tesis fco 1
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN FRECUENCIA DEL POLIMORFISMO DE TNFα-308 Y TNFβ +252 EN PACIENTES CON ENFERMEDAD DE KAWASAKI Y ANEURISMAS CORONARIOS TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRIA EN CIENCIAS EN INVESTIGACION CLINICA PRESENTA: DR. FRANCISCO CRUZ OLIVO Director de Tesis: Dra. Guadalupe de los Ángeles García Elorriaga Co-Director de Tesis: Dr. Javier Mancilla Ramírez Agosto de 2006
Transcript of tesis fco 1
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
FRECUENCIA DEL POLIMORFISMO DE TNFα-308 Y TNFβ +252 EN PACIENTES CON ENFERMEDAD DE KAWASAKI Y
ANEURISMAS CORONARIOS
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRIA EN CIENCIAS EN INVESTIGACION CLINICA
PRESENTA:
DR. FRANCISCO CRUZ OLIVO
Director de Tesis: Dra. Guadalupe de los Ángeles García Elorriaga
Co-Director de Tesis: Dr. Javier Mancilla Ramírez
Agosto de 2006
Este trabajo fue realizado en:
La Unidad de investigación Biomédica en Inmunología e
Infectología del Centro Médico Nacional la Raza.
La Unidad Médica de Alta Especialidad
Hospital Dr. Gaudencio González Garza del Centro Médico
Nacional La Raza, Instituto Mexicano del Seguro Social y,
El Instituto Nacional de Pediatría de la Secretaria de Salud
Bajo la Dirección de la Dra. Guadalupe de los Ángeles
García Elorriaga
INDICE
Glosario ...............................................................................................................IV
Relación de figuras y tablas ................................................................................ V
Resumen.............................................................................................................VI
Abstract .............................................................................................................. VII
1. Introducción..................................................................................................... 1
2. Antecedentes .................................................................................................. 2
3. Justificación.................................................................................................... 14
4. Hipótesis......................................................................................................... 15
5. Objetivos ........................................................................................................ 16
5.1. Objetivo General .................................................................................... 16
5.2. Objetivos Particulares ............................................................................ 16
6. Material y Métodos ......................................................................................... 17
7. Resultados ..................................................................................................... 27
8. Discusión........................................................................................................ 42
9. Conclusiones.................................................................................................. 49
10. Bibliografía ................................................................................................... 50
11. Anexos ......................................................................................................... 60
12.1. Anexo No. 1 ......................................................................................... 60
12.2. Anexo No. 2 ......................................................................................... 62
GLOSARIO
TNFα Factor de Necrosis Tumoral
TNFβ Linfotoxina
DNA Ácido desoxiribonucléico
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
IL-1 Interleucina 1
IL-6 Interleucina 6
IL-8 Interleucina 8
sIL-2R Receptor 2 de interleucinas
IFNγ Interferón gamma
TNFβ +252 Polimorfismo del gen de TNFβ en el primer intrón sitio +252
TNFα -308 Polimorfismo del gen de TNFα región promotora sitio -308
PG Polimorfismos genéticos
NAC Neumonía adquirida de la comunidad
RELACION DE FIGURAS Y TABLAS
Figura 1. Pacientes incluidos en el estudio 27
Cuadro 1. Características generales de niños con Enfermedad de Kawasaki y controles 28
Figura 2. Imagen de fotografía de gel de agarosa 28 Figura 3. Distribución de polimorfismos TNFα-308 29
Figura 4. Distribución de polimorfismos TNFβ +252 30
Figura 5. Niños con Enfermedad de Kawasaki y distribución de alelos TNFα-308 31
Figura 6. Distribución de alelos TNF α-308 32
Figura 7. Niños con Enfermedad de Kawasaki y distribución de alelos TNFβ +252 33
Figura 8. Distribución de alelos TNFβ +252 34
Figura 9. Frecuencia de TNFα -308 y TNFβ +252 en pacientes sin Enfermedad de Kawasaki 35 Cuadro 2. Alelos de TNFα-308 en los niños con Enfermedad de Kawasaki y grupo control 36
Cuadro 3. Aneurismas coronarios en niños con EK y el grupo control, con y sin alelo A1 y A2. 37
Cuadro 4. Niños con EK y grupo control, presencia y ausencia de alelo A1 y A2 38
Cuadro 5. Alelos de TNFβ +252 en niños con EK con y sin aneurismas coronarios y el grupo control 39
Cuadro 6. Presencia o ausencia de Alelos TNFβ +252 en niños con EK y el grupo control 40 Cuadro 7. Alelos de TNFα -308 y TNFβ +252 en niños y adultos sin Enfermedad de Kawasaki 41
RESUMEN
La Enfermedad de Kawasaki (EK) es la primera causa de cardiopatía adquirida
en niños en los países desarrollados, la complicación más grave es la
formación de Aneurismas Coronarios (AC). Existe una activación del sistema
inmune, que se considera el principal factor involucrado en la patogénesis de
la enfermedad.
Condiciones especiales del huésped, como ciertos polimorfismos genéticos, se
asocian a una respuesta inmune exagerada.
Objetivo. Determinar la frecuencia de asociación de los polimorfismos TNF α-
308 y TNFβ+252 en pacientes pediátricos mexicanos con Enfermedad de
Kawasaki y aneurismas coronarios.
Diseño. Estudio transversal analítico
Lugar. Unidad de investigación Biomédica en Inmunología e Infectología,
Unidad Médica de Alta Especialidad Hospital Dr. Gaudencio González Garza
del Centro Médico Nacional La Raza, del Instituto Mexicano del Seguro Social
y, El Instituto Nacional de Pediatría de la Secretaria de Salud.
Métodos. Se incluyeron 48 niños con Enfermedad de Kawasaki (22 con
aneurismas coronarios) y 61 niños del grupo control (sin EK). A todos se les
tomó muestra de sangre periférica y se extrajo DNA genómico. Mediante
RFLP-PCR se realizó la determinación de los polimorfismos TNF α-308 y
TNFβ+252.
Análisis estadístico. Para la descripción general de las características de los
niños se utilizó estadística descriptiva.
Para el análisis de las frecuencias de los polimorfismos TNF α-308 y
TNFβ+252 se realzó análisis bivariado. La significancia estadística de las
asociaciones se evaluó mediante la prueba de chi-cuadrada, cuando no fue
posible se aplicó la prueba exacta de Fisher, con nivel de significancia de 0,05.
Resultados. Se obtuvieron 48 muestras de niños con EK y 61 del grupo control
(sin EK). El número de homocigotos A1, en los niños con EK fue de 42
(87.5%), de A2, 5 (10%) y heterocigotos 1 (2%); en el grupo control
homocigotos A1 en 45 (74%), A2 con 10 (16%) y heterocigotos A1A2 en 6
(10%). El análisis no mostró diferencia significativa (p= 0.08). En los niños con
EK y Aneurismas coronarios fueron homocigotos A1 20 (91%), A2 en 2 (9%)
sin heterocigotos A1A2. En aquellos con EK sin aneurismas coronarios se
reportaron homocigotos A1 en 22 (85%), A2 fueron 10 (11%) y heterocigotos
A1A2 con 1 caso (4%). El análisis comparativo por grupos mostró una
tendencia a ser menos frecuente el genotipo heterocigoto A1A2 en los niños
con Enfermedad de Kawasaki y aneurismas coronarios, que el grupo control
(p= 0.052). Para la presencia o ausencia de A1 y A2, en los pacientes con EK
(48 pacientes, 96 alelos) se encontró A1 en 85 (89%) y de A2 en 11 (11%), en
el grupo control (61 pacientes, 122 alelos) presencia de A1 en 96 (79%) y de
A2 en 26 (21%), diferencia significativa con una menor frecuencia de A2 en los
niños con Enfermedad de Kawasaki (p=0.04) Para TNFβ +252, en los niños
con EK fueron homocigotos B1 2/48 (4%), B2 en 23 (48%) y heterocigotos
B1B2 con 23 (48%); en el grupo control homocigotos B1 con 6 (10%), B2 se
encontró en 26 (43%), heterocigotos B1B2 en 29 (47%). Sin diferencia
significativa al analizar las frecuencias.
Conclusiones. El genotipo heterocigoto A1A2 muestra una tendencia a ser
menos frecuente en los niños con Enfermedad de Kawasaki y aneurismas
coronarios, que el grupo control (p= 0.12).
En los niños con Enfermedad de Kawasaki y Aneurismas coronarios se
encontró menor frecuencia (con diferencia significativa), del A2, en
comparación con el grupo control (p= 0.04).
El alelo heterocigoto A1A2 mostró como tendencia ser más menos frecuente
(cercano a la significancia estadística) en los niños del grupo control,
comparación con aquellos del grupo control (p= 0.052).
No se encontró diferencia significativa en la frecuencia de los genotipos y alelos
de TNFβ+252 entre los grupos de estudio.
ABSTRACT
The Disease of Kawasaki (EK) is the first cause of cardiopathy acquired in
children in the developed countries, the most serious complication is the
formation of Aneurismas Coronarios (AC). An activation of the immune
system exists, that considers the main factor involved in the patogénesis of the
disease.
Special conditions of the guest, like certain genetic polymorphisms, are
associated to an exaggerated immune response.
Objective. To determine the frequency of association of polymorphisms TNF
α -308 and TNF β +252 in Mexican pediátricos patients with Disease of
Kawasaki and coronary aneurisms.
Design. Analytical cross-sectional study
Place. Unit of Biomedical investigation in Inmunología and Infectología, Medical
Unit of High Specialty Hospital Dr Gaudencio González Garza of the National
Medical Center the Race, of the Mexican Institute of the Social Insurance and,
the National Institute of Pediatría of the Secretary of Health.
Methods. 48 children with Disease of Kawasaki (22 with coronary aneurisms)
and 61 children of the group included themselves control (without EK). To all
peripheral blood sample was taken them and genomic DNA was extracted. By
means of Rflp-pcr the determination of polymorphisms TNF -308 and α TNF
+252 was madeβ .
Statistical analysis. For the general description of the characteristics of the
children descriptive statistic was used.
For the analysis of the frequencies of polymorphisms TNF α -308 and TNF
β +252 bivaried analysis was heightened. The statistical significance of the
associations was evaluated by means of the test of chi-square, when it was not
possible was applied the exact test of Fisher, with level of significance of 0,05.
Results. 48 samples of children with EK and 61 of the group were obtained
control (without EK). The number of homocigotos A1, in the children with EK
was of 42 (87.5%), of A2, 5 (10%) and heterocigotos 1 (2%); in the homocigotos
group control A1 in 45 (74%), A2 with 10 (16%) and heterocigotos A1A2 in 6
(10%). The analysis did not show significant difference (p = 0,08). In the
children with coronary EK and homocigotos Aneurisms they were A1 20 (91%),
A2 in 2 (9%) without heterocigotos A1A2. In those with EK without coronary
aneurisms homocigotos A1 in 22 were reported (85%), A2 was 10 (11%) and
heterocigotos A1A2 with 1 case (4%). The comparative analysis by groups
showed to a tendency to be less frequent the genotype heterocigoto A1A2 in
the children with Disease of Kawasaki and coronary aneurisms, that the group
control (p = 0,052). For the presence or absence of A1 and A2, in the
patients with EK (48 patients, 96 alelos) was A1 in 85 (89%) and of A2 in 11
(11%), in the group control (61 patients, 122 alelos) presence of A1 in 96 (79%)
and of A2 in 26 (21%), significant difference with a smaller frequency of A2 in
the children with Disease of Kawasaki (p=0.04)
For TNFβ +252, in the children with homocigotos EK were 2/48 (4%) 23 (48%)
heterocigotos and, B1B2 with 23 (48%); in the homocigotos group control B1
with 6 (10%), B2 was in 26 (43%), heterocigotos B1B2 in 29 (47%). Without
significant difference when analyzing the frequencies.
Conclusions. The genotype heterocigoto A1A2 shows to a tendency to be
less frequent in the children with Disease of Kawasaki and coronary aneurisms,
that the group control (p = 0,12).
In the children with Disease of Kawasaki and coronary Aneurismas was minor
frequency (with significant difference), of the A2, in comparison with the group
control (p = 0,04).
I stupefy heterocigoto A1A2 showed as tendency to be more less frequent (near
the statistical significance) in the children of the group control, comparison with
those of the group control (p = 0,052).
Ονε ωασ νοτ σιγνιφιχαντ διφφερενχε ιν τηε φρεθυενχψ οφ τηε γενοτψπεσ ανδ αλ
ελοσ οφ ΤΝΦ β +252 between the training groups.
1
2. ANTECEDENTES
La Enfermedad de Kawasaki (EK) es una vasculitis aguda sistémica de etiología
desconocida que afecta principalmente a niños menores de 5 años, descrita por
primera vez en 1967 por el Dr. Tomisaku Kawasaki, es la primera causa de
cardiopatía adquirida en niños en los países desarrollados incluidos los Estados
Unidos de Norteamérica (EU) y Japón.1,2
La enfermedad ha sido reportada en todos los grupos étnicos y raciales, en el 85%
de los casos se presenta en menores de 5 años, siendo menos común antes de
los de 6 meses y después de los 8 años, sin embargo en estos grupos de edad se
incrementa el riesgo de complicaciones cardiovasculares3.
Se han reportado desde la etapa neonatal hasta adolescentes con un pico de
incidencia entre los 9 y 11 meses de edad 4,5.
Es más frecuente en Japón con más de 186,000 casos reportados hasta este
momento, y una incidencia de 151/100,000 niños menores de 4 años, en EU de
acuerdo a la región y al grupo étnico la incidencia va de 6 a 67/100,000 en niños
menores de 5 años de origen no asiático y de 44/100,000 niños de origen
asiático6, en Canadá se describe una incidencia de 20.6/100,0007, en Chile se ha
calculado en 3/100,0008, en China se refiere de 22/100,000 niños9 y, en Gran
Bretaña, de 8.1/100,000 niños menores de 5 años6.
En México no obstante los reportes existentes, se desconoce la incidencia de la
enfermedad.
2
Se observa un incremento gradual de la enfermedad a nivel mundial,
especialmente en Japón, que es el país donde ocurre con mayor frecuencia10. Los
hombres se afectan más que loas mujeres con una relación 1,35 a 1. La
mortalidad se estima en 0.05%, con una tasa de recurrencia menor al 4%.6
La etiología es desconocida, sin embargo las variaciones estaciónales con un pico
entre febrero y mayo, y un patrón epidémico cíclico sugiere un probable origen
infeccioso.3,6,11-12
El conocimiento acerca de los cambios patogénicos que ocurren en la enfermedad
es limitado debido a la dificultad para analizar in vivo muestras de tejido de las
arterias coronarias. Existe un número importante de cambios inmuno-rreguladores,
donde la activación del sistema inmune es el hallazgo central en la enfermedad,
asociado a una concentración aumentada de citocinas pro-inflamatorias y
quimiocinas, incluyendo al Factor de Necrosis tumoral alfa (TNFα), interleucina-
1(IL-1), interleucina-6(IL-6) e Interleucina-8 (IL-8), particularmente en la fase
aguda de la enfermedad.13-14
La enfermedad se iniciaría con la exposición a un microorganismo, toxina o
antígeno que activa elementos celulares del sistema inmune, como consecuencia
un grupo de citocinas proinflamatorias se incrementan, de estas principalmente
TNFα, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, receptor 2 de interleucinas ( sIL-2R) e interferón gama
(IFN φ).15-17
Los niveles séricos de TNF-α se encuentran elevados en la mayoría de los niños
durante la fase aguda de la enfermedad, sobre todo en aquellos que desarrollan
3
aneurismas coronarios. Las paredes vasculares son atacadas por los anticuerpos
citotóxicos activados dando origen a la lesión vascular característica13-18. Se
encuentra acumulación subendotelial de células mononucleares, células T
primarias, monocitos y macrófagos, la inflamación transmural ocurre cuando los
infiltrados inflamatorios desde el lumen y la adventicia, ingresan a la capa media,
con edema y necrosis del músculo liso, finalmente ocurre destrucción de la capa
media y la formación de aneurismas19.
Se discute la participación de metaloproteinasas de la matriz, debido a los altos
niveles encontrados en la fase aguda de la enfermedad, especialmente en
aquellos que desarrollan aneurismas coronarios, la síntesis de estas proteasas es
incrementada por diversas citocinas, especialmente TNFα, IL-1, IL-2 e Interferón
gama20,21.
En las autopsias se encuentra formación de trombos con o sin recanalización,
proliferación de la intima y fibrosis de la media13.
Se desconoce porqué solo algunos pacientes presentan esta complicación, se ha
sugerido que una respuesta específica del huésped influye en la cascada de
eventos que culminan con la formación de los aneurismas3.
El diagnóstico de la EK se realiza con base a criterios elaborados por un panel de
expertos (cuadro 1)22, el objetivo fundamental es establecer un diagnóstico
temprano e instaurar un tratamiento oportuno, para tratar de evitar la complicación
más grave que es la formación de aneurismas2,11-12.
Algunos pacientes pueden presentar manifestaciones sistémicas como
4
irritabilidad, llanto frecuente y ataque al estado general. Otros datos clínicos
menos frecuentes son meningitis aséptica, uveitis anterior, artralgias y/o artritis,
diarrea, hepatomegalia, esplenomegalia, íleo, pancreatitis, hidrocolecisto, hepatitis,
neumonitis, otitis media, piuria estéril o uretritis, orquitis y eritema o induración en
el sitio de la inoculación de la vacuna BCG11,23.
De las lesiones más graves en la enfermedad se encuentran las alteraciones de
las arterias coronarias. Virtualmente toda la mortalidad atribuida a la enfermedad
esta relacionada con la afectación del sistema cardiovascular, que se puede
acompañar de derrame pericárdico, insuficiencia cardiaca, miocarditis,
insuficiencia valvular, arritmias cardiacas e infarto agudo al miocardio. La
frecuencia en la formación de aneurismas coronarios se describe con similar
frecuencia en todas las series, a pesar de que la mayor incidencia de la
enfermedad ocurre en el Japón. Se presenta hasta en un 20-35% de los casos no
tratados y en el 10-15% de los casos que recibieron tratamiento con
gammaglobulina6,7,12. En México, donde se desconoce la verdadera incidencia de
la enfermedad, los reportes encontrados pueden no reflejar la magnitud del
problema; Alarcón y cols.24 (1991) encuentra que se presentaron aneurismas
coronarios en 31.2% (5 de 16 casos) de su serie, Galnarez y cols25. (1991) lo
encontró en 53.8% (7 de 13 casos); Cruz y cols.26 (2001) en 57% (4 de 7 casos),
Rodríguez-Carbajal y cols27. (2003) en 35.7% (5 de 14 casos), finalmente en una
serie no reportada (motivo de una tesis) en la Unidad Médica de Alta Especialidad
“Dr. Gaudencio González Garza del Centro Médico Nacional La Raza28 se
encontraron en 78.6% (11 de 14 casos).
5
La historia natural de los aneurismas en las arterias coronarias depende del
tamaño y tipo de lesión. El mejor pronóstico se describe para los aneurismas
fusiformes menores de 8mm y el peor para los aneurismas gigantes de más de
8mm. Se ha señalado una evolución que varia desde la remisión de las lesiones,
hasta infarto miocárdico fatal, cerca del 20% de quienes presentaron aneurismas
durante la fase aguda de la enfermedad, desarrollaran estenosis coronaria y
subsecuentemente requerirán algún tipo de tratamiento para esta secuela12,29-30.
Se entiende por aneurisma coronario a la dilatación de las arterias coronarias en
su diámetro interno, considerándose aneurisma pequeño aquel con una medición
de 3 a 5mm, aneurisma mediano de 5 a 8mm y aneurisma gigante más de 8mm30.
En estudios longitudinales de hasta 21 años en Japón encuentran una regresión
de los aneurismas hasta en el 50%, estenosis en el 20% y persistencia de
aneurismas sin estenosis en el 40%31.
En aquellos que muestran regresión (50% de los casos) esta ocurre, en la mayoría
de las veces, en un lapso de 5 años, para las lesiones leves (3-4mm) en un
máximo de 2 años y en las lesiones moderadas el 80% lo hace alrededor de los 5
años. La estenosis en las arterias coronarias y la hipodistensibilidad son factores
de riesgo potencial para futuras complicaciones32. Puede ocurrir oclusión
trombótica de los aneurismas debido a éstasis del flujo y la reducción súbita a
través del aneurisma, aún en los casos donde existió regresión de los aneurismas,
persiste disfunción vascular y anormalidades morfológicas a largo plazo 33 .
Debe buscarse de manera intencionada en todo adulto joven con infarto al
6
miocardio o muerte súbita, una historia de enfermedad en la infancia compatible
con enfermedad de Kawasaki34.
La participación de los aneurismas coronarios en pacientes con EK se relaciona
con un mayor riesgo para el desarrollo de ateroesclerosis en la edad adulta35.
El tratamiento, una vez confirmada la enfermedad, esta dirigido a limitar el proceso
inflamatorio, reducir el desarrollo de aneurismas coronarios y otras complicaciones
secundarias a la vasculitis. Lo anterior se establece a base de gammaglobulina
humana intravenosa a dosis de 2 g/kg dosis única y ácido acetil salicílico a razón
de 100 mg/kg3,23. Existen reportes de otros tipos de medicamentos empleados
especialmente en pacientes con fiebre refractaria y aneurismas gigantes, tales
como metotrexato, dipiridamol, ciclosporina e infliximab.1,12.
Se ha sugerido una posible influencia genética debido a que la enfermedad se
presenta con mayor frecuencia en asiáticos y asiático-americanos. En Japón el
riesgo de adquirir la enfermedad entre hermanos es de 10 veces mayor que en la
población general36. No obstante, los estudios existentes han fallado en encontrar
esta asociación entre enfermedad de Kawasaki, y algún marcador del complejo
mayor de histocompatibilidad12.
Los investigadores han tratado de identificar aquellos pacientes con mayor riesgo
de presentar la complicación más grave, que es la formación de aneurismas
coronarios, los estudios sugieren que niveles séricos incrementados de
deshidrogenada láctica, bilirrubinas, glutamiltranspeptidasa, proteína C reactiva,
Hb menor a 9g/dl, cuenta de leucocitos con 1) más de 50% neutrofilos o más de
7
50% de bandas, o 2) más de 75% de neutrofilos o más de 10% de bandas, y
características demográficas (sexo masculino, menores de 6 meses y mayores de
8 años), así como respuesta incompleta a la administración de gammaglobulina
humana, se asocian al desarrollo ulterior de aneurismas coronarios37-39.
Se piensa de una susceptibilidad genética para el desarrollo de aneurismas
coronarios, relacionado con la capacidad de algunos individuos para secretar
mayores cantidades de TNFα frente a ciertos estímulos40-42; donde precisamente
el apoyo de eventos patogénicos y los cambios en la inmunoregulación de la fase
aguda de la enfermedad sitúan al TNFα como el iniciador, y quién mantiene esta
respuesta exagerada del organismo. Lo anterior respaldado por la asociación
encontrada entre niveles elevados de TNFα y la presencia de aneurismas
coronarios. Por otro lado la participación de TNFα y enfermedad coronaria ha sido
documentada en otras situaciones clínicas, como en el caso de adultos con
coronopatías, donde los niveles aumentados de esta citosina predice la
recurrencia de eventos cardiacos43.
TNFα es una citosina proinflamatoria que participa en la respuesta Th1, es una de
las muchas sustancias responsables de la regulación de las interacciones entre las
células del sistema inmune. TNFα es derivado principalmente por macrófagos
activados, células T y mastocitos activados, se genera como una glucoproteína
transmembranal, no glucosilada de 26 kd, después por un corte proteolítico es
ensamblada como un homotrímero de 51 kd, su acción se hace manifiesta luego
de la unión del trímero soluble a los receptores de superficie de las células. La
8
forma soluble de TNFα es un fragmento de 17 kd, ambas formas tienen actividad
biológica de importancia. Estimula la síntesis de novo de varios grupos de
moléculas de adhesión celular, induce cambios vasculares, afectando la adhesión
de leucocitos y promoviendo la actividad procoagulante44.
Las funciones de esta citosina varían dependiendo de la cantidad que se produce,
a concentraciones bajas (menos de 15 pg/mL) actúa a nivel de inflamación local, a
niveles moderados actúa como pirógeno endógeno, estimula la producción de IL-1
e IL-6, la administración continua de cantidades moderadas de manera crónica
induce al estado de caquexia y, a cantidades masivas (más de 1x10-7 pg/mL)
produce colapso circulatorio y coagulación intravascular diseminada.
A pesar de su papel fisiológico en el organismo (actividad antitumoral, antiviral,
antimicrobiana, induce crecimiento tisular, diferenciación de tejidos e
inmunorregulación), un aumento en sus niveles se ha relacionado con la
patogénesis de enfermedades asociadas al complejo mayor de
histocompatibilidad, especialmente aquellas con componente inflamatorio y
autoinmune.
Los mecanismos mediante los cuales interviene son:
1. Liberación de moléculas de adhesión en células endoteliales a través de
mecanismos coestimulatorios.
2. Activación de una variedad de elementos celulares incluyendo células T,
células B, macrófagos y fibroblastos.
3. Exceso de producción en el mismo TNFα y otras citosina proinflamatorias
9
incluyendo 1L-1, IL-6, IL-8, factor estimulante de colonias de granulocítos y
macrófagos y factor de diferenciación para osteoclastos.
4. Incremento en la expresión de moléculas de adhesión celular, migración y
activación celular, promoción de un estado de hipercoagulabilidad 45-48.
Se considera al TNFα como el detonante de la lesión endotelial, en especial en
arterias de pequeño y mediano calibre, particularmente las arterias coronarias.
El aumento de la expresión de TNFα con el consiguiente desarrollo de
enfermedades crónicas inflamatorias y auto-inmunes podría explicarse, además
de otros factores, en base a la presencia de determinados polimorfismos en su
gen, el cual se localiza en el brazo corto del cromosoma 6 en la región III (central)
del Complejo Mayor de Histocompatibilidad, a 250Kb centroméricas del locus del
HLA-B y 850 Kb teloméricas del HLA-DR. Es un gen polimórfico, lo cual se define
como presencia de dos o más alelos de cualquier sistema en una población en la
que la frecuencia del más raro de ellos no puede explicarse por mutación
recurrente49-51. La sustitución de una guanina por una adenina (G-A) en la
posición –308, genera los alelos conocidos como TNF1 (G) y TNF2 (A). Lo cual da
lugar a tres genotipos para TNFα: homocigotos A/A, homocigotos G/G y
heterocigotos A/G. La síntesis del TNFα puede variar en función de este
polimorfismo. El alelo TNF2 (G/A, A/A) se ha asociado con una transcripción
significativamente aumentada de la citocina. Se ha encontrado, en diferentes
estudios, que el este mismo alelo puede estar asociado con varias patologías
autoinmunes como Artritis Reumatoide y Lúpus Eritematoso Sistémico.
10
La asociación entre estos polimorfismos, del gen que expresa TNFα, con la
enfermedad, ha sido documentado, encontrando que los genotipos A2 de TNFα-
308 son hipersecretores de TNFα en pacientes con sepsis, así como en aquellos
que desarrollan malaria, shock séptico, tuberculosis, lupus eritematoso sistémico,
neumonía de la comunidad, y leishmaniasis, entre otras52-59, en los cuales la
presencia de este polimorfismo se relaciona con una mala evolución, mayor
mortalidad, y predisposición para desarrollar shock séptico; escenarios en los que
TNFα es la principal citosina involucrada.
Además del anterior, se sabe que el polimorfismo del gen TNFβ contribuye para
una mayor capacidad en la síntesis de TNFα, no es del todo clara la manera como
el polimorfismo de TNFβ se asocia con esta mayor secreción de TNFα. El
polimorfismo del gen se explica por la sustitución de guanina por adenina en la
posición +252, lo cual da lugar a los genotipos homocigotos B1B1 (G/G),
homocigotos B2B2 (A/A) y heterocigotos B1B2 (G/A), por convención el alelo más
frecuente se designa como B1 y el más raro como B250, precisamente la presencia
del genotipo B2B2 se asocia a niveles incrementados de TNFα circulantes43. Lo
anterior ha sido igualmente demostrado en adultos post-operados donde
encontraron asociación entre el alelo TNFB2 con más altos niveles de TNFα y
mayor tasa de mortalidad50, lo mismo en pacientes con sepsis postraumática, en
quienes mostraron una forma más grave de la enfermedad y mayor mortalidad
para los portadores del alelo B254.
McArthur encontró, en un grupo de pacientes pediatricos con bacteremia una
11
asociación entre el polimorfismo TNFB2 y mayores niveles de TNFα, con un
aumento en la mortalidad en el grupo de pacientes que presentaban dicho
polimofrismo60.
En pacientes con enfermedad EK se ha encontrado incremento en los niveles
circulantes de TNFα en la fase aguda de la enfermedad, y aún niveles más
elevados en quienes presentan la forma más grave de la enfermedad (presencia
de aneurismas coronarios)43,45-47, con base en lo anterior, se ha intentado
demostrar asociación entre este polimorfismo a TNFα -308, y el desarrollo o la
presencia de aneurismas coronarios; con la distribución y variabilidad en pacientes
donde la enfermedad es más frecuente (Japón), pero hasta ahora no ha sido
posible comprobar esta asociación61-63.
Quasney y cols64 en el 2001, estudiaron un grupo de pacientes blancos originarios
de Estados Unidos (EEUU) no descendientes de japoneses con EK y otro de
pacientes originarios del Japón, y encontró asociación entre polimorfismo a TNFα
en el sitio –308 (TNFA2), y la presencia de aneurismas coronarios en el grupo de
pacientes blancos y no en los japoneses, no así para TNFβ. Lo anterior apoya la
idea de una susceptibilidad genética de polimorfismo a TNFα –308, y la presencia
de aneurismas coronarios en la EK.
En México, la frecuencia y participación en la enfermedad, de los polimorfismos de
los genes que participan en la síntesis de TNFα ha sido analizada por Hernández-
Pacheco y cols65. al describir asociación del polimorfismo a TNFα -308 (alelo A2) y
enfermedad cardiaca reumática (en adultos); Rodríguez-Carreón y cols66.
12
demostró una mayor frecuencia de este mismo alelo (A2) de TNFα -308 en las
formas más severas de AR (adultos), finalmente Yamamoto-Furusho y cols67
encontró una asociación para el alelo A2 de TNFα -308 en pacientes con colitis
ulcerativa68. Además del reporte de un grupo colaborativo internacional69 que
señala una frecuencia del 5% de polimorfismo a TNFα -308, para el genotipo A2
(A/G) de 3-5%% (adultos mexicanos sanos), que al contrastarse con el 26% del
grupo control de adultos blancos de origen estadounidense sin enfermedad de
Kawasaki estudiado por Quasney, se observa que difieren notablemente.
Los estudios anteriores muestran una frecuencia diferente de los polimorfismos de
los genes que expresan TNFα y TNFβ entre la población blanca de EEUU (País
de donde se extrajo la muestra de pacientes por Quasney) y nuestra población, lo
cual se relaciona con una capacidad distinta para la expresión de TNFα, citosina
que juega un papel cardinal en la EK, particularmente en quienes desarrollan
aneurismas coronarios; por lo que es importante identificar, en pacientes
Mexicanos la asociación entre la frecuencia del polimorfismo a TNFα -308 y
TNFβ+252 en la enfermedad de Kawasaki con aneurismas coronarios
13
3. JUSTIFICACION
TNFα -308 y TNFβ +252 se asocian a una mayor producción de TNFα.
En población pediátrica Oriental con EK se ha informado ausencia de estos
polimorfismos, pero en otras poblaciones de niños con EK se ha encontrado hasta
en 35% de los casos.
En adultos mexicanos la frecuencia de TNFα -308 y TNFβ +252 es del 1.5-4%,
pero se desconoce en población pediátrica Mexicana y en la Enfermedad de
Kawasaki.
Su frecuencia podría ser mayor en pacientes pediátricos mexicanos con
enfermedad de Kawasaki que presentan aneurismas coronarios.
14
4. HIPOTESIS
Los polimorfismos TNFα -308 y TNFβ+252 son más frecuentes en pacientes
pediátricos mexicanos con enfermedad de Kawasaki que presentan aneurismas
coronarios.
15
5. OBJETIVOS
5.1. OBJETIVO GENERAL:
Determinar la frecuencia de asociación de los polimorfismos TNF α-308 y
TNFβ+252 en pacientes pediátricos mexicanos con Enfermedad de Kawasaki y
aneurismas coronarios.
5.2. OBJETIVOS PARTICULARES:
Determinar la frecuencia de polimorfismo de TNF α-308 y TNFβ+252 en pacientes
con EK con y sin aneurismas coronarios.
16
6. MATERIAL Y METODOS
6.1. Tipo de Estudio
Observacional
Analítico
Comparativo
Prolectivo
6.2. Ubicación Temporal y Espacial
Transversal
6.3. Criterios de Selección de la Muestra
Criterios de Inclusión:
Pacientes de 0 a 16 años
Sexo masculino y femenino
Con diagnóstico de Enfermedad de Kawasaki, de acuerdo a los criterios de la
American Heart Association (AHA).22
Con aneurismas coronarios (casos); sin aneurismas coronarios (controles) de
acuerdo a los criterios de la AHA22
Consentimiento informado por escrito del padre o responsable legal del paciente
17
Criterios de no inclusión
Portadores de enfermedades auto-inmune como Artritis reumatoide Juvenil, Lupus
Eritematoso Sistémico,Tuberculosis, Linfoma, Leucemia.
Con aneurismas coronarios de otra etiología como Poliarteritis Nodosa, arteritis de
Takayasu, Sífilis.
Criterios de eliminación
Muestreo incompleto
Muestra inadecuada
Degradación de DNA
Criterios de exclusión
No aplica por ser un estudio transversal
6.4. Variables
Variable Independiente (predictora)
POLIMORFISMO TNFα -308
Categoría. Cualitativa
Escala de medición Nominal
18
Unidad de análisis Dicotómica (Presente – ausente)
Definición conceptual. Es una variación en la secuencia del ADN que ocurre
en al menos 1% de la población. Dentro de la región promotora en la
posición –308 del gen para TNFα, que consiste en una transversión de la
base guanina por adenina 41,43.
Definición operacional. Los fragmentos del DNA genómico se amplificarán por
medio de la técnica de reacción en cadena de polimerasa (PCR) con
iniciadores específicos para TNFα.
La presencia del polimorfismo de cada paciente se determinará después de
la digestión con Nco1 del producto amplificado y posteriormente se realizará
electroforesis en gel de agarosa teñida con bromuro de etidio, donde se
determinará la presencia de los genotipos A1A1, A1A2, A2A2 .
POLIMORFISMO TNFβ
Categoría. Cualitativa
Escala de medición Nominal
Unidad de análisis Dicotómica (Presente – ausente)
Definición conceptual. Es el polimorfismo en la longitud del fragmento de
restricción Nco1 bi-alélico, en el primer intrón produciendo el alelo TNFB241.
Definición operacional. Los fragmentos del DNA genómico se amplificarán por
medio de la PCR con iniciadores específicos para TNFβ.
La presencia del polimorfismo en cada paciente se determinará después de la
19
digestión con Nco1 del producto amplificado y posteriormente se realizará
electroforesis en gel de agarosa teñida con bromuro de etidio, donde se
determinará la presencia de los genotipos B1B1, B1B2, B2B2.
Variable Dependientes (de desenlace)
ANEURISMAS CORONARIOS
Categoría. Cualitativa
Escala de medición. Nominal
Unidad de análisis. Dicotómica (Presente – ausente)
Definición conceptual. Dilatación de las arterias coronarias en su diámetro
interno, considerándose aneurisma pequeño aquel con una medición de 3 a
5mm, aneurisma mediano de 5 a 8mm y aneurisma gigante más de 8mm30.
Definición operacional. El diagnóstico se establece mediante ecocardiografía,
procedimiento que se realiza por un experto (Cardiologo Pediatra), con un
equipo HP sonus 5500MR, con transductor de alta frecuencia que de
acuerdo a la edad del paciente, de 4 mHz (lactantes y preescolares) o de 8
mHz (escolares), obteniéndose las mediciones de los diámetros internos de
las arterias coronarias mediante los siguientes ejes: eje corto para los
grandes vasos, eje largo para el ventrículo izquierdo y apical de 5 cámaras.
6.5. Tamaño de la Muestra
Se usó la fórmula para dos proporciones (variable de interés cualitativa)
20
Alfa 0.05
Beta 0.20
Unidireccional
n= Número de sujetos necesarios en cada uno de los grupos
Zα= Valor de Z correspondiente al riesgo α determinado (1.96)
Zβ= Valor de Z correspondiente al riesgo β determinado (0.840)
P1= Valor de la proporción del grupo de referencia (5%)
P2= Valor que se supone existe en el grupo de estudio (36%)
P1-P2= Valor mínimo de la diferencia que se desea detectar (0.36 – 0.05)
P= media ponderada de las proporciones P1 y P2
El valor P2 (36%) representa el porcentaje del genotipo heterocigoto A/G
encontrado por Quasney en niños con enfermedad de Kawasaki y neurismas
coronarios (Pediatr Res 2001;49:686-90).
El valor P1 (5%) es la frecuencia del mismo genotipo A/G encontrado en la
población mestiza Mexicana (J Autoimm 2005; 24:63-8)
Se tomó un grupo control externo (sin EK) ya que la información de la frecuencia
de estos polimorfismos en adultos Mexicanos, podría no corresponder la
frecuencia en población pediátrica. Por ello se hará un corte para ajuste y estimar
el número necesario para encontrar una diferencia significativa.
21
( )[ ] ( ) ( )[ ][ ]( )221
2
2211 1112PP
PPPPZPPZn
−
−+−+−=
βα
n= 20 en cada grupo
Además 60 pacientes sin Enfermedad de Kawasaki
6.7. Análisis Estadístico
El análisis de los genotipos y las frecuencias alélicas para ambos polimorfismos
en los grupos de estudio se realizó mediante la prueba Ji cuadrada para K
muestras independientes con corrección de Yates, de acuerdo al numero a incluir
en cada celda, cuando fue menor de 5, se utilizó entonces prueba exacta se
Fisher.
La Estadística descriptiva para variables cualitativas se realizó mediante moda,
mediana, rango y proporción, y para las cuantitativas, promedio y desviación
estándar.
6.8. Descripción Operativa del Estudio
De los pacientes que reunieron los criterios de selección, se procedió a la
recolección de la información y toma de muestra sanguínea, la cual se realizó en
la misma visita del paciente.
Se incluyó un grupo de pacientes sin enfermedad de Kawasaki que acudían para
22
toma de estudios básicos de laboratorio de los servicios de cirugía pediátrica y
oftalmologia, de los que se observó además una procedencia heterogénea en
cuanto a origen y residencia, que fueron por tanto pueden una muestra externa
representativa para los fines del estudio.
Recolección de datos.
Se realizó durante la entrevista mediante un cuestionario ( anexo 1 y 3), para
algunas preguntas se tomó información del expediente clínico, con la finalidad de
evitar el sesgo de recuerdo.
La información obtenida en el anexo 1 y 3, se archivó, hasta la obtención de todos
los datos de los pacientes investigados, creando una base de datos.
Para la obtención de la muestra de sangre se procedió a:
1. Localización de una vena periférica adecuada en el brazo (basílica o
cefálica)
2. Ligar el brazo elegido por arriba del sitio de punción.
3. Desinfectar la zona de punción elegida con alcohol al 70% en una torunda
de algodón
4. Utilizar para la punción, tubos de ensayo sellados del sistema Vacutainer MR
(previamente rotulados con clave numérica) con vacío, o jeringa de 10cc.
23
5. Punción con el menor traumatismo posible.
6. Obtención por vacío un tubo de 3 mL de Vacutainer MR con EDTA para
biometría hemática, ó en jeringa, Retiro de ligadura.
7. Algodón con alcohol al 70% sobre el sitio de punción.
8. Retiro gentil de la aguja.
9. Se solicito al paciente doblar su brazo y realizar presión con una torunda
impregnada con alcohol al 70% por 5 minutos.
10. Se Vacio inmediatamente a los tubos descritos, si la muestra se obtuvo por
jeringa, con cuidado de no producir hemólisis.
11. La muestra se colocó en refrigeración hasta su procesamiento, dentro de las
dos primeras horas de la extracción.
Obtención de células mononucleares por gradiente de densidad.
Se realizó mediante la técnica de obtención de células por gradiente de densidad
con el método estándar descrito en la metodología utilizada por Stuber y cols.54. El
reactivo utilizado fué LynphoprepMR.
Extracción de ácido desoxiribonucléico por método de fenol cloroformo con
precipitación en etanol.
El DNA genómico de cada paciente se extraerá por procedimientos de extracción
24
estándares con fenol/cloroformo de células mononucleares sanguíneas (47).
Análisis de las variantes alélicas de TNF basado en la técnica de PCR.
TNFα . Se amplificó un fragmento de 107 pares de bases (bp) (posición -327 a-
220) del promotor del TNFα por PCR de cada muestra con los iniciadores A1 (5' -
AGG CAA TAG GTI TTG AGG GCC AT- 3') y A2 ( 5' -TCC TCC CTG CTC CGA
TIC CC 3') (20). El iniciador Al se diseñó para incorporar el sitio polimórfico de TNF
A en una secuencia de restricción Nco1 (20). La PCR se llevará a cabo en tubos
de 0.2 mL con (2 ng) de DNA genómico servirá como molde en una mezcla de
reacción de 50µl. Esta mezcla de reacción con los siguientes químicos: 20 pmol de
cada uno de los iniciadores; una unidad de Taq polimerasa, buffer de reacción ;
200µm de cada desoxiribonucleósido trifosfato; y 2 µm de cloruro de magnesio. Se
llevó a cabo un ciclo a 95°C por 2 minutos. seguido por 35 ciclos a 94°C por 30
seg, 60°C por 30 seg y 72°C por 30 seg; finalmente por 7 min a 72°C.
Los productos de PCR fueron digeridos toda la noche a 37°C con Nco1 a 4U/20 µl
de reacción. Los patrones de restricción se visualizaron bajo luz ultra violeta
después de electroforesis (70 V por 45 min) a través de gel de agarosa al 1.5%
teñido con bromuro de etidio. La digestión de Nco1 del DNA genómico amplificado
por PCR produce dos fragmentos de 20 bp Y de 87 bp del alelo TNFα A1 y un solo
fragmento de 107 bp del alelo TNFα A2.
25
TNFβ. Se amplificó un fragmento de 782 bp de DNA genómico, conteniendo el
sitio polimórfico Nco1, se amplificará usando PCR. La PCR se llevará cabo en
tubos de 0.2 mL con 2 ng de DNA genómÍco que servirá como molde en una
mezcla de reacción de 50 µl. Esta mezcla de reacción con los siguientes reactivos:
20 pmol de cada uno de los iniciadores; 1 (5' CCG TGC TIC GTG CTT TGG ACT
A 3' ) Y el iniciador 2 ( 5' AGA GGG GTG GAT GCT TGG GTI' C 3' ); una unidad
de Taq polimerasa, buffer de reacción 1 x; 200 µM de cada desoxiribonucleósido
trifosfato; y 2 µM de cloruro de magnesio.
Protocolo para la Reacción en Cadena de la Polimerasa.
Primero, un paso de desnaturalización por 3 minutos a 95°C, seguido por 37 ciclos
de una desnaturalización por 30 seg a 95°C, un alineamiento por 30 seg a 68°C, y
una extensión por 42 seg a 74°C. Se llevó a cabo una extensión final por 6 min a
74°C antes de analizar 10 µl del producto amplificado por electroforesis en gel de
agarosa al 1.5% y tinción posterior con bromuro de etidio. La digestión con Ncol se
llevó a cabo en 15 µl del producto de DNA amplificado. El DNA digerido se analizó
por electroforesis en gel. La tinción con bromuro de etidio del gel demostró el
fragmento original de 782 bp (pacientes homocigotos para el alelo TNFB2,
careciendo del sitio Ncol; tres fragmentos de 782, 586 Y 196 bp de longitud
(pacientes heterocigotos), o dos fragmentos de 586 y 196 pb de tamaño
(pacientes homocigotos para el alelo TNF B1).
26
CONTROL DE CALIDAD
En la parte clínica y experimental se utilizó medidas generales de seguridad (uso
de bata, guantes. cubre bocas). En la parte experimental se trabajó bajo campana
de flujo laminar con material estéril, en las pruebas de laboratorio se ssiguieron las
indicaciones precisas recomendadas por los fabricantes de reactivos.
Para comprobar que realmente se obtuvo ADN después de la extracción se realizó
una lectura en espectrofotómetro a 260 nm y a 280 nm para obtener el índice de
pureza de la muestra. Para PCR se colocó un control positivo obtenido de la
clonación del DNA de cada genotipo, además de un control negativo, esto por
cada corrida.
Posterior a la digestión con enzima de restricción Nco1, se realizó electroforesis
del digerido en gel de agarosa, conjuntamente con los marcadores de peso
molecuIar se utilizará una muestra control (amplificada por PCR), para asegurar
que el tamaño obtenido de Ias bandas fuera el correcto.
27
7. RESULTADOS
Se incluyeron un total de 48 niños con Enfermedad de Kawasaki de los cuales 22
presentaban Aneurismas Coronarios.
Figura 1. Total de Pacientes con Enfermedad de Kawasaki
46%
54%
Con AneurismasCoronariosSin AneurismasCoronarios
Figura 1. Pacientes incluidos en el estudio. Se muestra un total de 48 pacientes, 22 de ellos presentaban aneurismas coronarios. En el cuadro 1 se muestran las características generales de los pacientes y del
grupo control. Se encontró predomino del sexo masculino en los pacientes con
EK, sin embargo no hubo diferencia significativa entre ambos grupos (EK y
control).
Como se observa no hubo diferencias en la edad de ambos grupos. Se realizó
prueba de t para las variables numéricas (edad) y Chi-cuadrada con corrección de
Yates para la variable de género.
28
Cuadro 1. Características generales de niños con Enfermedad de Kawasaki y controles.
Enfermedad de Controles t/p Kawasaki n= 48 n= 61
Edad 25.11+10.89 22.95+10.62 0.08
Masculino:femenino 30:18 33:28 0.12
Cuadro 1. Se muestran los valores de edad y sexo con su desviación estándar en cada una. Se determina prueba de t para las variables numéricas y chi-cuadrada con corrección de Yates para género. Se muestra el valor de p para cada una.
En la figura 2 se muestra una fotografías de gel de agarosa 1.5%, se muestra los
pesos moleculares y los carriles que corresponden a cada paciente.
Figura 2. Alelos A1 y A2 de TNFα
Figura 2. Imagen de fotografía de gel de agarosa en barrido electroforético. En el carril No. 1 se muestra las bandas de
25pb, en el carril 3 y 5 se observan dos bandas una de 87 pb y otra de 20 pb que corresponden al alelo A1, en los carriles 2
y 4 una banda de 107pb que corresponde al alelo A2.
1 2 3 4 5
29
Fue posible la identificación de los en todos los pacientes. Para TNFα-308, en los
niños con EK se encontraron homocigotos A1 en 42/48 (88%), de A2 en 5/48
(10.4%) y heterocigotos A1/A2 fue 1/48 (2%). En los niños sin EK el número de
homocigotos A1 fue de 45/61 (74%), de A2 en 10/61 (16%) y heterocigotos A1/A2
en 6/61 (10%).
Figura 3. Distribución de polimorfismos de TNFα en la población de estudio. En los niños con EK se encontraron una frecuencia de homocigotos A1 en 42/48 (88%), de A2 en 5/48 (10.4%) y heterocigotos A1/A2 fue 1/48 (2%). En los niños sin EK el número de homocigotos A1 fue de 45/61 (74%), de A2 en 10/61 (16%) y heterocigotos A1/A2 en 6/61 (10%).
87.5
210.5
74
816
0
20
40
60
80
100
Porc
enta
je d
e al
elos
Kawasaki Controles niños
Figura 3. Distribución de polimorfismos de TNFα -308
A1A1A1A2A2A2
30
La distribución de alelos TNFβ +252 en los niños Enfermedad de Kawasaki fue:
Niños con EK el alelo homocigoto B1 2/48 (4%), homocigoto B2 en 23/48 (48%) y
heterocigoto B1/B2 con 23/48 (48%). En el grupo control se encontró alelo
homocigoto B1 6/61 (10%), y homocigoto B2 29/61(48%), para el hterocigoto
B1/B2 fue de 26/61 (42%).
Figura 4. Distribución de polimorfismos TNFβ +252. En los niños con Enfermedad de Kawasaki el alelo homocigoto B1 estuvo presente en 2/48 (4%), homocigoto B2 en 23/48 (48%) y heterocigoto B1/B2 con 23/48 (48%). En el grupo control se encontró alelo homocigoto B1 6/61 (10%), y homocigoto B2 29/61(48%), para el hterocigoto B1/B2 fue de 26/61 (42%).
4
48 48
10
48 42
0
20
40
60
80
100
Kawasaki Controles niños
Figura 4. Distribución de polimorfismos de TNFβ +252
B1B1B1B2B2B2
31
La distribución de polimorfismos TNFα -308 en pacientes con Enfermedad de
Kawasaki y Aneurismas Coronarios fue de la siguiente manera: niños con alelos
homocigotos A1 fueron 20/22 (91%), y de A2 2/22 (9%), no se encontraron
heterocigotos A1/A2. En los niños con EK sin aneurismas coronarios se
encontraron de los alelos A1 homocigotos 22/26 (85%), A2 en 3/26 (11%) y
heterocigotos A1/A2 en 1/26 (4%).
Figura 5. Niños con Enfermedad de Kawasaki y distribución de alelos. De los alelos homocigotos A1 fueron 20/22 (91%), y de A2 2/22 (9%), no se encontraron heterocigotos A1/A2. En los niños con EK sin aneurismas coronarios se encontraron de los alelos A1 homocigotos 22/26 (85%), A2 en 3/26 (11%) y heterocigotos A1/A2 en 1/26 (4%).
91
09
85
4 11
74
10 16
0
20
40
60
80
100
Kawasaki conaneurismas coronarios
Kawasaki sinaneurismas coronarios
Controles
Figura 5. Niños con Enfermedad de Kawasaki y la distribución de alelos TNFα -308
A1A1A1A2A2A2
32
La distribución de polimorfismos TNFα -308 al considerar unicamente presencia o
ausencia de A1 y A2 se presentó como sigue: niños con EK y aneurismas
coronarios alelos A1 40/44 (91%) y A2 en 4/44 (9%), en los niños con EK sin
aneurismas coronarios para A1 fue de A1 45/52 (87%) y para A2 de 8/52 (13%).
En el caso de los controles A1 con 96/122 (79%) y A2 con 26/122 (21%).
Figura 6. Distribución de alelos TNFα, presencia o ausencia de alelo A1 y A2. En los niños con EK y aneurismas coronarios A1 40/44 (91%) y A2 en 4/44 (9%), en los niños con EK sin aneurismas coronarios para A1 fue de A1 45/52 (87%) y para A2 de 7/52 (13%). En el caso de los controles A1 con 96/122 (79%) y A2 con 26/122 (21%).
91
9
87
13
79
21
0
20
40
60
80
100
Kawasaki con aneurismascoronarios
Kawasaki sin aneurismascoronarios
Controles
Figura 6. Distribución de alelos TNFα -308
A1A2
33
En el caso de TNFβ +252, la distribución de los alelos se presento se la siguiente
forma: niños con EK y aneurismas coronarios, homocigotos B1 1/22 (4%), B2 en
10/22 (46%) y heterocigotos B1/B2 con 11 (50%); en los niños con EK sin
aneurismas coronarios con alelos homocigotos B1 fue 1/26 (4%), y de B2 13/26
(50%), de los heterocigotos B1/B2 en 12/26 (46%). En el grupo control se
presentaron con alelos homocigotos B1 6/61 (10%), de B2 29/61 (47%) y
heterocigotos B1/B2 26/61 (43%).
Figura 7. Niños con Enfermedad de Kawasaki y distribución de alelos TNFβ +252. En niños con EK y aneurismas coronarios, homocigotos B1 1/22 (4%), B2 en 10/22 (46%) y heterocigotos B1/B2 con 11 (50%); en los niños con EK sin aneurismas coronarios con alelos homocigotos B1 fue 1/26 (4%), y de B2 13/26 (50%), de los heterocigotos B1/B2 en 12/26 (46%). En el grupo control se presentaron con alelos homocigotos B1 6/61 (10%), de B2 29/61 (47%) y heterocigotos B1/B2 26/61 (43%).
En la distribución de polimorfismos para TNFβ +252 considerando la presencia o
4
50 46
4
50 46
10
47 43
0
20
40
60
80
100
Kawasaki conaneurismas coronarios
Kawasaki sinaneurismas coronarios
Controles
Figura 7. Niños con Enfermedad de Kawasaki y distribución de alelos TNFβ +252
B1B1
B1B2
B2B2
34
ausencia de B1 y B2 se encontró lo siguiente: niños con EK y aneurismas
coronarios alelo B1 en 13/44 (30%) y B2 con 31/44 (70%), en aquellos con EK sin
aneurismas coronarios, B1 en 14/52 (27%) y B2 38/52 (73%). En el caso de los
controles, se encontró B1 en 38/122 (31%) y el alelo B2 en 84/122 (69%).
Figura 8. Distribución de alelos TNFβ +252 . En niños con EK y aneurismas coronarios se encontró el alelo B1 en 13/44 (30%) y B2 en 31/44 (70%), en aquellos con EK sin aneurismas coronarios, B1 en 14/52 (27%) y B2 38/52 (73%). En el caso de los controles, se encontró B1 en 38/122 (31%) y el alelo B2 en 84/122 (69%).
30
70
27
73
31
69
0
20
40
60
80
100
Kawasaki conaneurismas coronarios
Kawasaki sinaneurismas coronarios
Controles
Figura 8. Distribución de alelos TNFβ +252
B1B1B1B2
35
Al considerar la presencia o ausencia de los alelos TNFα -308 y TNFβ +252 en los
niños y adultos del grupo control (ambos sin Enfermedad de Kawasaki) se
encontró lo siguiente: en niños el alelo A1 se observó en 96/122 (79%) y A2 en
26/122 (21%); en los adultos el mismo A1 estuvo presente en 86/96 (90%) y A2 en
10/96 (10%). En el caso del alelo B1, este se observó en 38/122 (31%) y B2 fue en
84/122 (69%) de los niños; por su parte en adultos B1 se presentó en 17/96 (18%)
y B2 lo hizo en 79/122 (82%), como se muestra en la figura 8.
Figura 9. Presencia o ausencia de alelos de TNFα -308 y TNFβ +252 en pacientes sin EK. En niños el alelo A1 se observó en 96/122 (79%) y A2 en 26/122 (21%); en los adultos el mismo A1 estuvo presente en 86/96 (90%) y A2 en 10/96 (10%). En el caso del alelo B1, este se observó en 38/122 (31%) y B2 fue en 84/122 (69%) de los niños; por su parte en adultos B1 se presentó en 17/96 (18%) y B2 lo hizo en 79/122 (82%).
79
2131
69
90
1018
82
0
20
40
60
80
100
Niños control Adultos control
Figura 9.Frecuencia de polimorfismos TNFα -308 y TNFβ +252 en pacientes sin Enfermedad de Kawasaki
A1A2.B1B2
36
En el cuadro 2 se presenta la frecuencia de alelos encontrados de TNFα-308 en
los grupos de estudio, se muestra la asociación entre los polimorfismos y la
presencia o ausencia de aneurismas coronarios, así como del grupo control.
Se elaboraron tablas de 2 x 2 en todas se utilizó prueba exacta de Fisher.
No se encontró diferencia significativa entre los grupos de estudio (p= 0.12).
Cruadro 2. Alelos de TNFα -308 en los niños con Enfermedad de Kawasaki (con y sin aneurismas coronarios) y el grupo control.
Kawasaki con Kawasaki sin Controles p aneurismas aneurismas coronarios coronarios
(n= 22) (n= 26) (n= 61) A1A1 20 22 45 A1A2 0 0 6 0.12 A2A2 2 4 10 Cuadro 2. Alelos de TNFα -308 en los grupos de estudio. Se utilizó la Prueba exacta de Fisher mostrando el valor de p.
37
En el cuadro 3 se muestra, dado la presencia o ausencia del alelo A1 y A2 y su
asociación con aneurismas coronarios en niños con Enfermedad de Kawasaki y el
grupo control.
Se utilizaron tablas de 2 x 2, en ellas se realizó chi-cuadrada con corrección de
Yates y exacta de Fisher (celdas con número menor de 5). Se encontró una
diferencia significativa entre los niños con EK con aneurismas coronarios y el
grupo control y la presencia del alelo A2.
Cuadro 3. Aneurismas coronarios en niños con EK y el grupo control, con y sin alelo A1 y A2..
Kawasaki con Kawasaki sin Controles p aneurismas aneurismas coronarios coronarios
(n= 22) (n= 26) (n= 61) Alelos= 44 Alelos = 52 Alelos= 122 A1 40 45 96 0.052 A2 4 7 26 Cuadro 3. Alelos de TNFα -308 en los grupos de estudio. Se utilizó la Prueba exacta de Fisher y chi-cuadrada con corrección de Yates, mostrando el valor de p.
38
Al analizar la presencia o ausencia del alelo A1 y A2 en los niños con Enfermedad
de Kawasaki y el grupo control, para lo cual se diseñó una tabla de 2 x 2,
utilizando la prueba exacta de Fisher, se encontró una diferencia
significativamente menor en la frecuencia del alelo A2 en el grupo de niños con
enfermedad de Kawasaki (p= 0.40)
Cuadro 4. Niños con EK y grupo control, presencia y ausencia de alelo A1 y A2
Enfermedad de Controles p Kawasaki
(n= 48) (n= 61) Alelos= 96 Alelos =122 A1 85 96 0.040 A2 11 26 Cuadro 4. Alelos de TNFα -308 en los grupos de estudio. Se utilizó la Prueba exacta de Fisher.
39
En el cuadro 4 se observan los alelos TNFβ +252 y su asociación o no con
aneurismas coronarios en niños con enfermedad de Kawasaki y el grupo control.
Se diseñaron tablas de 2 x 2 y se realizó prueba de chi-cuadrada con corrección
de Yates, o exacta de Fisher, (en aquellos con un número menor de 5 en cada
celda).
No se encontró diferencia significativa entre los polimorfismos TNFβ +252 y la
presencia o no de aneurismas coronarios en niños con enfermedad de Kawasaki,
y el grupo control.
Cruadro 5. Alelos de TNFβ +252 en niños con Enfermedad de Kawasaki con y sin aneurimas coronarios, y el grupo control.
Kawasaki con Kawasaki sin Controles p aneurismas aneurismas coronarios coronarios
(n= 22) (n= 26) (n= 61) B1B1 1 1 6 B1B1 11 12 26 0.36 B2B2 10 13 26 Cuadro 5. Alelos de TNFβ +252 en los grupos de estudio. Se utilizó la Prueba de chi-cuadrada (con corrección de Yates) y exacta de Fisher.
40
El cuadro 6 se exhiben la asociación entre la presencia o no de los alelos B1 y B2
con aneurismas coronarios en niños con Enfermedad de Kawasaki y el grupo
control. Se elaboraron tablas de 2 x 2 y se utilizó la prueba de chi-cuadrada con
corrección de Yates.
Se puede observar que no se encontró asociación entre la presencia o la ausencia
de los alelos y los grupos de estudio
Cruadro 6. Presencia o ausencia de Alelos de TNFβ +252 en niños con Enfermedad de Kawasaki y el grupo control.
Kawasaki con Kawasaki sin Controles p aneurismas aneurismas coronarios coronarios
(n= 22) (n= 26) (n= 61) (alelos = 44) (alelos= 52) (alelos= 122) B1 13 14 38 0.35 B2 31 38 84 Cuadro 6. Presencia o ausencia de Alelos de TNFβ +252 en los grupos de estudio. Se utilizó la Prueba de chi-cuadrada con corrección de Yates.
41
De manera adicional, al comparar la presencia o ausencia de los alelos TNFα -
308 y TNFβ +252 entre los controles de niños y adultos (ambos sin EK), para lo
cual se diseñaron tablas de 2 x 2, y se utilizó la prueba de chi-cuadrada con
corrección de Yates. Se encontró una diferencia significativa entre la presencia o
ausencia de ambos alelos (TNFα -308 y TNFβ +252 ) y los dos grupos, como se
muestra en el cuadro 6.
Cruadro 7. Alelos de TNFα -308 y TNFβ +252 en niños y adultos sin Enfermedad de Kawasaki.
Controles niños Controles adultos p (n= 61) (n= 48) (alelos = 122) (alelos= 96) A1 96 86 A2 26 10 .024 B1 38 17 B2 84 79 .017 Cuadro 7. Presencia o ausencia de Alelos de TNFα -308 y TNFβ +252 en niños y adultos sin EK. Se utilizó prueba d chi-cuadrada con corrección de Yates.
42
8. DISCUSION
La Enfermedad de Kawasaki constituye la primera causa de cardiopatía adquirida
en niños en los países desarrollados. Los mecanismos involucrados en la
patogénesis de la enfermedad están determinados por una activación del sistema
inmune, donde se sitúa a TNFα como la citosina más importante, responsable de
la activación de otras citocinas pro- inflamatorias, elementos pro-coagulantes,
factores titulares y endoteliales que conducen finalmente, en algunos pacientes, a
la formación de aneurismas coronarios, considerada la complicación más grave de
la enfermedad.
TNFα es una molécula secretoria no glicosilada, de 17 kDa, que deriva de una de
26 kDa producida principalmente por macrófagos. En condiciones fisiológicas,
forma un homotrímero de 55 kDa, no-covalentemente estabilizado. Posee 2
receptores de transmembrana, uno de 55 kDa (TNFR1 ó p55R ó CD120a) y otro
de 75 kDa (TNFR2 ó p75R ó CD120b), que serían parte de una familia emergente
de receptores. Producto de digestiones proteolíticas del dominio extracelular de
TNFR1 y TNFR2 se generan dos tipos de receptores solubles (TNF binding
proteins), que estarían involucrados en la regulación de los niveles circulantes de
la citoquina.
El gen que codifica TNFα está ubicado en la región central del MHC, entre los loci
HLA-B y HLA-D, en el brazo corto del cromosoma 6, en el segmento
correspondiente a las moléculas MHC de clase III. El locus de TNFα posee una
variedad de sitios polimórficos, tanto en la región codificante como en su vecindad.
43
Se describen dos formas de polimorfismo, la primera comprende los polimorfismos
mononucleotídicos (SNPs: single nucleotide polymorphisms), los cuales
representan cambios de un nucleótido, pudiendo detectarse éstos en cualquier
lugar del DNA, ya sea en las secuencias regulatorias en el extremo 5' (promotor) o
después de la región codificante (región no transcrita del extremo 3'), o bien,
dentro del DNA que codifica la proteína. En esta categoría se han identificado
varios SNPs, la transición G/A en la posición -308 de la región promotora del gen
de TNFα es el más estudiado.
La segunda variante polimórfica es el DNA microsatélite, que se distribuye en
todos los cromosomas a través del genoma. Estas son secuencias repetitivas de
DNA (generalmente C y T), no transcritas y de longitud variable, que se ubican en
regiones no codificantes. Aun cuando no se transcriben a RNA mensajeros, la
inserción de microsatélites puede alterar el plegamiento del DNA, afectando la
unión de proteínas y enzimas al DNA y por consecuencia el nivel transcripcional.
El análisis del locus de TNFα ha revelado la presencia de los microsatélites TNFa,
TNFb, TNFc, TNFd, TNFe y Tau-a
El TNFα es clave en la inmunidad del huésped, con actividad antitumoral, antiviral
y antimicrobiana. Induce crecimiento tisular, diferenciación de tejidos e
inmunorregulación. En individuos sanos, sus niveles son variables, fluctuando
entre 50 pg/ml y no detectables. Los niveles superiores a 100 pg/ml, en general,
se asocian con morbilidad. Las variaciones genéticas individuales que influyen en
la expresión o la actividad del TNF pueden influir en las manifestaciones clínicas y
el pronóstico de la infección y la sepsis.
44
Además, existen PG en estos genes asociados con valores plasmáticos más
elevados de TNF. En el caso del TNF-α , el PG más ampliamente estudiado es el
cambio en la posición 308 de guanina (TNF-α 1) por adenina en (TNF-α 2). En el
TNF-β puede existir un cambio de guanina (TNF-β 1) por una adenina (TNF-β2) en
el primer intrón (posición 1069) .
La frecuencia de estos polimorfismos, del gen que codifica TNF-α, se ha
encontrado incrementada en pacientes con diversas patologías, como lo señala
McGuire et al, quien encontró que el genotipo homocigoto α 2 se asoció con un
riesgo cuatro veces superior de desarrollar malaria cerebral y desarrollar secuelas
neurológicas comparado con los pacientes heterocigotos o no portadores de ese
alelo. Nadel et al analizaron el genotipo de 98 pacientes ingresados de forma
consecutiva con el diagnóstico de meningococemia en una UCI pediátrica. El alelo
α2 se asoció a una forma más grave de meningococemia y a una mayor
mortalidad. Stüber et al demostraron también que en los pacientes homocigotos
para el alelo α2 que desarrollaron sepsis se observaron valores más elevados de
TNF y a su vez mayor mortalidad. Estos datos fueron posteriormente corroborados
por Mira et al que analizaron el genotipo de 89 pacientes con el diagnóstico de
shock séptico. Las frecuencias de TNF-α2 fueron significativamente superiores en
los pacientes sépticos respecto al grupo control. Además, la mortalidad también
fue significativamente mayor en los pacientes portadores del alelo α 2.
Más recientemente, O'Keefe et al , en un estudio prospectivo, analizaron la
presencia de adenina en las posiciones 238, 308 o 376 de la región promotora del
45
gen del TNF-α como factor de riesgo para el desarrollo de sepsis. Sólo los
pacientes con adenina en posición 308 tuvieron un riesgo 4,6 veces superior de
desarrollar sepsis (IC del 95%, 1,9-10,9) y también un riesgo 2,1 veces superior de
mortalidad (IC del 95%, 0,6-7,3).
Majetschak et al analizaron la relación entre el genotipo del TNF-β y el desarrollo
de sepsis en pacientes politraumatizados, y llegaron a la conclusión de que los
pacientes homocigotos para el alelo β 2 tuvieron más riesgo de desarrollar sepsis
grave respecto a los sujetos que eran portadores o no tenían el alelo. Asimismo,
los pacientes homocigotos también tuvieron valores de TNF significativamente
mayores que los heterocigotos o no portadores.
Waterer et al analizaron los genotipos del TNF-α y β de 280 pacientes con
neumonía adquirida en la comunidad (NAC) y su relación con el desarrollo de
shock séptico e insuficiencia respiratoria y concluyeron que los pacientes
homocigotos β 2 tuvieron más riesgo de desarrollar shock séptico. Sin embargo, no
encontraron asociación entre el genotipo del TNF-α y el riesgo de desarrollar
shock séptico.
De forma reciente, se ha estudiado la influencia del PG en el pronóstico
(mortalidad) de la NAC. Wunderink et al , en un estudio prospectivo, analizaron los
genotipos (TNF-α 238, TNF-α 308 y TNF-β ) de 272 pacientes que desarrollaron
NAC, y describieron que la presencia de adenina en la posición 238 del gen del
TNF se asoció con un mayor riesgo de mortalidad en pacientes con NAC.
Además, corroborando los hallazgos previos, los pacientes homocigotos β 2
tuvieron un riesgo aumentado de desarrollar shock séptico.
46
En México se ha encontrado igualmente un aumento en la frecuencia de estos
polimorfismos en ciertas patologías. Rodriguez-Carreon y cols en pacientes con
Artritis Reumatoide, Yamamoto-Furusho y cols en Colitis Ulcerativa y Hernandez-
Pacheco et al en adultos con Enfermedad cardiaca reumática65-67 y Rodriguez-
Perez et al, en pacientes con Enfermedad de Chagas70. Garza-Gonzalez y cols,
en cambios, no encontró diferencia en la frecuencia en pacientes con Cáncer
Gástrico, cuando se comparó con el grupo control71.
En niños con Enfermedad de Kawasaki se ha tratado de demostrar asociación
entre estos polimorfismos, del gen responsable de la expresión de TNFα. Ahn YS
y cols, en Corea, no encontró diferencia en la frecuencia de alelos de TNFα -308
en niños con EK (con o sin aneurismas coronarios) y en su grupo control. Yang J
y cols, y Chien YH y cols, en china, Igualmente no lograron demostrar diferencia
en la frecuencia de alelos de TNFα -308 en sus series de niños con EK y
controles.
Quasney y cols al analizar la asociación entre los polimorfismos de TNFα -308 en
niños blancos con EK encontró una mayor frecuencia del alelo heterocigoto A1A2
en los pacientes que desarrollaron aneurismas coronarios, situación no
demostrada anteriormente. Sin embargo en su trabajo, donde incluyo igualmente
niños con EK de origen Japones, no encontró diferencia en la frecuencia de estos
polimorfismos.
En el presente trabajo se incluyeron niños de origen mestizo con Enfermedad de
Kawasaki, encontrando una mayor frecuencia de aneurismas coronarios de 46%
(22/48) con respecto a otras series3.
47
Al analizar los genotipos de TNFα -308 se encontró una diferencia significativa en
la frecuencia del heterocigoto A1A2 en los pacientes del grupo control (niños sin
EK), en comparación con los niños con EK que presentaban aneurismas
coronarios. De la misma forma se demostró una diferencia significativa en la
frecuencia del alelo A1 en niños del grupo control (sin EK) en comparación con los
niños con Enfermedad de Kawasaki
En lo que se refiere al análisis de los polimorfismos de TNFβ +252 no se encontró
diferencia significativa al analizar los diferentes grupos de estudio.
De manera adicional, aún cuando no se consideró como objetivo del trabajo, se
encontró una mayor frecuencia el alelo A2, en los niños del grupo control (sin EK)
que en adultos sanos (igualmente sin antecedente de EK)
Los resultados de este estudio muestran claramente una mayor frecuencia del
genotipo heterocigoto A1A2 y presencia de A2 de TNFα -308 en los niños del
grupo control, cuando se compararon con niños con EK, incluidos aquellos con
Aneurismas Coronarios; estos hallazgos que si bien son contrarios a lo que se
esperaba encontrar, es decir una mayor frecuencia de estos polimorfismos en los
pacientes con EK y aneurismas coronarios, pueden hablar de la participación de
otros elementos involucrados en la respuesta del huésped ante un estímulo
determinado, como es el caso de citocinas anti-inflamatorias (IL-10), y que por otro
lado reflejan, en la población mestiza mexicana, una distribución en la genética
poblacional, distinta a la reportada en estudios anteriores (en población adulta).
La diferencia de frecuencias encontrada en los grupos sin la enfermedad
(controles) de la población pediátrica y adulta, para el caso del alelo A2 de TNFα -
48
308, con 21% en niños y 10% en adultos, puede no expresar que un mismo
individuo presente un cambio en sus características genéticas, probablemente
expresa un mecanismo de selección natural, dado presencia del alelo A2 en la
edad pediátrica, lo que determina una capacidad mayor a desarrollar una
respuesta exagerada ante estímulos infecciosos-inflamatorios, con una
morbimortalidad aumentada, situación por lo cual en la población adulta, es
menor.
Es necesario investigar, en este grupo de pacientes mestizos mexicanos con
Enfermedad de Kawasaki, la participación de otras citocinas proinflamatorias,
involucradas en el proceso que conduce al desarrollo ulterior de Aneurismas
Coronarios.
49
9. CONCLUSIONES
Como conclusión, en el presente estudio el genotipo heterocigoto A1A2 de TNFα -
308 mostró como tendencia a ser menos frecuente en los pacientes con
Enfermedad de Kawasaki con Aneurismas Coronarios, en comparación con el
grupo control.
El alelo A2 de TNFα -308 se encontró con una frecuencia sgnifictivamente menor
en al considerar el grupo de niños con Enfermedad de Kawasaki, con respecto del
grupo control (p=0.40), lo mismo ocurrió al comparara a los niños con Enfermedad
de Kawasaki y aneurismas coronarios, en comparación con el grupo control, en
quienes el alelo A2 de TNFα -308 fue significativmente menor (p= 0.52)
No se encontró diferencia significativa en la frecuencia de los alelos de TNFβ +252
entre los grupos de estudio.
50
51
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12. ANEXOS
ANEXO 1 Carta de consentimiento informado
Procedencia: UMAE CM LA RAZA____ INP_____ No Control__________ México, D.F., a____de_________________de__________
Yo:____________________________________________________________
Por medio del presente, como responsable legal, acepto la participación de mi hijo
(a):___________________________________________________________
En el Proyecto de Investigación titulado:
Frecuencia de polimorfismo de Factor de Necrosis Tumoral α-308 y β -252
en pacientes con enfermedad de Kawasaki y aneurismas coronarios
El objetivo de este estudio es identificar la frecuencia de polimorfismo genético,
en los pacientes con enfermedad de Kawasaki, que es una característica propia
de cada persona, (por ejemplo como el grupo sanguíneo)
Se me ha explicado que la participación de mi hijo (a) consistirá en la toma de 3mL
de sangre mediante punción venosa.
Declaro que se me ha informado ampliamente sobre los posibles riesgos,
inconvenientes, molestias y beneficios de la participación de mi hijo (a) derivados
en el estudio, que son los siguientes: Sangrado o infección en el sitio donde se
obtendrá la muestra de sangre, para ello se me ha informado que se tomarán las
medias precautorias necesarias.
62
El investigador principal se ha comprometido a responder cualquier pregunta y
aclarar cualquier otro asunto relacionado con la investigación.
Entiendo que me reservo el derecho de retirar a mi hijo (a) del estudio en cualquier
momento en que lo considere conveniente, sin que por ello afecte la atención
médica que recibo del instituto Mexicano del Seguro Social.
El investigador principal me ha dado seguridades de que no se identificará a mi
hijo (a) en las presentaciones o publicaciones que deriven de este estudio y de
que los datos relacionados con la privacidad de mi hijo (a) serán manejados en
forma confidencial. También de ha comprometido a proporcionarme información
actualizada que se obtenga durante el estudio, aunque pudiera hacerme cambiar
de parecer al respecto de mi permanencia en el mismo.
Este estudio no tiene costo alguno y solo se solicita su autorización si usted tiene
duda antes de aceptar o durante el desarrollo del estudio el Dr. Francisco Cruz
Olivo esta en la disposición de aclarar y explicarle cualquier duda relacionada a la
participación de su hijo (a) en el estudio.
_________________ _______________________
Firma Padre o tutor Investigador Responsable
________________ _______________________
Testigo Testigo
Dirección del Investigador responsable: Av. Jacarandas y Vallejo S/N Colonia la Raza, Delegación Azcapotzalco, DF. Telefono Hospital 5782 1088 ext 23498,
celular 04455 2128 095
63
ANEXO 2
HOJA DE RECOLECCION DE DATOS Frecuencia de polimorfismos de Factor de Necrosis Tumoral α-308 y β -252 en pacientes con enfermedad de Kawasaki y
aneurismas coronarios Procedencia: UMAE CM LA RAZA____ INP_____ No Control__________ Nombre:_____________________________________ Sexo:____________ Cédula______________________________Fecha del diagnóstico:____________ Edad al momento del diagnóstico:_______________ ECOCARDIOGRAMA ANEURISMA (Marcar con una X) SI____ NO____ LOCALIZACIÓN: Izquierda ( ) Derecha ( ) ANGIOGRAFIA(Marcar con una X) SI___ NO___ REPORTE__________________________________________________________________________________________________________________________ POLIMORFISMOS (Marcar con una X) TNFα-308 GENOTIPO: A/A ( ) A/G ( ) G/G( )
ALELO: A1 ( ) A2 ( ) TNFβ -252 GENOTIPO: B1/B1 ( ) B1/B2 ( ) B2/B2 ( )
ALELO: B1 ( ) B2 ( )
