia y ausencia de alelos se distribuyan

equitativamente, es decir que la población presente un gran número de alelos de frecuencias

similares.

Dentro de la matriz binaria que se construyó para la cuantificación de la presencia y ausencia

de bandas, se calculó la frecuencia o ausencia de los alelos, es decir presencia el numero de

(p) se dividió entre el número total de individuos, a su vez la frecuencia de ausencia de

bandas (q) se cálculo de la misma manera, sin tomar en cuenta los valores perdidos o missing

data (9). Cabe resaltar que para el análisis solo se tomaron en cuenta solo se tomaron en

cuenta todos aquellos loci que tenían un índice de (p) a partir de 0.05

Se originaron patrones de bandas (ver figura Nº 8) a las que luego se les dio los valores de (1)

presencia y (0) ausencia para construir la matriz de similitud (anexo Nº 5). En la figura Nº 8

se muestran la cantidad de loci totales amplificados por iniciador; además la cantidad de loci

polimórficos, el ―Índice de Iniciador o Índice ISSR/RAPD‖. Estos valores fueron obtenidos

después del proceso de colección de datos y exclusión de los datos perdidos. Así

mismo también se estimó el nivel de capacidad de los marcadores moleculares para detectar el

grado de polimorfismo de la población en estudio observándose que las amplificaciones con

los iniciadores ISSR (UBC-835) y RAPD (OPO-19) presentaron un índice mayor 3.56 y 4.8

respectivamente obtenidas con las 60 accesiones seleccionadas.

Primer OPW 17

36

Tabla Nº 8. Lista de Iniciadores ISSR utilizados para el estudio molecular de las 60 accesiones de Piñón.

El índice ISSR es la suma de todos los PIC de los loci para cada iniciador.

Marcadores ISSR Marcadores RAPD

Iniciador Secuencia N°

Loci

N° Loci

Polimorficos

PIC Indice

Iniciador Secuencia N°

Loci

N° Loci

Polimorficos

PIC Indice

UBC807 (AG)8 T 10 5 3.06 OPG18 GGCTCATGTG 19 11 4.13

UBC808 (AG)8 C 4 3 1.24 OPC 18 TGAGTGGGTG 16 6 4.29

UBC809 (AG)8 G 5 5 2.25 OPP- 3 CTGATACGCC 7 2 1.28

UBC810 (GA)8 T 6 4 2.31 OPW-17

GTCCTGGGTT 15 5 2.24

UBC812 (GA)8 A 5 2 1.13 OPV-08 GGACGGCGTT 12 8 2.89

UBC816 (CA)8 T 8 4 1.97 OPQ-15 GGGTAACGTG 10 2 1.73

UBC823 (TC)8 C 3 1 0.44 OPO-19 GGTGCACGTT 16 8 4.8

UBC830 (TG)8 G 4 1 1.14 OPL- 14 GTGACAGGCT 9 1 0.67

UBC834 (AG)8 YT 5 2 2.1

UBC835 (AG)8 YC 10 6 3.56

UBC836 (AG)8 YA 7 1 2.17

UBC840 (GA)8 YT 5 3 1.99

UBC841 (GA)8 YC 9 4 2.8

UBC842 (GA)8 YG 7 2 2.16

UBC861 (ACC)6 3 0 0.91

En este contexto se seleccionaron los mejores marcadores moleculares que muestran un

grado de polimorfismo, es decir, los loci con una frecuencia de presencia de banda (p) igual a

1.0 son estimados como monomórficos, por lo cual no se les tomo en cuenta para el análisis

de similitud y agrupamiento. Se obtuvieron un total de 91 bandas amplificadas con los

marcadores ISSR de los cuales 44 son polimórficas siendo el 48.35%, con los marcadores

RAPD se obtuvo 104 bandas de los cuales 49 fueron polimórficas siendo el 47.11%.

Ilustración 1. Gráfico de los valores del PIC

37

6.7 Análisis Multivariado

6.7.1 Agrupamiento UPGMA

Sub Cluster 1.1

Sub Cluster 1.2

Sub Cluster 1.3

Sub Cluster 1.4

Sub Cluster 1.5

Sub Cluster 2.1

Sub Cluster 2.2

Sub Cluster 2.3

Sub Cluster 2.4

Coeficiente

Figura N° 10. Fenograma generado con el coeficiente de asociación Simple Matching usando

marcadores ISSR+RAPD. A un valor de 0,67 de similitud, se muestran 02 clusters en

diferentes colores. PJc1-PJc15 (Lambayeque);PJc16-PJc45 (Piura); PJc46-PJc60 (Tumbes).

38

Se generaron tres fenogramas el primero usando los marcadores ISSR, el segundo los

marcadores RAPD (Ver anexo Nº 6) y el tercero combinado los dos tipos de marcadores

ISSR+RAPD (ver figura Nº 9) para las 60 accesiones de Piñón usando el programa NTSYSpc

v2.1 y el coeficiente de asociación o similitud Simple Matching (SM).

En el fenograma construido con los marcadores ISSR+RAPD (figura Nº 9) fue el que

presento mayor coherencia en la formación de los cluster, se escogió un valor de similitud de

0.67 para resolver 02 agrupamientos o ―clusters‖; los cuales se incluyen con colores diferente

a la vez se formaron sub cluster dentro de cada agrupación.

6.7.2 Coeficiente de correlación (r)

Se obtuvo el coeficiente de correlación (r) con los marcadores ISSR+ RAPD obteniéndose el

valor de 0.7182, indicando una pobre correlación entre la matriz de similitud original y la

matriz obtenida del agrupamiento UPGMA realizado. El mayor valor obtenido es de 0.786

(ver anexo N° 7) utilizando los marcadores RAPD para los 60 genotipos. La correlación

observada con los marcadores ISSR es de 0.698 es la mas baja de los tres coeficientes de

correlación obtenidos.

Matriz

Cofenética

X Label

0.47 0.59 0.70 0.82 0.94

Y Label

0.66

0.73

0.80

0.87

0.94

Matriz de distancias

(r) = 0.71820

Figura N° 11. Comparación de las dos matrices: cofenética y de distancia de los 60 genotipos

utilizando los marcadores ISSR+RAPD.

39

VII. Discusión 7.1 Elección de los genotipos.

Las 60 muestras que se escogieron del total de las accesiones colectadas fueron seleccionadas

a base de dos criterios:

Por la calidad de ADN obtenido del proceso de extracción y purificación.

Por la distancia entre las localidades de colecta de las accesiones.

Suponiendo con estos criterios que se tomaría una muestra representativa de todas las

localidades colectadas; evitando problemas en la amplificación por la calidad de ADN.

No se encontraron diferencias morfológicas entre las accesiones colectadas, que sugieran

mayor divergencia genética, molecular y que proporcionen mayor polimorfismo en los

patrones de amplificación.

El tamaño de la muestra es significativo tomando en cuenta trabajos de caracterización

molecular en la que se consideraron 43 accesiones de Jatropha curcas L. (Basha y Sujatha

2007).26

7.2 Condiciones del ADN y la PCR

La extracción del ADN es un proceso fundamental, ya que es uno de los factores que influyen

en la reproducibilidad de los ensayos. En esta tesis, se siguió un protocolo para la extracción

del ADN basado en la metodología desarrollada por Doyle y Doyle (1987).74

Las

concentraciones de ADN (ng/μl) obtenidas variaron desde 78.2 hasta 3740 ng/μl resultando en

una amplia gama de concentraciones, pero de valores aceptables, dado que el PCR puede

utilizar una cantidad muy pequeña de ADN por reacción. Se comprobó en electroforesis en

agarosa (Anexo Nº 2) la integridad del ADN total extraído y se verificó que era necesario un

tratamiento enzimático con ribonucleasa.

En relación a las condiciones del PCR, se probaron los iniciadores a temperaturas de

amplificación trabajadas por Basha y Sujatha (Obtenidas mediante conversación personal),

los iniciadores que no mostraron un patrón definido fueron evaluados mediante gradiente de

temperatura. De esta manera se logro temperaturas óptimas de los iniciadores ISSR y RAPD

presentados en este estudio.

De las pruebas de preselección con los 53 iniciadores ISSR y 12 RAPD, se escogió un grupo

de los mejores iniciadores 15 ISSR y 8 RAPD para realizar las reacciones definitivas de

amplificación con los 60 genotipos.

De la lista de iniciadores ISSR con mejor amplificación (Tabla N°8), catorce de ellos son

iniciadores anclados y uno es no anclados. Los primeros tienen una secuencia que permite

40

el alineamiento estable al extremo 3’ o 5’ de las secuencias microsatélites la cual demostró

mayor reproducibilidad.

La electroforesis en gel de agarosa al 1.8% demostró baja resolución entre bandas con poca

diferencia en su peso molecular. Consecuentemente, la asignación de las bandas con los

valores binarios (1,0) se realizó minuciosamente y las bandas dudosas se consideraron como

datos perdidos, representados con el valor 9.

7.3 Valores descriptivos de los marcadores

La confiabilidad de la asignación de datos y la reproducibilidad de las observaciones son

cruciales para un sólido estudio de diversidad genética.

Por ello, se vio en la necesidad de considerar los datos perdidos o ―missing data‖

considerando que se deben excluir loci con más del 10% de datos perdidos, para nuestro caso

ninguno de los loci presento más del 10% de datos perdidos.

Se obtuvieron un total de 91 bandas amplificadas con los marcadores ISSR de los cuales 44

son polimórficas siendo el 48.35%, con los marcadores RAPD se obtuvo 104 bandas de los

cuales 49 fueron polimórficas siendo el 47.11%. Comparado con el estudio realizado por

Basha y Sujatha 2007 en la que trabajaron con 43 accesiones de Jatropha curcas, 100

iniciadores ISSR y 400 RAPD con los que lograron un 42% y 33.5% de polimorfismo

respectivamente, los resultados obtenidos en esta tesis es ligeramente superior.

Es posible medir la riqueza de los alelos para cada marcador, o la información que cada

marcador imparte al estudio este puede considerarse como la medida de la utilidad de cada

marcador en distinguir un individuo de otro, de esta manera el valor ―PIC‖ sirve para obtener

una noción del valor de la utilidad de los iniciadores utilizados para diferenciar los taxas.

Se sumaron los PIC de todos los loci analizados para cada iniciador, proporcionando el Índice

de Marcador para cada iniciador ISSR y RAPD. Los índices de iniciador más altos

correspondieron a los iniciadores con códigos: UBC835, UBC807 y UBC841; cuyos índices

fueron 3,56; 3,06 y 2,8 respectivamente para ISSR. Junto a los iniciadores OPO19, OPC18 y

OPG18; cuyos índices fueron 4.8, 4.29 y 4.13 respectivamente para RAPD. Lo cual señala su

valor potencial para un uso futuro en la caracterización molecular de piñón usando estos

marcadores ISSR y RAPD.

Conjuntamente con otros marcadores moleculares, estos resultados permitirían una

identificación directa y reconocimiento de ciertos genotipos valiosos.

Entonces, sería posible correlacionar las características de interés y marcadores moleculares

asociados a estos, con estudios más detallados y prolongados en segregación y herencia de los

diversos genotipos de Jatropha para comprobar la estabilidad de su herencia en varias

41

generaciones, y asegurar su utilidad como asistente molecular en un Programa de

Mejoramiento.

7.4 Agrupamiento

Con el objetivo de definir las relaciones de similitud entre los 60 genotipos de piñón

estudiados y encontrar entre ellos conjuntos consistentes y significativos de individuos, se

realizó un análisis de agrupamiento utilizando el algoritmo UPGMA. Éste se deriva a partir

de una matriz de distancias, calculada para nuestro caso con un coeficiente de asociación

(llamado también de similitud). Los cálculos de la matriz de distancia el coeficiente

simple matching ―SM‖ debido a la naturaleza dominante de los marcadores ISSR y RAPD, en

la que asumimos que tanto las presencias como ausencias en un loci determinado tienen un

mismo origen para todo el sistema.

Se examinaron tres fenogramas obtenidos con el coeficiente de similaridad Simple Matching

―SM‖ con la finalidad de lograr agrupaciones que expliquen de una manera más acertada las

relaciones de similitud y las razones de su vinculación al correspondiente cluster. Entonces, al

comparar los fenogramas generados (ISSR+RAPD: Figura N°10; ISSR y RAPD: Anexo

N°6), se observó un mejor agrupamiento en el fenograma generado por los marcadores

ISSR+RAPD. Esto significa que este último agrupamiento muestra una mejor disposición de

los cluster que correlaciona con la estructuración geográfica de las accesiones colectadas.

Entonces, bajo estos criterios, se eligió el fenograma mostrado en el Figura Nº, a un valor de

0,67 de similitud con el coeficiente Simple Matching, se distinguieron 02 clusters, en la que

los genotipos que la conforman se sobreponen geográficamente en el departamento de Piura

observándose que ningún genotipo Lambayecano se agrupa con algún genotipo Proveniente

de Tumbes, los genotipos colectados en el departamento de Piura se agrupan tanto con los

genotipos de Tumbes como de Lambayeque aunque forman sub cluster que las diferencia,

estas agrupaciones se detallan a continuación:

Cluster 1: Se encuentra todas las accesiones provenientes del departamento de Lambayeque

además de las accesiones provenientes de las localidades de Querecotillo, Salitral, Mallaritos,

El ingenio, Pampa la Hacienda, Morropón, Yapatera, Chulucanas, en el departamento de

Piura indicando que las accesiones colectadas en estas zonas tendrían un origen genético en

común.

Sub Cluster 1.1: Conformado, en su mayoría, por accesiones provenientes del

departamento de Lambayeque en las localidades de Motupe, Olmos, Tucume y Reque.

Denota coherencia con la distribución geográfica debido a la barrera geográfica que

presenta como es el desierto de Sechura. Aunque también se encuentra dos accesiones

42

provenientes de las localidades de Morropón y en el departamento de Piura debido a

que probablemente compartan un origen genético común detectado por los

marcadores.

Sub cluster 1.2: Se encuentran accesiones colectadas exclusivamente en el

departamento de Piura, observándose influencia de la distribución geográfica que los

separa de los genotipos Lambayecanos.

Sub cluster 1.3: Aquí se han agrupado accesiones provenientes de la localidad de

motupe en el departamento de Lambayeque sugiriendo diferencias que las separa del

rsto colectados en el mismo departamento.

Sub cluster 1.4: Singularmente este genotipo proveniente de Olmos (Lambayeque),

en la que las accesiones colectadas están formando parte del cluster 1.1 y 1.3; sin

embargo, se separa del resto de genotipos.

Sub cluster 1.5: Formado por las accesiones PJc17, PJc18, PJc19 ubicadas en las

localidades cercanas de Salitral y Querocotillo siendo las accesiones colectadas en la

zona mas septentrional del cluster 1.

Cluster 2: Se encuentran todas las accesiones colectadas en el departamento de Tumbes

además de las accesiones provenientes de las localidades de Chulucanas, y Tambo grande en

el departamento de Piura. Dentro de este agrupamiento se observan 4 sub cluster que se

detallan a continuación:

Sub Cluster 2.1: Conformado por accesiones provenientes del departamento de Piura

a excepción del genotipo PJc48 de la localidad de corrales en la zona sur del

departamento de Tumbes.

Sub cluster 2.2: Los miembros de este cluster provienen de colectas en zonas muy

cercanas entre si, en las localidades de Corrales y El Oidor, ubicadas en la parte mas

meridional de las colectas realizadas en el departamento de tumbes.

Sub cluster 2.3: Formado por dos accesiones PJc46 y PJc47 provenientes de Tumbes

y una accesión proveniente de Piura PJc45 siendo geográficamente diferentes al igual

que la accesión PJc48 en el cluster 2.1 lo que sugiere un flujo que podría deberse a que

los genotipos en un pasado hayan sido trasladados de un departamento a otro.

Sub cluster 2.4: Formado por los genotipos PJc48, PJc49 y PJc50 Es interesante ver

que geográficamente están localizadas cerca de las accesiones del cluster 2.2 pero

forman un cluster separado pudiéndose deber a características morfológicas no

determinadas por lo que las accesiones provienen de una colecta reciente.

43

Estas Agrupaciones sugieren una distribución longitudinal de dos poblaciones que se

interceptan en el departamento de Piura encontrándose en cada cluster que las accesiones

colectadas mas hacia el norte muestran para cada caso una agrupación que difieren con las

accesiones restantes de lo cual se puede inferir que existe una distribución proveniente de

norte sur. Esta es una hipótesis que quedaría comprobarla mediante estudios de flujo génico.

7.5 Validación interna

Con el fin de demostrar la solidez de los gráficos de agrupamiento generados, se utilizó la

prueba conocida como índice de correlación de Mantel de dos vías, en el software NTSYSpc

v2.1p, mediante la cual se puede demostrar, comparando la matriz de similitud versus la

matriz cofenética, que hay una adecuada representación de las similitudes genéticas por parte

del fenograma.

Se generaron los gráficos que se muestran en la figura Nº 10 y anexo Nº 7 los cuales señalan

la relación entre las matrices de similitud y cofenética, que surge de las similitudes

observadas entre los pares de individuos comparados. En los fenogramas generados con las 60

accesiones los coeficientes de correlación cofenética o ―r‖, resultaron siendo entre 0.69, 0.71,

0.78 para los fenogramas generado con los marcadores ISSR, ISSR+RAPD y RAPD

respectivamente. Esto indica que la técnica de agrupamiento UPGMA origina una

considerable distorsión, o dicho en otras palabras, que los agrupamientos en los fenogramas

representan modestamente los valores de similitudes genéticas entre las 60 accesiones de

Jatropha curcas L.

7.6 Análisis Poblacional

7.6.1 Porcentaje de loci polimórficos.

Se calculó el porcentaje de loci polimórficos directamente de los datos (conteo de presencias

y de ausencias) para el total de las accesiones colectadas. Observando estos resultados, el

polimorfismo es de 48.35% con los marcadores ISSR y 47.11% para RAPD. Estos valores

estarían indicando modestos niveles de variabilidad genética en la población analizada. Es

necesario continuar con los estudios con mayor número de marcadores o con marcadores mas

resolutivos como AFLP o Microsatelites.

44

VIII. CONCLUSIONES

1. Los marcadores moleculares ISSR y RAPDs demostraron ser eficientes en la

caracterización de la variabilidad genética de Jatropha curcas, obteniéndose 15

iniciadores ISSR y 8 RAPDs cuyo índice de contenido polimórfico reveló su alto valor

informativo.

2. Se observó una modesta variabilidad genética en la población analizada conformada

por 60 accesiones colectadas en los departamentos de Tumbes Piura y Lambayeque,

además los fenogramas construidos muestran una ―pobre‖ correlación entre la matriz

de similitud original con la Matriz cofenética.

3. Se logró encontrar la formación de dos clusters, en la que los genotipos que la

conforman se interceptan geográficamente en el departamento de Piura observándose

que ningún genotipo Lambayecano se agrupa con algún genotipo Proveniente del

departamento de Tumbes

4. Todas las accesiones se encontraron asociadas a otros cultivos como arroz, algodón,

plátano, entre otros; formando cercos vivos para la separación entre fincas, al borde de

caminos o carreteras en los departamentos de Tumbes, Piura y Lambayeque en la que

se realizaron las colectas.

45

IX. Recomendaciones

1. Ensayar con marcadores mas resolutivos como AFLP o microsatelites, afín de validar

los resultados obtenidos en esta tesis.

2. Utilizar la colección completa de 200 accesiones en estudios con los mismos y otros

marcadores para mayor comprensión de la dinámica en la población.

3. Las representaciones fenéticas (por agrupamiento) de los 60 individuos de Piñon se

pueden considerar como un criterio más a considerar en los programas de

mejoramiento genético o de selección asistido por marcadores (MAS).

4. Incluir en posteriores estudios accesiones colectadas a nivel nacional y accesiones

internacionales para un mayor entendimiento de la distribución y evolución de la

especie.

46

X. Referencias Bibliográficas

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51

XI. Anexos

Anexo N°1.- Datos de colecta realizada en distintas localidades de la región Lambayeque, Piura

y Tumbes.

52

53

54

55

56

57

58

59

Anexo 2.- Electroforesis del ADN de muestras de las regiones Piura, Tumbes y

Lambayeque

GEL 15-10(M)Fila 1

100

1281,67

663,29

2311,04

730,97

398,01 346,4

707,77

206,55 190,7

467

100

476,9437,8

494523,3

558,11

556,8491,27

263,77

0

500

1000

1500

2000

2500

ML1-1 L5-2

L7-3 L8-4 L9-5

L10-6

L11-7

L12-8

L13-9

L14-1

0

L15-1

1

L16-1

2

L17-1

3

L18-1

4

L19-1

5

L20-1

6

L21-1

7

L27-1

9 M

GEL 15-10 (M)Fila 2

431,1

100

648,77

415,1463,3

375,3429,25

202,8249,4

287,5

417,44364,3380,9

248

99,15

190,2244

100

196,65

102,35

0

100

200

300

400

500

600

700

L28-20 M

L29-21

L30-22

L34-25

L35-26

L36-27

L38-28

L39-29

L44-34

L46-36

L50-39

P2-2P4-4

P13-13

P14-14

P16-16

P18-18

P19-19 M

60

GEL 14-10 (T)

100

1013,6

1347

970,7

636,7

1228,6

583,6

888,4

1792,8

1251,2

840,7

1503,9

2151,1

1180,4

1863,9

621,4

1054,3

720,6

100

1915,5

1235,41266,7

1379,2

860,3805,3

770,4668,8

658,4

892,2

948,1

0

500

1000

1500

2000

2500

M

P40-39

P41-40

L55-43

L42-32P7-7

P11-11

P9-9

L52-41P5-5

L32-24P6-6

L60-48

L51-40

L61-49

L58-46

L31-23

L62-50

L47-37P3-3

L41-31

L45-35

L57-45

P42-41

L59-47

L22-18P8-8

P1-1

P10-10 M

GEL 16-10(M)Fila 1

176,1

674,7

168

539,9

100

1347

457,9

158,6

679,4802,2

1450,4

100325.6

304245

148,2

948,11012,7

1135,61013,6

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

P21-21

P22-22

P27-27

P29-29

P30-30

P31-31

P32-32

P34-34

P40-39 M

P41-40

P42-41

P43-42

P44-43

P45-44

P46-45

P47-46

P48-47

P49-48 M

GEL 16-10 (M)Fila 2

100

667,2

87,3

1362,8

2128,3

898,1

1436,3

1977

1090,7

481,3

100

15011519,1

1789,8

204,9229,3

233,8269,4

338,7468,4

0

500

1000

1500

2000

2500

M

P50-49

P51-50

P52-51

P53-52

P54-53

P55-54

P56-55

P57-56

P58-57

P59-58

P60-59

P61-60

P62-61

P63-62

P64-63

P65-64

P66-65

P67-66 M

61

GEL 17-10(M)Fila 2

100

860 955,6

400,26

1988,2

191,5

1490,7

2214,2

272,2100

0

500

1000

1500

2000

2500

M

T32

-32

T33

-33

T34

-34

T35

-35

T36

-36

T37

-37

T38

-38

T39

-39 M

GEL 16-10 (T)Fila1

100

471,7

160,6

334,4

910,25

462,6

256,2

800,3

363,2

78,2

199,3

1111,1

491,9

573,7

358,8369,5

100120,3

676,6725,1

0

200

400

600

800

1000

1200

M

P69-68

P70-69

P73-72

P75-74

P78-77

P79-78

P80-79

P82-81

P84-83

P85-84

P86-85

P87-86

P88-87

P89-88

P90-89

P91-90

P92-91

P93-92 M

GEL 16-10(T)Fila 2

100

888,4

3740

1368,41713,9

2929,8

639,5 773,2436,4

475,3

315,9 100151,2238,3309,5

231,5491,17

751,3480,2

836

0500

1000150020002500300035004000

M

P94-93

P95-94

P96-95

P97-96

P98-97

P99-98

P100-99

P101-100

T1-1T2-2

T3-3T4-4

T6-6T7-7

T8-8T9-9

T10-10

T11-11 M

GEL 17-10(M)Fila 1

100157,5 155 210,4

519,7

373,9 398

1079,2

398,4

705

520,3

278,4

620,3

258356,9 364

824,9

350,1

512,4

100

0

200

400

600

800

1000

1200

M

T13-13

T15-15

T16-16

T17-17

T18-18

T19-19

T20-20

T21-21

T22-22

T23-23

T24-24

T25-25

T26-26

T27-27

T28-28

T29-29

T30-30

T31-31 M

62

GEL 17-10(T)Fila 1

100

1542,2

215,3108

1066

165,9318,05

1061,65

145,99335,8

100

1467,5 1498,7

1001,1

1139,61060,3

471,5638,5

837,6937,6

0200400600800

10001200140016001800

M

T40-40

T41-41

T42-42

T43-43

T44-44

T45-45

T46-46

T47-47

T48-48

T49-49

T50-50

R.P17-1

7

R.P36-3

5

R.P68-6

7

R.P76-7

5

R.P77-7

6

R.T12-1

2

R.P20-2

0 M

GEL 17-10(T)Fila 2

100

559,74

668 659,4

248,51

762,16

638,29

270,36

1142,03 1131,08

100

0

200

400

600

800

1000

1200

M

R.P24

-24

R.P25

-25

R.P28

-28

R.P33

-33

R.P37

-36

R.P72

-71

R.P81

-80

R.P82

-83

R.P72

-71 M

63

Anexo 3.- Lista de los 53 Iniciadores ISSR y 12 RAPD. Los códigos ISSR corresponden a

iniciadores de la Universidad de British Columbia. Los códigos resaltados pertenecen

a los 15 iniciadores ISSR y 08 RAPD cuyos perfiles de amplificación fueron más

consistentes que del resto.

Iniciadores ISSR

UBC802 ATA TAT ATA TAT ATA TG UBC851 GTG TGT GTG TGT GTG TYG

UBC807 AGA GAG AGA GAG AGA GT UBC855 ACA CAC ACA CAC ACA CYT

UBC808 AGA GAG AGA GAG AGA GC UBC856 ACA CAC ACA CAC ACA CYA

UBC809 AGA GAG AGA GAG AGA GG UBC860 TGT GTG TGT GTG TGT GRA

UBC810 GAG AGA GAG AGA GAG AT UBC861 ACC ACC ACC ACC ACC ACC

UBC812 GAG AGA GAG AGA GAG AA UBC862 AGC AGC AGC AGC AGC AGC

UBC813 CTC TCT CTC TCT CTC TT UBC864 ATG ATG ATG ATG ATG ATG

UBC815 CTC TCT CTC TCT CTC TG UBC865 CCG CCG CCG CCG CCG CCG

UBC816 CAC ACA CAC ACA CAC AT UBC866 CTC CTC CTC CTC CTC CTC

UBC817 CAC ACA CAC ACA CAC AA UBC867 GGC GGC GGC GGC GGC GGC

UBC818 CAC ACA CAC ACA CAC AG UBC868 GAA GAA GAA GAA GAA GAA

UBC820 GTG TGT GTG TGT GTG TC UBC873 GAC AGA CAG ACA GAC A

UBC821 GTG TGT GTG TGT GTG TT UBC880 GGA GAG GAG AGG AGA

UBC822 TCT CTC TCT CTC TCT CA UBC881 GGG TGG GGT GGG GTG

UBC823 TCT CTC TCT CTC TCT CC UBC885 BHB GAG AGA GAG AGA GA

UBC824 TCT CTC TCT CTC TCT CG UBC886 VDV CTC TCT CTC TCT CT

UBC825 ACA CAC ACA CAC ACA CT UBC887 DVD TCT CTC TCT CTC TC

UBC828 TGT GTG TGT GTG TGT GA UBC888 BDB CAC ACA CAC ACA CA

UBC829 TGT GTG TGT GTG TGT GC UBC889 DBD ACA CAC ACA CAC AC

UBC830 TGT GTG TGT GTG TGT GG UBC891 HVH TGT GTG TGT GTG TG

UBC834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT Iniciadores RAPD

UBC835 AGA GAG AGA GAG AGA GYC OPG18 GGCTCATGTG

UBC836 AGA GAG AGA GAG AGA GYA OPV17 ACCGGCTTGT

UBC840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT OPC 18 TGAGTGGGTG

UBC841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC OPG 17 ACGACCGACA

UBC842 GAG AGA GAG AGA GAG AYG OPK-01 CATTCGAGCC

UBC843 CTC TCT CTC TCT CTC TRA OPP- 3 CTGATACGCC

UBC844 CTC TCT CTC TCT CTC TRC OPW-17 GTCCTGGGTT

UBC846 CAC ACA CAC ACA CAC ART OPV-08 GGACGGCGTT

UBC847 CAC ACA CAC ACA CAC ARC OPQ15 GGGTAACGTG

UBC848 CAC ACA CAC ACA CAC ARG OPO19 GGTGCACGTT

UBC849 GTG TGT GTG TGT GTG TYA OPL 14 GTGACAGGCT

UBC850 GTG TGT GTG TGT GTG TYC OPR 8 CCCGTTGCCT

64

PJc

1

PJc

2

PJc

3

PJc

4

PJc

5

PJc

6

PJc

7 P

Jc8

PJc

9

PJc

10

PJc

11

PJc

12

PJc

13

PJc

14

PJc

15

PJc

16

PJc

17

PJc

18

PJc

19

PJc

20

PJc

21

PJc

22

PJc

23

PJc

24

PJc

25

PJc

26

PJc

27

PJc

28

PJc

29

PJc

30

PJc

31

PJc

32

PJc

33

PJc

34

PJc

35

PJc

36

PJc

37

PJc

38

PJc

39

PJc

40

PJc

41

PJc

42

PJc

43

PJc

44

PJc

45

PJc

46

PJc

47

PJc

48

PJc

49

PJc

50

PJc

51

PJc

52

PJc

53

PJc

54

PJc

55

PJc

56

PJc

57

PJc

58

PJc

59

PJc

60

807-1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

807-3 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1

807-5 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1

807-8 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1

807-9 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

808-1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

808-2 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

808-3 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

809-1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1

809-2 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1

809-3 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1

809-4 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1

809-5 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1

810-1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 9 1 9 9 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

810-2 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 9 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

810-4 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1

810-6 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 1 1 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

812-3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1

812-5 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1

816-1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

816-2 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1

816-4 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1

816-6 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1

823-1 0 1 1 1 1 9 9 1 0 1 1 1 1 1 1 1 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

830-1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1

834-2 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1

834-3 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1

Anexo 4.- Datos Binarios (presencia: 1 ó ausencia: 0) de 93 loci (caracteres) para 60 genotipos (OTUs). El código 9 es el asignado a los

datos perdidos o ―missing data‖. Se muestran sólo los loci con un porcentaje de polimorfismo mayor al mayor 5%.

65

834-4 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

835-2 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1

835-3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1

835-4 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0

835-5 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1

835-7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1

835-9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1

836-3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

840-1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1

840-2 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1

840-4 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1

841-3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1

841-6 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0

841-7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

841-8 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1

842-1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1

842-2 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

OPC18-3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 9 1 1 1 1

OPC18-4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 9 0 0 1 1 1 1

OPC18-8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 9 1 1 1 9 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 9 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 9 1 1 0

OPC18-9 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 9 0 1 1 1 1 1 1 0 9 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1

OPC18-11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 9 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 9 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

OPC18-13 1 1 1 1 1 1 1 1 9 1 1 0 0 1 1 1 1 9 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 9 9 9 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0

OPG18-1 0 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 1 0 9 9 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0

OPG18-2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 9 9 1 1 9 1 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 1 0 0

OPG18-3 0 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 9 9 1 9 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0

OPG18-4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 9 9

66

OPG18-6 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 1 1 1 1 0 0 1 0

OPG18-7 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 9 1 1 1 1 9 1 9 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 9

OPG18-13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 9 9 1 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

OPG18-14 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0

OPG18-15 0 0 0 0 9 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 9 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9

OPG18-17 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 0 9 0

OPG18-18 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 9 0 0

OPG18-19 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0

OPL14-2 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 9 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 9 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

OPO19-1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

OPO19-2 0 9 9 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

OPO19-3 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 9 9 1 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

OPO19-4 1 1 1 1 1 1 1 0 0 9 1 9 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

OPO19-5 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

OPO19-6 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 9 9

OPO19-9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0

OPO19-10 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

OPO19-11 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

OPO19-12 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1

OPO19-13 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

OPO19-14 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

OPO19-16 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 9 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0

OPP3-5 0 0 0 0 0 0 0 0 9 9 1 1 1 1 0 0 9 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

OPP3-7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 9 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

67

OPQ15-6 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0

OPQ15-9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0

OPV8-1 1 1 1 1 1 1 0 0 9 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1

OPV8-2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 9 9 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1

OPV8-3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 9 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 9 0 0

OPV8-6 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

OPV8-7 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9

OPV8-8 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0

OPV8-9 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 9 0 9 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0

OPV8-11 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 0 0

OPW17-1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

OPW17-3 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0

OPW17-9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 9 9 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 9 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 1 1 1

OPW17-11 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 9 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

OPW17-15 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 9 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Anexo 5.- Matriz de similitud de la comparación uno a uno entre las 60 OTUs. Coeficiente de

Asociación simple matching ―SM‖.

PJc1 PJc2 PJc3 PJc4 PJc5 PJc6 PJc7 PJc8

-------------------------------------------------------------------------

PJc1 | 1.0000

PJc2 | 0.8172 1.0000

PJc3 | 0.7957 0.8280 1.0000

PJc4 | 0.7312 0.6989 0.8065 1.0000

PJc5 | 0.8387 0.8065 0.8925 0.7849 1.0000

PJc6 | 0.7742 0.7527 0.7957 0.7097 0.8280 1.0000

PJc7 | 0.7312 0.7312 0.7957 0.6667 0.8495 0.7849 1.0000

PJc8 | 0.6452 0.6774 0.6774 0.5484 0.7312 0.7312 0.7527 1.0000

PJc9 | 0.6667 0.6344 0.6989 0.5914 0.7419 0.6989 0.7312 0.7527

PJc10 | 0.6989 0.6882 0.7312 0.6667 0.7097 0.6344 0.6882 0.6452

PJc11 | 0.7527 0.7419 0.7634 0.6882 0.8495 0.7312 0.7957 0.6989

PJc12 | 0.6667 0.6344 0.6774 0.6129 0.7204 0.6882 0.6882 0.7957

PJc13 | 0.7097 0.6882 0.7097 0.6129 0.7742 0.7419 0.7419 0.7527

PJc14 | 0.7527 0.7419 0.7527 0.6667 0.7957 0.7742 0.8065 0.6989

PJc15 | 0.8065 0.7527 0.7742 0.6882 0.8387 0.7527 0.7419 0.6559

PJc16 | 0.7634 0.7634 0.7957 0.6774 0.8280 0.7312 0.7849 0.7849

PJc17 | 0.6022 0.6237 0.6559 0.5806 0.6774 0.6667 0.6989 0.6774

PJc18 | 0.6237 0.6667 0.6882 0.6344 0.6667 0.6344 0.6344 0.6452

PJc19 | 0.6022 0.6452 0.6882 0.6667 0.6667 0.6129 0.6774 0.5806

PJc20 | 0.7312 0.7849 0.8280 0.6774 0.7849 0.7097 0.7527 0.6774

PJc21 | 0.7204 0.7527 0.8495 0.7097 0.7957 0.7204 0.7419 0.6882

PJc22 | 0.6667 0.7204 0.7742 0.6989 0.7204 0.6452 0.6882 0.6129

PJc23 | 0.6989 0.7312 0.8065 0.7097 0.7527 0.6774 0.7204 0.6452

PJc24 | 0.6667 0.7097 0.7419 0.6452 0.7419 0.6882 0.7204 0.6129

PJc25 | 0.6882 0.7419 0.7634 0.6344 0.7204 0.7097 0.7097 0.6129

PJc26 | 0.6129 0.6667 0.7312 0.6989 0.6882 0.6344 0.6452 0.5806

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PJc28 | 0.8065 0.7527 0.8710 1.0000

PJc29 | 0.7742 0.7204 0.8602 0.8602 1.0000

PJc30 | 0.7957 0.7312 0.8280 0.8065 0.9032 1.0000

PJc31 | 0.8280 0.7957 0.8065 0.7957 0.8280 0.8280 1.0000

PJc32 | 0.8065 0.7634 0.8495 0.7849 0.8387 0.8172 0.9032 1.0000

PJc33 | 0.7849 0.7957 0.8495 0.8065 0.8387 0.8280 0.8172 0.8172

PJc34 | 0.7742 0.7527 0.7957 0.7957 0.7634 0.7527 0.7849 0.7634

PJc35 | 0.7849 0.7527 0.8065 0.7634 0.8387 0.7849 0.8172 0.8172

PJc36 | 0.7957 0.7527 0.7634 0.7849 0.7419 0.7312 0.7634 0.7419

PJc37 | 0.7849 0.7312 0.7634 0.7849 0.7312 0.6989 0.7527 0.7312

PJc38 | 0.7419 0.6989 0.7527 0.7419 0.7312 0.7527 0.7957 0.7527

PJc39 | 0.6989 0.6882 0.6989 0.6882 0.6774 0.6452 0.6774 0.6774

PJc40 | 0.6882 0.6774 0.7312 0.6989 0.6882 0.6774 0.7204 0.7312

PJc41 | 0.7097 0.6989 0.7204 0.7419 0.7634 0.7097 0.7312 0.7097

PJc42 | 0.6237 0.6667 0.6667 0.6989 0.6667 0.6559 0.6774 0.6344

PJc43 | 0.6344 0.6237 0.6774 0.6882 0.6989 0.6667 0.6452 0.6237

PJc44 | 0.6667 0.6559 0.6882 0.7527 0.6882 0.6559 0.6774 0.6559

PJc45 | 0.6559 0.6022 0.7097 0.6882 0.6882 0.6559 0.6667 0.6452

PJc46 | 0.6129 0.5376 0.6774 0.6237 0.6237 0.5914 0.5914 0.6129

PJc47 | 0.6452 0.5914 0.6774 0.7097 0.6989 0.6667 0.6237 0.6237

PJc48 | 0.6882 0.6559 0.7097 0.7634 0.7527 0.7204 0.6882 0.6774

PJc49 | 0.6237 0.6022 0.6559 0.6667 0.7204 0.6882 0.6237 0.6022

PJc50 | 0.6344 0.5806 0.6344 0.6452 0.6559 0.6344 0.6237 0.6129

PJc51 | 0.6667 0.6559 0.6882 0.6344 0.7097 0.6559 0.6667 0.6667

PJc52 | 0.6989 0.6667 0.7419 0.7097 0.7419 0.7097 0.7097 0.6882

PJc53 | 0.6882 0.6344 0.7097 0.6559 0.6882 0.6559 0.6559 0.6774

PJc54 | 0.6559 0.6237 0.6989 0.6667 0.6989 0.6774 0.6667 0.6882

PJc55 | 0.6344 0.6344 0.6667 0.6559 0.6667 0.6882 0.6559 0.6344

PJc56 | 0.6667 0.6882 0.6667 0.6989 0.6882 0.7097 0.6882 0.6452

PJc57 | 0.6129 0.6344 0.6237 0.6344 0.6559 0.6344 0.6344 0.6129

PJc58 | 0.6667 0.6237 0.7097 0.6774 0.7097 0.6774 0.7097 0.6882

PJc59 | 0.6344 0.5591 0.6344 0.6237 0.6344 0.6022 0.6559 0.6237

PJc60 | 0.6559 0.6237 0.6774 0.6774 0.6882 0.6559 0.7204 0.6989

PJc33 PJc34 PJc35 PJc36 PJc37 PJc38 PJc39 PJc40

-------------------------------------------------------------------------

PJc33 | 1.0000

PJc34 | 0.7849 1.0000

PJc35 | 0.8172 0.7957 1.0000

PJc36 | 0.7634 0.8172 0.8172 1.0000

PJc37 | 0.7634 0.8387 0.7634 0.8925 1.0000

PJc38 | 0.7634 0.7742 0.7634 0.7634 0.7957 1.0000

PJc39 | 0.7419 0.6667 0.6774 0.7204 0.7634 0.6774 1.0000

PJc40 | 0.7742 0.7204 0.7312 0.7634 0.7849 0.7097 0.7957 1.0000

PJc41 | 0.8065 0.7527 0.7419 0.7527 0.7742 0.6989 0.7957 0.8387

PJc42 | 0.7312 0.6344 0.6667 0.6559 0.6344 0.6774 0.7312 0.7097

PJc43 | 0.7419 0.6667 0.6774 0.6559 0.6774 0.6559 0.7419 0.7634

PJc44 | 0.7742 0.6882 0.6452 0.6344 0.6559 0.6559 0.6882 0.7097

PJc45 | 0.7419 0.6559 0.6989 0.6344 0.6452 0.6774 0.6989 0.7097

PJc46 | 0.6882 0.5484 0.6022 0.5591 0.5699 0.5914 0.6559 0.6882

PJc47 | 0.6989 0.6667 0.6559 0.6559 0.6882 0.6667 0.6452 0.6237

PJc48 | 0.7527 0.7097 0.6882 0.7312 0.7527 0.6559 0.7957 0.7419

PJc49 | 0.6989 0.6129 0.6989 0.6452 0.6559 0.6667 0.6989 0.6882

PJc50 | 0.6559 0.6667 0.6774 0.7204 0.7419 0.6989 0.7097 0.6882

PJc51 | 0.6882 0.6237 0.6882 0.6559 0.6882 0.6452 0.8065 0.7097

PJc52 | 0.7634 0.7204 0.7419 0.7097 0.7204 0.7204 0.6989 0.7419

PJc53 | 0.6882 0.6129 0.6667 0.6129 0.6452 0.6237 0.7312 0.7634

PJc54 | 0.7204 0.6882 0.7204 0.6774 0.6989 0.6559 0.7634 0.8065

PJc55 | 0.6882 0.6344 0.6667 0.5806 0.6237 0.6452 0.7312 0.6989

PJc56 | 0.6989 0.6667 0.6559 0.6344 0.6344 0.6989 0.7204 0.6882

PJc57 | 0.7097 0.5914 0.6344 0.6237 0.6237 0.6344 0.7097 0.6559

PJc58 | 0.7419 0.6989 0.7419 0.6882 0.6989 0.7204 0.7204 0.7097

PJc59 | 0.6344 0.6452 0.6667 0.6344 0.6344 0.6667 0.6559 0.6559

PJc60 | 0.7419 0.6774 0.6882 0.6667 0.6882 0.7097 0.7204 0.7204

PJc41 PJc42 PJc43 PJc44 PJc45 PJc46 PJc47 PJc48

-------------------------------------------------------------------------

PJc41 | 1.0000

PJc42 | 0.7742 1.0000

PJc43 | 0.8172 0.7742 1.0000

PJc44 | 0.8280 0.7742 0.8280 1.0000

PJc45 | 0.7527 0.7204 0.7527 0.7527 1.0000

PJc46 | 0.7204 0.6452 0.7312 0.7419 0.7957 1.0000

PJc47 | 0.7312 0.6344 0.7204 0.7312 0.6989 0.7204 1.0000

PJc48 | 0.8495 0.7312 0.7957 0.7634 0.7097 0.7419 0.8065 1.0000

PJc49 | 0.7849 0.7097 0.7527 0.6882 0.7097 0.7527 0.6882 0.7957

PJc50 | 0.7419 0.6667 0.7312 0.6667 0.6452 0.6882 0.7419 0.7527

PJc51 | 0.7742 0.6667 0.7312 0.7097 0.7204 0.6989 0.6344 0.7419

PJc52 | 0.7634 0.6452 0.7312 0.6774 0.7097 0.6774 0.6774 0.7742

PJc53 | 0.7312 0.6989 0.7097 0.6667 0.7204 0.7204 0.6667 0.7419

PJc54 | 0.7849 0.7097 0.7634 0.6989 0.7527 0.7097 0.6774 0.7957

PJc55 | 0.7312 0.7204 0.6667 0.6774 0.7097 0.6667 0.6022 0.7204

PJc56 | 0.7634 0.7419 0.6882 0.7097 0.6989 0.6129 0.6237 0.7419

PJc57 | 0.7527 0.6989 0.7097 0.6989 0.6667 0.5914 0.6452 0.7204

PJc58 | 0.7634 0.6559 0.7419 0.6774 0.6774 0.6452 0.6129 0.7634

PJc59 | 0.6452 0.5376 0.6559 0.5806 0.6667 0.5699 0.5591 0.6774

PJc60 | 0.7312 0.6237 0.6989 0.6559 0.6989 0.6129 0.6559 0.7419

PJc49 PJc50 PJc51 PJc52 PJc53 PJc54 PJc55 PJc56

-------------------------------------------------------------------------

PJc49 | 1.0000

PJc50 | 0.7957 1.0000

PJc51 | 0.8172 0.7634 1.0000

PJc52 | 0.7849 0.7419 0.7957 1.0000

PJc53 | 0.7742 0.6882 0.7634 0.8065 1.0000

PJc54 | 0.7957 0.7527 0.7742 0.7742 0.8387 1.0000

PJc55 | 0.7527 0.7097 0.7204 0.7419 0.7849 0.8495 1.0000

PJc56 | 0.7312 0.6452 0.6774 0.7097 0.7849 0.8065 0.8710 1.0000

PJc57 | 0.7204 0.6344 0.6667 0.7204 0.7742 0.7312 0.7419 0.7742

PJc58 | 0.7204 0.6559 0.6882 0.7742 0.6559 0.6989 0.6452 0.6452

PJc59 | 0.6022 0.5806 0.6022 0.6989 0.6559 0.6882 0.5914 0.6022

PJc60 | 0.6344 0.6344 0.6452 0.7527 0.6989 0.7312 0.6559 0.6882

PJc57 PJc58 PJc59 PJc60

-------------------------------------

PJc57 | 1.0000

PJc58 | 0.6667 1.0000*

PJc59 | 0.6559 0.7527 1.0000

PJc60 | 0.7419 0.7634 0.7849 1.0000

\\

Coefficient

Anexo N° 6.

6.1.- Fenograma UPGMA generado con los 60 individuos analizados, utilizando el coeficiente

de similitud Simple Matching.

Coefficient

6.2.- Fenograma UPGMA generado con los 60 individuos analizados, utilizando el coeficiente de

similitud Simple Matching.

Anexo N° 7.

7.1 Comparación de las dos matrices: cofenética y de distancia de los 60 genotipos

utilizando los marcadores RAPD. Se muestran los coeficientes de correlación cofenética para

cada gráfico.

(r) = 0.78405

X Label

0.39 0.53 0.66 0.80 0.94

Y Label

0.58

0.67

0.76

0.85

0.94

Matriz de distancias

Matriz

Cofenetica

7.2 Representación gráfica de la correlación entre la Matriz de Similitud y la Matriz

cofenética para los marcadores ISSR.

RAPD 60 SM

(r) = 0.69835

ISSR 60 Tesis NTSYS edit SM.NTS

0.36 0.51 0.66 0.81 0.95

ISSR 60 Tesis NTSYS edit SM UPGMA coph.NTS

0.63

0.71

0.79

0.87

0.95

RAPD 60 SM

UPGMA coph

Anexo N°8.- Extracción de ADN por el metodo cetil trimetil amonio bromuro (CTAB)

1. Obtener 5g de tejido, triturarlo con nitrógeno liquido

2. Transferir el polvo a tubos de 50ml /conteniendo 20ml de buffer de extracción y 200ul

de 2- mercaptocthanol,min 98%.

3. Incubar a 65ºC por 20 min. , mezclar cada 5 minutos.

4. Enfriar a temperatura ambiente por 10 minutos añadir un volumen igual al contenido

en el tubo falcon de cloroformo alcoholisoamilico (24:1), mezclar suavemente por 5

min.

5. Centrifugar a 4000rpm por 20 min. a 4ºC.

6. Transferir la fase superior acuosa (sobrenadante) a un nuevo tubo de 50 ml.

7. Añadir un volumen igual al sobrenadante de cloroformo alcoholaisoamilico (24:1)

mezclar suavemente por 5 min.

8. Centrifugar a 4000rpm por 20 min. a 4ºC.

9. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 ml conteniendo 2/3 del volumen del

sobrenadante , de isopropanol (15ml) mezclar suavemente.

Opcion A:

Dejar el tubo falcon a temperatura ambiente.

Colectar el ADN por pesca con una pipeta pasteur

Transferir el ADN a un nuevo tubo empendolf conteniendo 300 ul de Wash 1

buffer dejarlo a temperatura ambiente por 30 min.

Transferir el ADN a un nuevo tubo empendolf conteniendo 300 ul de Wash 2

por 5 segundos.

Transferir el ADN a un nuevo tubo empendolf y secar a temperatura ambiente

por 30 min.

Disolver el ADN en 500-1000 ul de T10 E1 (x tamaño del pellet)

Añadir RNAsa (10ng/ul) incubar a 37ºC por una hora.

Opcion B:

Dejar a 20ºC al menos una hora centrifugar a 4000 rpm por 30 min.

Dejar escurrir el isopropanol y secar a temperatura ambiente los tubos

destapados e invertidos.

Disolver el pellet de ADN en 500-1000ul de T10 E1 y 5-10 ul de RNAsa libre

de DNAsa (10ng/ml) incubar a 37ºC por una hora.

Almacenar a 4ºC.

Extracción de ADN Por el método CTAB (Para hojas secas)

1. En un tubo de 2ml agregar 1ml de buffer de extracción CTAB 2 X y 2ul de b-

mercaptoetanol.

2. Moler con nitrógeno líquido aproximadamente 100 mg de tejido vegetal.

3. Vaciar el polvo al tubo con el Buffer de extracción.

4. Incubar a 65ºC por 45 minutos. Agitar tres veces durante los primeros 5 minutos,

luego agitarlos dos veces cada 20 minutos.

5. Dejar enfriar a temperatura ambiente.

6. Agregar 1 ml de cloroformo:isoalmilico (24:1)

7. Agitar ligeramente hasta homogenizar el contenido.

8. Centrifugar a 14,000 rpm por 5 minutos.

9. transferir el sobrenadante a tubos de 1.5ml (usar tips de punta cortada).

10. Agregar 75 ul de CTAB 10X (65ºC) y agitar hasta homogenizar.

11. Agregar 650 ul de cloroformo:isoamilico (24:1) y agitar hasta homogenizar

completamente.

12. Centrifugar a 14,000 rpm x 5 minutos.

13. Transferir el sobrenadante (a tubos de 1.5 ml) esteriles.

14. Agregar 500 ul de isopropanol frio y agitar suavemente por espacion de 10 segundos –

usar repetitivo.

15. Incubar a -20ºC x 30 minutos ( puede detenerse el procedimiento hasta el dia

siguiente)

16. Centrifugar a 14,000 rpm por 20 minutos.

17. Decantar el isopropanol con cuidado de no perder el pellet.

18. Dejar los tubos invertidos por 1 minuto sobre papel toalla.

19. Agregar 300 ul de Wash 1 por 10 minutos.

20. Decantar con cuidado de no perder el pellet.

21. Dejar los tubos invertidos sobre papel toalla por 30 segundos.

22. Enjuagar con 300 ul deWash 2.

23. Decantar con cuidado.

24. Dejar secar los tubos por 30 minutos.

25. ( Opcional: secar en liofilizador por 10 minutos, opción médium)

26. Resuspender cada pellet en 75 ul de T10E1

(Opcional: Dejar overnight a 4ºC para una dilución total del pellet)

27. Agregar 2 ul de RNAsa A

28. Dejar por 30 minutos a 37ºC

CORRIDA ELECTROFORETICA

29. Tomar 9 ul de loading buffer

30. adicionar 1 ul de la muestra de ADN

31. Mezclar

32. Cargar en un gel de agarosa 1% y correr a 80-90 Volt x 30 minutos

33. (Nota.- Se usó buffer TBE)