Tesis Doctorado en Bioquimica Diego Rojas Rivera

UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS

“TMBIM3/GRINA: UN GEN REGULADO POR LA RESPUESTA A PROTEÍNAS MAL PLEGADAS (UPR) QUE INHIBE LA APOPTOSIS MEDIANTE LA MODULACIÓN DE

LA HOMEOSTASIS DEL CALCIO”

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Bioquímica por:

DIEGO ANDRES ROJAS RIVERA

Director de Tesis

Dr. CLAUDIO HETZ

SANTIAGO- CHILE 2012

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UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

INFORME DE APROBACIÓN

TESIS DE DOCTORADO

Se informa a la Dirección de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas que la Tesis de Doctorado presentada por el candidato:

DIEGO ANDRES ROJAS RIVERA

Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para optar al grado de Doctor en bioquímica, en el examen de defensa de Tesis rendido el día _____________________ Directores de Tesis: Dr. Claudio Hetz. ___________________________ Comisión Informante de Tesis: Dr. Andrew Quest (Presidente). ___________________________ Dra. Julieta González. ___________________________ Dr. Juan Olate. ___________________________ Dr. Ariel Orellana ___________________________

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Agradecimientos.

1. Quisiera agradecer en primer lugar a mi familia: Mis papás y mis hermanos.

2. A mi tutor de tesis, el Dr. Claudio Hetz. Por su guía, entusiasmo y compromiso en

la búsqueda de nuevos resultados.

3. A los científicos que pusieron su conocimiento en disposición para abordar desde

distintos tópicos, las preguntas que surgieron en el desarrollo de esta tesis.

Especialmente a:

Dr. Ricardo Armisen (Universidad de Chile).

Ana Luisa Eguiguren (Universidad de Chile).

Dr. Andrés Stutzin (Universidad de Chile).

Dra. Jimena Sierralta (Universidad de Chile).

Dra. Alicia Colombo (Universidad de Chile).

Dr. Rosario Rizzuto (Universita degli studi di Padova).

Dr. Geert Bultynck y Santeri Kiviluoto (Katholieke Universiteit Leuven).

4. A todo el laboratorio de “Estrés Celular y Biomedicina”. Especialmente a Fernanda

Lisbona, Sebastián Zamorano (los “UPR”) y Gabriela Martínez. Además de Pamela

Valdés, Karen Castillo, Vicente Valenzuela y Melissa Calegaro. Todas estas personas

contribuyeron enormemente al trabajo, tanto en el diseño de los experimentos, así como

en la discusión e interpretación de los resultados. Además de su apoyo, compañía,

motivación y amistad.

5. A mis amigos que fueron un apoyo en todo momento. Especialmente a: Dra. Paula

Rodas, Dr. Ariel Contreras, Barbra Toro, Dr. Fabian Jaña, Alexis Ahumada, Carlos Basulto

y Carlos Olivares.

4

6. A Cecilia Zúñiga por su ayuda técnica en el citómetro de flujo, a Fabian y Pablo por

su ayuda técnica en los experimentos con Drosophila melanogaster y Alvaro Díaz en los

experimentos con pez zebra.

5

Financiamiento.

Esta tesis de doctorado fue realizada en el laboratorio de “Estrés Celular y Biomedicina”,

perteneciente a:

1) Instituto de Ciencias Biomédicas. Facultad de Medicina. Universidad de Chile.

2) Centro FONDAP de Estudios Moleculares de la Célula. Facultad de Medicina.

Universidad de Chile.

3) Instituto Milenio de Morfogénesis Neural (NEMO). Facultad de Medicina. Universidad

de Chile.

Además, conto con el siguiente financiamiento:

1) Proyecto FONDAP 15010006 (a CH, AS y RA).

2) Beca para la realización de doctorado en Chile CONICYT 2007-2011 (D.R.R.).

3) Beca MECESUP para la realización de pasantía en el extranjero 2010 (D.R.R.).

4) Beca de apoyo para la realización de tesis doctoral CONICYT 2009 y 2010 (D.R.R.).

5) Beca CONICYT de asistencia a congreso internacional 2010 (D.R.R.)

6) Beca “Keystone Symposium”, por trabajo destacado en presentación paneles 2010

(D.R.R).

7) Proyecto FONDECYT 11090324 (A.C)

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Actividades y material de difusión:

1) Publicaciones:

• Rojas-Rivera D, Armisén R, Colombo A, Eguiguren AL, Martínez G, Díaz A,

Kiviluoto S, Rodríguez D, Patron M, Rizzuto R, Bultynck G, Concha ML, Sierralta J,

Stutzin A, Hetz C. TMBIM3/GRINA is a novel Unfolded Protein Response (UPR)

target gene that controls apoptosis through the modulation of ER calcium homeostasis. Cell death and differentiation. En prensa.

• Rodriguez D, Zamorano S, Lisbona F, Rojas-Rivera D, Arminsen R, Cubillos-Ruiz

JR, Cheng E, Letek M, Vaisar T, Henriquez DR, Irrazabal T, Heinecke JW,

Gonzalez-Billault C, Gupta S, Letai A, Pimentel-Muiños FX, Samali A, Kroemer G,

Hetz C. BH3-only proteins control the sustained signaling of the Unfolded

Protein Response sensor IRE1α . EMBO Journal. En prensa.

• Castillo K, Rojas-Rivera D, Lisbona F, Caballero B, Nassif M, Court F, Schuck S,

IbarC, Walter P, Sierralta J, Glavic A, Hetz C. BAX inhibitor-1 regulates

autophagy by controlling the IRE1α : branch of the unfolded protein response

EMBO Journal, 30 (21): 4465-4478, 2010.

• Rodríguez D, Rojas-Rivera D, Hetz C. Integrating stress signals at the

endoplasmic reticulum: The BCL-2 protein family rheostat. Biochim Biophys

Acta, 1813 (4): 564-574, 2010.

• Rojas-Rivera D, Benjamin Caballero, Sebastian Zamorano, Fernanda Lisbona and

Claudio Hetz; Alternative functions of the BCL-2 protein family at the

endoplasmic reticulum; The BCL-2 protein Family: From mechanisms to biomedical. Adv Exp Med Biol, 687: 33-47, 2010.

• Lisbona F, Rojas-Rivera D, Thielen P, Zamorano S, Todd D, Martinon F, Glavic A,

Kress C, Lin JH, Walter P, Reed JC, Glimcher LH, Hetz C. BAX Inhibitor-1 Is a Negative Regulator of the ER Stress Sensor IRE1. Mol Cell, 33: 679-691, 2009.

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2) Presentaciones a congresos internacionales:



Stutzin A, Hetz C. TMBIM3/GRINA is a conserved Unfolded Protein Response

(UPR) target gene that controls apoptosis through the modulation of ER

calcium homeostasis. Metabolism and Cancer. American Association for Cancer

Research. Sheraton Inner Harbor Hotel, Baltimore, Estados Unidos. 2011

• Rojas-Rivera D, Peter Thielen, Fernanda Lisbona, Alexis Martínez, Sebastián

Zamorano, Melissa Calegaro, Jimena Sierralta, Sergio Lavandero and Claudio

Hetz. TMBIM3: A new and conserved member of the Bax-inhibitor-1 family

that regulates ER stress-mediated apoptosis. Cell Death Pathways: Apoptosis,

Autophagy and Necrosis (X3). Keystone Symposium. Vancouver, British Columbia,

Canadá. 2010

• Lisbona F, Rojas-Rivera D, Zamorano S, Thielen P, Walter P, Reed JC, Glimcher

LH y Hetz C. BAX Inhibitor-1 is a negative regulator of the ER stress sensor

IRE1 and is a component of the UPRosome: A new function beyond apoptosis. Protein in Growth, Development & Disease. Estados Unidos. 2009

• Lisbona F, Rojas-Rivera D, Zamorano S, Thielen P, Walter P, Reed JC, Glimcher

LH y Hetz C. BI-1 is a negative regulador of IRE1. Cell Death Pathways, Whistler

Conference Centre, Whistler, British Columbia. Estados Unidos. 2009.

• Lisbona F, Rojas-Rivera D, Thielen P, Kress C, Reed J, Walter P, Glimcher L,

Hetz C. Bax-inhibitor 1 is a negative regulator of the ER stress sensor IRE1: a

new functions beyond apoptosis. Gordon conference: Molecules that specify the

variety of cell death mechanisms. Italia. 2007.

3) Presentación en congresos nacionales:



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Stutzin A, Hetz C. TMBIM3/GRINA is conserved unfolded protein response (UPR)

target gene that controls apoptosis through the modulation of ER Calcium

homeostasis. XXV Reunión Anual de la Sociedad de Biología Celular de Chile.

Gran Hotel Pucón, Chile, Noviembre.

• G Martínez, D Rojas-Rivera, A Colombo, F Lisbona, M Concha and C Hetz. A new

animal model of ER stress: Zebrafish UPR. Gabriela Martínez, Institute of

Biomedical Sciences, FONDAP Center for Molecular Studies of the Cell,

Millennium Nucleus for Neural Morphogenesis, U. of Chile, Santiago, Chile. XXIV

Reunión Anual de la Sociedad de Biología Celular de Chile. Gran Hotel Pucón,

Chile, Noviembre.

• Rojas-Rivera D, Armisen R, Eguiguren AL, Martínez G, Colombo A, Stutzin A,

Patron M, Rizzuto R, Sierralta J, Concha M, and Hetz C. TMBIM3: An ancestral

regulator of apoptosis that controls ER calcium. homeostasis. Fondap Center for

Molecular Studies of the Cell, Millennium Nucleus for Neural Morphogenesis,

ICBM, U. de Chile, and U. of Padova. XXIV Reunión Anual de la Sociedad de

Biología Celular de Chile. Gran Hotel Pucón, Chile, Noviembre.

• Diego Rojas-Rivera. "Reguladores ancestrales de la apoptosis: El mundo pre-

familia BCL-2". Reunión anual del Centro FONDAP de Estudios Moleculares de la

Célula. San Bernardo. Santiago.

• K Castillo, D. Rojas-Rivera, B. Caballero, F. Lisbona, A. Glávic, and C. Hetz.The

ER located protein Bax-inhibitor 1 (Bi-1) regulates autophagy (La proteína

inhibidora de Bax (BI-1) del RE regula la autofagia). XXII Reunión Anual de la

Sociedad de Biología Celular de Chile. Gran Hotel Pucón, Chile, Noviembre.

• Diego Rojas-Rivera, Peter Thielen, Alexis Martínez, Ricardo Armisen, Jimena

Sierralta, Sergio Lavandero and Claudio Hetz. GRINA: A new and conserved

member of the Bax-inhibitor-1 family that regulates ER stress mediated apoptosis.

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XXII Reunión Anual de la Sociedad de Biología Celular de Chile. Gran Hotel

Pucón, Chile, Noviembre.

• Fernanda Lisbona, Diego Rojas-Rivera, Sebastián Zamorano, Alvaro Glavic, and

Claudio Hetz. BAX Inhibitor-1 regulates the inactivation phase of the Unfolded

Protein Response (Bax Inhibitor-I regula la fase de inactivación de la respuesta a

proteínas mal plegadas) XXII Reunión Anual de la Sociedad de Biología Celular de

Chile. Gran Hotel Pucón, Chile.

• Rojas-Rivera D, Lisbona F, Zamorano S, Hetz C. GRINA: a new and conserved

anti-apoptotic protein located at the endoplasmatic reticulum. XXI Reunión Anual

de la Sociedad de Biología Celular de Chile. Gran Hotel Pucón, Chile.

• Lisbona F, Rojas-Rivera D, Glavic A, Walter P, Reed J, Thielen P, Glimcher L,

Hetz C. A new component of the UPRsome: Bax Inhibitor-1 is a negative regulator

of the ER stress sensor IRE1alpha. XXI Reunión Anual de la Sociedad de Biología

Celular de Chile. Gran Hotel Pucón, Chile.

• Rojas-Rivera D, Díaz-Elizondo J, Salas D, Chiong M, Lavandero S. “ERK1/2 on

the protection of cardiac myocyte to hyposmotic stress”. Centro FONDAP Estudios

Moleculares de la Célula, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas y

Medicina. Universidad de Chile 8389100. XX Reunión Anual de la Sociedad de

Biología Celular de Chile. Gran Hotel Pucón, Chile.

• Lisbona F, Rojas-Rivera D, Matus S, Stanley Korsmeyer, Glimcher L, Hetz C.

Regulation of the unfolded protein response and organelle physiology by

components of the apoptosis machinery. XX Reunión Anual de la Sociedad de

Biología Celular de Chile. Gran Hotel Pucón, Chile.

4) Pasantías Internacionales:

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Estudios del efecto de la expresión de TMBIM3 en el contenido de Calcio en el Retículo

Endoplasmático. Laboratorio de Rosario Rizzuto, Universidad de Padova, Veneto, Italia.

Beca MECESUP, Doctorado en Bioquímica, Universidad de Chile. Junio-Julio 2010.

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1. Índice General.

2) Índice de Figuras. ...................................................................................................... 13 3) Abreviaciones. ........................................................................................................... 16 4) Resumen. ................................................................................................................... 22 5) Summary .................................................................................................................... 16 6) Introducción. .............................................................................................................. 24 6.1) El Retículo Endoplasmático. .................................................................................. 24 6.2) El estrés de RE. ....................................................................................................... 24 6.3) La UPR. ..................................................................................................................... 25 6.4) La apoptosis ............................................................................................................ 29 6.5) La Familia BCL-2 ..................................................................................................... 30 6.6) La Apoptosis y la UPR ............................................................................................ 31 6.7) TMBIM6/BI-1 ............................................................................................................. 34 6.8) TMBIM6/BI-1 y el estrés de RE. .............................................................................. 35 6.9) Las proteínas de la familia TMBIM: nuevos reguladores de la muerte celular? 37 7) Hipótesis .................................................................................................................... 42 8) Objetivo General ........................................................................................................ 42 9) Objetivos específicos: .............................................................................................. 42 10) Materiales y Métodos ............................................................................................ 43 11) Resultados ............................................................................................................. 54 11.1) TMBIM3 y el control de la apoptosis ................................................................ 54

11.1.1) Sobreexpresión de TMBIM3 y muerte celular inducida por estrés de RE. ..... 54 11.1.2) Efecto de la deficiencia de TMBIM3 y TMBIM6 en la viabilidad celular. ......... 59 11.1.3) Efecto de la deficiencia de TMBIM3 en la muerte celular inducida por distintos estímulos de estrés. .................................................................................................... 61

11.2) TMBIM3 y su regulación transcripcional ............................................................ 65 11.2.1) Regulación de la expresión de TMBIM3 bajo condiciones de estrés de RE. .. 65 11.2.2) Regulación de la expresión de tmbim3 inducida por estrés de RE in vivo. .... 70

11.3) TMBIM3 y el control de la homeostasis del Ca2+ ................................................ 73 11.3.1) La expresión de TMBIM3 controla la homeostasis del calcio del RE. ............ 73 11.3.2) La sobreexpresión de TMBIM3 protege frente a la muerte celular inducida por sobrecarga de Ca2+. .................................................................................................... 76 11.3.3) La sobreexpresión de TMBIM3 no altera los niveles de Ca2+ RE ni la expresión de diferentes chaperonas en el RE. ........................................................... 77 11.3.4) TMBIM3 interactúa con IP3-R y modula su actividad. .................................... 80 11.3.5) Efecto de la liberación de Ca2+ desde el RE en la muerte inducida por estrés de RE .......................................................................................................................... 82 11.3.6) Efecto del Ca2+ en la inhibición de la apoptosis mediada por TMBIM3 .......... 83

11.4) Rol de TMBIM3 in vivo .......................................................................................... 85 11.4.1) TMBIM3 y TMBIM6 tienen actividades antiapoptoticas sinérgicas in vivo en un modelo de ER estrés en Drosophila melanogaster. .................................................... 85 11.4.2) Expresión de tmbim3 en pez zebra y tejidos de ratón. ................................... 90

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11.4.3) Deficiencia de tmbim3 incrementa la apoptosis durante el desarrollo del pez zebra. .......................................................................................................................... 92 11.4.4) Generación de un modelo de estrés de RE en pez zebra in vivo. .................. 98 11.4.5) TMBIM3 protege del estrés de RE en pez zebra in vivo. ................................ 98

12) Discusión. ............................................................................................................. 101 12.1) TMBIM3 es parte de una familia conservada de proteínas con actividad anti-apoptotica: el mundo pre-bcl2. .................................................................................. 101 12.2) Regulación del tmbim3, uno nuevo blanco de la UPR ................................... 106 12.3) Regulación del Ca2+ mediada por tmbim3, el vínculo con el control de la apoptosis inducida por estrés de RE. ....................................................................... 107 12.4) TMBIM3 y TMBIM6: compañeros en el control de la muerte celular. ........... 109 12.5) TMBIM3 y su función en el sistema nervioso. ................................................ 110 12.6) TMBIM3: un nuevo blanco conservado de la UPR que inhibe la apoptosis inducida por estrés de RE mediante el control de la homeostasis del Ca2+. ........ 112

13) Conclusiones. ...................................................................................................... 115 14) Bibliografía. .......................................................................................................... 115

13

2. Índice de Figuras.

Figura1: La Respuesta a Proteínas mal Plegadas. ...................................................... 28

Figura 2: Apoptosis inducida por estrés de RE. ........................................................... 34

Figura 3: Proteínas de la familia TMBIM. ..................................................................... 38

Figura 4: TMBIM3/GRINA es una proteína conservada. .............................................. 40

Figura 5: Sistema de cruzas para obtención de moscas iRNA. ................................... 50

Figura 6: Localización sub-celular de TMBIM3 en el RE y aparato de Golgi. .............. 55

Figura 7: Expresión estable de TMBIM3 en células MEFs. .......................................... 55

Figura 8: Efecto de la sobreexpresión de TMBIM3 en la muerte celular inducida por diferentes tipos de estrés celular. ................................................................................. 56

Figura 9: Efecto de la sobreexpresión de TMBIM3 en la apoptosis inducida por estrés de RE.. .......................................................................................................................... 57

Figura 10. Figura 10. Efecto de la sobreexpresión de TMBIM3 en la sobrevida bajo condiciones de estrés de RE. ....................................................................................... 58

Figura 11. Efecto de la sobreexpresión de TMBIM3-MYC en la proliferación celular. . 58

Figura 12: Generación de células “knock down” para tmbim3. .................................... 59

Figura 13: La disminución de los niveles de tmbim3 y su efecto en la muerte celular. 60

Figura 14: Efecto de la doble deficiencia de TMBIM3 y TMBIM6 en la apoptosis espontánea en células MEFs. ...................................................................................... 61

Figura 15: Efecto de la deficiencia de TMBIM3 y/o TMBIM6 en la muerte celular inducida por estrés de RE.. .......................................................................................... 62

Figura 16: Efecto de la disminución de tmbim3 en los niveles de muerte de células MEFs expuestas a estímulos que inducen apoptosis.. ................................................. 63

Figura 17: Efecto de la sobreexpresión de TMBIM3-MYC en células TMBIM6 KO y muerte celular inducida por estrés de RE. .................................................................... 63

Figura 18. Estudio de la posible formación de un complejo proteico entre TMBIM3-MYC y TMBIM6-HA forman un complejo. ..................................................................... 64

Figura 19: Cambios en los niveles de el ARNm de tmbim3 en condiciones de estrés de RE en células MEFs. .................................................................................................... 65

Figura 20: Efecto de la deficiencia del sensor de estrés de RE PERK en el incremento del ARNm de tmbim3 inducido por estrés de RE.. ....................................................... 66

Figura 21: Niveles de los blancos transcripcionales de la UPR en las células PERK WT y KO expuestas a estrés de RE.. .................................................................................. 67

Figura 22: Re-expresión de IRE1α en células deficientes para IRE1α.. ...................... 68

14

Figura 23: Efecto de la expresión del sensor de estrés IRE1α en la regulación del ARNm de tmbim3 bajo condiciones de estrés de RE.. ................................................. 68

Figura 24: Efecto de la deficiencia de PERK en la viabilidad de las células expuestas a estrés de RE. ................................................................................................................ 69

Figura 25: Efecto de la sobreexpresión de TMBIM3 en marcadores de la UPR.. ........ 70

Figura 26: Estudio de los niveles de ARNm de tmbim3 en riñones de ratones expuestos a estrés de RE in vivo.. ............................................................................... 71

Figura 27: ATF4 y el control de la expresión de tmbim3 en respuesta a estrés de RE in vivo. .............................................................................................................................. 72

Figura 28: TMBIM3-MYC y la regulación de la homeostasis del Ca2+. ......................... 74

Figura 29: Efecto TMBIM3-MYC en la salida de Ca2+ desde el RE inducida por la inhibición de la bomba SERCA.. ................................................................................... 75

Figura 30: Efecto de la deficiencia de TMBIM3 en la salida de Ca2+ desde el RE. ...... 75

Figura 31: La sobreexpresión TMBIM3 disminuye la muerte por sobre-carga de Ca2+. ...................................................................................................................................... 76

Figura 32: Determinación del contenido de Ca2+ del RE. ............................................. 77

Figura 33: Efecto de la sobreexpresión de TMBIM3 en el contenido de Ca2+ en el RE. ...................................................................................................................................... 78

Figura 34: Efecto de la sobreexpresión de TMBIM3 en los niveles de expresión de diferentes proteínas residentes del RE.. ....................................................................... 79

Figura 35: Efecto de la sobreexpresión de TMBIM-MYC en la liberación de Ca2+ desdedesde el RE inducida por IP3 ……….………………………………………………81

Figura 36: Co-inmunoprecipitación de TMBIM3-MYC con IP3-R y BCL-2. .................. 81

Figura 37: La expresión de TMBIM3 no genera un cambio en la expresión de algunas proteínas involucradas en el control del Ca2+ RE.. ....................................................... 82

Figura 38: El estrés de RE y su efecto en los niveles de Ca2+ en el RE. ..................... 83

Figura 39: Efecto del Ca+2 en la muerte inducida por estrés de RE. ............................ 83

Figura 40: Papel del Ca2+ en el control de la apoptosis ejercida por TMBIM3.. ........... 84

Figura 41: Generación de un modelo deficiente en tmbim3 y tmbim6 en Drosophila melanogaster. ............................................................................................................... 85

Figura 42: Efecto de la deficiencia de dTmbim3 y dTmbim6 en la generación de moscas adultas.. ........................................................................................................... 86

Figura 43: La deficiencia de tmbim3 y tmbim3 y su efecto en la apoptosis espontánea y en respuesta a Tm en Drosophila melanogaster.. ..................................................... 87

Figura 44: Efecto de la deficiencia de dTmbim3 y dTmbim6 en la generación de moscas adultas a partir de larvas crecidas en presencia o ausencia de Tm.. ............. 89

Figura 45: Expresión de z-Tmbim3 en distintos estados de desarrollo del pez zebra. 90

15

Figura 46: Perfil de expresión de z-tmbim3 en el desarrollo de pez zebra.. ................ 90

Figura 47: Patrón de expresión de zTmbim3 en pez zebra.. ........................................ 91

Figura 48: Expresión de tmbim3 en tejidos de ratón. . ................................................ 92

Figura 49: Efecto de la deficiencia de z-tmbim3 en la muerte celular durante el desarrollo del pez zebra. .............................................................................................. 93

Figura 50: Cuantificación de la tinción con naranjo de acridina en la médula espinal de los peces zebra inyectados con morfolino destinado contra zTmbim3. ....................... 94

Figura 51: Cuantificación de los niveles de caspasa 3 activada en la medula espinal de embriones de pez zebra inyectados z-Tmbim3-MO.. ................................................... 95

Figura 52: Efecto de la deficiencia de tmbim3 en pez zebra y la generación de individuos normales. ..................................................................................................... 95

Figura 53: Deficiencia de Tmbim3 y la formación de estructuras cerebrales en pez zebra.. ........................................................................................................................... 96

Figura 54. Sobreexpresión de m-tmbim3 y la letalidad inducida por z-Tmbim3-MO en pez zebra. ..................................................................................................................... 97

Figura 55: UPR en peza zebra. .................................................................................... 98

Figura 56: Analisis de la expresión de m-Tmbim3 en pez zebra. ................................. 99

Figura 57: tmbim3 y el control de la muerte celular inducida por Tg en pez zebra in vivo.. ............................................................................................................................. 99

Figura 58: tmbim3 y el control de la muerte celular inducida por Tg en pez zebra in vivo. ............................................................................................................................ 100

Figura 59: Modelo propuesto: TMBIM3 es un blanco de la UPR que controla la apoptosis mediante la inhibición del receptor de IP3. ................................................ 113

16

3) Abreviaciones.

2-APB: Inhibidor farmacológico del receptor de IP3

ADN: Ácido desoxiribonucleico.

AIF: Apoptotic Inducing Factor.

APAF1: Apoptotic Protease Activating Factor 1.

ARNm: Ácido Ribonucleico mensajero.

ASK1: Apoptosis signal-regulating kinase 1

ATF4: Activating Transcription Factor 4.

ATF6: Activating Transcription Factor 6.

ATF6f: fragmento de ATF6.

ATP: Adenosín trifosfato.

BCL-2: B-cell lymphoma 2 protein.

BH3: BCL-2 homology domain 3.

BH4: BCL-2 homology domain 4.

BIP: Immunoglobulin-Binding Protein.

BI-1: Bax Inhibitor 1 protein.

CaMKII: Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II.

CHOP: C/EBP-homologous protein.

DIABLO: Direct IAP-binding protein with low PI.

DIG: digoxigenin-UTP

dIRE1α: IRE1α expresado en Drosophila melanogaster.

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D.mel: Drosophila melanogaster (mosca).

D.rerio: Danio rerio (pez zebra).

dTMBIM6: TMBIM6 expresado en Drosophila melanogaster.

dTMBIM3: TMBIM3 expresado en Drosophila melanogaster.

eIf2α: eukaryotic translation initiation factor α 2.

ERAD: Endoplasmic Reticulum associated degradation.

ERO1: ER oxidase 1.

Est: Estaurosporina

Eto: Etopósido.

GAAP: Golgi Anti-Apoptotic Proteín

GADD34: growth arrest and DNA damage-inducible protein-34.

GBP: Glutamate binding protein.

GFP: Proteína Fluorescente verde, del inglés Green fluorescent protein.

GHITM: Growth-Hormone Inducible Transmembrane Protein.

GRINA: Glutamate Receptor, Ionotropic, N-methyl D-asparate-Associated protein 1.

HA: Péptido señal Human influenza hemagglutinin.

hpf: horas pos-fertilización.

hTMBIM6: Proteína TMBIM6 expresada en humano.

hTMBIM3: Proteína TMBIM3 expresada en humano.

IP3: inositol 1,4,5-trifosfato.

IP3-R1: Isoforma 1 del receptor de IP3.

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IP3-R3: Isoforma 3 del receptor de IP3.

IRE1: Inositol requering protein-1.

JNK: Stress-activated protein kinases SAPK/Jun N-terminal kinases.

KO: knock out.

LFG: Lifeguard.

MEFs: Células embrionarias de fibroblasto, del inglés Mice embrionary fibroblast.

Mis-MO: Morfolino en sentido inverso.

MYC: Péptido señal derivado del producto génico del gen c-myc.

M. mus: Mus musculus.

mTmbim3: gen de ratón que codifica para TMBIM3.

PBS: Solución tampón de fosfato.

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa.

PDI: Protein disulfide isomerase.

PERK: Protein kinase RNA (PKR)-like ER kinase.

PFA: Paraformaldehido.

PI: Ioduro de propidio.

qPCR: PCR cuantitativo.

RE: Retículo endoplasmático.

RECS1: Responsive to Centrifugal force and Shear tress gene 1.

r.p.m.: Revoluciones por minuto.

ROI: Región de interés.

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SERCA: bomba Ca2+/ATPasa.

shARN: ARN pequeño tipo horquilla, del inglés short hairping.

SMAC: Second Mitochondria-derived Activator of Caspases.

SP1: Site 1 protease.

SP2: Site 2 protease.

TEGT: Testis enhanced gene transcript.

Tg: Tapsigarguina.

Tm: Tunicamicina.

TMBIM: TransMembrane Bax-Inhibitor 1 Motive.

TNF: Tumour necrosis factor.

TRAF2: TNF receptor-associated factor 2.

UPR: Respuesta a proteínas mal plegadas por sus siglas en inglés Unfolded protein

response.

WT: Wild Type.

xbp-1: x-box binding protein-1.

XBP-1s: Proteína XBP-s, traducida a partir del ARNm procesado de xbp-1, s del inglés

splicing.

z-Tmbim3: ARNm de TMBIM3 expresado en pez zebra.

zTmbim3-MO: Morfolino destinado contra z-Tmbim3.

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4) Resumen.

La familia de proteínas TMBIM (del inglés TransMembrane Bax-Inhibitor 1 Motive)

es altamente conservada y ha sido pobremente caracterizada. Los genes de la familia

TMBIM están presente en mamíferos, insectos, plantas y virus y no presentan

homología aparente con los miembros de la familia BCL-2, los cuales clásicamente

han sido reconocidos como los reguladores maestros de la muerte celular

programada. Al igual que para los miembros de la familia BCL-2, para algunos

miembros de la familia TMBIM ha sido descrito que presentan actividad antiapoptótica

y la capacidad de modificar la homeostasis del Ca2+. El miembro más estudiado de la

familia TMBIM es TMBIM6/BI-1. Esta proteína puede inhibir la muerte celular bajo

condiciones de estrés de RE, el cual es una condición inducida por la acumulación de

proteínas mal plegadas en el interior del RE. El miembro de la familia TMBIM menos

estudiado es TMBIM3/GRINA y existen antecedentes de que se expresa

principalmente en el sistema nervioso central. Sin embargo, se desconoce si comparte

alguna de las actividades descritas para los miembros de la familia TMBIM.

En esta tesis, se propuso estudiar el papel de TMBIM3/GRINA en la muerte

inducida por estrés de RE. La hipótesis propuesta fue determinar si TMBIM3/GRINA

puede inhibir la muerte celular inducida por estrés de RE mediante un mecanismo

dependiente del control de la homeostasis del Ca2+.

Los resultados obtenidos muestran que TMBIM3 inhibe la muerte celular inducida

por estrés de RE y la apoptosis mediada por sobrecarga de Ca2+, sin afectar la muerte

celular inducida por estímulos intrínsecos de apoptosis. La disminución de la

expresión de TMBIM3 en células deficientes en TMBIM6 indujo apoptosis espontánea,

lo cual podría sugerir actividades antiapoptóticas complementarias. Los niveles del

21

ARNm de tmbim3 son altamente incrementados bajo condiciones de estrés de RE,

tanto en modelos celulares, como en modelos animales. Esta regulación de los niveles

del ARNm de tmbim3 son controlados por la vía de PERK/ATF4, la cual es activada

bajo condiciones de estrés de RE.

Además, TMBIM3 controla la homeostasis del Ca2 e interactúa físicamente con el

receptor de IP3, lo cual podría explicar su actividad antiapoptótica bajo condiciones de

estrés de RE.

Estudios de pérdida de función en D. melanogaster revelaron que TMBIM3 y

TMBIM6 tienen actividades sinérgicas respecto a la protección frente a estrés de RE.

De manera similar, la deficiencia de TMBIM3 en embriones de pez zebra generó

apoptosis espontánea durante el desarrollo y drásticas alteraciones en la morfología

del cerebro y la viabilidad neuronal. Además, la sobreexpresión de TMBIM3 protegió a

los embriones de pez zebra en condiciones experimentales de estrés de RE.

Todos estos resultados permiten establecer un rol crítico de TMBIM3 en el control

de la apoptosis inducida por estrés de RE, lo cual sugiere la existencia de un grupo

conservado de reguladores funcionales de la muerte celular, más allá de la familia de

proteínas BCL-2.

22

5) Summary.

The TMBIM proteins family is a highly conserved group of proteins that are poorly

characterized. The TMBIM genes are present in mammals, insects, plants and viruses

and have no apparent homology with members of the BCL-2 family, which have

classically been recognized as the master regulators of programmed cell death.

Similarly to members of BCL-2 family, some TMBIM family members have anti-

apoptotic activity and the ability to alter Ca2+ homeostasis. The most studied member

of the TMBIM family is TMBIM6. This protein can inhibit cell death under conditions of

ER stress, which is induced by the accumulation of misfolded proteins within the ER.

The TMBIM family member that is less studied is TMBIM3/GRINA and it is expressed

mainly in the central nervous system. However, it is unknown if it shares some of the

activities described for other TMBIM family members.

In this thesis, we studied the role of TMBIM3/GRINA in cell death induced by ER

stress. The hypothesis proposed was that TMBIM3/GRINA inhibits cell death induced

by ER stress through a mechanism dependent of homeostasis-Ca2+ controls.

The results obtained showed that TMBIM3 inhibits cell death induced by ER stress

and apoptosis mediated by overload of Ca2+, without affecting the cell death induced

by other intrinsic apoptosis stimuli. Knock down of TMBIM3 in TMBIM6 deficient cells

induced spontaneous apoptosis, which may suggest complementary anti-apoptotic

activities. Tmbim3 mRNA levels are highly increased under ER stress conditions, both

in cellular models and in animal models. This regulation of mRNA levels of tmbim3 is

controlled by the PERK/ATF4 signaling branch, which is activated under conditions of

ER stress. In addition, TMBIM3 controls Ca2+ homeostasis and physically interacts

23

with the IP3 receptor, which could explain its anti-apoptotic activity under conditions of

ER stress.

Loss of function studies in D. melanogaster revealed that TMBIM6 and TMBIM3

have synergistic activities on the protection against ER stress. Similarly, deficiency

TMBIM3 zebrafish embryos resulted in spontaneous apoptosis during development

and drastic alterations in the morphology of the brain and neuronal viability. In addition,

TMBIM3 over-expression protected zebrafish embryos in experimental conditions of

ER stress.

All these results indicate a critical role of TMBIM3 in apoptosis controlling induced

by ER stress, suggesting the existence of a group of conserved functional regulators of

cell death, beyond the family of BCL-2 protein.

24

6) Introducción. 6.1) El Retículo Endoplasmático

Cerca del 70% de las proteínas sintetizadas en una célula están destinadas a los

distintos sistemas membranosos intracelulares o a su exportación al medio extracelular. El

proceso de síntesis y maduración de estas proteínas se caracteriza por su paso a través

de una serie de organelos que comienza en el retículo endoplasmático (RE), desde que

se inicia el proceso de traducción de las proteínas en los complejos ribosomales hasta

que se encuentran completamente plegadas y funcionales en su sitio final de destinación.

Por lo tanto, el RE es un organelo fundamental en la ruta secretora de las proteínas. ¿Qué

características tiene el RE que permite el correcto plegamiento de las proteínas? En el RE

endoplasmático se localizan múltiples proteínas con actividad chaperona y foldasas,

además de un ambiente reductor que facilita la formación de puentes di-sulfuros, así

como complejos proteicos que permiten la glicosilación de proteínas, con la consecuente

reducción de la polaridad de la cadena aminoacídica, favoreciendo el plegamiento

(Gorlach et al, 2006). Por otra parte, el RE presenta una compleja y tradicional arquitectura que varía

según los requerimientos celulares, estando formado por una serie de estructuras

membranosas tubulares continuas y dinámicas que se organizan en subdominios. Estos

subdominios incluyen el RE rugoso, RE liso, RE transicional y la envoltura nuclear

(Borgese et al, 2006).

Facilitar la síntesis de proteínas no es la única función del RE, puesto que además

es clave en la síntesis de los fosfolípidos (Fagone & Jackowski, 2009; Jesch et al, 2006),

es el reservorio intracelular mas importe de Calcio (Ca2+) (Berridge, 2002; Borgese et al,

2006; Gorlach et al, 2006) y bajo determinadas circunstancias, se generan señales

celulares desde el RE que pueden activar o inhibir la muerte celular (Berridge, 2002;

Tabas & Ron, 2011).

6.2) El estrés de RE

Distintas condiciones que perturban la función del RE, y que tengan como

consecuencia un aumento en la síntesis de proteínas o la generación de proteínas mal

plegadas al interior del RE, pueden generar una condición denominada estrés de RE (Ron

25

& Walter, 2007; Schroder & Kaufman, 2005a). El estrés de RE puede ser, por ejemplo,

desencadenado por alteraciones en la homeostasis del Ca2+, estrés oxidativo y/o

alteraciones en el balance redox en el lumen del RE (Ron & Walter, 2007; Woehlbier &

Hetz, 2011). En eucariontes multicelulares, el estrés de RE es sensado por al menos tres

proteínas que controlan la activación de tres vías de traducción de señales complejas, las

cuales promueven una serie de eventos que pueden contribuir a la recuperación de la

homeostasis pérdida (Hetz & Glimcher, 2009; Schroder & Kaufman, 2005b). La activación

coordinada de estas tres vías constituye una respuesta especifica al estrés de RE, la cual

ha sido denominada Respuesta a Proteínas Mal plegadas o UPR, por sus siglas en inglés:

Unfolded Protein Response. 6.3) La UPR

La acumulación de proteínas mal plegadas en el RE es presumiblemente

detectada, directa o indirectamente, por al menos tres proteínas residentes del RE con un

dominio transmembrana, los cuales han sido denominados “sensores de estrés de RE”

(Cox et al, 1993; Ron & Walter, 2007). Cada uno de esos tres sensores comunica el

estado de plegamiento de las proteínas desde el RE hasta el citoplasma y el núcleo,

controlando la expresión de factores de transcripción específicos en conjunto con

múltiples efectos no transcripcionales (Hetz & Glimcher, 2009; Ron & Walter, 2007). La vía de la UPR mas conservada en la evolución involucra la activación

combinada de una proteína con actividades nucleasa y quinasa, denominada IRE1 (del

inglés Inositol requering protein-1) (Back et al, 2005; Calfon et al, 2002; Tirasophon et al,

1998). En mamíferos, existen dos isoformas: IRE1α, cuya expresión es ubicua, e IRE1β,

cuya expresión se restringe al tejido gastro-intestinal y a las vías respiratorias (Ron &

Hubbard, 2008). La activación de IRE1α es iniciada en el lumen del RE por la disociación

de la chaperona BIP (del inglés immunoglobulin-binding protein o Grp78) la cual se une

preferentemente a las proteínas mal plegadas en el lumen del RE (Bertolotti et al, 2000;

Kimata et al, 2003; Oikawa et al, 2009). Otro fenómeno que ha sido asociado

indirectamente a la activación de IRE1α, es la interacción directa de IRE1α con proteínas

mal plegadas, lo cual favorecería su homo-oligomerización espontánea (Hetz & Glimcher,

2009; Ron & Hubbard, 2008; Zhou et al, 2006). Estos procesos en el lumen del RE

controlan la activación del dominio citosólico de IRE1α, favoreciendo su auto-

26

transfosforilación y unión de un nucleótido (revisado en Hetz & Glimcher, 2009). Estos

eventos en su conjunto activan el dominio RNAsa y promueven una de sus funciones

efectoras en el citoplasma: el procesamiento no convencional del ARN mensajero (ARNm)

de un factor transcripcional denominado x-box binding protein-1 (xbp-1) (Calfon et al,

2002). El procesamiento del ARNm de xbp-1 induce la escisión de 26 nucleótidos,

generando, consecuentemente, un corrimiento en el marco de lectura y la generación de

un codón de stop río arriba del original, lo que induce la traducción de una proteína de

mayor tamaño que contiene un dominio de transactivación transcripcional, el cual actúa

como un potente factor transcripcional denominado XBP-1s (s del inglés splicing). XBP-1s

controla la expresión de un gran número de genes involucrados, en su mayoría, en el

restablecimiento de la homeostasis pérdida en el RE asociadas al plegamiento,

degradación de proteínas, traslocación al RE y síntesis de lípidos (Lee et al, 2003). Bajo

ciertas condiciones, la actividad nucleasa de IRE1α también puede degradar y bloquear la

traducción de una gran variedad de ARNm que codifican proteínas difíciles de plegar (Han

et al, 2009; Hollien et al, 2009; Hollien & Weissman, 2006), aunque el posible rol

fisiológico o patológico de esta actividad es aún desconocida.

Una segunda vía de la UPR es iniciada por la activación de la quinasa PERK (del

inglés Protein kinase RNA (PKR)-like ER kinase), la cual es activada de manera similar a

IRE1α, favoreciéndose bajo condiciones de estrés de RE su auto-transfosforilación y su

homo-oligomerización (revisado en Ron & Walter, 2007 y Bertolotti et al, 2000). La

proteína PERK fosforila a la sub-unidad α del factor de iniciación de la traducción, eIf2α

(del inglés eukaryotic translation initiation factor α 2), con la consecuente inhibición de la

traducción (Shi et al, 1998). Sin embargo, la traducción de otro ARNm que codifica para el

factor de expresión ATF4 es inducida, favoreciéndose la expresión de múltiples genes

blancos de ATF4 (Harding et al, 2000a), los que regulan el metabolismo de aminoácidos

(Harding et al, 2000a; Harding et al, 2003), homeostasis redox (Harding et al, 2003),

autofagia (Rzymski et al, 2009) y apoptosis (Kim et al, 2006) (revisado en Tabas & Ron,

2011). Un importante blanco de ATF4, el cual ha sido ampliamente descrito en la literatura

es chop (C/EBP-homologous protein; también conocido como GADD153) (Harding et al,

2000a). Usualmente, CHOP puede interactuar con otros factores de transcripción

regulando genes blancos de la UPR que favorecen la restauración de la homeostasis

27

pérdida en el lumen del RE (Tabas & Ron, 2011). Por otra parte, CHOP y ATF4 favorecen

la expresión de GADD34 (del inglés growth arrest and DNA damage-inducible protein-34),

una fosfatasa que desfosforila a eIF2α, previamente fosforilado por PERK, restaurándose

la traducción global de proteínas y suprimiéndose la expresión de ATF4 hasta niveles

basales (Novoa et al, 2001).

Una tercera vía de la UPR involucra a la proteína transmembrana ATF6. Bajo

condiciones de estrés de RE, ATF6 es localizada en el RE asociado a BIP (Shen et al,

2005; Sommer & Jarosch, 2002). Sin embargo, bajo condiciones de estrés de RE ATF6 es

translocada al aparato de Golgi (Chen et al, 2002; Shen et al, 2002), en donde es activado

mediante una proteólisis efectuada por las proteasas SP1 y SP2 (del inglés site 1

protease y site 2 protease) (Haze et al, 1999). Este procesamiento tiene como

consecuencia la liberación al citoplasma del fragmento citosólico correspondiente al N-

terminal de ATF6 (ATF6f) y su posterior translocación al núcleo, donde favorece la

expresión de chaperonas residentes del RE (Haze et al, 1999) y genes relacionados con

el sistema de degradación de proteínas asociada al RE o ERAD (del inglés Endoplasmic

Reticulum associated degradation) (Okada et al, 2002), así como la expresión de xbp-1

(Lee et al, 2002; Yoshida et al, 2001) y chop (Okada et al, 2002).

Estas tres vías son activadas bajo diversas condiciones fisiológicas (por ejemplo:

diferenciación de linfocitos B (Iwakoshi et al, 2003) o patológicas (por ejemplo: diabetes,

cáncer o enfermedades neurodegenerativas (revisado en Tabas & Ron, 2011) lo que ha

sido asociado con la transición entre la adaptación y apoptosis. Sin embargo, las cinéticas

de sus respectivas activaciones e inhibiciones difieren drásticamente en condiciones de

estrés de RE crónico. Aunque ha sido descrito que el proceso de atenuación es

secuencial para IRE1α, ATF6 y PERK, el contexto celular parece ser fundamental en las

respectivas cinéticas de activación y atenuación (Lin et al, 2007). Esto puede tener

consecuencias en la restauración de la homeostasis pérdida en el RE, favoreciéndose o

no, la atenuación de la condición de estrés mediante un proceso de adaptación celular.

En resumen, como consecuencia de la activación de los sensores de estrés

XBP1s y ATF6f, se regulan genes relacionados con chaperonas residentes del RE,

componentes del ERAD, síntesis de lípidos, tamaño del RE y aparato de Golgi, con el

consecuente aumento de la capacidad de plegamiento y degradación de proteínas (Figura

28

1). Por otra parte, ATF4 controla positivamente la expresión de genes que modulan el

estado redox y el metabolismo, así como foldasas, generando un medio-ambiente

favorable para el plegamiento oxidativo de proteínas (Figura 1). Colectivamente, estos

tres procesos reducen la cantidad de proteínas mal plegadas al interior del RE

favoreciendo la restauración de la homeostasis celular perdida, es decir forman parte de

una respuesta adaptativa (Woehlbier & Hetz, 2011). Sin embargo, bajo determinados

contextos fisiológicos y patológicos, por ejemplo cuando el estrés de RE es fuerte y

crónico, la UPR puede ser insuficiente para restablecer la homeostasis pérdida,

desencadenando eventos que favorecen la eliminación de las células que han sufrido un

daño irreversible, mediante la inducción de muerte celular por apoptosis (ver a

continuación la descripción de apoptosis) (Tabas & Ron, 2011).

Figura1: La Respuesta a Proteínas mal Plegadas. La acumulación de proteínas Induce la activación de los sensores de estrés de RE. Las quinasas PERK e IRE1α dimerizan y se autotransfosforilan, mientras que ATF6 es translocado al aparato de Golgi. Posterior a su fosforilación y dimerización, IRE1α procesa al ARNm del factor transcripcional xbp-1, mediante su actividad endonucleasa y degrada el ARNm de proteínas difíciles de plegar. PERK fosforila al factor iniciador de la traducción eIF2α bloqueando la traducción general de proteínas y favoreciendo la traducción preferencial del ARNm del factor transcripcional

ATF6 procesado

Aparato de Golgi

29

ATF4. Por su parte, el dominio citoplasmático de ATF6 es liberado, mediante una proteólisis efectuada por las proteasas S1P y S2P en el aparato de Golgi. El fragmento liberado es traslocado al núcleo, donde actúa como factor transcripcional. Los factores transcripcionales en conjunto, activan la expresión de un grupo de genes relacionados. Esta respuesta a proteínas mal plegadas o UPR contrarresta el estrés de RE producido, aumentando la expresión de genes relacionados con metabolismo y balance redox, chaperonas, foldadas, la degradación de proteínas asociada al RE, el volumen del RE, trafico vesicular e induciendo la autofagia y la apoptosis (La fiigura fue modificada a partir de una publicada en The Unfolded Protein Response: Integrating stress signals through the stress sensor IRE1a, de los autores Hetz C, Martino F, Rodriguez, and Glimcher LH. Physiological Reviews. 2011).

6.4) La apoptosis

La apoptosis es un tipo de muerte celular programa conservada a través de todos

los metazoos. Es un proceso esencial en la mantención de la homeostasis celular en los

tejidos en desarrollo y a lo largo de la adultez de los organismos multicelulares. A través

de ensayos de ganancia y pérdida de función de genes involucrados en la regulación de

la apoptosis en ratones y estudios genéticos en pacientes, se ha visto que la

desregulación de este proceso puede desencadenar diferentes patologías. Por ejemplo,

una disminución de la apoptosis puede contribuir a la formación de tumores debido a la

inmortalización celular y la replicación descontrolada de la célula, llevando al cáncer o

enfermedades autoinmunes. Por otra parte, el aceleramiento de la apoptosis podría

conducir al desarrollo de enfermedades neurodegenerativas, la inmunodeficiencia y

también a la infertilidad (Youle & Strasser, 2008).

Quizás, la característica más importante, y la cual algunos autores utilizan para

definir la apoptosis, es la activación de unas proteínas con actividad cisteín-proteasas

denominadas caspasas, las cuales se encuentran en las células animales como pro-

enzimas (Youle & Strasser, 2008). Por otra parte, la apoptosis también puede ser

clasificada de acuerdo a características morfológicas, como el redondeo de las células,

retracción de los pseudópodos, una reducción del volumen celular, la condensación de la

cromatina, la fragmentación nuclear, aparición de cambios en la ultra-estructura de los

organélos, generación de estructuras lobulares en la membrana citoplasmática (en inglés

“blebs”). Además, existen características no morfológicas tales como la caída del

potencial mitocondrial, la exposición de fosfatidil serina, una masiva activación de

caspasas y la fragmentación del ADN (Kroemer et al, 2009).

30

Respecto a los mecanismos que pueden promover la apoptosis, esta puede ser

inducida por señales desde la superficie celular mediante receptores activados por

ligando, tales como el receptor de Fas o el receptor del Factor de Necrosis Tumoral (TNF,

del inglés tumour necrosis factor) (vía extrínseca) o por varios agentes genotóxicos, daños

metabólicos o señales transcripcionales (vía intrínseca). En la vía extrínseca, los

receptores de muerte contienen un dominio de muerte intracelular que recluta a diferentes

moleculas adaptadoras, lo que induce la formación de un complejo denominado DISC (de

sus siglas en inglés Death-Inducing Signalling Complex). El DISC favorece la unión y

activación conformacional de caspasas iniciadoras, como la caspasa-8. Esto inicia una

cascada amplificadora de la señal mediada por la activación por proteólisis de caspasas

efectoras, como caspasa-3, -6 o -7, las que ejecutan la muerte celular. En el caso de la

vía intrínseca, la apoptosis puede ocurrir por estímulos intracelulares como infección viral,

daño del ADN, privación de factores de crecimiento, estrés de RE (ver más adelante) o

activación de programas genéticos, entre otros. Como se verá más adelante, estos

estímulos llevan finalmente a la activación de la caspasa iniciadora, caspasa-9, con la

posterior activación proteolítica de caspasas ejecutoras (Green, 2000).

La vía de apoptosis intrínseca también es conocida como la vía mitocondrial, ya

que los estímulos que causan este tipo de apoptosis llevan a la permeabilización de la

membrana externa de la mitocondria, lo que a su vez produce la liberación de proteínas

como SMAC/DIABLO (del inglés Second Mitochondria-derived Activator of

Caspases/Direct IAP-binding protein with low pI), AIF (del inglés Apoptotic Inducing

Factor) y citocromo c desde el espacio intermembrana de la mitocondria hacia el

citoplasma. En el citoplasma, el citocromo c une a una proteína adaptadora llamada

APAF1 (de las siglas en inglés Apoptotic Protease Activating Factor 1) formando un anillo

heptamérico que recluta a pro-caspasas-9. Este complejo es conocido como apoptosoma

y es esencial para la activación de la apoptosis (Bao & Shi, 2007). La unión de la pro-

caspasa-9 al anillo heptamérico provoca un cambio conformacional en la pro-caspasa-9,

permitiendo su dimerización, generando caspasa-9 activa. Esta caspasa iniciadora, luego

activa directamente a las caspasas efectoras caspasa-3 y caspasa-7 mediante corte

proteolítico (Wang, 2001).

6.5) La Familia BCL-2.

31

Diversas proteínas han sido identificadas como protagonistas en la regulación de

la apoptosis, entre las cuales destacan las proteínas de la familia BCL-2. Los integrantes

de esta familia modulan la activación de las caspasas, proteínas iniciadoras y/o ejecutoras

de la apoptosis. Dentro de la familia BCL-2 se encuentran proteínas antiapoptóticas,

definidas por la presencia de 4 dominios conservados denominados BH1, BH2, BH3 y

BH4 (del inglés BCL-2 homology) y proteínas pro-apoptóticas, las cuales pueden ser

subdivididas en aquellas que presentan multidominios homólogos a BH1, BH2 y BH3 (por

ejemplo BAX y BAX) o miembros que solo poseen el dominio BH3, denominados “BH3-

only” (como BIK, BIM, PUMA y NOXA). La activación de las proteínas BAX y BAK es

esencial para inducir la apoptosis, ya que en ellas convergen múltiples estímulos pro-

apoptóticos intrínsecos. Por otra parte, las proteínas BH3-only actúan río arriba de BAX y

BAK promoviendo su activación mediante un cambio conformacional, proceso que es

inhibido por las proteínas antiapoptóticas como BCL-2 y BCL-XL (Wei et al, 2001). La

activación de BAX y BAK se asocia a sus homo-oligomerizaciones, proceso que precede

a la permeabilización de la membrana mitocondrial y la posterior liberación de proteínas

mitocondriales hacia el citoplasma, como citocromo c, la cual gatilla la activación de

caspasas provocando la muerte celular (Danial & Korsmeyer, 2004).

Proteínas de los tres subgrupos de la familia BCL-2, también se localizan en la

membrana del RE (Oakes et al, 2006). Se ha propuesto que la familia BCL-2 regula en

este organelo distintas respuestas a condiciones de estrés (Hetz & Glimcher, 2008).

Algunas proteínas pro-apoptóticas BH3-only son fuertemente inducidas bajo condiciones

de estrés de RE, lo que esclarece en parte, el mecanismo por el cual se gatilla la

apoptosis en condiciones de daño al RE (Li et al, 2006; Puthalakath et al, 2007). Por otra

parte, proteínas de la familia BCL-2 también participan en el control de la homeostasis del

Ca2+ (Rong & Distelhorst, 2008) y en la regulación directa de la vía de IRE1α (Hetz et al,

2006).

6.6) La Apoptosis y la UPR

Previamente se comentó que un estrés de RE prolongado puede desencadenar la

apoptosis. Este proceso ha sido asociado directamente a una activación sostenida de

IRE1α y CHOP en determinados tipos celulares bajo ciertas condiciones fisiológicas o

patológicas. En un contexto fisiológico, la apoptosis inducida por la UPR podría tener

32

como consecuencia la eliminación de aquellas células expuestas al estrés de RE de

manera de seleccionar aquellas células adaptadas a la condición de estrés. La

eliminación de las células dañadas mediante apoptosis, tiene como consecuencia la

evasión de procesos inflamatorios asociados a muerte no-apoptótica, dado que la

apoptosis se caracteriza por una eficiente fagocitosis, lo cual previene la necrosis tardía

secundaria a la apoptosis, con la consecuente respuesta antiinflamatoria (Woehlbier &

Hetz, 2011).

En contraste con el escenario fisiológico donde la apoptosis es limitada y selectiva,

el estrés de RE crónico puede inducir una apoptosis patológica generalizada. La

apoptosis inducida por un estrés de RE no resuelto comienza a ser reconocido en la

literatura como un importante factor patogénico en un gran número de enfermedades,

entre las que se incluyen las enfermedades neurodegenerativas, diabetes, aterosclerosis

y enfermedades renales (Tabas & Ron, 2011).

Existen efectos no transcripcionales regulados por la vía de IRE1α, los cuales han

sido reconocidos como parte de la respuesta adaptativa a una condición de estrés de RE.

Sin embargo, una activación prolongada de IRE1α podría promover la apoptosis. Algunos

estudios en cultivos celulares expuestos a estrés de RE han identificado que IRE1α puede

asociarse a la proteína TRAF2. TRAF2 interactúa con la pro-caspasa12 y promueve

reclutamiento y su activación en respuesta al estrés de RE, fenómeno que podría ligar la

vía de IRE1α con inducción de apoptosis. Sin embargo, la participación de caspasa 12 en

la inducción de apoptosis es contradictoria. Por otra parte, la formación del complejo

IRE1α/TRAF2/ASK1 regula la activación de JNK (Urano et al, 2000a; Urano et al, 2000b),

lo cual también podría inducir apoptosis (Li et al, 2011a; Xia et al, 1995), de una manera

análoga a la que ha sido descrita para el receptor de muerte de TNFα. La fosforilación de

JNK podría tener como consecuencia la activación de BAX y BAK, mecanismos por el

cual podría ser amplificada la señal pro-apoptótica de IRE1α (Woehlbier & Hetz, 2011).

Sin embargo el mecanismo que relacione esos dos fenómenos no ha sido esclarecido.

Por otra parte, la inducción de CHOP mediada por un estrés de RE prolongado,

suprime la expresión de BCL2, lo cual ha sido asociado al efecto pro-apoptótico de

CHOP, presumiblemente mediante la interacción con uno o más factores transcripcionales

33

que reprimen la transcripción de bcl-2. Además, CHOP regula el aumento transcripcional

de bim, así como otras proteínas BH3-only pueden ser reguladas tanto

transcripcionalmente como no transcripcionalmente bajo condiciones de estrés de RE,

favoreciendo en última instancia, la activación de BAX y BAK, con la consecuente

inducción de apoptosis (revisado en Tabas & Ron, 2011).

Por otra parte, el estrés de RE también puede inducir muerte celular mediante un

mecanismo que involucra cambios en la dinámica del Ca2+, puesto que se ha observado

que en condiciones de estrés de RE existe una desregulación del Ca2+ contenido en el

lumen del RE, observándose un aumento en la concentración de Ca2+ citoplasmático.

Esto último da cuenta de la activación de caspasas y otras proteasas, como las calpaínas,

que se activan en respuesta a diferentes concentraciones de Ca2+ citoplasmático y que se

han reportado como moduladores de la caspasa-12 y de la cascada ASK-1/JNK (Tan et

al, 2006). Se ha observado, además, que la inducción de estrés del RE con agentes

farmacológicos estimulan la proteólisis y activación de caspasa-12 por reclutamiento a la

membrana del RE e interacción con la caspasa-7 (Rao et al, 2001).

Otro mecanismo que liga las señales de Ca2+ provenientes del RE con la muerte

inducida por estrés de RE, fue recientemente descrita en un estudio que demostró que la

inducción de la muerte inducida por CHOP es dependiente de Ca2+, mediante un

mecanismo que involucra la activación de CaMKII (Timmins et al, 2009). Además, también

se describió que CHOP podría regular la apoptosis mediante el control transcripcional de

ERO1 (de sus siglas en ingles ER oxidase 1), regulando la liberación de Ca2+ desde el RE

a través del receptor de IP3 (IP3-R), el cual es crucial en los efectos del Ca2+ en los

procesos de muerte celular (Li et al, 2009). Por otra parte, un reciente estudio demostró

que mediante un mecanismo dependiente de BIP, IP3-R1 puede modular la muerte

celular inducida en neuronas expuestas a estrés de RE y en un modelo de enfermedad de

Hungtinton (Higo et al, 2010). Sin embargo el papel de IP3-R en la muerte inducida por

estrés de RE aun no ha sido completamente descifrado.

34

Figura 2: Apoptosis inducida por estrés de RE. El estrés de RE induce la activación de distintas señales que pueden desencadenar apoptosis. PERK induce la expresión de ATF4 que en conjunto con ATF6 controla la expresión de chop. CHOP puede inhibir la expresión de bcl-2, así como inducir la expresión de las proteínas pro-apoptóticas BH3-only: bim, puma y noxa. A su vez, la activación de caspasa-2 puede activar, mediante un procesamiento proteolítico a la proteína BH3-only BID, la cual, en conjunto con NOXA, PUMA y BIM pueden inducir la oligomerización de BAX y BAK en la mitocondria, lo que favorece la salida de citocromo c, con la consecuente activación de caspasas e inducción de apoptosis. Paralelamente, TRAF2 se asocia a IRE1α, lo que favorece el reclutamiento de ASK1 y la activación, mediante fosforilación, de JNK. JNK induce la activación de BAX y BAK. Por último, bajo condiciones de estrés de RE, IP3R favorece la salida de Ca2+, proceso el cual es regulado por BCL-2 y que podría ser regulado por proteínas de la familia TMBIM (La fiigura fue modificada a partir de una publicada en The Unfolded Protein Response: Integrating stress signals through the stress sensor IRE1a, de los autores Hetz C, Martino F, Rodriguez, and Glimcher LH. Physiological Reviews. 2011).

6.7) TMBIM6/BI-1

De manera similar a las proteínas de la familia BCL-2, Bax Inhibitor-1 (BI-1) o

también llamado TMBIM6 (del inglés Tansmembrane BAX inhibitor motif containing 6)

ha sido relacionado funcionalmente con BCL-2, sin poseer una homología de secuencia

primaria aparente con los dominios conservados de la familia BCL-2. TMBIM6/BI-1

35

interactúa funcional y estructuralmente con BCL-XL y BCL-2 (Xu & Reed, 1998). A

continuación, se describen los antecedentes más relevantes sobre TMBIM6/BI-1 y de

proteínas que han sido identificadas como homólogos de secuencia de TMBIM6/BI-1.

TMBIM6/BI-1 fue el primer integrante descrito de una familia de proteínas con

destinación a membranas y con aparente actividad antiapoptótica. TMBIM6/BI-1 es una

proteína con 6 a 7 dominios hipotéticos para segmentos transmembranas, localizada en el

RE (Xu & Reed, 1998). TMBIM6/BI-1 se identificó inicialmente como “TEGT” (testis

enhanced gene transcript) (Walter et al, 1995) y posteriormente, en un estudio que

buscaba identificar posibles genes inhibitorios de la apoptosis inducida por la

sobrexpresión de Bax humano en levadura. En ese estudio, la co-expresión de

TMBIM6/BI-1 rescató del efecto letal de BAX, en forma similar a lo observado por la

sobreexpresión de BCL-2 (Xu & Reed, 1998). Luego en diversos estudios en células

humanas se demostró que la sobreexpresión de TMBIM6/BI-1, al igual que BCL-2,

protege frente a la muerte inducida por privación de nutrientes, daño al DNA, estrés de RE

y estrés oxidativo (vías intrínsecas) (Chae et al, 2004; Xu & Reed, 1998). Sin embargo,

TMBIM6/BI-1 no afectaba la apoptosis activada por receptores de muerte como Fas y

TNF-α (Xu & Reed, 1998). El análisis filogenético de la secuencia de TMBIM6/BI-1

estableció que esta proteína es altamente conservada en diferentes especies; incluyendo

levaduras, plantas e insectos (Chae et al, 2004; Reimers et al, 2008), sugiriendo que su

efecto antiapoptótico podría estar conservado en la evolución, desde organismos

unicelulares a complejos organismos multicelulares.

6.8) TMBIM6/BI-1 y el estrés de RE.

Estudios in vivo utilizando ratones deficientes para TMBIM6/BI-1 mostraron que

esta proteína es un importante regulador de la apoptosis iniciada bajo condiciones de

estrés en el RE (Bailly-Maitre et al, 2006; Chae et al, 2004). Asimismo, líneas celulares de

fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) carentes de TMBIM6/BI-1 presentaron una

mayor susceptibilidad a la apoptosis inducida por drogas como tunicamicina (Tm), la cual

gatilla estrés por inhibición de la glicosilación de proteínas (Chae et al, 2004).

Posteriormente, se describió que ratones deficientes en TMBIM6/BI-1 presentan hiper-

activación de la vía de IRE1α en respuesta a estrés de RE, tanto en el hígado como en

riñones de ratones sometidos a isquemia y reperfusión (Bailly-Maitre et al, 2006),

36

sugiriéndose que TMBIM6/BI-1 podría poseer una actividad inhibitoria de IRE1α. En esta

línea, nuestro laboratorio describió que proteínas pro-apoptóticas como BAX y BAK

también regulan a IRE1α mediante interacción directa (Hetz et al, 2006). Nuestro

laboratorio también ha caracterizado la respuesta frente a estrés de RE en células MEFs

carentes en TMBIM6/BI-1, observándose una mayor sensibilidad tanto en la activación de

la UPR en respuesta a estrés de RE como a la apoptosis (Lisbona et al, 2009).

Posteriormente, esto fue corroborado por otro grupo in vivo, en donde se asocio la

inhibición de IRE1α con la disminución de obesidad y inducida por resistencia a la

insulina y tolerancia a la glucosa (Bailly-Maitre et al, 2010). Paradójicamente, ambas

actividades parecen oponerse parcialmente, dado la correlación propuesta entre la

activación de IRE1α y la sobrevida celular (Lin et al, 2007). En concordancia con estos

hallazgos, resultados de nuestro laboratorio, sugieren un papel dual para TMBIM6/BI-1

respecto a su actividad antiapoptótica y capacidad para modular la UPR mediante

inactivación de IRE1α, siendo actividades independientes entre sí (Bailly-Maitre et al,

2010; Bailly-Maitre et al, 2006; Lisbona et al, 2009). Esta aparente capacidad de

TMBIM6/BI-1 de modular la activación de la UPR y sobrevida celular en respuesta al

estrés de RE, también es compartida con múltiples proteínas de la familia Bcl-2 (Hetz &

Glimcher, 2008). Sin embargo, se desconoce si otras proteínas de la familia de

TMBIM6/BI-1 presentan estas características

Por otra parte, la sobreexpresión de TMBIM6/BI-1, al igual que BCL-2 y BCL-XL,

disminuye los niveles de Ca2+ luminal del RE (Xu et al, 2008) así como la cantidad de

Ca2+ liberado desde el RE en respuesta a estímulos (Chae et al, 2004; Westphalen et al,

2005; Xu et al, 2008). Un estudio mostró que TMBIM6/BI-1 controla la homeostasis de

Ca2+ mediante la misma vía regulada por BCL-2 y BCL-XL, donde TMBIM6/BI-1 se ubica

como un modulador río abajo de BCL-2 (Xu et al, 2008). Se ha postulado que la

regulación del Ca2+ mediada por la familia BCL-2 y TMBIM6/BI-1 impactan

específicamente en la muerte celular inducida por la liberación de Ca2+ debido a su efecto

directo sobre la mitocondria (revisado en (Henke et al, 2011), ya que la sobrecarga de

Ca2+ en la mitocondria estimula la liberación del citocromo c mediada por el poro de

transición permeable y la posterior activación de las caspasas (Pinton et al, 2008).

37

Los estudios in vivo aportan una aproximación más fisiológica de la función de

genes, en particular en el contexto de un organismo complejo. Bajo esta premisa se

evalúo el efecto de la sobreexpresión de TMBIM6/BI-1 (dTMBIM6/BI-1) en Drosophila

melanogaster (D.mel). Larvas de moscas que poseen una mutación puntual que afecta la

expresión de dBI-1, resultó en la sobreexpresión de dTMBIM6/BI-1. En este sistema, se

evalúo la actividad de la vía IRE1α en larvas crecidas en presencia de Tm. En este

ensayo se observó una clara disminución del splicing del ARNm dxbp-1 en el tejido

larvario frente a condiciones de estrés en el RE (Lisbona et al, 2009). La correlación entre

el aumento de TMBIM6/BI-1 y disminución de la vía dIRE1α/XBP-1, permite establecer

otro vínculo entre TMBIM6/BI-1 y esta vía.

6.9) Las proteínas de la familia TMBIM: nuevos reguladores de la muerte celular?

Diversos análisis bio-informáticos han identificado posibles homólogos para

TMBIM6/BI-1 en mamíferos (Hu et al, 2009; Reimers et al, 2007; Reimers et al, 2008;

Zhou et al, 2008) y plantas (Huckelhoven, 2004), los cuales constituyen una familia

putativa de proteínas conservadas que incluyen: TMBIM6/BI-1, Lifeguard (LFG/TMBIM2),

Growth-Hormone Inducible Transmembrane Protein (GHITM/TMBIM5), Responsive to

Centrifugal force and Shear tress gene 1 (RECS1/TMBIM1), Golgi Anti-Apoptotic Proteín

(GAAP/TMBIM4) y Glutamate Receptor, Ionotropic, N-methyl D-asparate-Associated

protein 1 (GRINA/TMBIM3). La familia de proteínas TMBIM, comparte entre sí un dominio

denominado APF0005, altamente hidrofóbico que posee secuencias de destinación a

membranas. Sin embargo, la localización subcelular de los integrantes de la familia

TMBIM parece no ser compartida entre estos. Por ejemplo, TMBIM6/BI-1 (Xu & Reed,

1998) y TMBIM4/GAAP (Gubser et al, 2007) se identificaron como proteínas de la red RE-

Golgi; TMBIM2/LFG se expresa principalmente en la capa citoplasmática, en el RE y en la

membrana perinuclear (Gubser et al, 2007); TMBIM1/RECS1 se encuentra asociada a

lisosomas y membrana citoplasmática (Zhao et al, 2006b) y TMBIM5/GHITM se describió

como una proteína asociada a la membrana interna mitocondrial (Oka et al, 2008).

La capacidad de formar complejos con proteínas de la familia BCL-2, ha sido

estudiada sólo para TMBIM6/BI-1 y TMBIM2/LFG. Mediante co-inmunoprecipitación y

cross-linking se determinó que TMBIM6/BI-1 interactúa físicamente con BCLXL y BCL-2,

pero no con BAX o BAK (Xu & Reed, 1998). Contrariamente a lo establecido para

38

TMBIM/6BI-1, TMBIM2/LFG parece interaccionar con BAX y BAK, pero no con BCL-XL

(Hu et al, 2009). La probable interacción del resto de la familia TMBIM con proteínas de la

familia BCL-2 queda aún por ser determinada. Aunque las proteínas de la familia TMBIM

se definieron como homólogas de secuencia primaria, poco se sabe de su homología

funcional en términos de posibles propiedades antiapoptóticas. Por ejemplo, la

sobreexpresión de TMBIM2/LFG protege de la muerte inducida por el ligando FasL en

diferentes modelos celulares (Fernandez et al, 2007; Somia et al, 1999). La

sobreexpresión de TMBIM4/GAAP promueve la sobrevida celular frente a la

sobreexpresión de BAX o la exposición de células a ceramidas, estaurosporina o

cisplatino (Gubser et al, 2007). En el caso de TMBIM6/BI-1, su actividad antiapoptótica

protege a las células frente a un amplio espectro de estímulos deletéreos como Tm,

estaurosporina (Est), etopósido (Eto), doxorrubicina, privación de nutrientes, hipoxia y la

sobrexpresión de BAX (Chae et al, 2004; Xu & Reed, 1998). Por otra parte, aún se

desconoce si TMBIM1/RECS1, TMBIM5/GHITM o TMBIM3/GRINA presentan homología

funcional con TMBIM6/BI-1 en términos de la promoción de la sobrevida celular,

modulación de la UPR o actividades sobre la homeostasis del Ca2+.

Figura 3: Proteínas de la familia TMBIM: El árbol filogenético muestra los miembros descritos para la familia TMBIM en humano. TMBIM1 también ha sido nombrado como RECS1; TMBIM2, como LFG; TMBIM3, como GRINA; TMBIM4 como GHTIM; TMBIM5 como GAAP y TMBIM6 como BI-1. Además, se muestra la proteína putativa del gen Yn1305c de levadura, la cual ha sido sindicada como un putativo ancestro en común para toda la familia TMBIM.

Inicialmente un trabajo identificó a TMBIM3/GRINA como una proteína asociada al

receptor de NMDA (Kumar et al, 1991), lo que hace presumir que se expresa en el

TMBIM6TMBIM5

TMBIM4

TMBIM1TMBIM3

TMBIM2

Yn1305c

39

sistema nervioso. Recientemente, esto fue corroborado en un trabajo donde se describió

que TMBIM3/GRINA se expresa principalmente en el sistema nervioso central, con un alto

grado de expresión en el hipocampo. Además, mediante estudios de inmunofluorescencia

se demostró que TMBIM3 colocaliza con GM130 (marcador de aparato de Golgi) y

parcialmente con BIP (RE) (Nielsen et al, 2011). En este trabajo, se describió que la

generación del ratón deficiente en tmbim3 no se manifiesta en un fenotipo evidente

respecto a la supervivencia o letalidad del animal. En otro trabajo, recientemente se

describió que la sobreexpresión de un fragmento de TMBIM3 inhibe la muerte inducida

por la expresión de una toxina, mediante la inhibición del tránsito desde el RE al aparato

de Golgi de su receptor Globotriaosylceramida (Gb3) (Yamaji et al, 2010). Sin embargo, la

expresión de la proteínas completa no presentó la misma actividad del fragmento más

pequeño, pero sí otros miembros de la familia TMBIM.

Un resultado indirecto podría vincular a TMBIM3/GRINA y el estrés de RE. En un

modelo de retinitis pigmentosa, el cual involucra respuestas a estrés de RE (Lin et al,

2007), se determinó un incremento en los niveles de microRNAs (miR-96, miR-183, miR-

1, miR.133), entre los cuales TMBIM3/GRINA figura como potencial blanco (Loscher et al,

2007). TMBIM3/GRINA es la proteína de la familia TMBIM menos estudiada y posee un

grado de similitud e identidad semejante a los que presentan todos los miembros de la

familia TMBIM. TMBIM3/GRINA tiene un perfil de hidrofobicidad similar al de TMBIM3,

con 6 a 7 dominios putativos para transmembrana cercanos al extremo C-terminal,

basado en criterios de análisis Kyte-Doolittle para hidrofobicidad (Kyte & Doolittle, 1982)

con un dominio N-terminal más largo que TMBIM6/BI-1.

En mamíferos, TMBIM3 es una proteína conservada, con un altísimo grado de

identidad en mamíferos. Nuestros análisis filogenéticos muestran la presencia de

proteínas hipotéticas en gusano (Bombix mori), el pez zebra (Danio rerio), xenopus

(Xenopus leavis y Xenopus tropicales) y la mosca (D. melanogaster), con niveles de

conservación de secuencias similares al grado de identidad que presenta TMBIM6 en

diferentes especies.

Cabe destacar que el alto grado de identidad y similitud que conservan

hTMBIM6/BI-1 y hTMBIM3/GRINA en múltiples especies. Por ejemplo, en D.

melanogaster corresponden a 19 y 40% de identidad, y 34 y 55% de similitud,

40

respectivamente. Por otra parte todos los miembros de la familia TMBIM están presentes

en D. melanogaster o en pez zebra, lo que hace presumir su relevancia en la biología

celular. Esto último contrasta fuertemente con el hecho de que solo existen 2 miembros

de la familia BCL2 descritos en D.melanogaster. Esto sumado a la presencia funcional,

recientemente descrita, de la vía IRE1α/XBP-1 en D. melanogaster (Plongthongkum et al,

2007; Souid et al, 2007) y al papel descrito para TMBIM6/BI-1 como inhibidor de la vía

IRE1α/XBP-1 (Lisbona et al, 2009), hace posible proponer el uso D. melanogaster como

un buen modelo para estudiar la función de esta familia de proteínas Otro modelo in vivo

que posee grande ventajas, dado la fácil manipulación genética y la rapidez en el

desarrollo son los estudios en pez zebra, vertebrado que presenta los 5 miembros de la

familia TMBIM, sin embargo, ni uno ha sido estudiado.

Figura 4: TMBIM3/GRINA es una proteína conservada. Las proteínas correspondiente a los homólogos putativos de TMBIM3/GRINA en pez zebra (D.rerio), Drosophila melanogaster (D.mel), ratón (M.mus) y humano (H.sapiens) fueron alineados con el programa ClustalW. Junto con el nombre, entre paréntesis, se indica el número de aminoácido con el que se inicia cada fila, al igual que arriba de cada fila grupal, el cual es indicado en azul. La figura muestra en letra blanca y fondo negro los aminoácidos

41

idénticos conservados, letra negra y fondo gris los aminoácidos similares y en letra gris y fondo blanco los aminoácidos no conservados entre las especies analizadas.

A la fecha, no se ha estudiado en profundidad si TMBIM3/GRINA posee actividad

antiapoptótica frente a estímulos de apoptosis intrínseca o extrínseca, así como la

regulación de su expresión o su relevancia en el control de la apoptosis in vivo. Además,

aún se desconoce si TMBIM3/GRINA puede regular la homeostasis del Ca2+, tal como ha

sido descrito para otros miembros de la familia TMBIM. El probable control sobre la

homeostasis del Ca2+ podría dar cuenta de un probable mecanismo que explicará el

efecto antiapoptótico de los miembros de la familia TMBIM y específicamente de TMBIM3.

Mediante estrategias genéticas, en esta tesis se desarrollaron distintos modelos celulares

y animales, para evaluar la posible actividad antiapoptótica de TMBIM3 y su interacción

con TMBIM6, así como su regulación transcripcional y efecto en la homeostasis del Ca2+,

de manera de responder la siguiente hipótesis.

42

7. Hipótesis

La hipótesis propuesta para este trabajo fue: “TMBIM3/GRINA es regulado por la

Respuesta a Proteínas Mal plegadas que inhibe la apoptosis inducida por estrés de

retículo endoplasmático mediante el control de la homeostasis del Calcio”.

8. Objetivo General

El objetivo general de este trabajo es estudiar si TMBIM3/GRINA es un blanco de la

Respuesta a Proteínas Mal plegadas que presenta actividad antiapoptótica frente a estrés

de RE, así como su posible papel en el control de la homeostasis del Ca2+ in vitro e in

vivo.

9. Objetivos específicos:

1) Determinar si TMBIM3 tiene actividad antiapoptótica frente a condiciones de estrés de

RE.

2) Estudiar la posible regulación de la expresión de TMBIM3 frente a estrés de RE.

3) Evaluar si TMBIM3 puede regular las señales de Ca2+ desde el RE, así como el rol del

Ca2+ en la muerte inducida por estrés de RE.

4) Estudiar la probable función de TMBIM3 en modelos de estrés de RE in vivo usando

D.melanogaster y pez zebra.

43

10. Materiales y Métodos.

Materiales

Tunicamicina, tapsigargina, estaurosporina, etopósido, actinomicina D y TNFα

fueron adquiridos en Calbiochem EMB Bioscience Inc. El medio de cultivo, sueros fetales

bovinos y antibióticos se obtuvieron en Life Technologies (Maryland, USA). Las sondas

fluorescentes Hoechst, Brefeldina A-BODIPY, y anticuerpos secundarios acoplados a

fluoróforos ALEXA se adquirieron en Molecular Probes. Anticuerpos fluorescentes anti-IgD

y anti-IgM se adquirieron en BD Biosciences.

Cultivo celular y construcciones de ADN

Se generaron células MEFs SV40 y se mantuvieron en cultivo en medio DMEM

suplementado con L-glutamina 1X, aminoácidos no esenciales, penicilina y 5% de suero

fetal bovino, tal como se describió previamente (Cheng et al., 2001; Xu and Reed, 1998).

La proteína BI-1 de humano se clonó en el vector pcDNA3.1 y se fusionó al péptido HA

como se describió con anterioridad (Xu and Reed, 1998; Chae et al., 2003). La proteína

TMBIM3 de ratón se obtuvo desde una biblioteca de ADNc y se clonó en el vector

pCR3.1, y se marcó con el péptido MYC como se describió previamente (Hetz et al.,

2006). Luego, los ADNc fueron sub-clonados en el vector retroviral pMSCV puro

(Clontech).

Las células MEFs deficientes en PERK e IRE1α (Harding et al, 2000b) y sus

respectivos controles fueron obtenidas del laboratorio de David Ron.

Adicionalmente, generamos células MEFs con niveles reducidos, estables y

transitorias, de ARNm de tmbim3 mediante la herramienta de silenciamiento de la

expresión de ARNm, shARN (sh del inglés: short hairping), utilizando el sistema de

expresión lentiviral en el vector pLKO.1, como se describió previamente (Lisbona et al,

2009). Como control del silenciamiento del gen de tmbim3, se utilizó un shARN destinado

contra la secuencia de la luciferasa (Lisbona et al, 2009). Las construcciones para

silenciamiento de ARN, mediante shRNA, fueron generados por The Broad Institute

(Boston, USA) basados en distintos criterios de diseño de shRNA (ver

44

http://www.broad.mit.edu/genome_bio/trc/rnai.html). Se escogieron 5 construcciones de

las generadas y se seleccionaron los dos más eficientes mediante análisis por PCR en

tiempo real (shARN#1y shARN#2). Éstos, correspondieron a las secuencias blanco contra

Tmbim3: 5´-GCTGCATTTCTGTGCCACCTT-3’ y ´5’-CTGGACCATCATTGTCTCCTA-3’.

Inmunofluorescencia indirecta

Las células MEF silvestres fueron sembradas en cubreobjetos de vidrio a una

concentracion final de 2,0 x 105 en placas de 6 pocillos y fueron cultivados en condiciones

normales. 24 h despúes, las células fueron transfectadas con vectores de expresión, ya

sea para TMBIM3-MYC o para TMBIM6-MYC. Luego de 48 h las células fueron incubadas

con Brefeldina-A conjugada al fluoróforo BODIPY 558/568 (3,5 µM) por 45 min a 37ºC y

5% de CO2. A continuación, las células se fijaron con paraformaldehído (4% p/v en PBS,

20 min), se permeabilizaron (PBS 0,3% v/v Tritón X-100, 30 min) y se bloquearon (3% p/v

BSA en PBS, 1 h). Este procedimiento se realizó sobre hielo a 4°C con lavados entre

cada paso, utilizando PBS frio. Posteriormente, las células se incubaron con el primer

anticuerpo, anti-MYC (1:300), diluido en PBS-2% BSA por 1h a 37º C. Luego, las células

se lavaron y se incubaron con el segundo anticuerpo IgG de ratón conjugado a Alexa 488

(1:400), diluidos en PBS 2% BSA y protegidos de la luz. Los núcleos fueron teñidos con

Hoechst por 10 min a Tº ambiente. Finalmente, a los cubreobjetos se les agregó 10 µL de

medio de montaje anti apagamiento (DAKO) para extender el tiempo de decaimiento de

los fluoróforos. Las muestras así tratadas se observaron en microscopio confocal.

Ensayos de viabilidad celular

Se sembraron 2,0 x 104 células en placas de 24 pocillos y se mantuvieron por 24 h

en medio de cultivo DMEM suplementado con suero fetal bovino al 5% y aminoácidos no

esenciales. Se indujo estrés de RE agregando los agentes estresores del RE (Tm y Tg) a

las células en diferentes concentraciones y se mantuvieron por 24 h.

Para inducir privación de nutrientes, el medio de cultivo se reemplazó por EBSS

(Earle's Balanced Salt Solution) o RPMI, sin glucosa y sin suero, y se incubaron por 36,

24, 18, 12 ó 6 h según se indica. A continuación, se monitoreó la viabilidad celular usando

tinción con yoduro de propidio (PI) y análisis por citometría de flujo (FACS Canto A, BD),

como se describió con anterioridad (Hetz et al, 2002a). Para el análisis de las células

45

“hipo diploides” o “Sub-G1”, se incubaron las células por 24 h con los agentes inductores

de estrés de RE. Posteriormente, las células se tripsinizaron, y se fijaron y

permeabilizaron con metanol. Luego, las células se tiñeron con PI y se cuantificó la

población “Sub-G1” mediante análisis de citometría de flujo, como se describió

previamente (Hetz et al, 2002b). En paralelo, la apoptosis fue estimada mediante la

morfología nuclear, la cual se analizó por tinción con Hoechst 333342 (Molecular Probes)

y microscopía de epifluorescencia.

Para los experimentos de re-plaqueo de células, se sembraron 3,0 x 105 células en

placas de 3,5 cm y se trataron por 4 h con Tm 1 µg/mL. A continuación las células se

lavaron con PBS y fueron tripsinizadas. Luego, se sembraron 2 x 105 células MEFs en

placas de 10 cm y se cultivaron por 5 días en medio DMEM normal, suplementado con

suero al 5% y aminoácidos no esenciales. Cinco planos diferentes de cada condición

fueron fotografiados a los 2, 4 y 5 días mediante microscopía de luz y contraste de fase.

Luego, de los cinco días de cultivo en ausencia de Tm, las células cultivadas en las placas

se lavaron 3 veces con PBS, se fijaron con PFA 4% por 30 min a temperatura ambiente y

se tiñeron con cristal violeta por 30 min. Luego se lavaron 3 veces con agua destilada. Las

placas se dejaron secar y luego se escanearon.

Análisis por Western blot

Las células se colectaron en la solución tampón RIPA (Tris 20 mM [pH 8,0], NaCl

150 mM, SDS 0,1%, DOC 0,5%, y Tritón X-100 0,5%) suplementada con una mezcla de

inhibidores de proteasas (Roche, Basel, Switzerland). Luego, las muestras se

homogenizaron por sonicación. La concentración total de proteínas se determinó

mediante el ensayo micro-BCA (Pierce, Rockford, IL) (Hetz et al, 2006). Se cargaron entre

15 a 50 µg de proteínas totales en minigeles denaturantes al 4%, 6%, 8% y 12%,

dependiendo del peso molecular estimado de la proteína a analizar. Los anticuerpos

primarios y sus diluciones respectivas utilizadas, se detallan a continuación: anti-HSP90

1:4000, anti-ATF4 1:2000, anti-CHOP 1:2000, anti-BAX 1:2000, anti-MYC 1:1000, anti-

BCL-2 1:5000 (Santa Cruz), anti-BAK 1:2000 (Upstate Technology), anti-PERK 1:2000,

anti-caspasa-3 activada (Cell Signaling Technology), anti-PDI, anti-ERp57, anti-BiP, anti-

ERp72 1:2000 (StressGene), anti-EDEM 1:2000 (SIGMA), anti-HA 1:5000 (Roche), anti-

SERCA (Affinity Bioreagents), y anti-IP3-R1 y anti- IP3-R3 1:5000 (BD Biosciences). Los

46

anticuerpos secundarios anti-IgG de conejo o ratón (según corresponda) acoplado a la

ezima peroxidasa se utilizaron diluidos 1:3000 (Invitrogen).

Extracción de ARN y análisis mediante RT-PCR

Se extrajo ARN total de células y tejidos utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad,

CA). El ADNc se sintetizó con SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA) utilizando

partidores al azar p(dN)6 (Roche, Basel, Switzerland). Las reacciones de PCR en tiempo

real cuantitativo se realizaron utilizando el agente fluorescente SYBRgreen y el sistema

ABI PRISM7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las cantidades relativas de

ARNm se calcularon de los valores de ciclo umbral comparativo utilizando b-actina como

control de amplificación y normalizando los valores del ARNm de interés por el de actina.

Las secuencias de los partidores se diseñaron con el programa Primer Express software

(Applied Biosystems, Foster City, CA) o se obtuvieron de Primer Data bank

(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html). La mayoría de las reacciones de

PCR en tiempo real fueron descritas previamente (Lee et al., 2005). Adicionalmente,

utilizamos los siguientes partidores: TMBIM3, 5’-CCCTACCCTCAAGGAGGCTAC-3’ y 5’-

CTGGCGAATGTTCTTGTCCC-3’, de ratón; TMBIM3, 5’-GCTTAAGTTGAGGCGCAAAC-

3’ y 5’TTGAAAATCGGGATTCCTTG-3’, de Drosophila melanogaster; TMBIM3 5’-

ATTGTTGGAGTGGATTATGA-3’ y 5’-CAGGTTGTTAATCTGAACAT-3’, de pez cebra;

CHOP, 5’-ACCCTGAATCAGAAGCAGCCG-3’ y 5’-TACGACACGCTCCCACTCCT-3’, de

pez cebra; actina, 5’-ACACGACCCAGAGCATCAGGGAG y 5´-

CCTCTCTTGCTCTGAGCCTCA-3’, de pez zebra.

Para los ensayos de procesamiento del ARNm de xbp-1 en pez cebra se utilizaron

los siguientes partidores: 5´-GTTCAGGTACTGGAGTCCGA-3’ y 5’-

CTCAGAGTCTGCAGGGCCAG-3’.

Clonamiento del gen Tmbim3 de pez zebra (Danio rerio)

El 5’UTR y la parte de la región codificante de tmbim3 del pez cebra (zTmbim3) se

amplificaron por PCR utilizando ADNc de embriones 24 hpf (horas post fertilización). Se

diseñaron los siguientes partidores desde una secuencia conocida de zTmbim3 de pez

zebra (NM_201208):

47

- Sentido: 5´-GGGATGTTTACAGGAAGACGAG-3´.

- Reverso: 5´-ACAAACGCAGTGGTGATGG-3´.

Se clonó el producto de PCR en el vector pCRII-TOPO (Invitrogen, USA) (pCRII-

TOPO-z-tmbim3) y luego se secuenció para comprobar la fidelidad del producto obtenido.

Hibridización in situ e inmunofluorescencia de embriones de pez zebra

Se sintetizó una sonda ARN antisentido contra zTtmbim3, marcada con el

reportero DIG, utilizando la RNA polimerasa T7 y UTPs marcados con DIG (Roche)

usando como templado el pCRII-TOPO-z-tmbim3. La hibridización in situ del embrión

entero se realizó de acuerdo a protocolos estándares para pez zebra (Westerfield 1996).

Después de la tinción, los embriones marcados se montaron en glycerol al 100% y se

analizaron en un microscopio Nikon DIC (Eclipse 80i). Se hicieron ensayos de Caspasa 3

en embriones previamente fijados en paraformaldehído (PAF) al 4% toda lo noche a 4ºC,

y luego se transfirieron a metanol 100% y se dejaron nuevamente toda la noche a 4ºC. Se

utilizó el anticuerpo anti-caspasa 3 activada, concentración 1:200, (Cell signaling) y el

anticuerpo secundario contra conejo conjugado al fluoróforo Alexa-488 1:200 (Molecular

Probes). Para teñir núcleos se utilizó co-tinción nuclear, incubando por 1 h con la tinción

yodada To-Pro-31:1000 (642/661) (Molecular Probes). Los embriones se montaron en

glicerol y se analizaron mediante microscopía confocal en un microscopio Zeiss LSM-140

Axiovert 10.0. Las imágenes se procesaron utilizando el programa Image J

(http://rsb.info.nih.gov/ij/, NIH, USA).

Morfolino contra Tmbim3 de pez zebra

Los morfolinos oligonucleótidos antisentido (MO) fueron diseñados y sintetizados

por Gene Tools (Philomath, OR). Las secuencias son como se describe a continuación: 5’

GCCTGTATCCCTTATTCTGAGACAT-3’ (zTmbim3-MO) y el control 5’-

GCgTcTATCgCTTATTgTcAGACAT-3’ (mal apareamiento de bases, Mis-MO). Las letras

en minúscula indican los cambios de núcleotidos introducidos en la secuencia para

generar el mal apareamiento del morfolino control. La inyección del morfilino antisentido

se hizo a presión en los embriones Tübingen silvestre Tg (HuC::GFP) en estado de una

48

célula (1,5 a 4,5 ng por embrión) utilizando protocolos estándar (Park et al, 2000; Zhao et

al, 2006a).

Síntesis de ARN y ensayo de rescate en pez zebra

Se generaron secuencias de ARN sintético con el sistema T7 mMESSAGE

mMACHINE (Ambion) utilizando como templado el vector TMBIM3-pCT3.1 de ratón, el

cual fue linearizado, previamente con la enzima de restricción XhoI d. El ARNm sentido

(50 pg por embrión) se micro-inyectó en embriones de pez zebra en estado de una célula.

Para experimentos de rescate, los embriones de pez zebra fueron co-inyectados en

estado de una célula con una combinación de 50 pg de ARNm de mTmbim3 + 4,5 ng del

morfolino zTmbim3-MO, ó 50 pg del ARNm de gap43-Cherry-pCS2 + 4,5 ng del morfolino

zTmbim3-MO (o control). Los fenotipos se analizaron a 60-70% de epibolia y 24 hpf y

fueron fotografiados mediante microscopía de luz.

Ensayo de muerte celular in vivo en pez zebra

Para la detección de células apoptóticas in vivo, se inyectaron embriones silvestres

Tübingen en estado de 1 célula, con 1,5 ng del morfolino z-tmbim3-MO o del morfolino

control (mismatch-MO), y se mantuvieron por 24 h en medio E3 a 28,5 ºC. Después de

decorionarse, los embriones se incubaron con medio E3 suplementado con 2 mg/mL de

acridina orange por 30 min a 28,5 ºC, en placas de 24 pocillos (6 embriones por pocillo).

Luego de lavar 8 veces 5 min cada vez con medio E3 (Furutani-Selki M et al, 1996), los

embriones se anestesiaron con tricaína (Sigma-Aldrich) y los resultados se documentaron

mediante microscopía de fluorescencia. Todas las imágenes fueron tomadas exactamente

al mismo tiempo de exposición, ganancia y magnificación. El análisis de la región de

interés (ROI) se realizó en el área de la medula espinal y la cuantificación de la

fluorescencia se llevó a cabo con el programa Image J.

Para demostrar la pérdida de neuronas en el cerebro y la médula espinal, se

inyectaron embriones transgénicos Tg(ngn1::GFP) (Colombo et al, 2006) con 4,5 ng del

morfolino z-tmbim3-MO o morfolino control control-MO. Los embriones se incubaron por

24 h a 28,5 ºC. Para la adquisición de imágenes in vivo los embriones se montaron en

agarosa y se analizaron mediante microscopía confocal (Zeiss LSM-140 Axiovert 10.0).

49

Las imágenes fueron procesadas utilizando los programas Image J y Volocity

(Improvision).

Para evaluar el posible efecto protector de tmbim3 en condiciones de estrés de

retículo endoplásmico, se inyectaron los embriones de pez zebra con 50-100 pg del

ARNm de mTmbim3 o ARNm control (gap43-Cherry-pCS2). A continuación los

embriones se cultivaron en placas de 24 pocillos (6 embriones por placa) a 28,5º C, por 8

y 24 h en medio E3 suplementado con tapsigargina 1-5 µM. Finalmente, las células

apoptóticas se evaluaron en embriones vivos por tinción con acridina orange (8 hpf) o

mediante la determinación de cambios morfológicos en los embriones, asociados a

apoptosis (24 hpf).

Evaluación de toxicidad de Tm en Drosophila melanogaster

Las moscas se mantuvieron a 25º C en medio estándar con ciclos de luz-oscuridad

de 12x12 h. La línea Tub-Gal4/TM3-GFP se obtuvo del Bloomington Drosophila Stock

Center (Bloomington, Indiana). Las líneas UAS-ARNi se obtuvieron del Vienna Drosophila

RNAi Center (VDRC): UAS-TMBIM3RNAi (#28365) y UAS-BI-1RNAi (Dietzl et al, 2007). Para

los experimentos con ARNi, moscas hembra UAS-ARNi se cruzaron con moscas macho

Tub-Gal4/TM3-GFP. Larvas GFP positiva de segundo estadío (que no expresan el ARNi)

se separaron de las larvas GFP negativas (que expresan el ARNi) (Figura 5) y se

alimentaron por separado con Tm o DMSO (vehículo). En los experimentos de

sobrevivencia, un número indicado de larvas de segundo estadío del genotipo indicado

fueron alimentadas con 25 µg/mL de Tm o DMSO en alimento instantáneo de Drosophila

(Carolina Biological Supply 2700 York Burlington, NC). El número total de pupas, moscas

eclosionadas adultas y moscas sobrevivientes después de 5, 10 y 15 días se contaron y

se determinaron los porcentajes respecto del total. Para los experimentos de

inmunohistoquímica, se disectaron larvas en tercer estadío y se marcaron utilizando

protocolos convencionales (Walther & Pichaud, 2006; Wu & Luo, 2006). Brevemente, el

tejido se fijó con paraformaldehído al 4%, preparado en PBS, con Tritón al 0,3% por 30

minutos. A continuación, el tejido se bloqueó en Tritón al 0,3% en PBS y suero de oveja al

0,5% durante 1 hora. El tejido se incubó toda la noche con un anticuerpo anti-caspasa 3

activada 1:3000 (Cell signaling, rabbit) a 4°C, con rotación lenta. Después de lavar, se

agregó el anticuerpo secundario anti-conejo 1:200 conjugado a fluoresceína (Jackson

50

ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) y se incubó por 1 a 2 h a temperatura ambiente.

El tejido se montó con DAPI en una cámara y se analizó en un microscopio de spinning

disk.

Figura 5: Sistema de cruzas para obtención de moscas iRNA. Moscas hembra UAS-ARNi, heterocigotas (RNAi/RNAi, a la izquierda) se cruzaron con moscas macho Tub-Gal4/TM3-GFP (Izquierda). Luego, las larvas GFP positiva fueron separadas de las GFP negativas (iRNA) y mantenidas por separado con el fin de estudiar el efecto de la deficiencia del gen de estudio inducido por la expresión del RNAi regulado por la expresión del factor transcripcional Gal4, el cual se expresa bajo control del promotor de tubulina (Tub), de manera de obtener la expresión ubicua del RNAi.

Mediciones de Ca2+ citoplasmático

Las células se crecieron en cubreobjetos de vidrio y luego se cargaron con 1 µM

de la sonda de calcio Fluo-4 AM y se incubaron por 30 min a temperatura ambiente.

Luego se montaron los cubreobjetos en cámaras de 1 mL y se lavaron tres veces con

tampón libre de calcio (NaCl 150 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 10 mM, glucosa 10

mM y EGTA 5 mM, pH 7,4). Las señales de fluorescencia se registraron utilizando un

microscopio de fluorescencia invertido IX-81 (DSU, Olympus), equipado con una lámpara

de Xenón de 150-W (Olympus MT-20). La sonda Fluo-4 se excitó y se detectó con un

filtro FITC, utilizando un objetivo de inmersión en aceite a una magnificación de 40x y

apertura numérica 1,4 NA. Los cambios en el calcio citosólico se midieron en el campo

visual completo que contenía entre 15 a 30 células en promedio. Se adquirieron imágenes

cada 5 s y se analizaron utilizando los software Cell R (Olympus) e Image J. Las

51

intensidades promedio de las áreas celulares de interés se colectaron como F(t) y se

sustrajo la intensidad basal, utilizando una misma área de interés en una zona sin células

obteniendo la fluorescencia basal F(t)s. La señal de fluorescencia final se normalizó a la

fluorescencia basal F(0), como [F(t)s − F(0)]/F(0) (Gleason et al, 2004; Varela et al, 2007).

Mediciones de calcio en el retículo endoplásmico

Para mediciones de luminiscencia de Ca+2 se sembraron 5 × 104 células MEFs

silvestres (WT) en cubre-objetos de vidrio de 13 mm. Las células se co-transfectaron con

0,2 µg de la proteína sensora de Ca+2 reticular aequorina-ER (Pinton et al, 1998) y 0,8 µg

de TMBIM3-MYC o control MOCK, utilizando el agente para transfección Lipofectamina

LTX (Invitrogen). En el caso del estudio en las líneas celulares que expresan

establemente TMBIM3-MYC o su control MOCK, se transdujeron con Ad-aequorina-ER.

Luego de 24 h, las células fueron lavadas 3 veces con solución fosfato sin Ca2+, Glucosa

1g/L y 600 µg de EGTA. Luego, se adicionó al medio de lavado Ionomicina 1 µM y las

células se incubaron a 4°C por 5 min. Posteriormente, se agregó al medio celentazina N y

las células fueron incubadas 4°C. Una vez pasados 45 min, las células fueron lavadas 3

veces con solución de fosfato, sin Ca2+, EGTA 100 µM y BSA al 2%. Luego, las células

fueron montadas en el luminómetro y los fotones emitidos antes las distintas soluciones

perfundidas fueron determinados como se describió previamente (Visch et al, 2004). La

secuencia de perfusión fue la siguiente:

1) Solución sin Ca2+ con EGTA 100 µM por 20 s.

2) Solución sin Ca2+ con BSA al 2% por 180 s, EGTA 100 µM 40 s.

3) Solución sin Ca2+ con EGTA 100 µM 40 s.

4) Solución con Ca2+ 10 mM por 120 s.

5) Histamina 100 µM por 40 s.

6) Digitonina + Ca2+ 10 mM 100 s.

Ensayos de flujo de 45Ca2+ unidireccional

Los experimentos se hicieron en células MEFs WT y en aquellas que expresan

establemente TMBIM3-MYC crecidas en monocapas confluentes de células, como se

52

describió previamente (Rong et al, Mol Cell, 2008; Decuypere et al, Cell Calcium 2010). 2

x 105 células se sembraron en las palcas de 12 pocillos y se conservaron por 4 días en

condiciones normales de cultivo. Luego, las células se mantuvieron a 25°C en una placa

con termostato y agitación contante. Posteriormente, el medio de cultivo fue reemplazado

por 10 minutos con una solución compuesta por: KCl 120 mM, imidazole-HCl 30 mM (pH

6,8), MgCl2 2 mM, ATP 1 mM, EGTA 1 mM y saponina 20 µg/ mL. Luego, los reservorios

de Ca2+ no-mitocondriales se cargaron con Calcio radiactivo (45Ca2+) al incubarse las

células por 45 minutos con una solución compuesta por KCl 120 mM, imidazole-HCl 30

mM (pH 6,8), MgCl2 5 mM, ATP 5 mM, EGTA 0,44 mM, NaN3 10 mM y 150 nM de 45Ca2+

libre (28 µCi/mL). A continuación, las células se lavaron dos veces con 1 mL de la

solución de “flujo de salida”, la cual estaba compuesta por: KCl 120 mM, imidazole-HCl 30

mM (pH 6,8) y EGTA 1 mM, más thapsigarguina 4 µM (inhibidor de la bomba de Ca2+

SERCA). Luego, se agregó 500 mL de medio de “flujo de salida” y se reemplazó cada 2

min. Después de 10 min de pasar medio de flujo de salida, se aplicó diferentes

concentraciones de IP3 (pocillos 1 a 10) y 10 mM del ionóforo de Ca+2 A23187 (pocillos 11

y 12) por 2 min. Ocho minutos después, todo el 45Ca+2 remanente en los reservorios, se

liberó incubando con 1 mL de una solución de dodecil sulfato de sodio al 2% (w/v) por

30 min. Las diferencias entre las curvas de respuesta versus concentración se analizaron

mediante ANOVA de dos vías. De manera similar a la experiencia anterior, se realizaron

experimentos para determinar el contenido total de 45Ca2+-reticular entre ambos tipos

celulares. Sin embargo, la solución de “flujo de salida” se perfundio en ausencia de IP3.

Por otra parte, las células se cargaron en presencia de 10 µM del ionóforo de calcio

A23187, para determinar la unión no específica de 45Ca+2. La fuga específica de 45Ca+2

reticular se determinó restando el contenido de 45Ca+2 en presencia de A23187 10 mM al

contenido total de 45Ca+2.

Inmunoprecipitación

Todas las inmunoprecipitaciones se hicieron en tampón CHAPS 1 % (NaCl 150 mM,

KCl 100mM, Tris 50mM) como se describió previamente (Lisbona et al, 2009). En el caso

de las transfecciones transitorias en células HEK 293T, 3 x 105 fueron sembradas en

placas de 35 mm y cultivadas en medio DMEN suplementado con 5% de suero fetal

bovino. Luego de 24 h, las células fueron transfectadas con 2 µg de DNA total (1 µg

53

TMBIM3-MYC y 1 µg de MOCK o 1 µg TMBIM3-MYC y 1 µg de BI-1-HA) utilizando

efectine (Quiagen). Pasadas 48 h, las células fueron lavadas con PBS 1X y

posteriormente, fueron lisadas por 30 min en una solución tampón CHAPS 1% a 4° C.

Después, el lisado celular fue centrifugado por 5 min a 10.000 rpm y el sobrenadante fue

incubado con las esferas de sefarosa conjugadas covalentemente a IgG anti-MYC por 24

h a 4°C. Posteriormente, las esferas de sefarosa fueron centrifugadas, el sobrenadante

descartado, y se procedió a lavar las esferas con solución tampón CHAP 1% por tres

veces. Luego, se eluyeron los complejos proteicos inmunoprecipitados en 30 µL de

solución tampón CHAPS 1%, más péptido MYC 0,66 mg/mL por 30 min a T° ambiente,

seguidos de 5 min a 37°C y por último, 5 min a 4°C. Una vez finalizado esto, se procedió a

centrifugar las esferas de sefarosa por 2 min a 2000 r.p.m. El sobrenadante fue retirado,

descartando las esferas de sefarosa. Luego cada muestra fue analizada mediante

western blot.

Expresión de resultados y análisis estadístico

Los resultados presentados corresponden al promedio ± desviación estandar del

número de experimentos independientes indicados. En algunos casos las figuras o

imágenes corresponden a resultados representativos de cada grupo de experimentos

repetidos al menos 3 veces en forma independiente. La comparación estadistica entre

grupos se realizó usando el test de student; en algunos casos se realizó prueba ANOVA

de una vía con postest de Tukey o ANOVA de dos vías y postest de Bonferroni. Se

consideró como límite de significancia estadística, valores de p<0,05.

54

11) Resultados

11.1) TMBIM3 y el control de la apoptosis

11.1.1) Sobreexpresión de TMBIM3 y muerte celular inducida por estrés de RE.

Para estudiar el posible papel de TMBIM3 en la muerte celular, se procedió a

subclonar desde una biblioteca de cDNA el gen de tmbim3 de ratón en un vector pCR3.1,

el cual permite la expresión transitoria de la proteína TMBIM3 fusionada a un tag MYC.

Posteriormente, se evalúo la expresión y localización sub-celular de TMBIM3-MYC y se

comparó con la de TMBIM6-MYC. Con este fin, se procedió a transfectar fibroblastos

embrionarios de ratón (células MEFs; del inglés Mice embrionary fibroblast). Luego de 24

h pos-transfección, se evaluó su localización sub-celular mediante inmuno-fluorescencia y

microscopia confocal. Además, se realizó una co-tinción con Brefeldina A-bodipy, una

sonda fluorescente que permite teñir de rojo el RE y el aparato de Golgi. Los núcleos

fueron visualizados mediante la tinción con Hoescht (azul). Las imágenes de la figura 6

muestran que TMBIM3 presenta un patrón de localización sub-celular similar al de

TMBIM6, lo cual coincide con los análisis bio-informáticos que predicen la presencia de

una señal de retención en el RE en el c-terminal de TMBIM3 (Zhou et al, 2008).

Una vez determinada la localización sub-celular de TMBIM3 en las células MEFs,

el siguiente paso fue evaluar el efecto de TMBIM3 en la muerte celular. Con este fin, se

sobre-expresó TMBIM3-MYC mediante el uso de un vector retroviral, el cual permite la

expresión estable de la proteína en un grupo de células seleccionadas mediante la adición

al medio de cultivo del antibiótico puromicina. Una vez seleccionadas las células con el

antibiótico, se procedió a evaluar la expresión de TMBIM3 mediante western blot (Figura

7), en donde se inmunodetectó la proteína TMBIM3-MYC solo en las células transducidas

con los retrovirus TMBIM3-MYC, no así en las células transducidas con el vector viral

vacío.

55

Figura 6: Localización sub-celular de TMBIM3 en RE y aparato de Golgi. Para estudiar la localización sub-celular de TMBIM3-MYC y TMBIM6-MYC, se transfectaron las células MEFs con un vector de expresión que permite la expresión transitoria de TMBIM3-MYC o TMBIM6-MYC. Luego de 48 h, se evaluó la localización sub-celular de ambas proteínas mediante inmunofluorescencia indirecta y microscopía confocal. El RE fue teñido con Brefeldina A-Bodipy en rojo y los núcleos fueron teñidos con Hoescht (azul).

Figura 7: Expresión estable de TMBIM3-MYC en células MEFs. Las células MEFs se transducieron con retrovirus control (Mock) o con aquel que permite la expresión estable de TMBIM3-MYC. Luego de 48 h, las células transducidas se seleccionaron mediante la incubación con puromicina (0,3 µg/mL). Una vez seleccionadas las células, se procedió a estudiar la expresión de TMBIM3-MYC mediante western blot en extractos totales de proteínas. 30 µg de proteínas de cada línea celular fueron analizados en geles denaturantes de acrilamida al 12% (ver materiales y métodos). La expresión TMBIM3-MYC fue evaluada usando el anticuerpo 1º de ratón anti MYC (1:1000) y el anticuerpo secundario de conejo anti IgG de ratón (1:3000). Como control de carga, se evaluó la expresión de Hsp90 usando el anticuerpo 1º de conejo anti Hsp90 (1:3000) y el anticuerpo secundario de ratón anti IgG de conejo (1:3000).

Myc ER/Golgi MERGE Hoechst

TMBIM3

-MYC

TMBIM6

-MYC

95

43

TMBI

M3

Hsp90

MYC

MOCK

kDa

56

Posteriormente, se determinó la consecuencia de la sobreexpresión de TMBIM3-

MYC en la viabilidad celular de las células expuestas a diferentes condiciones de estrés,

la cual se determinó mediante tinción con Ioduro de propidio (PI) y análisis de citometría

de flujo. Con este fin, las células se incubaron con distintas dosis de agentes que inducen

estrés de RE: Tm (inhibidor de la N-glicosilación de proteínas) o Tapsigarguina (Tg,

Bloqueador de la bomba Ca2+/ATPasa). Además, se determinó el efecto de otros

estímulos que no inducen estrés de RE, pero si muerte celular por apoptosis, incluyendo:

Etopósido (Eto, daño al DNA), Estaurosporina (Sts; inhibidor general de tirosinas

quinasa), privación de nutrientes o suero y exposición a Factor de Necrosis Tumoral α

(TNFα; estímulo de apoptosis extrínseca). Sorprendentemente, la sobreexpresión de

TMBIM3-MYC disminuyó significativamente la muerte inducida por estrés de RE. Sin

embargo, no se observaron diferencias entre las células control (MOCK) y aquellas que

sobre-expresan TMBIM3-MYC, cuando estas se expusieron a los estímulos que no

inducen muerte celular mediada por estrés de RE (Eto, Sts, TNFα, privación de

nutrientes), lo cual se observa en la Figura 8.

Figura 8: Efecto de la sobreexpresión de TMBIM3 en la muerte celular inducida por diferentes tipos de estrés celular. Las células que sobre-expresan TMBIM3 y su respectivo control (MOCK) se sembraron en placas de 48 pozos a una concentración de 20 x 105 células por pozo. Luego de 24 h, las células se incubaron en presencia de Tm (0,25 y 1 µg/mL), Tg (0,1 y 1 µM), TNFα (1 ng/mL), Eto (4 µM) y Sts(1 µM). Para evaluar el efecto de la privación de nutrientes, el medio de cultivo (DMEN, 5% suero fetal bovino, aminoácidos no esenciales y poli-glutamina) se sustituyó por medio de cultivo sin suero y sin aminoácidos no esenciales o por medio EBSS, el cual no posee suero, aminoácidos, ni glucosa. Luego de 24 h, las células se tripsinizaron y la muerte celular se analizó midiendo la incorporación de ioduro de propidio (PI) mediante citometría de flujo. La figura muestra los promedios y desviación estándar de 3 o 4 experimentos independientes entre sí. Las diferencias estadísticas fueron analizadas mediante ANOVA (*P<0,05; **P<0,01).

24 h 48 h 24 h 48 h Privación de nutrientes

0

20

40

60

80

100

Cél

ulas

PI p

ositi

vas

(%)

Privación de suero Co

ntro

l TN

Fa

Eto

St

s

***

Tm (µg/ml) Tg (µM) Cont

rol 0,1 1

0

20

40

60

Cél

ulas

PI p

ositi

vas

(%)

*

0,25 1

MOCK TMBIM3-MYC

***

57

El efecto en la muerte celular de la sobreexpresión de TMBIM3 bajo condiciones

de estrés de RE, se validó mediante la cuantificación de la población apoptótica hipo

diploide “sub-G1” a través de la tinción con PI y análisis de citometría de flujo. En esta

experimento, se determinó que las células que sobreexpresan TMBIM3-MYC

experimentan menos apoptosis que las células controles al ser expuestas a estrés de RE.

Del mismo modo a lo observado en la cuantificación de la muerte celular, no se

observaron diferencias significativas entre ambas líneas celulares al ser expuesta a los

estímulos no relacionados con estrés de RE (Figura 9).

Figura 9: Efecto de la sobreexpresión de TMBIM3 en la apoptosis inducida por estrés de RE. Las células TMBIM3 y MOCK se estimularon de la misma forma descrita en la figura 8. La población Sub-G1 se analizó en células fijadas y permeabilizadas con Metanol y teñidas posteriormente con PI. El contenido de DNA se evalúo mediante citometría de flujo. Las figuras representan el promedio y la desviación estándar de 3 o 4 experimentos independientes entre sí. Las diferencias estadísticas fueron analizadas mediante ANOVA y postest de Tukey (*P<0,05).

Por otra parte, se investigó el efecto de la sobreexpresión de TMBIM3-MYC en

células expuestas a una condición aguda de estrés de RE y posterior pos-cultivo en

ausencia de agentes estresores. De esta manera, las células se expusieron a 1 y 2,5

µg/mL de Tm por un periodo de 4 h. Posteriormente, las células se lavaron con PBS, se

tripsinizaron y luego se sembraron (2 x 105 células por pozo) para ser cultivadas en

ausencia de la Tm. Así, se evaluó la proliferación y capacidad de adaptarse y sobrevivir a

una exposición transitoria a un agente inductor de estrés de RE. La figura 10 muestra que

la sobreexpresión de TMBIM3 protegió significativamente de la toxicidad de Tm,

Sub-

G1

(%)

0

20

40

60

MOCKTMBIM3

TgControl Tm

*

Control Eto Sts0

20

40

60

80

100

Sub-

G1

(%)

58

habiéndose evaluado la proliferación celular a los 2, 4 y 5 días post-exposición al agente

estresor y finalmente, se realizo la tinción de la placa de cultivo con cristal violeta. Dado la

diferencia observada entre ambos tipos celulares, se evaluó sí la sobreexpresión de

TMBIM3-MYC incrementa por sí sola la proliferación de las células MEFs en condiciones

basales. No se observaron diferencias (Figura 11) en la proliferación de ambos tipos

celulares. Considerando estos resultados en conjunto, se sugiere un papel especifico de

TMBIM3 en el control de la muerte celular inducida por estrés de RE.

Figura 10. Efecto de la sobreexpresión de TMBIM3 en la sobrevida bajo condiciones de estrés de RE. Se sembraron 3.5 x 105 células en placas de 6 pozos. Después de 24 h, las células se incubaron por 4 h con las dosis indicadas de Tm. Posteriormente, las células se lavaron 3 veces con PBS, se tripsinizaron y 2.0 x 105 células se sembraron y cultivaron en ausencia de Tm. Luego, las placas se fotografiaron y el número de células por mm2 fue cuantificado a los 2, 4 y 5 días. Al finalizar el experimento, se procedió a fijar las células en la placa con PAF y posteriormente, se tiñeron las células con cristal violeta. El grafico de la derecha muestra el promedio y desviación estándar de 3 experimentos independientes entre sí. Las diferencias estadísticas fueron analizadas mediante ANOVA y postest de Tukey (*P<0,05).

Figura 11. Efecto de la sobreexpresión de TMBIM3-MYC en la proliferación celular. Para medir la proliferación celular de la línea celular control y la línea celular MOCK y aquella que sobreexpresa TMBIM3-MYC, se sembraron 5 x 104 células en placas de 12 pozos. Luego, las células se tripsinizaron y se contaron cada 24 h en una cámara de Nuebaur, previa tinción con azul de tripán. La figura representa el promedio y la desviación estandar de tres experimentos independientes entre sí.

MOCK

TMBIM3-MYC

Control 1 2,5

Tm (µg/ml)

0

100

200

300

2 4 5Tiempo (Días) Nú

mer

o de

cél

ulas

/mm

2

*MOCKTMBIM3

0

50

100

150

200

1 2 3 4

TMBIM3MOCK

Tiempo (Días)

Núm

ero

de c

élul

as

59

11.1.2) Efecto de la deficiencia de TMBIM3 y TMBIM6 en la viabilidad celular.

Para evaluar la actividad antiapoptótica de TMBIM3 endógeno y ensayar, además,

un posible efecto aditivo o sinérgico con TMBIM6 en la regulación de la muerte celular, se

utilizaron dos short hairpin RNA (shARN) destinados contra el ARNm de tmbim3

(shRNA#1 y shARN#2), los que fueron entregados a las células mediante un vector

lentiviral. La eficiencia de ambos shRNA se evalúo mediante PCR en tiempo real. Como

control se utilizó un lentivirus que permite la expresión de un shARN destinado contra el

ARNm de luciferasa (shLuc). Las células transducidas con los shRNA destinados contra

tmbim3#1 y #2 arrojaron distintos niveles de disminución del ARNm de m-Tmbim3, siendo

su eficiencia en la reducción del ARNm de m-Tmbim3 cercana al 65 y 90%,

respectivamente (Figura 12).

Figura 12: Generación de células “knock down” para tmbim3. Las células MEFs wild type y knock out para tmbim6 (TMBIM6 WT y TMBIM6 KO, respectivamente) se transducieron con lentivirus que codifican shRNA destinado contra el ARNm de luciferasa (control) y dos shRNA destinados contra el ARNm de tmbim3 (sh#1 y sh#2). Luego de 48 h de transduccion, las células fueron seleccionadas con puromicina (0,3 µg/mL). Los valores de expresión del ARNm de tmbim3 se evaluaron en extractos de ARN total mediante RT-PCR en tiempo real, y fueron relativizados a los niveles de ARNm de actina, siendo considerado los controles como 100%. La figura representa el promedio y desviación estandar de tres determinaciones independientes entre sí.

shLuc sh#1 sh#2

Nive

les

de A

RNm

de tm

bim

3(%)

0

20

40

60

80

100

120

TMBIM3

TMBIM6 WTTMBIM6 KO

60

Las células TMBIM6 WT se transducieron transitoriamente con los lentivirus y no

se detectaron cambios morfológicos, ni tampoco cambios en la viabilidad celular (Figura

13). Sin embargo, la reducción de los niveles del ARNm de tmbim3 en las células TMBIM6

KO, indujó una disminución del tamaño celular y pérdida de la adhesión, lo cual se

observó mediante microscopía de contraste de fase (Figura 13). Tomando esto en

consideración, se procedió a cuantificar el efecto de la disminución de los niveles del

ARNm de tmbim3 en la muerte celular en las células TMBIM6 WT y TMBIM6 KO, lo cual

fue evaluado mediante incorporación de PI y análisis de citometría de flujo, observándose

un aumento significativo en la muerte celular inducida por el shRNA más eficiente en la

reducción de los niveles de m-Tmbim3 (Figura 13).

Figura 13: La disminución de los niveles de tmbim3 y su efecto en la muerte celular. Un número equivalente de células TMBIM6 WT y KO se transducieron con vectores lentivirales de expresión de shLuc, shTmbim3#1 o shTmbim3#2 y se cultivaron en medio suplementado con un 0,5% de suero fetal bovino. 4 días después, las células fueron fotografiadas con microscopia de contraste de fase (panel izquierdo) y la viabilidad celular fue determinada evaluando la incorporación de PI mediante citometría de flujo. El gráfico de la derecha muestra los promedios mas la desviación estándar de tres o cuatro experimentos independientes entre sí. Las diferencias estadísticas fueron analizadas mediante ANOVA y postest de Tukey (*=P<0,05).

61

Además, la inducción de apoptosis espontánea se validó mediante la

cuantificación de núcleos condensados y fragmentados, corroborándose que la doble

deficiencia de TMBIM3 y TMBIM6 afecta directamente la viabilidad celular, mediante la

inducción de apoptosis (Figura 14).

Figura 14: Efecto de la doble deficiencia de TMBIM3 y TMBIM6 en la apoptosis espontánea en células MEFs. Las células se trataron de la manera descrita en la figura 13. Luego, los núcleos fragmentados y condensados se fotografiaron con microscopía de epifluorescencia, previa tinción con Hoechst (fotos de la izquierda). La barra en el extremo inferior izquierdo representa 10 µM. La apoptosis se cuantificó mediante la estimación de los núcleos condensados y fragmentados (porcentaje respecto del total de núcleos). El gráfico de la derecha muestra el promedio y la desviación estándar de tres o cuatro experimentos independientes entre sí. Las diferencias estadísticas fueron analizadas mediante ANOVA y postest de Tukey (**=P<0,01; ***=P<0,001).

11.1.3) Efecto de la deficiencia de TMBIM3 en la muerte celular inducida por

distintos estímulos de estrés.

Para evaluar el probable efecto de la deficiencia de tmbim3 en la muerte celular

inducida por estrés de RE, las células TMBIM6 WT y KO fueron transducidas con los

lentivirus, y posteriormente seleccionadas, de manera que se expresará establemente el

shLuc (control) y los shTmbim3#1 y #2. De acuerdo con lo observado anteriormente, la

selección estable del shRNA más eficiente (#1) no fue viable en el tiempo cuando se

realizó en las células TMBIM6 KO. Por esta razón, se determinó el efecto del shRNA#2 en

la viabilidad celular de las células expuestas a estrés de RE inducido por el tratamiento

TMBIM6 KO shLuc

TMBIM6 KO shTmbim3#1

Apop

tosi

s (%

)

0

5

15

20

25

shLuc #1 #2

*****

10

shTmbim3

TMBIM6 WTTMBIM6 KO

62

con Tm (Figura 15) o Tg (Dato no mostrado). La figura 15 muestra que la disminución de

los niveles del ARNm de tmbim3 en las células TMBIM6 KO incrementó la muerte celular

cuando se expuso estas células a condiciones de estrés de RE. Sin embargo, no se

observaron diferencias cuando se cuantificó la muerte celular en las células TMBIM6 WT.

Figura 15: Efecto de la deficiencia de TMBIM3 y/o TMBIM6 en la muerte celular inducida por estrés de RE. Células TMBIM6 WT (gráfico de la izquierda) y KO (grafico de la derecha) que establemente expresan shLuc o shTmbim3 se expusieron a las dosis indicadas de Tm. Lugo de 24 h, se determinó la viabilidad celular mediante la evaluación de PI por citometría de flujo. Los gráficos representan 3 experimentos independientes entre sí y se grafica el promedio más la desviación estándar. El análisis de Anova de dos vías arrojo que las curvas del gráfico de la derecha (TMBIM6 KO: shLuc versus shTMBIM3) presentan diferencias estadísticamente significativa. Las diferencias estadísticas fueron analizadas mediante prueba ANOVA de dos vías (P<0,001).

Por otra parte, cuando se ensayó el efecto de otros estímulos que inducen muerte

celular que no se relacionan con la generación de estrés de RE (Eto, Sts, TNFα) no se

observaron diferencias en la muerte celular evaluada por incorporación de PI y análisis de

citometría de flujo, tanto en la células TMBIM6 y aquellas doble deficientes en TMBIM6 y

TMBIM3 (Fig 16).

0

20

40

60

0 0,1 1Tm (µg/ml)

Célu

las

PI p

ositi

vas

(%)

0,01

shLucshTMBIM3

TMBIM6 WT TMBIM6 KO

0

20

40

60

0 0,1 1Tm (µg/ml)

Célu

las

PI p

ositi

vas

(%)

0,01

shLucshTMBIM3

63

Figura 16: Efecto de la disminución de tmbim3 en los niveles de muerte de células MEFs expuestas a estímulos que inducen apoptosis. Del mismo modo a lo descrito en 15, las células fueron expuestas Eto (4 µM), Sts (1 µM) o TNFα por 24 h y la viabilidad celular fue determinada analizando la incorporación de PI mediante citometría de flujo. Las figuras muestran el resultado de tres experimentos independientes entre sí y se grafica el promedio y la desviación estándar. Ninguna diferencia significativa fue encontrada al comparar shLuc versus shTMBIM3 usando ANOVA y postest de Tukey.

Además, para ensayar la posible redundancia respecto a la actividades

antiapoptóticas de TMBIM3 y TMBIM6, se procedió a sobre-expresar establemente

TMBIM3 en células TMBIM6 KO y posteriormente se midió la muerte celular inducida por

estrés de RE. De este modo, se observó que la sobreexpresión de TMBIM3-MYC

disminuyó parcialmente la muerte de las células deficientes en TMBIM6 expuestas a Tm y

Tg (Figura 17).

Figura 17: Efecto de la sobreexpresión de TMBIM3-MYC en células TMBIM6 KO y muerte celular inducida por estrés de RE. TMBIM3 fue expresado establemente en las células TMBIM6 KO mediante la transducción de un vector retroviral. Luego, las células fueron incubadas por 24 h con Tm (100 ng/mL) o con Tg (100 nM). Luego, la viabilidad celular fue determinada mediante MTS. Los valores fueron relativizados al control de cada

0

25

50

75

100

Control Eto Sts TNFαCélu

las

PI p

ositi

vas

(%)TMBIM6 WT TMBIM6 KO shLuc

shTMBIM3

0

25

50

75

100

Control Eto Sts TNFαCélu

las

PI p

ositi

vas

(%)

64

línea celular (100%). El grafico, muestra el promedio ± desviación estándar de un experimento representativo hecho en triplicado (n=2).

Debido al efecto sinérgico en la regulación de la muerte celular observado entre

TMBIM3 y TMBIM6, se procedió a evaluar la posible interacción entre ambas proteínas

mediante un ensayo de co-inmunoprecipitación. Con este fin, se expresó transitoriamente

TMBIM3-MYC y TMBIM6-HA en células HEK293T y se procedió a inmunoprecipitar

TMBIM3-MYC desde un extracto total de proteínas. Posteriormente, se evaluó la co-

inmunoprecipitación de TMBIM6 mediante Western blot, como lo muestra la figura 18, lo

cual sugiere que ambas proteínas forman parte de un complejo proteico.

Figura 18. Estudio de la posible formación de un complejo proteico entre TMBIM3-MYC y TMBIM6-HA forman un complejo. Las células HEK 293T fueron transfectadas con vectores de expresión para TMBIM3-MYC y TMBIM6-HA. 48 h despues, las células fueron lisadas en una solución de lisado (CHAPS 1%, NaCl 150 mM, Kcl 40 mM, ) por 30 min a 4ºC con agitación constante. Luego, este lisado fue centrifugado por 5 min a 10000 r.p.m. y el sobrenadante fue incubado por 2 h con esferas de sefarosa acopladas covalentemente a un anticuerpo IgG anti-MYC, de manera de inmunoprecipitar TMBIM3-MYC. Posteriormente, las esferas de sefarosa fueron lavadas 3 veces con la solucion CHAPS (1%) y se procedio a eluir los complejos proteicos acoplados a los anticuerpo IgG anti-MYC por adición del péptido MYC 10 μM (30 min a temperatura ambiente con agitación constante). Luego, el sobrenadante fue removido de las esferas de sefarosa y las proteínas inmunoprecipitadas fiueron analizadas por western blot en geles de acrilamida al 12%. La co-inmunoprecipitación de TMBIM6-HA fue determinada usando el anticuerpo de raton 1º anti-HA (1:2000, Roche) y la inmunoprecipitación de TMBIM3-MYC fue determinada usando el anticuerpo 1º de ratón anti-MYC (1:2000, santa cruz). El asterisco (*) muestra la señal dada por la cadena liviana de la IgG utilizada en la inmunoprecipitación.

20

20

43 IP: MYC WB:Myc

IP: MYC WB:HA

*

*

WB:HA Extracto total

pCDNA3 TMBIM3-MYC

TMBIM6-HA

+ - - + + +

kDa

65

11.2) TMBIM3 y su regulación transcripcional

11.2.1) Regulación de la expresión de TMBIM3 bajo condiciones de estrés de RE.

Los resultados obtenidos sugieren que la expresión de TMBIM3 regula la muerte inducida

por estrés de RE. Por otra parte, el estrés de RE puede inducir apoptosis mediante

diversos mecanismos, uno de los cuales se caracteriza por el control transcripcional de

genes relacionados con la apoptosis a través de las señales rio abajo reguladas por la

UPR (Tabas & Ron, 2011). Considerando esto, se procedió a evaluar los niveles de

expresión del ARNm de tmbim3 en células MEFs expuestas a estrés de RE, mediante

PCR en tiempo real. De esta manera, se observó un aumento significativo del ARNm de

tmbim3 en células expuestas a estrés de RE, cercano a nueve veces. Este perfil de

aumento en la expresión fue similar a lo observado para erdj4, otro gen regulado por la

UPR (Lisbona et al, 2009) (Figura 19).

Figura 19: Cambios en los niveles de el ARNm de tmbim3 en condiciones de estrés de RE en células MEFs. Células MEFs fueron expuestas a 1 µg/mL de Tm por 4, 8, 16 y 24 h. Luego, desde extractos de RNA total, se determinó los niveles del ARNm de tmbim3 mediante PCR en tiempo real. El grafico muestra el promedio y la desviación estándar de tres experimentos independientes entre sí. Se graficó los niveles de ARNm de tmbim3 y erdj4 relativos a los niveles de ARNm de actina. Los asteriscos *** y ** indican los valores P de los niveles de ARNm de tmbim3 a los tiempos indicados comparados con los niveles de ARNm tmbim3 en el control. Las diferencias estadísticas fueron analizadas mediante ANOVA y postest de Tukey (**=P<0,01; ***=P<0,001).

0

3

6

9

12

15

0 8 16 24Tiempo (h)

*****

Nive

les

de A

RNm

erdj4tmbim3

66

0

3

6

9

12

15

0 8 16 24Tiempo (h)N

ivel

es d

e A

RN

mde

tmbim3

PERK KOPERK WT

WB: HSP90

WB: PERK

PERK: WT KO

!

kDa

70

130 kDa

70

35

PERK: + - + - + - + -Tm (h): 0 4 8 16

WB: CHOP

WB: HSP90

PCR: XBP1

!

PERK: + - + - + - + -Tm (h): 0 4 8 16

WB: CHOP

WB: HSP90

PCR: XBP1

!

pb 200

Posteriormente se procedió a estudiar qué vía de la UPR podría estar

involucrada en la regulación de la expresión del ARNm de tmbim3. Las señales celulares

reguladas por el sensor de estrés PERK, han sido vinculadas a la mantención de la

sobrevida celular, así como a la inducción de apoptosis, a través de la regulación de

distintos componentes, incluyendo la atenuación de la traducción mediante la fosforilación

del eIF2α y la regulación de genes relacionados con la apoptosis (Tabas & Ron, 2011),

respectivamente. Con este fin, se procedió a estudiar la regulación de tmbim3 en células

WT y células deficientes en PERK. Las células se incubaron con 1µg/mL de Tm por

distintos tiempos y se observó mediante PCR en tiempo real una atenuación en el

aumento del ARNm de tmbim3 en aquellas células deficientes en la expresión PERK

(Figura 20). Además, de manera de controlar que ambos tipos celulares son sensibles al

estrés de RE, se procedió a evaluar el procesamiento del ARNm de xbp-1 mediante RT-

PCR y la expresión de CHOP mediante western blot (Figura 20). Además, se estudió el

aumento del ARNm de bip y chop, donde se observó una completa atenuación del

incremento de estos ARNs mensajeros en las células PERK KO al ser comparadas con

las células PERK WT (Figura 21).

Figura 20: Efecto de la deficiencia del sensor de estrés de RE PERK en el incremento del ARNm de tmbim3 inducido por estrés de RE. La expresión de PERK fue evaluado mediante western blot en las células deficientes en PERK (PERK KO) y su respectivo control (PERK WT) (Panel de la izquierda). Luego, ambos tipos de células fueron expuestas a 1 µg/mL de Tm por 4, 8, 16 y 24 h. Posteriormente, la expresión del ARNm de tmbim3 fue determinada mediante PCR en tiempo real. En el panel de la derecha, el procesamiento del ARNm de xbp-1 fue determinado mediante RT-PCR y la inducción de CHOP, fue determinado mediante western blot. La expresión de Hsp90 fue evaluada como control de carga en el western blot.

67

Figura 21: Niveles de los blancos transcripcionales de la UPR en las células PERK WT y KO expuestas a estrés de RE. Células PERK WT y KO fueron expuestas a 1µg/mL Tm por 4, 8, 16 y 24 h. Luego, los niveles de ARNm de chop y bip fueron analizados mediante PCR en tiempo real. Los gráficos muestran el promedio de los niveles de ARNm de chop y bip expresados en niveles relativos al ARNm de actina de un experimento representativo hecho en triplicado.

Además, se estudió la posible participación de la vía controlada por el sensor de

estrés IRE1α en el control transcripcional de la expresión del ARNm de tmbim3. Con este

fin, se utilizaron células MEFs deficientes en IRE1α (IRE1α KO) y células IRE1α KO que

expresan establemente IRE1α con un tag HA (IRE1α-HA). La expresión de IRE1α-HA se

evalúo mediante western blot, como lo muestra la figura 22. De manera de estudiar si la

expresión estable de IRE1α-HA es funcional bajo condiciones de estrés de RE, se

procedió a estudiar si el ARNm de xbp-1 podía ser procesado en respuesta a estrés de

RE inducido por incubación de las células con la Tm. La figura 22 muestra que, en

contraste con las células IRE1α KO, la expresión de IRE1α-HA restauró el procesamiento

del ARNm de xbp-1 cuando las células se expusieron a Tm por distintos tiempos (Figura

22).

En concordancia con la inducción del procesamiento del ARNm de xbp-1, se

observó el aumento del ARNm de erdj4 un blanco de XBP-1 (Figura 23). Sin embargo, no

se observaron diferencias en el incremento del ARNm de tmbim3 inducido bajo

Nive

les

de A

RNm

chop

Tiempo (h)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

0 8 16 240

0,6

1,2

1,8

Nive

les

de A

RNm

de b

ip

0 8 16 24

Tiempo (h)

PERK KOPERK WT

PERK KOPERK WT

68

condiciones de estrés de RE entre las células deficientes en IRE1α y su respectivo control

reconstituido. De esta manera, se puede sugerir que la vía regulada por el sensor de

estrés PERK, específicamente, controla el aumento en la expresión del ARNm de tmbim3

bajo condiciones de estrés de RE, sin ser necesaria la participación de la vía regulada por

IRE1α.

Figura 22: Re-expresión de IRE1α en células deficientes para IRE1α . Las células IRE1α KO fueron transducidas con un vector retroviral para inducir la expresión estable de IRE1α-HA o del vector vacio (MOCK). Luego, la expresión de IRE1α-HA fue determinada mediante western blot (Panel izquierdo). Hsp90 fue utilizado como control de carga. Luego, las células fueron expuestas a 1 µg/mL de Tm por 4, 8, 16 y 24 h y el procesamiento del ARNm de xbp-1 fue determinado mediante RT-PCR (panel de la derecha). Las figuras muestran un experimento representativo de 2.

Figura 23: Efecto de la expresión del sensor de estrés IRE1α en la regulación del ARNm de tmbim3 bajo condiciones de estrés de RE. Las células IRE1α KO e IRE1α-HA fueron expuestas a 1 µg/mL de Tm por 4, 8, 16 y 24 h. Luego los niveles de ARNm de tmbim3 (izquierda) y erdj4 (derecha) relativos a actina fueron evaluados mediante PCR en tiempo real. Los gráficos muestran el promedio y desviación estándar de un experimento representativo hecho en triplicado.

Nive

les

de m

RNA

de tm

bim

3

Tiempo (h)

0

3

6

9

12

15

0 8 16 24 Nive

les

de m

RNA

de e

rdj4

0

0,1

0,2

0,3

IREα KO + IRE1αHAIREα KO + MOCK

0 8 16 24

Tiempo (h)

IREα KO + IRE1αHAIREα KO + MOCK

95

175

Hsp90

HA

IRE1α KO : IRE1α-HA: + - + - + - + - Tm (h): 0 4 8 16

MOCK

IR

E1α-

HA

XBP-1u XBP-1s

IRE1α KO

100 pb

kDa

69

Por otra parte, es sabido que la activación de PERK resulta en el control de una

vía transduccional que se ha relacionado con la mantención de la sobrevida bajo

condiciones de estrés de RE (Harding et al, 2000). De esta manera, se evaluó el impacto

de la ausencia de perk en la sobrevida de las células expuestas a estrés de RE,

observando una mayor muerte celular en las células deficientes en PERK, al ser

comparadas con las células control (Figura 24).

Figura 24: Efecto de la deficiencia de PERK en la viabilidad de las células expuestas a estrés de RE. Las células PERK WT y PERK KO fueron expuestas a las dosis indicadas de Tm por 24 h. Luego, la viabilidad fue evaluada mediante la determinación de incorporación de PI y análisis de citometría de flujo. El gráfico muestra el promedio y la desviación estándar de cuatro determinaciones independientes entre sí. Las diferencias estadísticas fueron analizadas mediante ANOVA y postest de Tukey (***=P<0,001).

Adicionalmente, se evaluó el efecto de la sobreexpresión de TMBIM3-MYC en la

inducción de ATF4 y CHOP, los cuales son factores transcripcionales cuya expresión es

controlada positivamente río abajo de la activación de PERK. Con este fin, se cultivaron

las células que sobre-expresan TMBIM3 y las células control MOCK en presencia de Tm

(1 µg/mL) por distintos tiempos, y se evaluó la expresión de ATF4 y CHOP mediante

western blot. No se observaron diferencias significativas entre las células control y

aquellas que sobreexpresan TMBIM3, como lo muestra la figura 25.

Tm (µg/ml)

0

20

40

60

80

100Cé

lula

s PI

pos

itiva

s (%

)PERK WTPERK KO

10,1

***

*

0

***

70

Figura 25: Efecto de la sobreexpresión de TMBIM3 en marcadores de la UPR. Las células que sobre-expresan TMBIM3 y su respectivo control (MOCK) fueron expuestas a 1 µg/mL de Tm por 2, 4, 6 y 8 h. Luego, la inducción de ATF4 y CHOP fue analizado mediante western blot desde extractos totales de proteínas. Hsp90 fue determinada como control de carga. Los paneles de abajo, muestran un experimento representativo y los gráficos superiores muestran la cuantificación de las bandas relativas a los niveles de Hsp90 para cada muestra (n=3; promedio + desviación estandar).

11.2.2) Regulación de la expresión de tmbim3 inducida por estrés de RE in vivo.

Con el fin de evaluar la regulación de la expresión de tmbim3 bajo condiciones de

estrés de RE in vivo, se inyectaron intraperitonealmente ratones con una dosis única de

Tm. De esta manera, se evaluó el efecto de distintas concentraciones de Tm en los

niveles de expresión del ARNm de tmbim3 en riñón e hígado mediante RT-PCR semi-

cuantitativo. Un fuerte incremento del ARNm de tmbim3 se observó en los riñones de

ratón después de 16 h de la inyección de Tm (Figura 26). En forma paralela, se determinó

mediante RT-PCR el procesamiento del ARNm de xbp-1, así como el incremento del

ARNm de chop.

1.5 1.5

0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 h (Tm 1µg/mL)

MOCK TMBIM3

0.5 1

1.5 2

2.5 0 5

10 15 20

Niv

eles

de

CH

OP

(U.A

.)

Niv

eles

de

ATF4

(U

.A.)

25

55

95

34 kDa

WB: ATF4

WB: CHOP

WB: Hsp90

71

Posteriormente, se determinó la contribución de la vía de PERK y ATF4 en el

control transcripcional del ARNm de tmbin3 in vivo. Con este fin, se expusieron ratones

atf4-/- y ratones atf4+/+ a Tm inyectada intraperitonealmente y se analizó la expresión del

ARNm de tmbim3 mediante RT-PCR semi-cuantitativo y PCR en tiempo real. La figura 27

muestra la inducción del mensajero de tmbim3 en los ratones atf4+/+ expuestos a Tm. Sin

embargo, este incremento se ve disminuido en los ratones atf4-/-. Como control se

determinaron los niveles de actina como control de carga. El mismo efecto en la inducción

del ARNm de tmbim3 se observó en la cuantificación hecha mediante PCR en tiempo real,

como lo muestra la figura 27, en donde se observa una diminución significativa de los

niveles de ARNm de tmbim3 en los ratones atf4-/- comparados con los ratones atf4+/+ al

ser expuestos a Tm mediante inyección intraperitoneal.

De esta manera, de logró determinar que el mRNA de tmbim3 es incrementado

bajo condiciones de estrés de RE y que esta regulación depende de la vía regulada por

PERK y del factor transcripcional ATF4. Este fenómeno ocurre tanto en cultivos celulares

de células MEFs expuestas a estrés de RE inducido por Tm, así como en riñones de

ratones expuestos a inyecciones intraperitoneales de Tm.

Figura 26: Estudio de los niveles de ARNm de tmbim3 en riñones de ratones expuestos a estrés de RE in vivo. Ratones fueron inyectados intraperitonealmente con Tm a las dosis indicadas. 16 h después, los riñones fueron extraídos y el RNA total fue aislado. Posteriormente, se procedió a determinar los niveles de ARNm de tmbim3 y chop mediante RT-PCR. El procesamiento del ARNm de xbp-1 fue analizado para controlar la inducción de estrés de RE mediante RT-PCR, así como los niveles de ARNm de chop Y los niveles de ARNm de actina fueron determinados como control de carga. La figura muestra el resultado de un experimento realizado.

Riñón (Tm µg/g)

Actina

pb

72

Figura 27: ATF4 y el control de la expresión de tmbim3 en respuesta a estrés de RE in vivo. Ratones atf4+/+ y ratones atf4-/- fueron inyectados intraperitonealmente con Tm por 16 h. Luego, desde extractos totales de RNA de riñón, se procedió a analizar la expresión del ARNm de tmbim3. La figura de la derecha muestra los niveles de expresión de tmbim3 analizados mediante qPCR. El gráfico de la derecha, muestra el análisis determinado mediante PCR en tiempo real. Los niveles de ARNm de tmbim3 son graficados en relación a los niveles de actina. Las diferencias estadísticas fueron analizadas mediante ANOVA y post test de Tukey (n=3, para cada grupo de animales; ***=P<0,001)

Niv

eles

rel

ativ

os d

e m

RN

A d

e tm

bim

3

pb

Tm Control 0

1

2

3

4 *** ATF4 WT ATF4 KO

actin 100

tmbim3 100

atf4+/+ atf4-/- Tm: - - + + - - + +

73

11.3) TMBIM3 y el control de la homeostasis del Ca2+

11.3.1) La expresión de TMBIM3 controla la homeostasis del calcio del RE.

Previamente, se demostró que TMBIM6 y TMBIM4 pueden modular negativamente la

liberación de Ca2+ desde el RE, fenómeno que se relaciona directamente con sus

respectivas actividades antiapoptóticas (Chae et al, 2004; Gubser et al, 2007). Por esta

razón, se monitorizó el Ca2+ citosólico en células que sobre-expresan TMBIM3-MYC

expuestas a estímulos que inducen la salida de Ca2+ desde el RE. Con este fin, las células

se incubaron con el sensor de Ca2+ Fluo-4 y posteriormente y en ausencia de Ca2+

extracelular, se determinaron por microscopia de spinning disc (ver metodología) los

cambios en el Ca2+ citosólico inducido por ATP, el cual favorece la producción de IP3

(Rizzuto et al, 2009), con la consecuente liberación de Ca2+ mediada por el receptor de

IP3R. La figura 28 muestra una cinética temporal en donde se observó una significativa

disminución del aumento de Ca2+ citosólico en las células que sobre-expresan TMBIM3-

MYC. Del mismo modo, se observó una disminución del máximo de la señal en aquellas

células que sobre-expresan TMBIM3-MYC. Por otra parte, cuando las células fueron

estimuladas con H2O2 (Figura 28), el cual induce un aumento del Ca2+ citosólico por la

generación de IP3 (Rizzuto et al, 2009), se observó que la sobreexpresión de TMBIM3-

MYC también se traduce en una disminución de la señal de Ca2+ inducida por H2O2.

Por otra parte, se analizó el efecto del tratamiento con Tg, el cual induce un

aumento del calcio citosólico, por inhibición de la bomba SERCA. La figura 29 muestra

que la adición de Tg induce un menor aumento del Ca2+ citosólico en las células que

sobre-expresan TMBIM3-MYC, respecto a las células control, fenómeno que puede

observarse tanto en la cinética, como en la cuantificación del máximo de fluorescencia

inducido por la adición de Tg (Figura 29).

Para complementar estos experimentos, se estudió el efecto en las señales de

Ca2+ de Tg y ATP en células deficientes en TMBIM6 (TMBIM6 KO) transducidas

establemente con el shRNA destinado contra el ARNm de tmbim3. De manera opuesta a

lo observado en las células que sobre-expresan TMBIM3-MYC, la reducción de los niveles

de tmbim3 se reflejó en un aumento en el máximo de Ca2+ liberado desde el RE inducido

con ATP o con Tg. La figura 30 muestra un experimento representativo del efecto inducido

74

por ATP y Tg, respectivamente, en el aumento de Ca2+ citoplasmático en células control

(shLuc) y en aquellas transducidas establemente con shRNA destinado contra tmbim3.

Estas diferencias también se observaron al cuantificar el máximo de la señal de Ca2+,

siendo mayor en aquellas que son doble-deficientes en tmbim3 y tmbim6 (Figura 30).

Figura 28: TMBIM3-MYC y la regulación de la homeostasis del Ca2+. Las células que sobre-expresan TMBIM3-MYC y su control, fueron incubadas con el sensor de Calcio Fura-4 AM en presencia de Ca2+ externo por 20 min a temperatura ambiente. Luego, las células fueron lavadas e incubadas con una solución sin Ca2+. Luego, las células fueron montadas en una cámara sobre un objetivo 40X y los cambios en la fluorescencia fueron adquiridos mediante microscopia de spinning disc. Se registró inicialmente 1 min de fluorescencia basal y después se adicionó al medio ATP (concentración final igual a 100 µM; panel superior) ó H2O2 (concentración final 500 µM; panel inferior). Los gráficos de la izquierda muestran los cambios en la fluorescencia de un experimento representativo detectados a partir del análisis de una región de interés realizado en el citoplasma de al menos 20 células. La flecha muestra el momento en el que se adicionó ATP o H2O2, según corresponda el caso. Los gráficos de la derecha, muestra la cuantificación de los máximos observados inducidos por ATP o por la adición de H2O2 a los 2 min. Se graficó el promedio y la desviación estándar de 3 o 4 experimentos independientes entre sí. Las diferencias estadísticas fueron analizadas mediante ANOVA y postest de Tukey (***=P<0,001).

***

ΔF/F

0*10

0

0100200300400500

1 2 3 4Tiempo (min)

ATP

0100200300400500

ΔF/F

0*10

0

TMBIM3MOCK

Control ATP

050100150200250

1 2 3 4Tiempo (min)

ΔF/F

0*10

0

0

100

200

300

ΔF/F

0*10

0

Control H2O2

H2O2

***

75

Figura 29: Efecto TMBIM3-MYC en la salida de Ca2+ desde el RE inducida por la inhibición de la bomba SERCA. Del mismo modo a lo descrito a la figura 28, se analizó el efecto de Tg 1µM en el Ca2+ citosólico. El grafico de la izquierda muestra un experimento representativo, donde al menos 20 células por condición fueron analizadas. El grafico de la derecha, muestra la cuantificación de los máximos observados inducidos por Tg. Se graficó el promedio y la desviación estándar. Las diferencias estadísticas fueron analizadas mediante ANOVA y postest de Tukey (n=4; ***=P<0,001).

Figura 30: Efecto de la deficiencia de TMBIM3 en la salida de Ca2+ desde el RE. Las células TMBIM6 KO shTMBIM3 y TMBIM6 KO shLuc fueron analizadas del mismo modo descrito en la figura 28 y 29. Los gráficos de la derecha muestran los cambios en la fluorescencia de un experimento representativo detectados a partir del análisis de una región de interés realizado en el citoplasma de al menos 20 células. La flecha muestra el momento en el que se adicionó ATP o Tg, según corresponda el caso. Los gráficos de la derecha, muestra la cuantificación de los máximos observados inducidos por ATP o por la

Tiempo (min)

050100150200250

1 2 3 4

TMBIM3MOCK

ΔF/F

0*10

00

100

200

300

ΔF/F

0*10

0

Control Tg

Thg

***TMBIM3MOCK

050100150200250

1 2 3 4 5

ΔF/F

0*10

0

Tiempo (min)

050100150200250

ΔF/F

0*10

0

Control Tg

Thg

***

shTmbim3shLuc

050100150200250

1 2 3 4

ΔF/F

0*10

0

Tiempo (min)5

050100150200250

ΔF/F

0*10

0ATP

***

Control ATP

shTmbim3shLuc

Tg

Tg

76

adición de H2O2 a los 2 min. Se graficó el promedio y la desviación estándar de 3 o 4 experimentos independientes entre sí. Las diferencias estadísticas fueron analizadas mediante prueba ANOVA y postest de Tukey (***=P<0,001).

11.3.2) La sobreexpresión de TMBIM3 protege frente a la muerte celular inducida

por sobrecarga de Ca2+.

El efecto en la homeostasis del Ca2+ inducido por TMBIM3 podría traducirse en un

cambio en la toxicidad de estímulos que inducen muerte celular por sobrecarga de Ca2+.

Basado en la evidencia obtenida en el punto anterior, se estudió si la sobreexpresión de

TMBIM3-MYC podría tener un efecto en la muerte inducida por sobrecarga de Ca2+

citosólico. Con este fin, se expusieron las células que sobreexpresan TMBIM3-MYC y su

respectivo control, a ácido araquidónico o a H2O2 y se determinó su efecto en la viabilidad

celular, observándose una menor muerte en aquellas que sobre-expresan TMBIM3. La

muerte celular en este caso, fuese evaluó mediante tinción con PI (células permeables) y

hoescht (núcleos totales). La figura 31 muestra una fotografía tomada a las 6 h pos-

tratamiento. Del mismo modo, se cuantificó la muerte celular mediante citometría de flujo

y tinción con PI (Figura 31). Estos resultados sugieren que el cambio en la homeostasis

del Ca2+ inducido por TMBIM3 se traduce funcionalmente en la muerte celular inducida

por sobrecarga de Ca2+.

Figura 31: La sobreexpresión TMBIM3 disminuye la muerte por sobre-carga de Ca2+. Las células TMBIM3-MYC y MOCK fueron incubadas en presencia de ácido araquidónico 200 μM (Ara) o H2O2 1 mM por 6 h. Luego la muerte celular fue determinada mediante tinción con PI (rojo) y el total de células fue determinado mediante tinción de los núcleos con Hoescht (Azul). Las imágenes muestran fotografías de un experimento representativo (n=3). Ádemas, la muerte celular fue evaluada por tinción con PI y análisis de citometría de flujo. El panel de la derecha muestra el promedio y desviación estandar de un experimento reprensetativo, de un total de tres, hecho en triplicado.

TMB

IM3-

MYC

M

OC

K

Control Araq H2O2

MOCK TMBIM3-MYC

0

10

20

30

40

50

Control Araq 0.2 µM

H2O2 1 µM

Cél

ulas

PI P

ositi

vas

(%)

77

11.3.3) La sobreexpresión de TMBIM3 no altera los niveles de Ca2+ RE ni la

expresión de diferentes chaperonas en el RE.

Existen reportes que indican que TMBIM6 y TMBIM4 pueden modular la

homeostasis del Ca2+ RE alterando el contenido neto de Ca2+ en el RE (Chae et al, 2004;

Gubser et al, 2007). Debido a esto, se estudió si la sobreexpresión de TMBIM3 podría

afectar los niveles de Ca2+ presentes en el RE. Con este fin, se transdujeron células

control (MOCK) y aquellas que sobre-expresan TMBIM3-MYC con un adenovirus que

permite la expresión de Aequorina-ER, una proteína destinada al RE y la cual emite luz en

presencia de Ca2+. De esta manera, se determinó que ni la sobreexpresión constitutiva, ni

la sobreexpresión transitoria de TMBIM3-MYC se traduce en un cambio en los niveles de

Ca2+ en el RE (Figura 32). La sobreexpresión de TMBIM3-MYC tampoco se tradujó en un

cambio en la liberación pasiva de Ca2+ desde el RE. Esto último fue demostrado con un

método cuantitativo usando Ca2+ radiactivo (45Ca2+). A partir de monocapaz de membrana

plasmática de ambos tipos celulares, los reservorios de Ca2+ no mitocondriales fueron

cargados con 45Ca2+ y se determinó la salida pasiva de 45Ca2+ (Figura 32). De esta

manera, se demuestró que la expresión de TMBIM3-MYC no alterá ni los niveles de Ca2+

contenidos en el RE, ni la salida pasiva de Ca2+ desde el RE hacia el citoplasma.

Figura 32: Determinación del contenido de Ca2+ del RE. Las células MOCK y TMBIM3 (expresión estable) fueron transducidas por 24 h con un vector adenoviral que permite la expresión de la proteína Aequerina fusionada a una secuencia de destinación al RE (Aequorina-ER). Para estudiar el efecto de la expresión transitoria de TMBIM3, las células MEFs WT fueron transfectadas por 24 h con un vector de expresión plasmidial que permite la expresión de Aequorina-ER. El contenido de Ca2+ en RE fue determinado en un luminómetro de acuerdo a lo descrito en materiales y métodos. El grafico muestra el promedio y desviación estándar de 4 experimentos independientes entre sí. Las diferencias estadísticas fueron analizadas mediante prueba t.

0

100

200

300

[Ca2

+ ]R

E µ

M

Expresión transitoria

Expresión estable

TMBIM3 MOCK MOCK

TMBIM3

0 20 40 60 80

100 120

0 5 10 15 20 Tiempo (min)

Con

teni

do d

e 45

Ca2

+

liber

ado

(% to

tal)

n.s.

n.s.

78

El nulo efecto de la expresión de TMBIM3-MYC en el contenido de Ca2+ del RE fue

corroborado por la medición del Ca2+ citosólico liberado desde el RE, siendo el RE la

única fuente posible de Ca2+. De esta manera, las células fueron incubadas con Fura-2 y

los cambios en la fluorescencia citoplasmática fueron medidas por análisis ROI y

microscopia de spinning disc. La figura 33 muestra los cambios inducidos en el Ca2+

citosólico generados por la adición de Ionomicina en ausencia de Ca2+ externo, la cual

hace poros en la membrana del RE, favoreciendo la salida de Ca2+ desde el RE hacia el

citoplasma. La cuantificación del máximo de fluorescencia inducido por la adición de

Ionomicina en las células MOCK y en aquellas que sobre-expresan TMBIM3 es graficado

y mostrado en la figura 33.

Figura 33: Efecto de la sobreexpresión de TMBIM3 en el contenido de Ca2+ en el RE. Las células MOCK y TMBIM3 fueron incubadas con la sonda Indo-2 por 20 min a temperatura ambiente. Luego las células fueron lavadas con una solución libre de Ca2+ externo y se montaron en una cámara. Los cambios en la fluorescencia fueron captados mediante microscopia de spinning disc. Luego de un min, se adiciono al medio Ionomicina 1 µM (flecha). El grafico de la derecha muestra un experimento representativo, en donde fueron cuantificadas al menos 20 células para MOCK (Azul) y 20 células para TMBIM3 (Verde). El Gráfico de la derecha muestra el promedio y la desviación estándar de los máximos cuantificados en 4 experimentos independientes entre sí.

79

Alteraciones directas o indirectas en el contenido de Ca2+ en el RE, podrían

traducirse en cambios compensatorios en la expresión de chaperonas residentes en el

RE. Estos cambios en la fisiología del RE podrían conceder una protección ante estímulos

que inducen estrés de RE. Tomando esto en consideración, se evaluó mediante western

blot el nivel de expresión de foldasas, chaperonas y proteínas involucradas en el control

de calidad de proteínas: PDI, ERp72, BIP/Grp78, ERp57/Grp58 y EDEM. La

sobreexpresión de TMBIM3, no se tradujo en una diferencia significativa en la expresión

de estas proteínas residentes en el RE (Figura 34). Además, se evaluó el efecto de la

sobreexpresión de TMBIM3 en la regulación de la expresión de estas chaperonas

residentes del RE bajo condiciones de estrés RE. Con este fin, se expusieron las células

control y aquellas que sobre-expresan TMBIM3-MYC a Tm por 24 h y luego se evaluó la

expresión de PDI, ERp72, BIP/Grp78, ERp57/Grp58 y de EDEM (Figura 34). De esta

manera, se determinó que la sobreexpresión de TMBIM3-MYC no altera la expresión

basal, ni el aumento que experimentan estas proteínas en respuesta a agentes que

inducen estrés de RE.

Figura 34: Efecto de la sobreexpresión de TMBIM3 en los niveles de expresión de diferentes proteínas residentes del RE. Las células que sobre-expresan TMBIM3 y su control, fueron o no expuestas a 100 ng/mL de Tm por 16 h. Luego, a partir de extractos totales de proteínas, se analizó el contenido de PDI, BIP, ERp72, ERp57 y EDEM mediante western blot. La proteína chaperona residente en el citoplasma, Hsp90, fue determinada como control de carga. Ádemas, se puede observar el cambio en la movilidad electroforética de la proteína EDEM, como consecuencia de la inhibición de la N-glicosilación de proteínas. La figura muestra un experimento representativo de tres hechos de manera independiente.

72

72 BIP

50 PDI

TMBIM3: - + - + Tm

50 ERp57

72

100

ERp72

Hsp90

EDEM

kDa

80

11.3.4) TMBIM3 interactúa con IP3-R y modula su actividad.

Distintas proteínas de la familia BCL-2 pueden regular la homeostasis del Ca2+ en

el RE y su libración desde el RE hacia el citoplasma, proceso el que puede involucrar la

interacción de estas proteínas con IP3-R, lo que podría alterar su actividad (algunos

ejemplos en (Oakes et al, 2005; Rong et al, 2009). Por otra parte, ha sido demostrado que

TMBIM4/GAAP puede interactuar con IP3-R, disminuyendo su actividad (de Mattia et al,

2009). Ademas, dado que la sobreexpresión de TMBIM3-MYC disminuye el incremento de

Ca2+ citosólico inducido por agentes que favorecen la producción de IP3 citoplasmática

(ATP, H2O2), se estudió el efecto de la sobreexpresión de TMBIM3-MYC en la liberación

de Ca2+ inducido directamente por el ligando endógeno del IP3-R, es decir: IP3. A partir

de células cargadas con 45Ca2+, se estudió el efecto de concentraciones crecientes de IP3

en la liberacion de 45Ca2+, observándose que la sobreexpresión de TMBIM-MYC

disminuye significativamente la liberación de 45Ca2+ inducida por IP3 (Figura 35). Esta

experiencia se realizó considerando que el flujo de Ca2+ es unidireccional, debido a la

ausencia funcional de mitocondrias y la bomba SERCA (ver metodología). Tomando esto

en consideración, se estudió la probable asociación entre TMBIM3-MYC y IP3-R mediante

estudios de co-inmunoprecipitación. Con este fin, se procedió a inmunoprecipitar

TMBIM3-MYC desde células MEFs que expresan establemente TMBIM3-MYC,

observándose una débil, pero reproducible co-inmunoprecipitación con el IP3-R3

endógeno (Figura 36). Con el fin de validar este resultado, se procedió a estudiar la

coinmunoprecipitacion entre TMBIM3-MYC y el IP3R endógeno en otros tipos celulares.

De este modo, las células HEK293T y las células Hela, fueron transfectadas con vectores

que permiten la expresión transitoria de TMBIM3-MYC y se determinó que TMBIM3-MYC

puede co-inmunoprecipitar, tanto con IP3-R3, así como con IP3-R1. También se

determinó, mediante inmunoprecipitación en las células MEFs que expresan establemente

TMBIM3-MYC, la asociación entre TMBIM3-MYC y la proteína BCL-2 endógeno, para la

cual ya ha sido demostrado que puede modular la actividad del receptor de IP3

(Vanderheyden et al, 2009).

81

Figura 35: Efecto de la sobreexpresión de TMBIM-MYC en la liberación de Ca2+

desde el RE inducida por IP3. 2 x 105 células MEFs MOCK y aquellas que que expresan establemente TMBIM3-MYC se sembraron en las palcas de 12 pocillos y se conservaron por 4 días en condiciones normales de cultivo. Los niveles de 45Ca2+ liberados desde el RE inducido por las dosis de IP3 indicadas en la figura son expresados como % del total de 45Ca2+ contenido en el RE y fueron determinados como se describe en la metodología. La figura representa el promedio y la desviación estandar (n=4). Las diferencias estadísticas fueron analizadas mediante ANOVA y postest de Tukey (***=P<0,001).

Figura 36: Co-inmunoprecipitación de TMBIM3-MYC con IP3-R y BCL-2. A partir de extractos totales de proteínas de las células MOCK y TMBIM3, o de células HEK293T o células Hela transfectadas con vectores que permiten la expresión transitoria de TMBIM3-MYC o el control MOCK, se procedió a inmunoprecipitar TMBIM3-MYC mediante su tag MYC. Posteriormente, se evalúo la co-inmunocprecipitacion de IP3-R3 (células MEFs y HEK293T, IP3-R1 (células Hela) y BCL-2 (células MEFs) mediante western blot. La figura muestra un resultado representativo (n=3).

0 20 40 60 80

100 120

Lib

erac

ión

de 4

5 Ca2

+

(%

del

tota

l) TMBIM3-MYC MOCK

***

1 3 10 IP3 (µM)

***

***

43

43

170

170

MOCK

TMBIM3-M

YC

IP: MYC WB: IP3-R1 IP: MYC WB: MYC Total extract WB: MYC Total extract WB: IP3-R1

43

43

170

170

MOCK


43

43

170

170

MOCK

TMBIM3-M

YC


MEF HEK Hela

TMBIM3-M

YC

IP: MYC WB: BCL-2 IP: MYC WB: MYC Total extract WB: MYC Total extract WB: BCL-2

MOCK

TMBIM3-M

YC

43

43

30

30

MEF

kDa kDa kDa kDa

82

Considerando el efecto de la sobreexpresión de TMBIM3 en la homeostasis del

Ca2+, se estudio si este cambio en la expresión de TMBIM3, podría afectar los niveles de

expresión de otras proteínas relacionadas con el control del Ca2+. Con este fin, se

evaluaron los niveles de expresión de BCL-2, SERCA, IP3-R y BAX. No se observaron

cambios significativos entre las células control (MOCK) y las células que sobre-expresan

TMBIM3-MYC (Figura 37).

Figura 37: La expresión de TMBIM3 no genera un cambio en la expresión de algunas proteínas involucradas en el control del Ca2+ RE. A partir de extractos proteicos totales de las células MOCK y de aquellas que sobre-expresan TMBIM3, se procedió a evaluar los niveles de expresión del IP3-R3, SERCA, BCL-2 y TMBIM3 mediante western blot. La expresión de Hsp90 fue determinada como control de carga (n=2).

11.3.5) Efecto de la liberación de Calcio desde el RE en la muerte inducida por

estrés de RE

Hay una asociación directa entre cambios en la homeostasis del Ca2+ relacionados

con el RE y la susceptibilidad al estrés de RE. Aunque inicialmente esta idea parecía ser

especulativa, existen algunos reportes que han podido correlacionar ambos fenómenos.

Con el fin de estudiar si efectivamente el estrés de RE cambia los niveles de Ca2+, se

expusieron las células MEFs WT a estrés de RE por 16 h y se evaluó posteriormente los

cambios en los niveles de Ca2+ citoplasmático inducidos por la adición de Ionomicina en

43

95

26

110 170 IP3-R3

Myc

Hsp90

Bcl2

SERCA

MOCK

TMBIM3-M

YC

kDa

83

ausencia de Ca2+ externo. La figura 38 muestra las curvas de cambio de fluorescencia de

Fura-2 en las células control y en aquellas expuestas a Tm, observándose una

disminución del Ca2+ liberado desde el RE inducido por el estrés de RE.

Figura 38: El estrés de RE y su efecto en los niveles de Ca2+ en el RE. Las células MEFs WT se incubaron con 0,1 y 0,25 µg/mL de Tm por 16 h (rojo y azul, respectivamente). Luego los niveles de Ca2+ del RE fueron determinados como fue descrito en la figura 33. El gráfico muestra un experimento representativo (n=3-4), donde cada cinética representa el promedio de al menos 20 células.

Con el fin de evaluar el papel del Ca2+ liberado desde el RE en la muerte celular

inducida por estrés de RE se estudio el efecto de 2-APB, un inhibidor farmacológico de

IP3-R. Con este fin se incubaron las células MEFs WT con 0,25 µg/mL de Tm, dosis a la

cual se induce una depleción de Ca2+ desde el RE, en conjunto con 10 µM de 2-APB. La

figura 39 muestra que la inhibición farmacológica de los IP3-Rs disminuye la muerte bajo

condiciones de estrés de RE.

Figura 39: Efecto del Ca+2 en la muerte inducida por estrés de RE. Las células MEF wild type se incubaron en presencia de 2-APB 10 µM y/o en presencia de 0,25 ng/mL de Tm por 16 h. Luego se determinó la viabilidad celular analizando la incorporación de PI mediante análisis de citometría de flujo. La figura representa los promedios ± desviación estándar de 4 experimentos independientes entre sí. Las diferencias estadísticas fueron analizadas mediante ANOVA y postest de Tukey (*=P<0,05).

0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1 2 3 4 5 Tiempo (min)

Raz

ón (3

40/3

80) 0,1 µg/mL Tm (16h)

0,25 µg/mL Tm (16h)

Control

Iono

0

20

40

60

80

NT 2-APB Tm Tm 2-APB

Cél

ulas

PI P

ositi

vas

(%)

*

84

11.3.6) Efecto del Ca2+ en la inhibición de la apoptosis mediada por TMBIM3

Para evaluar el rol funcional del Ca2+ liberado desde el RE en el control que ejerce

TMBIM3 en la apoptosis inducida por estrés de RE, se estudio en efecto de 2-APB en

conjunto con la disminución de los niveles de tmbim3. La figura 40 muestra que la

disminución de los niveles de tmbim3 aumenta significativamente la apoptosis inducida

por estrés de RE en células TMBIM6 KO. Sin embargo, este aumento significativo se

disminuyó cuando el estrés de RE es inducido en presencia de 2-APB, lo cual demuestra

el efecto protector de TMBIM3 sobre el estrés de RE, a través de la posible modulación de

IP3-R. La figura 39 muestra una tinción vial con Hoechst (azul) y con PI (Rojo), del

experimento previamente descrito. Además, la apoptosis fue evaluada mediante la

cuantificación de los núcleos condensados teñidos con Hoescht, lo que es graficado en la

figura 40.

Figura 40: Papel del Ca2+ en el control de la apoptosis ejercida por TMBIM3. Las células TMBIM6 KO que expresan establemente shLuc o shTmbim3 fueron expuestas a 0,1 µg/mL Tm y/o 10 µM de 2-APB por 16 h. Luego, se evalúo la apoptosis mediante tinción con Hoechst de núcleos fragmentados y condensados y la viabilidad celular, mediante incorporación de PI. Las imágenes de la izquierda muestran un experimento representativo (barra = 60 µm)y el gráfico de la derecha muestra la cuantificación de los núcleos condensados (apoptosis), respecto del total de núcleos por campo. Se graficó el promedio + desviación estándar de 4 experimentos independientes entre sí. Las diferencias estadísticas fueron analizadas mediante ANOVA y postest de Tukey (*=P<0,05; n.s.=no significativo).

0

10

20

30 * n.s.

Apo

ptos

is (%

)

shTmbim3:

+ + +

- + +

- + -

- - +

- - -

Tm: 2-APB:

Hoe

chst

shTmbim3:

+ + +

- + +

- + -

- - +

- - -

Tm: 2-APB:

PI

85

11.4) Rol de TMBIM3 in vivo

11.4.1) TMBIM3 y TMBIM6 tienen actividades antiapoptóticas sinérgicas in vivo en

un modelo de ER estrés en Drosophila melanogaster.

La secuencia primaria de todos los miembros de la familia de proteínas TMBIM es

conservada y presente en distintos organismos, incluyendo Drosophila melanogaster

(Figura 4). La mayoría de los componentes de las vías de la UPR están presentes en

mosca y previamente han sido descritos algunos modelos para estudiar moduladores de

la UPR in vivo (Lisbona et al, 2009; Mori, 2009; Plongthongkum et al, 2007; Ryoo et al,

2007). Para estudiar el efecto de la deficiencia del tmbim3, tmbim6 y la doble deficiencia

de ambos, se usaron moscas transgénicas GAL4/UAS-RNAi que permiten la expresión de

RNA interferente destinados contra el ARNm de tmbim3 o el ARNm de tmbim6. El gen del

factor transcripcional GAL4 se expresa bajo el control del promotor de tubulina, lo cual

permite su expresión ubicua. El factor transcripcional GAL4 induce la expresión de genes

que poseen una secuencia denominada UAS. En este caso, se estableció un sistema de

cruzas que permite la obtención de moscas heterocigotas que poseen GAL4/UAS-RNAi y

un control GFP/UAS-RNAi, el cual no expresa el RNAi interferente. Habiendo establecido

el sistema de cruzas, se procedió a determinar los niveles del ARNm de tmbim3 y tmbim6

en las larvas de moscas de segundo estadio (Figura 41). Además, con el fin de estudiar

posibles roles complementarios entre tmbim3 y tmbim6 en respuesta a estrés de RE in

vivo, se realizó un sistema de cruzas de manera de obtener moscas doble deficientes

para tmbim3 y tmbim6 (Doble RNAi).

Figura 41: Generación de un modelo deficiente en tmbim3 y tmbim6 en Drosophila melanogaster. Extractos de ARN total de larvas de moscas control y de RNAi tmbim3 y

86

tmbim6 fueron analizados mediante PCR en tiempo real y RT-PCR, respectivamente. Los niveles de los ARNm fueron relativizados a los niveles de actina (n=2).

Para estudiar si la disminución de los niveles de ARNm de dTmbim3 o dTmbim6

afecta el desarrollo de la mosca, se procedió a estudiar en ambos tipos de moscas el

número de larvas que pupan y que eclosionan A nivel basal, se observó que la

disminución de los niveles de tmbim3 o tmbim6 no altera significante el proceso de

eclosión de las moscas, así como en la viabilidad de estas mismas. El gráfico de la figura

42 muestra el resultado de las cruzas de moscas, donde se obtuvo un número similar de

moscas control y de aquellas que expresan el RNAi para dTmbim3 o dTmbim6. Sin

embargo, la generación de una línea de moscas doble RNAi lleva a una disminución

significativa en el número de larvas que llegan al estado adulto en condiciones normales

de crecimiento (Figura 42). Esto, podría sugerir que la deficiencia de ambos genes tiene

un efecto sinérgico en la viabilidad de la mosca. Además, el número de larvas que llegan

al estado de pupa no fue afectado significativamente en ninguna de las tres líneas RNAi

generadas.

Figura 42: Efecto de la deficiencia de dTmbim3 y dTmbim6 en la generación de moscas adultas. 100 larvas de segundo estadio de las líneas de moscas RNAi para tmbim6 (azul), tmbim3 (rojo) y doble RNAi (lila), fueron cultivadas y el número total de moscas obtenidas fue cuantificada. El grafico muestra el promedio y la desviación estándar de tres experimentos independientes entre sí. Las diferencias estadísticas fueron analizadas mediante ANOVA y postest de Tukey (*=P<0,05;**=P<0,01).

87

Para estudiar el efecto de tmbim3 o tmbim6 en la muerte inducida por estrés de

RE, se crecieron las larvas de moscas en un medio de crecimiento condicionado con 25

µg/mL de Tm, de manera de inducir estrés de RE en las larvas mediante la incorporación

de la droga a través de la ingesta de comida presente en el medio de crecimiento. Por

esta razón, se evaluó el efecto de la disminución en la expresión de dTmbim3 o dTmbim6

en la inducción de apoptosis en los intestinos de las larvas. Los intestinos de las larvas

fueron disectados y la apoptosis fue evaluada mediante la inmuno-fluorescencia indirecta

de caspasa 3 activada (verde) y el total de las células fue visualizado mediante la tinción

con Hoechst (azul). La figura 43 muestra que en las larvas control no se observó la

detección de caspasa 3 activada, tanto es condiciones basales, como en las larvas

expuestas al tratamiento crónico de una dosis baja Tm. Sin embargo, se detectó

basalmente apoptosis en las líneas RNAi para dTmbim3 y dTmbim6. Este proceso fue

mayor en las larvas expuestas a Tm. Esto sugiere que la disminución de la expresión de

dTmbim3 o dTmbim6 induce la apoptosis, tanto basalmente, como en respuesta a un

estímulo que genera estrés de RE.

Figura 43: La deficiencia de tmbim3 y tmbim3 y su efecto en la apoptosis espontánea y en respuesta a Tm en Drosophila melanogaster. Las larvas de las moscas wild type y de las líneas RNAi y sus respectivos controles fueron crecidas en presencia o ausencia de 50 µg/mL de Tm por 16 h. Luego, en los intestinos de las larvas, se procedió a analizar mediante inmuno-fluorescencia indirecta la presencia de caspasa 3 activa. Los núcleos totales fueron teñidos con DAPI. Las imágenes son parte de un experimento representativo (n=3) y fueron adquiridas mediante microscopía de spinning disc con un objetivo 10x.

88

A demás, se determinó el impacto funcional de la deficiencia de tmbim3 y tmbim6

en la sobrevida de los animales expuestos a estrés de RE inducido por Tm. Con este fin,

se cuantificó el número de larvas que se desarrollan hasta llegar a moscas adultas. La

exposición de las larvas a Tm llevó a una drástica disminución en el número de moscas

que llegan a estado adulto en las líneas que expresan el RNAi destinado contra el ARN

codificante para dTmbim3 y dTmbim6 (38 y 43%, respectivamente). Sin embargo, el

efecto de la Tm en sus respectivos controles, no induce una disminución significativa en

las moscas generadas. Por otra parte, la línea doble RNAi para dTmbim3 y dTmbim6 fue

extremadamente susceptible, tanto en la generación de moscas en condiciones basales,

así como en condiciones de estrés de RE inducido por Tm (Figura 44).

Considerando todos estos resultados, puede sugerirse que la expresión de

dTMBIM3 y dTMBIM6 tienen actividades antiapoptóticas in vivo, y que su expresión es

importante para el desarrollo de la mosca, pues la deficiencia de ambos genes es

parcialmente letal en moscas. Por otra parte, existe un efecto sinérgico en la deficiencia

de ambos genes, respecto a la viabilidad de moscas adultas, así como la resistencia a la

toxicidad en un modelo de estrés de RE in vivo en D. melanogaster.

89

Figura 44: Efecto de la deficiencia de dTmbim3 y dTmbim6 en la generación de moscas adultas a partir de larvas crecidas en presencia o ausencia de Tm. 100 larvas de segundo estadio de cada línea de mosca fueron crecidas en presencia o ausencia de 50 µg/mL de Tm. Luego, el número de moscas que eclosionan fueron cuantificadas día a día. Las figuras de la izquierda de cada panel muestran un experimento representativo de las cinéticas de eclosión de moscas para las líneas tmbim3 RNAi (A), tmbim6 RNAi (B) y doble RNAi (C). Los gráficos de la derecha, muestran el promedio y la desviación estándar de las moscas generadas en tres experimentos independientes entre sí. Las diferencias estadísticas fueron analizadas mediante ANOVA y postest de Tukey (*=P<0,05; **=P<0,01; ***=P<0,001).

dtmbim3 iRNA

15Tiempo (Días)

0 5 10

Control Control + Tmdtmbim3 RNAidtmbim3 RNAi + Tm

0

25

50

75

100

- Tm - Tm

*

Control

0

25

50

75

100

0

25

50

75

100

0 5 10 15

Control Control + Tmdtmbim6 RNAidtmbim6 RNAi + Tm

Tiempo (Días)- Tm - Tm

***

0

25

50

75

100

Tiempo (Días)

0

25

50

75

100

0 5 10 15

Control Control + Tmdoble RNAidoble RNAi + Tm

**

- Tm - Tm

**

0

25

50

75

100

A

B

C

Mos

cas

adul

tas

(%)

dtmbim6 iRNAControl

doble iRNAControl

Mos

cas

adul

tas

(%)

Mos

cas

adul

tas

(%)

Mos

cas

adul

tas

(%)

Mos

cas

adul

tas

(%)

Mos

cas

adul

tas

(%)

90

11.4.2) Expresión de tmbim3 en pez zebra y tejidos de ratón.

Análisis bio-informáticos de bases de datos del genoma de zebrafish indican la

presencia de un homologo putativo de TMBIM3: z-Tmbim3 (Figura 45). La presencia del

gen se confirmó mediante PCR semi-cuantitativo, analizando la expresión del ARNm de z-

Tmbim3 en el desarrollo embrionario de pez zebra utilizando extractos de ARNm de

tejidos totales de embriones a las 24 y 96 horas pos-fertilización (hpf) (Figura 45).

Además, se evaluaron los niveles de expresión del ARNm de zTmbim3 utilizando la

técnica de PCR en tiempo real, observándose un alto nivel de expresión relativo al ARNm

de actina en estadios embrionarios tempranos (embriones de 256 células, 4 y 10 somitos)

y menor en estadios embrionarios mas tardíos (Figura 46).

Figura 45: Expresión de z-Tmbim3 en distintos estados de desarrollo del pez zebra. Embriones de 24 y 96 hpf fueron cultivados en condiciones estándar y posteriormente se procedió a analizar la presencia del ARNm de z-Tmbim3 mediante RT-PCR desde extractos de RNA total. La figura muestra un experimento representativo de 4.

Figura 46: Perfil de expresión de z-tmbim3 en el desarrollo de pez zebra. A partir de extractos de ARN total de embriones de pez zebra de distintos estadios, se analizó los niveles de expresión de z-tmbim3 mediante PCR en tiempo real. El grafico muestra los niveles de z-tmbim3 relativo a actina de tres determinaciones independientes entre sí (promedio ± desviación estándar).

z-Tmbim3

24 hpf

96 hpf

5 kb

256$células$

4 som

itos

10$somitos$

15$somitos$

18$somitos$

gástr

ula

24 hp

f

48 hp

f

72 hp

f

96 hp

f 0

0,4

0,8

1,2

1,6

2

Niv

eles

de

AR

Nm

de

z-Tm

bim

3

91

Además se estudio el perfil de expresión del ARNm de zTmbim3 en pez zebra.

Con este fin, se realizó una hibridación in situ para analizar el patrón de expresión del

ARNm de z-Tmbim3 en pez zebra, observándose, principalmente, el transcrito en tejido

neuronal, incluyendo cabeza, ojo y medula espinal (Figura 47). La alta expresión del

ARNm de z-Tmbim3 en el sistema nervioso central coincide con lo previamente publicado

para d-Tmbim3 en D. melanogaster.

Figura 47: Patrón de expresión de zTmbim3 en pez zebra. La expresión del ARNm de tmbim3 en pez zebra (z-tmbim3) fue determinada mediante hibridación in situ en embriones de pez zebra en distintos niveles de desarrollo: i: 8 células; ii: 10 somitos y iii, iv y v: 24 hpf. Las imágenes corresponden a visiones laterales (i-iii) y dorsales (iv-v) de los embriones.

En consecuencia con lo anterior, se procedió a analizar los niveles de expresión

del ARNm de m-Tmbim3 en distintos tejidos de ratón mediante PCR en tiempo real

(ovario, útero, bazo, estomago, corazón, hígado, vejiga, cerebro, médula espinal,

cerebelo, riñón, testículos). La figura 48 muestra que tmbim3 en ratón tiene un perfil alto

de expresión relativa en medula espinal, cerebelo, cerebro, riñón y testículos; y bajo en

ovarios, útero, bazo, estómago y riñón.

ISH: z-Tmbim3

i ii

iii iv

v

92

Figura 48: Expresión de tmbim3 en tejidos de ratón. Desde extractos de RNA total de diferentes tejídos de raton, se analizó los niveles de ARNm de tmbim3 de ratón (m-Tmbim3) mediante PCR en tiempo real. El gráfico muestra los niveles de ARNm de m-Tmbim3 relativos al ARNm de actina para dos ratones (promedio ± desviación estándar).

11.4.3) Deficiencia de tmbim3 incrementa la apoptosis durante el desarrollo del pez

zebra.

Con el fin de estudiar el posible efecto de la deficiencia de TMBIM3 en la apoptosis

en pez zebra se diseño un morfolino, el cual actúa como oligonucleótido anti-sentido,

destinado contra la región 5’-UTR y la región ATG del ARNm de zTmbim3. De esta

manera, se procedió a inyectar los ovocitos fertilizados de pez zebra con 1,5 ng de

morfolino destinado contra el ARNm de z-Tmbim3 (z-Tmbim3-MO) o su control

“mismatch”, en el cual se sustituyeron 5 bases de manera de no permitir el correcto

apareamiento entre el oligonucleótido y el ARNm de tmbim3 (Mis-MO). Después de 24 h

pos-inyección, se estudio el patrón y el grado de muerte celular en diferentes tejidos del

animal mediante tinción con la sonda naranjo de acridina, la cual posee un máximo de

excitación/emision de 502/525 nm al estar unida al DNA, proceso que se ve favorecido en

tejido apoptótico. De este modo, la deficiencia en la expresión de z-Tmbim3 se tradujó en

un incrementó del grado de tinción y del número de células teñidas con naranjo de

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

Ova

rio

Úter

o Ba

zo

Esto

mag

o Co

razó

n Hí

gado

ve

jiga

Cere

bro

Méd

ula

espi

nal

Cere

belo

Ri

ñón

Test

ícul

o

Niv

eles

de

mR

NA

m-Tmbim3

93

acridina, fenómeno observado principalmente en la cola y la medula espinal (Figura 49), lo

cual coincide con el perfil de expresión observado mediante la hibridación in situ.

Figura 49: Efecto de la deficiencia de z-tmbim3 en la muerte celular durante el desarrollo del pez zebra. Los embriones de pez zebra en estado de una célula fueron inyectados con 1,5 ng del morfolino control (Mis-Mo) o del morfolino destinado contra ARNm de z-Tmbim3 (z-tmbim3-Mo). Luego de 24 h, se procedió a teñir con naranjo de acridina los embriones y posteriormente, se procedió a fotografiar a los embriones de 24 hpf. Las imágenes corresponden a visiones laterales de los embriones tanto en campo claro (paneles de la izquierda), así como de fluorescencia (paneles de la derecha). Las imágenes son representativas de tres experimentos independientes entre sí.

El nivel de muerte celular evaluado por tinción con naranjo de acridina fue

cuantificado mediante un análisis de fluorescencia en la región medula espinal. La figura

50 muestra que z-Tmbim3-MO incrementa significativamente, respecto al control Mis-MO,

el nivel de muerte celular en la medula espinal de los embriones después de haber sido

inyectados por 24 h con los respectivos morfolinos.

Para complementar estos resultados, se estudio la posible activación de caspasa 3

inducida por la disminución de los niveles de expresión de TMBIM3. La figura 50 muestra

la presencia de caspasa 3 activa en embriones de 24 hpf inyectados con z-Tmbim3-MO,

pero no con Mis-MO. Esto se evalúo mediante estudios de inmuno-fluorescencia indirecta.

El nivel de de activación fue cuantificado, observándose un aumento significativo de la

activación de caspasa 3 inducida por la inyección de z-Tmbim3-MO, respecto a su control

Mis-MO (Figura 51).

Mis-MO z-Tmbim3-MO

94

En esta primera etapa, se evalúo el efecto de una baja concentración del morfolino

en la generación de muerte celular en los tejidos del pez zebra. Sin embargo, el uso de

una dosis tres veces superior del morfolino (4.5 ng/embrión) generó una completa

desorganización del sistema nervioso central, desarrollándose peces acéfalos,

microcéfalos o con serios daños en la médula espinal, lo cual coincide con una masiva

letalidad espontánea de los animales. El 100% de los embriones inyectados con 4.5 ng de

z-Tmbim3-MO se desarrollo anormalmente, al contrario de aquellos que fueron inyectados

con el control. La figura 52 muestra una foto por contraste de fase de los embriones de

pez zebra inyectados con ambos morfolinos por 24 h.

Figura 50: Cuantificación de la tinción con naranjo de acridina en la médula espinal de los peces zebra inyectados con morfolino destinado contra zTmbim3. Las imágenes muestran una selección hecha en la sección de la médula espinal de los embriones tratados como se describe en la figura 49. Los pixeles teñidos en verde, fueron cuantificados y posteriormente graficados (panel izquierdo).Los datos representan el promedio y la desviación estándar de 20 embriones. Las diferencias estadísticas fueron analizadas mediante prueba t (**=P<0,01).

**

0

10

20

30

40

Pixe

les

de N

aran

jo d

e A

crid

ina/

area

(%)

Mis- MO

z-Tmbim3- MO

Naranjo de Acridina

Z-Tm

bim

3-M

O

Mis

-MO

95

Figura 51: Cuantificación de los niveles de caspasa 3 activada en la medula espinal de embriones de pez zebra inyectados z-Tmbim3-MO. La activación de caspasa 3 fue analizada mediante inmuno-fluorescencia (verde) y los núcleos totales fueron teñidos con topro (rojo). Luego, las imágenes fueron adquiridas mediante microscopía confocal en embriones de 24 hpf de pez zebra, los cuales fueron tratados como se describió en la figura 49. El panel de la izquierda muestra una imagen representativa de 3 animales analizados y la figura de la derecha muestra la cuantificación (promedio y desviación estándar) de los pixeles positivos para caspasa 3 activada. Las diferencias estadísticas fueron analizadas mediante prueba t (*=P<0,05).

Figura 52: Efecto de la deficiencia de tmbim3 en pez zebra y la generación de individuos normales. Los embriones de pez zebra se inyectaron con 4.5 ng/embrión del morfolino Mis-MO (control) o del morfolino z-tmbim3-MO. Luego de 24 h, se cuantificó el número de embriones normales y aquellos anormales (microcéfalos, acéfalos, sin columna vertebral o de nula movilidad). Las imágenes muestran dos embriones 24 hpf para cada condición. Las flechas rojas muestran los embriones sin cabeza. La razón entre

0

50

100

150 *

Mis- MO

z-Tmbim3- MO

Cas

pasa

3 a

ctiv

a (p

ixel

/are

a)

Casp-3 activa TOPRO

z-Tm

bim

3-M

O

Mis

-MO

Mis-MO z-Tmbim3-MO

Anormal/Total: 0/128 Anormal/Total: 156/156

96

los embriones con fenotipos anormal y el total de embriones esta puesta en el inserto de cada foto.

De manera de estudiar el efecto de la deficiencia de zTmbim3 en el sistema

nervioso central del pez zebra y corroborar el resultado descrito anteriormente, se

procedió a evaluar el efecto de z-Tmbim3-MO, y su respectivo control Mis-MO, en peces

zebra transgénicos que expresan la proteína fluorescente verde, GFP, mediante el control

de un promotor neuronal, se manera que la proteína GFP se expresa exclusivamente en

neuronas. Estos embriones fueron inyectados con 4.5 ng/embrión y la estructura del

cerebro y la medula espinal fue evaluada en embriones 24 hpf. Las imágenes de la figura

52 muestran el efecto de z-Tmbim3-MO en el desarrollo del cerebro del pez zebra,

obteniéndose cerebros más pequeños y con menor número de neuronas (evaluada por la

presencia de GFP). Respecto a lo observado en la medula espinal, la deficiencia de

zTmbim3 generó una evidente desorganización de los circuitos neurales, observándose

una disminución en el número de neuronas, así como en la presencia y largo de axones

(figura 53).

Figura 53: Deficiencia de Tmbim3 y la formación de estructuras cerebrales en pez zebra. Las imágenes muestran visiones dorsales de los embriones montados en una cámara. A la izquierda se muestra orientación anterior y a la derecha una orientación posterior. Los embriones transgénicos de pez zebra, los cuales expresan GFP bajo un promotor neuronal (ngn1; ngn1::GFP), fueron inyectados con 4,5 ng de Mis-MO o z-tmbim3-MO en el estadio de una célula. Luego, los embriones a 24 hpf fueron visualizados mediante microscopia confocal. Los datos representan el análisis de al menos 20 embriones para cada condición. Las estructuras marcadas con GFP corresponden a: telencéfalo (t), cerebro medio dorsal (m), interneuronas (in), neuronas sensoras Rohon-Beard (rb) sobre el fascículo longitudinal dorsal (dlf). Los límites de la medula espinal (sc) se muestran delineados con la flecha roja. La barra representa 20 µm.

rb

in

rb

in

dlf

Mis-MO

Cerebro Médula Espinal

t m 3v

A P

e

3v m t

e

97

Por otra parte se estudio si el efecto letal del morfolino destinado contra el ARNm

de zTmbim3 podría generar un daño en estadios más tempranos, previo a las 24 hpf. La

figura 53 muestra que la inyección de 4.5 ng/embrión de z-Tmbim3-MO no afecta el

proceso de gastrulación, el cual fue evaluado en embriones con un 70% de epibolia, lo

cual sugiere que los procesos tempranos de desarrollo no son dependientes de la

expresión de zTmbim3. Dado que cerca a un 80% de los embriones no fueron viables al

ser inyectados con z-Tmbim3-MO, se procedió a evaluar si este fenotipo podría ser

revertido mediante la micro-inyección de ARNm de Tmbim3 de ratón (mTmbim3)

transcrito in vitro. Con este fin, los ovocitos fertilizados de pez zebra fueron inyectados o

con el control Mis-MO, o inyectados simultáneamente con z-Tmbim3-MO más el ARNm

de gap43-cherry (control) o con el ARNm de mTmbim3. La imágenes de la figura 54

muestra que el ARNm de Tmbim3 disminuye la muerte espontánea inducida por la

deficiencia de zTMBIM3, generándose embriones normales a las 24 hpf. Esto se

cuantificó, lo cual es mostrado en el gráfico de la figura 55, donde se observa que el

ARNm de mTmbim3 rescata casi en un 100% el efecto en la sobrevida de los embriones

inyectados con el z-Tmbim3-MO, no así el ARNm de gap43-cherry. Este resultado,

sugiere que las funciones de ambos genes son conservadas

Figura 54. Sobreexpresión de m-tmbim3 y la letalidad inducida por z-Tmbim3-MO en pez zebra. Embriones de pez zebra en estado de una célula fueron inyectados con 4,5 ng de Mis-MO o zTmbim3-MO en presencia o ausencia de 50 µg del ARNm control (Gap43-cherry) o del ARNm de Tmbim3 de ratón (mTmbim3). Las imágenes de la izquierda, muestra los embriones de pez zebra, los cuales fueron fotografiados en campo claro a un 60-70% de epibolia o a 24 hpf. Los datos representan un total de 346 embriones de pez zebra. El gráfico de la derecha, muestra la cuantificación del porcentaje de embriones vivos a las 24 hpf. Los valores representan el promedio (línea) de dos experimentos independientes entre sí (círculos, triángulos y cuadrados; n=127 y 219 embriones fueron analizados en cada experimento, respectivamente).

Mis MO

z-tmbim3-MO + gap43-cherry

z-tmbim3-MO + mTmbim3

20 40 60 80

100

0 Mis MO

gap43 mTmbim3

z-tmbim3-MO

-

98

pb

11.4.4) Generación de un modelo de estrés de RE en pez zebra in vivo.

En este estudio se evaluó la contribución de z-Tmbim3 en la apoptosis generada

por estrés de RE en pez zebra. Con este fin, se generó un modelo de estrés de RE en pez

zebra, mediante la adición de Tg al medio de mantención de los peces de 24 hpf. Usando

este método, se observó una evidente inducción del procesamiento no convencional del

ARNm de xbp-1 a las 4 h de tratamiento con 1 y 5 µM de Tg, lo cual es indicativo de la

generación de estrés de RE. Además, mediante PCR en tiempo real se observó un

aumento de la expresión del ARNm de tmbim3 y chop en los embriones de 24 hpf

expuestos a Tg por 4 h (Figura 55). Estos resultados sugieren que es posible estudiar

UPR en el modelo de estrés de RE en pez zebra in vivo.

Figura 55: UPR en pez zebra: Embriones de pez zebra a las 24 hpf fueron expuestos a Tg 1 y 5 µM por 4 h. Luego, el procesamiento del ARNm de xbp-1 fue determinado mediante RT-PCR. La figura de la izquierda, muestra los fragmentos generados por el PCR correspondientes a la forma procesada (s) y no procesada (u) están indicadas en la figura. Los niveles de actina fueron monitorizados como control de carga. El grafico de la derecha muestra en los embriones descritos anteriormente, los niveles de z-Chop y z-tmbim3 relativos a actina evaluados por PCR en tiempo real. Los datos representan el promedio y la desviación estandar de dos experimentos independientes entre sí realizado en triplicado.

11.4.5) TMBIM3 protege del estrés de RE en pez zebra in vivo.

Para evaluar el efecto de la expresión de TMBIM3 en la muerte celular inducida

por estrés de RE, y considerando el efecto de “rescate” realizado por el ARNm de

mTmbim3 ante la disminución de la expresión de zTmbim3 endógeno, se procedió a

100

zActin

Tg (µM) 0 1 5

Niv

eles

de

mR

NA

0 - Tg - Tg

0.4

0.8

zchop zTmbim3

zXBP-1u zXBP-1s

100

99

sobreexpresar la proteína mediante la micro-inyección del ARNm de mTmbim3 en

ovocitos fertilizados en estadio de una célula. La presencia del ARNm de mTmbim3 fue

corroborada en los embriones de 24 hpf mediante PCR semi-cuantitativo, así como la

presencia del ARNm de zTmbim3 endógeno (Figura 56).

Figura 56: Análisis de la expresión de m-Tmbim3 en pez zebra. Embriones de pez zebra fueron inyectados con 50 pg de ARNm de tmbim3 de ratón sintetizado in vitro (mTmbim3). Luego de 24 h, la presencia del ARNm de mTmbim3 exógeno fue determinado mediante RT-PCR. Los niveles del ARNm de z-tmbim3 endógeno fueron evaluados mediante RT-PCR como control del experimento.

Posteriormente, se evaluó en embriones de 8 hpf, el efecto en la muerte celular

inducido por un tratamiento de Tg por 4 h. Las imágenes de la figura 57 muestran el

efecto en la muerte celular de dos dosis de Tg en los embriones utilizados como control y

aquellos que sobreexpresan mTmbim3. La muerte celular fue evaluada mediante la

tinción de los embriones con naranja de acridina y posteriormente adquisición de las

imágenes con un microscopio de fluorescencia. El inserto en cada imagen, muestra una

foto tomada al mismo plano con la luz transmitida. En la figura 56 se puede observar que

la sobreexpresión de m-Tmbim3 disminuye la muerte ante una exposición aguda a estrés

de RE inducida por Tg in vivo.

100

100 zTmbim3

mTmbim3

Contro

l m

Tmbi

m3

pb

100

Figura 57: tmbim3 y el control de la muerte celular inducida por Tg en pez zebra in vivo. Embriones de pez zebra a las 8 hpf fueron expuestos a Tg por 4 h. Luego la muerte celular fue determinada mediante tinción de los embriones con naranjo de acridina y evaluada mediante fluorescencia. Las imágenes insertas en el extremo superior izquierdo de cada imagen, muestra las fotografías adquiridas en el mismo plano que la fotografía fluorescente, pero con el campo claro. Los datos representan tres experimentos independientes entre sí, donde 3-5 embriones fueron analizados por cada determinación.

Además, se observó que la exposición a Tg por 4 h genera una curvatura en la

cola del pez zebra. Este fenómeno fue revertido completamente en aquellos embriones

que sobre-expresan m-Tmbim3, lo cual sugiere un amplio papel protector de tmbim3 in

vivo (Figura 58). Estos resultados sugieren en conjunto que z-Tmbim3 podría tener un

papel importante en control de la apoptosis durante el desarrollo y en la regulación de la

muerte inducida por estrés de RE in vivo.

Figura 58: c Los cambios en la morfología de las colas de los embriones de pez zebra fueron determinados a las 24 hpf en los embriones tratados como se describió en la figura 54. Los datos son representativos de tres experimentos independientes entre sí, donde un total de 10-15 embriones fueron analizados para cada condición por experimento.

101

12) Discusión.

12.1) TMBIM3 es parte de una familia conservada de proteínas con actividad

antiapoptótica: el mundo pre-bcl2.

La regulación fina de la apoptosis es esencial para el desarrollo de los organismos

multicelulares y la mantención de la homeostasis de los tejidos en el adulto. Respecto a

este punto, gran parte de los estudios de la apoptosis se han enfocado en entender el

papel de las proteínas de la familia BCL-2 en este proceso, y específicamente en definir y

esclarecer los eventos moleculares y las señales bioquímicas que convergen en la

mitocondria. Esto puede ser explicado, en gran parte, por una razón histórica. A finales

de los años 80 y principios de los 90, se identificó el gen bcl-2 (Negrini et al, 1987;

Tsujimoto et al, 1987), cuya sobreexpresión en linfocitos B podría ser la causa de una

forma particular de un linfoma, contribuyendo a la patogénesis en esta forma de leucemia

(Butturini & Gale, 1990; Crescenzi et al, 1988; Ngan & Berinstein, 1990). Posteriormente,

BCL-2 fue identificada como una proteína localizada en la mitocondria (Reed et al, 1991),

hechos que ayudaron a establecer el papel de estas proteínas en la muerte celular

programada y en la carcinogénesis. Posteriormente, el descubrimiento de BCL-2 llevo a la

identificación de distintos homólogos de secuencia primaria, capaces de interactuar entre

ellos lo que llevo a la definición de una familia de proteínas denominada familia BCL-2

(Kozopas et al, 1993; Larsen, 1994; Lin et al, 1996; Meijerink et al, 1995; Reed, 1995;

Takayama et al, 1995; Yang et al, 1995). Aunque las proteínas de la familia BCL-2 son

esenciales en la regulación de la apoptosis, esta actividad ha sido limitada básicamente a

modelos mamíferos, debido a que la mayoría de los miembros de la familia BCL-2 son

pobremente conservados en otras especies, pese a que la muerte celular programada

tiene un papel fundamental en el desarrollo y mantención fisiológica de los organismos

multicelulares (Degterev & Yuan, 2008; Youle & Strasser, 2008). Un ejemplo de esto es la

presencia de solo dos homólogos putativos de componentes de la familia de proteínas

BCL-2 en D.melanogaster, con papeles controversiales en la muerte celular programada

(Galindo et al, 2009; Kornbluth & White, 2005; Sevrioukov et al, 2007; Wu et al, 2010) y

recientemente fueron descritos funcionalmente algunos miembros de esta familia de

proteínas en pez zebra (Jette et al, 2008). Sin embargo, en otros organismos, incluyendo

102

levadura y plantas, ningún homologo funcional de la familia BCL-2 ha sido descrito

(Ameisen, 2002; Hengartner, 1996; Hengartner & Horvitz, 1994; Youle & Strasser, 2008)

pese a ser reconocida diversas formas de muerte celular programada en estos

organismos. Esto, contrasta fuertemente con los estudios genéticos y bio-informáticos que

han descrito a los miembros de la familia TMBIM como genes altamente conservados en

la evolución (Chae et al, 2003; Hu et al, 2009; Reimers et al, 2008), con un posible

ancestro en común en levadura con una controvertida actividad antiapoptótica (Buttner et

al, 2011; Cebulski et al, 2011; Huckelhoven, 2004). Incluso, ha sido descrita la presencia

de homólogos en virus (Gubser et al, 2007) o en bacterias (van Stelten et al, 2009).

La proteína TMBIM6/BI-1 es el miembro de la familia TMBIM mejor caracterizado a

la fecha, y es la única cuya actividad antiapoptótica ha sido validada in vivo. Existen

pocos estudios que se han enfocado en estudiar el posible papel antiapoptótico de otros

miembros de la familia TMBIM en modelos celulares. Sin embargo, ninguno de estos

trabajos ha logrado descifrar el probable mecanismo por el cual ejercen un papel

antiapoptótico, y en ninguno de ellos se ha ensayado la probable interacción entre los

miembros de la familia TMBIM lo cual contrasta fuertemente con toda la literatura

existente para la familia BCL-2.

Actualmente, se ha descrito para TMBIM2/LFG que se localiza principalmente en

membrana citoplasmática y específicamente, en microdominios o balsas lipídicas

denominadas “lipid-raft” y existen varios estudios que muestran que su sobreexpresión

disminuye la apoptosis inducida por el ligando de Fas, con una relevante actividad en

neuronas (Beier et al, 2005; Fernandez et al, 2007; Schweitzer et al, 2002; Somia et al,

1999). Para TMBIM1/RECS1 se describió que se localiza en lisosomas, aparato de Golgi

y membrana plasmática (Zhao et al, 2006b; Zhao et al, 2006c), y solo un estudio ha

demostrado su impacto en la apoptosis inducida por el ligado de Fas (Shukla et al, 2011).

TMBIM4/GAAP se localiza exclusivamente en el aparato de Golgi y su expresión

disminuye la muerte inducida por diversos estímulos intrínsecos (sobreexpresión de BAX

y tratamientos con estaurosporina, cisplatino y ceramida c2) y estímulos que inducen

apoptosis extrínseca (ligando de Fas y TNFα) (de Mattia et al, 2009; Gubser et al, 2007).

TMBIM5/GHITM se localiza en la mitocondria y su expresión previene la fragmentación

mitocondrial y la liberación de citocromo c inducido por tratamientos con actinomicina D

103

(Oka et al, 2008). Respecto a trabajos que vinculen a TMBIM3/GRINA con su probable

papel antiapoptótico, existe un trabajo en donde se analizó una biblioteca de cDNA y se

identificó un fragmento del cDNA de TMBIM3/GRINA como un posible inhibidor de la

muerte inducida por la toxina Shiga, mediante la retención del receptor Gb3 en el aparato

de Golgi. Además, la expresión del TMBIM1,2,4,6, pero no TMBIM5 ni el fragmento

completo de TMBIM3, también presentaron un efecto protector ante la toxina Shiga

(Yamaji et al, 2010). Respecto al papel de TMBIM3 in vivo, recientemente, un trabajo

confirmó la expresión de TMBIM3 en el sistema nervioso central y además publicó la

generación de un ratón deficiente en TMBIM3, el cual no presenta un fenotipo espontáneo

(Nielsen et al, 2011). Sin embargo no se realizaron estudios en donde evaluarán la

susceptibilidad de este ratón ante modelos patológicos, como lo fue descrito para

TMBIM6. Por otra parte, en este estudio se corroboró el tamaño predicho de la proteína

(38 Kda) y su localización tanto en aparato de Golgi, como en RE, mediante estudios de

inmuno-fluorescencia indirecta, lo cual coincide con los resultados presentados en esta

tesis. Respecto al análisis de la actividad antiapoptótica, en este trabajo se presentó un

discreto análisis en donde la expresión transitoria de TMBIM3 disminuyó la muerte

inducida por H2O2 en células COS. Esto coincide con los resultados obtenidos en esta

tesis en donde la sobreexpresión estable de TMBIM3 inhibe la muerte, así como la sobre-

carga de Ca2+ citosólico inducida por H2O2 en las células MEFs.

A la fecha, los estudios existentes que han descrito el papel de algunos miembros

de la familia TMBIM in vivo se han basado en TMBIM6. La expresión de TMBIM6 ha sido

propuesta como un factor importante en el desarrollo del cáncer (Lee et al, 2010; Reimers

et al, 2008), al favorecer la transformación e inmortalización celular, inhibir la apoptosis en

células tumorigénicas y aumentar la metástasis (Lee et al, 2010). Por otra parte, los

ratones deficientes en TMBIM6 son viables y no presentan un fenotipo espontáneo

aparente. Sin embargo, la deficiencia de TMBIM6 en ratones se tradujo en un aumento

del área del tejido renal dañado en respuesta a isquemia y reperfusión (Chae et al, 2004;

Krajewska et al, 2010); así como, paradójicamente, en un aumento en la regeneración del

hígado después de una hepatoctomía parcial (Bailly-Maitre et al, 2007). Por otra parte, la

sobreexpresión de TMBIM6 mediante adenovirus en hígado mejoró el metabolismo

asociado a glucosa en ratones con dieta normal y en ratones con dieta rica en grasa y

revertió la hiperglicemia en ratones espontáneamente obesos (Bailly-Maitre et al, 2010). A

104

demás, mediante el uso de lentivirus codificantes para shRNA destinados contra el RNAm

de TMBIM6 se determinó que la disminución de los niveles de TMBIM6 previene la

proliferación ex vivo de células cancerígenas, así como el crecimiento de los tumores de

carcinoma nasofaringeal (Li et al, 2011b). Por otra parte, los estudios para establecer el

papel de TMBIM6 se han extendido a otros sistemas, por ejemplo, recientemente se

determinó que la expresión de TMBIM6 es necesaria para la inhibición de la apoptosis

regulada por la proteína NIeH durante la infección de Escherichia coli enteropatogenica

(Hemrajani et al, 2010). Ratones deficientes en TMBIM2 también son viables. Sin

embargo la eficiencia de este gen induce un aumento en la susceptibilidad de sufrir

dilatación de la aorta, así como un aumento en la degeneración media cística, lo cual

podría hacer presumir un importante rol de TMBIM2 en la mantención de la homeostasis y

fisiología cardiovascular (Zhao et al, 2006b).

Otro ejemplo de la relevancia de los miembros de la familia TMBIM, así como su

alto grado de conservación es la presencia de un homologo de TMBIM4 en Vaccinia virus,

gen que conserva la actividad antiapoptótica y que además controla positivamente la

virulencia del virus en un modelo de infección murina (Gubser et al, 2007).

Por último, y como otra evidencia de que el alto grado de conservación de TMBIM

no se restringe solamente a su secuencia, recientemente un grupo publicó que el único

gen que ha sido indicado como un homologo putativo para los miembros de la familia

TMBIM en levadura conserva, tanto su localización sub-celular, limitándose al RE, así

como su actividad antiapoptótica frente a distintos estímulos (estrés de temperatura y

metabólico, muerte inducida por etanol y estrés de RE) así como su capacidad de inhibir

la UPR (Cebulski et al, 2011), efecto que previamente había sido descrito por nuestro

laboratorio en un modelo murino (Lisbona et al, 2009) y corroborado posteriormente por el

grupo de Bailly-Maitre (Bailly-Maitre et al, 2010). Todos estos ejemplos, apuntan a un

hecho que con el pasar del tiempo se ha vuelto más evidente, y es que las proteínas de

la familia TMBIM, no solo presentan un alto grado de conservación, si no que presentan

una gran relevancia en diversos procesos biológicos.

En este trabajo, se ha investigado en diversos modelos tanto in vitro como in vivo,

el posible impacto de TMBIM3 en la regulación de la apoptosis. Basado en modelos de

ganancia y pérdida de función, en esta tesis se ha descrito que TMBIM3 presenta una

105

conservada actividad supresora de la apoptosis inducida por estrés de RE, sin afectar la

muerte inducida por otros estímulos que inducen apoptosis, como TNFα, daño al DNA

privación de nutrientes o ausencia de factores de crecimientos. A demás, la reducción de

los niveles de TMBIM3 en ausencia de su ortólogo TMBIM6 induce apoptosis espontánea

en células MEFs e incrementa la susceptibilidad de estas células a la muerte inducida por

estrés de RE, lo cual hace presumir que ambas proteínas sinergizan en sus actividades

antiapoptóticas. De manera similar, en estudios de pérdida de función in vivo, se generó

un modelo en D. melanogaster en donde se evidenció que TMBIM3 y TMBIM6 tienen

potentes y sinérgicas actividades pro-sobrevida bajo condiciones de estrés de RE. Esto,

se suma a la evidencia que muestra que la generación de moscas deficientes en tmbim3 y

tmbim6 induce apoptosis espontanea en los intestinos de las larvas, así como la

disminución de la viabilidad de las moscas, lo cual podría reflejar un papel relevante en la

mantención de la viabilidad celular. Interesantemente, el efecto de TMBIM3 y TMBIM6 en

la mantención de la sobrevida y muerte de los animales contrasta con lo descrito para los

únicos dos ortólogos de BCL-2 y BAX en mosca, en donde la generación de mutantes

para buffy (BCL-2) o debcl (BAX) no se tradujo en un fenotipo espontáneo en D.

melanogaster (Galindo et al, 2009; Sevrioukov et al, 2007). La importancia de la familia

BCL-2 en D. melanogaster en la mantención y control de la muerte celular podría ser

secundaria respecto a la familia TMBIM, dado que todos los miembros descritos de la

familia TMBIM están presentes en mosca y presentan, en algunos casos, hasta el doble

de grado de identidad y similitud respecto a buffy y debcl.

Por otra parte, en esta tesis se estudio la función in vivo de TMBIM3 en un modelo

vertebrado. Con este fin, se corroboró la presencia del z-TMBIM3 en pez zebra, se clonó

el cDNA y se sintetizó un morfolino con el fin de bloquear la traducción del mRNA. La

disminución de la expresión de z-TMBIM3 en pez zebra, generó un aumento de la

apoptosis durante el desarrollo y produjo drásticas alteraciones en la morfología del

cerebro y la sobrevida neuronal. Por otra parte, la expresión de TMBIM3 de ratón en pez

zebra, rescató completamente el fenotipo observado al bloquear la expresión de su

homologo endógeno en pez zebra, lo cual indica que sus funciones son conservadas. En

consistencia con el fenotipo en el sistema nervioso central descrito en esta tesis, destaca

la evidencia que indica que TMBIM3 es uno de los 28 genes que se expresan

preferentemente en la zona marginal en el desarrollo de la corteza cerebral del ratón

106

(Tachikawa et al, 2008), así como el patrón de expresión en el sistema nervioso central

descrito en D. melanogaster (Pellicena-Palle & Salz, 1995) o el estudio de expresión del

ARNm hecho mediante PCR en tiempo real para Tmbim3 en tejidos de ratón durante el

desarrollo de esta tesis.

12.2) Regulación del tmbim3, uno nuevo blanco de la UPR

Nuestros resultados indican que la expresión de tmbim3 en cultivo es

posiblemente regulada bajo condiciones de estrés de RE a nivel transcripcional, y que es

controlada por la vía de la UPR dependiente de PERK/ATF4. Esta regulación

transcripcional podría explicar la actividad antiapoptótica específica de TMBIM3 bajo

condiciones de estrés de RE. Dado que la activación de la vía de PERK ha sido sindicada

como una señal fundamentalmente de adaptación frente a la condición de estrés de RE y

como consecuencia de esto, de sobrevida celular (Harding et al, 2000b), podría

especularse que la regulación de TMBIM3 es un componente protector de esta vía

durante la etapa adaptativa de la UPR. Esta idea está acorde con la observación de una

menor viabilidad celular de células MEFs deficientes en PERK expuestas a una condición

de estrés de RE. Por otra parte, el control sobre la muerte celular ejercido por la vía

PERK/ATF4 ha sido ligado a la regulación de la expresión de miembros de la familia BCL-

2, disminuyendo la expresión de BCL-2 (Puthalakath et al, 2007) e incrementado la

expresión de miembros pro-apoptóticos, como BIM, PUMA y NOXA (revisado en

(Rodriguez et al, 2011).. Si bien, el control que podría ejercer TMBIM3 o cualquiera de los

miembros de la familia TMBIM sobre la apoptosis inducida por los miembros pro-

apoptóticos de la familia BCL-2, aún no ha sido estudiada, la evidencia que relaciona

ambas familias de proteínas se limita, básicamente, a estudios de co-inmunoprecipitación

que establecen que bajo condiciones basales, tanto TMBIM6 (Xu & Reed, 1998), TMBIM2

(Reimers et al, 2006) y TMBIM3 pueden interactuar con BCL-2. Sin embargo, el posible

impacto funcional de estas interacciones no ha sido estudiado y no existen antecedentes

a la fecha que evalúen si la formación de complejos proteicos entre los miembros de la

familia BCL-2 con las proteínas miembros de la familia TMBIM puede ser regulada bajo

condiciones de estrés de RE o si la regulación de ambos grupos de genes podría ser

preponderante en la muerte inducida por los miembros pro-apoptóticos de la familia BCL2.

107

Retomando la relación entre TMBIM3 y la UPR, queda pendiente evaluar si esta

proteína comparte el control que ejerce TMBIM6 sobre la inactivación IRE1α. Tal como se

describió previamente, TMBIM6 inhibe la actividad RNAsa de IRE1α bajo condiciones de

estrés de RE, siendo un factor necesario para el retorno a un estado inactivo de IRE1α

bajo condiciones de estrés de RE crónico (Lisbona et al, 2009). Considerando que la

activación de las vías de la UPR, no desencadena señales unidireccionales que actúan

descoordinadamente y como ejemplo de esto es el control positivo que ejerce ATF6 sobre

la expresión del mRNA de xbp-1, el cual es procesado posteriormente por IRE1α; en este

trabajo, se determinó que la presencia de IRE1α no es necesaria para el incremento del

ARNm de tmbim3 bajo condiciones de estrés de RE, pero no puede descartarse que

TMBIM3 ejerza alguna acción sobre la actividad de IRE1α bajo condiciones de estrés de

RE, al igual como lo que ha sido descrito para TMBIM6

Por otra parte, se evalúo in vivo la regulación de la expresión de tmbim3. Con este

fin, se determinó que el ARNm de tmbim3 fue fuertemente incrementado en los riñones de

ratones expuestos a Tm mediante inyección intra-peritoneal. Sin embargo, no se observó

un incremento en el hígado de los mismos ratones, lo cual contribuye al concepto que las

características de la UPR son fuertemente dependientes del contexto fisiológico y del

tejido en estudio. Además, utilizando ratones deficientes en ATF4 se estableció que la

presencia de este factor transcripcional es necesaria para la regulación de la expresión

del ARNm tmbim3 bajo condiciones de estrés de RE.

12.3) Regulación del Ca2+ mediada por tmbim3, el vínculo con el control de la

apoptosis inducida por estrés de RE.

Dado el alto grado de similitud entre las secuencias primarias los miembros de la

familia TMBIM, se estudio si TMBIM3 presenta un efecto en la regulación de la

homeostasis de Ca2+ que ya ha sido descrito para TMBIM6 (Xu & Reed, 1998) y TMBIM4

(de Mattia et al, 2009). Del mismo modo, se observó que las células que sobreexpresan

TMBIM3 experimentan una drástica disminución del Ca2+ liberado desde el RE. Sin

embargo, los niveles basales de Ca2+ en el RE no fueron afectados. En consecuencia con

esto, se observó que la doble deficiencia de TMBIM3 y TMBIM6 sinergiza respecto al

control del Ca2+ liberado desde el RE. Además del efecto de la sobreexpresión de

108

TMBIM3 en la liberación de Ca2+ desde el RE mediada por IP3, se determinó que TMBIM3

co-inmunoprecipita con el IP3-R1 y con el IP3-R3. Estos resultados permiten especular

que TMBIM3 podría tener un efecto inhibidor sobre el IP3-R al formar un complejo

proteico.

El control en la liberación del Ca2+ ejercido por TMBIM3 podría tener un impacto

significativo en la apoptosis inducida por estrés de RE. Esto fue corroborado en los

experimentos donde se observó una disminución de la muerte inducida por estrés de RE

crónico al usar 2-APB, un inhibidor farmacológico del IP3-R. Sin embargo, el mecanismo

exacto de cómo TMBIM3 regula la homeostasis del Ca2+ aún no ha sido determinada. Por

otra parte, la liberación de Ca2+ desde el RE, en primera instancia podría ser fundamental

para la mantención del potencial mitocondrial, favoreciendo de este modo, la producción

de ATP, lo cual podría ser considerado como un mecanismo que favorece la sobrevida

celular, ante la alta demanda metabólica que podría generarse ante condiciones de estrés

de RE (Bravo et al, 2011). En contraste con esto, debe considerarse que la apoptosis es

un mecanismo de muerte controlado, el cual necesita ATP para la formación del

apoptosoma y posterior activación de las caspasas efectoras (Youle & Strasser, 2008).

Por lo tanto el control de las señales de Ca2+ emanadas desde el RE no pueden ser

consideradas unidireccionales, ya sea señales pro-sobrevida celular o pro-apoptosis. Otro

ejemplo de esto, es el papel que descrito para las proteínas de la familia BCL-2 en el RE,

ejerciendo un control en la homeostasis de Ca2+, en donde BCL-2 puede inhibir al IP3-R,

modulando su fosforilación y a su vez el flujo de Ca2+ desde el RE hacia el citoplasma

(revisado en (Pinton & Rizzuto, 2006) o BCL-XL que regula la frecuencia e intensidad de

estas señales (White et al, 2005). Por otra parte, BAX y BAK sinergizan en el RE, de

modo que la ausencia de ambas proteínas disminuyen el contenido neto de Ca2+ en

lumen del RE (Oakes et al, 2005; Scorrano et al, 2003), similar al fenotipo observado en

células en donde se sobre-expresa BCL-2 (algunos ejemplos en Bassik et al, 2004;

Distelhorst et al, 1996; Lam et al, 1994; Oakes et al, 2003; Pinton et al, 2000). Este efecto

sinérgico parece no ser restringido para la familia BCL-2, dado lo observado para TMBIM3

y TMBIM6, en donde ambas proteínas parecen tener actividades complementarias

respecto del control del Ca2+ y en la apoptosis inducida por estrés de RE.

109

12.4) TMBIM3 y TMBIM6: compañeros en el control de la muerte celular.

La disminución simultánea de la expresión de TMBIM3 y TMBIM6 se traduce en un

fenotipo celular relacionado con la inducción de apoptosis espontanea. Esta observación

sugiere que existe una compleja red de proteínas que podrían ejercer su actividad desde

la membrana del RE, en donde distintos miembros de la familia TMBIM podrían

interactuar funcionalmente y sinergizar desde el RE en el control de la muerte celular.

Esta idea podría ser apoyada por la evidencia que demuestra la existencia de

heterodímeros formados por TMBIM3 y TMBIM6, lo cual fue evaluado mediante co-

inmunoprecipitación de ambas proteínas.

El efecto sinérgico en las proteínas que controlan la apoptosis también ha sido

descrito para los miembros de la familia BCL-2. Cabe destacar que todas las señales

mediadas por los miembros de la familia BCL-2 convergen en la activación de BAX/BAK,

favoreciendo la formación de un poro en la membrana mitocondrial con la consecuente

salida de citocromo c y activación posterior del apoptosoma. Respecto al sinergismo entre

estas proteínas, la evidencia existente en la literatura muestra que la mono-deficiencia de

BAX o BAK no implica un efecto importante en el control de la muerte celular, mientras

que la doble deficiencia de ambas proteínas, tanto en ratones como en células, resulta en

una alta resistencia a estímulos intrínsecos de apoptosis, incluyendo el estrés de RE

(Hetz et al, 2006; Scorrano et al, 2003; Wei et al, 2001). Del mismo modo, las células

deficientes en las proteínas BH3-Only BIM o PUMA, son ligeramente resistente a la

apoptosis (Erlacher et al, 2006; Kim et al, 2009). Sin embargo, esta resistencia se

incrementa enormemente en las células doble deficientes o en aquellas triple deficientes

para BIM/PUMA/BID (Ren et al, 2010). Este efecto podría ser explicado porque las

proteínas BH3-only pueden activar directamente a BAX/BAK o inhibir a los miembros

antiapoptóticos, de manera dependiente de su dominio BH3. Interesantemente, la doble

deficiencia para BAX y BAK ha sido descrita como letal. Sin embargo, el 10% de los

animales es viable (Wei et al, 2001), lo cual sugiere que existen otros reguladores de la

muerte celular programada que pueden compensar o controlar la apoptosis,

independiente de las proteínas de la familia BCL-2. En esta tesis, un fenómeno similar fue

observado en D. melanogaster en donde la doble deficiencia de TMBIM3 y TMBIM6

110

sinergizan en el control de la muerte celular, lo cual se refleja en una disminución

significativa de individuos adultos viables.

Otro punto importante a considerar es la reciente descripción de un dominio BH3

en la proteína Bxi1p/Ybh3p (Buttner et al, 2011), codificada por el gen YNI305C presente

en levadura, el cual es el homologo putativo para los miembros de la familia TMBIM.

Aunque el rol de Bxi1p/Ybh3p en la apoptosis puede ser considerada controversial, dado

que dos trabajos describen actividades contrarias (Buttner et al, 2011; Cebulski et al,

2011), resulta interesante la presencia de un dominio BH3 en las proteínas de la familia

TMBIM, dado su alto grado de conservación y su presencia en virus, plantas, insectos y

mamíferos. En humanos, la presencia de un putativo dominio BH3 ha sido descrito en el

extremo C-terminal de las proteínas TMBIM1, 2 (Buttner et al, 2011). Sin embargo, se

desconoce el posible rol funcional de estos dominios en el control de la apoptosis.

Además, la presencia de Bxi1p/Ybh3p como única proteína en levadura, permite

especular que Bxi1p/Ybh3p pudiera operar como un único miembro de ambas familias en

levadura, mientras que en animales podría haberse desarrollado un sofisticado sistema

regulatorio formado por componentes de la familia BCL-2 y los miembros de la familia

TMBIM. Esta idea, podría ser apoyada por las interacciones descritas entre TMBIM3 y

TMBIM6 con BCL-2, así como con la evidencia que describe que tanto TMBIM6, como

TMBIM5 pueden inhibir la muerte inducida por BAX. Estos dos hechos en conjunto,

apoyan la idea de la existencia de dos familias de proteínas que, coordinadamente,

podrían controlar le muerte celular. Por otra parte, podría ser interesante determinar si, al

igual que los miembros de la familia BCL-2, los miembros de la familia TMBIM poseen

actividades complementarias, sinérgicas o incluso opuestas en consecuencia con la

presencia o ausencia de los dominios BH3 putativos. Como antecedente a esta idea, en

esta tesis se presenta por primera vez el efecto sinérgico en la viabilidad observado ante

la deficiencia de TMBIM3 y TMBIM6, tanto en cultivos celulares mamíferos, como in vivo

en D. melanogaster.

12.5) TMBIM3 y su función en el sistema nervioso.

Basado en el patrón de expresión neuronal de TMBIM3 y la asociación del estrés

de RE y distintas enfermedades neurodegenerativas (Matus et al, 2011), en esta tesis se

evaluó la contribución de TMBIM3 en la fisiología del sistema nervioso además del

111

impacto de TMBIM3 bajo condiciones patológicas. Aproximadamente hace dos décadas

atrás un gen homólogo putativo de TMBIM3/GRINA fue descrito en rata como una

proteína unida al receptor de NMDA, cuyo nombre asignado fue NMDARA1 o GBP, del

inglés Glutamate Binding Protein (Kumar et al, 1991). El empeño de los autores en

identificar un nuevo subtipo de receptores de glutamato fue contrariado ante las dudas

generadas por la falta de evidencias y ante un probable error en el método de clonamiento

(Hollmann & Heinemann, 1994). Esto, habría resultado en la obtención de un gen que

codifica para una proteína con un peso estimado en 56 KDa (Kumar et al, 1991). No

obstante, los estudios bioquímicos arrojaron que el peso molecular aparente de esta

proteína sería cercano a los 70 KDa, lo cual contrasta con el peso predicho para la

proteína codificada por los genes homólogos en ratón o humano. Estas diferencias en el

peso molecular podrían ser explicadas por que la secuencia clonada en 1991 generaría

una proteína con un extremo C terminal adicional.

Previamente se describió que GBP se localiza en cuerpos neuronales y dendríticos

en el cerebro y la medula espinal (Eaton et al, 1990; Mattson et al, 1991; Pal et al, 1999).

Además, se determinó que el ARNm de GBP podía ser incrementado en neuronas

expuestas crónicamente a etanol (Bao et al, 2001; Bhave et al, 1996; Chen et al, 1997), y

que además presenta un posible rol protector ante el daño generado por isquemia y

reperfusión en la retina (Aikawa et al, 2003). En esta tesis, se describió que la expresión

de TMBIM3 es esencial para el desarrollo y generación de estructuras cerebrales en pez

zebra, lo cual podría dar cuenta de un probable papel protector de TMBIM3 en el sistema

nervioso central. Sin embargo, un reciente reporte describe la ausencia de un fenotipo

espontáneo como consecuencia de la generación de un ratón deficiente para TMBIM3

(Nielsen et al, 2011). Por otra parte, el efecto de la deficiencia de TMBIM3 ante

condiciones fisiológicas no fue evaluado en este modelo murino. Por último, pero no

menos relevante, está el antecedente que describe que el gen de TMBIM3 humano está

asociado una duplicación génica en un locus ligada genéticamente a la generación de

epilepsia (Bonaglia et al, 2005; Lewis et al, 1996).

Los antecedentes obtenidos a la fecha acerca de TMBIM3, así como de toda la

familia TMBIM y en conjunto con los resultados obtenidos en esta tesis, hacen necesario

considerar un análisis sistemático para establecer y definir si existe una organización

112

jerárquica entre sus componentes, así como el papel que juega la interacción con los

miembros de la familia BCL-2. Esto podría ser relevante tanto en el desarrollo, como en la

mantención de la homeostasis fisiológica, así como en la patogenia de enfermedades

relacionadas con la alteración en el plegamiento de proteínas.

12.6) TMBIM3: un nuevo y conservado gen regulado por la UPR que inhibe la

apoptosis inducida por estrés de RE mediante el control de la homeostasis del Ca2+.

Los antecedentes reunidos en esta tesis permiten proponer a TMBIM3 como parte

funcional de la familia de proteínas TMBIM, la cual, desde el RE, coordina en conjunto con

TMBIM6 una respuesta antiapoptótica, específicamente, bajo condiciones de estrés de

RE. Estudios en modelos celulares y animales, nos demostraron que los niveles de

expresión del ARNm de tmbim3 son fuertemente incrementados en respuesta a estrés de

RE, como consecuencia de la activación de la vía de la UPR comandada por el sensor de

estrés de RE PERK y el factor de transcripción ATF4. Por otra parte, se describió que

TMBIM3 sinergiza con TMBIM6, respecto al control de la apoptosis, así como en la

sobrevida de animales en estado adulto. Además, se evalúo el efecto de TMBIM3 en el

control de la homeostasis del Ca2+, observándose que TMBIM3 inhibe la salida de Ca2+

desde el RE, efecto que podría estar asociado con la interacción descrita entre TMBIM3 y

el IP3-R evaluado mediante co-inmunoprecipitación (Figura 58).

Los estudios de pérdida de función en D. melanogaster demostraron que TMBIM3

y TMBIM6 tienen actividades pro-sobrevida, las cuales están funcionalmente relacionadas

en respuesta al estrés de RE in vivo. De manera similar, la manipulación de los niveles de

TMBIM3 en pez zebra, reveló un papel esencial de TMBIM3 en el control de la apoptosis

durante el desarrollo neuronal y en modelos de estrés de RE. Todos estos hallazgos en

conjunto, sugieren la existencia de un grupo conservado de reguladores relacionados

funcionalmente con muerte celular.

113

Figura 59. Modelo propuesto: Rol de TMBIM3 en la mantención de la sobrevida celular y como blanco de la UPR que controla la apoptosis mediante la inhibición del receptor de IP3. La expresión de TMBIM3 es escencial para la mantención de la sobrevida celular bajo condiciones normales y durante el desarrollo. Por otra parte, bajo condiciones de estrés de RE se induce la activación del sensor de estrés de RE PERK, favoreciéndose su auto-transfosforilación. Río abajo, se induce la expresión del factor transcripcional ATF4, el cual se transloca al núcleo y regula la expresión de sus genes blancos. Directa o indirectamente regulado por ATF4, se induce la expresión de tmbim3. TMBIM3 dimeriza con TMBIM6 en el RE. A su vez, el flujo de Ca2+ desde el RE hacia el citoplasma mediante el receptor de IP3 (IP3R) es inducido bajo condiciones de estrés de RE favoreciendo la activación de apoptosis, proceso el cual podría ser inhibido por TMBIM3.

Citoplasma

114

13) Conclusiones

Las conclusiones más relevantes del trabajo realizado en esta tesis son:

• TMBIM3 tiene actividad antiapoptótica bajo condiciones basales y de estrés de

RE.

• TMBIM3 y TMBIM6 tienen actividades complementarias.

• TMBIM3 interactúa con TMBIM6.

• Tmbim3 aumenta bajo condiciones de estrés de RE, mediante un mecanismo

dependiente de la vía PERK/ATF4.

• La expresión de TMBIM3 controla la homeostasis del calcio y disminuye la muerte

inducida por estrés de retículo mediada por Calcio.

• TMBIM3 interactúa con BCL-2, IP3R1 e IP3R3.

• TMBIM3 y TMBIM6 tienen actividades antiapoptóticas complementarias (in vitro e

in vivo).

• La deficiencia de Tmbim3 aumenta la apoptosis durante el desarrollo en pez

zebra.

• TMBIM3 tiene actividad antiapoptótica en un modelo de estrés de RE en pez

zebra.

115

14) Bibliografía.

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Tesis Doctorado en Bioquimica Diego Rojas Rivera

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