Tesis e Monsalvez

1

INDICE PÁGINA

1. RESUMEN 6

2. INTRODUCCIÓN 7

2.1. La industria de celulosa Kraft en Chile 7

2.2. La materia prima y proceso productivo Kraft 9

2.3. Efluentes, los tratamientos empleados para su depuración y la

gestión ambiental de la industria

11

2.4. Los compuestos extractivos de la madera: Los fitosteroles 14

2.5. Las alteraciones endocrinas provocadas por la exposición a los

CDE.

16

2.6. Modo de acción de los compuestos disruptores endocrinos y sus

propiedades físico-químicas

17

2.7. Saccharomyces cerevisiae y la tècnica YES (Yeast Estrogen Assay)

(YES)

21

3. HIPÓTESIS DE TRABAJO 26

4. OBJETIVOS 26

4.1. Objetivo general 26

4.2. Objetivos específicos 26

5. METODOLOGÍA 27

5.1. Actividad estrogénica 27

5.1.1. Cepa de levadura recombinante 27

5.1.2. Preparación de las soluciones del medio de cultivo 27

5.2. Crecimiento de levadura recombinante: Análisis previos

5.3. Cultivo de levadura

30

31

5.3. Preparación de soluciones para el ensayo 32

2

5.4. Preparación de solución de Rojo clorofenol β-D-

galatopiranosido (CPRG, reactivo cromogénico)

33

5.5. Preparación de las diluciones para el ensayo 33

5.6. Técnica “Yeast Estrogen Assay” (YES)

5.7. Análisis de resultados

34

36

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 37

6.1. Crecimiento de levadura recombinante: Análisis previos 37

6.2. Ensayo Yeast Estrogen Assay (YES) 39

7. CONCLUSIONES 48

8. REFERENCIAS 49

3

INDICE DE TABLAS PÁGINA

Tabla I. Plantas de celulosa Kraft operantes, actualmente, en Chile así

como también se ven detalladas el tipo de celulosa que producen y el

río al cual vierten sus Riles

8

Tabla II. Potenciales contaminantes provenientes de la industria de

celulosa

12

Tabla III. Anomalías endocrinas ocasionadas por la exposición a los

efluentes de celulosa Kraft o a algún compuesto especifico presentes en

ellos

18

Tabla IV. Propiedades físico-químico de compuestos presentes en el

efluente de celulosa Kraft

22

Tabla V. Velocidad de crecimiento especifico del biosensor a distintas

temperaturas, mediante ala ecuación 2

38

Tabla VI. Concentraciones efectivas (EC50) obtenidas para el EE2,

Estigmasterol y β-sitosterol a través de la aplicación de una regresión

logarítmica a las curvas dosis respuestas, entregadas por el programa

Origin versión 6.0

42

Tabla VI. Potencia relativa estrogénica para cada fitoesterol con

respecto al patrón

45

4

INDICE DE FIGURAS PÁGINA

Figura 1. Estructuras químicas de algunos fitosteroles y ácidos

resínicos detectados en los efluentes de celulosa Kraft

20

Figura 2. Lac-Z: Gen reportero; hER: Gen receptor de estrógenos

humanos; ERE: Elemento de respuesta estrogénica; CPRG: Clorofenol

rojo-β-D-galactopiranosido (Reactivo cromogénico)

24

Figura 3. Balanza analítica marca Precisa, modelo XB 120 A 28

Figura 4. Peachímetro c/ electrodo Sentix 41, Marca WTW, modelo

Inolab pH level 1

29

Figura 5. Espectrofotómetro marca Spectronic Unicam, modelo Génesis

10UV

31

Figura 6. Cámara de Flujo Laminar marca Misonix Modelo PCR 6 32

Figura 7. Agitador orbital c/regulación de tiempo y Tº, marca LAB-LINE,

modelo Enviromental Shaker

32

Figura 8. Estufa marca Termo Areus, modelo B6 35

Figura 9. Lector de placas EL x 800, BioTex 36

Figura 10. Gráfico que demuestra los resultados obtenidos de los

cultivos de levadura, realizados con distintas cantidades de inóculos

(μL), incubados a distintas temperaturas por un tiempo que va desde las

0 a 192 h

37

Figura 11. Velocidad específica de crecimiento del biosensor a distintas

temperaturas

Figura 12. Placas que resultaron tener resultados erróneos (coloración

roja) puesto que daban positivo al compuesto control (negativo o

39

40

5

blanco), el cual en este trabajo corresponde al etanol absoluto

Figura 13. Placa con la respuesta de un viraje de color correcto, cuando

se utiliza agua ultrapirogénica

41

Figura 14. Respuesta obtenida del ensayo YES, para un rango de

dilución de 54,48 μg/L a 26,61 ng/L del compuesto patrón (17α-

etinilestradiol)

43

Figura 15. Respuesta obtenida del ensayo YES, para un rango de

dilución de 100 mg/L a 50 μg/L del compuesto patrón (β-sitosterol) 44

Figura 16. Actividad de la enzima muestra β-galactosidasa frente a

Estigmasterol en un rango de dilución de 100 mg/L a 50 μg/L

44

6

1. RESUMEN

Compuestos con actividad hormonal llamados comúnmente compuestos disruptores endocrinos

(CDE) son encontrados en bajas concentraciones en efluentes finales de celulosa Kraft. Efectos

observados, principalmente en peces habitantes en las cercanías de las descargas de dichos

efluentes hacen pensar que compuestos presentes en los efluentes de celulosa son los

responsables de dichas anomalías. Específicamente a compuestos que forman parte de la

fracción de los extraíbles de la madera y se denominan fitoesteroles. Ellos presentan una

estructura química similar a la del colesterol, y debido a sus propiedades físico-químicas, como

el coeficiente octanol-agua (Kow) presentan una nula solubilidad en agua y una alta afinidad a

las matrices lipídicas, dificultando su eliminación en el ambiente. Para detectar este tipo de

compuestos y su potencial estrogénico, existe el biosensor Saccharomyces cerevisiae

recombinante, el cual posee la capacidad de detectar compuestos con actividad endocrina, por

medio de respuestas colorimétricas, debido a que posee inserto un gen estrogénico humano a

nivel cromosomal y un elemento de respuesta estrogénica a nivel plasmidial. El objetivo de este

trabajo es, evidenciar la presencia de compuestos con actividad estrogénica en los efluentes de

celulosa Kraft. Para ello se trabajó con 2 fitoesteroles puros (estigmasterol y β-sitosterol),

detectados en el efluente de celulosa Kraft, a los cuales se le midió su potencial estrogénico

mediante la concentración efectiva 50 (CE50), obtenida de la técnica YES (Yeast Estrogen

Assay). Los resultados indican que estos compuestos poseen actividad estrogénica a una

concentración de 0,00023 mg/L para el β-sitosterol y de 0,00126 mg/L para el estigmasterol. Se

concluye que los efluentes de la industria de celulosa Kraft poseen compuestos que presentan

un potencial estrogénico, además, el biosensor utilizado posee una alta sensibilidad analítica,

capaz de detectar compuestos con bajo potencial estrogénico. Por otro lado, la técnica

conocida como YES es una herramienta útil para evaluar compuestos que posean potencial

estrogénico, presentes en mezclas complejas como lo es el efluente de celulosa Kraft.

7

2. INTRODUCCION

2.1 La industria de celulosa Kraft en Chile

En las últimas dos décadas, el sector forestal ha presentado un gran desarrollo gracias a la

industria de celulosa Kraft, alcanzando una notable competitividad en el ámbito internacional.

En la actualidad, según datos de la CORMA (Corporación Chilena de la Madera), Chile ocupa el

quinto lugar como exportador mundial. Este notable desarrollo se ve reflejado en los 3 millones

de toneladas de pulpa producidas al año. Es más, se estima que para el año 2008 alcanzaría el

orden de los 4,7 millones de toneladas al año, dejándola en el cuarto lugar a nivel mundial. Esta

producción se debe, principalmente, a las 13 industrias de celulosa, localizadas en el sur de

Chile, de las cuales 9 usan procesos Kraft (ubicadas entre la séptima y décima región) mientras

que, 4 de ellas realizan procesos mecánicos (Xavier, 2006). En este contexto, la región del Bío

Bío, se destaca en la producción de celulosa Kraft, debido a que genera un 46 % de la

producción nacional, razón por la cual alrededor del 62% de este tipo de industrias se asientan

allí.

Específicamente, el desarrollo de esta industria, en Chile, comenzó a partir del año 1959 con la

puesta en marcha de la planta de Laja. Luego, se le sumaron dos nuevas plantas: Arauco I y

Constitución, pero el crecimiento no se detuvo ahí, ya que en la década de los 90' se

construyeron cuatro plantas más: Santa Fe, Pacifico, Arauco II y Licancel. Por otra parte, desde

el año 2000 aparecen tres nuevas industrias: Nueva Aldea, Valdivia y la ampliación de Santa Fe

(Tabla 1) y, este desarrollo se ve reflejado a través del aumento de la producción de celulosa al

año y hace cada vez más notable la gran expansión y desarrollo de esta industria (Vidal et al.,

2007). Estas industrias están comandadas por dos grandes empresas, Compañía

Manufacturera de Papeles y Cartones (CMPC) y Celulosa Arauco y Constitución (CELCO).

8

Tabla I. Plantas de celulosa Kraft operantes, actualmente en Chile. Se detallada el tipo de celulosa que producen y el cuerpo

receptor al cual vierten sus Riles.

P: Tratamiento Primario; S: Tratamiento Secundario; T: Tratamiento Terciario; Pro: Proyecto; CL: Clarificador Gravitacional; LG: Lagunas; LA:

Laguna Aireada Extendida; LO; Lodos activados; DAF: Floculación + Flotación; MBBR (Movil Bed Biofilm Reactor), Extr: Vidal et al., 2007.

Planta Región Propietario Proceso Tipo de celulosa

Producción (miles ton/año)

Tratamiento de efluentes

Cuerpo acuático receptor

Constitución VII CELCO Kraft s/blanqueo

UKP 335 P: CL; S: LG; Pro: LO

Mar-Océano-Pacífico

Laja

VIII CMPC Kraft c/ECF BSKP-UKP 345 P: CL; Pro: MBBR+LO

Río Bío-Bío

Arauco I VIII CELCO Kraft c/ECF BSKP-BEKP 260 P: CL; S: LA Mar-Océano-Pacífico

Santa Fe VIII CMPC Kraft c/ECF CG-MS 1160

P: CL; Pro: MBBR+LO

Río Bío-Bío

Pacifico IX CMPC Kraft c/ECF BEKP 490 P: CL; S: LA Río Bío-Bío

Árauco II VIII

CELCO Kraft c/ECF BSKP-BEKP 470

P: CL; S: LA Mar-Océano-Pacífico

Licancel VII CELCO Kraft c/ECF BSKP 110 P: CL; S: LA Río Mataquito

Valdivia X CELCO Kraft c/ECF BSKP-BEKP 430 P: CL; S: LO; T: DAF

Río Cruces

Nueva Aldea VIII CELCO Kraft c/ECF BSKP-BEKP 850 P: CL; S: LO; T: DAF

Río Itata

9

2.2. La materia prima y proceso productivo Kraft

La celulosa es el principal componente de la madera (Xavier et al., 2004). Es básicamente una

fibra vegetal que varía en longitud y espesor según el tipo de árbol. Los árboles utilizados para

producir celulosa se clasifican en dos grupos dependiendo de las características de su madera:

las coníferas o árboles de fibra larga, encontrándose aquí diferentes especies de pinos y

abetos, y las latifoliadas o árboles de fibra corta, dentro de las que se pueden mencionar a las

variedades de eucaliptos, abedules, álamos y acacias.

En Chile, las materias primas más utilizadas por la industria de celulosa Kraft son: maderas

blandas correspondientes a Pinus radiata, el cual tiene fibras de celulosa de 2 a 3 mm de

longitud obteniendo de él, la celulosa conocida como BSKP (celulosa blanqueada de fibra

larga), y por otro lado, se encuentran las maderas duras correspondientes a Eucaliptos

globulus, el cual a su vez, posee fibras de 0,6 a 0,8 mm de longitud, obteniendo de él, la

celulosa conocida como BSKE (celulosa blanqueada de fibra corta). Ambas especies son

cultivadas en nuestro país principalmente desde la VII hasta la X región (Xavier, 2006) con un

buen nivel de productividad, y con una buena tasa de madurez tanto para pino (20-25 años)

como para eucalipto (10-15 años).

El proceso productivo Kraft, apunta principalmente a para separar las fibras de celulosa de los

demás componentes de la madera, principalmente de la lignina (Chamorro et al., 2005). Este

proceso puede dividir en 4 pasos: descortezado, astillado, digestión y blanqueo. El cual

comienza con la recepción de la madera, la cual es recibida en rollizos, los cuales son troncos

de dimensiones ya estandarizadas, los que descortezados en discos rotatorios de gran

dimensión y que giran a cierta velocidad y, transformados en astillas, las que después son

enviadas a una pila de acopio para su homogeneización. Las cortezas retiradas de las astillas

10

son recuperadas y quemadas en las calderas de poder para producir vapor y energía eléctrica

para satisfacer a toda la planta.

Desde la pila de acopio, los chips, son clasificados por sus tamaños y llevados a la etapa de

cocción, también conocida como digestión. Para ello, en un principio son conducidas hacia la

tolva de astillas, en la cual son pre-impregnadas con una solución de licor blanco, la cual es una

solución acuosa de soda cáustica compuesta por hidróxido de sodio (NaOH) y sulfuro de sodio

(Na2S), la que finalmente rompe las uniones de la lignina y de las fibras de celulosa.

Posteriormente las astillas pasan a un digestor, en el cual se cosen con una mayor cantidad de

licor blanco, a altos niveles de temperatura y presión, pero controladas. El licor blanco con la

lignina disuelta, se convierte en una solución acuosa residual muy compleja, compuesta de

material orgánico y reactivos sobrantes, conocida como licor negro. Este último, se concentra

para ser quemado en unos equipos denominados calderas recuperadoras para ser procesado

en el sistema de recuperación de productos químicos y energía (Oñate, 2006).

La parte orgánica del licor negro produce energía en el proceso de combustión, generando el

vapor que se utiliza en la producción de energía eléctrica para calefaccionar a toda la planta.

Mientras que la parte inorgánica se recuperan después del proceso de combustión y son

usadas en la etapa de caustificación para regenerar el licor blanco usado en la cocción.

Finalmente de la etapa de cocción, se obtiene una pasta de celulosa, la cual es lavada a altas

temperaturas con la finalidad de retirar el licor negro residual aun contenido en ella.

Posteriormente, esta fibra lavada es llevada a un estanque de soplado donde se le reduce la

presión y para liberar así las fibras que aún permanecen compactas y, así pasa a ser clasificada

en varios filtros. La pasta, ahora lavada y filtrada se denomina celulosa cruda o sin blanquear.

Esto, debido a que dicha pasta aún contiene una cantidad considerable de lignina, la cual es

11

responsable de su coloración café. Es por ello, que se procede a blanquearla. En el proceso de

blanqueo se pierde entre un 5 y 9% de la pasta de celulosa cruda. La pasta procedente de la

etapa de blanqueo es preparada para su secado, la cual contiene un altísimo contenido de agua

(entre 98 y 99%). Además, aquí con la pasta se forma una lámina uniforme. Este equipo es

accionado por varios rodillos, los cuales con la ayuda de la gravedad y bombas de vacío, sacan

el agua de la pasta. Luego, de formada la lámina, ésta se corta formando pliegos, los cuales se

apilan, se prensan y se embalan formando los fardos para, a su vez, éstos formar los units, los

que finalmente son almacenados en las bodegas. Posteriormente, se seca y se embala

(PAPELNET, 2007).

Se debe considerar que para producir una tonelada de celulosa, no sólo conlleva el uso del

recurso forestal (3 m3 de madera), sino además de ingentes volúmenes de agua (30 m3),

energía (60 toneladas como gas natural) e insumos químicos (140 Kg) (Zaror, 2007).

En los años 80’ la cantidad de agua consumida por tonelada de celulosa producida oscilaba

entre los 120 y 140 m3. En la actualidad, se consumen solo 40 m3. Esto ha sido posible gracias

a que el agua con la que se realiza el proceso productivo, se limpia para posteriormente, ser es

reutilizada, lo que se conoce como un ciclo cerrado.

2.3. Efluentes, los tratamientos empleados para su depuración y la gestión ambiental de

la industria

A pesar de su gran desarrollo, esta industria ha sido por años considerada como una de las

principales fuentes de contaminación del medio ambiente, debido a su toxicidad, carga

orgánica, sólidos en suspensión y color (Ali and Sreekrishnan, 2001), y a la toxicidad, atribuida

principalmente a la fracción de compuestos extraíbles (Kovacs et al., 1992). Es así como esta

12

industria ha tenido que enfrentarse a grandes desafíos y presiones tales como las sociales,

económicas y ambientales.

Debido a la misma complejidad, en cuanto a la composición de las maderas utilizadas como

materia prima, los efluentes de la industria celulosa Kraft son mezclas extremadamente

complejas, con sustancias de alto y bajo peso molecular (Vidal et al., 2001), encontrándose una

variedad de contaminantes que en algunos casos son difíciles de detectar, caracterizar y por

ende, clasificar (Tabla II).

Tabla II. Potenciales contaminantes provenientes de la industria de celulosa.

Tipo de contaminante Problemas y fuente

Gases Gases de mal olor (Mercaptano, ácido sulfhídrico;

proveniente del pulpaje, óxidos de azufres

proveniente del proceso de recuperación en

hornos de cal.

Efluentes Sólidos suspendidos, (partículas de corteza,

pigmentos, fibra). Compuestos orgánicos

(hemicelulosa, azucares, ligninas, fenoles, resinas,

fitoesteroles). Disolventes inorgánicos (hidróxido

de sodio, sulfato de sodio)

Partículas Partículas de cenizas, provenientes de

quemadores

Residuos Sólidos Sólidos provenientes de lodos de tratamiento

primarios y secundarios

Sin embargo, frente a todo lo anteriormente expuesto, esta industria ha reaccionado de una

manera muy responsable frente a esta situación, basándose en la gestión ambiental y

tecnología, planteándose el claro objetivo de producir más limpio. Para ello, ha realizado

grandes modificaciones para cumplir dicho objetivo, firmando en el año 1999 el primer acuerdo

13

de producción limpia. Entre dichas modificaciones se pueden mencionar, el hecho de haber

disminuido considerablemente la cantidad de agua y de materia prima, requerida para realizar

su proceso productivo. Por otra parte, ha incorporado tecnología que le permite recuperar

reactivos, ahorrándose materiales y energía. A su vez, ha generado cambios en el proceso de

blanqueo, sustituyendo el blanqueo con el típico y dañino cloro elemental (blanqueo

convencional) como agente oxidante, por el blanqueo de tipo ECF (libre de cloro elemental)

cuyo agente blanqueador es el dióxido de cloro, llegando a emplear el proceso TCF

(Totalmente libre de cloro) en el cual se ha eliminado completamente el cloro en cualquiera de

sus formas utilizando alternativamente otros agentes oxidantes, tales como: oxígeno (O2),

peróxido (H2O2) y ozono (O3).

Por otra parte, han adoptado tecnologías primarias (clarificadores gravitacionales) para eliminar

sólidos suspendidos (SS), y secundarias para eliminar la carga orgánica. Un ejemplo de

tratamiento secundario, corresponde a sistemas aeróbicos con biomasa suspendida tales como

lagunas aireadas y lodos activados y por otra parte, sistemas con biomasa inmovilizada tal

como MBBR (Movil Bed Biofilm Reactor), Además, se han dispuestos tratamientos terciarios

para eliminar compuestos específicos, como el color.

Sin embargo, a pesar de la implementación de este tipo de tecnologías, estudios han

demostrado la presencia de contaminantes con actividad hormonal presentes en los cuerpos de

agua receptores de los efluentes de celulosa Kraft. Estos contaminantes están llegando, a

través de las descargas de los efluentes de dicha industria y, al parecer están generando

anomalías a nivel endocrino, específicamente estrogénicas, en algunos organismos acuáticos

que habitan las zonas donde se realizan dichas descargas (Hewitt et al., 2005).

14

2.4. Compuestos extractivos de la madera: Los Fitosteroles

Como ya se mencionó, al parecer las gestiones y nueva tecnología implementada por la

industria de celulosa Kraft, no han sido suficientes ya que, lamentablemente, estudios señalan

la presencia de nuevos contaminantes presentes sus efluentes. Se trata de sustancias con

actividad hormonal. Al respecto, investigaciones han demostrado que existen alteraciones

crónicas en la función endocrina de una creciente cantidad de especies de animales, por

exposición a estas sustancias entre los cuales encontramos a crustáceos, aves, mamíferos y

peces (Argemi et al., 2005). Y al parecer, es en estos últimos organismos en los que el daño

generado ha sido más evidente.

Estos contaminantes, tienen una estructura química similar a la del colesterol, ya que

comparten el mismo núcleo (ciclopentanoperhidrofenantreno) y una cadena lateral que los

diferencia entre sí (Guang-guo et al., 2002). Es por esto último, que ingresan con mucha

facilidad a las rutas metabólicas de los organismos expuestos y, con esta misma facilidad

mimetizan la acción de las hormonas endógenas, es decir, de las hormonas que realmente

debieran estar actuando en aquel momento y entregar la respuesta adecuada. Lo cual,

evidentemente genera un desequilibrio hormonal, pues altera las vías endocrinas normales y

por ende, la homeostasis del organismo, lo cual se traduce en anomalías endocrinas (Sumpter,

2005).

A estos compuestos con actividad hormonal se le han denominado compuestos disruptores

endocrinos (CDE). Algunos de estos CDE son de origen natural, como por ejemplo, los que se

encuentran en los compuestos extractivos de la madera. Dentro de estos últimos, los más

preocupantes son los fitosteroles. Dicho de otra manera, éstos compuestos son hormonas

naturales de la madera y constituyen, junto con los fitostanoles, los componentes esenciales en

15

las membranas celulares. Sin embargo, al ser descargados a los cuerpos de agua, pueden

causar distintos tipos de alteraciones (Shiliro et al., 2000).

Sin duda, la proporción de estos compuestos en los efluentes de celulosa, está determinada por

el tipo de materia prima que es utilizada en el proceso productivo de dicha industria. Por

ejemplo, la madera de Pinus radiata, posee una cantidad de extractivos que varían entre los 0,5

a 7,0% y que es rica en ácidos resínicos mientras que, en menor grado Eucaliptos globulus,

presenta entre 0,2 a 3,5% de estos extractivos, siendo sus maderas ricas en fitosteroles

(LaFleur, 1996).

Estos compuestos son liberados a través del proceso de digestión del proceso productivo

empleado por la industria de celulosa Kraft y, pasan a formar parte del licor negro de dicha

etapa. No obstante, el problema no son los contaminantes presentes en el licor negro que

posteriormente es recuperado, sino que son los contaminantes que quedan adherido en la fibra

sucia y que son eliminados con el agua de lavado, es decir, pasa junto con ésta a la posterior

etapa, correspondiente a lavado, y es producto de ese lavado a la fibra que se genera un

residuo líquido que contiene una mínima parte del licor negro y por ende, de esos nuevos

contaminantes. Estos no son recuperados y pasan, con los demás residuos líquidos del proceso

productivo, a los sistemas de tratamientos pero que, lamentablemente, debido a las

propiedades físico-químicas que presentan no pueden ser degradados en su totalidad y

finalmente una pequeña porción llega a los cuerpos de agua, causando las anomalías

endocrinas.

16

2.5. Las alteraciones endocrinas provocadas por la exposición a los CDE

Como se mencionó anteriormente, pareciera ser que la atención de estos compuestos se ha

centrado principalmente en organismos acuáticos, debido a que ellos son los que están en un

contacto más directo con los efluentes. Además, los efectos se dan a conocer en un período de

tiempo relativamente más corto de lo que se dan a conocer en los demás seres vivos,

probablemente, por tener un contacto más íntimo de estos organismos con los compuestos. Ya

que justamente, es el ambiente acuático el que recibe la mayor cantidad de contaminantes de la

industria de celulosa, entre otras. Como consecuencia, se han observado ciertas alteraciones

estrogénicas en organismos habitantes en lugares cercanos a las descargas de efluentes de

celulosa Kraft. Dentro de las afecciones observadas, se pueden mencionar efectos como, la

feminización de peces machos, el aumento de vitelogenina, reducción del tamaño de sus

gónadas, prematura madurez sexual, inducción de citocromo P-450, disminución en la

producción de hormonas reproductivas, mortalidad de ovas, depresión de la fecundidad,

disminución de la fertilidad, graves deformidades en las crías y alteraciones en las

características sexuales secundarias. Algunas de estas afecciones son presentadas en la Tabla

III (Hodson et al., 1996; Janz et al., 1997; Kukkonen et al., 1999; Munkittrick et al., 1997;

Larsson et al., 2002; Tamagawa et al., 2005; Campbell et al., 2006). Estudios realizados por

Servos et al. (1996), y Kostamo et al. (2004), infieren que los responsables de tales efectos son

las hormonas naturales de la madera. Las que pueden son capaces de mimetizar a las

hormonas normales y producir alteraciones a nivel fisiológico y bioquímico con incidencia en el

sistema reproductor.

En nuestro país, investigaciones realizadas por Orrego et al. (2006), en peces machos juveniles

de la especie Onchorynchus mikiss habitante en las cercanías de las descargas de los

efluentes de celulosa Kraft, evidencian alteraciones a nivel homeostático. En general se

17

observa un cambio a nivel estrogénico, ya que los peces presentan un incremento en la

maduración de las gónadas y de la concentración de vitelogenina plasmática (VTGp). Sin

embargo, aún no se conocen los compuestos específicos que causan dichas alteraciones.

Se debe considerar que el o los efectos varían de acuerdo a la especie, edad, sexo, su

potencial endocrino y principalmente, el momento de la exposición. Se ha podido comprobar

que esta última parece tener más importancia que la misma dosis ingerida puesto que, a partir

de este se pueden determinar el carácter de gravedad y su evolución. Se destaca como la

exposición más critica a la comprendida en el tiempo de desarrollo embrionario, ya que en éstas

se alteran las etapas en las que el embrión se esta desarrollando y que por ende, definirá el

futuro individuo, así como también su sexo. Involucra toda la embriogénesis del futuro ser

incluyendo el neurodesarrollo (Olea and Zuluaga, 2001).

2.6. Modo de acción de los compuestos disruptores endocrinos y sus propiedades físico-

químicas

En condiciónes normal, la hormona endógena se une al receptor celular, lo cual desencadena

una serie de procesos correspondientes esperados en forma de cascada. Todo compuesto que

modifique algún proceso natural, estimulando o inhibiendo cualquiera de sus etapas, es

considerado en endocrinología como un compuesto xenobiótico o como los hemos llamado

hasta ahora, CDE (Landman et al., 2006). A su vez, aquellos compuestos que interfieran

directamente sobre el accionar de los esteroides naturales son denominados xenoestrógenos o

xenoandrógenos.

18

Tabla III. Anomalías endocrinas ocasionadas por la exposición a los efluentes de celulosa Kraft o a algún compuesto especifico

presentes en ellos.

Especie Efluente y/o

compuesto

Concentración en

efluente final

Efectos Referencia

Carassius auratus β-sitosterol 75-1200 (μg/L) Inducción de MFO McLatchy et al., 1997

Gambusia holbrokii Celulosa Kraft 0,14 nM

Decrecimiento de hormonas

masculinas

Jenkins et al., 2003

Zoarces viviparous Celulosa Kraft ----- Mayor porcentaje de embriones Larsson et al., 2002

Oncorhynchus mykiss Celulosa Kraft ----- Inducción de EROD y

vitelogenina

Oakes et al., 2005

Oncorhynchus mykiss Celulosa Kraft ----- Decrecimiento de hormonas

masculinas

Larsson et al., 2006

Daphnia magna Celulosa Kraft 20 % efluente Crecimiento Abdominal Xavier et al., 2005

Oryzias latipes Celulosa Kraft ----- Baja densidad de espermios Kiparissi et al., 2003

Oncorhynchus mykiss Celulosa Kraft ----- Inducción de MOF Burnison et al., 1999

Rainbow trout Celulosa Kraft ----- Inducción de vitelogenina Mellanen et al., 1996

19

Esto se debe a que, como ya se ha mencionado, estos compuestos pueden mimetizar la acción

de las hormonas endógenas, uniéndose al receptor específico propio de éstas, lo cual es

considerado como una de sus características más importantes, ya que les permiten interferir en

la reacción ya sea bloqueándola o generando reacciones más potentes o provocar respuestas

más débiles que las normales y en el momento inadecuado (Birkett and Lester, 2003). También

pueden unirse a los receptores específicos y no activarlos, actuando como antiestrógenos o

antiandrógenos ya que antagonizan la acción de las hormonas (Argemi et al., 2005).

Estudios realizados consistentes en el análisis de los efluentes industriales han permitido

afirmar que, efectivamente, muchos de estos compuestos disruptores endocrinos, tanto

artificiales como naturales, están presentes en los riles (Zeng et al., 2002) y que no todos tienen

el mismo potencial tóxico (Sumpter, 2005). Los compuestos más comunes encontrados en los

riles de celulosa, corresponden al campesterol, estigmastanol coumestrol, genistein, ácido

abiético, ácido dehidroabiético, ácidos grasos, ácido pimárico y cloroguiacoles entre otros,

destacando al β-sitosterol y estigmasterol, los cuales forman principalmente el licor negro

(Lacorte et al., 2003) (Figura 1).

Sin embargo, se debe tener en cuenta que el comportamiento de los disruptores endocrinos es

influenciado por sus propiedades físico-químicas, es decir, debido a estas propiedades, dichos

compuestos pueden permanecer o transformarse en ambiente. Esto último, ya sea por medio

de la absorción de éstos a la superficie del sólido o en la biota propiamente tal (Birkett and

Lester, 2003).

Dentro de estas propiedades físico-químicas se pueden mencionar a la solubilidad del agua, la

cual les otorga un potencial de disolución, la constante de ley Henry’s, favoreciéndoles el poder

evaporarse, el coeficientes de partición orgánico/carbono (Koc) y el octanol/agua (Kow) (Tabla

20

IV). Se puede indicar que a mayor valor de log Kow (coeficiente de partición octanol/agua) el

compuesto tiene una mayor bioacumulación. Sin embargo, esta condición sólo se cumple para

aquellos compuestos que presentan log Kow< 6.

Figura 1. Estructuras químicas de algunos fitoesteroles y ácidos resínicos detectados en los

efluentes de celulosa Kraft.

Se conoce que los fitoesteroles debido a sus propiedades físico-químicas, no están siendo

removidos, en su totalidad, con los sistemas de tratamientos implementados por la industria de

celulosa Kraft, incluso se evidencia que compuestos como el estigmasterol, es incrementado

luego de un tratamiento por laguna aeróbica (Cook et al., 1997). Es decir, que a pesar de tener

nuevas tecnologías, no son lo suficientemente eficientes pues un porcentaje considerable

continúa en los vertidos finales.

Ácido abiético Genistein β-sitosterol

HO

HO

HO O

OH O C O O H

Ác. dehidroabiético

Campesterol C O O H HO

O

Estigmasterol

21

2.7. Saccharomyces cerevisiae, recombinante y la tecnica YES (Yeast Estrogen Assay)

Las recientes investigaciones están siendo orientadas a detectar la actividad estrogénica y

androgénica de compuestos específicos contenidos en el efluente de celulosa Kraft y su

potencialidad como disruptores endocrinos. Cabe destacar que la atención ha sido enfocada en

el desarrollo de métodos de “screening”, para clasificar las sustancias estrogénicas (De Boever

et al., 2001). Sin embargo, los resultados de estos análisis no son los mismos debido a la

distinta sensibilidad que presentan las técnicas o los organismos expuestos (Formal et al.,

2002).

Comúnmente, para la detección de compuestos con actividad endocrina, se han empleado

técnicas analíticas y ensayos basados en respuestas bioquímicas y fisiológicas en organismos,

con gran efectividad, como la espectrometría (UV, visible, IR) y cromatografía (CGMS, HPLC)

(Campos et al., 2004). Sin embargo, estas técnicas son muy complejas y de alto costo

operacional. Además, la caracterización de la mayoría de los compuestos con disrupción

endocrina, no ha podido ser determinado, debido a la gran complejidad que presenta el efluente

de celulosa Kraft (Shaughnessy et al., 2007). Además, el hecho de que estos compuestos se

encuentran en una muy baja concentración, dificulta su identificación a través de técnica

analíticas.

22

Tabla IV. Propiedades físico-químico de compuestos presentes en el efluente de celulosa Kraft.

C*: Concentración en el efluente final.

Compuesto C (μg/L)* Punto de

fusión (°C)

Log Kow Solubilidad

mg/L 20°C

Peso

Molecular

Referencias

Ác. abiético 283-800 139-142 <5 ≈3 4.75 250 Xavier, 2006

Ác.

dehidroabietico

----- ----- < 5 ≈ 3 5.11 ----- Xavier, 2006

Genistein ----- 300 5,9 ----- 270,24 Mahmood-Khan and

Hall, 2003

β-sitosterol 75-1200 165-167 9,65 < 0.0001 414,72 Mahmood-Khan and

Hall, 2003

Campesterol 7,6 -----

----- ----- 400,7 Mahmood-Khan and

Hall, 2003

Estigmasterol 32,1 139-142 10,20 < 0.0001 414,70 Mahmood-Khan and

Hall, 2003

Estigmastanol 1,8 ----- 9,43 ----- 416,7 Mahmood-Khan and

Hall, 2003

23

No obstante, persiste la necesidad de implementar técnicas efectivas para cumplir dicho

objetivo, es por ello, que se ha recurrido a la utilización de los biosensores. Estos últimos son

organismos manipulados genéticamente con un fin. Ellos poseen componentes que reconocen

cambios físicos o químicos y que al estar unidos a ciertos elementos, producen una señal en

respuesta al impacto presente en el ambiente. Pueden, a su vez, ser clasificados en tres tipos:

celular, molecular y tejido fino (Bousse, 1996).

Principalmente, se debe destacar al biosensor que lleva por nombre Saccharomyces cerevisiae

recombinante. Esta levadura, fue modificada genéticamente en el Departamento de Glaxo en

Inglaterra, con el objetivo de otorgarle la capacidad de detectar el potencial estrogénico de

compuestos con actividad hormonal, por medio de respuestas colorimétricas, esto mediante la

técnica que lleva por nombre “Yeast Estrogen Assay” (YES) según lo establecido por el

protocolo de Routledge and Sumpter (1996). Este ensayo está basado en la expresión de la

enzima β-galactosidasa, la cual es usada como medida de actividad del receptor frente a un

compuesto estrogénico ya que, en presencia del compuesto estrogénico se estimula la

actividad transcripcional del biosensor y así, se expresa la respuesta del gen reportero (Xie et

al., 2004).

Saccharomyces cerevisiae es un organismo se conoce totalmente su genoma está totalmente,

además, es considerado como modelo simple de célula eucariótica. Para transformarlo en un

biosensor, como ya se mencionó, fue necesario modificarlo genéticamente. Dicha modificación,

específicamente, consistió en la adición de un receptor estrogénico en el ADN de la levadura

(hER-α) instalándose como un gen cromosomal (Roda et al., 2006), y un gen reportero a nivel

plasmidial (Lac-Z), el cual codifica para la síntesis de la enzima β-galactosidasa gracias a la

ayuda del promotor transcripcional o elemento de respuesta estrogénica (ERE) y a un promotor

fuerte (PGk).

24

Figura 2. Esquema que muestra como ocurren las reacciones en cadena en la levadura,

inducidas luego de que un compuesto estrogénico se une al receptor de estrógenos humano.

hER: Gen Receptor de Estrógenos Humano; ERE: Elemento de Respuesta Estrogénica; PGk:

Plásmido de expresión; Lac-Z: Gen reportero que induce la expresión de la enzima β-

galactosidasa.

La presencia del contaminante con un potencial estrogénico, en el medio, es detectada por el

biosensor. El contaminante se une al receptor hormonal, el cual se transforma en un receptor

activo, este estimulan al activador transcripcional y se expresa el gen reportero, el cual induce a

la expresión de la β-galactosidasa. Esta última, sale al medio y en presencia del reactivo

cromogénico (CPRG), se produce un viraje de color, el cual va de amarillo a rojo. El producto de

este último, se detecta cuantificando la actividad enzimática correspondiente, medido finalmente

con un espectrofotómetro (Sanseverino et al., 2005) a absorbancia de 550 nm y 630 nm (Birket

and Lester, 2003).

Citoplasma

CPRG Amarillo

Estrógeno

Receptor Activado

β-galactosidasa 5

4

CPRG Rojo

Lac-Z

2

3

hER

1Medio

PGk

ERE

Levadura

25

Este método se realiza actualmente en Brasil, pero es aplicado a aguas residuales domesticas.

Sin embargo, ya se está ocupando en estudios realizados en los efluentes de las industrias de

celulosa, para detectar o no compuestos con actividad estrogénica. Por ejemplo, en U.S.A y

Alemania. En este último país, Hamm et al. (2006), evaluaron 16 muestras de efluentes de

pulpa química mediante el YES de levadura recombinante, 10 muestras fueron probadas

positivas, 7 de ellas eran efluentes de celulosa Kraft con tratamiento distintos tipos de

tratamientos para sus efluentes.

26

3. HIPOTESIS DE TRABAJO

Existen compuestos específicos puros, derivados de compuestos extractivos de la madera,

presentes en un efluente de celulosa Kraft y que presentan actividad estrogénica detectada por

el biosensor Saccharomyces cerevisiae, recombinante

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general.

Evaluar la actividad estrogénica de compuestos específicos puros, presentes en un efluente de

celulosa Kraft.

4.2. Objetivos específicos.

1. Evaluar la respuesta del biosensor, Saccharomyces cerevisiae recombinante,

mediante compuestos de referencias.

2. Evaluar la actividad estrogénica de compuestos específicos puros, contenidos en

efluente de celulosa Kraft mediante Saccharomyces cerevisiae recombinante.

27

5. METODOLOGÍA

5.1. Actividad estrogénica

La actividad estrogénica de los compuestos específicos puros detectados en los efluentes de

celulosa Kraft, fue determinada mediante la técnica Yeast Estrogen Assay (YES), realizada

según la metodología descrita por Routledge and Sumpter (1996).

5.1.1. Cepa de levadura recombinante

La cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae recombinante, fue modificada genéticamente

por el Departamento de Genética da Glaxo, para ser usada como un test en la identificación de

sustancias que pueden interactuar con el gen humano (hER), el cual controla la expresión del

gen reportero Lac-Z produciendo la enzima β-galactosidasa. La cepa a utilizar en este ensayo,

fue donada por la profesora Marcia Dezotti del Departamento de Ingeniera Química de Polución

de Aguas de la Universidad Federal de Río de Janeiro, Brasil.

5.1.2. Preparación de las soluciones del medio de cultivo

Preparado previamente para un nuevo cultivo de levadura. Este medio se compone de: 45 mL

medio mínimo, 0,5 mL de vitaminas, 5 mL de solución de glucosa, 1,25 mL de solución de ácido

aspártico, 0,4 mL de solución de L- Treonina y 125 μL de una solución de Cobre II. Todas las

mediciones de los reactivos, fueron realizadas en la Balanza analítica marca Precisa, modelo

XB 120 A (Figura 3).

28

a) Preparación del medio mínimo (pH 7,0 - 7,1)

El medio mínimo se preparó en 1 L de agua HyPure Cell Culture marca HyClone por la adición

de 13, 61 g de KH2PO4 (98% Fluka), 1,98g (NH4)2SO4 (Scharlau), 4,2g de KOH pellets

(Scharlau), 0,2g de MgSO4 (Merck), 1 mL de solución de Fe2(SO4)3 (40 mg/50 mL H2O) 50 mg

de L-Leucina (98% Sigma), 50 mg de L-Histidina (99% Sigma), 50 mg de Adenina (99% Sigma),

20 mg de L-Arginina-HCl (98% Sigma), 20 mg de L-Metionina (98% Sigma), 30 mg de L-

Tirosina (98% Sigma), 30 mg de L-Isoleucina (98% Sigma), 30 mg de L-Lisina-HCl (98%

Sigma), 25 mg de L-Fenilalanina (98% Sigma), 100 mg de L-ácido glutámico (98% Sigma), 150

mg de L-Valina (98% Sigma), y 375 mg L-Serina (99% Sigma). Posteriormente, la solución fue

estandarizada a pH 7,1 en el Peachímetro c/ electrodo Sentix 41, Marca WTW, modelo Inolab

pH level 1 (Figura 4), almacenada en frascos de vidrio, esterilizados a 121º C por 15 minutos y

guardados a temperatura ambiente.

Figura 3. Balanza analítica marca Precisa, modelo XB 120 A.

29

b) Preparación de solución de vitaminas

Una solución de vitaminas se preparó en 180 mL de agua HyPure Cell Culture marca HyClone

por la adición de 8 mg Tiamina (98% Sigma), 8 mg Piridoxina (98% Sigma), 8mg Pantetonato

de calcio (98% Sigma), 40 mg Inositol (98% Sigma) y, 20 mL de solución de Biotina (2mg/100

mL de H2O) (99% Sigma). Posteriormente, esta solución fue filtrada a través de una membrana

estéril de 0,2 μm. Posteriormente fueron guardadas en alícuotas de 10 o 20 mL, a 4º C en

frascos de vidrio esterilizados.

Figura 4. Peachímetro c/ electrodo Sentix 41, Marca WTW, modelo Inolab pH level 1.

c) Preparación de solución de Glucosa

Una solución de 20% p/v (20g/100mL) de D (+) glucosa (98% Merck), fue preparada y

esterilizada en alícuotas de 20 mL de agua HyPure Cell Culture marca HyClone, a 121° C por

10 minutos y guardada a temperatura ambiente.

30

d) Preparación de solución de ácido L-aspártico

Una solución stock de 4 mg/mL (400 mg/ 100mL) de ácido aspártico (98% Sigma), fue

preparada y esterilizada en alícuotas de 20 mL de agua HyPure Cell Culture marca HyClone, a

121°C por 10 minutos y guardadas a temperatura ambiente.

e) Preparación de solución de L-Treonina

Una solución stock de 24 mg/mL (600 mg/25 mL) de L-Treonina (98% Sigma), fue preparada y

esterilizada en alícuotas de 5 mL de agua HyPure Cell Culture marca HyClone, a 121° C por 15

minutos y guardadas a 4°C.

f) Preparación de solución de Sulfato de Cobre II

Una solución de 20 mM (0,5 g/100 mL de agua HyPure Cell Culture marca HyClone) de sulfato

de cobre (II) fue preparada, filtrada en membrana estéril de 0,2 μm esterilizada. La solución fue

guardada a temperatura ambiente en frascos de vidrio esterilizados.


Previo a la aplicación de la técnica se realizaron cultivos realizados con distintas cantidades de

inóculos de levadura (μL), incubados a distintas temperaturas por un determinado tiempo. Los

cultivos realizados fueron: 250 μL a 26º C, 250 μL a 28º C, 500 μL a 28º C, 250 μL a 30º C, 250

μL a 32º C y uno de 1000 μL a 28º C. Todo esto, se realizó para la obtención de datos que

permitieran un crecimiento óptimo para la levadura, debido a la necesidad de obtener un

31

número total de 4x107 células de levadura. Sólo teniendo tal número se puede hacer uso del

biosensor en la técnica YES. Para verificar dicho valor, se midió la absorbancia (A) de cada uno

de los cultivos realizados desde el tiempo 0 a 192 (h) cada 24 h, a través del espectrofotómetro

marca Spectronic Unicam, modelo Génesis 10UV (Figura 5) a una longitud de onda de 630 nm.

Dicha absorbancia debe tener un valor entre 0,8–1,0 (Boever et al., 2001), lo cual indica que se

cuenta con el número de células de levadura indicado anteriormente. Si la A es < 0,8, se

adiciona un pequeño volumen de levadura (de 0,2 a 0,2 ml), por otra parte, si A > 1, se adiciona

medio de cultivo. El cultivo de la levadura debió ser realizado en una cámara de flujo laminar

marca Misonix Modelo PCR 6 (Figura 6).

5.3. Cultivo de levadura

En un frasco T estéril de 50 mL, se adicionaron 10 mL de medio de cultivo más 100 μL de

levadura y luego, se incubó en el Agitador Orbital c/regulación de tiempo y Tº, marca LAB-LINE,

modelo Enviromental Shaker (Figura 7), a 28° C e 100 rpm durante 24 horas para ser utilizada

en el ensayo.

Figura 5. Espectrofotómetro marca Spectronic Unicam, modelo Génesis 10UV.

32

Figura 6. Cámara de Flujo Laminar marca Misonix Modelo PCR 6.

Figura 7. Agitador orbital c/regulación de tiempo y Tº, marca LAB-LINE, modelo Enviromental

Shaker.

5.4. Preparación de soluciones para el ensayo

Las soluciones ocupadas en el ensayo corresponden a un patrón ó compuesto positivo de 17α-

etinilestradiol (EE2) con una pureza de 99%, Sigma. Un blanco ó compuesto negativo (Etanol

absoluto). Y dos compuestos puros de fitoesteroles: β-sitosterol y Estigamasterol

33

Para la obtención de la curva del patrón se tomaron concentraciones entre 54,48μg/L-26,6 ng/L.

Para la preparación de los compuestos puros se realizaron soluciones Stock de estigmasterol,

(100mg/25mL de etanol absoluto) posteriormente, esta solución fue sonicada en el Sonicador

marca Transsonic 460. Para β-sitosterol (100mg/25mL de etanol absoluto), se realizó el mismo

procedimiento que para el fitoesterol ya mencionado. Las soluciones mencionadas fueron

almacenadas a 4° C.

5.5. Preparación de solución de Rojo clorofenol β-D-galatopiranosido (CPRG, reactivo

cromogénico)

Una solución stock de 10 mg/mL de Rojo β-D-galactopiranosido (90%, Fluka) fue preparada

en agua HyPure Cell Culture marca HyClone, y guardada a 4° C en frascos de vidrio

esterilizados. Esta solución contiene el sustrato sobre el cual actúa la enzima β-

galactosidasa, liberada por el biosensor, cuando ésta detecta un compuesto con potencial

estrogénico en el medio. Así, dicha enzima rompe la unión de este reactivo y libera al medio,

una molécula de galactosa y una de rojo clorofenol, este último es responsable de la

coloración roja que nos hace posible saber que la levadura ha detectado dicho potencial.

5.6. Preparación de las diluciones para el ensayo

Para cada ensayo se prepararon dos microplacas (Corning). Una de ella corresponde a la placa

de dilución y la otra la del ensayo propiamente tal. En la primera se realizaron diluciones

seriadas en duplicado para el compuesto patrón o 17α-etinilestradiol, desde el pocillo n°1 al

n°12, quedando con concentraciones de 54,48 μg/L a 26,61 ng/L. En otro par de filas, se realizó

34

la dilución seriada para estigmasterol y para β-sitosterol. Ambos compuestos quedaron con

concentraciones de 100 mg/L a 50 μg/L.

Para hacer las diluciones, se adicionaron 100μL de etanol absoluto en 12 pocillos de la fila de la

placa de dilución del blanco, menos en el pocillo n°1. Mientras que en el pocillo n°1 se adicionó

200μL de solución stock de 17α-etinilestradiol o de las muestras, según corresponda. Por otro

lado, en el pocillo n°2 se adicionó 100μL de solución del 1° y se agitó. A su vez, en el pocillo n°3

se adicionó 100μL de solución del 2° y se agitó. Así se continuó, sucesivamente, hasta el último

pocillo de la fila.

Todo este ensayo debe estar en las condiciones máximas posibles de esterilidad por lo mismo

todos los pasos, a partir de la placa de dilución, se realizaron en la Cámara de Flujo Laminar

marca Misonix Modelo PCR 6. Sólo una vez listos estos pasos, se continua en lo que respecta a

la placa de ensayo.

5.7. Técnica “Yeast Estrogen Assay” (YES)

Luego, de terminada las diluciones en la placa de dilución se procedió a realizar la placa de

ensayo. Sin embargo, antes de esto se prepararon dos tubos. Para la preparación del primer

tubo se adicionaron 25 mL de medio de cultivo a un tubo falcón de 50 mL, a este mismo se le

agregaron 250 μL de la solución de CPRG (10mg/mL) y 25μL de solución del Tubo 2. Para la

preparación de este último, se adicionaron 4 mL de medio de cultivo a un tubo falcón de 10 mL,

además de 1,1 mL de un cultivo de levadura de 24 horas al día del ensayo.

35

Una vez preparados estos medios, se procede a adicionar 10μL de cada pocillo de la placa de

dilución a la placa de ensayo. De la mezcla realizada en el tubo 1, se transfirió una alícuota de

200μL a cada pocillo de la microplaca. Luego de este procedimiento las microplacas fueron

selladas con cinta de autoclave, y agitadas vigorosamente por 2 min. Finalmente, cada placa

fue incubada por 72 horas a 30º C. en la estufa marca Termo Areus modelo B6 (Figura 8).

Figura 8. Estufa marca Termo Areus, modelo B6.

Cumplido el tiempo de incubación se procedió a retirar las placas de la incubadora y se dejaron

descansar por una hora a temperatura ambiente. La respuesta se consideró como positiva al

cambio de color amarillo a rojo, el cual fue medido espectrofotométricamente a través del lector

de placas EL x 800, BioTex a dos longitudes de onda, 550nm (color reflejado en la actividad de

la β-galactosidasa) y a 630nm (turbidez) (Figura 9).

36

Figura 9. Lector de placas EL x 800, BioTex.

5.8. Análisis de Resultados

El análisis de resultados se realizó por medio del programa Origin version 6.0 en el cual se

ingresaron los siguientes datos: concentraciones de dilución de cada uno de los 12 pocillos de

cada fila, desviación del compuesto patrón y la absorbancia corregida. Esta última resulta de

una ecuación matemática (Ecuación 1).

Donde A 550 nm corresponde a la absorbancia del compuesto a 550 nm, A 630 nm es la absorbancia

del compuesto a 630 nm y, A media del blanco 630 nm es la absorbancia media obtenida de todos los

pocillos blanco a 630 nm.

Posteriormente, se obtiene una curva sigmoidal a la que se aplica logaritmo en base 10 para

finalmente obtener la concentración EC50, la cual seré explicada más adelante.

Ecuación 1 A 550 nm – (A 630 nm – A media del blanco 630 nm)

37

0.80 0.66

0 24 48 72 96 120 144 168 192 2160,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Abs

orba

ncia

630

nm

Tiempo (h) 26 °C 28 °C 28 °C 30 °C 32 °C

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN


Para determinar las condiciones óptimas de crecimiento de la levadura se realizaron distintos

cultivos a diferentes temperaturas y concentración del biosensor. Los resultados indican que el

óptimo de la cepa para realizar el ensayo, corresponde a un cultivo inoculado con 500 μL de la

cepa de Saccharomyces cerevisiae, recombinante, e incubado a 28 ºC, durante 24 h. Con la

necesidad de obtener una densidad óptica del cultivo entre 0,8 y 1 a 630 nm (Figura 10).

Figura 10. Gráfico que demuestra los resultados obtenidos de los cultivos de levadura,

realizados con distintas cantidades de inóculos (μL), incubados a distintas temperaturas por un

tiempo que va desde las 0 a 192 h.

38

En un cultivo posterior, se inocularon 1000 μL, los cuales fueron incubados a 28 ºC durante 24

horas. Este óptimo de temperatura se demostró también en la velocidad de crecimiento

específico del biosensor (Figura 11). Cumplido ese tiempo, el cultivo demostró tener una mejor

absorbancia para realizar la técnica YES (A 1,0). Esto último, indica que es posible la

realización de la técnica después de 24 horas pero, con la adición de un inóculo más

concentrado. A través de la medición de la absorbancia del cultivo de levadura se pudo obtener,

una cinética de la velocidad de crecimiento especifico del biosensor a distintas temperaturas

(Tabla V), mediante la Ecuación 2.

Donde dx, corresponde a la variación de la concentración de la levadura y dt a la variación en el

tiempo y, µ corresponde a la velocidad de crecimiento especifica del biosensor.

Tabla V. Velocidad de crecimiento especifico del biosensor a distintas temperaturas, mediante

la Ecuación 2.

Temperatura

(ºC)

Velocidad de

crecimiento

20 0

26 0.0088

28 0.0188

30 0.0119

32 0.0054

Ecuación 2 µ X dx

dt

=

39

Figura 11. Velocidad específica de crecimiento del biosensor a distintas temperaturas.

De acuerdo a lo anterior se concluyó trabajar, a una temperatura de 28ºC, con un inóculo de

1000 μL de un cultivo de 24 horas.

6.2. Ensayo Yeast Estrogen Assay (YES)

La actividad estrogénica de dos compuestos específicos puros detectados en los efluentes de

celulosa Kraft, estigmasterol y β-sitosterol, fue determinada mediante el uso de la técnica Yeast

Estrogen Assay (YES) para la obtención de la EC50. Esta última, es la concentración en la que

se produce una actividad estrogénica igual al 50% del compuesto patrón (Hamblen et al., 2003),

el cual en este trabajo, correspondió al 17α-etinilestradiol (EE2) y fue determinada para cada

compuesto a través del programa Origin versión 6.0. De este último, se obtienen curvas dosis

respuestas (obtenida usando el método de regresión logarítmica), resultantes de los valores de

la absorbancia corregida (nm) (variable dependiente) y la concentración de actividad

estrogénica (variable independiente).

20 22 24 26 28 30 32 34

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

Vel.

esp.

crem

, u

Temperatura (°C)

40

Durante los primeros ensayo en el periodo de incubación de la placa (72 h), se evidencia una

coloración roja en la mayoría de los pocillos, incluyendo la del control (etanol, control negativo),

los cuales debían permaneces sin viraje de color. De acuerdo a esto, se plantea que el agua

utilizada (agua nanopura tratada por un sistema milliQ) tanto para la dilución de los compuestos

como para la preparación del medio mínimo, posee compuestos con potencial estrogénico, los

cuales estaban induciendo una respuesta positiva errónea (Figura 12). Por lo tanto, no es

posible utilizar el agua nanopura.

Figura 12. Placas que resultaron tener resultados erróneos (coloración roja) puesto que daban

positivo al compuesto control (negativo o blanco), el cual en este trabajo corresponde al etanol

absoluto.

Para la solución de este problema, se recurrió al uso de agua ultrapirogénica o HyPure Cell

Culture marca HyClone, para la preparación de todas las soluciones, tanto de las del ensayo

como las del medio de cultivo de la cepa de Saccharomyces cerevisiae recombinante.

Resuelto el problema de la coloración errónea en el compuesto negativo, utilizando el agua

HyPure Cell Culture marca HyClone, se obtuvieron los resultados correctos. En estos últimos,

41

después de las 72 horas de incubación, el compuesto control seguía presentando una

coloración amarilla producto de la presencia del reactivo cromogénico, mientras que, los

compuestos que tenían un potencial estrogénico presentaban una coloración rojiza. Esto

evidencia que, efectivamente el agua milliQ utilizada en los primeros ensayos, presentaba

compuestos con actividad estrogénica y que estaban induciendo la actividad de la β-

galactosidasa del biosensor. A su vez, indica que este microorganismo genéticamente

modificado, posee una alta sensibilidad analítica ya que, es capaz de detectar compuestos aún

con bajo potencial estrogénico en su medio. Además, dicho biosensor es capaz de generar una

serie de reacciones en cadena, las cuales se traducen en la expresión de la enzima β-

galactosidasa, la cual sale al medio y reacciona con reactivo cromogénico (CPRG) produciendo

un cambio en el color del medio de amarillo a rojo. Esto último es posible ver en la Figura 13.

Figura 13. Placa con la respuesta de un viraje de color correcto, cuando se utiliza agua

ultrapirogénica.

Los dos fitoesteroles evaluados mostraron tener un potencial estrogénico reflejado en la

concentración efectiva (EC50), destacándose al β-sitosterol ya que, demostró una

estrogenicidad mucho más fuerte que la presentada por el estigmasterol. Específicamente, y

A B

42

como lo indican los resultados de la Tabla VI, se puede observar que el 17α-etinilestradiol

presenta un potencial estrogénico de 6.46E-05 μg/L, mientras que el β-sitosterol y estigmasterol

presentaron una EC50 de 2.30E-04 μg/L y 0.001262 μg/L, respectivamente. En otras palabras, el

β-sitosterol es 3,8 veces menos estrogénico que el EE2, mientras que, el estigmasterol es 21

veces menos potente que el compuesto patrón. No obstante, estas diferencias no significan que

estos compuestos no tengan un potencial estrogénico.

Tabla VI. Concentraciones efectivas (EC50) obtenidas para el EE2, Estigmasterol y β-sitosterol a

través de la aplicación de una regresión logarítmica a las curvas dosis respuestas, entregadas

por el programa Origin versión 6.0.

Estos hallazgos sugieren que el EE2, a pesar de no estar presentes en los efluentes de

celulosa Kraft, se ha detectado en los efluentes domésticos, llegando a través de éstos, a los

sistemas de tratamiento. Sin embargo, al no ser depurado en su totalidad, las mínimas

concentraciones detectadas, en los cuerpos de agua sugieren que dicho compuesto, presenta

actividad estrogénica (Routledge et al., 1998), al igual que el estigmasterol y β-sitosterol

(presentes en los efluentes de celulosa Kraft). Estos compuestos mencionados podrían ser los

responsables de las alteraciones estrogénicas observadas en peces machos expuestos a los

efluentes domésticos y de celulosa Kraft. De hecho, autores señalan que el β-sitosterol puede

causar alteraciones endocrinas a los 14 μg/L (Bruchet et al., 2002).

Compuesto EC50 (μg/L)

EE2 0,0000646

Estigmasterol 0,001262

β-sitosterol 0,000230

43

Los resultados entregados por el biosensor mediante el ensayo YES para el compuesto patrón,

pueden observarse en la Figura 14. La exposición de los seres vivos a los disruptores

endocrinos es masiva y universal, ellos no discriminan. A su vez, nadie esta expuesto a un sólo

compuesto, es más, muchos de ellos podrían no actuar solos sino, en combinación con otros

(Hilscherova et al., 2000). Los efectos endocrinos que están siendo observados en los

organismos que habitan las cercanías de donde se vierten lo efluentes de celulosa Kraft hacen

surgir la necesidad de conocer más acerca de estos compuestos y su potencial estrogénico, sin

embargo, los análisis a estos efluentes, biológicamente tratados, apenas han sido explorados

hasta ahora (Hamm, 2006).

Figura 14. Respuesta obtenida del ensayo YES, para un rango de dilución de 54,48 μg/L a

26,61 ng/L del compuesto patrón (17α-etinilestradiol).

1E-7 1E-6 1E-5-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.02.2

Activ

idad

B-g

alac

tosi

dasa

(Aco

rreg

ida)

Log concentración (M)

44

1E-4 1E-3 0.01

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

Act

ivid

ad B

-gal

acto

sida

sa (A

corr

egid

a)


Figura 15. Respuesta obtenida del ensayo YES, para un rango de dilución de 100 mg/L a 50

μg/L del compuesto patrón (β-sitosterol).

Figura 16. Actividad de la enzima muestra β-galactosidasa frente a Estigmasterol en un rango

de dilución de 100 mg/L a 50 μg/L.

1E-4 1E-3 0.01

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Act

ivid

ad B

-gal

acto

sida

sa (A

corr

egid

a)


45

Debido a la gran complejidad química de estos compuestos y la mezcla de ellos, aumentan su

efecto adverso sobre los sistemas biológicos, actuando con una mayor fuerza en poblaciones

que están cerca de aquellas industrias. Por otra parte, las características físico-químicas de los

compuestos juegan un rol importantes en la distribución de éstos en el ambiente.

Por otra parte, para hacer una comparación más directa del potencial estrogénico de cada

compuesto evaluado en el ensayo, fue determinada la potencia relativa estrogénica (PR) tanto

para el estigmasterol β-sitosterol calculada a partir de la Ecuación 3. Esta para cada sustancia

con referencia al EE2 (Tabla VII).

Tabla VII. Potencia relativa estrogénica para cada fitoesterol con respecto al patrón.

El impacto ambiental que generan los efluentes de la industria de celulosa Kraft, puede

provocar serias consecuencias a nivel ambiental. Considerando que investigaciones realizadas

evidencian que estos compuestos están siendo detectados en los efluentes de celulosa Kraft a

concentraciones que superar el poder de su estrogenicidad. Van Den Heuvel et al. (2002),

realizaron un estudio en los efluentes de celulosa Kraft con tecnología de blanqueo tipo ECF y

detectó en ellos, el campesterol (7,6 μg/L), estigmasterol (21,1 μg/L) y β-sitosterol (165,4 μg/L).

Compuesto PR

Estigmasterol 0.0511

β-sitosterol 0.2808

Ecuación 3 EC50EE2 PR =

EC50 muestra

46

Estos vertidos en general han sido evaluado a través de estudios de toxicidad aguda, por medio

de respuestas letales (mortalidad) o a través de estudios de toxicidad crónica, con respuestas

subletales (fertilización, crecimiento, comportamiento) (Priha, 1996). Sin embargo, en las

últimas cuatro décadas, los efluente de celulosa Kraft, han sido relacionados con problemas en

el sistema reproductor endocrino.

Lo grave, es que pareciera no haber tratamiento que nos libre de ellos, puesto de que, hay

estudios que dejan en claro de que estos compuestos no están siendo eliminados por los

tratamientos empleados por esta industria en la depuración de sus riles. Esto último, hace que

estos compuestos lleguen, a los cuerpos de agua y estén actuando perjudicialmente sobre un

sin número de organismos, principalmente acuáticos, lo cual se puede observar con cierta

facilidad en los peces que son expuestos a efluentes previamente tratados (Howell et al., 1980;

Hartley et al., 1998; Hewitt et al., 2000; Houtman et al., 2004; Shaughnessy et al., 2007).

Al respecto, se han realizado investigaciones en las que se observa un efecto crónico e

irreversible de alteración hormonal (Servos et al., 1996; Cook et al., 1997; Kostamo et al., 2004;

Sumpter, 2005; Orrego et al., 2006; Vidal et al., 2007). De hecho, Chile no es la excepción de

esta invasión de compuestos con actividad hormonal. Es así como se dan a conocer, por

primera vez en Chile, las alarmantes evidencias obtenidas en estudios de campo, experimentos

de laboratorio y estadísticas, para plantear en términos científicos, pero accesibles para todos,

el caso de este nuevo peligro. Y es así mismo, como nace la necesidad de caracterizarlos,

evaluar, además de conocer su capacidad endocrina como también los efectos adversos que

pueden ocasionar en la población y en el medio ambiente. Actualmente, la atención ha sido

dirigida a identificar los productos químicos, principalmente estrogénicos, porque muchos de los

efectos demostrados en la fauna parecen ser una consecuencia de la feminización de machos

(Sumpter, 2005).

47

Sin lugar a dudas, estamos frente a un problema emergente, real y silencioso, que está

dispuesto a atentar contra la salud ambiental. Lo curioso es que los enemigos, ahora son

sustancias naturales y más aún, son parte de nuestra vida y han llegado a convertirse en parte

integrante de nuestra economía industrial, difundiéndose con asombrosa facilidad por todo el

ambiente (White et al., 1994).

Como se ha podido observar, es importante conocer los compuestos presentes en el efluente

de celulosa Kraft que pudiesen causar disrupción endocrina, debido al panorama que se

enfrenta este tipo de empresa los próximos años, con el creciente aumento de demanda de

celulosa blanqueada, lo que posteriormente resultara en una mayor cantidad de estos

contaminantes al medio ambiente, en especial el acuático y con estos resultados se darían a

conocer detalladamente los distintos potenciales estrogénicos, de manera de estimar los

riesgos asociados a este ámbito industrial, y poder tomar medidas de prevención y protección.

48

7. CONCLUSIONES

• Las condiciones óptimas para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae, recombinate son

1000 μL levadura incubados durante 24 h a una temperatura de 28 ºC.

• La concentración efectiva 50 del estigmasterol es de 0,001262 μg/L , para el β-sitosterol

0,000230 μg/L mientras que para el EE2 fue de 0,0000646 μg/L

• La potencia relativa estrogénica (PR) del estigmasterol con respecto al potencial del 17

α-etinilestradiol es de 0,051 y para el β-sitosterol es de 0,28.

49

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