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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR
ÁREA DE CONOCIMIENTO DE CIENCIAS DEL MAR
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA MARINA
TESIS
DINÁMICA ANUAL DE LA ESTRATEGIA, ESFUERZO
REPRODUCTIVO Y CALIDAD OVOCITARIA DEL MEJILLÓN
Modiolus capax (Bivalvia: Mytilidae; Conrad, 1837)
EN LA BAHÍA DE LA PAZ, B.C.S. MÉXICO
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
BIÓLÓGO MARINO
PRESENTA:
JOSÉ LUIS GARCÍA CORONA
DIRECTOR(A):
Dra. CARMEN RODRÍGUEZ JARAMILLO
LA PAZ, BAJA CALIFORNIA SUR, DICIEMBRE 2014.
A mi familia
Por creer en mí, por apoyarme siempre de manera incondicional,
por estar conmigo en los buenos y malos ratos, pero sobre todo, por
dejarme ir hasta donde mis sueños me permitieron… por todo su
amor.
A mis padres
Blas García Castañeda y Gloria Corona Espinosa, por su inmenso amor, apoyo
incondicional, y valores firmes, por dejarme dedicarme a lo que siempre fue
mi sueño, gracias a ustedes he logrado llegar hasta aquí y convertirme en lo
que ahora soy, ustedes han sido mi mejor ejemplo a seguir y por ello es un
privilegio ser su hijo.
A mis hermanos
Osvaldo y Francis, por ser mis dos personas favoritas, por compartir
conmigo del amor y sacrificio de nuestros padres, pero lo más valioso para
mí, por quererme cada uno a su manera con mis defectos y virtudes.
Que cada logro… sea motivado por nuestros sueños, coraje y perseverancia, y que cada triunfo sea
considerado la meta de lo que nos hemos planeado y el principio de un nuevo éxito…
Porque todo logro comienza con la decisión de intentarlo.
AGRADECIMIENTOS
De manera especial dedico el primer agradecimiento de esta que es mi mayor obra académica hasta el momento a una gran investigadora, virtuosa y tenaz mujer, pero sobre todo, gran ser humano y amiga… Gracias por siempre Dra. Carmen Rodríguez Jaramillo, por ser un ejemplo a seguir, por dirigir mi trabajo de tesis, por compartir conmigo de toda esa sabiduría y conocimientos suyos, por su paciencia ante mi inexperiencia, pero lo más valioso para mí, gracias por brindarme su gran amistad y cariño, algo que tenga por seguro, atesoro muy dentro de mi ser. Ha sido un honor ser su tesista y amigo, esta es solo una meta, vamos por muchos éxitos más.
No soñemos nuestra vida, vivamos nuestros sueños porque todo logro es un triunfo compartido.
A la Universidad Autónoma de Baja California Sur (UABCS) que a través del Departamento Académico de Biología Marina hizó posible mi formación profesional como Biólogo Marino.
Al Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR, S.C.) por brindar las instalaciones, equipos, laboratorios y facilidades para realizar mi trabajo de tesis.
Un agradecimiento muy especial al Dr. José Manuel Mazón Suástegui por haber co-
dirigido este trabajo, por su apoyo económico con becas de entrenamiento técnico,
contrato para trabajar en su proyecto “CIBNOR R&D projects (SEP-
CONACyT/CB2009129025 and PROINNOVA-CONACyT/C0003-2012-01-185797)”, pero
sobre todo por confiar en mí como estudiante.
Un agradecimiento especial a mis profesores e integrantes del comité tutorial de esta tesis, B.M. Marco A. Medina López y Dra. Liliana Hernández Olalde, por sus valiosos comentarios y sugerencias, por ser dos de los mejores ejemplos que tuve durante mi formación profesional como Biólogo Marino, gracias por la confianza que siempre depositaron en mí, por sus ánimos mientras fui estudiante y por su valiosa amistad.
Al Dr. Cesar Ruiz Verdugo del Departamento de Pesquerías de la UABCS por formar parte del comité tutorial de esta tesis, por sus acertados comentarios y sugerencias para enriquecer y mejorar este trabajo.
A la Sra. Eulalia Meza Chávez por todo su apoyo técnico en el laboratorio de Histología e Histoquímica del CIBNOR y por sus muestras de afecto y cariño para conmigo, es usted una gran mujer y se ha ganado un lugar especial en mi corazón.
A mis roomates y grandes amigos Israel (Dooki), Chrsthian y Perla, gracias por su apoyo moral en mis desmadrugadas, por tantas horas de diversión (el huracán Odile también nos dejó gratos recuerdos) por no dejarme morir de hambre durante la elaboración de mi tesis pero sobre todo por ser mi familia en La Paz.
A mis compañeros y amigos de la generación Biología Marina 2010-2014, Dulce
(Wanda), Christhian (Comadre), Cynthia (Le Perre), Amayraní (Marraní), Maritza
(Caderas), Maritza (Chaom), Raúl (Primo), Majo (Pequeña), Daleth (Postrecito),
Andrés (Nalgón), Salwa (Zorrita bebé), Pete, Karen, José, Rebeca (Olanes), Carlos
(Rumpelstinski), Tanaíri (Tangairi), Luis, Mafer, Heidi (Oh! Haidi) y Carolina (Ñoñis)
por compartir tantas experiencias inolvidables, fiestas épicas, salidas de campo,
buenos y malos momentos, porque desde el inicio fuimos una familia al llegar a La
Paz, B.C.S. en busca de cumplir nuestros sueños, porque sin duda hemos logrado
trascender en cada una de nuestras mentes y corazones y ¡Porque sin bullying no
hay amistad!
A mis compañeros y amigos del Laboratorio de Histología e Histoquímica del
CIBNOR Doña Eulalia (Sra. de las Navajas), Maritza, Ricardo, Andrés, Angélica,
Grecia, Fanny, Tony, Samanta, Antonia, Armando, Amada, Anngy y Alice porque
cada uno de ustedes puso su granito de arena apoyándome moral o físicamente con
el trabajo de laboratorio de mi tesis.
A mi compañero del CIBNOR y amigo Jesús Antonio López Carvallo por su valioso
apoyo con la colecta del material biológico en la Bahía de La Paz para llevar a cabo
esta tesis (créeme que después del último muestreo valoro infinitamente tu ayuda).
Muchas gracias a Eva Elizabet Nolasco (Betty) del Depto. de Biología Marina de la
UABCS por todo su apoyo, paciencia y atenciones, sin su ayuda la culminación de
este enorme esfuerzo no hubiese sido posible Betty, pero sobre todo, gracias por su
amabilidad y amistad, su labor, dedicación y carisma la han llevado a ganarse mi
reconocimiento y afecto.
A carolina Villaseñor Cibrían, amorsin, gracias por siempre estar a mi lado
echándome porras y animándome a seguir adelante durante la persecución de este
sueño, por tu amistad y amor incondicionales, todas son cosas que valoro tanto
como el amor de mi familia.
A los familiares y amigos que durante estos cuatro últimos años me han acompañado
en la búsqueda de alcanzar lo que hoy la culminación de mi más grande sueño y no
me dejaron llegar solo hasta aquí, espero seguir teniendo el honor de compartir con
todos ustedes muchos éxitos y logros más.
En la vida no hay nada imposible, porque los sueños de ayer son los triunfos de hoy, y
las esperanzas del presente pueden convertirse en realidad mañana.
ÍNDICE GENERAL
LISTA DE FIGURAS………………………………………………………………. I
LISTA DE TABLAS................................................................................ IX
RESUMEN………………………………………………………………………….. X
ABSTRACT…………………………………………………………………………. XII
1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………... 1
2. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………… 7
3. HIPOTESIS………………………………………………………………………. 9
4. OBJETIVOS……………………………………………………………………... 10
4.1. General……………………………………………………………………... 10
4.2. Específicos………………………………………………………………… 10
5. ÁREA DE ESTUDIO……………………………………………………………. 11
6. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………... 12
6.1. Muestreos y colecta de organismos………………………………….. 12
6.2. Biometrías y disección………………………………………………….. 13
6.3. Análisis histológico e histoquímico………………………………….. 13
6.4. Estimación de índices morfofisiológicos……………………………. 16
6.4.1. Índice de condición (IC)……………………………………………. 16
6.4.2. Área de cobertura gonádica (ACG) y área de cobertura de
tejido somático (ACS)…………………………………………….. 16
6.5. Análisis histológicos cualitativos…………………………………….. 17
6.5.1. Ciclo reproductivo, desarrollo gonádico y ovocitario…………… 17
6.6. Análisis histológicos cuantitativos…………………………………… 18
6.6.1. Indicadores morfométricos de calidad ovocitaria……………….. 18
6.6.1.1. Diámetro teórico (DT)……………………………………. 18
6.6.1.2. Diámetro máximo (DM)…………………………………. 19
6.6.1.3. Relación núcleo/citoplasma (N/C)……………………… 19
6.6.2. Indicadores histoquímicos de calidad ovocitaria………………… 19
6.6.2.1. Índice lipídico (IL)…………………………………………. 19
6.6.2.2. Índice de carbohidratos (ICH)………………………….. 20
6.7. Obtención de datos de variables ambientales (temperatura
superficial y clorofila-a………………………………………………… 20
6.8. Análisis estadístico de datos………………………………………….. 20
7. RESULTADOS…………………………………………………………………. 22
7.1. Muestreos y rangos de talla-peso de organismos…………………. 22
7.2. Estimación de índices morfofisiológicos…………………………… 23
7.2.1. Índice de condición (IC)……………………………………………. 23
7.2.2. Área de cobertura gonádica (ACG) y área de cobertura de
tejido somático (ACS)………………………………………………
24
7.3. Ciclo reproductivo……………………………………………………….. 30
7.3.1. Descripción de estadios de desarrollo gonádico………………… 30
7.3.2. Frecuencias de estadios de desarrollo gonádico……………….. 35
7.3.3. Proporción de sexos……………………………………………….. 38
7.3.4. Frecuencias de categorías de desarrollo ovocitario……………. 39
7.3.5. Atresia y degeneración ovocitaria…………………………………. 40
7.4. Análisis histológicos cuantitativos…………………………………… 41
7.4.1. Indicadores morfométricos de calidad ovocitaria……………….. 41
7.4.1.1. Área de ovocitos y sus núcleos……………………….. 42
7.4.1.2. Diámetro teórico (DT) y diámetro máximo (DM) de los
Ovocitos…………………………………………………… 45
7.4.1.3. Relación núcleo/citoplasma (R/C)……………………… 49
7.4.1.4. Índice de redondez (IR) de los ovocitos y núcleos……. 52
7.4.2. Indicadores histoquímicos de calidad ovocitaria……………….. 55
7.4.2.1. Índice lipídico (IL)………………………………………… 55
7.4.2.2. Índice de carbohidratos (ICH)………………………….. 63
7.4.2.3. Índice de reservas energéticas totales en forma de
lípidos y carbohidratos………………………………….. 71
7.5. Variación de la temperatura superficial y clorofila-a……………… 77
8. DISCUSIÓN……………………………………………………………………… 80
9. CONCLUSIONES……………………………………………………………….. 105
10. BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA…………………………………………….. 107
11. ANEXOS.................................................................................................... 127
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Morfología externa de la concha del mejillon o choro (Modiolus capax)
(Tomado de: Femorale 2012)……………………………………………………………….2
Figura 2. Sitio de colecta de organismos y de extracción de datos de los sensores
remotos-satelitales de las variables ambientales de temperatura superficial del mar y
Clorofila a, en la Bahía de La Paz, B.C.S. en el Noroeste de México……………...…12
Figura 3. Anatomía del mejillón Modiolus capax. a) Anatomía completa del animal; b)
sección sagital de la porción media del animal. Las líneas muestran la localización de
cada órgano/ tejido (Tomado de: Howard y Smith, 1983)………………………...……13
Figura 4. Crecimiento en talla y peso para Modiolus capax (media±error estándar).
Los datos fueron analizados usando el mes como factor y la longitud (F9,290=2.6702;
P=0.00543); peso total fresco con concha (F9,920=5.7144; P<0.0001) y peso de la
carne (F9,920=17.552, P<0.0001) como variables dependientes en un ANOVA
unifactorial. El asterisco es el post hoc e indica diferencias estadísticamente
significativas (P<0.05) n=300………………………………………………...……………23
Figura 5. Variación del índice morfofisiológico de condición (IC; F9,290=133.72,
P<0.0001) de Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S.
Los datos fueron analizados usando el mes como variable independiente en un
ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias
estadísticamente significativas (P<0.05) n=300…………………………………………24
Figura 6. Área de cobertura de la gónada (ACG; F9,241=30.908, P<0.0001, n=251) vs
Área de cobertura del tejido somático (ACS; F9,241=30.908, P<0.0001, n=251) del
mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los
datos fueron analizados usando el mes como variable independiente en un ANOVA
unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente
significativas (P<0.05)...…………………………………………………………...……….25
Figura 7. Área de cobertura de la gónada (ACG) vs Área de cobertura del tejido
somático (ACS) de las hembras del mejillón Modiolus capax (media±error estándar)
en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el mes (ACG:
F9,107=30.274, P<0.0001, n=127; ACS: F9,107=30.277, P<0.0001, n=127) y (b) el
estadio de desarrollo ovárico (ACG: F4,112=43.394, P<0.0001, n=117; ACS:
F4,112=43.397, P<0.0001, n=117) como variable independiente en un ANOVA
unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente
significativas…………………………………………………………………………………27
Figura 8. Área de cobertura de la gónada (ACG) vs Área de cobertura del tejido
somático (ACS) de los machos del mejillón Modiolus capax (media±error estándar)
en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el mes (ACG:
F9,114=18.977, P<0.0001, n=124; ACS: F9,114=18.976, P<0.0001, n=124) y (b) el
estadio de desarrollo ovárico (ACG: F4,100=27.458, P<0.0001, n=105; ACS:
F4,100=27.458, P<0.0001, n=105) como variable independiente en un ANOVA
unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente
significativas…………………………………………………………………………………29
Figura 9. Estadios de desarrollo gonádico en hembras de mejillón Modiolus capax
descritos en este estudio durante un ciclo reproductivo anual en la Bahía de La Paz,
B.C.S. E0. Indiferenciado, EI. Previtelogénesis, EII. Vitelogénesis, EIII.
Posvitelogénesis, EIV. Desove parcial, EV. Posdesove, descritos en este estudio. tc,
tejido conjuntivo; fl, folículos ováricos; td, tubo digestivo; cg y ovg, ovogonias; gd,
gonoducto; op, ovocitos previtelogénicos; ov, ovocitos vitelogénicos; opv, ovocitos
posvitelogénicos; oat, ovocitos atrésicos; n, núcleo; un, núcleolo; clf, células
foliculares; ovp, ovoplásma; np, nucleoplasma; he, hemocitos. Tinción Hematoxilina-
Eosina (H&E) (10X Barra=60µm; 20X Barra=100µm y 100X Barra=10µm)…….……34
Figura 10. Estadios de desarrollo gonádico en machos de mejillón Modiolus capax
descritos en este estudio durante un ciclo reproductivo anual en la Bahía de La Paz,
B.C.S. E0. Indiferenciado, EI. Espermatogénesis temprana, EII. Espermatogénesis
avanzada, EIII. Espermiogénesis, EIV. Desove parcial, EV. Posdesove. tc, tejido
conjuntivo; cfl, células foliculares; eg, espermatogonias; a, acinos testiculares; spz,
espermatozoos; spd, espermátidas; gd, gonoducto; he, hemocitos. Tinción
Hematoxilina-Eosina (H&E) (10X Barra=60µm; 20X Barra=100µm y 100X
Barra=10µm)…………………………………………………………………………………35
Figura 11. Frecuencia acumulada (%) de los estadios de desarrollo gonádico de las
hembras de mejillón Modiolus capax en un ciclo reproductivo anual en la Bahía de La
Paz, B.C.S. n=300………………………………………………………………………..…37
Figura 12. Frecuencia acumulada (%) de los estadios de desarrollo gonádico de los
machos de mejillón Modiolus capax en un ciclo reproductivo anual en la Bahía de La
Paz, B.C.S……………………………………………………………………………………38
Figura 13. Proporción sexual (%) del mejillón Modiolus capax en un ciclo
reproductivo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. n=300………………………………39
Figura 14. Número total de ovocitos por hembra (a 10X) del mejillón Modiolus capax
distribuidos en cada uno de los estadios de desarrollo ovárico en un ciclo
reproductivo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S………………………………………41
Figura 15. Microfotografías de cortes histológicos de las gónadas femeninas
(ovarios) del mejillón Modiolus capax que muestran el fenómeno de atresia y
degeneración ovocitaria. Ovocitos vitelogénicos (ovit), ovocitos posvitelogénicos
(opv), ovocitos atrésicos (oat), folículo ovárico (f), tejido conjuntivo (tc), núcleo (n),
núcleolo (nu), carbohidratos ácidos (cha), material citoplásmico (mc). Tinción Azul
Alciano-PAS (AAPAS) (20X Barra=100µm)………………………………………...……42
Figura 16. Área de los ovocitos y los núcleos (µm2) del mejillón Modiolus capax
(media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados
usando (a) el mes (AO: F9,1401=28.302, P<0.0001, n=1410; AN: F9,1401=17.244,
P<0.0001, n=1410) y (b) el estadio de desarrollo ovárico (AO: F4,1406=56.240,
P<0.0001, n=1410; AN: F4,1406=53.485, P<0.0001, n=1410) como variable
independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican
diferencias estadísticamente significativas n=1,410……………………………………44
Figura 17. Área de los ovocitos (F2,86=0.40962, P=0.66519, n=89) y de los núcleos
(F2,86=8.1449, P=0.00058, n=89) (µm2) del mejillón Modiolus capax (media±error
estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el tipo
de ovocito como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras
indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas……………45
Figura 18. Diámetro teórico y máximo de los ovocitos (µm) del mejillón Modiolus
capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron
analizados usando (a) el mes (Diámetro teórico: F9,1401=31.477, P<0.0001, n=1410;
Diámetro máximo: F9,58=90.4020, P<0.0001, n=68) y (b) el estadio de desarrollo
ovárico (Diámetro teórico: F4,1406=81.876, P<0.0001, n=1410; Diámetro máximo:
F4,46=12.027, P<0.0001, n=51) como variable independiente en un ANOVA
unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente
significativas…………………………………………………………………………………48
Figura 19. Diámetro Teórico (F2,86=0.65245, P=0.52333, n=89) y Máximo
(F4,46=7.098, P<0.0194, n=51) de los ovocitos (µm) del mejillón Modiolus capax
(media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados
usando el tipo de ovocito como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las
letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas……49
Figura 20. Relación Núcleo/ Citoplasma de los ovocitos del mejillón Modiolus capax
(media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados
usando (a) el mes (F9,1401=13.445, P<0.0001, n=1410) y (b) el estadio de desarrollo
ovárico (F4,1406=7.0865, P<0.0001, n=1410) como variable independiente en un
ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias
estadísticamente significativas……………………………………………………………51
Figura 21. Relación Núcleo/ Citoplasma (F2,86=6.8880, P=0.00168, n=89) de los
ovocitos del mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz,
B.C.S. Los datos fueron analizados usando el tipo de ovocito como variable
independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican
diferencias estadísticamente significativas………………………………………………52
Figura 22. Índice de Redondez (IR) de los ovocitos y los núcleos del mejillón
Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos
fueron analizados usando (a) el mes (IR ovocitos: F9,1401=8.3374, P<0.0001, n=1410;
IR núcleos: F9,1401=18.163, P<0.0001, n=1410) y (b) el estadio de desarrollo ovárico
(IR ovocitos: F4,1406=11.781, P<0.0001, n=1410; IR núcleos: F4,1406=17.356,
P<0.0001, n=1410) como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las
letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas……54
Figura 23. Índice de Redondez (IR) de los ovocitos (F2,86=105.49, P<0.0001, n=89) y
de los núcleos (F2,86=21.768, P<0.0001, n=89) del mejillón Modiolus capax
(media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados
usando el tipo de ovocito como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las
letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas……55
Figura 24. Microfotografías de cortes histológicos de las gónadas femeninas
(ovarios) del mejillón Modiolus capax. Ovocitos vitelogénicos (ovit), ovocitos
posvitelogénicos (opv), ovocitos atrésicos (oat), folículo ovárico (f), tejido conjuntivo
(tc), núcleo (n), núcleolo (nu), triglicéridos (tgl). Tinción Sudán Negro para grasas
(SN) (20X Barra=100µm)……………………………………………………………..……57
Figura 25. Índice Lípidico (IL) del ovario del mejillón Modiolus capax (media±error
estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el
mes durante un ciclo anual (F8,253=40.046, P<0.0001, n=262) y (b) el estadio de
desarrollo ovárico (F4,256=23.792, P<0.0001, n=261) como variables independientes
en ANOVAS unifactoriales. Las letras indexadas diferentes indican diferencias
estadísticamente significativas………………………………………………………….…59
Figura 26. Índice Lipídico (IL) de (a) los ovocitos vitelogénicos (F8,253=2.3843,
P=0.01712, n=262), (b) ovocitos posvitelogénicos (F8,253=3.0486, P=0.00272, n=262)
y (c) ovocitos atrésicos (F8,253=2.1731, P=0.03, n=262) para el mejillón Modiolus
capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron
analizados usando el mes durante un ciclo anual como variable independiente en un
ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias
estadísticamente significativas…………………………………………………….………61
Figura 27. Índice Lipídico (IL) de (a) los ovocitos vitelogénicos (F4,256=1.4531,
P=0.021702, n=261), (b) ovocitos posvitelogénicos (F4,256=3.8992, P=0.011104,
n=261) y (c) ovocitos atrésicos (F4,256=3.5070, P=0.00828, n=261) para el mejillón
Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos
fueron analizados usando el estadio de desarrollo ovárico como variable
independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican
diferencias estadísticamente significativas………………………………………………63
Figura 28. Índice total de Lípidos (IL) por categoría de tipo de ovocito (F2,769=6.7917,
P=0.03194, n=772) para el mejillón Modiolus capax (media±error estándar) durante
un ciclo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el
tipo de ovocito como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras
indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas……….……64
Figura 29. Microfotografías de cortes histológicos de las gónadas femeninas
(ovarios) del mejillón Modiolus capax. Ovocitos vitelogénicos (ovit), ovocitos
posvitelogénicos (opv), ovocitos atrésicos (oat), folículo ovárico (f), tejido conjuntivo
(tc), núcleo (n), núcleolo (nu), carbohidratos neutros (chn). Tinción Azul Alciano-PAS
(AAPAS) (20X Barra=100µm)……………………………………………..………………65
Figura 30. Índice de Carbohidratos (ICH) para el mejillón Modiolus capax
(media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados
usando (a) el mes durante un ciclo anual (F8,167=16.819, P<0.0001, n=176) y (b) el
estadio de desarrollo ovárico (F4,172=1.7208, P=1.4751, n=177) como variables
independientes en ANOVAS unifactoriales. Las letras indexadas diferentes indican
diferencias estadísticamente significativas………………………………………………67
Figura 31. Índice de Carbohidratos (ICH) de (a) los ovocitos vitelogénicos
(F8,167=12.675, P<0.0001, n=176), (b) ovocitos posvitelogénicos (F8,167=10.113,
P<0.0001, n=176) y (c) ovocitos atrésicos (F8,167=15.623, P<0.0001, n=176) para el
mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los
datos fueron analizados usando el mes durante un ciclo anual como variable
independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican
diferencias estadísticamente significativas………………………………………………69
Figura 32. Índice de Carbohidratos (ICH) de (a) los ovocitos vitelogénicos
(F4,172=9.5175, P<0.0001, n=177), (b) ovocitos posvitelogénicos (F4,172=3.2764,
P=0.01282, n=177) y (c) ovocitos atrésicos (F4,172=5.2682, P=0.0005, n=177) para el
mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los
datos fueron analizados usando el estadio de desarrollo ovárico como variable
independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican
diferencias estadísticamente significativas………………………………………………71
Figura 33. Índice total de Carbohidratos (ICH) por categoría de tipo de ovocito
(F2,511=2.1826, P=0.030731, n=514 para el mejillón Modiolus capax (media±error
estándar) durante un ciclo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron
analizados usando el tipo de ovocito como variable independiente en un ANOVA
unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente
significativas…………………………………………………………………………………72
Figura 34. Índice total acumulado de Lípidos (IL) y Carbohidratos (ICH) por (a) mes y
(b) estadio de desarrollo ovárico para el mejillón Modiolus capax durante un ciclo
anual en la Bahía de La Paz, B.C.S………………………………………………………73
Figura 35. Índice total acumulado de Lípidos (IL) y Carbohidratos (ICH) por categoría
de tipo de ovocito para el mejillón Modiolus capax durante un ciclo anual en la Bahía
de La Paz, B.C.S……………………………………………………………………………75
Figura 36. Índice total acumulado de reservas energéticas en ovario (F1,436=1036.4,
P<0.0001, n=438) en forma de lípidos (IL) y carbohidratos (ICH) para el mejillón
Modiolus capax (media±error estándar) durante un ciclo anual en la Bahía de La Paz,
B.C.S. Los datos fueron analizados usando el índice como variable independiente en
un ANOVA unifactorial. El asterisco es el pos hoc e indica diferencias
estadísticamente significativas……………………………………………………………76
Figura 37. Índice total acumulado de reservas energéticas en los ovocitos
(F1,1315=2408.4, P<0.0001, n=1,317) en forma de lípidos (IL) y carbohidratos (ICH)
para el mejillón Modiolus capax (media±error estándar) durante un ciclo anual en la
Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el índice como variable
independiente en un ANOVA unifactorial. El asterisco es el pos hoc e indica
diferencias estadísticamente significativas………………………………………………77
Figura 38. Variación temporal de la temperatura superficial del agua y concentración
de clorofila-a (los datos son la media) en la Bahía de La Paz, B.C.S. entre enero de
2013 y enero de 2014. El área sombreada indica el periodo en el que se observaron
las mayores proporciones de individuos sexualmente maduros. Las líneas verticales
continuas indican los meses en los que se observaron los valores más altos en el
área de cobertura de las gónadas. Las líneas verticales discontinuas indican los
meses en los que se observaron las mayores proporciones de individuos con
gónadas indiferenciadas o en reposo, los meses en los que se observaron los
valores más bajos en el área de cobertura de las gónadas, y los meses en los que se
reportan las mayores áreas de cobertura de tejidos somáticos de Modiolus
capax…………………………………………………………………………………………79
Figura 39. Estructuras subcelulares que participan en la captación y almacenamiento
de nutrientes por los ovocitos de invertebrados. Los nutrientes lipídicos y del vitelo
atraviesan la membrana basal del folículo ovárico y llegan a la superficie de los
ovocitos a través del espacio extracelular que separa las células epiteliales
foliculares (flechas). Al llegar a la superficie del ovocito, los nutrientes son tomados
por endocitosis mediada por el receptor específico (lípidos o proteínas). Después de
pasar por las vesículas de endocitosis (endosomas), las proteínas se acumulan en
los compartimentos de almacenamiento de proteínas esféricas, llamadas cuerpos de
yema (parte del vitelo). Mientras que los triglicéridos y ácidos grasos son
almacenados en gotitas lipídicas. Anteriormente no se había identificado ningún otro
tipo de estructuras especializadas para la transferencia de lípidos extracelulares a las
gotitas de almacenamiento de lípidos en los ovocitos (Tomado de: Ziegler y Van
Antwerpen, 2010)………………………………………………………………...…………98
LISTA DE TABLAS
Tabla I. Descripción de los estadios de desarrollo gonádico de las hembras del
mejillón Modiolus capax……………………………………………………………………30
Tabla II. Descripción de los estadios de desarrollo gonádico de los machos del
mejillón Modiolus capax……………………………………………………………………32
RESUMEN
La mitilicultura es una actividad productiva y rentable en diversos países del mundo,
ente los que sobresale España. El mejillón Modiolus capax se distribuye
naturalmente en la Bahía de La Paz, B.C.S., México, y como otros mitilidos, tiene
potencial para ser cultivado. Sin embargo, los estudios enfocados al conocimiento de
su biología reproductiva son escasos para la región, lo cual limita el desarrollo de las
tecnologías acuícolas aplicables. En el presente estudio se analizó mediante técnicas
histológicas e histoquímicas, cualitativas y cuantitativas, la estrategia, dinámica y
esfuerzo reproductivo anual de la especie en la Bahía de La Paz, durante el periodo
comprendido entre febrero/2013 y enero/2014. Se determinaron las variables
biométricas de los organismos, tales como: longitud de la concha, peso total fresco y
peso fresco de la carne; y los índices morfofisiológicos como: el índice de
Ccondición, área de cobertura de la gónada y área de cobertura de tejidos
somáticos. El ciclo gonádico de M. capax se categorizó en cinco estadios de
desarrollo para hembras y machos identificando cinco categorías de desarrollo
ovocitario. La proporción de sexos se determinó en razón de 1:0.88 M:H. Los
resultados de esta investigación muestran que el mejillón M. capax se reproduce
durante todo el año con una máxima actividad gametogénica en primavera-verano,
con desoves parciales y totales principalmente a finales del verano e inicio del otoño.
La calidad ovocitaria se determinó mediante análisis digital de imágenes para
tomando como referencia parámetros morfométricos tales como el área (AO),
diámetro teórico (DT), diámetro máximo (DM), relación núcleo/citoplasma (N/C) e
índice de redondez (IR) de los ovocitos. Igualmente se evaluaron indicadores
histoquímicos tales como índice de lípidos (IL) y de carbohidratos (ICH), tanto en los
ovocitos como en el tejido ovárico del mejillón. Con base en lo anterior se concluye
que M. capax aplica una estrategia reproductiva “conservadora”, ya que la
gametogénesis se realiza a partir de la energía almacenada en sus tejidos
somáticos. Se concluye también, que el mayor esfuerzo reproductivo de la especie
se lleva a cabo entre abril y agosto con la mayor transferencia de reservas de los
compartimentos somáticos al tejido gonádico. Lo anterior, considerando que la
temperatura superficial promedio de la Bahía de La Paz fue de 23.95±0.98°C y la
concentración de Clorofila-a de 2.01±0.33 mg/m3 en promedio durante el ciclo anual
que comprende este estudio.
Palabras clave: Mejillones, ciclo reproductivo, desarrollo gonádico, reservas
energéticas, calidad de desoves.
ABSTRACT
Mitiliculture is a productive and profitable activity in several countries of the world,
among which stands out Spain. The mussel Modiolus capax is distributed naturally in
Bahía de La Paz, B.C.S., Mexico, and as other mussels, has potential to be
cultivated. However, studies focused on the knowledge of its reproductive biology are
scarce for the region, which limits the development of aquaculture applicable
technologies. In this study was analyzed by histological and histochemical,
quantitative and qualitative techniques, the strategy and reproductive effort annual
dynamics of this species in Bahía de La Paz, during the period February/2013
January/2014. Biometric variables of organisms, such as shell length, total fresh
weight and fresh meat weight were determined; and morpho-physiological indexes
such as condition index, gonad coverage area and somatic coverage area tissues.
The gonadic cicle of M. capax was categorized into five stages of development for
male and female, identifying five categories of oocyte development. The sex ratio was
determined in a 1:0.88 M:F. The results of this research show that the mussel M.
capax reproduces throughout the year with a maximum gametogenic activity in
spring-summer, partial and total spawning was observed mainly late summer and
early autumn. The oocyte morphometric quality was determined by digital image
analysis using as reference parameters such as Area (AO;) Theoretical Diameter
(TD), Maximum Diameter (MD), Nucleus/Cytoplasm relation (N/C) and Roundness
Index (IR) of oocytes. Also histochemical indicators such as Lipid Index (LI) and
carbohydrates (CHI) were evaluated in oocytes and mussel ovarian tissue. Based on
the above is concluded that M. capax applies a "conservative" reproductive strategy
because gametogenesis is made from the energy stored in their somatic tissues. It
was also concluded that the greater reproductive effort of the species takes place
between April and August with the largest transfer of reserves to gonadal somatic
tissue compartments. This, considering that the average temperature was 23.95±0.98
°C and the concentration of chlorophyll-a was 2.01±0.33 mg/m3 at Bahia de La Paz
surface temperature was 23.95 ± 0.98 ° C and the concentration of chlorophyll-a of
2.01 ± 0.33 mg/m3 averaged over the annual cycle comprising this study.
Keywords: Mussels, reproductive cycle, gonadal development, energy reserves,
quality of spawning.
1
1. INTRODUCCIÓN
En el filo de los moluscos se incluyen los invertebrados más y mejor
estudiados a nivel mundial, y entre ellos, la clase Bivalvia constituye el grupo de
mayor importancia ecológica y económica, ya que comprende recursos pesqueros y
acuícolas de alto valor comercial y nutricional (Cruz et al. 2000; Cáceres-Puig, 2007;
Maeda-Martínez, 2011). Los mejillones son moluscos bivalvos conuna importante
demanda como recurso alimentario en algunas regiones del mundo, principalmente
en países europeos como Francia, Dinamarca, Países Bajos, España e Italia
(Bardach et al.1972; Korringa, 1976; Ochoa-Báez, 1985; Bückle y Garza, 1989;
Cabrera-Peña y Solano-López, 1995; Uriarte, 2008; Oyarzún et al., 2011). En la
actualidad, la pesca y la producción acuícola de mejillón a nivel mundial generan en
promedio cerca de 0.25 millones de toneladas anuales (FAO, 2012).
Entre los mitílidos presentes en el Pacífico Americano se incluye el mejillón
Modiolus capax (Conrad, 1837), conocido regionalmente como “choro” (Fig. 1). La
explotación de la especie se ha basado tradicionalmente en la extracción pesquera
de sus bancos naturales, aunque ya comienzan a desarrollarse cultivos extensivos
que proporcionan cosechas modestas en algunos países. En Chile, el cultivo
comercial de mitílidos o choros se centra principalmente en especies nativas cuya
biología reproductiva ha sido recientemente descrita y a pesar de ello, la producción
alcanza un buen impacto comercial y social (Cabrera-Peña y Solano-López, 1995;
Uriarte, 2008; Oyarzún et al., 2011). Como contraparte, la especie no tiene demanda
comercial en México, por lo que no se ha generado suficientemente la necesidad de
generar nuevo conocimiento científico aplicable al desarrollo de técnicas de
producción. Sin embargo, considerando el desarrollo que van teniendo especies
afines de mejillón, es necesario y pertinente desarrollar estudios en ciencia aplicada,
enfocados al conocimiento de los aspectos biológicos de M. capax para desarrollar
nuevas opciones de producción acuícola.
M. capax se distribuye en la franja tropical y subtropical, a temperaturas que
fluctúan entre 16 y 32°C en límites extremos invierno/verano. Habita en la zona
rocosa intermareal y sublitoral hasta 46m de profundidad, desde el sur de Santa
Cruz, California, E.U.A., hasta Paita, Perú eislas Galápagos (Keen 1971; Brusca,
2
1980; Rehder, 1981; Ochoa-Báez, 1987; Cabrera-Peña y Solano-López, 1995). En el
litoral Mexicano, la especie se distribuye en la costa occidental del Golfo de California
(Ochoa-Baez, 1985; Ochoa-Baez, 1987) incluyendo Bahía de los Ángeles, B.C.
(Bückle-Ramírez y Garza-Aguirre, 1989) y Bahía de La Paz, B.C.S. (Ochoa-Baez,
1985; Ochoa-Baez, 1987) siendo más abundante en Bahía Concepción, y al Norte de
Santa Rosalía, B.C.S. (Olguín, 1976).
Figura 1. Morfología externa del mejillon o choro (Modiolus capax) (Femorale 2012).
En México, el consumo de mejillones es limitado, ya que se restringe a
determinados sectores sociales gourmet de la población (Ochoa-Báez, 1985; Ochoa-
Báez, 1987; Bückle-Ramírez y Garza-Aguirre, 1989). A nivel nacional el recurso se
explota mínimamente por pescadores artesanales y para auto-consumo, debido a
que existen otros bivalvos con mayor valor comercial y mayor demanda en el
mercado nacional y de exportación. Sin embargo, existen posibilidades para la
especie, ya que es bien sabido que el mejillón tiene un sabor agradable y que su
contenido proteico es elevado, estimándose en un 69.5% aproximadamente (Mateus
y Scott, 1986).
Los estudios enfocados a conocer la biología reproductiva de diferentes
especies de moluscos bivalvos proveen de información valiosa y útil para efectuar
predicciones su reclutamiento y ciclos de maduración gonádica (Hernández-Olalde,
2003; Rodríguez-Jaramillo, 2004). Esta información es necesaria para el manejo
controlado de reproductores en y obtención de semilla, pero tambien resulta aplicable
para el aprovechamiento sostenible del recursoa partir de la extracción pesquera de
sus poblaciones naturales (Seed, 1976; Arsenault y Himmelman, 1998; Oyarzún et
3
al., 2011). En este contexto, la nueva información acerca de los ciclos de desarrollo
gonádico, estrategia y esfuerzo reproductivo del mejillón M. capax en la Bahía de La
Paz es fundamental para desarrollar técnicas de producción acuícola que pudieran
llegar a ser interesantes a escala comercial.
La reproducción de los moluscos bivalvos en su medio natural puede ser
cíclica (anual, semianual) o continua (Sastry, 1979; Alfaro et al., 2001). La estrategia
reproductiva de los moluscos bivalvos está relacionada con una combinación
compleja de factores exógenos (ambientales), como temperatura, fotoperiodo, ciclo
lunar, ciclos de mareas, profundidad, salinidad, disponibilidad y calidad de alimento.
Sin embargo, existen factores endógenos propios que son determinantes para cada
especie, como nutrientes almacenados (reservas energéticas), carga genética y
neurosecreción hormonal (Galtsoff, 1964; Sastry, 1979; Mackie, 1984; Barber y
Blake, 1991; Thompson et al., 1996; Avellanal et al., 2002; Quiñones-Arreola, 2003;
Hernández-Olalde, 2003; Thorarinsdóttir y Gunnarsson, 2003; Cáceres-Puig, 2007).
Diversos estudios sugieren que la temperatura la disponibilidad de alimento y
la calidad del agua (Barber y Blake, 1991; Hernández-Olalde, 2003; Cáceres-Puig,
2007; Ortiz-Zarragoitia y Cajaraville, 2010), son los principales factores que regulan
el ciclo gametogénico y el movimiento de reservas energéticas como lípidos y
carbohidratos durante la reproducción de los bivalvos marinos (Seed, 1976;
Macdonald y Thompson, 1986; Malachowsky, 1988; Jaramillo et al., 1993; Jaramillo y
Navarro, 1995). Los bivalvos presentan una gran plasticidad para adaptarse a
diferentes condiciones ambientales que modulan sus ciclos y estrategias
reproductivas. Esta capacidad de adaptación les permite tener una muy amplia
distribución geográfica, que incluye diferentes latitudes, profundidades y hábitats
(Bayne, 1976; Gease y Pearse, 1974, 1979; Lubet, 1981; Baber y Blake, 1991;
Lucas, 1992; Chávez-Villalba, 2001).
El mejillón M. capax es una especie gonocórica con fecundación externa y con
dimorfismo sexual. El macho presenta una gónada de color crema amarillento y la
hembra se distingue por su color crema anaranjado (Ochoa-Báez, 1987; Bahamodes
y Muñoz, 1998; Clasing et al., 1998; Uriarte, 2008; Oyarzún et al., 2011). Sin
embargo, existe un registro exclusivo para la Bahía de La Paz (Ochoa-Báez, 1987)
4
en donde se reportaron eventos muy escasos de hermafroditismo y bisexualidad
funcional y no funcional en una población de M. capax en el año de 1983.
Los estudios de la biología reproductiva en moluscos bivalvos se abordan a
partir de aproximaciones histológicas. Sin embargo, son pocos los estudios que
involucran análisis de condición morfofisiológica, calidad ovocitaria y cuantificación
de reservas energéticas por medio de técnicas histoquímicas, a pesar de que estos
indicadores ofrecen una mejor aproximación del ciclo reproductivo. En los moluscos,
se define como esfuerzo reproductivo a la cantidad de energía que se destina de los
tejidos somáticos a la reproducción (gónada), en determinadas condiciones (Lucas,
1992; Thompson y MacDonald, 1991; Gangnery, 1997; Cáceres-Puig, 2007). Los
bivalvos tienen la capacidad de almacenar reservas en sus tejidos durante periodos
de alta disponibilidad de alimento, las cuales son canalizadas en momentos de
escases alimenticia y/o de alta demanda de energía, como puede ser, durante la
reproducción (Cáceres-Puig, 2007). La estrategia reproductiva de cada especie se
define en función de su capacidad para acumular y movilizar sus reservas
energéticas. (Baber y Blake, 1991; Lucas, 1992; Mathieu y Lubet, 1992; Gangnery,
1997; Villalejo-Fuerte y García-Domínguez, 1998; Villalejo-Fuerte y Muñeton-Gómez,
2002; Rodríguez-Astudillo et al., 2002). En virtud de que dichas reservas energéticas
son limitadas en tiempo y espacio, deben repartirse estratégicamente y de manera
diferencial para su uso en el crecimiento de los tejidos somáticos y/o para la
reproducción (Ziolko y Kozlowski, 1983; MacDonald y Thompson, 1986; Paulet y
Boucher, 1991; Duinker, 2002; Cáceres-Puig, 2007).
El tipo y la cantidad de reservas energéticas son muy importantes para
asegurar la calidad de los gametos y el éxito de un evento reproductivo.Las larvas de
la mayoría de los moluscos bivalvos son inicialmente lecitotróficas y su desarrollo
temprano depende de las reservas bioquímicas que son transferidas a los ovocitos
durante la vitelogénesis (Holland, 1978; Bayne y Newel, 1983; Marty et al., 1992;
Rodríguez-Jaramillo, 2004).
Se ha demostrado que durante la vitelogénesis, embriogénesis y desarrollo
larvario, los lípidos, y particularmente, los triglicéridos (Racotta et al., 2003;
Rodríguez-Jaramillo, 2004) y los carbohidratos en forma de glucógeno (Puente-
5
Carreón, 2000; Guerra et al. 2012), juegan un papel importante como reserva
energética, mientras que los fosfolípidos participan en la formación de membranas
celulares (Rodríguez-Jaramillo, 2004).
Las adaptaciones del metabolismo energético durante la reproduccion juegan
un papel clave en el conjunto de rasgos adaptativos que le permiten a moluscos
bivalvos prosperar en ambientes muy variados como lo son las zonas intermareales,
estuarios y aguas costeras con alto impacto antropogénico (Ortiz-Zarragoitia y
Cajaraville, 2010; Hinnzman et al., 2013;). El suministro de energía suficiente es un
requisito muy importante no sólo para la supervivencia inmediata de los organismos,
sino para todas las demás funciones demandantes de energía que aseguran el éxito
de la especie, tales como el crecimiento y la reproducción (Sokolova et al., 2011). La
cantidad y tipo de reservas energéticas esta ligada a los cambios fisiológicos durante
períodos de intenso crecimiento y de reproducción (Constantini, 2010), lo cual
constituye un factor importante durante la historia de vida reproductiva del mejillón.
En el presente trabajo se estudió una población natural de mejillon M. capax
durante un ciclo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. Se identificaron los estadios de
desarrollo gonádico de la especie durante un ciclo anual, se determinaron cambios
morfofisiológicos, principalmente en talla y peso, variación de los índices de
condición y de área de cobertura de la gónada/ tejido somático, del movimiento y uso
de reservas energéticas (carbohidratos y lípidos). Igualmente, se estimaron algunas
variables morfométricas (área total, diámetro teórico y máximo, relación
núcleo/citoplasma e índice de redondez de los ovocitos) e histoquímicas de calidad
(índice lípidico y de carbohidratos) que tienen utilidad como indicadores de la calidad
ovocitaria durante la gametogénesis de Modiolus capax.
Un requerimiento básico para aplicar normas de explotación de especies
marinas comerciales como M. capax es el conocimiento detallado del proceso de
maduración gonádica y ciclo reproductivo, el cual puede deducirse con base en la
descripción histológica e histoquímica como la que se ha realizado con esta
investigación.
6
Su posición taxonómica, según Coan y Valentich-Scott (2012) es:
Filo: Mollusca (Linnaeus, 1758)
Clase: Bivalvia (Linnaeus, 1758)
Subclase: Pteriomorphia (Beurlen, 1944)
Orden: Mytiloida (Férussac, 1822)
Superfamilia: Mytiloidea (Rafinesque, 1815)
Familia: Mytilidae (Rafinesque, 1815)
Género: Modiolus (Linnaeus, 1758)
Especie: Modiolus capax (Conrad, 1837)
7
2. JUSTIFICACIÓN
El consumo del mejillón Modiolus capax en la Bahía de La Paz, B.C.S. se
restringe a la extracción ribereña artesanal, recreativa y turística pues hasta el
momento, no existe ninguna regulación para la captura y aprovechamiento de este
molusco. La producción natural es limitada, pero al igual que otras especies de
mejillón, M. capax podría ser objeto de cultivo masivo si se desarrollan estudios en
materia de ciencia básica, y ciencia aplicada al desarrollo y/o adecuación de
tecnologías ad-hoc para la acuacultura de esta especie. Los bancos naturales de la
especie son muy accesibles a la pesca sin control, lo cual podría propiciar un
agotamiento de las poblaciones silvestres tal y como ha ocurrido con otras especies
de bivalvos de la zona como es el caso de la “almeja catarina” Argopecten
ventricosus (Avilés-Quevedo y Muciño-Díaz, 1990; Cáceres-Martínez et al. 1990;
Mazón-Suástegui, 2005), “hacha china” Atrina maura y “hacha larga” Pinna rugosa
(Robles-Mungaray, 2004), “almeja chocolata” Megapitaria aurantiaca, M. squialida
(Arellano-Martínez et al., 2006; López-Rocha et al., 2010), “almeja mano de león”
Nodipecten subnodosus (Arellano-Martínez et al., 2004; Maeda-Martínez, 2011);
“almeja voladora” Pecten vogdesi; “madre perla” Pinctada mazatlanica (Baqueiro-
Cárdenas et al., 1981; Baqueiro-Cárdenas et al., 1982) y “concha nácar” Pteria
sterna (Hernández–Olalde, 2003; Cáceres-Puig, 2007).
El choro o mejillón M. capax representa hasta el momento un recurso
potencial a ser explotado en la Bahía de La Paz, B.C.S. en vista de que las
poblaciones naturales de otros bivalvos de interés comercial en la región se
encuentran sobreexplotados o agotados (Luna-González, 1997; Arias-León, 2002).
Sin embargo, en México y sobre todo en la región noroeste del país, existe un
desconocimiento de ese potencial y carencia de información relacionada con su
biología reproductiva y los cambios morfofisiológicos asociados, tales como su ciclo
gametogénico, movimiento y uso de reservas energéticas y calidad ovocitaria
durante la temporada reproductiva. Son escasos los estudios que abordan a partir de
aproximaciones histológicas e histoquímicas cualitativas y cuantitativas, el análisis de
la condición morfofisiológica y energética, así como de la calidad ovocitaria de
moluscos bivalvos marinos durante su ciclo reproductivo en condiciones naturales.
8
No obstante, estos indicadores representan una aproximación más directa para
estudiar el evento reproductivo (Cáceres-Puig, 2007; Rodríguez-Jaramillo et al.,
2008). Es indispensable conocer los indicadores de calidad morfométricos, así como
el tipo, contenido y movimiento de reservas energéticas de los ovocitos de M. capax
durante un ciclo reproductivo anual en el medio natural permitirá identificar los
momentos de mayor fortaleza y vulnerabilidad reproductiva de la especie, así como
su estrategia y esfuerzo reproductivo en relación con los cambios en ciertos
parámetros ambientales, como la temperatura del agua y el alimento disponible
(clorofila-a).
El agotamiento de los bancos naturales de otras especies de moluscos
bivalvos en la Bahía de La Paz, B.C.S. ha obligado a buscar alternativas sobre
recursos potenciales a su aprovechamiento como el mejillón, que, además, puedan
proporcionar buenos resultados en su reproducción, crecimiento y supervivencia
durante su cultivo.
9
3. HIPÓTESIS
Resulta fundamental conocer la dinámica del crecimiento, ciclo reproductivo y
calidad ovocitaria, así como la movilización de reservas energéticas de los tejidos
somáticos y germinales del mejillón Modiolus capax durante un ciclo anual en el
medio natural en la Bahía de La Paz, ya que el conocimiento de su ciclo, estrategia y
esfuerzo reproductivo permitirá identificar las temporadas de mayor vulnerabilidad
para la explotación y aprovechamiento del recurso.
Los índices morfofisiológicos (de condición y de área de cobertura gonádica/
tejido somático), la estrategia y el esfuerzo reproductivo (cantidad, tipo y movimiento
de reservas energéticas), y los indicadores de la calidad ovocitaria (área de los
ovocitos, diámetro teórico, diámero máximo, relación núcleo/citoplasma, índice de
redondez o de forma e índices lípidico y de carbohidratos) del mejillón M. capax
varían de acuerdo a las diferentes etapas de su ciclo reproductivo y tienen relación
con la variación de los parámetros ambientales (temperatura superficial del agua y
productividad primaria ) durante el periodo de estudio, en la Bahía de La Paz, B.C.S.
México.
10
4. OBJETIVOS
4.1. General
Estudiar la estrategia y esfuerzo reproductivo de una población natural del
mejillón nativo Modiolus capax durante un ciclo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S.
México.
4.2. Específicos
Determinar la proporción de sexos de Modiolus capax durante un ciclo anual
en la Bahía de La Paz, B.C.S.
Describir el ciclo reproductivo y el desarrollo gonádico en hembras y machos
durante un ciclo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. clasificando los estadios
de desarrollo gonádico mediante la evaluación histológica cualitativa.
Estimar y comparar los índices morfofisiológicos de condición, área de
cobertura gonádica y de tejido somático para M. capax en un ciclo
reproductivo anual en condiciones naturales.
Determinar la frecuencia de las categorías ovocitarias durante el ciclo
reproductivo anual, clasificando y cuantificando los ovocitos de las hembras en
gametogénesis en cinco categorías (ovogonias, ovocitos previtelogénicos,
vitelogénicos, posvitelogénicos y atrésicos) mediante la evaluación histológica
cualitativa.
Determinar las variables morfométricas (área, diámetro teórico y máximo,
índice de redondez y relación núcleo/citoplasma) e histoquímicas (índice de
lípidos y carbohidratos) de calidad de los ovocitos de M. capax durante un
ciclo anual mediante la evaluación histológica e histoquímica cuantitativa y el
análisis digital de microfotografías.
Describir las variaciones en el esfuerzo y estrategia reproductiva de la especie
durante un ciclo anual, identificando los momentos de mayor vulnerabilidad y
susceptibilidad energética y fisiológica.
Analizar las variaciones de temperatura superficial y concentración de
clorofila-a en la Bahía de La Paz, B.C.S. para relacionarlas con el patrón
reproductivo de la especie.
11
5. ÁREA DE ESTUDIO
La Bahía de La Paz, B.C.S. está localizada en la costa occidental del Golfo de
California entre los 24°06’ y 24°47’ latitud norte y los 110°18’ y 110°45’ longitud oeste
(Fig. 2). Tiene forma de ovalo, su eje mayor (81km) está orientado de noroeste a
suroeste, mientras que su eje menor mide aproximadamente 33km (Martínez-López
et al., 2001). La zona norte de la bahía es la más profunda, llega hasta los 400m. En
la parte media la profundidad varía entre 180 y 270m y en la parte sur es menor a
50m (Cruz-Orozco et al., 1996). La temperatura mínima superficial en la bahía es de
20°C en invierno-primavera y la máxima entre 31 y 32°C en verano (Espinoza y
Rodríguez, 1987, Martínez-López et al., 2001). La masa continental que delimita a la
bahía presenta un clima muy seco y semicálido (Cruz-Ayala, 1996). La precipitación
promedio anual es menor a 200mm, siendo septiembre el mes más lluvioso (Robles
Gil-Mestre, 1998) (<100 mm). Los vientos predominantes del noroeste durante el
invierno tienen velocidades medias de 2 a 3 m.s-1, en ocasiones alcanzan
intensidades medias de 4 m.s-1 y rachas de 10m.s-1 (Robles Gil-Mestre, 1998). En
verano lo vientos tienen una componente sur, con intensidades medias de 2 a 3 m.s-1
(Robles Gil-Mestre, 1998). La temperatura promedio ambiental mínima en la capa de
aire superficial a la bahía es de 8°C en invierno y la máxima de 37°C en verano
(Cruz-Ayala, 1996).
La clorofila-a presenta un comportamiento estacional inverso a la temperatura
y a la transparencia del agua en la bahía, ya que las menores concentraciones
(<10mg/m2) ocurren en los meses más cálidos como resultado de la fuerte
estratificación de la columna de agua, que no permite el transporte de material
asimilable por el fitoplancton de la capa profunda a la capa superficial (Martínez-
López et al., 2001). Las mayores concentraciones (142.8 mg/m2) se presentan en la
época fría, asociadas con los procesos de mezcla de la columna de agua por la alta
disponibilidad de nutrientes en la zona eufótica (Martínez-López et al., 2001).
12
6. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1. Muestreos y colecta de organismos
Los organismos empleados para llevar a cabo la presente investigación fueron
colectados durante un ciclo anual comprendido entre los meses de Febrero de 2013
a Enero de 2014. Mensualmente se colectaron 30 ejemplares mediante buceo libre
en la Bahía de La Paz, B.C.S. (24°18'6.68"N; 110°20'8.79"O) (Fig. 2) a una
profundidad de 1.5 a 4 m. Los mejillones colectados se limpiaron exteriormente para
retirar de las valvas epibiontes e incrustantes así como el biso y las proyecciones del
periostraco características de la especie. Los organismos limpios fueron fijados in
situ en solución Davidson (Shaw y Blatle, 1957) por 72 hrs (Anexo I) y trasladados al
laboratorio de Histología e Histoquímica del CIBNOR-La Paz.
Figura 2. Sitio de colecta de organismos y de extracción de datos de los sensores remotos-satelitales de las variables ambientales de temperatura superficial del mar y Clorofila a, en Bahía de La Paz, B.C.S. al Noroeste de México (Tomado de: García-Corona et al., 2014a).
13
6.2. Biometrías y disección
En el laboratorio, se realizaron biometrías de cada ejemplar colectado,
determinando longitud total de la concha (distancia anteroposterior del umbo al
margen exterior de las valvas), utilizando un Vernier de precisión (±0.01mm).
Adicionalmente se determinó y se registró el peso fresco de los animales enteros
(peso con concha) y el peso fresco de la carne (peso sin concha) con una balanza
analítica de precisión (±0.0001 g) modelo OHAUS TS4000®. Posteriormente se
realizaron por disección dos cortes transversales de toda la región media de cada
organismo para obtener una sección sagital que incluyera los tejidos
correspondientes al manto, gónada, glándula digestiva y músculo aductor (Fig. 3), lo
anterior de acuerdo al protocolo descrito por Howard y Smith (1983). Los tejidos
disectados se colocaron en histocasettes para su posterior procesamiento histológico
e histoquímico.
Figura 3. Anatomía del mejillón Modiolus capax. a) Anatomía completa del animal; b) sección
sagital de la porción media del animal. Las líneas muestran la localización de cada órgano/ tejido (Tomado de: Howard y Smith, 1983).
6.3. Análisis histológico e histoquímico
Las secciones transversales fueron colocadas individualmente en
histocasettes y preservadas en alcohol etílico al 70% durante 24 hr. El procesamiento
histológico (deshidratación y aclaramiento) de las muestras se llevó a cabo
empleando un procesador automático de tejidos LEICA ASP200S®. La
deshidratación se realizó en series de alcohol etílico de concentración ascendente
a) b)
14
(70%; 80%; 90%; 96%; 100%). El aclarado de las muestras se hizo con xilol absoluto
(100%) pasando antes los tejidos por una solución de alcohol etílico absoluto:xilol
(1:1) y después por xilol al 100%. La infiltración de las muestras en parafina se
realizó introduciendo los tejidos en un recipiente con una solución 1:1 de
parafina:xilol para después colocarlas en cuatro recipientes más con parafina líquida
caliente a 60°C. La inclusión de las muestras se llevó a cabo en Paraplast X-Tra con
punto de fusión de 54-56 °C en un centro de inclusión LEICA EG1150H y EG1150C®.
Los moldes se dejaron enfriar en una placa fría (-5 °C).
Empleando un micrótomo de rotación LEICA RM2155® se realizaron cortes de
los tejidos a 4µm de grosor a y para extenderlos, se colocaron en un baño de
flotación con agua y grenetina al 1%, durante 5min a 43°C. Enseguida se tomaron los
cortes del baño de flotación con portaobjetos previamente etiquetados y se dejaron
secar a temperatura ambiente durante 24 hr.
Los tejidos se desparafinaron en tres recipientes con Xilol I, II y III durante
10min en cada uno, luego pasaron a una solución 50:50 alcohol etílico 100%-xilol
durante 5 min, posteriormente las muestras se hidrataron haciéndolas pasar por un
tren de alcohol etílico en concentración decreciente (96%; 70%; 70%) durante 2min
en c/u, finalmente, pasaron por agua destilada durante 5min. Después de estos
procedimientos, las laminillas con los cortes de tejido gonádico se tiñeron en el
teñidor automático de tejidos LEICA ST5020®.
Para el estudio histológico de las gónadas (ciclo reproductivo y desarrollo
gonádico) de los mejillones se empleó la técnica histológica convencional de
Hematoxilina-Eosina (H&E). Los cortes teñidos con esta técnica se emplearon para
llevar a cabo la clasificación de los estadios de desarrollo de las gónadas de M.
capax, así como para la clasificación de los ovocitos en cinco categorías ovocitarias
de desarrollo. La técnica Hematoxilina-eosina (H&E) (Anexo II) supone que la
aplicación de la tinción con hematoxilina de Harris por ser catiónica o básica, tiñe
estructuras ácidas (basófilas) en tonos azul y púrpura, como por ejemplo los núcleos
celulares; mientras que el uso de eosina-floxina (12 min) tiñe componentes básicos
(acidófilos) en tonos naranja-rosa, gracias a su naturaleza aniónica o ácida, como el
citoplasma (Sheehan y Hrapchak, 1973; Montalvo-Arenas, 2010).
15
Para los análisis histoquímicos de calidad de los ovocitos (tipo y cantidad de
reservas energéticas) se emplearon las técnicas de tinción histoquímicas Azul
Alciano PAS (para carbohidratos) y Sudan Negro (para lípidos). Por una parte, con la
técnica de tinción histoquímica Azul Alciano PAS (AAPAS) (Anexo III) se puede
diferenciar fácilmente la presencia de carbohidratos (glicoconjugados ácidos y
neutros) en la misma preparación (Bancroft y Stevens, 1990). Consiste en una
primera tinción con azul alcián seguida del reactivo o Ácido Peryódico Schiff. El uso
en primer lugar del azul alciano permite colorear los glicoconjugados,
glicosaminoglicanos y mucopolisacáridos ácidos en tono azules. Por lo tanto, la
posterior utilización del PAS sólo reaccionará con los gliconjugados neutros
(carbohidratos de reserva energética) coloreándolos en tonalidades púrpura-magenta
(Sheehan y Hrapchak, 1980; Bancroft y Stevens, 1990). La presencia de mucinas
ácidas en las células globosas secretoras de mucosidad en los epitelios de los
conductos primarios de la gónada se interpreta como evidencia de transporte de
gametos hacia el exterior durante el desove (Lora-Vilchis et al., 2003), mientras que
la presencia de estas mismas mucinas ácidas en otros epitelios germinales se
considera evidencia de la respuesta inmune de los organismos ante un proceso
infeccioso (bacteriano, fúngico o viral) o de la captura, transporte de agentes
partículados exógenos, lubricación y señalización celular (Cannuel y Beninger, 2007).
Para el propósito de coloración de los componentes grasos de los tejidos se usó la
técnica histoquímica Sudán Negro (SN) (AnexoIV). El colorante Negro Sudán es un
reactivo de auxocrómo azul-negro en etanol acuoso y por solubilidad tiene
preferencia por los componentes lipídicos de los tejidos, tiñéndolos de color negro
azulado (Junqueira, 1988; Sobbota, 1988; Rodríguez-Jaramillo et al., 2008). El
colorante sudán negro tiñe una amplia variedad de lípidos que comprende
principalmente fosfolípidos (tonos grises), así como esteres de colesterol y
triglicéridos en tonalidades que van del azul oscuro a negro (Genneer, 1989;
Rodríguez-Moscozo y Arnaiz, 1998).
Para el montaje, las laminillas correspondientes a las técnicas de tinción con
Hematoxilina-Eosina y Azul Alciano PAS se colocaron en medio permanente de
resina sintética o Entellan, mientras que las laminillas de la técnica Sudán Negro se
16
montaron en medio de gelatina glicerinada. Las laminillas montadas se dejaron
secando por 24 hr y transcurrido ese tiempo se removió el exceso de resina para,
finalmente, realizar las observaciones al microscopio, de las estructuras histológicas
de cada tejido.
6.4. Estimación de índices morfofisiológicos
Se realizó la estimación del índice de condición (IC) e índice gonádico (IG) de
los mejillones colectados durante un ciclo anual, mediante los procedimientos que se
describen con detalle a continuación:
6.4.1. Índice de Condición (IC)
El índice de condición (IC) se estimó como el porcentaje del peso húmedo de
la carne (partes blandas) respecto al peso húmedo total (con concha). Este índice
permite observar la variación mensual del peso total de las partes blandas respecto
al peso total del cuerpo (Villalejo-Fuerte y Ceballos-Vázquez 1996). La fórmula
utilizada para el cálculo fue la siguiente:
IC= [(pt-pco)/pc]*100
Donde:
pt = peso total
pco = peso de la concha
pc = peso de la carne
6.4.2. Área de cobertura gonádica (ACG) y Área de cobertura de tejido somático
(ACS)
El área de cobertura gonádica (ACG) y área del cobertura de tejido somático
(ACS) se calcularon determinando el área promedio ocupada por la gónada y la
masa visceral de tres imágenes a 4X (7.9mm2) de cada especimen, usando el
sistema de análisis digital de imágenes Image Pro Premier (versión 9.0) Olympus-
Media Cybernetics®. El análisis de las imágenes se basó en la segmentación de los
pixeles con la intensidad del color específico del tejido gonádico y somático. El
software utilizado calculó automáticamente el área ocupada por la gónada y la masa
visceral en pixeles y la expresó en µm2. El ACG y el ACS se calcularon a partir del
17
área de cobertura de la gónada y de la masa visceral versus el área de cobertura
total de los tejidos, expresando el resultado en términos de porcentaje (Rodríguez-
Jaramillo et al., 2008) mediante la aplicación de las siguientes formulas:
ACG =Área de cobertura de la gónada
Área total de los tejidos X 100
ACS =Área de cobertura del tejido somático
Área total de los tejidos X 100
6.5. Análisis histológicos cualitativos
Los cortes de tejidos teñidos con las técnicas antes descritas fueron
observados mediante microscopia de luz en un microscopio óptico compuesto de
contraste de fases y campo claro Olympus BX41 y una cámara digital para
microscopio marca Nikon Digital Sight DS-Ri1® conectada a una computadora. Las
imágenes (microfotografías) de los tejidos fueron digitalizadas con los objetivos 4X y
10X y analizadas digitalmente con el software Image Pro Premier (versión 9.0)
Olympus-Media Cybernetics®.
6.5.1. Ciclo reproductivo, desarrollo gonádico y ovocitario
A partir de las preparaciones histológicas con la técnica de tinción H&E, se
realizó la descripción de los estadios de desarrollo de las gónadas tanto de hembras
(Tabla I) como de machos (Tabla II), tomando referencia en la clasificación
propuesta por Rodríguez-Jaramillo et al. (2008). Los ovocitos fueron clasificados en
cinco categorías ovocitarias de acuerdo con su estadio de desarrollo gametogénico
durante el ciclo reproductivo anual en condiciones naturales en la Bahía de La Paz,
considerando para ello la descripción morfológica de Rodríguez-Jaramillo et al.
(2001): ovogonias, ovocitos previtelogénicos, vitelogénicos, posvitelogénicos y
atrésicos. Lo anterior, para llevar a cabo el análisis particular de sus variables
morfométricas y de calidad ovocitaria (Rodríguez-Jaramillo, 2004).
18
La frecuencia de estas categorías ovocitarias fue estimada en varias regiones
del ovario, contando el número de ovocitos de cada estadio de maduración presentes
en un área predeterminada de 2.88 mm2 con el aumento 10X (Rodríguez-Jaramillo,
2004; Rodríguez-Jaramillo et al. 2008).
6.6. Análisis histológicos cuantitativos
6.6.1. Indicadores morfométricos de calidad ovocitaria
El área total del ovocito (AT) y las áreas del nucleoplasma y ovoplasma fueron
determinados en tres diferentes regiones de cada ovario usando el software de
análisis digital de imágenes SigmaScan Automated Image Analysis (versión 5.0).
Para realizar estos análisis, solamente fueron considerados los ovocitos cortados en
el plano ecuatorial que mostraron nucleoplasma, (Rodríguez-Jaramillo et al. 2001).
La calibración del sistema de análisis digital se hizo mediante una reglilla
micrométrica para el objetivo 20X. De las 3 imágenes de cada ovario se
seleccionaron 30 ovocitos con nucleoplasma bien definido, delimitando el perímetro
de cada ovocito y de su nucleoplasma de forma manual con el cursor. El software
calculó automáticamente el área total (AT) y el área del nucleoplasma, así como el
índice de redondez (IR) de los ovocitos. Las mediciones del diámetro teórico (DT),
diámetro máximo (DM), área de los ovocitos (AT) y relación núcleo/citoplasma (N/C)
se realizaron siguiendo los criterios descritos por Rodríguez-Jaramillo et al. (2001) y
Rodríguez-Jaramillo (2004). Dado que los ovocitos presentan formas irregulares
durante la ovogénesis, se calculó el diámetro teórico (DT) y el diámetro máximo (DM)
de los ovocitos a partir del área (A) de cada ovocito, para evitar errores al establecer
el diámetro de forma arbitraria usando las siguientes formulas:
6.6.1.1. Diámetro Teórico (DT)
DT= √4𝐴/π (Briarty, 1975; Saout et al. 1999).
6.6.1.2. Diámetro Máximo (DM)
19
Se seleccionó el valor de diámetro máximo de los ovocitos de cada hembra
por mes, estadio de desarrollo gonádico y por categoría de desarrollo
ovocitario.
6.6.1.3. Relación núcleo/citoplasma (N/C)
N/C= área del núcleo/ área del citoplasma (Rodríguez-Jaramillo et al. 2001).
6.6.2. Indicadores histoquímicos de calidad ovocitaria
Se evaluaron siguiendo el procedimiento descrito por Rodríguez-Jaramillo
(2004) y Rodríguez-Jaramillo et al., (2008). Para delimitar el perímetro de cada
ovocito y de su núcleo de forma manual se utilizó el cursor y el programa de análisis
digital de imágenes Image Pro Premier (versión 9.0) Olympus-Media Cybernetics®
Para ello se seleccionaron previamente 3 imágenes de cada gónada femenina a un
aumento de 20X y se seleccionaron 20 ovocitos con núcleo bien definido de cada
una de ellas. Una vez que el ovocito quedó definido se utilizó la herramienta
segmentadora del programa, que identifica solo los colores azul oscuro-negro
(lípidos) y magenta (carbohidratos) y que además cuantifica, mediante la suma de
pixeles del área ocupada por estos tonos de color, correspondientes a las reservas
energéticas de los ovocitos. Las áreas de cada ovocito ocupadas por píxeles azul
oscuro-negro (triglicéridos) y magenta (carbohidratos neutros) quedaron registradas
en una hoja de cálculo en Excel, para llevar a cabo la posterior estimación de los
índices lipídico (IL) y de carbohidratos (ICB) mediante las siguientes formulas:
6.6.2.1 Índice Lipídico (IL)
El índice lipídico (IL) se calculó dividiendo la sumatoria de las áreas ocupadas
por los gránulos de lípidos (triglicéridos) entre la superficie total del ovoplasma
(Rodríguez-Jaramillo, 2004; Rodríguez-Jaramillo et al., 2008), expresada en
porcentaje:
20
IL =Área de cobertura de lípidos
Área del ovoplasma X 100
6.6.2.2. Índice de Carbohidratos (ICH)
El índice de carbohidratos (ICH) se calculó dividiendo la sumatoria de las
áreas ocupadas por los carbohidratos (glicoconjugados neutros) entre la superficie
total del ovoplasma (Rodríguez-Jaramillo, 2004; Rodríguez-Jaramillo et al., 2008),
expresada en porcentaje:
ICH =Área de cobertura de carbohidratos
Área del ovoplasma X 100
6.7. Obtención de datos de variables ambientales (temperatura superficial y
clorofila a)
La información correspondiente a las variables fisicoquímicas en elsitiode
estudio fue obtenida a partir del sensor remoto satelital NOAAPOESAVHRR para la
temperatura superficial, y del sensor remoto AquaMODIS para la medición de la
concentración de clorofila-a de la Bahía de La Paz. Los datos de ambas variables
oceanográficas fueron extraídos de una base de datos del servidor BloomWatch de
la NOAA empleando para ello un código de programación en el software matemático
MATLAB® con resolución de 5x7km para el periodo comprendido entre los meses de
enero de 2013 a enero de 2014, La información obtenida fue ordenada en una base
de datos y procesada con el paquete estadístico Excel® para su análisis e
interpretación.
6.8. Análisis estadístico de datos
Los valores obtenidos de las variables morfométricas del mejillón M. capax
durante un ciclo reproductivo anual (longitud de la concha, peso de la carne y peso
total con concha), índice de condición (IC), área de cobertura gonádica (ACG) y área
de cobertura de tejidos somáticos (ACS), así como de todos los indicadores de la
calidad ovocitaria (DT, AT, relación N/C, IR, IL e ICH) fueron revisados y analizados
21
con el paquete estadístico STATISTICA® (versión 8.0 StatSoft Inc.). Se aplicaron las
pruebas a priori Kolmogorov-Smirnoff para determinar la existencia de normalidad, y
de Levene para homocedasticidad de los datos (Zar 1999). Posteriormente se
aplicaron análisis de varianza unifactoriales (Zar 1999), utilizando como factores
cada mes de muestreo respecto a las variables morfométricas (longitud de la concha,
peso de la carne y peso total con concha), el mes de muestreo y el estadio de
desarrollo ovárico respecto al ACG y ACS, y cada mes de muestreo, los estadios de
desarrollo ovárico y las categorías de tipo de ovocito respecto a los indicadores de
calidad ovocitaria evaluados (DT, DM, AT, relación N/C, IR, IL e ICH). El nivel de
significancia estadística fue establecido en α=0.05.
Los valores expresados en porcentaje fueron transformados a arco-seno
(arco-seno√𝑃) a fin de normalizar los datos y realizar los análisis estadísticos
correspondientes (Zar, 1993).
Cuando se encontraron diferencias significativas en las variables
morfométricas, índices de condición e indicadores de la calidad de los ovocitos, se
realizaron pruebas a posteriori de comparación de medias de Tukey (α=0.05) (Day y
Quinn, 1989) para grupos homogéneos.
22
7. RESULTADOS
7.1. Muestreos y rangos de talla-peso de organismos
Para realizar la presente investigación se colectaron 300 organismos en total,
en la zona oriental de la Bahía de La Paz, B.C.S. durante los meses de febrero,
marzo, abril, mayo, julio, agosto, septiembre, octubre y noviembre de 2013 y enero
de 2014. El intervalo de tallas (longitud de la concha) obtenido durante la colecta
anual de M. capax fue de 5.5 a 9.9 cm, con un promedio de 7.7±0.05 cm.
La talla (longitud) y el peso promedio total (con concha y sin concha) de los
organismos colectados en febrero al inicio de la presente investigación fue de
7.51±0.13cm, 35.04±2.15g y 10.48±0.59g, respectivamente. En marzo se observó un
decremento brusco en las tres variables pero durante los diez meses siguientes se
observaron incrementos y decrementos paulatinos tanto en talla como en peso de los
organismos. El máximo significativo de la longitud de la concha de los mejillones se
registró en el mes de octubre, con un promedio de 7.93±0.18cm y el mínimo se
observó en marzo con un valor promedio de 7.15±0.1cm. Mientras que el peso de la
carne alcanzó su máximo significativo en el mes de julio, con un promedio de
16.96±0.94g, y el mínimo en enero (8.90±0.45g); En el último mes de muestreo
(enero) se registraron valores promedio de 3.73±0.096, 2.29±0.1 y 2.09±0.064cm de
longitud, ancho y alto de la concha respectivamente, mientras que, el peso total se
disminuyó significativamente a un valor aproximado de 2.80±0.1g (Fig. 4).
23
Figura 4. Variación en talla y peso para Modiolus capax (media±error estándar). Los datos fueron analizados usando el mes como factor, y la longitud (F9, 290=2.6702; P=0.00543); peso total fresco con concha (F9,920=5.7144; P<0.0001) y peso de la carne (F9,920=17.552, P<0.0001) como variables dependientes en un ANOVA unifactorial. El asterisco es el post hoc e indica diferencias estadísticamente significativas (n=300).
7.2. Estimación de índices morfofisiológicos
7.2.1. Índice de Condición (IC)
El índice de condición de M. capax (Fig. 5) presentó importantes variaciones durante
el ciclo anual que se describe, fluctuando entre 16.98 y 91.40 %, con un promedio
anual de 39.72±0.83%. El análisis de varianza unifactorial aplicado a los datos del IC
indicó que existen diferencias estadísticamente significativas (P<0.05) entre los
meses de muestreo, conformándose cuatro grupos homogéneos. El valor promedio
mínimo del IC se registró durante los meses de febrero, agosto, septiembre, octubre,
noviembre y enero forman el grupo, correspondiendo el valor mínimo al mes de
enero (29±0.64%). Por otro lado, durante el periodo febrero-julio se observó una
tendencia creciente en el IC, con el valor promedio significativamente más alto en
julio (65±2.10%).
24
Figura 5. Variación del índice morfofisiológico de condición (IC; F9,290=133.72, P<0.0001) de Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el mes como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (n=300).
7.2.2. Área de cobertura gonádica (ACG) y Área de cobertura de tejido somático
(ACS)
En general, el área de cobertura de la gónada (ACG) y el área de cobertura
del tejido visceral o somático (ACS) del mejillón M. capax mostraron tendencias
inversamente proporcionales, ya sea discriminando por sexo (machos o hembras),
por mes o por estadio de desarrollo gonádico.
Las variaciones en el ACG respecto al ACS durante el estudio variaron
significativamente a lo largo de los meses (ACG, 37.61±1.73%, F9,241=30.908,
P<0.05; ACS, 62.39±1.73%, F9,241=30.908, P<0.05), como se aprecia en la Figura 6.
Se observan cambios en ambos indicadores de condición morfofisiológica de los
organismos, comenzando por el ACG que presentó valores mínimos al inicio y al final
del ciclo reproductivo en los meses de febrero y enero (10.47±2.53% y 8.81±3.41%,
respectivamente), seguidos de un paulatino aumento hasta alcanzar un máximo
significativo (P<0.05) en los meses de mayo y julio (71.9±1.94% y 69.16±2.92%,
respectivamente), un nuevo descenso en los meses de agosto y septiembre y un
25
último incremento en el mes de octubre (36.21±4.26%, respectivamente). Por otro
lado, el ACS muestra un patrón de variación temporal inverso al del ACG (Fig. 6). Los
valores máximos del ACS se observaron durante los meses de enero (91.19±3.41%)
y febrero (89.53±2.53%), seguidos de un progresivo descenso durante los meses de
abril y mayo hasta alcanzar los mínimos significativos (P<0.05) en los meses de
mayo y julio (28.12±1.94% y 30.84±2.92%, respectivamente), es a partir de este
lapso en el que se observa una continua recuperación en el ACS hasta el mes de
octubre en el que se observó un ligero decremento (63.79±4.26%) para continuar a
partir del mes de noviembre con tendencia a incrementarse (Fig. 6).
Figura 6. Área de cobertura de la gónada (ACG; F9,241=30.908, P<0.0001, n=251) vs Área de cobertura del tejido somático (ACS; F9,241=30.908, P<0.0001, n=251) del mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el mes como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.
Las variaciones en el ACG de las hembras fueron significativas en relación
con el tiempo en meses (F9,107=30.274, P<0.05) y además, se observó un
comportamiento opuesto al del ACS (F9,107=30.277, P<0.05) a lo largo del estudio
(Fig. 7a), en donde el ACG presenta los valores más bajos en los meses de enero
(17.39±11.34%), febrero (10.16±2.57%) y marzo (17.91±3.27%), en los meses el mes
26
de abril se observa un significativo aumento (P<0.05) hasta que el ACG alcanza sus
valores más altos en los meses de mayo y julio (71±2.23% y 74.15±2.09%,
respectivamente), luego disminuye gradualmente en los meses de agosto y
septiembre para incrementar significativamente (P<0.05) en los meses de octubre y
noviembre (60.04±6.51% y 62.63±4.61%, respectivamente). Mientras que el ACS
varia inversamente en el tiempo respecto al ACG, ya que los valores
significativamente más altos (P<0.05) de este indicador se observan en los meses de
enero (82.61±11.34%), febrero (89.84±2.57%) y marzo (82.1±3.27%), disminuyen
continua y significativamente (P<0.05) en el mes de abril hasta llegar a los valores
más bajos de ACS en los meses de mayo y julio (29±2.23% y 25.85±2.1%,
respectivamente), posteriormente aumentan en agosto y septiembre, y disminuyen
nuevamente en octubre y noviembre hasta valores de 39.96± 6.5% y 37.36± 4.61%,
respectivamente (Fig. 7a).
La variación del ACG (F4,112=43.394, P<0.05) respecto a la del ACS
(F4,112=43.397, P<0.05) empleando como factor de análisis el estadio de desarrollo
ovárico también muestra un patrón inverso (Fig. 7b). En dicho análisis se puede
observar que el ACG tiene un valor significativamente mínimo (9.16±4.05%; P<0.05)
en el estadio posterior al desove (EV), este incrementa constantemente en el estadio
previtelogénico (EI) y vitelogénico (EII) hasta que alcanza un valor significativamente
más alto (P<0.05) en el estadio posvitelogénico de máxima madurez (EIII,
64.13±2.39%), posteriormente el ACG promedio disminuye en el estadio
correspondiente a los desoves parciales (EIV) a un valor promedio de 56.5±3.02%.
Por otro lado, el ACS tiene sus máximos en los estadios de mínima actividad
reproductiva (EI y EV) con valores estimados en 80.47±4.05% y 90.84±3.72%,
respectivamente, dichos valores disminuyen significativamente (ANOVA, P<0.05) al
aumentar la maduración gonadal en el EII (66.01±2.89%) y llegan valores promedio
significativamente menores (ANOVA, P<0.05) estimados en 35.87±2.4% en el EIII
posvitelogénico de máxima madurez ovárica (Fig. 7b).
27
Figura 7. Área de cobertura de la gónada (ACG) vs Área de cobertura del tejido somático (ACS) de las hembras del mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La
Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el mes (ACG: F9,107=30.274, P<0.0001, n=127; ACS: F9,107=30.277, P<0.0001, n=127) y (b) el estadio de desarrollo ovárico (ACG: F4,112=43.394, P<0.0001, n=117; ACS: F4,112=43.397, P<0.0001, n=117) como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.
28
El patrón de variación mensual del ACG (F9,114=18.977, P<0.0001) y ACS
(F9,114=18.976, P<0.0001) de los machos del mejillón M. capax es muy similar al que
se observó en las hembras en un análisis similar, ya que en la Figura 8a se puede
observar que los valores de ACG mínimos para los machos en el presente estudio se
presentaron en los meses de noviembre (12.23±2.62%), enero (6.47±3.11%) y
febrero (12.87±6.45%), dichos valores aumentan progresivamente en los meses de
marzo y abril hasta que llegan a máximos significativos (P<0.05)en los meses de
mayo y julio (73.62±3.87% y 64.94±4.88%, respectivamente), luego decrecen
continua y pronunciadamente hasta que se observó un pequeño aumento en el mes
de octubre a un valor promedio de 24.92±2.78%. Mientras que el ACS refleja
máximos significativos en noviembre (87.77±2.62%), enero (93.53±3.11%) y febrero
(87.13±6.45%), estos valores disminuyen entre marzo y abril hasta los mínimos en
los meses de mayo y julio con valores promedio que van del 26.37±3.87% al
35.1±4.88%, respectivamente; posteriormente aumentan de manera continua entre
agosto y septiembre y disminuyen ligeramente en octubre a un valor promedio de
75.1±2.78% (Fig. 8a).
Los cambios del ACG (F4,100=27.458, P<0.0001) y del ACS (F4,100=27.458,
P<0.0001) en relación con el estadio de desarrollo gonádico de los machos
presentaron diferencias estadísticamente significativas (P<0.05) y se describen en la
Fig. 8b. Se aprecia un patrón de variación inverso entre el ACG y el ACS similar al
que se observó en las hembras, ya que el valor significativamente más bajo (P<0.05)
del ACG (15.2±6.63%) se observa en el estadio posdesove (EV), el ACG
incrementa progresivamente al iniciarse la gametogénesis en el EI
(espermatogénesis temprana) y el EII (espermatogénesis avanzada) e incrementa
repentinamente hasta alcanzar el valor significativamente más alto (P<0.05) de
aproximadamente 68.68±3.54% en el estadio de máxima madurez testicular (EIII,
espermogénesis), posteriormente el ACG disminuye significativamente (P<0.05) en el
estadio de desoves parciales (EIV) a un valor de 30.38±3%. Mientras que el ACS se
comportó de manera totalmente inversa al ACG por estadio de desarrollo gonádico,
ya que fue en el EIII en el que se observó el valor promedio significativamente más
bajo estimado en 31.32±3.54%, y fue en los estadios de baja actividad gametogénica
29
(EV y EI) en los que se obtuvieron los valores promedio significativamente más altos,
calculados en 84.8±6.63% y 75.82±3.84%, respectivamente (Fig. 8b).
Figura 8. Área de cobertura de la gónada (ACG) vs Área de cobertura del tejido somático (ACS) de los machos del mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La
Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el mes (ACG: F9,114=18.977, P<0.0001, n=124; ACS: F9,114=18.976, P<0.0001, n=124) y (b) el estadio de desarrollo ovárico (ACG: F4,100=27.458, P<0.0001, n=105; ACS: F4,100=27.458, P<0.0001, n=105) como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.
30
7.3. Ciclo reproductivo y desarrollo gonádico
7.3.1. Descripción de estadios de desarrollo gonádico
La descripción de los diferentes estadios de desarrollo gonádico para hembras
(Tabla I) y machos (Tabla II) del mejillón M. capax esta basada en la clasificación de
desarrollo gonádico propuesta por Rodríguez-Jaramillo et al. (2008), se describe a
continuación. Además, se presentan microfotografías de cada estadio de desarrollo
de la gónada para hembras (Fig. 9) y para machos (Fig. 10).
Tabla I. Descripción de los estadios de desarrollo gonádico en las hembras de M. capax
Estadio de desarrollo
Cortes en Parafina (H&E) 20X Referencias
Estadio 0 (indiferenciado)
Se observan nidos de ovogonias, sobre todo cerca de los epitelios de los folículos ováricos que se encuentran rodeados por tejido conjuntivo. Esta fase puede representar un periodo de recuperación con algunos folículos destruidos y/o en reabsorción. La mayor parte del tejido que se observa en esta fase es conjuntivo laxo.
Equivalente al Estadio 0 (Ochoa-Báez, 1987); Fase 1 (Hinzmann et al.
2013).
Estadio I (Previtelogénesis)
Folículos alargados, los túbulos gonadales están rodeados de abundante tejido conjuntivo. Las ovogonias son redondas (6.2±0.82µm de diámetro). Los Ovocitos previtelogénicos (37.59±0.78µm de diámetro) tienen escaso citoplasma basófilo. Es común encontrar algunos ovocitos vitelogénicos en esta fase.
Equivalente al Estadio I (Ochoa-Báez, 1987);
Fase 2 (Hinzmann et al. 2013).
Estadio II Vitelogénesis
Los folículos ováricos son grandes y están llenos de ovocitos vitelogénicos (41.93±0.51µm de diámetro) poligonales o pedunculados adosados a los epitelios de los folículos, presentan citoplasma acidófilo; algunos ovocitos previtelogénicos todavía se pueden encontrar en este estadio de desarrollo.
Equivalente al Estadio II (Ochoa-Báez, 1987); Fase 2 (Hinzmann et al.
2013).
Estadio III Posvitelogénesis
Los folículos ováricos están llenos de ovocitos posvitelogénicos que ya no están unidos a los epitelios de los folículos y la mayoría son de tamaño homogéneo (44.1±0.26µm de diámetro); presentan morfologías ligeramente poligonales o redondas; tienen un citoplasma acidófilo. Algunos ovocitos vitelogénicos y
Equivalente al Estadio III y IV (Ochoa-Báez,
1987); Fase 3 y 4 (Hinzmann et al. 2013).
31
previtelogénicos que siguen adheridos a las paredes folículos pueden están presentes aún. Hay una reducción considerable del tejido conjuntivo que rodea los folículos.
Estadio IV Desove parcial
El desove puede ser parcial o total, con espacios en los folículos ováricos que dejan los ovocitos maduros desovados. Ovocitos previtelogénicos y vitelogénicos pueden encontrarse asociados a los epitelios de los folículos y hay abundantes hemocitos. Se puede observar el epitelio ciliado en los conductos de desove con algunos ovocitos postvitelogénicos y en degeneración (sobremadurados y atrésicos). El área ocupada por la gónada es generalmente más pequeña en comparación con la fase inicial. Es común encontrar algunos ovocitos posvitelogénicos residuales y/o en degeneración, separados de la pared del folículo que no fueron liberados.
Equivalente al Estadio IV, V y VI (Ochoa-Báez,
1987); Fase 5 (Hinzmann et al. 2013).
Estadio V Posdesove
Folículos ováricos vacíos con muy pocos o nulos ovocitos residuales, el tejido conjuntivo que rodea a los acinos es escaso y se observa una importante infiltración hemocitica.
Equivalente al Estadio VI (Ochoa-Báez, 1987); Fase 5 (Hinzmann et al.
2013).
32
Tabla II. Descripción de los estadios de desarrollo gonádico en los machos de M. capax
Estadio de desarrollo
Cortes en Parafina-H&E-20X Referencias
Estadio 0 (indiferenciado)
Se observan espermatogonias, sobre todo cerca de los epitelos de los acinos testiculares que se encuentran rodeados por tejido conjuntivo. Esta fase puede representar un periodo de recuperación con algunos folículos destruidos y/o en reabsorción. La mayor parte del tejido que se observa en esta fase es conjuntivo laxo.
Equivalente al Estadio 0 (Ochoa-Báez, 1987); Fase 1 (Hinzmann et al.
2013).
Estadio I (Espermatogénesis
temprana)
Las espermatogonias están fijas a las paredes epiteliales de los acinos del testículo. El tejido conjuntivo es abundante. Los espermatocitos se distribuyen en un patrón concéntrico de las paredes acino al lumen.
Equivalente al Estadio I (Ochoa-Báez, 1987); Fase 1 y 2 (Hinzmann
et al. 2013).
Estadio II (Espermatogénesis
avanzada)
Los acinos testiculares están llenos de todas las categorías de células sexuales incluyendo espermatozoos. El tejido conjuntivo se reduce respecto al estadio anterior.
Equivalente al Estadio II (Ochoa-Báez, 1987); Fase 2 y 3 (Hinzmann
et al. 2013).
Estadio III (Madurez)
Los acinos testiculares son más grandes y llenos de espermatozoos con las caudas orientadas hacia el lumen. Algunos espermatocitos todavía se pueden observar. Los acinos están rodeados por tejido conjuntivo que se reduce y los acinos se unen.
Equivalente al Estadio III y IV (Ochoa-Báez,
1987); Fase 3 y 4 (Hinzmann et al. 2013).
Estadio IV Desove parcial
Se pueden observar los acinos interconectados llenos de espermatozoos siendo liberados al gonoducto. Los espermatozoides residuales se pueden observar en el lumen de los acinos vacíos que también tienen abundantes hemocitos.
Equivalente al Estadio IV, V, VI y VII (Ochoa-Báez, 1987); Fase 5
(Hinzmann et al. 2013).
Estadio V Posdesove
Acinos testiculares vacíos con muy pocos o nulos espermatozoos residuales, el tejido conjuntivo que rodea a los acinos es escaso y se observa una importante infiltración hemocitica.
Equivalente al Estadio VI y VII (Ochoa-Báez,
1987); Fase 5 (Hinzmann et al. 2013).
33
Figura 9. Estadios de desarrollo gonádico en hembras de mejillón Modiolus capax descritos
en este estudio durante un ciclo reproductivo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. E0. Indiferenciado, EI. Previtelogénesis, EII. Vitelogénesis, EIII. Posvitelogénesis, EIV. Desove parcial, EV. Posdesove, descritos en este estudio. tc, tejido conjuntivo; fl, folículos ováricos; td, tubo digestivo; cg y ovg, ovogonias; gd, gonoducto; op, ovocitos previtelogénicos; ov, ovocitos vitelogénicos; opv, ovocitos posvitelogénicos; oat, ovocitos atrésicos; n, núcleo; nu, núcleolo; clf, células foliculares; ovp, ovoplásma; np, nucleoplasma; he, hemocitos. Tinción Hematoxilina-Eosina (H&E) (10X Barra=60µm; 20X Barra=100µm y 100X Barra=10µm).
34
Figura 10. Estadios de desarrollo gonádico en machos de mejillón Modiolus capax descritos
en este estudio durante un ciclo reproductivo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. E0. Indiferenciado, EI. Espermatogénesis temprana, EII. Espermatogénesis avanzada, EIII. Espermiogénesis, EIV. Desove parcial, EV. Posdesove. tc, tejido conjuntivo; cfl, células foliculares; eg, espermatogonias; a, acinos testiculares; spz, espermatozoos; spd, espermátidas; gd, gonoducto; he, hemocitos. Tinción Hematoxilina-Eosina (H&E) (10X Barra=60µm; 20X Barra=100µm y 100X Barra=10µm).
35
7.3.2. Frecuencias de estadios de desarrollo gonádico
Durante el ciclo reproductivo anual del mejillón, los máximos estadios de
madurez gonádica de las hembras (posvitelogénesis) se observaron en abril, mayo,
julio y agosto, registrando la máxima frecuencia de hembras previtelogénicas en julio
con un promedio de 84.62%, seguido de un 75% en abril y agosto (con un promedio
de 57.16%). Se encontró la presencia de hembras en previtelogénesis y
vitelogénesis en cinco (febrero, marzo, agosto, septiembre y octubre) de los diez
meses de muestreo que contempló la presente investigación, encontrando la mayor
proporción de hembras previtelogénicas en febrero (26.92%) y vitelogénicas en
septiembre con un promedio de 35.29%. La mayor proporción de hembras en desove
parcial se registró en los meses de octubre y noviembre (con promedios de 75 % y
70.59 % respectivamente) seguido del primer evento importante de desove parcial en
septiembre (64.71%), sin embargo, se encontraron hembras en desove parcial en
menores proporciones los meses de marzo, abril, mayo, julio y agosto. Durante los
meses de febrero y abril se observaron las mayores proporciones de hembras en
posdesove (23.08% y 12.5% respectivamente), mientras que las mayores
proporciones de organismos sexualmente indiferenciados se encontraron en enero
con un promedio de 95.24%, y febrero (con 50% aproximadamente) indicando un
periodo de reposo reproductivo en este periodo (Fig. 11).
36
Figura 11. Frecuencia acumulada (%) de los estadios de desarrollo gonádico de las hembras de mejillón Modiolus capax en un ciclo reproductivo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S.
n=300.
Respecto al ciclo reproductivo de los machos del mejillón M. capax en la Bahía
de La Paz, tal y como se puede apreciar en la figura 12, se observaron las mayores
proporciones de individuos en estadios de desarrollo gonádico III (espermiogénesis)
en los meses de mayo (62.5 %), abril (62.5 %) y un máximo de madurez reproductiva
en julio, con un promedio de 81.25 %. Al igual que en el caso del ciclo reproductivo
anual de las hembras (Fig. 11) en el caso de los machos se encontraron
proporciones importantes de individuos en estadios de espermatogénesis temprana y
avanzada en todos los meses de muestreo (excepto mayo y julio que corresponden
al pico reproductivo principal), observando las mayores proporciones de machos en
espermatogénesis temprana en marzo y enero (11.11% para ambos meses) y un
52.38% en espermatogénesis avanzada en octubre. Se observó una tendencia
0
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cia
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esa
rro
llo G
on
ad
ico
de
H
em
bra
s (
%)
Tiempo (meses)
Indiferenciado (0) Previtelogénesis (I) Vitelogénesis (II)
Posvitelogénesis (III) Desove Parcial (IV) Posdesove (V)
37
marcada a los desoves parciales en 7 de los diez meses de muestreo comenzando
en abril y terminando en noviembre, siendo este último el mes con más desoves
parciales para los machos en la Bahía de La Paz con un 56.25% aprox. Los machos
en estadio posdesove fueron más abundantes en abril (12.5%), mientras que los
individuos sexualmente indiferenciados mostraron mayores proporciones en los
meses de enero (74.07%), febrero con un máximo de 76.47%, marzo (44.45 %) y
noviembre (con 31.25 %) indicando un periodo de reposo reproductivo durante estos
cuatro meses (Fig. 12).
Figura 12. Frecuencia acumulada (%) de los estadios de desarrollo gonádico de los machos de mejillón Modiolus capax en un ciclo reproductivo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S.
0
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esa
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llo G
on
ad
ico
en
Ma
ch
os (
%)
Tiempo (meses)
Indiferenciado (0) Espermatogénesis temprana (I)
Espermatogénesis Avanzada (II) Espermiogénesis (III)
Desove Parcial (IV) Posdesove (V)
38
7.3.3. Proporción de sexos
Respecto a la proporción de sexos (M:H) del mejillón M. capax (Fig. 13), esta
fue dominada por los machos durante todo el ciclo reproductivo (1: 0.88). Contrario a
lo que se esperaba, la proporción de machos superó la de las hembras durante los
meses de máxima actividad reproductiva, ya que durante julio y agosto (máxima
madurez gonádica de las hembras; Fig. 11) la proporción M:H fue de 1:0.81 y 1:0.37,
respectivamente. Mientras que en los meses de abril, mayo y septiembre (con
elevada actividad reproductiva) la proporción de hembras fue mayor que la de los
machos con el 53.33%, 60% y 62.96%, respectivamente. El mes de septiembre fue
en el que se registró la mayor proporción de hembras con un 62.96%, mientras que
la menor proporción se observó en el muestreo correspondiente a enero (con un
3.57%). Por otra parte, los machos mostraron mayores abundancias en agosto, con
un 73.08%, mientras que su mínimo se estimó en un 13.33% en febrero. La mayor
proporción de individuos sexualmente indiferenciados se encontró en enero, con un
71.43%, seguido de un 43.33% en febrero (Fig. 13), lo cual, coincide con los periodos
durante los cuales las gónadas se encuentran en reposo y reabsorción posdesove
(Fig. 12).
Figura 13. Proporción sexual (%) del mejillón Modiolus capax en un ciclo reproductivo anual
en la Bahía de La Paz, B.C.S. n=300.
0
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%)
Tiempo (meses)
Hembras Machos Indiferenciados
39
7.3.4. Frecuencia de categorías de desarrollo ovocitario
La frecuencia de las categorías de desarrollo ovocitarias (Fig. 14) obtenidas
durante un ciclo reproductivo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. muestran que la
proporción de estadios de maduración tempranos (ovogonias) fue relativamente
elevada durante el primer mes de muestreo (febrero) con 176 células por unidad de
área, mientras que el resto de los meses de muestreo la cantidad de ovogonias y
ovocitos previtelogénicos fue mínima (menos de 34 y 32 células/ área,
respectivamente). Por otro lado, las máximas frecuencias de ovocitos vitelogénicos
se registraron durante los meses de abril, julio, agosto (máximo con 230 ovocitos
vitelogénicos/ área) y noviembre, sin embargo, la presencia constante de ovocitos en
esta categoría de desarrollo durante el resto de los meses muestreados proporciona
evidencias de que el mejillón M. capax se encuentra listo para reproducirse y
madurar gametos femeninos durante todo el año (a excepción de los meses de enero
y febrero, donde solo se observó la presencia de ovocitos atrésicos en reabsorción y
ovogonias, respectivamente). En el mes de julio se cuantificó la mayor cantidad de
ovocitos maduros posvitelogénicos (247 ovocitos/ área), seguido del mes de abril con
233 ovocitos/ área y de mayo (173 ovocitos/ área), mismos resultados que coinciden
con los estadios de máxima madurez gonádica de la especie durante ciclo de campo
descrito en este estudio (Fig. 11). Es importante señalar que durante todos los meses
contemplados en el ciclo reproductivo anual del mejillón se encontraron frecuencias
importantes de ovocitos atrésicos, a excepción de los meses de febrero y enero (Fig.
14) en los que las gónadas se encontraban principalmente en estadio indiferenciado
(Fig. 11), siendo el mes de noviembre en el que se registró la mayor cantidad de
ovocitos atrésicos con 112 ovocitos/ área, seguido por los meses de julio (76 células/
área), agosto (con 64 ovocitos atrésicos/ área) y septiembre con 61 ovocitos
atrésicos/área, sin embargo, la frecuencia de ovocitos dañados por atresias se
mantuvo por arriba de los 38 ovocitos/ área durante el resto del ciclo reproductivo
(Fig.14).
40
Figura 14. Número total de ovocitos por hembra (a 10X) del mejillón Modiolus capax
distribuidos en cada uno de los estadios de desarrollo ovárico en un ciclo reproductivo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S.
7.3.5. Atresia y degeneración ovocitaria
Mediante el análisis histológico de las muestras de ovarios de mejillón a lo largo
del ciclo anual que comprende el presente estudio se observó un importante proceso
de atresia ovocitaria en los folículos ováricos de las gónadas femeninas,
principalmente durante el proceso de gametogénesis avanzada de M. capax en
donde se observa que la mayoría de los ovocitos vitelogénicos y postvitelogénicos
del ovario sufren el fenómeno de “lisis o degeneración ovocitaria” entrando en una
fase de muerte y reabsorción celular en las fases terminales de la vitelogénesis y que
se caracteriza por que los gametos femeninos pierden las propiedades basófilas del
núcleo, la disminución de la densidad del citoplasma y la deformación periférica
poliédrica de las células configurando la apariencia característica de una pieza de
rompecabezas, además de la importante producción de mucinas ácidas en la
periferia de los ovocitos, la abundante cantidad de material citoplásmico disperso en
el lumen de los folículos ováricos (Fig. 15).
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Tiempo (meses)
Ovocitos atrésicos
Ovocitos posvitelogénicos
Ovocitos vitelogénicos
Ovocitos previtelogénicos
Ovogonias
41
Figura 15. Microfotografías de cortes histológicos de las gónadas femeninas (ovarios) del mejillón Modiolus capax que muestran el fenómeno de atresia y degeneración ovocitaria.
Ovocitos vitelogénicos (ovit), ovocitos posvitelogénicos (opv), ovocitos atrésicos (oat), folículo ovárico (f), tejido conjuntivo (tc), núcleo (n), núcleolo (nu), carbohidratos ácidos (cha), material citoplásmico (mc). Tinción Azul Alciano-PAS (AAPAS) (20X Barra=100µm).
7.4. Análisis histológicos cuantitativos
7.4.1. Indicadores morfométricos de calidad ovocitaria
En total se emplearon 1,500 ovocitos para llevar a cabo los análisis y la
estimación de los parámetros morfométricos de calidad ovocitaria del mejillón M.
capax durante el ciclo reproductivo anual en la Bahía de La Paz.
Los análisis morfométricos de calidad ovocitaria (área de ovocitos y sus
núcleos, DT, DM, relación N/C e IR) se llevaron a cabo discriminando por mes,
estadio de desarrollo ovárico y tipo de ovocito, considerando para este último tres
categorías de madurez de ovocito (vitelogénicos, posvitelogénicos y atrésicos).
42
7.4.1.1. Área de los ovocitos y sus núcleos
En la Fig. 16 se muestra la evolución durante un ciclo anual del área de los
ovocitos y sus respectivos núcleos en función del mes (a) y del estadio de desarrollo
gonádico (b). Se puede observar que ambas variables morfométricas se comportan
de manera similar en función del tiempo durante el ciclo anual (Fig. 16a), ya que
tanto el área del núcleo como el área del ovocito tienen mínimos significativos al en
el mes de enero (55.17±10.48 µm2 y 431.19±15.76µm2 respectivamente) y con forme
avanza el tiempo el área de ambos incrementa hasta alcanzar un máximo
significativo en el mes de julio que corresponde a un área promedio de
648.238.46µm2 para el núcleo y de 1597.54±25.73 µm2 para los ovocitos completos,
a partir de este máximo se observa una tendencia paulatina al decremento (a
excepción del incremento en el área de los ovocitos que se observa en el mes de
noviembre) hasta llegar al fin del ciclo reproductivo en los meses de enero y febrero.
Mientras que el análisis del área de los ovocitos y sus núcleos por estadio de
desarrollo ovárico (Fig. 16b) muestra que ambas variables morfométricas muestran
tendencias similares conforme avanza la madurez de la gónada. Tanto el área del
núcleo como el área del ovocito tienen mínimos significativos al en el estadio de
madurez I (126.44±9.42µm2 y 357.62±25.63µm2 respectivamente) aumentando
significativamente el área de ambos en el estadio II hasta alcanzar un máximo
significativo en el estadio posvitelogénico (E III) que corresponde a un área promedio
de 610.57±6.50µm2 para el núcleo y de 1558.24±17.56µm2 para los ovocitos, a partir
de este máximo se observa una tendencia paulatina al decremento (a excepción del
incremento en el área de los ovocitos que se observa en el estadio V) hasta llegar al
último estadio de desarrollo gonádico. El área promedio de los ovocitos durante el
desarrollo de la gónada que reporta en el presente estudio fue de
1,447.48±12.14µm2 y el de los núcleos en 563.94±5.21µm2 (Fig.16).
43
Figura 16. Área de los ovocitos y de los núcleos (µm2) del mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el mes (área ovocitos: F9,1401=28.302, P<0.0001, n=1410; área núcleos: F9,1401=17.244, P<0.0001, n=1410) y (b) el estadio de desarrollo ovárico (área ovocitos: F4,1406=56.240, P<0.0001, n=1410; área núcleos: F4,1406=53.485, P<0.0001, n=1410) como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas n=1,410.
44
La evolución del área de los ovocitos y los núcleos del mejillón M. capax por
categoría ovocitaria de madurez (Fig. 17). Se puede observar que el tamaño de los
ovocitos no muestra diferencias estadísticamente significativas (P>0.05) entre
categoría de madurez. Adicionalmente, en el análisis que se muestra en la Fig. 17,
se puede apreciar que el área de los núcleos aumenta ligeramente al madurar de
ovocitos vitelogénicos (146.46±6.36µm2) a posvitelogénicos (150.04±6.006µm2) y
que disminuye significativamente (P>0.05) cuando los ovocitos se degeneran, siendo
los núcleos de los ovocitos atrésicos los que muestran valores de área de núcleo
significativamente menores (11.15±6.59µm2) respecto a las otras dos categorías de
madurez ovocitaria (Fig. 17).
Figura 17. Área de los ovocitos (F2,86=0.40962, P=0.66519, n=89) y de los núcleos (F2,86=8.1449, P=0.00058, n=89) (µm2) del mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el tipo de ovocito como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.
45
7.4.1.2. Diámetro teórico (DT) y máximo (DM) de los ovocitos
Los resultados del cálculo del diámetro teórico de (DT) de los ovocitos durante
el ciclo reproductivo de M. capax se muestran en la Fig. 18. Los resultados del
cálculo del diámetro teórico (DT) y diámetro máximo (DM) de los ovocitos por mes
durante el ciclo reproductivo de M. capax se muestran en la Fig. 18a. Se puede
observar como las máximas tallas de los ovocitos medidas en DT coinciden con el
periodo de máxima madurez gonádica de los mejillones (abril, mayo, julio y agosto)
alcanzando un máximo DT de 44.82±0.35µm en el mes de mayo y un máximo DM
con un valor de 72.66±1.72µm en julio con diferencias estadísticamente
significativas (P<0.05) entre los meses que comprende el análisis; al igual que en el
caso del área (Fig. 16a), el DT de los ovocitos comienza a decrecer a partir del mes
de mayo (con un significativo incremento en el mes de noviembre) hasta su mínimo
DT en enero (24.43±0.43µm) para reanudar su tendencia a incrementar a partir del
mes de febrero. Sin embargo, los resultados a partir de los análisis del DM por mes
durante el ciclo reproductivo anual muestran una tendencia distinta y más clara que
los del DT de los ovocitos del mejillón, ya que en la Fig. 18a se puede observar que
valores del DM más altos (72.66±1.72µm, 63.67±1.68µm y 63.65±1.82µm)
correspondientes a los meses de julio, agosto y abril (respectivamente) coinciden con
los meses en los que se presentó la máxima actividad reproductiva con la mayor
proporción de hembras en estadios de madurez ovárica avanzados y la mayor
cantidad de ovocitos maduros por unidad de área (Fig. 11 y 14) mientras que los
valores de DM más bajos (23.855±0.43µm, 50.16±2.211µm y 54.23±3.15µm)
correspondientes a los meses de enero, febrero y marzo (respectivamente) coinciden
con los periodos en los que se observaron las mayores proporciones de gónadas en
reposo y organismos en estadios posteriores al desove (Fig. 18a).
Con base en el análisis por estadio de desarrollo ovárico (Fig. 18b) se puede
observar como las máximas tallas de los ovocitos coinciden con el estadio de
máxima madurez gonádica de los mejillones (E III) alcanzando un máximo DT de
44.1±0.26µm; al igual que en el caso del área (Fig. 16b), la talla de los ovocitos
comienza a decrecer a partir del estadio III (con un incremento no significativo en el
estadio posdesove; V) observando el DT mínimo en el estadio de desarrollo I
46
(20.95±0.82µm). Mientras que los valores de las máximas tallas de los ovocitos por
estadio de desarrollo de la gónada (DM; Fig. 18b) mostraron que, al igual que el DT,
la talla significativamente más alta de los ovocitos (72.7±0.26µm) se presenta
durante el estadio de madurez (E III) y que no hay diferencias significativas (P>0.05)
entre los valores de DM de los ovocitos de los estadios de vitelogénesis (E II) y de
desove parcial (E IV). El DM de los ovocitos disminuye significativamente durante el
estadio de desarrollo V (53.54±1.17µm), sin embargo, el valor de DM más bajo del
análisis (28.9±0.82µm) se observó durante el estadio I de previtelogénesis de los
ovocitos (Fig. 18b).
El DT promedio de los ovocitos durante el ciclo reproductivo anual se estimó
en 42.31±0.19µm y el DM promedio en 51.81±0.96µm, con diferencias
estadísticamente significativas (P<0.05) entre los meses de muestreo y los estadios
de desarrollo ovárico (Fig. 18).
47
Figura 18. Diámetro teórico y máximo de los ovocitos (µm) del mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el mes (Diámetro teórico: F9,1401=31.477, P<0.0001, n=1410; Diámetro máximo: F9,58=90.4020, P<0.0001, n=68) y (b) el estadio de desarrollo ovárico (Diámetro teórico: F4,1406=81.876, P<0.0001, n=1410; Diámetro máximo: F4,46=12.027, P<0.0001, n=51) como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.
48
Los resultados del cálculo del diámetro teórico (DT) y máximo (DM) por tipo de
ovocito se muestran en la Fig. 19. Se puede observar que no hay diferencias
significativas (P>0.05) entre los valores del DT de los tres estadios de madurez
ovocitario considerados en el análisis, siendo los ovocitos vitelogénicos los que
mostraron un DT ligeramente mayor al de los ovocitos posvitelogénicos
(23.26±0.40µm y 23.1±0.37µm, respectivamente) mientras que el valor de DT
promedio para los ovocitos atrésicos fue el menor de todos y se estimó en un
promedio de 22.54±0.6 µm. Sin embargo, los resultados del cálculo del DM de los
ovocitos muestran una tendencia diferente a la observada para el DT, ya que, si bien,
los ovocitos vitelogénicos poseen valores promedio de DM altos (28.64±2.24µm)
estos disminuyen pronunciadamente al avanzar a la categoría de ovocitos
posvitelogénicos (26.53±2.21µm) y posteriormente aumentan de talla hasta alcanzar
un máximo significativo (30.006±2.9µm) como ovocitos atrésicos y degenerados (Fig.
19).
Figura 19. Diámetro Teórico (F2,86=0.65245, P=0.52333, n=89) y Máximo (F4,46=7.098, P<0.0194, n=51) de los ovocitos (µm) del mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el tipo de ovocito como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.
49
7.4.1.3. Relación núcleo/citoplasma (N/C)
Por otra parte, el promedio de la relación núcleo/ citoplasma (N/C) de los
ovocitos del mejillón durante el ciclo reproductivo anual de M. capax en la Bahía de
La Paz se estimó en 0.68±0.01 (Fig. 20).
La relación N/C es un indicador de calidad ovocitaria que muestra importantes
variaciones temporales (por mes) a lo largo del estudio. Tal y como se aprecia en la
Fig. 20a, es en el mes de enero en el que se presenta la mínima cantidad de
reservas en los ovocitos de los mejillones, con la relación N/C más baja con un valor
de 0.14±0.03, y es a partir de este mínimo que se observan aumentos y decrementos
constantes en la relación del núcleo respecto a la cantidad de citoplasma que poseen
los ovocitos a lo largo de todo el año. La mayor cantidad de reservas en los ovocitos
se observaron en el mes de octubre por el máximo y significativo aumento (P<0.05)
hasta un valor de 0.81±0.02 en la relación N/C de los ovocitos, seguido de los meses
de julio, marzo y agosto (0.745±0.01, 0.7±0.02 y 0.68±0.02 respectivamente) mismos
meses en los que también se observaron las mayores cantidades de ovocitos
vitelogénicos y posvitelogénicos (Fig. 14). Mientras que febrero y enero fueron los
meses en los que se observó la relación N/C más baja y que además coincide con el
fin del ciclo gonádico y con las mayores frecuencias de hembras en estadios de
desove parcial y posdesove (Fig. 9) además de ser los meses en los que se
cuantificaron las mayores cantidades de ovogonias y ovocitos atrésicos en
reabosrción y/o en degeneración (Fig. 14).
Sin embargo, el análisis de dicha relación por estadio de desarrollo ovárico
muestra tres principales variaciones (tres grupos homogéneos; P<0.05) a lo largo del
proceso de madurez gonadal. Tal y como se aprecia en la Fig. 20b, es en el estadio I
(previtelogénesis) es en el que se presenta la mínima cantidad de reservas en los
ovocitos de los mejillones, con una relación N/C de 0.58±0.04, y es a partir de este
mínimo que se observan aumentos progresivos durante el estadio de maduración II
hasta alcanzar un máximo en el estadio posvitelogénico (E III) con un promedio
aproximado de 0.7±0.01; posteriormente se observan decrementos constantes en la
relación del núcleo respecto a la cantidad de citoplasma que poseen los ovocitos
hasta llegar a un valor mínimo posterior al desove (E V) con un valor de 0.48±0.03.
50
La mayor cantidad de reservas en el citoplasma de los ovocitos se denota por la
presencia de un grupo homogéneo (P<0.05) con los valores más altos en los
estadios de desarrollo gonádico II, III y IV (Fig. 20b) lo cual, coincide con los periodos
de más elevada actividad reproductiva de las hembras durante el ciclo reproductivo
anual (Fig. 9).
Figura 20. Relación Núcleo/ Citoplasma de los ovocitos del mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el mes (F9,1401=13.445, P<0.0001, n=1410) y (b) el estadio de desarrollo ovárico (F4,1406=7.0865, P<0.0001, n=1410) como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.
51
La relación núcleo/citoplasma (N/C) de los tres tipos de ovocitos mostró un
patrón diferente al que se obtuvo a partir del cálculo del resto de los indicadores
morfométricos de calidad ovocitaria (Fig. 21). Tal y como se puede apreciar, la
relación N/C promedio de los ovocitos vitelogénicos se calculó en un valor
aproximado de 0.52±0.02 y ésta aumento considerablemente en el estadio
posvitelogénico hasta alcanzar su máximo significativo calculado en 0.56±0.022. En
la Fig. 21 también se puede apreciar que la relación N/C de los ovocitos atrésicos
disminuye significativamente hasta un valor promedio de 0.44±0.03.
Figura 21. Relación Núcleo/ Citoplasma (F2,86=6.8880, P=0.00168, n=89) de los ovocitos del mejillón Modiolus capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos
fueron analizados usando el tipo de ovocito como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.
52
7.4.1.4. Índice de Redondez (IR) de los ovocitos y sus núcleos
El índice de redondez (IR) de los ovocitos y sus respectivos núcleos (Fig. 22)
es quizá uno de los indicadores más importante de la calidad de los ovocitos, ya que
entre más cercano a 1 sea su valor la calidad de los gametos es mayor. Sin
embargo, este índice muestra un patrón diferente al que se encontró para el resto de
las variables morfométricas empleadas para evaluar la calidad de los ovocitos en el
presente estudio, ya que, al analizar los valores del IR por mes durante el ciclo anual
se observó que son significativamente menores (P<0.05) en el mes de febrero (tanto
de los ovocitos como de los núcleos; 0.63±0.03 y 0.69±0.02, respectivamente),
posteriormente el IR aumenta de manera significativa (P<0.05) en marzo para
mantenerse relativamente constante hasta noviembre, donde muestra un
pronunciado decremento, para finalmente, incrementar hasta los máximos valores
promedio de 0.94±0.01 para los núcleos, y de 0.82±0.04 para los ovocitos (Fig. 22a).
Por otra parte, en la Fig. 22b se puede observar que los valores del IR por
estadio de desarrollo ovárico tanto de los ovocitos como de los núcleos son
significativamente bajos (P<0.05) durante los máximos estadios de desarrollo
gonádico (E II, III y IV; 0.73±0.01, 0.74±0.004 y 0.71±0.004, respectivamente),
posteriormente se observa un ligero y no significativo aumento (P>0.05) en el estadio
gonádico posterior al desove (E V). Los valores máximos promedio en el IR para los
núcleos (0.94±0.01) y para los ovocitos (0.82±0.02) se observaron durante el estadio
de desarrollo previtelogénico (E I).
Es importante denotar que los núcleos mostraron un IR promedio mayor
(0.84±0.002) que el de los ovocitos (0.73±0.003) a lo largo de todo el ciclo
reproductivo y proceso de maduración gonádica del mejillón M. capax en la Bahía de
La Paz (Fig. 22).
53
Figura 22. Índice de Redondez (IR) de los ovocitos y los núcleos del mejillón Modiolus capax
(media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el mes (IR ovocitos: F9,1401=8.3374, P<0.0001, n=1410; IR núcleos: F9,1401=18.163, P<0.0001, n=1410) y (b) el estadio de desarrollo ovárico (IR ovocitos: F4,1406=11.781, P<0.0001, n=1410; IR núcleos: F4,1406=17.356, P<0.0001, n=1410) como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.
54
El índice de redondez (IR) de los ovocitos y sus núcleos muestra un patrón
muy similar entre si y respecto a los resultados obtenidos del cálculo de la relación
N/C por tipo de ovocito. En la Fig. 23 se puede observar tanto el IR de los ovocitos
como de sus núcleos disminuye significativamente (0.55±0.02 y 0.74±0.02
respectivamente) cuando los ovocitos se degeneran y son atrésicos. Es importante
resaltar que el IR de los núcleos es mayor que el de los ovocitos en todas las
categorías de madurez ovocitarias consideradas para realizar dicho análisis (Fig. 23).
Figura 23. Índice de Redondez (IR) de los ovocitos (F2,86=105.49, P<0.0001, n=89) y de los núcleos (F2,86=21.768, P<0.0001, n=89) del mejillón Modiolus capax (media±error estándar)
en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el tipo de ovocito como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.
55
7.4.2. Indicadores histoquímicos de calidad ovocitaria
En total se emplearon 1,317 ovocitos para llevar a cabo los análisis y la estimación
de los parámetros histoquímicos de calidad ovocitaria del mejillón M. capax durante
el ciclo reproductivo anual en la Bahía de La Paz.
7.4.2.1. Índice Lipídico (IL)
El análisis de los cortes histológicos en parafina teñidos con SN reveló la
presencia y localización de lípidos neutros en forma de triglicéridos (que se tiñeron
de azul oscuro-negro), y los fosfolípidos estructurales (de color gris). Las
microfotografías que se analizaron digitalmente correspondientes a ésta técnica
histoquímica (Fig. 24) permitieron realizar análisis cualitativos y cuantitativos, ya que,
se llevó a cabo la cuantificación de la cantidad de lípidos de reserva (triglicéridos)
discriminando por mes, estadio de desarrollo ovárico y por tipo de ovocito, además
de que se observaron las características del proceso de incorporación de reservas
lípidicas en los ovocitos de las hembras de M. capax, cuantificando además la
cantidad de lípidos presentes en la totalidad del tejido gonádico (ovocitos y tejido
conjuntivo adyacente a los folículos ováricos). En la Fig. 24 se puede apreciar de
manera cualitativa que la cantidad de triglicéridos es escasa en el tejido conjuntivo de
reserva que se encuentra entre los folículos del ovario, mientras que la cantidad de
dichos lípidos en los ovocitos es mayor, ya que se observan granulos lipídicos bien
definidos y abundantes.
56
Figura 24. Microfotografías de cortes histológicos de las gónadas femeninas (ovarios) del mejillón Modiolus capax. Ovocitos vitelogénicos (ovit), ovocitos posvitelogénicos (opv),
ovocitos atrésicos (oat), folículo ovárico (f), tejido conjuntivo (tc), núcleo (n), núcleolo (nu), triglicéridos (tgl). Tinción Sudán Negro para lípidos (SN) (20X Barra=100µm).
La cuantificación del Índice Lipídico (IL) en el tejido gonádico de hembras del
mejillón M. capax por el método de área de cobertura de los lípidos neutros o de
reserva (triglicéridos) del presente trabajo se llevó a cabo discriminando por mes, por
estadio de desarrollo ovárico y por tipo de ovocito.
En la Fig. 25a se puede observar que el IL de las gónadas femeninas de los
mejillones presenta diferencias temporales (por mes) estadísticamente significativas
(F8,253=40.046, p<0.0001), siendo los meses de febrero (3.6±0.73%) y marzo
(5.22±0.93%) en los que se observaron los valores promedio significativamente más
bajos (ANOVA, P<0.05) del IL, luego dichos valores aumentan significativamente
durante el mes de abril hasta llegar a los valores de IL más altos en los meses de
mayo, julio y agosto (18.25±0.53%, 17.32±0.48% y 15.5±1.3%, respectivamente), a
57
partir de agosto se observa una tendencia a la baja del IL hasta llegar a un valor
promedio de 7.70±0.75% en el mes de octubre, mismo que incrementa ligeramente
en el mes de noviembre a un IL de 9.56±0.37%.
Mientras que para el caso de la variación del IL por estadio de desarrollo
ovárico (Fig. 25b) el análisis de varianza unifactorial aplicado a los datos indicó que
existen diferencias estadísticamente significativas (F4,256=23.792, P<0.0001) entre los
estadios de desarrollo gonádico, conformándose tres grupos homogéneos (TUKEY,
P<0.05), el primero de ellos conformado por los estadios de baja actividad
reproductiva de previtelogénesis (EI) y posdesove (EV) en los que se observaron los
valores promedio más bajos del IL con (5.64±2.11% y 4.62±0.01%, respectivamente),
el segundo correspondiente a los estadios de vitelogénesis (EII) y desove parcial
(EIV) con valores de IL de 10.75±1.06% y 11.11±0.45% respectivamente; y por
último, el grupo homogéneo en el que se alcanzó el máximo valor promedio del IL
(16.17±0.5%) correspondiente al EIII posvitelogénico y de máxima madurez sexual
de las hembras. En general el análisis del IL por estadio de desarrollo ovárico
muestra una tendencia normal, ya que se observan valores muy bajos en el primer
estadio de desarrollo, aumenta al incrementar la vitelogénesis de los ovocitos,
alcanza su máximo en el estadio de madurez optima de las hembras, disminuye
durante los desoves parciales, para, finalmente, volver a denotar valores
significativamente bajos en el estadio posterior al desove (Fig. 25b).
58
Figura 25. Indice Lipídico (IL) del ovario del mejillón M. capax (media±error estándar) en la
Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el mes durante un ciclo anual (F8,253=40.046, P<0.0001, n=262) y (b) el estadio de desarrollo ovárico (F4,256=23.792, P<0.0001, n=261) como variables independientes en ANOVAS unifactoriales. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.
59
En general, los análisis del IL por tipo de ovocito en función del tiempo (Fig.
26) muestran importantes variaciones temporales a lo largo del ciclo anual que
comprende el presente trabajo.
Por un lado en la figura 26a se puede observar que la variación mensual
durante el ciclo anual del IL en los ovocitos vitelogénicos presenta diferencias
significativas (F8,253=2.3843, P=0.01712) a lo largo del estudio, se aprecia que es en
los meses de febrero, mayo y agosto es donde se obtuvieron los IL más altos
(56.07±6.97%, 43.16±12.57% y 62.20±22.93%, respectivamente) mientras que el
resto de los meses el IL conforma un solo grupo homogéneo (TUKEY, P<0.05) cuyos
valores promedio se mantienen dentro de un rango que fluctúa entre el 27.85±3.63%
y 24.17±2.84%.
La variación del IL de los ovocitos posvitelogénicos también fue
significativamente diferente (F8,253=3.0486, P=0.00272) entre los meses que
comprende el presente estudio, en la figura 26b se puede observar que los valores
significativamente más altos (P<0.05) del IL en esta categoría de madurez ovocitaria
se presentaron en los meses de agosto y febrero con valores de 33.37±2.84%
y34.18±4.56% (respectivamente), seguidos de marzo, mayo y septiembre
(28.23±4.49%, 28.26±3.2% y 27.74±2.34%, respectivamente), mientras que los
valores significativamente menores de este indicador de calidad ovocitaria fueron de
28.22±4.49%, 21.94±2.7% y 21.94±2.5, correspondientes a los meses de marzo,
octubre y noviembre.
De las tres categorías de madurez ovocitaria en las que se estimó el IL, la de
los ovocitos atrésicos (Fig. 26c) fue la que mostro la mayor variación mensual
(F8,253=2.1731, P=0.03) en el ciclo anual que comprende la presente investigación, ya
que se observan continuos altibajos en los valores del IL entre los meses. Sin
embargo, se puede apreciar que los valores promedio significativamente más altos
(P<0.05) del IL se presentan en el mes de febrero (44.83±0.73%), mientras que los
más bajos (23.83±2.42%) se observan en el mes de noviembre. En el resto de los
meses se puede observar que las variaciones en el IL de los ovocitos atrésicos y/o
en degeneración presentan ascensos y descensos que fluctúan entre el
37.08±6.21% y el 29.23±5.16% (Fig. 26c).
60
Figura 26. Índice Lipídico (IL) de (a) los ovocitos vitelogénicos (F8,253=2.3843, P=0.01712, n=262), (b) ovocitos posvitelogénicos (F8,253=3.0486, P=0.00272, n=262) y (c) ovocitos atrésicos (F8,253=2.1731, P=0.03, n=262) para el mejillón M. capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el mes durante un ciclo anual como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.
61
En la figura 27 se muestra la variación del IL de cada una de las categorías
ovocitarias (ovocitos vitelogénicos, posvitelogénicos y atrésicos) en función del
estadio de desarrollo ovárico. En general se puede observar que el IL de cada uno
de los tipos de ovocitos muestra un patrón de variación atípico respecto al estadio de
madurez ovárico de las hembras.
El análisis del IL de los ovocitos vitelogénicos (Fig. 27a) presentó diferencias
significativas (F4,256=1.4531, P=0.021702) entre estadios de madurez ováricos. En el
gráfico correspondiente a dicho análisis se puede observar que en los primeros
estadios de madurez de los ovarios, previtelogénesis (EI) y vitelogénesis (EII) los
valores promedio del IL son muy similares (46.48±21.29% y 45.41±16.24%,
respectivamente) y sin diferencias significativas entre sí, posteriormente los valores
promedio del IL de los ovocitos vitelogénicos caen hasta los mínimos obtenidos que
fueron de 31.21±4.73% en el estadio posvitelogénico (EIII) de máxima madurez
ovárica, y de 27.79±2.76% en el estadio posterior al desove (EIV), el IL aumenta
significativamente (P<0.05) hasta un valor máximo de 49.79±0.07% en el estadio
posterior al desove total (EV).
El IL de los ovocitos posvitelogénicos también varía significativamente
(F4,256=3.8992, P=0.011104) al analizar los valores de este indicador usando el
estadio de desarrollo ovárico como variable independiente (Fig. 27b). La prueba a
posteriori de Tukey demostró que existen diferencias estadísticamente significativas
(P<0.05) entre el valor promedio más alto (47.01±5.37%) del IL en los ovocitos
posvitelogénicos (correspondiente al EI de madurez de la gónada), respecto al resto
de los estadios ováricos que conformaron un solo grupo homogéneo cuyos valores
promedio de IL fluctuaron entre 27.55±0.04% y 23.81±1.63% (Fig. 27b).
Los valores promedio del IL de los ovocitos atrésicos por estadio de desarrollo
ovárico mostraron el patrón de variación más atípico de las tres categorías
ovocitarias (Fig. 27c), ya que, el valor más alto del IL para este tipo de ovocitos se
observa en el EV (posdesove) con un valor estimado en 49.99±0.1%, y los valores
más bajos comprenden un grupo homogéneo (P<0.05) de valores que van del
31.41±1.7% en el estadio de desove parcial (EIV) al 29.62±1.92% en el estadio de
máxima madurez ovárica (EIII).
62
Figura 27. Índice Lipídico (IL) de (a) los ovocitos vitelogénicos (F4,256=1.4531, P=0.021702, n=261), (b) ovocitos posvitelogénicos (F4,256=3.8992, P=0.011104, n=261) y (c) ovocitos atrésicos (F4,256=3.5070, P=0.00828, n=261) para el mejillón Modiolus capax (media±error
estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el estadio de desarrollo ovárico como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.
63
Por último, el análisis del IL por tipo de ovocito (F2,769=6.7917, P=0.03194)
muestra que tanto los ovocitos vitelogénicos como los ovocitos atrésicos y/o en
degeneración poseen valores promedio de IL similares y que además son los valores
significativamente más elevados (31.98±2.91% y 32.08±1.23% respectivamente), y,
peculiarmente, son los ovocitos maduros (posvitelogénicos) los que poseen el IL
significativamente más bajo, con un valor promedio de 25.73±0.95% (Fig. 28).
Figura 28. Índice total de Lípidos (IL) por categoría de tipo de ovocito (F2,769=6.7917, P=0.03194, n=772) para el mejillón M. capax (media±error estándar) durante un ciclo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el tipo de ovocito como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.
7.4.2.2. Índice de carbohidratos (ICH)
Por otra parte, y a la par de la cuantificación de lípidos neutros en el tejido
germinal de M. capax, el análisis de los cortes histológicos en parafina teñidos con la
técnica histoquímica Azul Alciano PAS reveló la presencia y localización de
carbohidratos neutros o de reserva (que se tiñeron en tonalidades magenta) y ácidos
(que se tiñeron de azul). Las microfotografías que se analizaron digitalmente
correspondientes a ésta técnica de tinción (Fig. 29) permitieron realizar análisis
64
cualitativos y cuantitativos, ya que, se llevó a cabo la cuantificación de la cantidad de
carbohidratos neutros de reserva discriminando por mes, estadio de desarrollo
ovárico y por tipo de ovocito, además de que se observaron las características del
proceso de incorporación de carbohidratos neutros a los ovocitos de las hembras de
M. capax y se cuantificó la cantidad de carbohidratos neutros presentes en la
totalidad del tejido gonádico (ovocitos y tejido conjuntivo adyacente a los folículos
ováricos) (Fig. 29).
Figura 29. Microfotografías de cortes histológicos de las gónadas femeninas (ovarios) del mejillón M. capax. Ovocitos vitelogénicos (ovit), ovocitos posvitelogénicos (opv), ovocitos
atrésicos (oat), folículo ovárico (f), tejido conjuntivo (tc), núcleo (n), núcleolo (nu), carbohidratos neutros (chn). Tinción Azul Alciano-PAS (AAPAS) (20X Barra=100µm).
65
La cuantificación del Índice de Carbohidratos (ICH) en el tejido gonádico de
hembras del mejillón M. capax por el método de área de cobertura de los
carbohidratos neutros (de reserva) del presente trabajo se llevó a cabo discriminando
por mes, por estadio de desarrollo ovárico y por tipo de ovocito.
En la Fig. 30a se puede observar que el ICH de las gónadas femeninas de los
mejillones presenta diferencias temporales (por mes) estadísticamente significativas
(F8,167=16.819, P<0.0001), siendo los meses de agosto (26.08±1.14%) y octubre
(26.66±1.71%) en los que se observaron los valores promedio significativamente más
altos (P<0.05) del ICH (a excepción de un brusco y significativo descenso en el ICH
en septiembre de 14.24±1.15%), luego dichos valores disminuyen significativamente
(P<0.05) durante el mes de noviembre hasta llegar a los valores de ICH más bajos
en dicho mes (11.1±0.89%), a partir de marzo se observa una tendencia del ICH a
mantenerse en valores más o menos constantes que no varían en gran medida
durante los siguientes tres meses (abril, mayo y julio) fluctuando entre valores
promedio que van del 11.76±1 al 14.28±1.23%.
Mientras que para el caso de la variación del ICH por estadio de desarrollo
ovárico (Fig. 30b) se observa un patrón poco claro de cómo fluctúa el ICH en función
del proceso de maduración de la gónada en las hembras de mejillón, sin embargo, el
análisis de varianza unifactorial aplicado a los datos indicó que no existen diferencias
estadísticamente significativas (F4,172=1.7208, P=1.4751) en el ICH por estadios de
desarrollo gonádico, conformándose un solo grupo homogéneo (P>0.05) donde los
dos valores promedio más bajos del ICH se observaron en un estadio de baja
actividad reproductiva de previtelogénesis (EI) y un estadio de actividad reproductiva
elevada de desoves parciales (EIV) con 15.57±3.5% y 14.57±0.88%
(respectivamente). Los valores más altos del ICH se observaron en los estadios de
vitelogénesis (II), posvitelogénesis (III) y posdesove (V) con promedios de
18.48±1.4%, 17±1.1% y 16.76±3.25% respectivamente.
66
Figura 30. Índice de Carbohidratos (ICH) para el mejillón M. capax (media±error estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando (a) el mes durante un ciclo anual (F8,167=16.819, P<0.0001, n=176) y (b) el estadio de desarrollo ovárico (F4,172=1.7208, P=1.4751, n=177) como variables independientes en ANOVAS unifactoriales. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.
67
En general, los análisis del ICH por tipo de ovocito en función del tiempo
muestran importantes variaciones temporales y el mismo patrón de cambios
mensuales a lo largo del ciclo anual que comprende el presente trabajo (Fig. 31).
Por un lado en la Fig. 31a se puede observar que la variación mensual durante
el ciclo anual del ICH en los ovocitos vitelogénicos presenta diferencias significativas
(F8,167=12.675, P<0.0001) a lo largo del estudio, se aprecia que del mes de febrero
(27.34±9.28%) a marzo (36.34±3.83%) se da un aumento en el ICH, que luego
disminuye significativamente para formar un grupo homogéneo (P<0.05) con los
valores más bajos del ICH en todo el ciclo anual desde abril a julio, incluyendo el mes
de mayo (16.10±2.26%, 17.48±1.9% y 16.55±1.73%, respectivamente). Sin embargo,
después se observa un brusco aumento en el ICH hasta el valor promedio
significativamente más alto (P<0.05) en el mes de agosto (43.11±1.6%), que
posteriormente disminuye pronunciadamente en el mes de septiembre
(24.31±1.78%) y vuelve a aumentar significativamente (P<0.05) en el mes de octubre
a un valor promedio de (39.36±4.11%) para decaer finalmente en el mes de
noviembre a un valor de 23.33±2.42% (Fig. 31a).
La variación del ICH de los ovocitos posvitelogénicos también fue
significativamente diferente (F8,167=10.113, P<0.0001) entre los meses que
comprende el presente estudio y mostró el mismo patrón de variación que en los
ovocitos vitelogénicos y atrésicos. En la Fig. 31b se puede observar que los valores
significativamente más altos (P<0.05) del ICH en esta categoría de madurez
ovocitaria se presentaron en los meses de agosto y octubre con valores de
38.34±1.77% y 36.94±3.13% (respectivamente), seguidos de febrero y marzo
(20.59±3.82% y 32.16±2.03%, respectivamente), mientras que los valores
significativamente menores de este indicador de calidad ovocitaria formaron un solo
grupo homogéneo (P<0.05) con valores de 15.8±2.86%, 15.78±1.96% y
18.16±4.24%, correspondientes a los meses de abril, mayo y julio (respectivamente).
De las tres categorías de madurez ovocitaria en las que se estimó el ICH, la
de los ovocitos atrésicos (Fig. 31c) fue la que mostro la mayor variación mensual
(F8,167=15.623, P<0.0001) pero con el mismo patrón de fluctuación que los otros dos
tipos de ovocitos. Ya que, como se puede observan en la Fig. 31c, los valores
68
promedio significativamente más altos (P<0.05) del ICH se presentan en marzo,
agosto y octubre (41.55±4.34%, 41.4±2.33% y 40.95±4.04%), mientras que los más
bajos se observan en los meses de abril (15.5±2.4%), mayo (14.3±1.95%) y julio
(19.64±3.1%).
Figura 31. Índice de Carbohidratos (ICH) de (a) los ovocitos vitelogénicos (F8,167=12.675, P<0.0001, n=176), (b) ovocitos posvitelogénicos (F8,167=10.113, P<0.0001, n=176) y (c) ovocitos atrésicos (F8,167=15.623, P<0.0001, n=176) para el mejillón M. capax (media±error
estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el mes durante un ciclo anual como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.
69
En la Fig. 32 se muestra la variación del ICH de cada una de las tres
categorías ovocitarias mencionadas anteriormente (ovocitos vitelogénicos,
posvitelogénicos y atrésicos) en función del estadio de desarrollo ovárico. En general
se puede observar que el IL de cada uno de los tipos de ovocitos muestra un patrón
de variación diferente y atípica respecto a lo que se esperaría que ocurriera en cada
estadio de madurez ovárico de las hembras, mismo patrón que se describe con
detalle a continuación.
El análisis del ICH de los ovocitos vitelogénicos (Fig. 32a) presentó diferencias
significativas (F4,172=9.5175, P<0.0001) entre estadios de madurez ováricos. En el
gráfico correspondiente a dicho análisis se puede observar que el valor promedio del
ICH disminuye significativamente (P<0.05) del estadio de previtelogénesis (EI,
54.6±12.70%) al estadio de vitelogénesis (EII) a un valor de 33.95±2.21%, y este
continúa disminuyendo hasta llegar a los mínimos valores promedio estimados en
23.61±1.92% y 22.65±1.45% en los estadios posvitelogénicos (EIII) y de desoves
parciales (EIV). Posteriormente se aprecia que el ICH aumenta significativamente
(P<0.05) cuando la gónada se encuentra en reposo en el estadio posterior al desove
(EV, 34.4±5.75%).
El IL de los ovocitos posvitelogénicos también varía significativamente
(F4,172=3.2764, p=0.01282) al analizar los valores de este indicador usando el estadio
de desarrollo ovárico como variable independiente (Fig. 32b). La prueba a posteriori
de Tukey demostró que existen diferencias estadísticamente significativas (P<0.05)
entre los valores promedio más altos (28.37±2.07%, 29.33±1.69% y 34.75±7.73%)
correspondientes a los estadios de desarrollo ovárico I, II y V (respectivamente) y los
valores del ICH de los estadios III (23.19±2.41%) y IV (21.01±1.37%) que fueron
significativamente menores (P<0.05).
Los valores promedio del ICH de los ovocitos atrésicos por estadio de
desarrollo ovárico mostraron el patrón de variación significativo (F4,172=5.2682,
P=0.0005, n=177) más complicado que el de las otras tres categorías ovocitarias. Tal
y como se puede apreciar en la Fig. 32c, el valor significativamente más bajo del ICH
para este tipo de ovocitos se observa en el EI (previtelogénesis) con un valor
estimado en 21.4±1.37%, luego ese valor aumenta bruscamente hasta el ICH
70
promedio más alto en el estadio II (35.14±2.59%) para esta categoría ovocitaria, y
disminuye en los estadios III y IV a valores similares (23.16±2.15% y 22.12±1.59%
respectivamente), para finalmente, aumentar a un valor promedio de 31.68±7.47% en
el estadio posterior al desove (V).
Figura 32. Índice de Carbohidratos (ICH) de (a) los ovocitos vitelogénicos (F4,172=9.5175, P<0.0001, n=177), (b) ovocitos posvitelogénicos (F4,172=3.2764, P=0.01282, n=177) y (c) ovocitos atrésicos (F4,172=5.2682, P=0.0005, n=177) para el mejillón M. capax (media±error
estándar) en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el estadio de desarrollo ovárico como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.
71
Por último, el análisis del ICH por tipo de ovocito (F2,511=2.1826, P=0.030731)
realizado en la presente investigación reveló que los ovocitos vitelogénicos poseen
valores promedio de ICH significativamente más elevados (P<0.05; 26.23±1.14%)
seguido de los ovocitos atrésicos con un ICH de 25.23±1.19%, mientras que,
peculiarmente, son los ovocitos maduros (posvitelogénicos) los que poseen el ICH
significativamente más bajo, con un valor promedio de 23.88±1.1% (Fig. 33).
Figura 33. Índice total de Carbohidratos (ICH) por categoría de tipo de ovocito (F2,511=2.1826, P=0.030731, n=514 para el mejillón Modiolus capax (media±error estándar) durante un ciclo
anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el tipo de ovocito como variable independiente en un ANOVA unifactorial. Las letras indexadas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.
7.4.2.3. Índices de reservas energéticas totales en forma de lípidos y carbohidratos
El análisis de lípidos y carbohidratos en el tejido del ovario de los mejillones
también se realizó en función del mes durante el ciclo anual que comprende la
presente investigación y en función del estadio de desarrollo gonádico de las
hembras (Fig. 34).
La mayor cantidad de reservas energéticas totales en las gónadas femeninas
de los mejillones se observaron en agosto (41.58±2.45%) y octubre (34.37±2.46%),
seguidos de los meses de mayo y julio con valores totales de 30.01±1.54% y
72
31.6±1.7% respectivamente. Mientras que las mínimas cantidades de reservas
totales se obtuvieron en los meses de febrero y noviembre con valores muy similares
(20.54±2.91% y 20.66±1.26%, respectivamente). Durante el resto de los meses los
valores totales de reservas en forma de lípidos y carbohidratos totales se
mantuvieron en niveles más o menos similares que fluctuaron ligeramente entre el
25.53±1.88% y el 24.83±2.75% (Fig. 34a). De manera general se puede observar en
la Fig. 34a que las reservas de carbohidratos por mes superan a las de lípidos, a
excepción de los meses de mayo y julio en donde las cantidades de lípidos en el
tejido gonádico (18.25±0.53% y 17.32±0.48%, respectivamente) fueron mayores a
las reservas energéticas en forma de carbohidratos (11.76±1.01% y 14.28±1.23%,
respectivamente). Las mayores cantidades de carbohidratos de reserva en la gónada
se observaron en agosto (26.1±1.14%) y octubre (26.66±1.71%), y los menores
porcentajes de lípidos de reserva se presentaron al principio del ciclo (febrero y
marzo con valores de 3.6±0.73% y 5.22±0.93%, respectivamente) y al final del ciclo
en los meses de octubre (7.7±0.75%) y noviembre (9.56±0.37%).
En la figura 34b se puede observar que la cantidad total de reservas
energéticas (lípidos y carbohidratos) muestra un patrón de distribución normal acorde
con el proceso de maduración ovárico, ya que inicialmente tiende a incrementar
constantemente, desde el estadio previtelogénico (EI) de un valor de 21.22±5.62% a
un 29.23±2.46% en el estadio de vitelogénesis (EII) hasta llegar a el valor más alto
de reservas de la gónada de 33.16±1.57% en el estadio posvitelogénico (E III) de
máxima madurez. Luego el porcentaje de lípidos y carbohidratos totales decrece
continuamente durante los desoves parciales (EIV, 25.68±1.32%) hasta un
21.38±3.26% en el estadio posterior al desove (EV). Al igual que en el caso de
análisis por mes (Fig. 34a), la comparación de la cantidad y tipo de reservas por
estadio de desarrollo ovárico (Fig. 34b) muestra que en todos los estadios de
madurez la cantidad de carbohidratos en la gónada es mayor que la de triglicéridos,
siendo los estadios II y III en los que se observó la mayor cantidad de carbohidratos
(18.48±1.39% y 17±1.1%, respectivamente), mientras que los valores más bajos de
este sustrato energético fueron de 15.57±3.5% y 14.57±0.88% para los estadios I y
IV, respectivamente. Por otro lado, el estadio III presentó el mayor porcentaje de
73
triglicéridos en ovario con un valor del 16.17±0.51%, siendo los estadios I y V los que
mostraron la menor cantidad de lípidos de reserva durante el proceso de maduración
gonádica de las hembras con valores de 5.64±2.11% y 4.62±0.01%, respectivamente
(Fig. 34b).
Figura 34. Índice total acumulado de Lípidos (IL) y Carbohidratos (ICH) por (a) mes y (b) estadio de desarrollo ovárico para el mejillón Modiolus capax durante un ciclo anual en la
Bahía de La Paz, B.C.S.
74
En la figura 35 se puede apreciar que los porcentajes más altos de reservas
energéticas totales se presentan en los ovocitos vitelogénicos (57.92±0.5%) y
atrésicos (57±0.45%), mientras que los ovocitos maduros posvitelogénicos son los
que tienen la menor cantidad de reservas con promedio del 49.23±1.07% de
reservas totales en forma de lípidos y carbohidratos.
Sin embargo, curiosa y contrariamente al caso de la comparación entre el tipo
y cantidad de reservas energéticas en forma de triglicéridos y carbohidratos neutros
en los ovarios de los mejillones, al realizar en análisis por tipo de ovocito se puede
observar en la figura 35 que la cantidad de lípidos es mayor que la de carbohidratos
en todas las categorías de madurez ovocitaria, donde los ovocitos vitelogénicos y
atrésicos fueron en los que se observaron los mayores porcentajes de triglicéridos
(31.98±2.91% y 32.1±1.23%, respectivamente), mientras que los ovocitos
posvitelogénicos tuvieron los niveles más bajos de lípidos de reserva con un
promedio del 25.73±0.95%. La cantidad de carbohidratos en los ovocitos para cada
categoría oscilo entre un promedio del 25.94±1.14% para los ovocitos vitelogénicos,
23.5±1.08% para los ovocitos posvitelogénicos y del 24.93±1.19% para los ovocitos
atrésicos (Fig. 35).
La cantidad total de reservas energéticas (tanto lípidos como carbohidratos)
por tipo de ovocito se estimó en cerca del 57.92% para los ovocitos vitelogénicos,
49.23% para los ovocitos posvitelogénicos y 57% para los ovocitos atrésicos (Fig.
35).
75
Figura 35. Índice total acumulado de Lípidos (IL) y Carbohidratos (ICH) por categoría de tipo de ovocito para el mejillón M. capax durante un ciclo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S.
En la figura 36 se puede apreciar que en general la cantidad promedio de
reservas energéticas en forma de carbohidratos neutros (16.33±1.93%) en el tejido
gonádico de las hembras de mejillón es significativamente mayor (P<0.05) que la de
triglicéridos (12.33±2.2%).
76
Figura 36. Índice total acumulado de reservas energéticas en ovario (F1,436=1036.4, P<0.0001, n=438) en forma de lípidos (IL) y carbohidratos (ICH) para el mejillón M. capax (media±error estándar) durante un ciclo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el índice como variable independiente en un ANOVA unifactorial. El asterisco es el pos hoc e indica diferencias estadísticamente significativas.
Contrario a la cantidad de reservas energéticas en todo el tejido ovárico de los
mejillones (Fig. 36), en la figura 37 se puede apreciar que el porcentaje de
triglicéridos es significativamente (ANOVA, P<0.05) más elevado (30.35±0.7%) que
el de los carbohidratos de reserva (24.45±0.65%) al hacer el análisis tomando en
cuenta solo el tejido germinal que comprende los ovocitos maduros y atrésicos de la
gónada.
77
Figura 37. Índice total acumulado de reservas energéticas en los ovocitos (F1,1315=2408.4, p<0.0001, n=1,317) en forma de lípidos (IL) y carbohidratos (ICH) para el mejillón M. capax
(media±error estándar) durante un ciclo anual en la Bahía de La Paz, B.C.S. Los datos fueron analizados usando el índice como variable independiente en un ANOVA unifactorial. El asterisco es el pos hoc e indica diferencias estadísticamente significativas.
7.5. Variación de temperatura superficial (TS°C) y clorofila-a (Chl-a)
La variación mensual de la temperatura superficial del agua (TS °C) y
concentración de clorofila-a (Chl-a) se presenta en la figura 38 La temperatura
presentó valor máximo (29 °C) en septiembre mínimo (20.11 °C) en febrero y un
valor promedio de 23.95±0.98°C durante el ciclo anual. Las concentración de Chl-a
en el área de estudio mostró una relación inversa con la temperatura, a excepción de
un “bloom” fitoplanctónico registrado al fin de la primavera e inicio del verano, con el
valor máximo (20.11 mg/m3 ) en febrero y el valor mínimo (0.58mg/m3) en diciembre,
con un valor promedio de 2.01±0.33 mg/m3 durante el periodo de estudio (Fig. 38).
Siguiendo con la descripción de la Fig. 38, se puede observar que la
temperatura se reporta con un valor promedio mínimo de 20.11°C en el mes de
febrero (invierno) que marcó el inicio del periodo de muestreo de los organismos,
78
posteriormente se observa un incremento continuo durante los meses que conforman
parte de la primavera (marzo y abril) hasta los meses de mayo y junio (primavera) en
los que la TS prácticamente no cambió (23°C) y luego se observa un repentino y
brusco incremento de la TS en los meses de verano hasta el máximo valor promedio
reportado para esta variable en septiembre (29°C), es justo después de este único
pico de aumento en la TS del agua que se observa un continuo y acelerado
descenso en la TS en los meses de otoño e invierno (octubre, noviembre y
diciembre) hasta una temperatura promedio de 21.25°C en enero de 2014, valor muy
similar al que se muestra para enero de 2013 (21,13°C).
La concentración de Chl-a en la Bahía de La Paz en el periodo que
comprende la investigación mostró una relación inversa con la temperatura (a
excepción de un “bloom” fitoplanctónico anómalo en el fin de la primavera y el inicio
del verano). Los valores más altos en la concentración de Chl-a se reportan en los
meses de invierno comenzando por enero de 2013 en donde el valor promedio
aumenta de 3.30mg/m3 a 20.11 mg/m3 en febrero, luego se observa una continua
tendencia a la disminución en la productividad del área de estudio en la primavera
conforme aumenta la TS hasta un promedio de 2.04 mg/m3 en mayo, y es justo en el
final de la primavera (entre mayo y junio) que se observa un repentino aumento en la
concentración de Chl-a hasta los 3.9 mg/m3 valor inclusive por arriba del reportado
para enero en el invierno de ese mismo año, luego de este repentino “bloom” se
observa un brusco descenso en la concentración de Chl-a durante el verano (julio y
agosto) hasta el periodo comprendido entre los meses de septiembre y noviembre en
los que la productividad fluctúa entre0.73 mg/m3 y 1.1 mg/m3 y es justo en el fin del
otoño y comienzo del invierno (entre noviembre y diciembre) que la concentración de
Chl-a vuelve a dispararse de 0.58 mg/m3 en diciembre a 2.55 mg/m3 en enero de
2014 (Fig. 38).
Las frecuencias más altas de mejillones sexualmente maduros de ambos
sexos y los valores mayores de ACG coinciden con el incremento de la TS durante
el periodo comprendido entre primavera (abril) y verano (agosto) y también coinciden
justo con el “Bloom” de fitoplancton que se presentó al final de la primavera e inicio
del verano. Contrariamente, las frecuencias más altas de individuos totalmente
79
desovados, indiferenciados y en reposo, así como los valores mas bajos en ACG se
observaron a fines de otoño (noviembre) con el descenso pronunciado de la TS,
durante el invierno (enero y febrero) y a inicios de la primavera (marzo), cuando se
registraron las temperaturas más bajas. Los valores máximos en ACS coincidieron
con los meses en los que se registraron aumentos súbitos en la concentración de
alimento (Chl-a) en la Bahía de La Paz, concretamente los meses de febrero y
noviembre de 2013 y enero de 2014 (Fig. 38).
Figura 38. Variación temporal de la temperatura superficial del agua y concentración de clorofila-a (los datos son la media) en la Bahía de La Paz, B.C.S. entre los meses de enero de 2013 y enero de 2014. El área sombreada indica el periodo en el que se observaron las mayores proporciones de individuos sexualmente maduros. Las líneas verticales continuas indican los meses en los que se observaron los valores más altos en el área de cobertura de las gónadas. Las líneas verticales discontinuas indican los meses en los que se observaron las mayores proporciones de individuos con gónadas indiferenciadas o en reposo, los meses en los que se observaron los valores más bajos en el área de cobertura de las gónadas, y los meses en los que se reportan las mayores áreas de cobertura de tejidos somáticos de Modiolus capax.
80
8. DISCUSIÓN
Los resultados de la presente investigación demuestran que Modiolus capax
es un molusco bivalvo desovador parcial que se reproduce prácticamente durante
todo el año en la Bahía de La Paz, B.C.S., con un periodo de actividad reproductiva
máxima que va de abril a agosto principalmente, con un segundo pico reproductivo
de menor intensidad en el mes de noviembre. M. capax presenta una máxima
madurez gonádica entre los meses de abril y agosto con altas frecuencias de
organismos en estadio posvitelogénico (Fig. 11 y 12), desoves máximos ocurridos
durante octubre y noviembre (Fig. 11 y 12) y las más altas áreas de cobertura
gonádica (ACG) (Fig.6), lo anterior respaldado por el descenso del índice de
condición (Fig. 5) en ese lapso de tiempo, así como las altas frecuencias
porcentuales de individuos en maduración avanzada, desove y posdesove (Fig. 11 y
12) y las altas cantidades de ovocitos en estadios de maduración avanzados
(vitelogénicos y posvitelogénicos) durante prácticamente todo el ciclo reproductivo
(Fig. 14) . Se logró identificar un periodo de reposo reproductivo durante el otoño-
invierno (noviembre, enero y febrero) e inicio de la primavera (marzo) ya que más del
80% de la población de mejillones se muestra inmadura y sus gónadas están en
reabsorción o indiferenciadas (Fig. 11 y 12), hecho que coincide temporalmente con
el descenso y las temperaturas más bajas (Fig. 38) durante el presente estudio.
Además, en el presente trabajo se encontró que la proporción de sexos está
dominada por los machos durante todo el ciclo reproductivo (tanto en las temporadas
de baja actividad reproductiva como en las de alta madurez gonádica y de
reproducción activa) (Fig. 13).
Para describir histológicamente del ciclo reproductivo y de desarrollo gonádico de M.
capax en la Bahía de La Paz se siguieron los criterios y escalas de desarrollo
propuestas por Rodríguez-Jaramillo et al., (2008), sin embargo, en la presente
investigación se observaron importantes características y procesos que no se habían
descrito previamente para esta especie de mejillón en la misma área de estudio por
Ochoa-Báez (1985), probablemente debido a que las condiciones ambientales de la
zona fueron distintas a las reportadas por dicho autor entre 1983 y 1984 y a la alta
periodicidad con la que se tomaron muestras en este trabajo.
81
Los resultados de esta investigación difieren de los reportados por (Ochoa-
Báez 1985; Ochoa-Báez, 1987) donde se proporcionó un amplio marco de
conocimientos y antecedentes respecto a la biología poblacional y reproductiva de M.
capax en la Bahía de La Paz, ya que en sus estudios comprendidos entre los años
de 1983 y 1984 encontró que el máximo periodo de actividad reproductora se
presenta en junio con desoves máximos en julio, y que la reproducción de esta
especie en la Bahía de La Paz se lleva a cabo desde finales de mayo hasta
principios de julio. Los resultados de Ochoa-Báez (1985); Ochoa-Báez, (1987)
también difieren de los reportados en el presente trabajo en el hecho de que sus
análisis muestran que si bien, la proporción de machos es mayor durante periodos de
baja actividad reproductiva, la de las hembras supera a la de los machos durante los
meses de máxima madurez gonádica y desove.
Sin embargo, los resultados de la presente investigación coinciden en gran
medida con los obtenidos por Bückle-Ramírez y Garza-Aguirre (1989) al estudiar el
ciclo reproductivo de M. capax en la Bahía de los Ángeles, B.C. entre febrero de
1985 y enero de 1986, ya que dichos autores encontraron evidencias de liberación
de gametos durante todo el periodo de estudio, donde el ciclo reproductivo tuvo fases
bien definidas. Al igual que en el presente trabajo (como se observa en la Fig. 6, 7, y
8) Bückle-Ramírez y Garza-Aguirre (1989) mencionan que de febrero a julio la
mayoría de los organismos se encontraron en etapas de crecimiento gonadal, en
agosto fue evidente un periodo de intensa liberación de gametos para ambos sexos,
reiniciándose rápidamente la gametogénesis entre agosto y septiembre, además de
que la liberación de gametos en un gran número de organismos continuó hasta el
final del ciclo (enero), como fue el caso de hembras y machos en este estudio (Fig.
11 y 12).
Los moluscos presentan formas diversas de reproducción sexual, que van
desde dioicos estrictos, la bisexualidad alternativa (hermafroditas secuenciales),
hasta el hermafrodistismo funcional (Coe, 1943; Guo y Allen, 1994; Rodríguez-
Jaramillo, 2014). Aunque los sexos separados (dioicos) suelen ser los casos mas
comunes en los moluscos, el 40% de los 5,600 géneros de este filo son
hermafroditas simultaneos o secuenciales (Rodríguez-Jaramillo, 2014).
82
En sus resultados, Ochoa-Báez (1987) aporta un registro exclusivo para la
Bahía de La Paz en donde se reportaron eventos muy escasos de hermafroditismo y
bisexualidad funcional y no funcional en la población de M. capax estudiada en los
años de 1983 y 1984 en la Bahía de La Paz, mientras que otros autores como
Cáceres-Martínez y Figueras (1998); Newell (1989) y Villalba (1995) han reportado
prevalencias de hermafroditismo funcional y no funcional en mejillones alrededor de
1/1000. Sin embargo, en la presente investigación realizada tres décadas después, y
que también abarca el estudio de un ciclo reproductivo anual en la misma área de
estudio que Ochoa-Báez (1987), no se encontraron organismos que presentaran
algún tipo de hermafroditismo o bisexualidad en esta especie.
En otras especies de bivalvos marinos como los ostiones del género
Crassostrea prevalece la hipótesis respecto a que estos organismos tienen
sexualidad alternativa protándrica, en los que el sexo está determinado por factores
ambientales como la disponibilidad de alimento y temperatura del agua (Coe, 1936;
Galtsoff, 1964; Quayle, 1988). Sin embargo, en especies mas y mejor estudiadas
como C. gigas ha sido demostrado que el sexo esta determinado genéticamente por
factores contenidos en los cromosomas, en este caso, un locus de macho dominante
con alelo (M), y un alelo para las hembras protándricas (F), y el genotipo MF son
machos verdaderos que no cambian de sexo, mientras que FF son hembras
protándricas que maduran como machos en la etapa juvenil y pueden cambiar de
sexo durante los últimos años (Rodríguez-Jaramillo, 2014). La tasa de cambio de
sexo en los individuos puede estar influenciada por genes secundarios y/o por la
influencia de factores ambientales (Guo et al., 1998). Lo anterior sirve como
referencia para explicar como es que en M. capax se han reportado escasos eventos
de hermafroditismo a pesar de que en el presente trabajo no se hayan observado
este tipo de eventos de cambio de sexo.
Los Índices de condición (IC) y gonadal son ampliamente utilizados en el
estudio del crecimiento y reproducción de invertebrados marinos (Grant y Tyler,
1983; Suárez et al., 2005), representan una manera sencilla y práctica de hacer una
aproximación inicial al estado del desarrollo sexual de los individuos. Al igual que el
caso del presente trabajo, la mayoría de los autores utilizan toda la carne (tejido
83
somático y gonadal) para el cálculo del índice de condición (Guillou et al., 1990) y de
partes de la masa visceral tales como la gónada para el cálculo del índice gonádico
bajo el mismo principio (Emmett et al., 1987; Jaramillo y Navarro, 1995). Sin
embargo, teniendo en cuenta que la gónada de M. capax es difusa y se caracteriza
por desarrollarse inmersa en parte de la masa visceral durante el ciclo reproductivo,
es por ello que en el presente trabajo se empleó el área de cobertura gonádica
(ACG) en lugar del índice gonádico que se determina convencionalmente en la
mayoría de los trabajos usando el peso de la gónada respecto al peso del resto de la
carne (Bückle-Ramírez y Garza-Aguirre. 1989; Cáceres-Martínez et al., 1990;
Villalejo-Fuerte y Ceballos- Vázquez, 1996; Villalejo-Fuerte y Muñetón-Gómez, 2002;
Hernández-Olalde, 2003; Suárez et al., 2005; García-Corona et al., 2014) como un
indicador de la proporción real de la gónada respecto al resto de la carne de los
organismos. En esta investigación tanto el IC (Fig. 5) como el ACG (Fig. 6) muestran
una variación estacional bien definida (Fig.38) cuya diferencia, además, es
estadísticamente significativa debido a los distintos estadios de desarrollo gonádico y
estadios de madurez de los organismos a lo largo del ciclo reproductivo (Fig. 5 y 6).
Estacionalmente, tanto en hembras (Fig. 7) como en machos (Fig. 8), los valores
mínimos del ACG se presentan desde el invierno hasta el principio de la primavera,
después de los principales desoves y al final del ciclo gonadal (Fig. 11). Del verano al
final del otoño, los valores del IC (Fig. 5) y del ACG (Fig.6) aumentan
significativamente hasta alcanzar su valor máximo entre el verano y el otoño, justo
antes de los meses en los que se registró la máxima actividad reproductiva (Fig. 38).
En cuanto a las etapas del ciclo gonádico descrito, el ACG (Fig. 6) presenta
diferencias significativas entre meses (ANOVA, P<0.05). Alcanzando un máximo en
el final de la primavera y el principio del verano, y un mínimo después de los desoves
totales y cuando las gónadas se encuentran indiferenciadas y en reposo durante el
invierno (Fig. 38). Esto confirma la idoneidad del ACG como una herramienta
análoga al índice gonadal que se emplea tradicionalmente, porque en ambos casos
los resultados sugieren que puede variar más en función del número de gametos en
lugar de la cantidad de tejido de reserva.
84
El IC indica que se presenta una recuperación significativa de las partes
blandas (carne) de los mejillones (incluidos tejidos somáticos y germinales) entre los
meses de febrero a julio, lo cual se interpreta como un incremento en la condición
reproductiva y en la gametogénesis de M. capax en este periodo hasta su máximo
significativo en el mes de julio (Fig. 5), lo anterior respaldado por el análisis
específico de ACG (Fig.6) que además se realizó tanto en hembras (Fig. 7) como en
machos (Fig. 8). Mismo incremento en el IC que fue observado y reportado por
Ochoa-Báez (1985) pero entre los meses de octubre y noviembre junto con una
prolongación de la gametogénesis activa en las hembras hasta el invierno y
principios de la primavera que coincidió con un descenso de temperatura superficial
del agua en la Bahía a la entrada invernal, todo lo contrario al proceso observado en
este trabajo en el que, tanto el incremento en el IC como en el ACG coincidieron con
el incremento progresivo y continuo de la temperatura del agua ente la primavera y el
verano (Fig.38). El periodo en el incremento del IC que reporta Ochoa-Báez (1985)
entre octubre y noviembre representa en el presente estudio un periodo de descanso
reproductivo (posdesove), reabsorción gonadal e indiferenciación sexual (Fig. 5 y 6)
que coincidió con el descenso y los mínimos valores promedios de TS °C (Fig. 38).
Contrario a lo mencionado por Ochoa-Báez (1987) para el ciclo reproductivo
de M. capax en la Bahía de La Paz, B.C.S., Bückle-Ramírez y Garza-Aguirre (1989)
mencionan que el periodo de crecimiento gonádico más acelerado y la liberación de
gametos más intensa estuvieron relacionados con las temperaturas más altas de la
Bahía de los Ángeles, B.C., al igual que el caso de la población de esta misma
especie en la Bahía de La Paz en el presente trabajo (Fig. 38).
Si bien los resultados obtenidos por Ochoa-Báez (1985); Ochoa-Báez (1987)
en la Bahía de La Paz, B.C.S. difieren de los reportados por Bückle-Ramírez y
Garza-Aguirre (1989) para Bahía de los Ángeles, B.C. y en mayor medida con los del
presente trabajo, los tres estudios coinciden entre sí respecto a otros trabajos
realizados para otras especies de mitílidos en el Océano Pacífico de América
(Bückle-Ramírez y Garza-Aguirre, 1989; Jaramillo y Navarro, 1995; Toro et al. 2002;
Oyarzún et al. 2011), en que el ciclo gametogénico y de desarrollo gonádico en
principio es continuo durante todo el año, demostrándose que entre la primavera y el
85
verano cerca del 90% de los adultos (machos y hembras) se reproducen
simultáneamente con ciclos gaméticos asincrónicos que producen varios desoves
parciales durante gran parte de año (especialmente en machos como se puede
apreciar en la Fig. 12). Su número e intensidad pueden ser, tal y como lo mencionan
Galtsoff (1964); Sastry (1979); Mackie (1984); Barber y Blake (1991); Thompson et
al. (1996); Avellanal et al. (2002); Quiñones-Arreola (2003); Hernández-Olalde
(2003); Thorarinsdóttir y Gunnarsson (2003); Cáceres-Puig (2007), una característica
particular de la población (factores endógenos de condición fisiológica-reservas
energéticas, neurosecreción hormonal y carga genética) y a la vez depender de los
factores ambientales (factores exógenos como temperatura, salinidad, disponibilidad
de alimento, ciclos lunares y de mareas) predominantes en el área de estudio, o de
una combinación compleja de ambos. Puede ser que cambios temporales en dichos
factores (principalmente ambientales) determinan en conjunto el patrón de
reproducción de M. capax en la Bahía de La Paz y den lugar a las diferencias en el
desarrollo gonádico y ciclo reproductivo de esta especie en el tiempo.
En la literatura existe una amplia variedad de sistemas de clasificación
propuestos para diferenciar los estadios de desarrollo gonádico tanto de hembras,
como de machos y hermafroditas no funcionales de bivalvos mitílidos (Pipe, 1987a;
Jaramillo y Navarro, 1995; Toro et al. 2002; Suárez et al., 2005; Ortiz-Zarragoitia y
Cajaraville, 2010; Oyarzún et al. 2011 Hinzmann et al., 2013), incluido Modiolus
capax en el Golfo de California (Ochoa-Báez, 1985; Ochoa-Báez, 1987; Bückle-
Ramírez y Garza-Aguirre, 1989). Sin embargo, en el presente estudio se propone
una adaptación del esquema específico para la población del mejillón M. capax de la
Bahía de La Paz durante un ciclo reproductivo anual basado en observaciones
morfológicas cualitativas y cuantitativas de los gametos y estructuras histológicas
específicas de la gónada que describe detalladamente el proceso de maduración
gonádica de esta especie en un compendio de cinco estadios de desarrollo para
hembras (Tabla I; Fig. 9) y machos (Tabla II; Fig. 10).
La alta frecuencia de organismos en resposo gonádico durante agosto,
septiembre, octubre y noviembre (Fig. 11 y 12) sugiere que la gametogénesis se
reinició rápidamente y que la mayoría de los organismos pasaron por una etapa de
86
reabsorción de los ovocitos reciduales que sucedió en un período de tiempo corto,
como se ha observado en otras especies de mejillones como Mytilus californianus y
Aulacomya maoriana (Kennedy, 1977), Mytilus edulis (Kelley et al., 1982), Mytilus
galloprovincialis (Suárez et al., 2005) y Modiolus metcalfei (López y Gómez, 1982).
Esta puede ser la causa de que en los meses siguientes se observaran bajas
proporciones de organismos con valores bajos en el IC (Fig. 5) y ACG (Fig. 6) como
consecuencia de una alta proporción de organismos maduros y en etapas de
liberación de gametos (Fig. 11 y 12).
En el ciclo gametogénico del mejillón M. capax en el presente estudio se ha
descrito la existencia de fenómenos atresia y degeneración ovocitaria muy elevados
(Fig. 14 y 15). Este proceso de observó principalmente en estadios de vitelogénesis,
desove y posdesove (IV y V; Fig. 9 y 15), durante los periodos que comprenden
desoves parciales (durante todo el ciclo reproductivo, Fig.11), también durante los
meses en los que la mayor proporción de las hembras se encuentran en periodos de
reposo gonádico (final del otoño-invierno y principios de la primavera, Fig. 11) y en el
final del ciclo de gametogénico (final del otoño-invierno) época en la que se
presentan las mayores frecuencias de ovocitos atrésicos (Fig. 14). Este fenómeno es
frecuente en los moluscos bivalvos (Pipe, 1987b; Dorange y Le Pennec, 1989;
Motavkine y Varaksine 1989; Beninger y Le Pennec, 1991). Según Motavkine y
Varaksine (1989), esto puede ser debido a la capacidad limitada del folículo a
mantener las células germinales ante condiciones ambientales adversas para llevar a
cabo los desoves, a los procesos de auto-limpieza al final del ciclo gametogénico
tales como la preparación para la siguiente temporada reproductiva y/o una
respuesta ante situaciones de estrés (contaminación ambiental, déficit nutricional,
restricción hormonal pero principalmente bajas y altas repentinas y bruscas en las
temperaturas).
Uno de los principales criterios que se utilizan para hablar de ovocitos
atrésicos es la pérdida de redondez y de afinidad a los colorantes, incluyendo otros
procesos y cambios a nivel de la membrana plasmática de los ovocitos y el vitelo de
éstos que son particularmente propensos a daño oxidativo debido a su alto contenido
de ácidos grasos, este proceso puede alterar la fluidez de la membrana y causar
87
ruptura y cambios morfológicos y citológicos que provocan el cambio de forma de los
ovocitos atrésicos de bivalvos marinos (Rodríguez-Jaramillo, 2014).
Se ha observado que en hembras de moluscos bivalvos las temperaturas
elevadas favorecen el procesos de reabsorción de la gónada así como altas
prevalencias de atresias y degeración ovocitaria (Maru, 1981; Paulet et al., 1988;
Beninger y Le Pennec, 1991; Arellano-Martínez et al., 2004; Chung et al., 2008;
Rodríguez-Jaramillo, 2014). La intensa atresia ovocitaria que se observó en M. capax
durante el invierno (con el descenso de la temperatura, Fig. 14 y 38) y su disminución
en la primavera de 2014 (ascenso de la temperatura, Fig. 38), en el presente trabajo
se infiere que el fenómeno de atresia y degeneración ovocitaria está más relacionada
con los descensos de temperatura que con otras variables como la disponibilidad de
alimento (concentración de Chl-a), ya que tal y como se aprecia en la Fig. 38, los
meses en los que se observaron las mayores frecuencias de ovocitos en proceso de
lisis y degeneración (Fig. 14) coincidieron con los súbitos descensos de temperatura
mas importantes y las mayores concentraciones de Chl-a en la Bahía de La Paz.
Este fenómeno de degeneración de los gametos femeninos puede estar relacionado
con una alta permanencia de ovocitos maduros en la luz folicular ante la falta de
condiciones ambientales favorables en el medio para estimular el desove. Este
fenómeno se ha relacionado a los ovocitos que presentan actividad lisosomal (Pipe y
Moore 1985), y los productos derivados de esta lisis podrían ser reabsorbidos por las
células auxiliares, hemocitos y células foliculares de los gonoductos del ovario, como
señalan diferentes autores (Pipe, 1987; Lubet et al. 1987; Dorange y Le Pennec,
1989; Le Pennec et al. 1991). En esta investigación se ha observado este fenómeno
tanto en el folículo como en los gonoductos de los ovarios (Fig. 9 y 15).
Aunque se ha comprobado en algunos bivalvos marinos que las condiciones
de estrés causadas por las fluctuaciones de temperatura y escases de alimento
pueden provocar importante fenómenos de lisis ovocitaria (atresias), degeneración,
regresión y reabsorción de los gametos femeninos en etapas vitelogénicas
avanzadas (Tang, 1941; Christiansen y Olivier, 1971; Ozanai, 1975; Sastry, 1978;
Bayne, 1978; Lubet et al., 1987; Gaulejac et al., 1995; Rodríguez-Jaramillo et al.,
2001; Rodríguez-Jaramillo, 2004; García-Corona et al., 2014; Rodríguez-Jaramillo,
88
2014), la causa de la atrofia parcial de los ovocitos de una gran cantidad de
organismos, y observada durante todo el ciclo reproductivo en M. capax (a excepción
de enero y febrero cuando las gónadas estaban indiferenciadas), no puede
dilucidarse de este estudio. Estos resultados demuestran que ante condiciones
ambientales adversas los ovocitos de M. capax son viables dentro de los folículos
ováricos por poco tiempo, entrando en degeneración celular en caso de que no sean
liberados. De esta forma, existiría un reaprovechamiento de los nutrientes existentes
en el vitelo de los ovocitos y consecuentemente una optimización del proceso
reproductivo cuando las condiciones de desove no son favorables (Beninger y Le
Pennec, 1991; Faveris y Lubet, 1991; Lubet et al., 1991). Esta reabsorción por parte
de las células del sistema inmune ocurriría tanto en los folículos como en los
conductos genitales (Lubet et al., 1995), mostrando que la presencia de ovocitos
atrésicos no necesariamente significaría la liberación de los mismos con el
consecuente desperdicio energético (Fig. 9 y 15).
Es de importante resaltar que la alta prevalencia de atresias y degeneración
de ovocitos maduros que se observó en los mejillones durante todo el ciclo
reproductivo, pero sobre todo entre el otoño y el principio del invierno (Fig. 14)
sugiere que la capacidad reproductiva y la viabilidad de los gametos de los mejillones
se puede ver afectada principalmente por condiciones ambientales adversas para
llevar a cabo desoves parciales o totales. Al igual que en esta investigación, otros
autores como Suárez et al. (2005) han descrito altas prevalencias de atresias
ovocitarias en mejillones de Galicia Mytilus galloprovincialis (en el noroeste de la
península Ibérica) durante los meses de invierno en los que se registran los mínimos
promedio en la TS°C del mar, como fue el caso del presente trabajo (Fig. 38).
Como se mencionó anteriormente, el fenómeno de atresias ovocitarias se
asocia normalmente a la falta de condiciones ambientales favorables para llevar a
cabo los desoves (Ortiz-Zaragoitia et al., 2010). Factores como un déficit nutricional
por la baja concentración de alimento disponible, bajas temperaturas y la
contaminación ambiental pueden incrementar el proceso de atresia y degeneración
de los ovocitos en algunas especies de mejillones como Mytilus galloprovincialis
(Ortiz-Zaragoitia et al., 2010). Es por lo anterior que las altas frecuencias de ovocitos
89
atrésicos (Fig. 14) en el presente trabajo se asocian más con las bajas temperaturas
en el otoño-invierno que con la disponibilidad de alimento (Chl-a), ya que, como se
puede observar en la Fig. 38, los meses en los que se reportan las mayores
cantidades de ovocitos atrésicos, si bien coinciden con las más bajas temperaturas
también coinciden con las máximas concentraciones de fitoplancton en la bahía.
Ortiz-Zaragoitia et al. (2010) llevaron a cabo experimentos en los que
sometieron a un stock de mejillones a una exposición prolongada de hidrocarburos
aromáticos policíclicos (PAH’s) y fenoles alcalinos, y, al igual que otros autores como
Aarab et al. (2004); Lowe (1988); Lowe y Pipe (1987); Ortiz-Zarragoitia y Cajaraville
(2006) demostraron que estos agentes químicos fungen como disruptores
hormonales que propician las altas prevalencias de atresias ovocitarias en algunas
especies de mejillón como Dreissena polymorpha (Binelli et al., 2001) en un lago
contaminado con Dicloro Difenil Tricloroetano (DDT), y en algunas especies de
almejas como Mizuhopecten yessoensis (Vaschenko et al., 1997) en una bahía
contaminada con tetracloruro de carbono (CCl4).
La población de mejillones estudiada se ubica cerca de las inmediaciones de
una planta de almacenamiento, refinación y distribución de combustibles
(hidrocarburos) de la empresa Petróleos Mexicanos S.A. de C.V. (PEMEX) y de una
central termoeléctrica de la Comisión Federal de Electricidad (CFE) en el Puerto de
Pichilingue dentro de la Bahía de La Paz. Ambas industrias están ubicadas en de la
Bahía de La Paz, a menos de 1km de distancia del sitio donde se colectaron las
muestras y se obtuvo el material biológico para llevar a cabo la presente
investigación (Fig. 2). A la vista de los resultados obtenidos, cabe la posibilidad de
que ahí se origine y descargue algún tipo de contaminante que pudiese propiciar
algún proceso de disrupción hormonal e inhibición estrogénica (Tran et al., 1996;
Navas y Segner, 2000; Gagne et al., 2002; Gauthier-Clerc et al., 2002; Ortiz-
Zarragoitia y Cajaraville, 2006; Tintos et al., 2007). Cabe también la posibilidad de
que lo anterior pudiese tener algun efecto negativo en el proceso de maduración de
los ovocitos durante la gametogénesis de M. capax en la Bahía de La Paz. De
acuerdo con los autores antes citados, han demostrado que la exposición
prolongada a hidrocarburos interrumpe la producción de algunas hormonas sexuales
90
esteroideas como los estrógenos en los ovarios (principalmente estrona y estradiol),
que cumplen una función primordial en la inducción a la proliferación de células
germinales. Así mismo, el exceso de estos contaminantes y la disrupción en la
producción de estas hormonas sexuales puede conducir a fenómenos de
sobremaduración de los ovocitos, con lo cual se inicia un proceso de degeneración
que puede alterar el metabolismo de los lípidos, principalmente en el tejido ovárico
(Cajaraville et al., 1991; Tran et al., 1996; Navas y Segner, 2000; Gagne et al. 2002;
Gauthier-Clerc et al. 2002; Ortiz-Zarragoitia y Cajaraville, 2006; Tintos et al. 2007) ya
que estos compuestos contaminantes son insolubles en agua pero altamente
lipofilicos.
Como evidencia de la influencia negativa a las poblaciones naturales de
moluscos bivalvos en la zona indutrial de la Bahía de La Paz, Robles-Mungaray
(comunicación personal) menciona que en el centro de producción acuícola
“Acuacultura Robles S.P.R. de R.I. de C.V.” (donde se produce y comercializa semilla
de diferentes especies de bivalvos marinos de importancia comercial a productores
de la región) se registran altas tasas de mortalidad en los cultivos (larvarios y de
semilla) de todas las especies con las que se trabaja cuando el abastecimiento de
agua del centro de producción coincide con las descargas de aguas tratadas a la
Bahía de La Paz tanto de la Central Termoeléctrica como de la planta de refinación
de hidrocarburos.Tales efectos en la población estudiada de M. capax, solo se
pueden considerar como una posibilidad y no como un hecho concluyente que
explique los fenómenos de degradación en ovocitos, que se encontraron durante el
presente estudio.
Durante el seguimiento del desarrollo gonádico de las hembras de M. capax
se observó que el proceso de emisión de gametos al medio (desove) es diferente al
reportado para otras especies de bivalvos. Por ejemplo, la almeja catarina (A.
ventricosus), la almeja mano de león (Nodipecten sp.) y el ostión japonés (C. gigas)
presentan glándulas unicelulares secretoras de mucinas ácidas que facilitan el
movimiento de los gametos a través de los conductos de desove en la gónada
durante su expulsión. Estas secreciones actúan también como una barrera de
defensa bioquímica ante el ingreso de posibles patógenos que puedan afectar la
91
calidad de los ovocitos desovados (Lora-Vilchis et al. 2003; Vázquez-Yeomans,
2006; Estrada et al., 2011; García-Corona et al. 2014a).
Con respecto a los parámetros de calidad ovocitaria del mejillón M. capax en
la Bahía de La Paz, es importante destacar que los conocimientos generados hasta
el momento para este y para otros mitílidos son muy escasos. La mayoría de los
estudios que abordan aspectos de la biología reproductiva de moluscos bivalvos se
basan solo en interpretaciones y evaluaciones histológicas meramente cualitativas,
dejando de lado análisis histológicos cuantitativos como los que se presentan en este
trabajo. En ese sentido, la presente investigación aporta información novedosa, ya
que la medición de variables morfométricas e histoquímicas de calidad ovocitaria,
como el área de los ovocitos y de sus núcleos, el diámetro teórico y diámetro
máximo, la relación núcleo/citoplasma de los ovocitos, el índice de forma o de
redondez de los gametos y sus núcleos, así como los índices de reservas
energéticas de los ovocitos (lípidos y carbohidratos), proporcionan mucha
información útil y valiosa para conocer y entender las estrategias y el esfuerzo
reproductivo que aplica M. capax en el área de estudio.
La cantidad de reservas en el citoplasma de los ovocitos es un factor muy
importante para asegurar una buena calidad ovocitaria y un adecuado desarrollo
larvario. Las larvas de la mayoría de los moluscos bivalvos son inicialmente
lecitotróficas y su desarrollo temprano depende de las reservas bioquímicas
acumuladas en el vitelo de los ovocitos, que son transferidas desde algunos tejidos
somáticos (Holland, 1978; Bayne y Newel, 1983; Marty et al., 1992; Rodríguez-
Jaramillo, 2004).
La tecnología de análisis digital de imágenes ha convertido a la histología en
una herramienta cuantitativa útil (Heffernan y Walker, 1989; Racotta et al., 2003;
Ceballos-Vázquez et al., 2003; Rodríguez-Jaramillo et al. 2008; García-Corona et al.
2014a; Rodríguez-Jaramillo, 2014; García-Corona et al. 2014b). Con esta
herramienta se pueden estimar algunas variables morfométricas como el área del
ovocito y su diámetro teórico (Saout et al., 1999), la relación núcleo/citoplasma (N/C)
y el índice de redondez (IR), así como indicadores de calidad energética de los
gametos como el índice lipídico (IL) y el de carbohidratos (ICH). Los dos últimos han
92
sido empleados como indicadores de calidad de ovocitos en Atrina maura
(Rodríguez-Jaramillo, 2004) en ostión de placer Crassostrea corteziensis
(Rodríguez-Jaramillo et al., 2008) el ostión C. gigas (Rodríguez-Jaramillo, 2014). La
relación N/C se fundamenta en que el núcleo alcanza su tamaño final al inicio de la
gametogénesis en la fase de ovogonia (Raven, 1966; Rodríguez-Jaramillo et al.
2001), y por lo tanto, puede tomarse como referencia para el crecimiento de otras
partes de la célula como el citoplasma, el cual continúa su crecimiento hasta la fase
posvitelogénica.
Los resultados de la presente investigación muestran que tanto el AO, como el
DT, DM, la relación N/C e IR son buenos indicadores de calidad ovocitaria en el
mejillón M. capax durante su ciclo reproductivo. Tal y como se puede observar en las
figuras 16 y 18, tanto el AO como el DT se comportaron de manera muy similar a los
estadios de desarrollo de las gónadas femeninas, lo cual corresponde directamente
al desarrollo ovocitario normal de los mejillones (Fig. 14) que se reporta en este
trabajo.
Sin embargo, la relación N/C se comportó de manera más variada e inestable.
En la mayoría de los estadios de desarrollo gonádico propuestos en el estudio el
valor de dicha relación se mantuvo por debajo de 0.68±0.01, que es muy bajo si se le
compara con lo reportado para otras especies de moluscos bivalvos por Rodríguez-
Jaramillo, et al. (2001) y Rodríguez-Jaramillo (2004) para el hacha china A. maura, o
por Rodríguez-Jaramillo et al. (2008) para el ostión de placer C. corteziensis.
Mediante el análisis con microscopia de luz de las preparaciones histológicas de las
gónadas femeninas, se pudo observar, que el área y DT de los núcleos de los
ovocitos guarda una relación desproporcional con respecto al área, DT y relación N/C
de los ovocitos (Fig. 16, 18 y 20). Igualmente, se registraron altas frecuencias de
ovocitos atrésicos en los folículos ováricos de la mayoría de las hembras en estadios
de desarrollo gonádico avanzado (Fig. 9 y 14). Esto podría explicar la fluctuante
relación N/C (Fig. 20) y el bajo promedio general en el IR (Fig. 22) de los ovocitos
durante todo el ciclo reproductivo, estimado en 0.73±0.003. El hecho de que el IR
promedio de los núcleos (0.84±0.002) haya sido más alto que el de los ovocitos
(0.73±0.003) (Fig. 22), aunado a la baja relación N/C (0.68±0.01) (Fig. 20), sugiere
93
que M. capax dispone de una escasa cantidad de reservas energéticas en el
citoplasma de los gametos maduros, que podría a su vez relacionarse con la alta
cantidad de atresias observada en los estadios de maduración tardíos de la especie
objetivo durante su evento reproductivo en la Bahía de La Paz.
Los análisis de indicadores de calidad morfométrica discriminando por tipo de
ovocito (vitelogénicos, posvitelogénicos y atrésicos), fueron muy útiles porque
aportaron información valiosa a cerca del potencial y viabilidad ovocitaria de los
mejillones durante el ciclo reproductivo que se estudió en el presente trabajo. En la
Fig. 17 se puede apreciar que el área de los ovocitos no mostró diferencias
significativas entre categorías de desarrollo, reportándose un promedio de
419.22±9.95µm2, y sin embargo, las tallas de los ovocitos no mostraron diferencias
significativas entre categorías de desarrollo para el DT pero si para el DM, ya que
este parámetro fue signigficativamente menor en los ovocitos maduros
posvitelogénicos que en los ovocitos atrésicos (Fig. 19).
Es importante mencionar que en el presente trabajo se esperaba obtener
resultados similares a los que se obtuvieron en otros estudios de evaluación de la
calidad ovocitaria de otros moluscos bivalvos con base en el análisis morfométrico de
sus ovocitos, como es el caso de los estudios realizados por Rodríguez-Jaramillo et
al. (2008), Rodríguez-Jaramillo (2004) y Oyarzún et al. (2011) para C. corteziensis,
A. maura y Mytilus chilensis respectivamente. Estos autores reportan que tanto el
área como el diámetro (ya sea teórico o máximo) de los ovocitos es
significativamente mayor cuando se encuentran maduros y por lo tanto, en estadio
posvitelogénico.
Es probable que el significativamente mayor DM de los ovocitos atrésicos
respecto a los ovocitos vitelogénicos y posvitelogénicos se deba a la deformación en
la morfología celular de este tipo de ovocitos durante su degeneración, debido a la
lisis de la célula, la actividad enzimática, la degradación de orgánulos celulares,
despolarización y perdida de fluidez de la membrana citoplásmica y a la distención
del retículo endoplásmico, procesos normales asociados a la autofagocitosis del
material que constituye al ovocito (Beninger y Le Pennec, 1991; Faveris y Lubet,
1991; Lubet et al., 1991; Tran et al., 1996; Rodríguez-Jaramillo, 2014).
94
Entre todos los indicadores de calidad morfométricos evaluados durante el
presente estudio, discriminando por tipo de ovocito, la relación N/C (Fig. 21) y el IR
(Fig. 23) fueron los que mostraron patrones de variación más normales. Los valores
mínimos para ambos indicadores se reportan para los ovocitos vitelogénicos y
aumentan en los ovocitos maduros (posvitelogénicos), mientras que los valores
promedio para ambas variables disminuyen significativamente cuando los ovocitos se
degeneran y entran en procesos de atresias, lo cual, según Beninger y Le Pennec
(1991); Cajaraville et al. (1991); Ortíz-Zarragoitia y Cajaraville (2010) puede deberse
principalmente a la perdida de la configuración poliédrica de las células (en el caso
de la diminución en el IR), y, a los cambios drásticos que sufren los ovocitos en su
composición citoplasmica y nuclear, para el caso de la disminución en la relación N/C
(Beninger y Le Pennec, 1991; Gagne et al., 2002).
Son pocos los estudios que se han realizado acerca de la biología
reproductiva de moluscos bivalvos desde el punto de vista de la dinámica de
sustratos energéticos aplicando métodos histoquímicos y métodos de análisis digital
de imágenes estandarizados. La mayoría de los trabajos abordan dichos análisis
aplicando estereología y análisis bioquímico como técnicas básicas. Los análisis
bioquímicos son importantes, pero generalmente impiden disponer de la precisión
cualitativa y cuantitativa simultánea en la que se basa la metodología aplicada en
este estudio, para M. capax. Las herramientas bioquímicas empleadas comúnmente
para llevar a cabo el estudio de la bioenergética durante la reproducción de moluscos
bivalvos proporcionan información fina sobre la utilización de reservas energéticas,
sin embargo, los métodos histoquímicos cuantitativos empleados en la presente
investigación reflejan con suficiente detalle la dinámica precisa de los fenómenos
metabólicos y los cambios fisiológicos que engloban los procesos de acopio,
transferencia y utilización de reservas energéticas en los tejidos somáticos y
reproductivos durante el desarrollo gonádico, el desove y el reposo post-desove de
los organismos. Por tal razón, en este trabajo se optó por emplear técnicas
histoquímicas cualitativas y cuantitativas, que permitieron estimar con suficiente nivel
de confianza la dinámica anual de la estrategia y esfuerzo reproductivo de M. capax,
obteniendo indicadores poco analizados hasta ahora en estudios de biología
95
reproductiva de bivalvos marinos, que son complementarios a las técnicas
bioquímicas tradicionales. A partir estas técnicas, se tuvo la posibilidad de disponer
de información suficiente para comprender de manera general los cambios
fisiológicos estacionales de la especie estudiada, que en su conjunto constituyen la
dinámica energética y la estrategia y esfuerzo reproductivo de M. Capax en la zona
de estudio.
La dinámica anual en los principales sustratos energéticos (lípidos y
carbohidratos) que se emplean metabólicamente durante la reproducción han sido
estudiados en mayor grado en almejas de la familia pectinidae (Sastry y Blake, 1971;
Ansell, 1974; Comely, 1974; Taylor y Venn, 1979; Barber y Blake, 1981, 1983, 1991;
Robinson et al., 1981; Epp et al., 1988; Couturier y Newkirk, 1991; Besnard, 1991;
Martínez, 1991; Martínez y Mettifogo, 1998; Pazos et al., 1997; Racotta et al., 1998;
Lodeiros et al., 2001; Racotta et al., 2003; Arellano-Martínez et al., 2004; Palacios et
al., 2004; Palacios et al., 2005; Palacios et al., 2007; Arjona et al., 2008; Kraffe et al.,
2010), ostras perleras (Desai et al., 1979; Saucedo et al., 2002; Vite-García, 2005;
Vite-García y Saucedo, 2007), ostiones (Kang et al., 2000; Rodríguez-Jaramillo et al.,
2008; Hurtado et al., 2009a; Hurtado et al., 2009b; Rodríguez-Jaramillo, 2014), callo
de hacha (Rodríguez-Jaramillo, 2004), y en menor grado en ciertas especies de
mejillones (Gabbott, 1975, 1976, 1983; Bayne, 1976; Zandee et al., 1980; Bayne et
al., 1982; Wendell, 2013). En la mayoría de estos estudios, como en el caso del
presente, se ha demostrado que las variaciones en el contenido energético de los
tejidos asociados a la reproducción permiten inferir la condición fisiológica del
organismo durante el evento reproductivo, y deducir a partir de los resultados,
algunas rutas metabólicas que conllevan los procesos de almacenamiento y
movilización de energía que además de asegurar el crecimiento de tejidos somáticos,
también aseguran la reproducción de los organismos.
En el presente trabajo se logró estimar como las variaciones en el tipo y
volumen de los tejidos somáticos de almacenamiento energético se relaciona con la
estrategia y esfuerzo reproductivo de los organismos (estudiado aquí a nivel de tejido
gonadal y somático) para regular la reproducción. Respecto a lo anterior, algunos
autores como Zandee et al. (1980); Gabbott (1983); Bayne et al. (1982); Wendell
96
(2013) mencionan que la mayor parte de la energía canalizada para llevar a cabo el
desarrollo y maduración gonádica en bivalvos de la familia mytilidae proviene de
reservas almacenadas en el tejido conjuntivo de la gónada (~30%), que en el
presente estudio, con la aplicación de técnicas histoquímicas se caracterizó como
tejido conjuntivo vesicular (Fig. 29). Este tejido almacena altas cantidades de
carbohidratos neutros de reserva (Fig. 30 y 34) y escasas cantidades de lípidos
neutros o triglicéridos (Fig. 25 y 34); es muy abundante entre los folículos ováricos
durante los estadios intermedios de maduración gonádica (E I, II y III) y durante
periodos de baja actividad reproductiva (noviembre, enero, febrero y principios de
marzo; Fig. 6) tanto de hembras (Fig. 7) como de machos (Fig. 8). El tejido conjuntivo
vesicular disminuye considerablemente durante los periodos de intensa actividad
reproductiva (abril a noviembre; Fig. 7 y 8) y durante los últimos estadios de
desarrollo gonadal (E IV y V de desove parcial y posdesove) como se puede apreciar
en la figura 6.
Estos resultados demuestran que el principal tejido de reserva durante el
desarrollo gonádico y proceso de maduración ovocitaria no es adipogranular como lo
afirma Ochoa-Báez (1987) para el mejillón M. capax en la Bahía de La Paz y Lobo-
da-Cunha y Serrao-Santos (2005) para Bathymodiolus azoricus, una especie de
mejillón que habita en ventilas hidrotermales del Océano Pacífico. Ambos autores
mencionan que la principal fuente de energía para la gametogénesis de estas y otras
especies de mejillón como Mitylus edulis, se encuentra almacenada en las células
adipogranulares del tejido conjuntivo que rodea a los folículos ováricos. Sin embargo,
los resultados obtenidos en el presente estudio, mediante técnicas histoquímicas
específicas para la tinción de lípidos (SN; Fig. 24 y 25) y carbohidratos de reserva
(AAPAS; Fig. 20 y 30), confirman que es el tejido conjuntivo vesicular de la gónada,
rico en carbohidratos neutros, el principal reservorio energético que sustenta el
desarrollo de la gónada y la gametogénesis durante el ciclo reproductivo de M. capax
en la Bahía de La Paz.
Al hacer una comparación entre la fracción de cobertura correspondiente al
contenido energético en forma de lípidos (Fig. 25) y carbohidratos (Fig. 30) en el
tejido conjuntivo de la gónada (discriminando por mes y por estadios de desarrollo
97
ovárico), se logró determinar que la participación de los carbohidratos para fines de
la estrategia aplicada por M. capax durante la reproducción, son mucho más
importantes que la de los lípidos en forma de triglicéridos (Fig. 34 y 36). Lo anterior
sugiere que el tejido conjuntivo vesicular de la gónada participa de manera activa
como un componente fundamental en la estrategia reproductiva de esta especie. En
apoyo a esta hipótesis, se observa un aumento en la cantidad de carbohidratos
almacenados en este tejido al inicio de la gametogénesis, así como una marcada
disminución al finalizar el desove (Fig. 34), lo cual sugiere una movilización de
nutrientes almacenados en dicho tejido hacia la gónada para contribuir al desarrollo
gonádico en su conjunto y a la maduración de los gametos.
Los triglicéridos son lípidos de reserva energética en los moluscos, que se
transfieren de los progenitores a la progenie (Holland, 1978) y han sido reportados
por varios autores como el principal sustrato de suministro de energía durante sus
primeros estadios de desarrollo (Galler y Mann, 1986; Frasser, 1995; Rodríguez-
Jaramillo, 2005; Rodríguez-Jaramillo et al. 2008). Racotta et al. (2003) afirman que
los triglicéridos son los lípidos más importantes para el almacenamiento de energía y
Besnard (1991) demostró que los lípidos en forma de triglicéridos presentes en los
ovocitos, aseguran la conversión energética indispensable para el adecuado
desarrollo de los embriones. La importancia de estimar el IL como indicador de
calidad ovocitaria es relevante porque al evaluar la cantidad individual de triglicéridos
por ovocito se puede estimar la viabilidad del embrión y de los primeros estadios
larvarios.
Existe poca información detallada sobre el proceso de acumulación de lípidos
en los ovocitos de invertebrados. En los insectos se lleva a cabo la síntesis de ácidos
grasos, principalmente triglicéridos, a partir de carbohidratos (Lubzens et al., 1981;
Ferenz, 1985). Sin embargo, la capacidad de los ovocitos para sintetizar ácidos
grasos es muy limitada. En otros organismos como Manduca sexta (Kawooya et al.,
1988) y Aedes aegypti (Ziegler, 1997), la cantidad de ácidos grasos sintetizados por
el ovocito en sí corresponden como máximo a 1% del lípido que se encuentra en el
huevo maduro. Esto significa que casi todos los lípidos deben ser importados y
pueden proceder directamente de la dieta o de los depósitos de almacenamiento en
98
la grasa corporal. El cuerpo almacena grasas incluidas en la dieta pero algunos
lípidos se sintetizan a partir de carbohidratos (Ziegler y Roth, 1985; Ziegler y Ibrahim,
2001). En el mosquito A. aegypti al menos el 80% de los lípidos que se encuentran
en los ovocitos se originan a partir de lípidos provenientes de grasa corporal, que son
sintetizados a partir de azúcares presentes en los tejidos de reserva (Ziegler y
Ibrahim, 2001).
Con base en lo anterior, es de suma importancia resaltar algunos resultados y
fenómenos que se observaron en la dinámica del tipo y cantidad de reservas
energéticas en forma de triglicéridos y carbohidratos de reserva tanto anual, como
durante el proceso de maduración ovárica de los mejillones objeto del presente
estudio. Como se mencionó anteriormente, y como se puede observar en las figuras
34 y 36, si bien la cantidad promedio de carbohidratos (17.12±1.96%) supera la de
los lípidos de reserva (11.12±1.73%), estacionalmente y por estadios de desarrollo
gonádico de las hembras, al realizar el análisis del tipo y la cantidad de dichas
sustancias de reserva discriminando solo por tipo de ovocito (Fig. 28 y 33), se pudo
observar que durante el proceso de maduración de los ovocitos las cantidades
promedio de lípidos (29.93±2.1 %; Fig. 26 y 27) son mayores que las de los
carbohidratos (24.79±0.71%; Fig. 31 y 32), mismo hecho que puede observarse
claramente al comparar los valores de ambos tipos de reservas en las figuras 35 y
37. Lo anterior podría explicarse con base en una ruta metabólica de lipogénesis en
la que los organismos por medio de reacciones bioquímicas en el citoplasma de las
células del tejido conjuntivo vesicular como fibroblastos y fibrocitos, llevan a cabo la
síntesis de ácidos grasos y esterificados de cadena larga que posteriormente son
unidos a moléculas de glicerol para formar triglicéridos o grasas de reserva (Lubzens
et al., 1981; Ferenz, 1985). Estas reacciones suceden específicamente en el retículo
endoplásmico de fibroblastos y fibrocitos, en donde el alargamiento de la cadena de
ácidos grasos se lleva a cabo por medio de los sistemas enzimáticos acetil-CoA
carboxilasa y la vía de la ácido-graso-sintetasa (Lubzens et al., 1981; Ferenz, 1985) y
los triglicéridos son posteriormente transportados (por endocitosis) a los ovocitos que
se encuentran madurando en los folículos ováricos (Ziegler, 1997) durante los
estadios de madurez ovárica intermedia (EI y EII) y de maduración máxima (EIII). En
99
estos estadios de madurez se observaron los mayores valores en el IL para M. capax
(Fig. 25). Las rutas metabólicas como la lipogénesis que se lleva a cabo durante la
vitelogénesis en invertebrados, han sido ampliamente estudiadas y descritas por
Ziegler y Van Antwerpen (2010). Estos autores mencionan que cuando los ovocitos
maduran en los folículos ováricos de los invertebrados, se llevan a cabo procesos de
endocitosis por medio de los cuales la célula introduce moléculas grandes de
triglicéridos y ácidos grasos englobándolas en una invaginación de la membrana
citoplasmática dando lugar a una vesícula denominada “fagosoma” o “endosoma”,
que posteriormente es digerida por los lisosomas (complejo “fagolisosoma” o
“fagoendosoma”) que son los orgánulos encargados de realizar la digestión celular y
dejar disponibles los triglicéridos para su utilización en el ovoplasma de los ovocitos
(Fig. 39).
Figura 39. Estructuras subcelulares que participan en la captación y almacenamiento de nutrientes por los ovocitos de invertebrados. Los nutrientes lipídicos y del vitelo atraviesan la membrana basal del folículo ovárico y llegan a la superficie de los ovocitos a través del espacio extracelular que separa las células epiteliales foliculares (flechas). Al llegar a la superficie del ovocito, los nutrientes son tomados por endocitosis mediada por el receptor específico (lípidos o proteínas). Después de pasar por las vesículas de endocitosis (endosomas), las proteínas se acumulan en los compartimentos de almacenamiento de proteínas esféricas, llamadas cuerpos de yema (parte del vitelo). Mientras que los triglicéridos y ácidos grasos son almacenados en gotitas lipídicas. Anteriormente no se había identificado ningún otro tipo de estructuras especializadas para la transferencia de lípidos extracelulares a las gotitas de almacenamiento de lípidos en los ovocitos (Tomado de: Ziegler y Van Antwerpen, 2010).
100
Los resultados obtenidos en esta investigación explican más a fondo la
estrategia reproductiva de M. capax en la Bahía de La Paz, no habían sido
reportados para esta especie (Ochoa-Báez, 1987; Bückle-Ramírez y Garza-Aguirre,
1989), pero si para otras especies de moluscos con mayor valor e interés comercial
como ostreidos (Rodríguez-Jaramillo et al., 2008), pínnidos(Rodríguez-Jaramillo,
2004) y pectínidos (Racotta et al., 1998; Lodeiros et al., 2001; Racotta et al., 2003;
Arellano-Martínez et al., 2004; Palacios et al., 2004; Palacios et al., 2005; Palacios et
al., 2007; Arjona et al., 2008; Kraffe et al., 2010).
Es bien sabido que desarrollo gonádico y la gametogénesis representan
periodos de alta demanda de energía, misma que según Bayne (1976), Epp et al.
(1988), Barber y Blake (1991), Lobo-da-Cunha y Serrao-Santos (2006) y Ziegler y
Van Antwerpen (2010), puede provenir de una fuente exógena como el alimento
consumido, o de una fuente endógena asociada a reservas energéticas previamente
almacenadas en tejidos somáticos como el conjuntivo vesicular de la gónada
identificado en el presente estudio (Fig. 29). La utilización de la energía contenida en
el alimento ingerido supone la adopción por parte del organismo de una estrategia
oportunista, mientras que el empleo de energía almacenada en tejidos somáticos
indica que la estrategia es de tipo conservadora (Bayne, 1976). En el caso de M.
capax, se asume que la especie sigue una estrategia reproductiva conservadora, ya
que la movilización de energía (principalmente carbohidratos) del tejido conjuntivo
vesicular a la gónada es muy activa durante los periodos de intensa reproducción
(Fig. 7 y 8).
En su conjunto, los resultados del seguimiento del desarrollo gonádico y de la
evaluación de los parámetros de calidad ovocitaria (morfométricos e histoquímicos)
sugieren que M. capax tiene una reducida plasticidad para seleccionar la estrategia
que mejor convenga a su éxito reproductivo, ya que el esfuerzo en la movilización y
utilización de las reservas contenidas en dichos tejidos es intenso (Fig. 6), sobre todo
en las hembras (Fig. 7). Tendencias similares han sido observadas también para
otras especies de zonas templadas o subtropicales, como Pecten maximus en el
Noroeste de España (Pazos et al. 1997), A. ventricosus en Bahía de La Paz, México
(Luna-González et al., 2000; García-Corona et al. 2014), P. sterna en Bahía de La
101
Paz, México (Cáceres-Puig, 2007; Vite-García y Saucedo, 2007) A. maura
(Rodríguez-Jaramillo, 2004), C. gigas en Korea del norte (Kang et al., 2000) y C.
corteziensis Golfo de California (Rodríguez-Jaramillo et al. 2008).
Tal y como se infiere en el presente estudio, y en medida de lo propuesto por
autores como MacDonald y Thompson, (1985); MacDonald et al. (1987) y Chávez-
Villalba et al. (2002), la selección de la estrategia reproductiva que adoptan los
bivalvos marinos, incluido M. capax, tiene su origen en las variaciones en la
abundancia del alimento disponible y/o en los cambios de temperatura del agua, pero
sobre todo, la cantidad de alimento disponible, ya que como se aprecia en la figura
38, los meses en los que se registraron las mayores concentraciones de Chl-a en la
Bahía de La Paz coinciden con los valores máximos en el ACS (Fig. 7 y 8) y con la
mayor cantidad de carbohidratos neutros confinados en el tejido somático de la
gónada (Fig. 30a) lo cual confirma el patrón de estrategia conservadora que sigue
esta especie durante su reproducción. Sin embargo, no se puede dejar de lado el
hecho de que la temperatura sea un factor exógeno que actúa fuertemente como
control en la regulación de la dinámica energética entre los diferentes tejidos
relacionados con la reproducción.
El esfuerzo reproductivo en los moluscos bivalvos se define como la cantidad
de energía de los tejidos somáticos que se destina a la reproducción (gónada), bajo
determinadas condiciones (Lucas, 1992; Thompson y MacDonald, 1991; Gangnery,
1997; Cáceres-Puig, 2007). Los moluscos bivalvos tienen la capacidad de
almacenar reservas en sus tejidos durante periodos de elevado suministro de
alimento, las cuales son canalizadas en los momentos de escases alimenticia y/o de
alta demanda de energía, ya sea durante la reproducción o bajo condiciones de
estrés fisiológico (Cáceres-Puig, 2007).
Como se puede apreciar en la fgura 6, la mayor transferencia de reservas de
los tejidos somáticos a la gónada de M. capax se da al final del invierno y durante
toda la primavera (febrero a abril) y los mínimos en el ACS, es decir, la máxima
transferencia de reservas energéticas del tejido somático al gonádico se da entre los
meses de mayor actividad reproductiva que son mayo y julio, justo cuando el ACG
alcanza sus máximos en el ciclo anual. Este es el periodo de mayor esfuerzo
102
reproductivo que realiza la población de mejillón durante el ciclo reproductivo anual
que se estudia en el presente trabajo. Después del máximo en el ACG y el mínimo
en el ACS se puede observar una recuperación acelerada en el ACS lo cual se
puede interpretar como un lapso de recuperación de las reservas energéticas
durante la reproducción (Fig. 6). Esto coincide con el descenso de la temperatura y
los máximos en la disponibilidad de alimento (mayores concentraciones de Chl-a),
como se puede apreciar en la figura 38 Sin embargo, es importante hacer notar que
las hembras de M. capax realizan un mayor esfuerzo reproductivo durante el ciclo
anual, ya que, como se puede observar en la figura 7a, se presentan dos picos
principales de transferencia de reservas desde el tejido somático al tejido de la
gónada, uno principal entre mayo y julio y otro secundario y de menor intensidad en
el otoño entre octubre y noviembre. En cambio, los machos solo presentan un pico
máximo de transferencia de reservas a la gónada en el mes de mayo y en menor
medida en el mes de julio, donde el resto del tiempo representa periodos de
recuperación de reservas en el tejido somático (Fig. 8a). Tanto en hembras, como en
machos, los periodos de recuperación de las reservas en los tejidos somáticos
coincidieron con los descensos en la TS °C y con los máximos en la concentración
de Chl-a (Fig. 38).
Por último, tal y como se esperaba, y como se ha observado en otras especies
como Pteria sterna (Cáceres-Puig, 2008) y Atrina maura (Barrios-Ruíz, D. 2005), la
cantidad de reservas energéticas del mejillón M. capax (tanto en hembras como en
machos) varió de acuerdo a las diferentes etapas de madures y desarrollo ovárico,
observándose la mayor movilización de componentes lipídicos y de carbohidratos a
la gónada en los estadios de máxima madurez gonádica (EIII y IV), mientras que el
reposo y recuperación de las reservas en los compartimentos somáticos se observó
durante los estadios de indiferenciación sexual (E0) y baja actividad gametogénica
(EI) (Fig. 7b y 8b).
Con base en lo anterior, es claro que una aproximación para estimar la
cantidad de reservas energéticas trasladadas desde los tejidos somáticos a la
gónada durante la reproducción puede ser expresada en el presente estudio en
términos del esfuerzo reproductivo de la especie, y que coincide con la definición de
103
(Calow y Woolhead, 1997; Ziolko y Kozlowski, 1983; Ziegler y Ibrahim, 2001) como la
porción de recursos disponibles (alimento ingerido y reservas) que están
proporcionando energía para la reproducción.
Estudiar la dinámica de sustratos energéticos disponibles en tejidos asociados
a la reproducción, así como las variables de calidad morfometrías e histoquímicas de
los ovocitos estacionalmente y durante los periodos de reposo, activación y
reproducción durante el ciclo reproductivo de especies poco estudiadas como el
mejillón M. capax puede ser útiles para estudiar el efecto de las condiciones
ambientales sobre el estado reproductivo de los bancos naturales de esta y otras
especies de moluscos bivalvos susceptibles a explotación comercial, así como para
definir las condiciones apropiadas (temperatura y requerimientos nutricionales de la
especie, principalmente) para realizar experimentos de acondicionamiento y
maduración de reproductores en condiciones controladas de laboratorio, lo cual, se
espera se vea reflejado en desoves más exitosos y de mayor calidad, menor
mortalidad de organismos, mayor probabilidad de éxito en la supervivencia larvaria y
producción de semilla de calidad.
El patrón del ciclo, estrategia y esfuerzo reproductivo de Modiolus capax en la
Bahía de La Paz descrito en el presente trabajo parece ajustarse al de la mayoría de
las especies de origen meridional las cuales, al expandirse hacia el norte, tienden a
reproducirse principalmente en los meses de verano (Margalef, 1972; Bückle-
Ramírez y Garza-Aguirre, 1989).
Los estudios enfocados a la biología reproductiva de Modiolus capax proveen
de información valiosa y útil para efectuar predicciones actualizadas sobre el stock
de reclutamiento, ciclos de maduración gonádica y calidad de los desoves de esta
especie en la Bahía de La Paz, B.C.S., información necesaria para la obtención de
semilla, aprovechamiento del recurso a partir de sus bancos naturales y el desarrollo
de su cultivo en sistemas acuícolas a niveles experimentales y comerciales.
Un requerimiento básico para aplicar normas de conservación, explotación y/o
manejo y el desarrollo del cultivo acuícola de especies marinas comerciales como el
mejillón M. capax es el conocimiento detallado del proceso de maduración gonádica,
ciclo reproductivo y calidad ovocitaria, el cual puede describirse con base en un
104
análisis histológico (cualitativo y cuantitativo) detallado como el que se realizó en
esta investigación.
105
9. CONCLUSIONES
La proporción de sexos en la población del mejillón Modiolus capax estudiada en
el presente trabajo se vio dominada por los machos durante todo el ciclo
reproductivo y no se registró hermafroditismo o bisexualidad funcional o no
funcional en los organismos.
Las frecuencias más altas de individuos sexualmente maduros (hembras y
machos) y en estadios de reproducción activa se observaron entre los meses de
abril y agosto, mientras que la mayor proporción de organismos en reposo
gonádico e indiferenciados sexualmente, se registtró entre enero y febrero.
La estimación de frecuencias de categorías de madurez ovocitarias reveló que
entre los meses de abril a julio se presentan las mayores proporciones de
ovocitos maduros posvitelogénicos con potenciales de ser liberados al medio
durante los desoves, y también permitió observar la prevalencia de atresias y
degeneración ovocitaria durante prácticamente todo el ciclo reproductivo.
El análisis digital de imágenes permitió realizar un estudio detallado de la calidad
de los ovocitos durante el ciclo reproductivo anual discriminando por meses,
estadios de desarrollo ovárico y tipo de ovocito, identificando variaciones
estacionales y por estadio de desarrollo gonádico en los indicadores de calidad
morfométrica (área total, área del núcleo, diámetro teórico y diámetro máximo,
relación núcleo citoplasma, e índice de redondez de los ovocitos y sus núcleos),
e indicadores de calidad histoquímicos como los índices lipídico y de
carbohidratos.
El cálculo de los indicadores de calidad morfométricos e histoquímicos mostró
que los desoves de mayo, julio y agosto son los de mejor calidadya que los
ovocitos tienen una mayor cantidad de lípidos. Sin embargo los análisis por tipo
de ovocito demostraron que los ovocitos maduros (posvitelogénicos) y liberados
al medio durante los desoves son los que tienen la más baja calidad por su pobre
contenido de triglicéridos y carbohidratos de reserva.
La población de M. capax presentó una estrategia reproductiva conservadora por
la abundante cantidad de tejido conjuntivo vesicular (rico en carbohidratos
106
neutros) y por el incremento en el ACS durante los periodos en los que se
reportó la mayor cantidad de alimento disponible (Chl-a) en la Bahía de La Paz.
Con la aplicación de técnicas histoquímicas específicas para la tinción de
triglicéridos (SN) y carbohidratos de reserva (AAPAS) se pudo inferir que M.
capax probablemente utiliza una ruta metabólica de lipogénesis (síntesis de
triglicéridos a partir de los carbohidratos del tejido conjuntivo vesicular de la
gónada), para incluir una mayor cantidad de lípidos a los ovocitos durante el
proceso de maduración ovocitaria.
Con base en el conocimiento del contenido y distribución de sustratos
energéticos de los principales compartimentos somáticos (ACS) y germinales
(ACG), se logró identificar el periodo comprendido entre mayo y julio como el de
mayor esfuerzo reproductivo en la población de M. capax.
El análisis de área de cobertura gonádica (ACG) y somática (ACS) permitió
demostrar que las hembras realizan un mayor esfuerzo reproductivo que los
machos durante el ciclo reproductivo anual, ya que presentan dos picos máximos
en el ACG y transferencia de reservas desde los tejidos somáticos, uno principal
entre abril y agosto y uno secundario de menor intensidad entre octubre y
noviembre. Mientras que los machos solo presentan un periodo anual de máximo
esfuerzo reproductivo y de menor duración entre mayo y julio.
El estudio de las variaciones temporales en la temperatura superficial y
concentración de Chl-a, permitieron demostrar que la mayor actividad
reproductiva de los mejillones se da entre el final de la primavera y el inicio del
verano con el incremento de la temperatura y un “bloom” fitoplanctonico, y que
los periodos de reposo e indiferenciación sexual de los organismos coincide con
el descenso de la temperatura y la mayor disponibilidad de alimento entre el
otoño y el invierno.
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ANEXOS
Anexo I. Formulación de solución fijadora Davidson para cortes en parafina. Reactivo Cantidad (ml)
Glicerina 400 Formaldehído (37-40%) 800
Alcohol etílico (96%) 1200 Agua de mar filtrada 1200
-Tiempo óptimo de fijación 36-48 horas a temperatura ambiente, dependiendo del tamaño del
tejido, secciones mayores de 1 cm3 deberán dejarse mínimo 48 horas. -El volumen de solución fijadora debe triplicar el volumen de tejido a fijar.
Anexo II. Tinción con Hematoxilina-Eosina (H&E).
1.- Xilol 100% (3 cambios) (10 minutos c/u) 2.- Xilol:Alcohol etílico 100% (1:1) (5 minutos) 3.- Alcohol etílico 95% (5 minutos) 4.- Alcohol etílico 70% (2 cambios) (5 min c/u) 5.- Agua destilada (5 minutos) 6.- Hematoxilina de Harris (4 minutos) 7.- Agua corriente (5 minutos)
10.- Agua destilada (5 minutos) 11.- Agua amoniacal (10-15 segundos) 12.- Agua destilada (5 minutos) 13.- Alcohol etílico 50% (2 minutos) 14.- Alcohol etílico 70% (2 minutos) 15.- Eosina-Floxina alcohólica (3 minutos) 16.- Alcohol etílico 96% (2 cambios) (2 min c/u)
8.- Agua destilada (5 minutos) 17.- Alcohol 100% (3 cambios) (1 minutos c/u) 9.- Alcohol ácido (10- 15 segundos) 18.- Citrisolv (3 cambios) (5 minutos c/u) Resultados esperados
Núcleo Azul-morado Citoplasma Naranja-rosa Nucléolo Morado-azul Tejido conjuntivo Rosa
Anexo III. Tinción Azul Alciano PAS (AAPAS) para mucopolisacáridos neutros y ácidos.
1.- Xilol 100% (3 cambios) (10 minutos c/u) 2.- Xilol:Alcohol etílico 100% (1:1) (5 minutos) 3.- Alcohol etílico 95% (5 minutos) 4.- Alcohol etílico 70% (2 cambios) (5 min c/u) 5.- Agua destilada (5 minutos) 6.- Reactivo Azul Alcián (20 minutos)
11.- Reactivo de Schiff (30 minutos) 12.- Solución sulfurosa (3 cambios) (2 min c/u) 13.- Agua corriente (5 minutos) 14.- Hematoxilina férrica de Weigert (5 minutos) 15.- Agua destilada (2 minutos) 16.- Ácido pícrico (1 minuto)
7.- Agua destilada (2 minutos) 17.- Alcohol 96% (2 cambios) (5 minutos c/u) 8.- Ácido periódico al 0.5% (10 minutos) 18.- Alcohol 100% (2 cambios) (5 minutos c/u) 9.- Agua corriente (5 minutos) 19.- Citrosolv 100% (5 minutos) 10.- Agua destilada (2 minutos) Resultados esperados
Mucopolisacáridos ácidos Azul Sustancias cartilaginosas Púrpura Mucopolisacáridos neutros Magenta Mucina epitelial Azul oscuro
128
Anexo IV. Tinción Sudán Negro (SN) para lípidos.
1.- Xilol 100% (3 cambios) (10 minutos c/u) 7.- Solución Sudán Negro (15-30 minutos) 2.- Xilol:Alcohol etílico 100% (1:1) (5 minutos) 8.- Diferenciar en Alcohol etílico 70% (5 min) 3.- Alcohol etílico 95% (5 minutos) 9.- Carmalum o Hematoxilina de Harris 4.- Alcohol etílico 70% (2 cambios) (5 min c/u) 10.- Agua corriente (5 minutos) 5.- Agua destilada (5 minutos) 11.- Agua destilada (5 minutos) 6.- Alcohol etílico 70% Resultados esperados
Esteres de colesterol Azul-Negro Fosfolípidos Gris Triglicéridos Azul-Negro Mielina Bronce