i

ii

JURADO DICTAMINADOR

iii

PRESENTACIÓN

SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO:

Cumpliendo con el reglamento de graduación de la Escuela de Post-Grado de la

Universidad Nacional de Trujillo, someto a vuestra consideración la tesis doctoral titulada:

EFECTO DEL Bacillus subtilis Y “Gallinaza” COMO SUPRESORES DE Meloidogyne sp. EN

CULTIVO Capsicum annuum, PIURA, PERÚ 2010 – 2011.

Trujillo, 15 de febrero de 2014

MsC. Nancy Mercedes Soto Deza

iv

Gracias...

A DIOS,

por guiarme en el camino del saber, darme la sabiduría para

culminar este proyecto y poder contribuir a un mundo mejor.

A mi esposo GERARDO EDMUNDO,

por su amor y ser el cómplice incondicional en el logro

de mis metas.

A mi hijo FRANCHESCOLY,

por ser mi fuente de inspiración para avanzar y que un

día quiera seguir mis pasos.

v

Gracias...

A mis Padres ARTEMIO Y PAULINA, por su amor, apoyo y

motivación constante en el logro de cada proyecto soñado.

Gracias por pertenecerles.

A mis Hermanos EDGAR, MARÍA SONIA, JULIA

MARLENY, TERESA ISABEL Y ELOISA ANTONIETA y

Hermanos Políticos RIGOBERTO Y MERY, por brindarme

su cariño y con el compromiso de ser su mano amiga en el

logro de sus metas.

A mis sobrinos, JOUSETH, SEBASTIAN,

ALLMENDRA, FIORELLA, EDGAR MANUEL,

JHAROL y JIMMY, con el deseo me tengan presente

en su superación personal y ser parte de sus éxitos.

A mi sobrino JHOSSER, con cariño en

memoria de su recuerdo.

vi

AGRADECIMIENTOS

Expreso mi especial agradecimiento a:

- Mis asesores, Dr. Segundo Eloy López Medina y Dr. César A. Murguía Reyes,

por sus sabios consejos y orientaciones en el desarrollo del presente trabajo.

- Sr. Guillermo León Arámbulo, Gerente General de ECOSAC, por su apoyo

incondicional en la ejecución del presente trabajo.

- Dra. Milly Otiniano García, por su orientación en el trabajo de laboratorio.

- Dr. Mario Esparza Mantilla, por su apoyo en la identificación molecular de

microorganismos.

- Sr. Luis Bustamante, Gerente Agrícola de la empresa ECOSAC y al equipo

técnico que hizo posible la ejecución del plan de trabajo para el cultivo de ají

pimiento del piquillo:

Ing. Jorge Espinoza Huancas: Jefe de cultivos de Pimientos

Ing. Luis Bobadilla: Supervisor del área en estudio.

Bach. Jessica K. Valdivieso Calle: Área de Investigación y Desarrollo

Ing. William Saavedra: Coordinador Fertirriego Capsicums

- Instituciones públicas y privadas que de una u otra manera han colaborado en la

presente investigación:

Empresa Ecoacuicola SAC, Chapairá, Castilla, Piura, Perú.

Universidad Nacional de Trujillo, Facultad de Ciencias Biológicas, Trujillo, Perú.

Universidad Nacional de Piura, Laboratorio de Nematología, Piura, Perú.

Universidad de Antofagasta, Laboratorio de Biominería. Centro de Bioinnovación

y Departamento de Acuicultura, Chile.

vii

“…La causa de tu presente es tu pasado, así como la causa de tu futuro será

tu presente…”

Pablo Neruda

viii

RESUMEN

En Piura, Chapairá, en parcela de cultivo de Capsicum annuum “ají pimiento piquillo”

infestados con nematodos Meloidogyne sp., se evaluó el efecto del Bacillus subtilis y

“gallinaza” como agentes supresores del nematodo del nudo Meloidogyne sp.; se aplicó

diseño de bloques completos al azar. En la parcela se incorporó “gallinaza” al 85 % de

pureza, en dosis 15 y 30 t/ha. Para la siembra directa se inoculó semilla de C. annuum en B.

subtilis, a concentración 1 X106 esp/mL y 2 X 106 esp/mL. A los 45 y 90 días se determinó:

análisis de poblaciones de nematodos, índice de nodulación, altura de planta, número total

de frutos y análisis microbiológico para determinar presencia de B. subtilis en raíz de C.

annuum. Los datos se sometieron a análisis de varianza utilizándose software Statgraphics

Plus 5.0. Las poblaciones iniciales de Meloidogyne sp., antes de aplicación de tratamientos

variaron entre 275 y 27720 nematodos/100 cm3 de suelo; después de aplicar B. subtilis, la

población final registró valores de 13 a 0 nematodos/100 cm3 de suelo, con un índice de

agallamiento entre grado 0 y 2. Los resultados indicaron diferencias significativas (P≤0,05)

entre los tratamientos; concluyendo que la “gallinaza” interactuó con B. subtilis

favoreciendo la acción supresora sobre Meloidogyne sp., en cultivo de C. annuum,

mejorando la productividad del cultivo.

Palabras clave: Bacillus subtilis, Gallinaza, Meloidogyne sp., Capsicum annuum.

ix

ABSTRACT

In Piura, Chapairá in plot cultivated Capsicum annuum "chili pepper piquillo" infested with

nematodes Meloidogyne sp., the effect of Bacillus subtilis and "chicken manure" was

evaluated as suppressing agents knot nematode Meloidogyne sp. Two trials were

established, where it is applied design of complete randomized block design. Driveway

"chicken manure" was incorporated into 85% pure, at doses 15 and 30 t / ha. For direct

sowing seed C. annuum in B. subtilis was inoculated at a concentration of 1X106 spore/mL

and 2 X 106 spore/mL. At 45 and 90 days was determined: analysis of nematode

populations, nodulation index, plant height, total number of fruits and microbiological

analysis to determine the presence of B. subtilis in the wake of C. annuum. The data was

subjected to analysis of variance using the Statgraphics plus 5.0 software. Initially, the study

showed highly infested knot nematode Meloidogyne sp., 275 to 27720 soil nematodes/100

cm3; after application of B. subtilis, the final population recorded values nematodos/100 13-

0 cm3 soil with degree galling index between 0 and 2. The results indicated significant

differences (P ≤ 0.05) between treatments. Concluding that the "chicken manure"

interacted with B. subtilis favoring suppressive action on Meloidogyne sp. in culture of C.

annuum, improving crop productivity.

.

Key words: Bacillus subtilis, Chicken manure, Meloidogyne sp., Capsicum annuum

x

INDICE

Pág.

AGRADECIMIENTO ......................................................................................... viii

RESUMEN ........................................................................................................... viii

ABSTRACT ........................................................................................................... ix

LISTA DE TABLAS. ............................................................................................ xi

LISTA DE FIGURAS. .......................................................................................... xii

I. INTRODUCCIÓN………………………………………………................................ 1

II. MATERIAL Y MÉTODOS ………………………………………………. ............. 8

2.1MATERIAL DE ESTUDIO ............................................................................... 8

2.2ÁREA DE ESTUDIO ........................................................................................... 8

2.3LUGAR DE ESTUDIO ........................................................................................ 8

2.4 DISEÑO DE EXPERIMENTACIÓN ............................................................... 8

2.5 METODOLOGÍA ............................................................................................... 9

2.5.1 Preparación del terreno ............................................................................. 9

2.5.2 Adquisición del inoculo ............................................................................. 10

2.5.4 Estandarización del inóculo ..................................................................... 12

2.5.5 Tratamiento ............................................................................................... 13

2.5.6 Parámetros de medición ........................................................................... 14

2.5.7 Análisis de datos ........................................................................................ 15

III. RESULTADOS ......................................................................................................... 16

IV. DISCUSIÓN .............................................................................................................. 27

V. CONCLUSIONES ...................................................................................................... 31

VI. RECOMENDACIONES .......................................................................................... 32

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 33

VIII. ANEXOS ................................................................................................................ 36

iv

xi

LISTA DE TABLAS

Página

Tabla II-1. Aplicación de tratamientos. 9

Tabla III-2.

Efecto de Bacillus subtilis sobre población de Meloidogyne sp. en

cultivo de Capsicum annuum “ají pimiento piquillo” 17

Tabla III-3.

Análisis de varianza (ANVA) del efecto de Bacillus subtilis, y

“Gallinaza” sobre poblaciones del nematodo Meloidogyne sp. en

cultivo de Capsicum annuum “ají pimiento piquillo” 24

xii

LISTA DE FIGURAS

Página

Fig. 8-1. Fruto de Capsicum annuum. 37

Fig. 8-2. Melidogyne sp. 38

Fig. 8-3. Ciclo de vida de Meloidogyne sp. 39

Fig. 8-4. Bacillus subtilis con tinción de Gram. 40

Fig. 8-5.

Preparación de la parcela, distribución de camas y tendido de mangueras

para sistema de riego tecnificado por goteo. 41

Fig. 8-6. Vista panorámica del fundo Ecoacuícola SAC, Chapairá, Piura. 41

Fig. 2-7. Distribución de tratamientos en la parcela. 13

Fig. 3-8.

Interacción entre agallamiento de la raíz de Capsicum annuum “ají

pimiento piquillo”, “Gallinaza” y concentración de Bacillus subtilis. 18

Fig. 3-9.

Interacción entre agallamiento de raíz de Capsicum annuum “ají pimiento

piquillo”, concentración de Bacillus subtilis y “Gallinaza”. 19

Fig. 3-10.

Interacción entre la altura de planta de Capsicum annuum “ají pimiento

piquillo”, concentración de Bacillus subtilis y “Gallinaza”. 20

Fig. 3-11.

Interacción entre altura de planta de Capsicum annuum “ají pimiento

piquillo”, “Gallinaza” y concentración de Bacillus subtilis. 21

Fig. 3-12.

Interacción entre tamaño de fruto de Capsicum annuum “ají pimiento

piquillo”, “Gallinaza” y concentración de Bacillus subtilis. 22

Fig. 3-13.

Interacción entre tamaño de fruto de Capsicum annuum “ají pimiento

piquillo”, concentración de Bacillus subtilis y “Gallinaza”. 23

Fig. 3-14. Colonias de Bacillus subtilis. 25

xiii

Fig. 3-15.

Esporas de Bacillus subtilis en raíz de Capsicum annum a 1000X (coloración

Gram) 25

Fig. 3-16.

Esporas de Bacillus subtilis adheridas a la cutícula de Meloidogyne sp. J2

(3000X). 26

Fig. 8-17.

Observación de clorosis en las hojas de Capsicum annuum en Fundo

Ecoacuicola SAC, Chapairá, Piura, 2010. 42

Fig. 8-18.

Raíz de Capsicum annuum, con presencia de nódulos (Fundo Ecoacuicola

SAC, Chapairá, Piura, 2010.) 42

Fig. 8-19.

Observación de no evidencia de clorosis en las hojas de Capsicum annuum

en Fundo Ecoacuicola SAC, Chapairá, Piura, 2011. 43

Fig. 8-20.

Inoculación de esporas de Bacillus subtilis en semillas de Capsicum

annuum “ají pimiento piquillo”. 47

Fig. 8-21. Siembra directa de Capsicum annuum “ají pimiento piquillo”. 47

Fig. 8-22. Distribución de Bloques I, II y III. 48

Fig. 8-23. Recalce de Capsicum annuum. 48

Fig. 8-24. Raíz de Capsicum annuum sin nódulos 49

Fig. 8-25. Planta y fruto de Capsicum annuum. 49

Fig. 8-26. Cultivo de Capsicum annuum a los 45 días. 50

Fig. 8-27. Altura de planta de Capsicum annuum a los 65 días. 50

Fig. 8-28. Fruto de Capsicum annuum 51

Fig. 8-29. Cosecha de Capsicum annuum a los 90 días 52

1

I. INTRODUCCIÓN

El cultivo de Capsicum annum “ají pimiento piquillo”, está siendo de gran

importancia comercial en la zona de Chapairá, Piura; sin embargo, requiere de un

manejo especial para alcanzar rendimientos altos y de óptima calidad; en el mes de

marzo (2010), una semana después de la siembra de C. annuum, se observaron

nodulaciones en las raíces, se tomaron muestras de bandeja de plantines transportadas

del vivero Génesis y se enviaron al laboratorio de nematología de la Universidad

Nacional de Piura, para determinar la fuente de infectación temprana; el resultado de

estos análisis fueron positivos para Meloidogyne sp. y otros saprófitos, tanto en raíces

como para el suelo.

Con la presencia de Meloidogyne sp. en las plantas de C. annuum, se observó

clorosis en las hojas, nodulaciones en las raíces, ocasionado disminución en la calidad

y producción de la cosecha, incrementando la aplicación de nematicidas, elevando los

costos de producción en un 40% y provocando con el uso elevado de sustancias

químicas la alteración al ambiente.

Meloidogyne sp. son organismos microscópicos que suelen producir bultos en las

raíces de las plantas, llamados "rosarios" o "porrillas"; producen deformaciones,

necrosis y podredumbre en los órganos vegetales especialmente del sistema radical y,

en el caso de ataques graves, la progresiva reducción de los rendimientos, cuyo efecto

generalmente es aducido al agotamiento de nutrientes del suelo y a una mala nutrición

de la planta. Estos daños impiden la absorción por las raíces, traduciéndose en un

menor desarrollo de la planta y la aparición de síntomas de marchitez en verde en las

horas de más calor, clorosis y enanismo. Se distribuyen por rodales o líneas y se

transmiten con facilidad por el agua de riego, con el calzado…, etc. Sólo especies del

género Meloidogyne atacan al pimiento, produciendo marchitez y enanismo en las

plantas (Incagro, 2009).

2

La duración del ciclo de vida de Meloidogyne sp, nematodo nodulador es altamente

influenciada por la temperatura y otros factores edáficos, se inicia con la formación

de un huevo, seguido de cuatro etapas juveniles y la etapa adulta. Las larvas del

segundo estado o etapa infectiva generalmente penetran la raíz justamente en la punta

o caliptra y se mueven entre las células no diferenciadas, alojándose cerca de los

haces vasculares donde completan su ciclo. Con los estiletes perforan las paredes de

las células alimentándose e inyectando secreciones a la planta. El síntoma más

común producido por la hembra del nematodo nodulador es la formación de

engrosamientos radiculares conocidos como nódulos. Una raíz puede presentar

nódulos pequeños causados por una sola hembra incrustada y/o nódulos grandes

como resultado del ataque de varias hembras en su interior. Una vez infectadas las

raíces, se acortan y se deforman, se reduce el número de raíces laterales y el

desarrollo de pelos radiculares, teniendo como consecuencia que se disminuya la

absorción de agua y nutrientes del suelo. Además, se paraliza el crecimiento general

del sistema radicular, y la planta se debilita (Pérez, 2007).

En investigaciones realizadas por Pérez (2007) en Puerto Rico, se determinó que

densidades poblacionales de Meloidogyne incognita mayores a 12,000 huevos/J2, por

tiesto causaron amarillamiento, defoliación y hasta la muerte de la planta de kenaf

(H. cannabinus), malvácea utilizada en la producción de papel y alimento de ganado.

Las plantas infectadas con Meloidogyne incognita mostraron clorosis en hojas.

Poblaciones de 6,000 huevos/J2 estimadas, redujeron significativamente el peso fresco

del follaje.

Según Jiménez, et al. (2009), reporta investigaciones en Venezuela donde se

registraron que el nematodo Meloidogyne sp. es el más ampliamente distribuido en

los cultivos y es el que causa mayor daño.

En la búsqueda de alternativas de solución, se encuentra a nivel internacional

investigaciones realizada por Rodríguez, et al. (2005) quien planteó que las

3

afectaciones fundamentales atribuidas a Meloidogyne sp. están relacionadas con el

acortamiento del período útil de las plantaciones y mermas en los rendimientos.

Pérez (2007) reportó que en el control de nematodos de la platanera, las poblaciones

máximas de nematodos a partir de las cuales se recomienda tratamientos de control es

1.000 Meloidogyne/100 g de raíz. Aún así, para decidir realizar un tratamiento

químico debe efectuarse un examen del conjunto de la plantación y del desarrollo

radicular, ya que una correcta nutrición y riego y raíces bien desarrolladas soportan

niveles superiores sin provocar daños en la producción. Asimismo, aportes de

materia orgánica al suelo manteniendo niveles superiores al 3% estimulan el

desarrollo radicular y ejercen un efecto de control natural sobre los nematodos.

En la segunda convención internacional en sistemas de producción y fitosanidad de

hortalizas, García (2008), reportó que los plaguicidas químicos provocan persistencia

ambiental, generación de organismos resistentes, contaminación de recursos hídricos

con degradación de flora y fauna y crean ambientes inhabitables en el suelo para otro

tipo de microorganismos que actúan de manera benéfica.

Es importante resaltar que Pérez (2007), afirma que las aplicaciones de nematicidas

químicos son muy tóxicos para el suelo y el ambiente por lo que debe efectuarse sólo

en casos absolutamente necesarios; si la decisión es aplicar productos químicos

recomienda tener en cuenta: Alternar familias químicas, el pH del agua, ya que los

nematicidas se inactivan a pH superiores a 7, no dar más de dos tratamiento al año, a

principios de primavera (marzo-abril) y a finales de otoño (septiembre-octubre), el

sistema de riego para establecer dosis correctas y la solubilidad de los nematicidas ya

que influye en la distribución del producto en el suelo.

El desarrollo y aplicación de agentes de control biológico de plagas adquiere una

importancia relevante como una alternativa en el desarrollo de una agricultura

sostenible que preserve los recursos naturales y el ambiente para las futuras

4

generaciones. La aplicación controlada en agro ecosistemas de organismos vivos o

sus metabolitos para el control de plagas y enfermedades, implica el mejoramiento de

los cultivos, al proteger las plantas del deterioro producido por agentes fitopatógenos

(Gómez, et al., 2002).

El control biológico de nematodos es una de las mejores alternativas para incrementar

los rendimientos, sin causar daño al medio ambiente. Se han realizado algunos

estudios utilizando leguminosas supresoras de nematodos, las cuales en las prácticas

agrícolas además se brindan otros beneficios como: Control de la erosión hídrica

cuando se establecen como cobertoras, estimulación de una microfauna benéfica y el

mejoramiento de la fertilidad del suelo. En Perú, según el manual de buenas prácticas

en el manejo orgánico del cultivo de Sacha inchi (Incagro, 2009), se afirma que la

agricultura orgánica es importante porque contribuye a reducir al mínimo la

contaminación del ambiente, evitando los fertilizantes y plaguicidas sintéticos lo que

propicia un ecosistema sostenible, alimentos seguros, buena nutrición, bienestar

animal y desarrollo rural.

García (2008), afirma que la aplicación de un control natural contra las plagas, tiene

ventajas como: son menos tóxicos que los químicos, por lo general son inocuos,

pueden ayudar a disminuir notablemente el uso de químicos, disminuyen la cantidad

de residuos, son efectivos en pequeñas cantidades, frecuentemente se descomponen

rápido y por lo general afectan solo a la plaga objetivo.

López, et al. (2004) recomienda que para combatir los nematodos en ají pimiento se

debe rotar con otros cultivos, desinfectar la tierra mediante la solarización. La

Solarización consiste en elevar la temperatura del suelo mediante la colocación de

una lámina de plástico transparente sobre el suelo regado previamente en abundancia

durante un mínimo de 30 días en verano. Lo que se hace es "cocer" el suelo y matar

muchos parásitos: hongos, nematodos, insectos, malas hierbas, etc.

5

Los agentes biocontroladores como los organismos que interactúan con los

nematodos fitoparásitos en el suelo deben tener algunas características básicas: No

deben ser patógenos de plantas, hombres o animales, capaz de reducir o suprimir

eficientemente las poblaciones de nematodos por debajo del nivel crítico, capacidad

de adaptación a diferentes ambientes del suelo (textura, grado de humedad,

composición química y materia orgánica), buena habilidad competitiva, alto potencial

de reproducción para obtener una población alta, capacidad de sobrevivir en épocas

difíciles (Piedra, 2008).

Gallegos, et al. (2009). Reporta que las bacterias son un grupo abundante de

microorganismos del suelo sobre los cuales se ha realizado pocos esfuerzos para

determinar su potencial de uso y que las bacterias que presenta un potencial

biocontrolador son Pasteuria penetrans, Bacillus cereus y Bacillus subtilis.

El género Bacillus incluye una importante variedad de especies gram positivas, no

patogénicas, con propiedades antagonistas; son buenas secretoras de proteínas y

metabolitos, fáciles de cultivar y altamente eficientes para el control de plagas y

enfermedades. Los mecanismos de acción de Bacillus sp., incluyen competencia por

espacio y nutrientes, antibiosis e inducción de resistencia. Además, tienen

comprobado efecto en la promoción de crecimiento de las plantas. La capacidad de

Bacillus sp. de formar esporas que sobreviven y permanecen metabolitamente activas

bajo condiciones adversas, las hace apropiadas para la formulación de productos

viables y estables para el control biológico (Chaves, 2007). Para considerar que la

bacteria sea un biocontrolador del nematodo, su ciclo de vida debe desarrollarse en

sincronía con el del nematodo.

B. subtilis, microorganismo cuyo hábitat natural es el suelo, se encuentra

ampliamente distribuido en la naturaleza. Entre sus principales características se

encuentra su capacidad para formar esporas en diversas condiciones de estrés, crecer

en un intervalo amplio de temperaturas (desde 15 hasta 55 ºC), presentar motilidad y

6

velocidades de crecimiento altas, sobrevivir en concentraciones salinas (hasta el 7%

de NaCl), producir una amplia variedad de antibióticos y enzimas hidrolíticas

extracelulares (Nakamura et al., 1999).

Estudios realizados en cultivo de garbanzo Siddiqui, et al. (2001), reportan que;

plantas tratadas con B. subtilis redujeron el agallamiento y multiplicación del

nematodo M. incógnita, dando como resultado crecimiento vegetal mejorado. Este

tratamiento también redujo el índice de putrefacción de la raíz en plantas inoculadas

con M. phaseolina. Las mejoras en crecimiento vegetal pueden ser atribuidos a

efectos inhibitorios de agentes patógenos por B. subtilis. Estudios previos indicaron

que el tratamiento con B. subtilis incrementa la producción en varias cosechas.

Además, la bacteria mejora el crecimiento vegetal, por inhibición del parásito

patógeno de la raíz, produciendo substancias biológicamente activas, o por

transformación inexequible de mineral y de componentes orgánicos disponibles para

la planta. Por otra parte el extracto no celular de B. subtilis, se reporta que también

tiene un alto grado de propiedades larvicidas sobre nudos y quistes nematodos.

De Araujo y Poletto (2009), reportaron que las endotoxinas producidas por B.

subtilis, intervienen con el ciclo reproductivo de nematodos, en el estadío de

ovulación y eclosión de juveniles, considerando a B. subtilis, como supresor del

nematodo formador de agallas en cultivo de tomate.

En Perú, no se ha encontrado investigaciones específicas de control de nematodos por

bacterias en solanáceas, pero Nicho (2005), en investigaciones en cultivo de ají

paprika, realizadas en la estación experimental Donoso-Huaral, recomienda para el

control de Meloidogyne aplicar en la siembra guano de vaca 15 toneladas por

hectárea.

La zona de Chapairá, Piura; los suelos deteriorados por el uso ineficiente de

fertilizantes químicos, ha provocado una disminución en el contenido de materia

7

orgánica y nutrición de los cultivos de C. annum. Alcozer et al. (2006), encontró que

el Meloidogyne sp., está muy diseminado en los suelos agrícolas de los valles de

Piura, siendo el uso de nematicidas químicos la principal medida de control;

buscando otras alternativas evaluó efectos de solarización y enmiendas orgánicas

contra el nematodo del nudo M. incognita bajo condiciones de vivero, determinando

que su población en el substrato solarizado y no solarizado disminuyeron con

respecto a las iniciales.

Aldana (2001) manifiesta que el pimiento es muy exigente en fósforo y nitrógeno;

por lo que recomienda adicionar “gallinaza” antes del transplante. Según Macías

(2012), la aplicación de “gallinaza” al suelo representa una excelente alternativa en la

producción, pues incrementa el rendimiento, precocidad y calidad del fruto. Quezada

(1999) en su investigación en banano evidencia que, la severidad del daño de los

nematodos puede reducirse si se crean condiciones que favorezcan el desarrollo de

enemigos naturales que ya están presentes en el suelo. La adición de “gallinaza”

incrementa sustancialmente la actividad microbial de los suelo, por que proveen de

carbono, energía, y nutrientes para favorecer el crecimiento, actividad y número de

microorganismos.

En este contexto, el objetivo del presente trabajo, fue evaluar el efecto del B. subtilis

y “gallinaza” como agentes supresores del nematodo del nudo Meloidogyne sp, en el

cultivo de C. annuum, para promover la utilización de productos biológicos en la

mejora de la productividad del ají pimiento piquillo, disminuir el uso de productos

químicos, reducir los costos de producción y no provocar daño al ambiente.

8

II. MATERIAL Y MÉTODOS

2.1 MATERIAL DE ESTUDIO

Semillas de Capsicum annuum “ají pimiento piquillo” (Anexo 1) del Fundo

Ecoacuicola SAC, “gallinaza” (85 % de pureza), suelo agrícola infestado por

Meloidogyne sp. (Anexo 2) y cepa nativa Bacillus subtilis (Anexo 3).

2.2. ÁREA DE ESTUDIO

Parcela con siembra directa de C. annuum, en un área total de 0.270 ha, divido en

3 bloques, con microparcelas de 200 m2, conformado por dos camas de 50 m

lineales, con una distancia de cama-surco-cama de 4 m2; aplicación de sistema de

riego tecnificado por goteo; en condiciones climáticas de principios de otoño

(marzo), hasta primavera (octubre). (Anexo 4, fig. 5).

2.2. LUGAR DE ESTUDIO

La investigación se realizó en campos de cultivo de la empresa acua-

agroindustrial Ecoacuícola SAC., ubicado en el caserío de Chapairá, distrito de

Castilla, provincia de Piura, departamento de Piura, a una Latitud de -5.1166 y

una longitud de -80.6333, zona privilegiada por su estupendo clima cálido y

tierras fértiles, idóneas para el cultivo durante los 365 días del año; en campos

provenientes de siembras de Capsicum annuum “ají pimiento piquillo” con

infestación de nematodos. (Anexo 4, fig.6).

2.4 DISEÑO DE EXPERIMENTACIÓN

Se aplicó un arreglo factorial de 2 X 3 en un diseño bloques completos al azar,

DBCA. Como factor 1: sin y con esporas de B. subtillis y el factor 2: sin y con

“gallinaza”. En total se trabajó 9 tratamientos, 3 repeticiones y 27 unidades

muéstrales (Tabla 1).

9

Tabla 1. Aplicación de tratamientos

Factor 1

To = 0 esporas B. subtilis /mL

T1 = 1000000 esporas B. subtilis /mL

T2 = 2000000 esporas B. subtilis /mL

Factor 2

Go = 0 t “Gallinaza”/ha

G1 = 15 t “Gallinaza”/ha

G2 = 30 t “Gallinaza”/ha

2.5 METODOLOGÍA

2.5.1 Preparación del terreno

Según buenas prácticas agrícolas, BPA (sistema EUROGAP).

En la parcela se realizó movimiento de tierra y exposición al sol

(solarización natural).

Luego se incorporó en forma uniforme “gallinaza”, en la dosis de

15 t/ha y 30 t/ha, según distribución de tratamientos (Fig. 7);

inmediatamente se aplicó riego hasta conseguir la humedad de

capacidad de campo.

Tratamiento (T)

“Gallinaza”

0 esporas

B. subtilis/mL

1 000 000 esporas

B. subtilis /mL

2 000 000 esporas

B. subtilis /mL

G To T1 T2

0 t/ha Go To GoT1 GoT2

15 t/ha G1To G1T1 G1T2

30 t/ha G2To G2T1 G2T2

X 2 X3

10

2.5.2 Adquisición del inóculo

2.5.2.1. Aislamiento de Bacillus subtilis

Para el aislamiento de B. subtilis, se seleccionaron raíces de ají

pimiento piquillo con presencia de nódulos y muestra de suelo del

fundo Ecocuicola SAC, infestado con Meloidogyne, siguiendo el

procedimiento siguiente:

1. Lavado y Desinfección:

Las raíces seleccionadas se lavaron con agua corriente hasta

eliminar toda la tierra, luego se desinfectaron con hipoclorito

de sodio al 2%, y se enjuagaron con agua destilada estéril.

2. Extracción de las bacterias.

Las raíces desinfectadas se colocaron en un recipiente estéril

con SSF estéril y con una bagueta estéril fueron trituradas,

luego se dejó sedimentar y se recogió la suspensión en un

recipiente estéril. A partir de este extracto se prepararon

diluciones y se sembró en placas conteniendo Agar Soya

Tripticasa (AST), y se incubó a temperatura ambiental (19 +2

°C) durante 48 horas.

La muestra de suelo fue usada para preparar diluciones

seriadas. Para ello, se pesaron 10 gramos, los que fueron

colocados en una botella con 90 mililitros de agua destilada

estéril (dilución 1/10). La suspensión de suelo fue agitada por

45 minutos. Una vez trascurrido éste tiempo, se prepararon las

diluciones hasta llegar a 1/106; se sembró en placas

conteniendo Agar Soya Tripticasa (AST), y se incubó a

temperatura ambiental (19 +2 °C) durante 48 horas.

11

Una vez transcurrido el tiempo se contó el número de colonias

y se determinó el número de unidades formadoras de colonias

por gramo de muestra (ufc/g) (Fig. 14).

3. Selección de Cultivos

Después del periodo de incubación, se seleccionaron las

colonias con las características de Bacillus y se colorearon

mediante la técnica de Gram (Fig. 15). Los bacilos esporulados

Gram positivos fueron aislados en tubos con agar nutritivo,

para su identificación.

4. Identificación del cultivo

La identificación molecular de los cultivos se llevó a cabo en el

Centro de Bioinnovación de Antofagasta, Universidad de

Antofagasta, Chile, siguiendo la siguiente metodología: Se

purificó el ADN total del aislado microbiano enviado al CBIA,

para ser usado como molde en la amplificación del gen ARNr

16S mediante PCR, luego se separaron las bandas mediante

electroforesis de gel en gradiente denaturante (DGGE) para

verificar la pureza del cultivo previo a la secuenciación. Se

detectaron fragmentos de ADN (bandas) que demostraron la

presencia de microorganismos del dominio Bacteria.

Posteriormente se realizó la amplificación del gen ARNr 16S

por PCR, con primers para el dominio Bacteria que amplifican

un fragmento de aproximadamente 1500 pb, el que fue

posteriormente purificado y secuenciado. El microorganismo se

identificó mediante análisis computacional usando software

Bioinformáticos en tres bases de datos diferentes y se

seleccionó la predicción con mayor precisión (Anexo 7).

12

2.5.3 Estandarización del inóculo

El cultivo identificado fue sembrado en placas con AST y se

incubó a temperatura ambiental (19 +2 °C) durante 48 horas.

En un tubo con agua destilada estéril, se preparó una suspensión de

B. subtilis, del cual se prepararon diluciones semejante al tubo 1 del

nefelómetro de Mac farland, (3 x 108 cel/mL) y se hicieron

diluciones hasta alcanzar una concentración aproximada de 1X106

esp/mL y 2X106

esp/mL. que constituyen la formulación de las

dosis.

Formulación de las dosis.

1000000 y 2000000

esporas B. subtilis /mL.

13

2.5.4 Tratamiento

En la parcela seleccionada con un área total de 0.270 ha, se estableció 27 camas con una distancia de cama-surco-cama de 4 m2,

cada microparcela de 50 m lineales y se realizó siembra directa cada 12.5 cm/línea/1 semilla de C. annuum, previa inoculación

de esporas de B. subtilis mediante inmersión, teniendo en cuenta la distribución de los tratamientos planificados (Fig. 7); luego

se realizó el monitoreo correspondiente.

Fig. 7. Distribución de tratamientos en la parcela.

To = 0 esporas B. subtilis /mL

T1 = 1000000 esporas B. subtilis /mL

T2 = 2000000 esporas B. subtilis /mL

Go = 0 t “Gallinaza”/ha

G1 = 15 t “Gallinaza”/ha

G2 = 30 t “Gallinaza”/ha

BLOQUE I BLOQUE II BLOQUE III

0 Días 0 Días 0 Días

Go To GoT2 GoT2

GoT1 Go To GoT1

GoT2 GoT1 Go To

G1T1 G1T2 G1To

G1T2 G1To G1T1

G1To G1T1 GM1T2

G2T1 G2T2 G2To

G2T2 G2To G2T1

G2To G2T1 G2T2

Siembra directa Capsicum annuum “ají pimiento piquillo”50 m

4 m2

14

2.5.5 Parámetros de medición

2.5.5.1 Poblaciones del nematodo: En cada uno de los tratamientos se

realizaron análisis de suelo para determinar las poblaciones iniciales

del nematodo antes de la aplicación de la bacteria B. subtilis.

Posteriormente se realizaron análisis de la dinámica de poblaciones

del nematodo, a los 45 y 90 días después de la siembra directa y

trasplante.

Se colectó muestras de suelo por cada bloque experimental tomadas

con un barreno de 2,5 cm de diámetro x 20 cm de profundidad. Las

muestras se mezclaron para obtener muestra final de 100 cm3 para

la extracción de nematodos usándose el método de tamizado de

Cobb, filtrándose luego la solución suelo obtenida, con el método

del embudo de Baermann. La cuantificación de poblaciones se

determino utilizándose un microscopio estereoscópico.

2.5.5.2 Índice de Nodulación: Durante la cosecha se seleccionaron

20 plantas al azar por unidad experimental para determinar el índice

de agallamiento sobre raíces, utilizándose la Escala de Zeck (1971).

:INDICE DE NODULACION

GRADO 0

GRADO 1

Sin nódulos

10 %

20 %,

30 %,

40 %,

50 %,

60 %,

70 %,

80 %,

90 %,

100 % del sistema radical agallado

GRADO 2

GRADO 3

GRADO 4

GRADO 5

GRADO 6

GRADO 7

GRADO 8

GRADO 9

GRADO 10

2.5.5.3 Análisis de la producción: Antes de la cosecha se determinó la

altura de planta y el número total de frutos.

15

2.5.5.4 Análisis microbiológico: Presencia de bacteria B. subtilis en raíz de

C. annuum “ají pimiento piquillo”.

2.5.6 Análisis de datos

Los datos poblacionales obtenidos en las mediciones posteriores a la

aplicación de los productos (Pf) se compararon con los obtenidos de muestras

previas (Pi). Se obtuvo la Tasa de Reproducción (TR) que relaciona las

poblaciones finales con las iniciales (Pf/Pi). Los datos de las poblaciones del

nematodo, índices de agallamiento, altura de planta, y número de frutos se

sometieron a un análisis de varianza (ANVA) para un diseño de bloques

completos al azar utilizándose el software Statgraphics Plus 5.0.

16

III. RESULTADOS

A nivel de siembra directa, la poblaciones iniciales de Meloidogyne sp., antes de la

aplicación de los tratamientos variaron entre 342 y 27720 nematodos / 100 cm3 de suelo,

confirmando que los suelos presentaron altos niveles de infestación del nematodo. Después

de la aplicación de la bacteria Bacillus subtilis, la población final registró valores de 13 y 0

nematodos/100 cm3 de suelo; los niveles de población de nematodos disminuyó

considerablemente, con TR de 0.0327 a cero (Tabla 2).

El agallamiento alcanzó valores de 8 a 23 %, con un índice de agallamiento entre el grado 0

y 2, presentando diferencias significativas (P≤0,05) entre los tratamientos (Fig. 8 y 9). La

menor altura de planta registró 20 cm a concentración cero de B. subtilis y “Gallinaza” y

la mayor altura a 32 cm a concentración 2000000 esporas B. subtilis, con 30 t/ha de

“Gallinaza”, la interacción respecto a la concentración de B. subtilis y la dosis de

“Gallinaza” se observa en las figuras 10 y 11. En la interacción concentración de B. subtilis

y “Gallinaza”, el menor tamaño de fruto alcanzó 9 cm a concentración cero de B. subtilis y

“Gallinaza” y el tamaño mayor a 19.5 cm a concentración 1000000 esporas B. subtilis, con

15 t/ha de “Gallinaza”, (Fig. 12 y 13).

El análisis de varianza (P≤0,05) para las poblaciones iniciales y finales de Meloidogyne sp.,

así como para la tasa de reproducción, muestran diferencia significativa entre los

tratamientos aplicados (Tabla 3).

17

Tabla 2. Efecto de Bacillus subtilis sobre Población de Meloidogyne sp. en cultivo de

Capsicum annuum “ají pimiento piquillo”

N° esporas

Bacillus

subtilis/mL)

“Gallinaza”

(tn/ha) Bloque

Meloidogyne sp/100 cm3 de

suelo Agallamiento

(%)

Altura planta

(cm)

Tamaño fruto

(cm) Pob. Inicial Pob. Final TR

0 0 1 647 2 0.0031 23 20 10

0 0 2 647 2 0.0031 21 22 9

0 0 3 647 2 0.0031 21 28 12

0 15 1 2410 9 0.0037 14 25 15

0 15 2 7610 0 0 14 26 16.5

0 15 3 5104 3 0.0006 20 25 19

0 30 1 7443 8 0.0011 21 25 16

0 30 2 20570 13 0.0006 19 30 17.5

0 30 3 342 0 0 20 29 19

1000000 0 1 2410a 9ª 0.0037ª 14ª 25ª 15

1000000 0 2 7610ª 0a 0a 14ª 26ª 16.5

1000000 0 3 5104ª 3ª 0.0006ª 20ª 25ª 19

1000000 15 1 9340ª 5ª 0.0005ª 13ª 27ª 16.5

1000000 15 2 12030ª 1ª 0.0001ª 8ª 27ª 14

1000000 15 3 1200ª 1ª 0.0008ª 17ª 27ª 19.5

1000000 30 1 4540ª 4ª 0.0009ª 11ª 27ª 17

1000000 30 2 581ª 0a 0a 12ª 25 17

1000000 30 3 1879ª 0a 0a 13ª 27 17.5

2000000 0 1 7443ª 8ª 0.0011ª 21ª 25 16

2000000 0 2 20570ª 13ª 0.0006ª 19ª 30 17.5

2000000 0 3 342ª 0a 0a 20ª 29 19

2000000 15 1 1555ª 2ª 0.0013ª 17ª 29 15.5

2000000 15 2 13184ª 3ª 0.0002ª 9ª 29 15.5

2000000 15 3 275ª 9ª 0.0327ª 13ª 31 17.5

2000000 30 1 3124ª 2ª 0.0006ª 16ª 27 16

2000000 30 2 27720ª 2ª 0.0001ª 14ª 32 16.5

2000000 30 3 2875ª 2a 0.0007a 11ª 30 18

18

Fig. 8. Interacción entre agallamiento de raíz de Capsicum annuum “ají pimiento piquillo”, “Gallinaza” y concentración de

Bacillus subtilis.

19

.

Fig.9. Interacción entre agallamiento de raíz de Capsicum annuum “ají pimiento piquillo”, concentración de Bacillus subtilis y

“Gallinaza”.

20

Fig. 10. Interacción entre la altura de planta de Capsicum annuum “ají pimiento piquillo”, concentración de Bacillus subtilis y

“Gallinaza”.

21

Fig. 11. Interacción entre altura de planta de Capsicum annuum “ají pimiento piquillo”, “Gallinaza” y concentración de

Bacillus subtilis.

22

Fig. 12. Interacción entre tamaño de fruto de Capsicum annuum “ají pimiento piquillo”, “Gallinaza” y concentración de

Bacillus subtilis.

23

Fig. 13. Interacción entre tamaño de fruto de Capsicum annuum “ají pimiento piquillo”, concentración de Bacillus subtilis y

“Gallinaza”.

24

Tabla 3. Análisis de varianza (ANVA) del efecto Bacillus subtilis, y “Gallinaza” sobre poblaciones del nematodo Meloidogyne sp.

en cultivo de Capsicum annuum “ají pimiento piquillo”.

POBLACIÓN INICIAL

POBLACIÓN FINAL

Fuente Suma de

cuadrados

GL Cuadrado promedio

Cociente-F P-Valor

Fuente Suma de

cuadrados

GL Cuadrado promedio

Cociente-F P-Valor

A: N° esporas Bacillus subtilis /mL)

7.60E+07 2 3.80E+07 0.67 0.5264

A: N° esporas Bacillus subtilis /mL)

21.6296 2 10.8148 0.64 0.5408

B: “Gallinaza” (t/ha) 3.26E+07 2 1.63E+07 0.29 0.7551

B: “Gallinaza” (t/ha) 3.85185 2 1.92593 0.11 0.8935

INTERACCIONES Suma de cuadrados

GL

Cuadrado Medio

Cociente-F P-Valor

INTERACCIONES Suma de cuadrados

GL

Cuadrado promedio

Cociente-F P-Valor

AB 1.86E+08 4 4.65E+07 0.81 0.533

AB 82.5926 4 20.6481 1.21 0.3391

Totales 1.03E+09 18 5.71E+07

Totales 306 18 17

TR = PF/PI

Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado promedio

Cociente-F P-Valor

A: N° esporas Bacillus subtilis /mL) 0.00005563 2 0.00002781 072 0.5020

B: “Gallinaza” (t/ha) 0.00007487 2 0.00003743 096 0.4002

INTERACCIONES Suma de cuadrados

GL Cuadrado promedio

Cociente-F P-Valor

AB 0.00017422 4 0.00004356 1.12 0.3773

Totales 0.00069912 18 0.00003884

25

Fig. 14. Colonias de Bacillus subtilis.

Fig. 15. Esporas de Bacillus subtilis en raíz de Capsicum annum a 1000X

(coloración Gram).

26

Fig. 16. Esporas de Bacillus subtilis adheridas a la cutícula de Meloidogyne sp. J2 (3000X)

Foto: Murguía, 2011.

27

IV. DISCUSIÓN

En el cultivo de Capsicum annuum, antes a la ejecución de la presente investigación, se

evidenció presencia de clorosis y nodulaciones en las raíces (Anexo 5); una de las causas

que provoca ésta manifestación, es por infestación del nematodo Meloidogyne sp., el cual

es responsable de la formación de nódulos en la raíz e interfiere en la absorción de agua y

nutrientes.

Según Pérez, (2007), las plantas enfermas presentan síntomas típicos tales como: cese del

crecimiento de la planta, proliferación del desarrollo de nódulos en raíces, amarillamiento

en las hojas, defoliación, culminando con la muerte en plantas, etc.

El control (Tabla 2) evidenció una población alta de Meloidogyne sp., luego de un espacio

de seis meses a campo limpio mostró una población baja, posiblemente debido a factores

climáticos de la zona en los meses de octubre a marzo, donde se registraron temperaturas

que oscilaron entre 30 y 48°C a 20 cm de profundidad del suelo, coincidiendo con Alcozer,

et al. (2006), quien reportó en su investigación sobre solarización en suelos agrícolas del

valle de Piura, que en el substrato solarizado las temperaturas promedio a 10 cm de

profundidad superaron los 40 °C y que es posible que el riego aplicado durante el

bioensayo (sin ningún tratamiento) incentivaran la actuación de los antagonistas del nematodo

y que éstos contribuyeran a la reducción de las poblaciones.

La aplicación de esporas de B. subtilis, en la semilla para siembra directa se hizo por

inoculación (Anexo 8), ésta estrategia es una de las más sugeridas para obtener efectividad

en la disminución de poblaciones de Meloidogyne sp., de forma directa; según Gómez, et

al. (2010), indican que éste tipo de estrategia es más eficiente en el control de diversas

poblaciones de Meloidogyne sp., pero requiere de más tiempo para que ocurra la selección

natural, de esta forma las endosporas específicas para una determinada población de

Meloidogyne sp. presente en un área dada, se multiplicaran en su progenie.

28

Después de aplicar la cepa nativa de Bacillus subtilis, se observó ausencia de clorosis,

evidenciando acción supresora en Meloidogyne sp. (Anexo 6).

Los resultados de ésta investigación muestran que el efecto que ejerce la bacteria B. subtilis

sobre la población del nematodo del nudo Meloidogyne sp. (fig. 8, 11 y 12), está

relacionada con la cantidad de esporas inyectadas; esto se hace evidente al aplicar el

tratamiento con 1000000 esporas B. subtilis /mL y “Gallinaza” 30 t/ha y 2000000 esporas

B. subtilis /mL y “Gallinaza” 0 t/ha siendo la efectividad aproximado 99% (Tabla 2).

Según Rojas, et al. (1999), la eficacia de la bacteria depende en gran medida de la cantidad

de esporas existentes en el suelo y de la posibilidad de que éstas se puedan adherir a la

cutícula de los nematodos para poder parasitar generaciones futuras; las esporas se pueden

almacenar en el suelo y raíz seca por periodos largos sin mostrar pérdida aparente de

viabilidad. Solorio (2002) afirma que nematicidas a base de B. subtilis con un mínimo de

esporas de 107 UFC/mL, resulta una buena alternativa para el control de Meloidogyne sp. y

que además fortalece y estimula el crecimiento vegetativo de la planta.

A los 90 días de aplicación de los tratamientos, se estimó la tasa de reproducción,

encontrándose comportamientos similares en los registros de población final del nematodo

Meloidogyne sp., con una tasa de reproducción menor que 1, lo cual indica el control

ejercido por la bacteria B. subtilis; y esto se evidencia en la menor formación de

agallamiento (48% raíces agalladas) (Fig. 8 y 9). Así mismo se encontró que las plantas de

C. annum lograron mayor altura a tratamiento de 2000000 esporas B. subtilis /mL y el

tamaño de fruto tuvo mayor tamaño y uniformidad con los tratamientos de 1000000 y

2000000 esporas B. subtilis /mL (Fig. 10, 11, 12, y 13), (Anexo 8, fig. 27 y 28). Los

resultados obtenidos tienen una similitud con el reporte de Guillén, et al (2006), sobre el

rendimiento de plantas de chile, donde la altura incrementó en un 33% y 24% a los 56 días,

después de inocular cepas de Bacillus sp.; infiere que algunas bacterias de Bacillus, inducen

diferentes mecanismos relacionados con la promoción de crecimiento en las plantas, ya sea

que proporcionen directamente nutrientes, participen en la fijación de nitrógeno, fósforo y

potasio, o bien que las plantas sean capaces de producir hormonas vegetales y sustancias

29

promotoras del crecimiento como el ácido indolacético o por la producción de antibióticos

para la supresión de daños.

La acción de la bacteria también interactúa con algunos factores como tipo de suelo,

temperatura, fertilidad del suelo, edad de la planta, humedad, etc., es decir que la severidad

de los síntomas y el desarrollo de la enfermedad causada por las especies de Meloidogyne

dependen de la respuesta de la planta a la infección, tipo de suelo y condiciones del medio

ambiente. Según Cuervo (2010) la bacteria Bacillus subtilis es un gran controlador

biológico, promueve el desarrollo de las plantas y previene las enfermedades del suelo

causadas por Sclerotium rolfsii, Fusarium sp., Verticillium sp, Sclerotinia sclerotiorum,

Phytophthora capsici, Pythium sp, y el nematodo nodulador de raíces Meloidogyne sp y

Rhizoctonia solani, agente causal de la enfermedad denominada “mal del tallito” del

algodonero.

La “gallinaza” utilizada a 30 t/ha (Tabla 2), (Fig. 9, 10 y 13); ha tenido un efecto positivo al

interactuar con la bacteria B. subtilis, esto se evidenció en los niveles de poblaciones de

Meloidogyne sp en el suelo, los cuales disminuyeron significativamente a los 90 días. Se

conoce que la actividad de las enmiendas orgánicas incorporadas al suelo contra nematodos

parásitos de plantas puede variar con la especie del nematodo, tipo de enmienda y

subproductos, de la época de la aplicación de la enmienda y de las propiedades físicas,

químicas y biológicas del suelo; así el amonio liberado durante la descomposición del

estiércol, tiene acción tóxica contra nematodos parásitos. Según Rodríguez, (1986); Kaplan

y Keen (1993); Esnard et al., (1998), estiércoles de animal (sólidos o líquidos) y mezclas

compostadas de materia animal y vegetal aplicadas en grandes cantidades antes de la

siembra incrementan las poblaciones de microorganismos antagonistas supresores de

nematodos.

La acción de “gallinaza”, ha interactuado en el efecto supresor de B. subtilis contra el

nematodo, favoreciendo el incremento del cultivo de C. annuum, alcanzando una

producción final de 37 t/ha, según Macías (2012), la aplicación de “gallinaza” al suelo

representa una excelente alternativa en la producción, pues incrementa el rendimiento,

30

precocidad y calidad del fruto, y Quezada (1999) en su investigación en banano evidencia

que, la severidad del daño de los nematodos puede reducirse si se crean condiciones que

favorezcan el desarrollo de enemigos naturales que ya están presentes en el suelo y que la

adición de “gallinaza” incrementa sustancialmente la actividad microbial de los suelo, por

que proveen de carbono, energía, y nutrientes para favorecer el crecimiento, actividad y

número de microorganismos.

Llevar a cabo un control biológico de nematodos ha permitido disminuir el uso de

químicos, los cuales no son beneficiosos para el suelo; según el manual de buenas prácticas

en el manejo orgánico del cultivo de Sacha inchik (Incagro, 2009), se afirma que la

agricultura orgánica es importante porque contribuye a reducir al mínimo la contaminación

del ambiente, evitando los fertilizantes y plaguicidas sintéticos lo que propicia un

ecosistema sostenible, alimentos seguros, buena nutrición, bienestar animal y desarrollo

rural. García (2008), afirma que la aplicación de un control natural contra las plagas, tiene

ventajas como: son menos tóxicos que los químicos, por lo general son inocuos, pueden

ayudar a disminuir notablemente el uso de químicos, disminuyen la cantidad de residuos,

son efectivos en pequeñas cantidades, frecuentemente se descomponen rápido y por lo

general afectan solo a la plaga objetivo.

Los resultados observados en el presente estudio (Tabla 2) demuestran que el control por B.

subtilis representa una alternativa natural dentro de un sistema de manejo integrado del

nematodo del nudo Meloidogyne sp., coincidiendo con la investigación de Siddiqui, et al.

(2001) donde se reporta, que; plantas tratadas con B. subtilis redujeron el agallamiento y

multiplicación del nematodo M. incógnita, dando como resultado crecimiento vegetal

mejorado.

La aplicación de varianza para las poblaciones iniciales y finales de Meloidogyne sp., y la

tasa de reproducción, explican la existencia de diferencia significativa (P≤0,05) (Tabla 3);

evidenciando ligeras variaciones, las cuales tendrían relación directa de acuerdo a los

tratamientos aplicados.

31

V. CONCLUSIONES

La cepa nativa de Bacillus subtilis tiene efecto supresor sobre poblaciones de

Meloidogyne sp. en cultivo de Capsicum annuum “ají pimiento piquillo” y la

“Gallinaza” al interactuar con la bacteria posiblemente favoreció la supresión del

nematode.

La acción supresora de Bacillus subtilis en Meloidogyne sp., aportó a un incremento

de la altura de planta de Capsicum annuum entre 20 y 32 cm y tamaño de fruto de

entre 9 a 19.5 cm.

32

VI. RECOMENDACIONES

Para posteriores investigaciones y realizar un control efectivo, se recomienda la

determinación específica del nematodo, determinar la densidad poblacional y repetir

los bioensayos.

Se recomienda motivar hacia la aplicación de programas de manejo integrado de

nematodos, para contribuir a la conservación del ambiente.

Se debe enfatizar en la utilización de bacterias como control biológico de

nematodos, y dejar como última alternativa el control químico.

Se recomienda para el manejo integrado de nematodos, tomar en cuenta el historial

del campo, calidad del agua, tipo de suelo, nutrición.

33

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Dr. Segundo Eloy López Medina Nancy Mercedes Soto Deza Código Nº 2193. C.M. Nº 8011009-01

ASESOR

36

VIII. ANEXOS

37

Anexo 1

DESCRIPCIÓN DE Capsicum annuum

Reino : Plantae

Filo Magnoliophyta

Clase : Magnoliopsida

Subclase : Asteridae

Orden : Solanales

Familia : Solanaceae

Género : Capsicum

Especie : Capsicum annuum

CARACTERÍSTICAS

Color rojo sangre de toro, sabor dulce, con dos caras planas y otras redondeadas a los lados,

finalizando con una punta tipo pico de loro, la cual da origen a su nombre: pimiento

piquillo.

El origen del pimiento se remonta a tiempos preincaicos y se sitúa en América del Sur. En

su primer viaje, Cristóbal Colón llevó al viejo mundo los pimientos americanos. Con el

pasar de los años se desarrollaron distintas variedades de pimientos en España, uno de ellos

es el piquillo; por lo que solemos atribuir su "nacionalidad" a este país, específicamente a la

ciudad de Lodosa, en donde se cultiva de forma artesanal. Entre 1994 y 1996 se importaron

semillas de dicha hortaliza a nuestro país, que fueron sembradas y cosechadas por

empresarios peruanos. Gracias a la cercanía de nuestro país a la línea ecuatorial, a que en la

costa del Perú no existen extremos de temperatura y a que nos encontramos en la zona

tropical del mundo (entre el Trópico de Cáncer y el de Capricornio), el resultado de la

siembra fue un pimiento piquillo con características tan excepcionales que está desplazando

al pimiento piquillo español en España.

Fuente: http://www.comexperu.org.pe.

Fig. 1. Fruto de Capsicum annuum

38

Anexo 2

DESCRIPCIÓN DEL NEMATODO DEL NUDO Meloidogyne sp.

Reyno: Animal

Phylum: Nematoda

Clase: Secernentea

Orden: Tylenchida

Sub orden: Tylenchina

Super familia: Heteroderoidea

Familia: Meloidogynidae

Sub familia: Meloidogyninae

Género: Meloidogyne

Especie: Meloidogyne sp.

Características:

El ciclo de vida de M. incognita, es similar a la de todas las especies de este género, sin

embargo, la tasa de desarrollo depende de la temperatura y del hospedante.

Los huevos son puestos por la hembra en estado de célula simple; estos se encuentran

embebidos en una masa gelatinosa glicoproteínica (matriz), que los protege de la

deshidratación; son ovalados, algunas veces elipsoidales, levemente cóncavos y pueden

medir de 30 a 52 micras de ancho por 67 a 128 micras de largo, la hembra oviposita un

promedio de 500 a 1000 huevos, que breves horas después comienzan el desarrollo hasta

que se observa una larva completamente formada, siendo este el primer estadío larvario;

poco después ocurre la primera muda y se produce el estado de larva infectivo la cual corta

con su estilete la cáscara del huevo para migrar e invadir las raíces justamente sobre la

caliptra de la raíz.

La larva presenta una segunda muda y da lugar a la tercera etapa larvaria, luego ocurre una

tercera muda y se desarrolla una cuarta etapa larvaria, en la cual es posible distinguirlo ya

como individuo macho o hembra. El macho sufre la cuarta y última muda y emerge de la

raíz como un macho adulto vermiforme, el cual vive libremente en el suelo. La hembra de

la cuarta etapa larvaria continúa aumentando de grosor y un poco más de longitud, sufre la

última muda y se desarrolla en una hembra adulta, la cual continúa hinchándose y,

fecundada o no por el macho, forma huevecillos que deposita en una cubierta protectora

(matriz). El ciclo de vida puede concluir al cabo de 3 o 4 semanas, bajo condiciones

ambientales óptimas.

Fig. 2. Melidogyne sp.

Fuente: http://www.plagasyenfermedadesvid.net/2011/10/genero-meloidogyne.html

39

Esta especie, Esta especie, al igual que todas las especies de nematodos, se reproduce

sexualmente, pero cuando las condiciones no son apropiadas o favorables lo hacen

partenogenéticamente (asexual). Produce muchas generaciones durante el ciclo del cultivo,

incrementando su población al final del mismo... Funte: Puedmag Ruano, J. F. y col. (2007).

Anexo 3

Fig. 3. Ciclo de vida de Meloidogyne sp.

40

Anexo 3

DESCRIPCIÓN DE LA BACTERIA Bacillus subtilis

Reino : Bacteria

Filo Firmicutes

Clase : Bacilli

Orden : Bacillales

Familia : Bacilliaceae

Género : Bacillus

Especie : Bacillus subtilis

Características: Es una bacteria Gram positiva, produce endospora las que son termorresistentes y también resiste factores físicos perjudiciales como la desecación la radiación los ácidos y los desinfectantes químicos, produce enzimas hidrofilicas extracelulares que descomponen polisacáridos, ácidos nucleicos permitiendo que el organismo emplee estos productos como fuente de carbono y electrones, producen antibióticos como la bacitricina,polimixina,gramicidina y circulina,fermentan la caseína y el almidón, vive dentro de los limites de 55 a 70ºC. Es un gran controlador biológico, Bacillus subtilis promueve el desarrollo de las plantas y previene las enfermedades del suelo causadas por Sclerotium rolfsii, Fusarium spp., Verticillium spp, Sclerotinia sclerotiorum, Phytophthora capsici, Pythium spp, y el nematodo nodulador de raíces (Meloidogyne spp) y Rhizoctonia solani, agente causal de la enfermedad denominada “mal del tallito” del algodonero. (Calderón et al, .2002).

Fuente: Cuervo Lozada, J. P. (2010).

Fig. 4. Bacillus subtilis con tinción de Gram

41

Anexo 4

ÁREA DE ESTUDIO

UBICACIÓN DEL ESTUDIO

Región, Piura

Valle, medio Piura.

Zona, Santa Ángela

Fundo acua-agroindustrial Ecoacuícola SAC.

Fig. 6. Vista panorámica del fundo Ecoacuicola SAC, Chapairá, Piura.

Fuente: León, 2008

Parcelas de cultivo de pimiento

Fig. 5. Preparación de la parcela, distribución de camas y tendido de

mangueras para sistema de riego tecnificado por goteo.

42

Anexo 5

Fig. 17: Observación de clorosis en las hojas de Capsicum annuum en Fundo Ecoacuicola

SAC – Chapairá – Piura, 2010.

.

Fig. 18. Raíz de Capsicum annuum, con presencia de nódulos

(Fundo Ecoacuicola SAC – Chapairá – Piura, 2010.)

43

Anexo 6

Fig. 19. Observación de no evidencia de clorosis en las hojas de

Capsicum annuum en Fundo Ecoacuicola SAC – Chapairá –

Piura, 2011

44

Anexo 7

45

46

47

Anexo 8

Fig. 20. Inoculación de esporas de Bacillus subtilis, en

semillas de Capsicum annuum “ají pimiento piquillo”.

Fig. 21. Siembra directa de Capsicum annuum “ají pimiento piquillo”.

48

Fig. 23. Recalce de Capsicum annuum

Fig. 22. Distribución de Bloques I, II y III.

49

Fig. 24. Raíz de Capsicum annuum sin nódulos.

Fig. 25. Planta y fruto de Capsicum annuum.

50

Fig. 26. Cultivo de Capsicum annuum a los 45 días.

Fig. 27. Altura de planta de Capsicum annuum a los 65 días.

51

Fig. 28. Fruto de Capsicum annuum

52

Fig. 29. Cosecha de Capsicum annuum a los 90 días.