TESIS de Maestría en “Tecnología de los Alimentos” "ESTUDIO DE ...

TESIS de Maestría en

“Tecnología de los Alimentos”

"ESTUDIO DE LA VIDA ÚTIL DE QUESO CREMA UTILIZANDO MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA"

Tesista: Miryam Siciliano

Director: Sandra Guerrero

Codirector: Stella Alzamora

Ciudad Autónoma de Buenos Aires, 2010

A mi marido, Guillermo, por alentarme siempre en mi superación como

profesional.

A mis hijas,Bárbara y Cecilia, a quienes dediqué principalmente mi vida.

A mi nietito, Juani , rey de mi corazón.

A mi madre y a la memoria de mi padre.

INDICE

1-INTRODUCCIÓN, 2 1.1 Origen del queso, 2 1.2 Producción y consumo nacional e internacional del queso, 3 1.3 Proceso de elaboración del queso, 5 1.3.1 Preparación de la leche, 6 1.3.2 Cuajado, 7 1.3.3 Corte de la cuajada, 7 1.3.4 Moldeado, 8 1.3.5 Prensado, 8 1.3.6 Salado, 9 1.3.7 Madurado, 9 1.3.8 Acabado, 10 1.4 Producción de queso untable sin conservante (sorbato de potasio)

efectuada por Danone para el presente estudio, 10

1.5 Variedades de quesos, 13 1.6 Clasificación de quesos, 14 1.7 El queso y la salud, 16 1.8 El queso como alimento nutritivo,16 1.8.1 Aporte de macronutrientes, 17 1.8.2 Aporte de micronutrientes, 18 1.9 El queso como alimento seguro, 19 1.10 Tecnologías combinadas de preservación, 22 1.10.1 Efecto de la reducción de la aw, 23

1.10.2 Efecto de la reducción de pH, 24 1.10.3 Efecto del sorbato de potasio, 26 1.10.4 Utilización de antimicrobianos naturales, 26 1.10.4.1 Timol, 27 1.11 Calidad, vida útil y seguridad, 28 1.12 Microbiología predictiva, 29 1.12.1 Generalidades, 29 2-OBJETIVOS, 36 2.1 Objetivo general, 36 2.2 Objetivos específicos, 36 3- MATERIALES Y MÉTODOS, 39 3.1 Matriz utilizada, 39 3.1.1 Elaboración del queso untable base, 39 3.1.2 Medición del pH, 40 3.1.3 Medición de la actividad de agua (aw),40 3.2 Reactivos utilizados, 41 3.2.1 Medios líquidos de enriquecimiento selectivo y no selectivo, 41 3.2.2 Medios sólidos de aislamiento diferencial y selectivo, 42 3.2.3 Otros reactivos utilizados, 43 3.3 Microorganismos utilizados, 43

3.3.1 Caracterización de los microorganismos utilizados en este estudio, 45

3.4 Metodología, 46 3.4.1 Preparación de los inóculos, 46

3.4.2 Preparación de la solución de timol.Evaluación sensorial,46 3.4.3 Inoculación del queso untable base, 46 3.4.4 Recuento de los microorganismos, 47 3.5 Estudios realizados, 47 3.5.1 Estudio del efecto de la temperatura de almacenamiento, 47

3.5.2 Estudio del efecto de la ausencia de sorbato de potasio (queso untable base), 48 3.5.3 estudio sobre el efecto del pH, 48 3.5.4 Estudio de reto microbiano, 50 3.5.5 Utilización de timol, 50

3.6 Obtención de las curvas de crecimiento o supervivencia.Modelado matemático, 51 3.6.1 Modelado primario, 51 3.6.1.1 Modelo para caracterizar curva de crecimiento, 51 3.6.1.2 Modelo para caracterizar curva de supervivencia, 53 3.6.2 Modelado terciario, 54 3.7 Análisis estadístico, 56

4- RESULTADOS, 58

4.1 Estudio de la microbiología predictiva en queso untable base. Efecto

de la temperatura de almacenamiento, 58

4.2 Estudio en queso untable base, 64 4.3 Efecto combinado del pH y la temperatura de almacenamiento, 68

4.4 Estudio de reto microbiano en queso untable base utilizando cepas

responsables de ETAS, 86

4.4.1 S.aureus, 86

4.4.2 E.coli, 96

4.4.3 S.Enteritidis, 105

4.4.4 L.monocytogenes, 113

4.5 Uso de antimicrobianos naturales:timol, 121 5-CONCLUSIONES, 132 6-APÉNDICE, 136 6.1 Definiciones y fórmulas, 137 6.1.1 Población estadística, 137 6.1.2 Distribución normal, 137 6.1.3 Parámetros y estimadores, 138 6.1.4 Significancia estadística, 140 6.2 Análisis de la varianza (ANOVA), 141 6.2.1 Test F de significación de la regresión, 143 6.2.2 Coeficiente de determinación R2, 144 6.2.3 Análisis de residuales, 145 6.2.3.1 Versus valores predichos,Y1, 145

7- BIBLIOGRAFÍA, 147

RESUMEN

En microbiología predictiva los modelos matemáticos son utilizados para

predecir el comportamiento de los microorganismos bajo diferentes condiciones.

Antes de ser utilizados en una situación práctica, estos modelos matemáticos

deben ser validados con el propósito de demostrar que las bacterias se comportan

de igual modo tanto en los alimentos reales como en los sistemas modelo que se

utilizaron para generar dichos modelos. En este trabajo se estudió el crecimiento

o la inactivación de diferentes microorganismos pátogenos de relevancia en

queso untable (S.aureus; E. coli; S. Enteritidis y L. monocytogenes) bajo

diferentes condiciones microambientales (pH; temperatura; presencia de sorbato

de potasio; presencia de timol). Dichas respuestas fueron caracterizadas por los

modelos primarios de Gompertz y Gompertz modificado para muerte obteniendo

los parámetros característicos. También se utilizó para la predicción el programa

terciario de modelado de patógenos PMP. Los modelos fueron validados

estadísticamente y también por los estudios de reto microbiano en queso untable.

El modelo de Gompertz, utilizado para describir el crecimiento microbiano no

presentó limitaciones estadísticas. No ocurrió lo mismo con el modelo de

Gompertz modificado para muerte, el cuál sobreestimó la caída global al final del

almacenamiento en muchas situaciones. El programa de simulación modelado de

patógenos mostró debilidades al momento de predecir la conducta microbiana en

el queso untable debido seguramente a las limitaciones biológicas imperantes en

el queso. Este estudio resaltó la necesidad de validar los modelos matemáticos en

un alimento real.

RECONOCIMIENTOS

• A la Dra. Sandra Guerrero por el tiempo que me ha dedicado y por su excelente

dirección y dedicación .

• A la Dra. Stella Alzamora por su valiosa co-dirección.

• Al Director Municipal de Salud Ambiental de la Secretaría de Salud Pública de la

Municipalidad de Lomas de Zamora quien comprendió , incentivó y avaló

siempre y desde un principio toda la capacitación que enriquece

profesionalmente a las personas, Ingeniero Arturo Villafañe.

• A los Ingenieros Jorge Orlandini y Jorge Millosi de la empresa Danone-La

Serenísima por proveerme gentilmente el queso expresamente preparado para

esta Tesis y toda la información necesaria.

• A los técnicos y auxiliares del Laboratorio de Control de Alimentos de la

Municipalidad de Lomas de Zamora ,Sra. Hilda Alvarez, Srita.María Victoria

Alves Fernandes y Sra.Nelly Santillán, por asistirme con la preparación de

medios y material en todo momento que fuera necesario.

• A mis compañeros de trabajo por amenizar largas horas de trabajo.

LISTADO DE FIGURAS Y TABLAS

INTRODUCCIÓN Y MATERIALES Y MÉTODOS

Cuadro 1. Principales variables del mercado internacional (año 2002) (PAG.3)

Figura 1. Consumo mundial de quesos per cápita (PAG.4)

Figura 2.Producción nacional de quesos (PAG.4) Figura 3. Consumo nacional per cápita de diferentes quesos (PAG.5) Figura 4: Diagrama de flujo de la elaboración de Queso (PAG.6)

Figura 5: Preparación de la leche (PAG.7)

Figura 6: Proceso de cuajado (PAG.7) Figura 7: Corte de la cuajada (PAG.8) Figura 8: Moldeado (PAG.8) Figura 9: Prensado (PAG.9) Figura 10: Salado (PAG.9) Figura 11: Madurado (PAG.10) Figura 12: Acabado (PAG.10) Figura 13. Pirámide nutricional (PAG.17) Figura 14. Parámetros matemáticos de la ecuación de Gompertz (PAG.52)

Figura 15. Parámetros de la ecuación de Gompertz modificada para

muerte (PAG.53)

Figura 16: Ejemplo de curva de crecimiento bacteriano (PAG.55)

Figura 17: Ejemplo de curva de supervivencia bacteriana (PAG.55)

RESULTADOS Figura 1: Efecto de la temperatura de almacenamiento : 5°C (-■- ) y

15°C ( -■- ) en el desarrollo de S.aureus inoculado en caldo BHI (a) y en

queso untable (b); (I) desvío estándar. (PAG.59)

Figura 2: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de

inactivación de S.aureus en queso untable almacenado a 5ºC, (�) valores

experimentales; (—) predicción (PAG.61)

Tabla 1: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos

parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de

S.aureus en queso untable almacenado a 5 ºC. (PAG.61)

Figura 3 : Validación interna del modelo propuesto para la inactivación

de S.aureus en queso untable almacenado a 5ºC: a) Valores observados

vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (�) valores

experimentales; (—) predicción. (PAG.62)

Figura 4 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de

inactivación de S.aureus en queso untable almacenado a 15ºC, (�)

valores experimentales; (—) predicción. (PAG.63)

Tabla 2 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos


S.aureus en queso untable almacenado a 15 ºC. (PAG.64)

Figura 5: Validación interna del modelo propuesto para la inactivación

de S.aureus en queso untable almacenado a 15 ºC: a) Valores observados


experimentales; (—) predicción. (PAG.64)

Figura 6: Comportamiento de S.aureus a 15ºC en queso untable sin

(base, -▲-) y con agregado de 1000 ppm de sorbato de potasio (-■-); (I)

desvío estándar. (PAG.65)


inactivación de S.aureus en queso untable base almacenado a 15ºC, (�)

valores experimentales; (—) predicción . (PAG.66)



S.aureus en queso untable base almacenado a 15 ºC. (PAG.66)


de S.aureus en queso untable base almacenado a 15 ºC: a) Valores

observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos .

(�) valores experimentales; (—) predicción. (PAG.67)

Figura 9 : Comportamiento de S. aureus en el queso untable base

almacenado a 10ºC (-♦- ), 15ºC ( -■- ) y 22ºC ( -▲-). (a) pH 5,0; (b) pH

4,3; (I): desvío estándar. (PAG.69)

Figura 10 : Comportamiento de S.aureus en el queso untable base a pH

5,0 y diferentes temperaturas de almacenamiento. (a): 10º C, (b): 15ºC y

(c): 22ºC . ( ▬ ) predicción , ( --- ) limite de confianza superior predicho,

( --- ) limite de confianza inferior predicho, (-♦- ) datos experimentales;

(I) desvío estándar. (PAG.71)


inactivación de S.aureus en queso untable base (pH 5.0) almacenado a

10ºC, (�) valores experimentales; (—) predicción . (PAG.73)





de S.aureus en queso untable base almacenado a 10 ºC: a) Valores




crecimiento de S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a

22ºC, (�) valores experimentales; (—) predicción (PAG.75)

Figura 14 : Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento

de S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 22 ºC: a)

Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores

predichos . (�) valores experimentales; (—) predicción (PAG.76)

Tabla 5: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos

experimentales y sus respectivos parámetros característicos,

correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable base

(pH 5.0) almacenado a 22 ºC (PAG.76)

Figura 15: Comportamiento de S.aureus a pH 4,3 y 10º C(a), 15ºC (b) y

22ºC (c): (▬) predicción , ( --- ) límite de confianza superior predicho, (

--- ) límite de confianza inferior predicho ,(-♦- ) datos experimentales.

(PAG.78)







(pH 4,3) almacenado a 10 ºC (PAG.80)

Figura 17: Validación interna: Análisis estadístico del modelo propuesto

para el crecimiento de S.aureus en queso untable base (pH 4,3)

almacenado a 10 ºC: a) Valores observados vs valores predichos; b)

Residuales vs. valores predichos . (�) valores experimentales; (—)

predicción (PAG.80)








Figura 19: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento



predichos . (�) valores experimentales; (—) predicción.(PAG.82)


inactivación de S.aureus en queso untable base ( pH 4.3) almacenado a







de S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22 ºC: Valores

observados vs valores predichos (PAG.84)


de S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22

ºC:Residuales vs. valores predichos . (�) valores experimentales; (—)


Figura 23: Evaluación del comportamiento de S.aureus en queso untable

base, pH 5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6ºC (-♦- ),

17ºC ( -■- ) y 25ºC ( -▲-); (I) desvío estándar. (PAG.87)

Figura 24: Comportamiento predicho de S.aureus a pH 5,0 y 6º C (a),

17ºC (b) y 25ºC (c) : ( ▬ ) predicción, ( --- ) límite de confianza superior

predicho, ( --- ) límite de confianza inferior predicho, (-♦-) datos

experimentales. (PAG.88)



valores experimentales; (—) predicción (PAG.89)



S.aureus en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 6 ºC (PAG.90)

Figura 26: Validación del modelo propuesto para la inactivación de

S.aureus en queso untable base almacenado a 6 ºC: a) Valores observados









Figura 28 : Validación del modelo propuesto para la inactivación de

S.aureus en queso untable base almacenado a 17 ºC: a) Valores




crecimiento de S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a




S.aureus en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 25 ºC (PAG.94)




predichos. (�) valores experimentales; (—) predicción (PAG.95)

Figura 31: Evaluación del comportamiento de E.coli en queso untable

base, pH 5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6ºC (-♦-

),17ºC ( -■- ) y 25ºC (-▲- ); (I):desvío estándar. (PAG.97)

Figura 32: Comportamiento predicho de E.coli a pH 5,0 y 6º C (a),

17ºC (b) y 25ºC (c): ( ▬ ) predicción , ( --- ) límite de confianza superior

predicho, ( --- ) límite de confianza inferior predicho, (-♦- ) datos

experimentales (PAG.98)


inactivación de E.coli en queso untable base almacenado a 6ºC, (�)

valores experimentales; (—) predicción (PAG.99)


parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de E.coli

en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 6 ºC (PAG.99)

Figura 34: Validación interna del modelo propuesto para la

supervivencia de E.coli en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 6

ºC: a) Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores

predichos . (�) valores experimentales; (—) predicción. (PAG.100)


inactivación de E.coli en queso untable base almacenado a 17ºC, (�)




en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 17 ºC. (PAG.101)

Figura 36: Validación interna del modelo propuesto para el

comportamiento de E.coli en queso untable base (pH 5,0) almacenado a

17 ºC: a) Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs.

valores predichos . (�) valores experimentales; (—) predicción

(PAG.101)


crecimiento de E.coli en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25ºC,

(�) valores experimentales; (—) predicción (PAG.102)



en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 25 ºC (PAG.103)


de E.coli en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 ºC: a) Valores



Figura 39: Evaluación del comportamiento de S.Enteritidis en queso

untable base, pH 5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6ºC (-

♦- ),17ºC ( -■- ) y 25ºC ( -▲- ); (I):desvío estándar. (PAG.105)

Figura 40 : Comportamiento predicho de S.Enteritidis a pH 5,0 y 6º C

(a), 17ºC (b) , 25ºC (c) : ( ▬ ) predicción, ( --- ) límite de confianza

superior predicho, ( --- ) límite de confianza inferior predicho, (-♦- )

datos experimentales. (PAG.106)


inactivación de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado

a 6ºC, (�) valores experimentales; (—) predicción (PAG.107)



S.Enteritidis en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 6 ºC

(PAG.108)

Figura 42: Validación interna del modelo propuesto para S.Enteritidis en

queso untable base (pH 5,0) almacenado a 6 ºC: a) Valores observados vs

valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (�) valores



inactivación de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado

a 17ºC, (�) valores experimentales; (—) predicción (PAG.109)




(PAG.109)


de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 17 ºC: a)




crecimiento de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a





(PAG.112)


para el crecimiento de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0)

almacenado a 25 ºC: a) Valores observados vs valores predichos; b)

Residuales vs. valores predichos . (�) valores experimentales; (—)


Figura 47: Evaluación del comportamiento de L.monocytogenes en

queso untable base, pH 5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento:

6ºC (-♦- ),17ºC ( -■- ) y 25ºC ( -▲- ); (I): desvío estandar (PAG.113)

Figura 48: Comportamiento predicho de L.monocytogenes a pH 5,0 y 6º

C (a), 17ºC (b) y 25ºC (c) : ( ▬ ) predicción, ( --- ) límite de confianza

superior predicho, ( --- ) límite de confianza inferior predicho, (-♦- )

datos experimentales. (PAG.114)


inactivación de L.monocytogenes en queso untable base (pH 5,0)

almacenado a 6ºC (a),17°C (b) y 25°C (c) (�) valores experimentales;

(—) predicción (PAG.116)



L.monocytogenes en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 6 ºC

(PAG.117)




(PAG.117)




(PAG.118)


para el crecimiento de L.monocytogenes en queso untable base (pH 5,0).

a) Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores


Figura 51: Comportamiento de S.aureus en queso untable base con (-♦-)

y sin agregado de (-♦-) timol (0,3% p/p), pH 5,0, almacenado a tres

temperaturas: (a) 6ºC, (b) 17ºC, (c) 25ºC ; (I):desvío estándar.

(PAG.122)

Figura 52: Comportamiento de S.Enteritidis en queso untable base con

(-♦-) y sin agregado de (-♦-) timol (0,3% p/p), pH 5,0 almacenado a

17ºC; (I): desvío estandar. (PAG.123)


inactivación de S.aureus en queso untable base con timol (pH 5,0)

almacenado a 6ºC (a); 17°C (b); y de S. Enteritidis en igual matriz

almacenada a 17°C (c) (�) valores experimentales; (—) predicción

(PAG.126)



S.aureus en queso untable base (pH 5.0) con timol almacenado a 6 ºC

(PAG.127)



S.aureus en queso untable base (pH 5.0) con timol almacenado a 17 ºC.

(PAG.127)



S.Enteritidis en queso untable base (pH 5.0) con timol almacenado a 17

ºC. (PAG.128)


de S.aureus en queso untable base (pH 5,0) con timol almacenado a 6ºC ;

17°C; y de S. Enteritidis en igual matriz almacenada a 17°C: a) Valores




crecimiento de S.aureus en queso untable base con timol almacenado a




S.aureus en queso untable base con timol (pH 5.0) almacenado a 25 ºC

(PAG.130)


de S.aureus en queso untable base con timol (pH 5,0) almacenado a 25

ºC: a) Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores

predichos. (�) valores experimentales; (—) predicción (PAG.131)

1

1. INTRODUCCIÓN

2

1.1 Origen del queso

Según el Código Alimentario Argentino (C.A.A.), queso es el producto fresco

ó madurado que se obtiene por separación del suero de leche ó leche reconstituída

(entera, parcial ó totalmente descremada), ó de sueros lácteos , coagulados por la

acción física, del cuajo, de enzimas específicas, de bacterias específicas, de ácidos

orgánicos, solos ó combinados, todos de calidad apta para uso alimentario; con ó sin

el agregado de sustancias alimenticias y/o especias y/o condimentos, aditivos

específicamente indicados, sustancias aromatizantes y materiales colorantes (Art

605, C.A.A.)

La elaboración de quesos es una actividad que comenzó aproximadamente

8000 años atrás y en la actualidad existen cerca de 1000 variedades diferentes de

queso cada uno de los cuales resulta ser único con respecto a sus características

organolépticas.

La elaboración del queso seguramente fue descubierta por diversas

comunidades al mismo tiempo. En el antiguo Egipto se cuidaban vacas y se les

ordeñaban para tener la leche por lo que se piensa que también esas comunidades

elaborarían quesos. La leche se conservaba en recipientes de piel, cerámica porosa o

madera, pero como era difícil mantenerlos limpios, la leche fermentaba con rapidez.

El siguiente paso fue el de extraer el suero de la cuajada para elaborar algún tipo de

queso fresco, sin cuajo, de sabor fuerte y ácido. Cuenta la leyenda que un pastor

árabe volvía a su morada con la leche de las ovejas dentro de una bolsa hecha con la

tripa de uno de sus corderos y que después de caminar a pleno sol, al abrir la bolsa la

leche estaba cuajada, sólida y hecha queso. Los romanos lo incluían en su dieta

condimentándolo con tomillo, pimienta, piñones y otros frutos secos, cuando sus

soldados se asentaban en un campamento, elaboraban queso. Con el auge del

comercio y el aumento de la población urbana, el queso se convirtió en producto

importante para la economía, empezó a comercializarse con queso, fuera de las zonas

de producción y más allá de las fronteras y cuando se colonizó el Nuevo Mundo, se

llevaron sus tradiciones queseras.

Al principio se utilizaba leche cruda, pero en la década de 1850 el

microbiólogo Louis Pasteur estableció el proceso de pasteurización como una

herramienta fundamental en la preservación de alimentos, hecho que cambió

3

radicalmente el proceso de elaboración de este producto. Empezó a mezclarse leche

de distinta procedencia y distintos rebaños para obtener un producto homogéneo y de

ese modo disminuyó considerablemente el riesgo de aparición de organismos que

pudieran contaminar el producto.

1.2. Producción y consumo nacional e internacional de quesos

El queso tiene una producción anual superior a otros productos del mundo

muy importantes tales como café, té, cacao y tabaco. Estados Unidos es el mayor

productor mundial y casi la totalidad de esa producción está dirigida al mercado

local, siendo casi nula su exportación. Alemania es el mayor exportador en cuanto a

cantidad y Francia el mayor exportador en cuanto a valor monetario. Así mismo,

siguen a Estados Unidos en cuanto a producción. Dentro de los países productores

en cuarta posición encontramos a Italia y en décimo lugar a la Argentina. Los países

importadores de quesos por excelencia son: Alemania, Reino Unido e Italia. El

mayor consumo per cápita lo registra Grecia, seguido de Francia y en tercera

posición, Italia. Luego siguen Suiza, Alemania, Países Bajos, Austria, Suecia,

etc.(SAGyP, MINAGRI,2010)

En el cuadro 1 se presenta un resumen de los volúmenes producidos,

consumidos y los stocks finales de los principales productos comercializados en el

mercado mundial.

Cuadro 1. Principales variables del mercado internacional (año 2002)

Productos Producción

Consumo

(tonelada)

Stocks

Leche en Polvo descremada 3.473 3.127 970 Leche en Polvo entera 3.116 2.438 186 Quesos 12.470 12.091 716 Manteca 6.211 5.854 310

Fuente: United States Department of Agriculture ( 2009) USDA

4

La Argentina se encuentra dentro de los países cuyas costumbres dietarias

incluyen el consumo de este producto alimenticio tal como se evidencia en la Figura

1.

Figura 1. Consumo mundial de quesos per cápita

Fuente: SAGPyA, (2000).

Según la Food and Agriculture Organization FAO, en 2004, Argentina fue el

9º país productor mundial de quesos (con una participación del 2,4%) con una

estadística que se describe en el gráfico de la Figura 2.

Figura 2.Producción nacional de quesos

Fuente: Dir. de Industria Alimentaria y Agroindustrias ..sobre la base de datos del Convenio SAGPyA-CIL-FIEL (2009)

5

La producción nacional de quesos según el tipo de pasta se puede observar en

la Figura 3. Si se observan los datos estadísticos de elaboración de quesos de pasta

blanda, se denota un aumento progresivo en los últimos años (2004-2008). Luego de

alcanzar el récord histórico de casi 455.000 toneladas en 1999, la producción

argentina acusó una merma del 27% hasta 2003. En 2004 se produjo un interesante

repunte del 20%, hasta ubicarse en las 398.000 toneladas. Mientras que los quesos

blandos crecieron el 13% en 2004, los quesos semiduros y duros exhibieron ritmos

superiores al promedio general del grupo, con alzas del 28 y 31%, respectivamente.

El crecimiento de la elaboración de quesos verificado en 2004 fue impulsado

principalmente por la demanda interna –alrededor del 80% de la producción

adicional respecto de 2003 fue absorbido por el consumo doméstico- y en menor

medida por las exportaciones, que se llevaron el 20% restante (SAGyP, MINAGRI,

2010).

Figura 3. Consumo nacional per cápita de diferentes quesos

Fuente: Dir. de Industria Alimentaria y Agroindustrias sobre la base de datos del Convenio SAGPyA-CIL-FIEL (2009).

1.3. Proceso de elaboración de queso Son numerosas las recetas queseras tradicionales con las que se cuenta

actualmente y que dan lugar a la gran variedad de quesos artesanales. Pero

independientemente del tipo de leche y del lugar de procedencia, hay un proceso

general (Figura 4) que a continuación se describe (ICMSF, 1980):

6

Figura 4: Diagrama de flujo de la elaboración de Queso

Leche ↓

Filtrado ↓

Pasteurización ↓

Enfriamiento ↓

Inoculación con fermentos lácticos ↓

Adición de CaCl2 y cuajo ↓

Cuajado ↓

Corte de la cuajada ↓

Moldeado ↓

Prensado ↓

Salado ↓

Maduración, previo oreado, volteado y limpieza de los quesos ↓

Acabado

1.3.1 Preparación de la leche

Una vez que la leche llega a la quesería, procedente del establecimiento

lácteo, es sometida a una serie de análisis químicos y microbiológicos (Figura 5)

para asegurar la calidad inicial de la misma. En esta etapa, la leche es filtrada y/o

higienizada para eliminar cualquier tipo de impurezas que hayan podido pasar a la

leche durante el ordeño. Posteriormente se almacena en los tanques de refrigeración

donde permanece a una temperatura de 4ºC. En el caso de las queserías que elaboran

quesos con leche pasteurizada, la leche es sometida a temperaturas superiores de

70ºC durante unos segundos.

7

Figura 5: Preparación de la leche

1.3.2 Cuajado

Una vez la leche en la cuba de cuajado (Figura 6), se añaden los fermentos

lácticos, bacterias que contribuirán a la posterior maduración del queso. Es en esta

fase donde se le adiciona el cuajo, que dependiendo del tipo de queso podrá ser

vegetal, animal o microbiano, formándose “la cuajada”. Físicamente, consiste en la

precipitación de las micelas de caseína formando un gel que retiene además los

glóbulos de grasa, agua y sales.

Figura 6: Proceso de cuajado

1.3.3 Corte de la cuajada

Una vez transcurrido el tiempo de coagulación, el cuál será distinto

dependiendo del tipo de queso, se procede al corte de la cuajada (Figura 7). Esta

fase consiste en la división de la cuajada mediante las liras en granos más pequeños

para favorecer el desuerado. El tamaño del grano viene determinado por el queso a

8

elaborar. Luego se trabaja el grano mediante agitación y elevación de la temperatura

favoreciendo todavía más la expulsión del suero.

Figura 7: Corte de la cuajada

1.3.4. Moldeado

El moldeado consiste en el llenado de los moldes con los granos de cuajada

(Figura 8).

Figura 8: Moldeado

1.3.5. Prensado

Una vez llenados los moldes se pasa a la etapa de prensado, la cual en la

actualidad se realiza con unas prensas neumáticas en la mayoría de las queserías.

Debido a la presión, que variará dependiendo del tipo de queso que estemos

elaborando, se facilita la unión entre los granos de la cuajada y el desuerado (Figura

9).

9

Figura 9: Prensado

1.3.6. Salado

Una vez finalizado el tiempo de prensado, se procede al salado del queso a

mano ó bien, sumergiéndolo en salmuera (Figura 10). Con la fase de salado, se

consigue realzar el sabor del queso; preservar del crecimiento de microorganismos

indeseables, favorecer la pérdida de suero y la formación de la corteza.

Figura 10: Salado

1.3.7. Madurado

A esta fase pasan los quesos tiernos, semicurados y curados. Son mantenidos

en cámaras donde se controla la temperatura y la humedad. Durante esta fase los

quesos son volteados frecuentemente para evitar que se deformen y la corteza se

forme de forma uniforme. La maduración comprende una serie de cambios en las

10

propiedades físicas y químicas adquiriendo el queso su aspecto, textura y

consistencia así como aromas y sabores característicos (Figura 11).

Figura 11: Madurado

1.3.8. Acabado

La fase de acabado se refiere a las distintas presentaciones en las que podemos

encontrar algunos de los quesos, por ejemplo, quesos al pimentón, al romero,

etc.(Figura 12)

Figura 12: Acabado

VBCV

1.4. Producción de queso sin conservante (base) efectuada por Danone para el

presente estudio.

El proceso de elaboración del queso untable base utilizado en el presente

estudio y realizado por la empresa Danone posee varios pasos alguno de los cuales

son específicos para esta variedad.

Como primer paso se realizó la pasteurización con el fin de destruir flora

indeseada.

Posteriormente al tratamiento térmico se dió comienzo a un proceso

bioquímico pero de decisiva importancia: se adicionaron el cuajo, los cultivos

11

iniciadores o fermentos lácticos (fermentación) y cloruro de calcio (por tratarse de

leche pasteurizada) (Johnson,1997).

La función principal de este paso es la de producir ácido, principalmente

ácido láctico, destinado a: a) favorecer la formación de la cuajada por enzimas

coagulantes, como el cuajo; b) favorecer el drenaje del suero de los granos de

cuajada; c) impedir o inhibir el crecimiento de los microorganismos patógenos y de

los causantes de alteraciones, y d) gobernar las actividades de las enzimas que

inducen los cambios organolépticos deseados. Los cultivos lácticos iniciadores

producen ácido láctico a partir de la lactosa propia de la leche rindiendo

componentes del sabor y aroma como diacetilo. Estos cultivos solo son adecuados

para aquellos quesos en los que la temperatura de esta etapa no supera los 40ºC

durante algunos minutos. El cuajo ,con la colaboración del ácido formado, precipita

la caseína (proteína principal de la leche) y forma un gel.

La termización se realizó a 65ºC durante 6 minutos a un pH < 4,6

y tiene tres aspectos tecnológicos:

• Aumentar la tasa de recuperación de proteínas solubles, por

insolubilización de algunas lacto albúminas en medio ácido y mejorar el

rendimiento del proceso.

• Ajustar la temperatura óptima de separación de la masa magra del suero.

• Disminuir la carga microbiológica del fermento presente en la cuajada la

cual pasa aproximadamente de 1 x 107 UFC/mL (unidades formadoras de

colonias por mililitro) a valores del orden de 1 x 103 / 1 x 104 UFC/mL.

Esta disminución es necesaria para reducir la pos-acidificación del

producto.

Cuando la masa misma (luego de la adición del resto de los ingredientes como el

cloruro de sodio cuyo objetivo es potenciar el sabor y ayudar a controlar el

crecimiento de microorganismos alterantes) adquirió la firmeza adecuada se

sometió al proceso de homogenización y envasado. Esta operación puede ir

acompañada por la aplicación de una determinada presión (acondicionamiento). El

enfriamiento se realizó a una temperatura de aproximadamente 40ºC. Finalmente se

almacenó en cámara fría (0-5ºC).

12

Proceso de elaboración del queso untable base utilizado en el presente trabajo.

Recepción, descarga y pasteurización de la

leche cruda

Pasteurización

Fermentación

Incorporación de cloruro de calcio,cuajo y

fermento

Fermentación

Termización

Homogeneización

Envasado

Acondicionamiento

Enfriamiento

Almacenamiento en cámara fría

Inyección de crema

Inyección de ingredientes

Homogeneización

13

1.5 Variedades de quesos

Aunque es casi imposible realizar una lista única de quesos, sólo en Francia

hay más de 400 variedades de quesos, y en España encontramos, por ejemplo, queso

Burgos, Cabrales, Cebreiro, Mató, Quesaillas, Roncal (por sólo nombras algunos) y

el queso manchego, típico de la región de La Mancha . En Argentina, existen

numerosas variedades de queso (http://www.todoagro.com.ar). Una clasificación

muy general comprende:

Quesos blandos: son los que tienen abundante materia grasa y humedad. La textura

de ellos es muy cremosa, Eso hace que se los pueda extender con facilidad. Son

elásticos al tacto y tienen un aroma similar al de las nueces. Los quesos que

pertenecen a esta variedad son: el Camembert, el Cuartirolo y el Fontina. En esta

categoría entran los semiblandos como el Port Salut y el Mozzarella. Las

características de estos quesos los hacen ideales para ser usados en pizzas, budines,

terrinas, arroces, polentas y fondues.

Quesos duros y semiduros: son muy grasos pero con muy poca humedad. Son de

sabores suaves ó fuertes y texturas flexibles ó desmenuzadas. Algunos quesos de este

tipo tienen agujeros producidos por bacterias lácticas durante la maduración. En esta

categoría están: el Emmenthal, el Parmesano, el Reggianito, el Sardo, el Provolone y

el Pecorino. En esta categoría también se incluyen los quesos semiduros, como el

Cheddar, el Fontina y el Pategrás. Los quesos duros son apropiados para rallar,

preparar salsas y gratinar carnes, y los semiduros para fondue.

Quesos azules: son aquellos a los que se les introduce un cultivo fúngico (p.e.

Penicillium roquefortii) para generar las características vetas azules. Son intensos.

No deben oler a amoníaco ni tener sabor terroso ni muy salado. En esta variedad se

encuentran : el Azul y el Cabrales.

Quesos frescos: Estos quesos comprenden un proceso de elaboración sin la etapa de

maduración. Carecen de corteza. Su consistencia puede ser desde cremosa y

homogénea hasta otra mucho más densa. El queso fresco tiene que ser húmedo,

blando y sin moho. En esta variedad encontramos: el queso Crema, el Mascarpone, la

14

Ricota y el Fundido. Estos quesos son muy aptos para ser incorporados en ensaladas

y para elaborar salsas livianas y frías para acompañar carnes.

1.6. Clasificación de quesos Los criterios para la clasificación de quesos son múltiples, ya que pueden basarse en

cuestiones documentales, jurídicas o tecnológicas. Sin embargo, los criterios de

clasificación más utilizados son los siguientes:

:

- Contenido en materia grasa expresado en porcentaje de grasa / masa sobre el

extracto seco total ( % G/ES). De acuerdo a este criterio puede ser: Extra graso;

Graso; Semi graso; Bajo contenido de grasa y Magro.

- Consistencia de la pasta teniendo en cuenta el porcentaje del queso sin

considerar su grasa, ó lo que es igual, la humedad del queso desgrasado (

%HSMG o HQD, contenido de humedad sin extracto seco). De acuerdo a este

criterio puede ser: Extraduro; Duro; Semiduro; Semiblando y Blando.

- Período de maduración atendiendo a su maduración ó ausencia de ella. Pueden

ser frescos o madurados. Queso fresco es el que está dispuesto para el consumo al

finalizar el proceso de fabricación. Queso madurado es el que, tras el proceso de

elaboración, requiere mantenerse durante cierto tiempo a una temperatura y en

condiciones tales que se produzcan los cambios físicos y químicos característicos

del mismo.

- Tipo de leche utilizada. Aparte de su clasificación por el origen de la leche del

animal, también se clasifica por los diferentes tratamientos que tiene la leche

antes de empezar el proceso de elaboración del queso. Pueden utilizar leche

cruda (leche que no ha sido calentada a una temperatura superior a 40º C

térmicamente, ni sometida a un tratamiento de efecto equivalente); pasteurizada

(se obtiene al calentar la leche a una temperatura entre 71,3°C - 73°C durante 15

segundos o 61°C - 63º C durante 30 minutos, seguido de un enfriamiento

inmediato); termizada (leche que ha tenido un tratamiento térmico consistente en

elevar la leche a una temperatura entre 57°C - 62°C durante 15 a 20 segundos,

15

seguido de un enfriamiento inmediato ó microfiltrada (leche que ha sufrido una

micro-filtración. Este proceso consiste inicialmente en separar la nata de la leche,

posteriormente se filtra la leche desnatada a través de unas membranas muy

delgadas que retienen las bacterias y finalmente a esta leche filtrada se le

incorpora la nata en proporciones adecuadas).

- Tipo de Elaboración atendiendo al método de elaboración de los mismos. Pueden

ser Quesos "Fermier" ó de Granja (son elaborados con métodos tradicionales y en

la propia granja); Artesanales (elaborados siguiendo métodos tradicionales y en

general mediante estructuras pequeñas que suelen oscilar entre 1 y 5 personas);

Quesos "Latiere" (elaborados en forma semi-automatizada con leche de los

propios tambos de la cooperativa) y Quesos Industriales (producto industrial

obtenido a partir de leche adquirida a diferentes granjas, a veces muy distantes

unos de otras, con un proceso de fabricación automatizado que se realiza a gran

escala. De ahí su necesidad de estandarizar la materia prima, con el indispensable

uso de la pasteurización, termización o micro-filtración).

- Intensidad del sabor o gusto. Es una clasificación que se expresa en términos de

intensidad: Fresca ó Dulce (quesos de Burgos, cuajadas, petit suisse, y quesos de

cabra lácticos); Poco Pronunciada (quesos cuya maduración es corta; p.e.

Camembert, Brie, Coulommiers); Pronunciada (quesos donde su maduración

está en su punto y predominan sabores a leche cocida, cereales, frutos secos,

vegetales; p.e. Gruyère o los Beaufort y los de pasta azul blandos como el Cashel

Blue y de cabra de pasta prensada semicurados); Fuerte (quesos con toque

picante además de tener un punto de salado razonable; p.e. quesos de pasta

blanda y de corteza lavada- Livarot, Maroilles , Epoisses , Munster; quesos

azules - Fourme d'Ambert ó Montbrison); Muy Fuerte (quesos algo más picantes

y salados que la intensidad fuerte; p.e. azules y de doble fermentación).

16

1.7 El queso y la salud

Todos los tipos de queso aportan a nuestra dieta un gran valor nutritivo. El ser

humano puede vivir sin sufrir enfermedades causadas por carencias vitamínicas

consumiendo únicamente queso, pan y fruta, puesto que el conjunto de estas tres

llevan las vitaminas, sales minerales y proteínas necesarias para vivir. Según pasa el

tiempo el queso aumenta el aporte de calorías y mejora su calidad bacteriológica. El

queso también contiene la proporción adecuada de ácidos grasos. Es un alimento

fácilmente digerible a su vez. El conjunto de moho, bacterias que confiere puede

actuar de forma favorable en nuestra flora intestinal.

El queso combinado con pan se convierte en una dieta equilibrada para

nuestra salud porque se complementan, el primero con las proteínas y los lípidos y el

segundo con los hidratos de carbono. Los quesos frescos por su alto contenido en

agua son más adecuados para una dieta con inferior número de calorías que uno

semicurado ó ya curado (Mahaut y col.,2003).

1.8 El queso como alimento nutritivo

Los alimentos lácteos a los cuales acudimos como fuente de calcio nos

aportan mucho más a nuestra nutrición y salud. En una dieta, los productos lácteos

contribuyen aproximadamente sólo con el 9% de las calorías disponibles. En cambio

proveen el 73% del calcio, el 31% de la riboflavina, el 33% del fósforo, el 19% de

las proteínas, el 16% del magnesio, el 21% de la vitamina B12, el 17 % de la

vitamina A, el 10% de la vitamina B6, 6% tiamina, apreciables cantidades de

vitamina D y niacina equivalentes. De hecho los productos lácteos se reconocen

como “ricos” o “fuentes de muchos nutrientes” en sí mismos sin tener que ser

modificados (Mahaut y col.,2003).

En la pirámide nutricional que especifica el Departamento de Agricultura de

los Estados Unidos (USDA, por sus siglas en Inglés) (Figura 13), se reconocen a los

alimentos lácteos como uno de los grupos de mayor relevancia, recomendando un

consumo de los mismos de 2 a 3 porciones/día (leche, yogur, quesos). Las nuevas

17

recomendaciones previstas por el MERCOSUR, recogiendo los consejos mundiales,

establecen 1000 mg de calcio como Ingesta Diaria Recomendada o Ingesta Adecuada

para mayores de 18 años. Teniendo en cuenta los hábitos locales, ese requerimiento

es alcanzable sólo consumiendo no menos de 4 porciones/día de leche ó su

equivalente en derivados. Esta cantidad representa la cantidad que al menos el 97%

de la población necesita (Portela, 2007) .

1.8.1 Aporte de macronutrientes

El contenido de los quesos sobresale ante otros productos ya que posee

proteínas de alto valor biológico y calcio de fácil asimilación, fósforo, magnesio,

vitaminas del grupo B y liposolubles.

Proteínas - A la proteína de la leche se la califica de alta calidad, con alto valor

biológico y alta digestibilidad, usada como estándar para evaluar el valor nutritivo de

las proteínas de los alimentos.

Figura 13. Pirámide nutricional

Carbohidratos- La lactosa es el azúcar principal en leche. En los niños se ha

comprobado que mejora la absorción de calcio y una porción pasa al colon y

funciona como prebiótico en la flora intestinal.

18

Grasas- Aparte de ser fuente de energía (42% de la energía de la leche entera) aporta

a la textura, sabor y al poder de saciedad de este alimento. . Los lácteos son la fuente

natural más rica en ácido linoleico conjugado siendo identificado este producto como

potencial fuente benéfica para la salud, teniendo propiedades antioxidantes habiendo

evidencias de tener propiedades anticarcinogénicas (colon mama)

antiarteroesclerosis, estimular el sistema inmune.

1.8.2 Aporte de micronutrientes

Es bien sabido que el calcio y la vitamina D contribuyen de manera esencial a

mantener la buena salud y el bienestar nutricional en el curso de la vida. Sin

embargo, aunque gran parte del interés por estos nutrientes sigue centrándose en su

importancia para el buen estado de los huesos, recientes investigaciones han arrojado

interesantes resultados sobre una amplia variedad de cuestiones nutricionales y

sanitarias relacionadas con ellos.

Las variaciones en los procedimientos utilizadas en su línea de producción

tales como diferentes temperaturas y diferentes técnicas de obtención de la cuajada

juegan un papel decisivo en determinar las características organolépticas del

producto final, pero los microorganismos o bacterias ácido lácticas (BAL) utilizadas

juegan un papel crítico en el desarrollo de sus características distintivas (Beresford y

col., 2001; Lars 2004). La primera función de las BAL es producir ácido durante el

proceso fermentativo a partir de la lactosa, hidrato de carbono mayoritario de la

leche. Ellas también contribuyen en la proteólisis y conversión de los aminoácidos en

componentes responsables del flavour (aroma + sabor) del queso (Lars, 2004).Las

BAL producen suficiente ácido láctico como para descender el pH a < 5.3 en 6 hs. a

30-37ºC. Estas bacterias, también llamadas “starters” pueden ser agregadas al

comienzo del proceso de producción de quesos o pueden ser contaminantes naturales

de la leche como en el caso de muchos quesos artesanales fabricados con leche

cruda. Una vez presentes junto al resto de los ingredientes comienzan su proceso de

crecimiento y logran alcanzar recuentos aproximados de 1 x 108 UFC/gr. en pocas

horas. Según su temperatura óptima de crecimiento se clasifican en mesófílas 30ºC-

45ºC o termófílas 55ºC-75ºC.

19

Las BAL más comúnmente usadas desde el punto de vista de la tecnología

alimentaria pertenecen a los géneros Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus,

Leuconostoc , Enterococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Oenococcus,

Pediococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weisella (Axelsson, L. 2004). Se

utilizan también cultivos “mixtos” como Lactococcus lactis ssp. cremoris y L. lactis

ssp. lactis (ambos mesófilos), Streptococcus salivarius ssp. Thermophilus ,

Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus,

Lb.delbrueckii ssp. lactis o Lb. helveticus.

Otro de los roles de las BAL es proveer un ambiente óptimo con respecto al

potencial redox, pH y contenido de humedad del queso (Wood, 1995).

1.9 El queso como alimento seguro

La principal causa de deterioro de los alimentos es causada por la presencia

de diferentes tipos de microorganismos. El deterioro microbiano de los alimentos

tiene pérdidas económicas sustanciales, tanto para los fabricantes (pérdida de

materias primas y de productos elaborados antes de su comercialización, deterioro de

la imagen de marca, etc.) como para distribuidores y consumidores (deterioro de

productos después de su adquisición y antes de su consumo).

La producción de alimentos seguros está basada en la implementación de

medidas generales de Buenas Prácticas de Higiene (BPH) y Buenas Prácticas de

Manufactura (BPM). Estos conocimientos son esenciales para contar con productos

alimenticios seguros, corregir errores y si fueran necesarias tomar medidas

preventivas. Es conocido que en la práctica la recontaminación con patógenos es una

causa frecuente de Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETAS).

Se ha establecido que los riesgos microbiológicos en quesos están más

vinculados con quesos blandos, de humedad superior al 46%. En cambio, los quesos

duros, de humedad menor al 36% pueden ser elaborados con leche termizada

(tratamiento térmico más suave que la pasteurización), la larga maduración requerida

para alcanzar esos niveles de humedad dificulta el desarrollo de los patógenos que

20

pudieran haber contaminado inicialmente, aunque de no haberse respetado las

Buenas Prácticas de Elaboración podrían presentar enterotoxina estafilocóccica.

La demanda creciente del consumo de quesos y su consecuente elaboración

ha incrementado el interés en obtener más información acerca de su calidad y

estabilidad. Muchos de los estudios realizados sobre la calidad microbiológica de los

quesos de pasta blanda y pasta semiblanda fueron ya publicados (Scott y col., 2002).

Diferentes microorganismos tales como Staphylococcus aureus, Escherichia

coli, Salmonella spp. y Listeria monocytogenes son microorganismos asociados

desde 1970 con brotes asociados a quesos (Roberts, 2002). Muchos de estos

microorganismos están distribuidos en el ambiente y pueden ocasionar

contaminaciones naturales durante la producción, maduración y almacenamiento así

como contaminaciones cruzadas en restaurantes y hogares debido a un inapropiado

uso.

La distribución ubicua de Salmonella spp,, su prevalencia, su virulencia y su

potencial impacto económico en la industria alimentaria predice la necesidad de un

continuo control (Iurlina y Fritz, 2004).

La contaminación de S.aureus, coco Gram positivo (Jablonsky, 1997), en

productos lácteos puede tener lugar en varias etapas del proceso.

E.coli, bacilo Gram negativo asporógeno, es usualmente considerada un

habitante no patógeno del tracto intestinal humano y es utilizada como indicador de

un inadecuado proceso de sanitización de agua y comidas. A pesar de ésto en los

años recientes algunas cepas de E.coli halladas han sido implicadas en enfermedades

trasmitidas al hombre por alimentos (Doyle,1997).

Salmonella spp. es un bacilo Gram negativo no formador de esporas, aerobio

facultativo, que puede sobrevivir en condiciones favorables. Hay mas de 2000

serotipos basados en la presencia de antígenos somáticos (O) y flagelares (H)

(Daoust, 1997). A pesar de ésto solo un pequeño número son patógenos para el

hombre .Su crecimiento está favorecido por la temperatura (20 a 45ºC ) y el pH (4.5

a 9.0). Su tolerancia al pH convierte a este microorganismo en sobreviviente en

comidas fermentadas como quesos y salsas Salmonella spp. crece también en

ambientes con aw 0.94 pero no puede tolerar altas concentraciones de sal o

temperaturas elevadas.

21

La dosis infectiva depende del estado inmunológico del individuo y ha sido

demostrado que alimentos ricos en grasa tienden a dar un ambiente protector al

microorganismo (Eley, 1996). Salmonella spp. se distingue de otros patógenos por su

frecuente presencia en alimentos, su habilidad para crecer en una gran variedad de

alimentos, su fácil diseminación y contagio persona a persona y su prolongado

período de excreción (10 semanas).

L.monocytogenes es un bacilo Gram positivo, asporógeno, anaerobio

facultativo y sobrevive a temperaturas de 0 a 45ºC. Su aw óptima de crecimiento es

de 0,97 con un mínimo de 0,93 y su pH óptimo de crecimiento está en el rango 5,6-

9,6 (Rocourt, 1997). La dosis infecciosa no está bien establecida pero

L.monocytogenes no representa un problema hasta tanto no alcance altos niveles de

contaminación, en personas sanas. Este microorganismo es ubicuo y puede

contaminar diferentes alimentos y bebidas. Aunque la listeriosis humana es

esporádica, se han reportado en algunos casos consecuencias severas a partir del

consumo de productos crudos, inadecuadamente calentados, y recontaminación de

alimentos tratados (Yuste y col., 2002). Ha sido asociada con varios brotes en los

cuales estaban implicados los quesos y consecuentemente su ocurrencia ha sido

muy bien estudiada. L. monocytogenes es un importante microorganismo asociado a

enfermedades transmitidas por alimentos debido a la severidad de la infección

causada y a la mortalidad que produce (30%). La contaminación de muchos

alimentos con L. monocytogenes es casi inevitable debido a su naturaleza ubicua en

el medio ambiente. Mas aún su inusual habilidad por sobre otros patógenos de crecer

a temperaturas de refrigeración la asocia con productos normalmente almacenados

en estas condiciones (Smith-Palmer y col., 2001). Ha sido detectada en numerosos

alimentos incluyendo paté( Mc Lauchlin ,1991), comida lista para consumo y

particularmente en quesos blandos ( Linnan y col., 1999). La supervivencia de este

patógeno a valores de pH muy bajos (3,0 a 4,5) ha recibido poca atención,

probablemente debido a que se asume su rápida muerte bajo estas condiciones, pero

resultados obtenidos por Parish y col. (1989) indican que en productos de bajo pH

puede encontrarse Listeria y se puede producir una masiva contaminación si estos

alimentos son consumidos en un período corto de tiempo. Su crecimiento a pH <4,4

está influenciado por la temperatura y el tipo de ácido (McLauchlin, 1990).

22

1.10 Tecnologías combinadas de preservación

La estabilidad microbiológica y la calidad sensorial de la mayoría de los

alimentos, están basados en la combinación de factores de preservación. Esto es

cierto, tanto para alimentos tradicionales con factores empíricos inherentes, como

para productos nuevos para los cuales se han seleccionado racionalmente los factores

de estrés y se han aplicado intencionalmente (Alzamora y col., 2000).

El objetivo de las tecnologías de obstáculos es seleccionar y combinar

factores de preservación o barreras de forma tal que la estabilidad y seguridad

microbiológica puedan ser garantizadas, reteniendo las características nutritivas y la

aceptación sensorial (Leistner, 1992). Este método usa varias barreras que

separadamente pueden no dar una adecuada preservación, pero que cuando se las

combina pueden brindar la protección necesaria. Las barreras pueden incluir la

disminución de la temperatura, pH o actividad de agua (por adición de por ejemplo

NaCl o azúcares); el calentamiento mínimo; o la adición de antimicrobianos

(Buchanan y Phillips, 1990; Leistner, 1992; Leistner, 1995). Para que este concepto

sea aplicado exitosamente, es necesario cuantificar la influencia de los distintos

factores sobre el crecimiento microbiano.

La aplicación de este concepto ha sido muy exitosa en los últimos años,

dentro del conjunto de tecnologías de preservación de mínimo procesamiento, y ello

ha sido posible debido a los grandes avances ocurridos en el conocimiento del modo

de acción de los distintos factores de preservación y de su interacción en los

microorganismos (Sajur, 1985; Alzamora y col., 1989; Guerrero y col., 1993; Rojas y

col., 1994).

La estabilidad u homeostasis del medio interno (composición y volumen de

los fluidos) es vital para la supervivencia y el crecimiento de los microorganismos.

En los alimentos preservados por factores combinados, la homeostasis activa de los

microorganismos vegetativos y la homeostasis refractaria pasiva de las esporas se

interfieren en “un número de sitios” o de “manera cooperativa”, utilizando una

combinación de factores de conservación, aplicando cada uno de ellos en forma no

letal, disminuyendo la severidad de los tratamientos. Por ejemplo, en el caso de

células vegetativas, se reduce la disponibilidad de energía (removiendo O2, limitando

nutrientes, reduciendo la temperatura) y/o se incrementa la demanda de energía

23

(reduciendo aw y pH, añadiendo compuestos activos a nivel de membrana). Para

esporas, la idea es dañar estructuras claves (por ataque químico, enzimático o físico

sobre el cortex) o provocar la germinación de las mismas (con “falsos disparadores”,

por aplicación de altas presiones, etc.) (Gould y col., 1983; Gould, 1995).

Este concepto de combinación no sólo se aplica a la estabilidad

microbiológica, sino que se hace extensivo a la calidad total. También desde el punto

de vista microbiológico, el concepto se ha tornado más abarcativo y se refiere no sólo

a la interferencia de la homeostasis por barreras sinérgicas o aditivas sobre un mismo

microorganismo, sino a la aplicación selectiva de factores de conservación que

puedan ser efectivos contra un organismo específico o un grupo de microorganismos

solamente. Es así, que en los últimos años, un gran número de publicaciones en la

literatura internacional se refiere a la utilización de este concepto con distintas

finalidades: optimizar tecnologías tradicionales; desarrollar nuevos productos y como

medida de seguridad o “back-up” para asegurar la calidad microbiológica de

alimentos mínimamente procesados (Alzamora, 1997).

La adopción de altos estándares en el control de calidad, buenas prácticas de

manufactura y el sistema HACCP son esenciales para asegurar la calidad

microbiológica del producto. Más aún, debido a los reducidos márgenes de

seguridad, los distintos organismos de contralor internacionales han recomendado el

uso de “obstáculos” adicionales en el diseño de los sistemas de preservación tal que

procesos, distribución y almacenamiento no adecuados puedan todavía garantizar

productos microbiológicamente seguros. Así, el uso de factores combinados juega un

importante rol en la seguridad microbiológica de aquellos productos donde los

puntos críticos de control sean imposibles o difíciles de controlar.

Los valores altos de aw en quesos blandos no son suficientes para garantizar la

seguridad microbiológica de este tipo de alimentos, por lo que es necesaria la

combinación con otros factores y/o formas tradicionales de preservación.

Varios factores de preservación, cuyos efectos se describen a continuación, son

frecuentemente utilizados en estas tecnologías. Algunos de ellos han sido empleados

en este trabajo.

1.10.1 Efecto de la reducción de la aw

24

Cuando la aw del medio externo se reduce, los microorganismos tienden

rápidamente a alcanzar el equilibrio osmótico con el medio que los rodea,

principalmente a través de la pérdida de agua, produciéndose plasmólisis de la

célula con pérdida de la turgencia de membrana. Inmediatamente se pone en

marcha un mecanismo osmoregulador que les permite recuperar el agua pérdida y

mantener la homeostasis con respecto de su contenido de agua. Se produce la

acumulación intracelular de solutos “compatibles” por síntesis y/o por transporte

activo desde el medio extracelular hasta balancear la osmolalidad externa (Gould,

1995).

El modo de acción de estos solutos “compatibles” no sólo se explica por su

papel de osmolitos, sino que se cree, tienen una propiedad molecular fundamental:

estabilizar la estructura proteica (y por lo tanto sus funciones) preservando las

funciones de la capa de hidratación (Leistner y Russell, 1991). En las bacterias,

los solutos compatibles de mayor importancia son los aminoácidos (ácido

glutámico, glicilbetaína, ácido γ-aminobutírico, prolina, etc.) y en las levaduras y

los hongos, los polioles (manitol, arabitol, sorbitol, glicerol, etc.).Las diferencias

en la capacidad de biosíntesis o de mecanismos de transporte son responsables de

la diferencia en los valores de aw límite de crecimiento de las varias especies y

géneros de microorganismos.

También se puede producir una alteración de la composición de los lípidos

de la membrana, incrementándose la proporción de lípidos aniónicos de forma tal

de impedir el pasaje de la fase lamelar (o bicapa) a la fase no lamelar (hexagonal)

(Bygraves y Russel, 1988). La disrupción de la conformación lipídica normal de

la membrana, destruiría sus propiedades de permeabilidad pasiva y alteraría las

interacciones lípido-proteína, influenciando las actividades proteíno-mediadas de

la misma (por ej. metabolismo intermedio, bombeo de iones, sistemas de

transporte) (Leistner y Russell, 1991).

1.10.2 Efecto de la reducción del pH

25

El pH es otro factor básico en la preservación de alimentos, afectando la

conformación de las proteínas, el camino de síntesis enzimática y los productos

finales del metabolismo. El crecimiento y la supervivencia de los

microorganismos están fuertemente influenciados por el pH y el contenido de

ácidos orgánicos del alimento. Éstos determinan, de acuerdo a su valor, floras

contaminantes diferentes y de distinta resistencia a los factores de conservación.

Las bacterias, en general, requieren un rango de pH externo entre 4 y 9 para poder

crecer, mientras que los hongos y las levaduras exhiben mayor tolerancia,

pudiendo desarrollarse en los rangos de pH externo 1,5-11,0 y de 1,5-8,0,

respectivamente (Alzamora, 1997).

Los microorganismos necesitan mantener su pH intracelular (pHi) dentro

de cierto rango muy estrecho y cercano a la neutralidad para poder crecer. Éste

valor óptimo de pH depende de la especie: las bacterias acidófilas tienen pHi

comprendidos entre 4,5-6,0, al igual que hongos y levaduras; las neutrófilas entre

7,5-8,0 y las alcalófilas, entre 8,4-9,0. Los organismos tienen distintas

capacidades para regular su pH, y por lo tanto, exhiben también diferente

tolerancia a la perturbación del pH externo. Los microorganismos que son más

resistentes a valores bajos de pH (hongos, levaduras y bacterias acidófilas),

poseen también valores menores de pHi, lo que indicaría una adaptación

específica al medio ácido (Booth y Kroll, 1989).

Existen tres formas en que puede actuar el pH como factor de

conservación (Corlett y Brown, 1980; Brown y Booth, 1991), si bien todavía no se

conoce totalmente el mecanismo por el cual los microorganismos interactúan con

el pH:

� Vía ácidos fuertes: éstos disminuyen el pH externo, pero no permean a través de

las membranas celulares y ejercerían su acción alterando la conformación y la

actividad de una o más enzimas esenciales presentes en las capas externas de la

célula, y por lo tanto disminuyendo la efectividad de los sistemas de transporte de

iones esenciales y nutrientes. Tales niveles de acidez son generalmente

inaceptables en los alimentos y sólo permisibles en bebidas carbónicas, en las que

se emplea el ácido fosfórico como acidulante.

� Vía ácidos débiles lipofílicos (ácidos cítrico, sórbico, benzoico, propiónico, etc.):

las formas no disociadas de estos ácidos débiles, permean a través de las

26

membranas y actúan como transportadores de protones, ionizándose en el

citoplasma y acidificando el medio interno. El efecto primario es disminuir el

pHi, pero además, el anión del ácido no disociado puede tener efectos inhibitorios

específicos en el metabolismo, incrementando el efecto del pH (ej: ácido acético,

fórmico, sórbico).

� Vía iones ácido-potenciados: el bajo pH potencia la actividad de compuestos

tales como bicarbonato, sulfito y nitrito, incrementando la acción de la especie

antimicrobiana; es decir, que el efecto del pH es indirecto.

1.10.3 Efecto del sorbato de potasio

El sorbato de potasio es principalmente efectivo contra mohos y

levaduras, aunque tiene cierta efectividad sobre algunas bacterias. El efecto sobre

los hongos, se debe a la inhibición de los sistemas de enzimáticos de

deshidrogenasas, las cuales intervienen en el mecanismo de oxidación de los

ácidos grasos (Jay, 1991) y enzimas sulfihidrílicas tan importantes como

aspartasas, succinodeshidrogenasas y fumarasas. Es altamente efectivo en la

inhibición de la producción de micotoxinas por algunas cepas (Ryu y col., 1993).

Su efectividad depende de muchos factores tales como pH, aw, presencia

de otros aditivos, procesamiento y envasado, temperatura y condiciones de

almacenamiento (Sofos y Busta, 1983). La cantidad a utilizar depende del tipo de

microorganismo, la aw del alimento y de la carga inicial considerados. En general,

concentraciones de sorbato añadidas en el orden de 0,05 – 0,10 %, inhiben el

desarrollo de hongos y levaduras en una amplia gama de alimentos.

1.10.4 Utilización de antimicrobianos naturales

La incidencia creciente de enfermedades transmitidas por alimentos, junto

con las implicancias socio-económicas moviliza a una constante necesidad de

producir alimentos seguros y desarrollar nuevos agentes antimicrobianos.

Considerando la seguridad de ciertos conservantes químicos y la reacción negativa

27

de los consumidores quienes los perciben como artificiales, ha surgido un creciente

interés en alternativas más naturales. Particular interés se ha planteado en la potencial

aplicación de aceites esenciales de plantas. La propiedades antimicrobianas están

bien establecidas contra un gran espectro de microorganismos incluyendo bacterias

(Smith-Palmer y col., 1998) ,levaduras ( Lachowicz y col.,1998; Mangena y

Muyima, 1999) y hongos (Paster y col., 1990; Mishra y Dubey 1994).

Diversos autores han estudiado el efecto de aceites esenciales como agentes

bactericidas (Smith-Palmer, 2001). Skandamis y col. (2001) testearon, por ejemplo,

la efectividad del aceite esencial del orégano contra E.coli en caldo BHI hallando

resultados positivos en cuanto a su efecto inhibitorio. Azzous y Bullerman (1982)

encontraron que el clavo de olor era un eficiente antimicótico contra Aspergillus

flavus, A. parasiticus y A. ochradeus y cuatro cepas de Penicillium demorando su

crecimiento por más de 21 días. Cerrutti y col. (1997) evaluaron el potencial uso de

vainillina como antimicrobiano (en lugar de sorbato de potasio y bisulfito de sodio)

en la formulación para obtener puré de frutillas mínimamente procesado. Vrinda

Menon y Garg (2001) estudiaron el efecto bactericida del aceite del clavo de olor

sobre Listeria monocytogenes en carnes y quesos. Wilkins y Board (1989) reportaron

que más de 1389 plantas son potencialmente fuente de agentes antimicrobianos como

es el caso del timol obtenido del tomillo y orégano, el aldehído cinámico de la canela

y el eugenol de clavos de olor.

Sin embargo la actividad antimicrobiana de algunos aditivos, combinados o

no, en sistemas como agua o medios de cultivo reflejan pobremente, en general, su

comportamiento en sistemas más complejos como los alimentos (Alzamora y col.,

2005).

En algunos casos, el responsable de la reducción de su actividad

antimicrobiana es la interacción con los diferentes nutrientes del alimento (proteínas,

grasas, etc.) y otros factores de preservación (Sofos y col., 1998). Así y todo, los

mecanismos por los cuales se podría explicar cierta toxicidad o resistencia

antimicrobiana a determinados preservantes son menos conocidos.

1.10.4.1 Timol

28

El aceite de tomillo es obtenido por destilación por arrastre de vapor de las

hojas de Thymus vulgaris. Sus componentes mas importantes son los alcoholes

fenólicos los que expresados como timol se encuentran en una concentración

superior al 35%. Otros componentes observados lo constituyen el p-cimeno y el

terpineno los que junto al timol le imparten su aroma y sabor característico.

El timol es empleado para aromatizar todo tipo de alimentos. Dentro de la

industria farmacéutica el timol es un conocido antiséptico, su color es amarillo

intenso, olor agradable, densidad 0,91 - 0,94 e índice de refracción 1,492 - 1,499.

El mismo es reconocido también como conservante natural contra

Staphylococcus aureus y Salmonella Enteritidis (Juven y col. 1994; Lambert y col.,

2001). Algunos de los sinónimos con los que se lo puede encontrar en la bibliografía

son: ácido tímico, alcohol timólico, fenol timólico, isopropilmetacresol, etc. Medina

y col. (2004) estudiaron la actividad bactericida “in vitro”, por el método de difusión

en agar, frente a cultivos puros de cinco bacterias patógenas (Listeria

monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella Enteritidis, Enterococcus sp. y

Escherichia coli) y seis cepas de bacterias lácticas que alteran alimentos. Los

resultados encontrados destacan la efectividad del aceite de tomillo frente a cultivos

puros de bacterias patógenas así como frente a bacterias lácticas (Alzamora y

col.,2003).

1.11 Calidad, vida útil y seguridad

La falta de calidad en los alimentos puede ser la consecuencia de cambios

físico-químicos, enzimáticos o microbiológicos. Los microorganismos desempeñan

un papel clave en la pérdida de calidad a través de las actividades de bacterias,

hongos y levaduras pero también a través del crecimiento o supervivencia de

especies patógenas. Por lo tanto, si se quieren obtener juicios confiables sobre la

calidad del alimento, su vida útil y su seguridad, es necesario disponer de datos

cuantitativos sobre los efectos de los factores que afectan el crecimiento, la

supervivencia y/o la inactivación. Recientemente, con el avance informático, las

técnicas para desarrollar modelos predictivos se han mejorado enormemente y es

posible pensar en una Base de Datos para Predicciones Microbiológicas a ser usada

por la industria y otros organismos relacionados a esta temática.

29

Los quesos presentan problemas de vida útil en heladera asociados al hábito

de consumo (alimentos de abre y cierre) que provocan un deterioro prematuro por

desarrollo de microorganismos. Estos productos pasteurizados poseen un pH

relativamente elevado (5,1- 6,2) y una actividad de agua (aw) óptima para el

desarrollo microbiano. Numerosos estudios han establecido que el deterioro de los

mismos depende de factores intrínsecos tales como variedad del queso, aw,

contenido de sal, contenido y tipo de emulsificante, pH y de factores extrínsecos, de

los cuales los más importantes resultan la temperatura de almacenamiento y la

contaminación post-pasteurización. Datos de bibliografía muestran que Listeria

monocytogenes, Salmonella spp, y Staphylococcus coagulasa positivo representan a

los patógenos de mayor incidencia en quesos (Ahmed y col.,1988; Abdalla y

col,1992; Altekrus y col.,1998; Larson y col.,1999; Jorgensen y col.,2005). Si se

quieren obtener juicios confiables sobre la calidad de este alimento, su vida útil y su

seguridad, es necesario disponer de datos cuantitativos sobre los efectos de los

factores que afectan el crecimiento, la supervivencia y/o la inactivación.

Los modelos matemáticos son la mejor manera de hacer predicciones bajo

estas circunstancias.

Una herramienta para el desarrollo de tecnologías para poder estimar la

conducta microbiana, es la aplicación de la microbiología predictiva (Mc Meekin y

col., 1993).

1.12 Microbiología Predictiva

1.12.1 Generalidades

La microbiología predictiva consiste en el desarrollo de modelos matemáticos

para predecir la velocidad de crecimiento o de declinación de los microorganismos

bajo un dado conjunto de condiciones ambientales (Walls y Scott, 1997). El

conocimiento detallado de las respuestas de crecimiento de los microorganismos

frente a las condiciones ambientales, es decir, el conocimiento de la ecología

microbiana, permite evaluar objetivamente el efecto del procesamiento, la

distribución y el almacenamiento en la seguridad microbiológica y la calidad de los

alimentos. Utilizando diseños experimentales adecuados y modelos matemáticos

30

apropiados, la microbiología predictiva permite la selección de los factores de

preservación para alcanzar la vida útil deseada de diversos alimentos.

Antes de ser usados estos modelos matemáticos en la práctica deben ser

validados a los fines de demostrar que el comportamiento bacteriano es el mismo

tanto en el laboratorio como en el alimento real.

El testeo de todo modelo es su habilidad para predecir respuestas en nuevas

situaciones. En microbiología de alimentos esto significa la habilidad del laboratorio

de generar modelos para predecir el comportamiento de los microorganismos

concernientes al alimento en preparaciones comerciales, almacenamiento y

distribución. Claramente la validación en este nivel debe ser realizada antes que los

modelos predictivos puedan ser usados en la práctica con cierto grado de certeza.

Existen potenciales consecuencias de un prematuro uso comercial de un modelo

predictivo. Desde el punto de vista de la seguridad de los consumidores y la

aceptación de la industria de los conceptos de microbiología predictiva un fracaso de

un modelo no validado puede ser serio (Mc Meekin y col., 1993).

Draper y Smith (1981) indicaron que una vez que el modelo fue validado en

la práctica es todavía necesario realizar algún procedimiento para mantener el

modelo y reconocer cuando deviene en obsoleto. Ellos recomiendan que por rutina el

modelo debe ser periódicamente chequeado mediante análisis estadísticos que deben

permitir discernir mas formas de desviaciones sutiles.

No es un problema cuán bien un modelo puede ajustar una serie de datos, el

verdadero valor de un modelo recae en cuán bien ese modelo puede predecir la

respuesta microbiana bajo nuevas condiciones que no son las que fueron

específicamente testeadas. Es decir, cuán bien ese modelo funciona en el mundo real.

El modelado microbiano comenzó aproximadamente en 1920 con los cálculos

del tiempo de muerte térmica y el uso de los valores D (tiempo de reducción

decimal) y z (grados de variación en la temperatura, necesarios para reducir el valor

de D en un 90%), para describir la resistencia térmica bacteriana. En la década del

‘70, se profundizó principalmente en el modelado de la probabilidad de producción

de toxinas de C. botulinum, principalmente en USA y en el Reino Unido (Roberts e

Ingram, 1973). En los años ’80 el marcado incremento en la incidencia de brotes de

enfermedades producidas por alimentos, llevó a tomar conciencia pública de la

necesidad de un abastecimiento seguro de alimentos. En ese momento, los

31

microbiólogos de alimentos comenzaban a aceptar que los métodos microbiológicos

tradicionales para determinar la calidad y seguridad alimenticia, estaban limitados

por el tiempo requerido para obtener los resultados y que los métodos indirectos

basados en cambios químicos, físicos o fisicoquímicos, no proporcionaban una

respuesta hasta que un gran número de células se encontraba presente. Lo mismo

ocurría con varios métodos rápidos que necesitaban, o bien un alto nivel de

contaminación para que la respuesta sea evidente, o dependían del uso de

equipamiento muy sofisticado y oneroso.

Antes del advenimiento de la microbiología predictiva, la mayor parte de la

bibliografía definía las condiciones ambientales limitantes del crecimiento, cuando

los demás factores ambientales se encontraban en los valores óptimos. Además, sólo

ocasionalmente los efectos de dos o más factores de conservación se estudiaban de

tal forma que permitieran cuantificar la interacción de los mismos. A consecuencia

de ello, muchos de estos datos no eran de utilidad o bien no permitían predecir la

respuesta microbiana.

Si bien el modelado no revela comportamientos microbianos extraños o poco

esperados, los modelos se pueden usar para predecir, por interpolación, el

crecimiento bajo una combinación de condiciones que no fueron específicamente

testeadas en el protocolo experimental (Whiting, 1995).

Se han propuesto varios esquemas para categorizar los modelos, uno de ellos

propone dividirlos en modelos de crecimiento y modelos de

inactivación/supervivencia. Dentro de cada categoría se subdividen en modelos

primarios, secundarios y terciarios (Whiting y Buchanan, 1994; Alzamora y col.,

1995; López-Malo, 2000; Alzamora y col.,2010).

Los modelos primarios describen cambios en la respuesta microbiana con el

tiempo en un ambiente específico. El modelo puede cuantificar unidades formadoras

de colonia por mililitro o por gramo (UFC/mL), formación de toxinas, niveles de

sustrato o productos metabólicos (que son medidas directas del crecimiento);

absorbancia e impedancia (medidas indirectas de la respuesta). Una vez generada la

curva de crecimiento o muerte microbiana, se utiliza una función o ecuación

matemática para describir el cambio de la respuesta en función del tiempo. Ejemplos

de modelos primarios son: la función de Gompertz para crecimiento exponencial; el

modelo de Gompertz modificado para describir la inactivación microbiana; modelos

para describir la declinación no lineal de esporas sobrevivientes con el tiempo; el

32

modelo logístico aplicado a destrucción térmica; el modelo de Stannard; el modelo

de Schnute; la ecuación de Fermi; etc. (Mc Meekin y col., 1993). El valor D (tiempo

necesario a una determinada temperatura para reducir en un 90% la población

microbiana ) es también ejemplo de un modelo primario (Whiting y Buchanan,1994).

Los modelos secundarios describen las respuestas de los parámetros de los

modelos primarios frente a cambios en uno o más factores ambientales como

temperatura, pH o aw. Ejemplos de modelos secundarios son el modelo de Arrhenius

y el modelo de la raíz cuadrada (Bělehrádek), que describen la dependencia con la

temperatura, y el modelo polinómico. El valor z (ºC necesarios para disminuir el

valor D un ciclo logarítmico) utilizado en procesos térmicos es también un ejemplo

de modelo secundario (Whiting y Buchanan, 1994). Los mismos no serán objeto de

estudio en el presente trabajo.

Los modelos terciarios son rutinas de software para computadora menos

difundidas que convierten a los modelos primarios y secundarios en programas

amigables. Estos programas pueden calcular las respuestas microbianas frente a

condiciones que no fueron evaluadas inicialmente, comparar el efecto de diferentes

condiciones o contrastar el comportamiento de varios microorganismos, por lo que

permiten elegir a el o los microorganismos blanco de ataque en situaciones

específicas de formulación-procesamiento de alimentos. Ejemplos de modelos

terciarios son el programa “USDA Pathogen Modeling Program” realizado por el

Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, disponible gratuitamente en

Internet (http://www.arserrc.gov) y el “Food Micromodel” avalado por el Ministerio

de Agricultura Pesca y Alimentación del Reino Unido (Wilson y col., 2002).

Es necesario remarcar que llevando a cabo este modelado se puede describir

exitosamente el comportamiento microbiano en la mayoría de los alimentos pero hay

ocasiones en las que se encuentran discrepancias entre el modelo y el crecimiento

observado . Estas discrepancias son descriptas como “fallas”. Un ejemplo sería que

el crecimiento observado es más lento que el predicho por el modelo (Wilson y col.,

2002).

La validación de los modelos matemáticos es esencial para demostrar su

aplicabilidad en alimentos. Si bien buenas coincidencias son observadas también

suelen observarse algunas debilidades.

33

Una de las debilidades mayormente encontradas está dada por la severidad

del medio que representa la matriz alimentaria con respecto a los medios de cultivos

que se utilizan en los ensayos de laboratorio. Otra debilidad observada está

relacionada con cuanto de rápido se adapte el microorganismo a su nuevo medio

ambiente. Si en los experimentos se utilizan los mismos microorganismos a los

utilizados en el programa PMP, medios similares y las mismas condiciones de

crecimiento es de esperar que el alimento en estudio provea condiciones más

favorables aún para el crecimiento bacteriano que el medio utilizado en Laboratorio

(Walls y Scott ,1997).

Otra consideración a tener en cuenta es que muchos modelos utilizan una

mezcla de cepas es decir cepas de rápido crecimiento junto con cepas de lento

crecimiento .Idealmente la mezcla de cepas representarían lo que normalmente se

podría encontrar en los alimentos o al menos lo más parecido. Existen cepas como

Salmonella senftenberg termoresistente que debería tener un modelo de inactivación

separado del resto. Los microbiólogos deben chequear ambos modelos y aplicar su

propio criterio (Whiting y Buchanan ,1997).

Recientes estudios han indicado que las condiciones bajo las cuales el inóculo

utilizado debe crecer tienen un impacto importante en el crecimiento o inactivación

bacteriana. Los datos utilizados para generar los modelos están basados en el

crecimiento de cepas a su vez crecidas en ambientes favorables antes de ser usadas

en el medio de cultivo. Estas células pueden tener diferencias en sus tiempos de fase

lag , en sus características de crecimiento, etc., con respecto a células que no fueron

pre-adaptadas.

Los modelos matemáticos microbianos proveen información sumamente útil

para tomar decisiones en determinadas situaciones. Estas situaciones pueden

resumirse en (Whiting y Buchanan, 1994) :

• Predicción en seguridad y tiempo de vida útil: Crecimiento y

supervivencia microbiana permiten estimar peligros potenciales

provocados por microorganismos patógenos en alimentos luego de un

normal o abusivo tiempo de almacenamiento.

34

• Control de Calidad: Los modelos pueden brindar ayuda en desarrollar

programas HACCP mostrando que condiciones permiten crecer o

sobrevivir y así identificar los puntos críticos de control. Esto es

particularmente importante en alimentos en donde pueden existir

interacciones de diferentes factores que influyen en el crecimiento

microbiano.

• Desarrollo de nuevos productos; Cambios en la composición del

alimento o una nueva formulación pueden ser rápidamente evaluadas

en cuanto a posible crecimiento o supervivencia de microorganismos.

Los modelos muestran que factores tienen más influencia en la

población microbiana y permite comparar nuevas versus viejas

formulaciones.

• Educación: a través de la generación de gráficos o estimando el

tiempo de generación de una población microbiana crítica, los

modelos permiten demostrar drásticamente la importancia de

mantener la correcta temperatura o los beneficios que representa

trabajar con materias primas de alta calidad con bajos contenidos

microbianos iniciales.

• Planeamiento en Laboratorio y análisis de bases de datos: Ahorra

recursos, tiempo y dinero permitiendo al laboratorio a concentrar sus

esfuerzos en los puntos críticos. El modelado representa cada vez más

una técnica de rutina para análisis de datos de comportamientos

bacterianos. Estos datos pueden ser manipulados matemáticamente y

estimas así los errores.

35

2. OBJETIVOS

36

2.1 Objetivo general En microbiología predictiva los modelos matemáticos son utilizados para

predecir el comportamiento de los microorganismos bajo diferentes condiciones.

Antes de ser utilizados en una situación práctica, estos modelos matemáticos deben

ser validados con el propósito de demostrar que las bacterias se comportan de igual

modo tanto en los alimentos reales como en los sistemas modelo (p.e. medio de

laboratorio) que se utilizaron para generar dichos modelos. La presente propuesta

tiene como objetivo general la aplicación de una estrategia que integra el concepto de

factores combinados de preservación y la microbiología predictiva para contribuir al

aseguramiento de la calidad microbiológica de un derivado lácteo mediante la

validación de diferentes tipos de modelos matemáticos.

2.2 Objetivos específicos

1) Obtener respuestas microbiológicas de crecimiento, supervivencia y/o

inactivación de microorganismos de interés a distintos factores de conservación

utilizados y potenciales (temperatura: presencia de distintos aditivos; pH) y a sus

combinaciones en queso untable comercial.

2) Modelar y validar internamente la cinética de

crecimiento/supervivencia/inactivación de un microorganismo clave utilizando como

herramienta fundamental a la microbiología predictiva a fin de establece la matriz a

utilizar.

3) Realizar estudios de reto microbiano utilizando pátógenos

comúnmente causantes de ETAS en este tipo de alimento. Modelar y validar

internamente la cinética de crecimiento/supervivencia/inactivación utilizando como

herramienta fundamental a la microbiología predictiva.

37

4) Una vez validados los modelos, evaluar la influencia de los factores de

estrés aplicados de uso corriente o potenciales (p.e. uso de antimicrobianos naturales)

a través del análisis de los parámetros obtenidos para los distintos modelos.

5) Predecir la conducta microbiana y evaluar el riesgo ante situaciones de

abuso térmico.

6) Cuando sea posible, comparar la aplicabilidad y concordancia de los

diferentes modelos utilizados primarios y terciarios en la predicción de la conducta

microbiana en queso untable.

38

3. MATERIALES Y MÉTODOS

39

3.1- Matriz utilizada

Para el presente estudio se han utilizado dos matrices que responden a la

denominación de queso (Introducción, sección 1.1) con la única diferencia de

poseer o no (1000 ppm) sorbato de potasio.

A los fines prácticos llamaremos queso untable base al queso untable sin

sorbato de potasio y queso untable al que posee sorbato de potasio (1000 ppm) y

que es el que se adquiere para consumo masivo.

3.1.1 Elaboración del queso untable base

El queso untable base fue elaborado a escala piloto y provisto por la

empresa Danone S.A. El mismo fue fraccionado en potes comerciales flexibles

(capacidad ≅ 150 gramos), usualmente usados para el envasado de yogures.

El proceso de elaboración del queso incluyó como primer paso la

elaboración de un producto intermedio: la masa magra descremada, a base de leche

descremada, fermento, cuajo y cloruro de calcio. En un segundo paso, se adicionó a

la masa magra, crema, gelatina, cloruro de sodio y citrato de sodio en los siguientes

porcentajes:

• Masa magra 54,3%

• Crema 44,5%

• Gelatina 0,7%

• Cloruro de sodio 0,2%

• Citrato de sodio 0,3%

La composición porcentual del producto final resultó:

� Leche seleccionada descremada pasteurizada 84%

40

� Crema 15,98%

� Gelatina (textura) 0,002%

� Citrato de Sodio (estabilizante de proteínas) 0,0008%

� Cloruro de Sodio 0,0006%

� Cloruro de Calcio 0,004%

� Fermento(cultivo iniciador) 0,02%

� Cuajo 0,0001%

El fermento mencionado anteriormente estaba compuesto por una

mezcla de cultivos de las siguientes bacterias lácticas: Lactococcus lactis subsp.

lactis, Lactococcus lactis biovar. diacetylactis y Leuconostoc mesenteroides ssp.

cremoris los cuales generan ácido láctico hasta pH ~ 4,5. Estos cultivos lácticos

generan diacetilo a partir del citrato (Axelsson, L., 2004), producto que le confiere al

queso un sabor amargo característico.

El pH del producto final se ajustó a ~ 5,0. Una vez alcanzado este valor,

el porcentaje final de ácido láctico en el queso untable base tuvo un valor

aproximado de 0,6-0,7%.

3.1.2 Medición de pH

Para la medición de pH se utilizó un equipo marca Orion, ión selectivo,

modelo 710 (Orion, Inc, USA) calibrado con soluciones buffer (Hanna Instruments,

Italia) de pH 4,01 +/- 0,01 y pH 7,01 +/- 0,01. Las determinaciones se realizaron

por duplicado informándose el valor promedio.

3.1.3 Medición de actividad de agua (aw )

La actividad de agua se midió con un higrómetro de punto de rocío AquaLab CX-2

(Decagon Devices, Inc., Pullman, WA) calibrado con soluciones saturadas de NaCl,

(NH4)2SO4, KCl y BaCl2; como lo describen Roa y Tapia de Daza (1991). Las

determinaciones se realizaron por duplicado informándose el valor promedio.

41

3.2- Reactivos utilizados

Tanto para el enriquecimiento como para el aislamiento de las bacterias se

usaron medios selectivos y diferenciales entendiéndose por “selectivo” aquel medio

de cultivo que posee en su composición algún ingrediente con capacidad de inhibir el

crecimiento de la flora acompañante permitiendo “seleccionar” el crecimiento de la

bacteria deseada. Bajo el término de diferencial se entiende aquel medio que posee

algún componente que acentúa alguna característica “exclusiva” de la bacteria en

estudio de tal forma de poder “diferenciarla” del resto de las bacterias que pueda

crecer.

3.2.1- Medios líquidos de enriquecimiento selectivos y no selectivos

� Caldo BHI (Merck, Darmstadt, Alemania), composición:

Extracto de cerebro, corazón y peptona 27,5 gr,

D-glucosa 2,0 gr

Cloruro sódico 5,0 gr

Hidrógenofosfato di sódico 2,5 gr

Agar-agar 15,0 gr

� Caldo FDA (Merck, Darmstadt, Alemania), composición:

Peptona de caseína 17,0 gr

Peptona de harina de soja 3,0 gr

D-glucosa 2,5 gr

Cloruro sódico 5,0 gr

Hidrógenofosfato di potásico 2,5 gr

Extracto de levadura 6,0 gr,

Suplemento: acriflavina, cicloheximida, ac.nalidíxico.

� Agua peptonada ( Britania, Buenos Aires, Argentina), composición:

Peptona 10,0 gr

Cloruro de sodio 5,0 gr

Fosfato disódico 3,5 gr

42

Fosfato monopotásico 1,5 gr

3.2.2-Medios sólidos de aislamiento diferenciales y selectivos

� Agar Baird Parker (Merck, Darmstadt, Alemania), composición:


Extracto de carne 5,0 gr

Extracto de levadura 1,0 gr

Cloruro de litio 5,0 gr

Glicina 12,0 gr

Piruvato de sodio 10,0 gr

Agar 17,0 gr.

Aditivos : emulsión de yema de huevo con telurito.

� Agar Oxford ( Difco, Detroit, USA),composición:

Agar base Columbia 39,0 gr

Esculina 1,0 gr

Citrato de amonio férrico 0,5 gr

Cloruro de litio 15,0 gr

Agar 2,0 gr

Suplemento: cycloheximida, colistina, cefotetán, fosfomicina,acriflavina.

� Agar BPL ( Merck, Darmstadt, Alemania), composición:

Peptona de carne 5,0 gr


Extracto de carne 5,0 gr

Cloruro de sodio 3,0 gr

Hidrógenofosfato disódico 2,0 gr

Lactosa 10,0 gr

Sacarosa 10,0 gr

Rojo de fenol 0,08 gr

Verde brillante 0,0125 gr

Agar-agar 12,0 gr

43

� Agar Levine ( Difco, Detroit, USA), composición:

Peptona 10,0 gr

Lactosa 10,0 gr

Fosfato dipotásico 2,0 gr

Eosina 0,4 gr

Azul de metileno 0,065 gr

Agar-agar 15,0 gr

3.2.3- Otros reactivos utilizados

� Solución fisiológica (Rivero SRL, Buenos Aires, Argentina).

� Timol en polvo (Firmenich, Buenos Aires, Argentina)

3.3- Microorganismos utilizados

Se utilizaron para este estudio cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923,

Listeria monocytogenes ATCC 19114D, Salmonella Enteritidis obtenida de material

clínico y Escherichia coli de igual procedencia.

Las cepas fueron conservadas a 5ºC en pico de flauta de agar nutritivo y

repicadas periódicamente con el propósito de mantener su viabilidad .Los

aislamientos iniciales fueron realizados en un medio sólido diferencial y selectivo

apropiado para cada microorganismo.

� S. aureus fue aislado en agar Baird Parker (protocolo en estándar

internacionales: United States Pharmacopea XXI,1995;Internacional

Organization for Standarization-ISO, 1977/1978; Federación Internacional de

Lechería,1978) .

� L. monocytogenes fue aislada en agar Oxford (Protocolo 143 de IDF-FIL

para productos lácteos , 1990).

� S. Enteritidis fue aislada en agar Verde brillante-rojo de fenol-lactosa (BPL)

(protocolo sugerido por Kauffmann-1935) .

� E .coli fue aislada en agar Levine (Protocolo sugerido por Standard Methods

for the examination of Water and Wastewater-1975; United Status

Pharmacopoeia XXI-1985).

44

El enriquecimiento de cada colonia pura fue realizado en los caldos o medios

líquidos correspondientes: S. aureus en caldo cerebro-corazón (BHI), L.

monocytogenes en caldo de enriquecimiento FDA (Food and Drug Administration) y,

S. Enteritidis y E. coli en agua peptonada.

Aislamiento de S.aureus ATCC 25923 utilizados en este estudio, medio agar Baird

Parker.

Aislamiento de L.monocytogenes ATCC 19114D utilizados en este estudio, medio

agar

Oxford.

45

Aislamiento de S.Enteritidis aislada de material clínico utilizada en este estudio,

medio agar Verde brillante-rojo de fenol-lactosa.

Aislamiento de E.coli aislada de material clínico utilizada en este estudio, medio

agar Levine.

3.3.1 Caracterización de los microorganismos utilizados en este estudio

Las cepas provenientes de material clínico (materia fecal humana) fueron

tipificadas por el Instituto Nacional de Microbiología “Carlos G. Malbran”. Allí se

realizaron todas las pruebas microbiológicas y serológicas necesarias para su

clasificación taxonómica.

Las cepas de colección S.aureus ATCC 25923 (ATCC) y L.monocytogenes

ATCC 19114D fueron adquiridas comercialmente (Medicatec SRL, Bs As,

Argentina ).

46

3.4-Metodología

3.4.1- Preparación de los inóculos

Para cada una de las cepas, se aisló una colonia a partir del agar diferencial y

selectivo correspondientes (Figuras 2a, b, c y d). Dicha colonia se inoculó en 10 ml

de caldo de enriquecimiento (Materiales y Métodos, sección 3.2), el cual se incubó

durante 24 hs a 37ºC.

Para la elaboración de un inóculo madre, se tomó 0,5ml del inóculo de cada

microorganismo y se diluyó en 500 ml de agua peptonada alcanzando en todos los

casos una solución con un recuento aproximado de entre 105 y 107 UFC/ml .

3.4.2-Preparación de la solución de timol. Evaluación sensorial

Se hizo una prueba piloto de aceptación organoléptica con un panel de 5

personas (provenientes del laboratorio de trabajo) para establecer la máxima

concentración de timol aceptable desde el punto de vista sensorial. La preparación de

la solución de timol se realizó utilizando etanol como diluyente. Se evaluaron las

siguientes concentraciones en el queso untable base: 0,2; 0,3; 0,5 y 1 %.

Para cada concentración de timol, se pesaron 100 gr de queso untable base en

bolsas estériles (Whirl-pack, Nasco, U.S.A). Posteriormente, se añadió la solución

de timol necesaria para alcanzar la concentración deseada en el queso untable base y

se homogeneizó en stomacher durante dos minutos a baja velocidad. La degustación

de las muestras de queso untable base adicionadas con distintos niveles del

antimicrobiano se realizó en el sentido de concentraciones crecientes neutralizando

entre muestra y muestra con agua y en caso de ser necesario con grisines sin sal

(Lawless y Heymann, 1999). Se descartaron aquellas concentraciones que resultaban

inaceptables organolépticamente. Se seleccionó, para la realización del estudio, la

máxima concentración promedio aceptada por el panel de degustadores.

3.4.3- Inoculación del queso untable base

Se pesaron 160 gr. de en bolsa estéril (Whirl-Pack, Nasco, U.S.A) y se

agregaron 3,25 ml del inóculo madre, se homogeneizó en stomacher durante 2

47

minutos a baja velocidad. Las bolsas, conteniendo los 160 gr de queso inoculado y

0,48 gr de timol, se cerraron manualmente sacando todo el oxígeno remanente y se

almacenaron a las distintas temperaturas correspondientes en cada ensayo (5ºC-

25ºC) para su posterior análisis.

3.4.4- Recuento de microorganismos

De cada bolsa inoculada y almacenada a la temperatura correspondiente a la

experiencia se tomaron en los días de recuento10 gr de la muestra de queso, por

duplicado (duplicado de experiencia). Se agregaron 90 ml de agua peptonada a cada

bolsa y se homogeneizaron 2 minutos a baja velocidad en stomacher (Seward

Medical,Londres,UK) para asegurar un correcto mezclado.

A partir de dichos homogenatos se calcularon las diluciones correspondientes

como para lograr un recuento de no más de 100 colonias por placa y minimizar el

error de conteo. Se inocularon las placas de Petri, por duplicado (duplicado de placa)

realizando la metodología de recuento combinado.

Para la metodología del recuento combinado se tomó 1 ml del homogenato

presente en las bolsas agitadas en el stomacher, se distribuyó homogéneamente en 3

placas de Petri (0,33 ml en cada placa), se esparció con espátula de Drigalsky hasta

absorción total y se puso a incubar. El medio utilizado para las placas fue el agar de

aislamiento específico para cada microorganismo (Materiales y Métodos, sección

3.2.2). La incubación se llevo a cabo en incubadoras (Velp, Italia) a 37ºC ,el tiempo

correspondiente a cada experiencia. Se realizó el recuento informando UFC/gr.

3.5 Estudios realizados

3. 5.1 Estudio del efecto de la temperatura de almacenamiento

Se estudió el comportamiento de S. aureus en el queso untable (conteniendo

1000 ppm de sorbato de potasio) a temperatura de refrigeración: 5ºC y temperatura

de abuso térmico: 15ºC y se comparó con el comportamiento a las mismas

temperaturas pero en caldo nutritivo (BHI) a modo de tener un parámetro mas de

referencia.

48

La experiencia se llevó a cabo tal como se indica en el siguiente cuadro:

Matriz Temperatura de

almacenamiento

Días de recuento

Queso untable 5ºC 0,7,12,17 y 21

Queso untable 15ºC 0,3,5,7,10,12,14,17 y 19

BHI 5ºC 0,1,2,3,10,12 y 14

BHI 15ºC 0,2,5,9,12,13,y 14

3. 5.2 Estudio del efecto de la ausencia de sorbato de potasio (queso untable

base)

Matriz Temperatura de

almacenamiento

Días de recuento

Queso untable 15ºC 0,3,5,7,10,12,14,17 y 19

Queso untable base 15ºC 2,4,6,8,10,12,14 y 16

3. 5.3 Estudio sobre el efecto del pH

El pH del queso untable base se ajustó mediante la utilización de diferentes

volúmenes de jugo de limón. Se realizó de modo complementario una prueba de

aceptación organoléptica con un panel de 5 personas evaluando muestras de queso

untable base con su pH original (5,0-5,1) y en el rango de pH 4,1- 5.

Según el volúmen de jugo de limón agregado a 10 gr de queso untable base

se llegó a los siguientes valores de pH:

49

Volumen de jugo de limón agregado

(ml)

pH final medido

0,1 5,0

0,3 4,6

0,5 4,5

0,7 4,4

0,9 4,3

1,1 4,2

1,3 4,1

El valor de pH seleccionado fue el de menor valor organolépticamente

aceptado. Una vez ajustado el pH se procedió a preparar la matriz sobre la cual se

desarrollaría el estudio .Para dicho propósito se trabajo con el queso untable base a

dos pH: 5,0 y 4,3. Las condiciones de temperatura y pH y en las que se desarrolló

el presente estudio se detallan en la siguiente tabla:

Temperatura/pH Días de recuento

10ºC/ 5,0 0,5,7,12,20,25,30 y 40

15ºC/ 5,0 0,2,4,6,8,11,13,15 y 17.

22ºC/5,0 0,2,5,7,12,16,19,26,28,30,33 y 38

10ºC/ 4,3 0,20,40,50,60 y 65.

15ºC/ 4,3 0,3,7,11,14,17 y 19.

22ºC/ 4,3 0,2,6 y 20

50

3. 5.4 Estudio de reto microbiano

De acuerdo a la información aportada por la microbiología predictiva que

describe el comportamiento de los microorganismos en medio de cultivo en

determinadas condiciones de pH y temperatura, se intentó estudiar el

comportamiento de cuatro bacterias seleccionadas. En base a esta información se

elaboraron programas de estudio a 6, 17 y 25ºC.

La matriz utilizada fue queso untable base y las bacterias fueron S.aureus,

E.coli, S. Enteritidis y L.monocytogenes

Temperatura/pH Días de recuento

6ºC/ 5,0 0, 6, 13, 20, 27, 30, 33 y 36

17ºC/ 5,0 0, 2, 5, 8, 11, 12, 13 y 14

25ºC/ 5,0 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7

A cada día de recuento fueron removidas 2 bolsas de la cámara de

incubación y cada una fue sometida al estudio microbiológico descripto (Materiales

y Métodos, sección 3.4)

3. 5.5 Utilización de timol

Considerando el comportamiento observado en el apartado anterior se intentó

estudiar el comportamiento de los mismos microorganismos adicionando al queso

untable base un antimicrobiano natural compatible con este tipo de productos, timol,

componente principal del aceite esencial de orégano y observar así el efecto que el

mismo produce sobre su desarrollo.

El queso untable base fue adicionado con timol (0,3% p/p) y luego inoculado

con S.aureus ó S. Enteritidis (Materiales y Métodos, sección 3.4.3) y almacenados a

diferentes temperaturas. Los días de recuento (y temperaturas de almacenamiento)

fueron similares a los establecidos en el mismo ensayo pero en ausencia de timol a

51

los fines de poder realizar una comparación del comportamiento del microorganismo

ensayado. Se realizó el siguiente esquema de muestreo:

Matriz Microorganismo Temperatura/pH Días de recuento

Queso untable

base + 0,3%timol

S.aureus 6ºC/ 5,0

17ºC/ 5,0

25ºC/ 5,0

0,7,14,21,31,33 y 35

0,4,7,11,12,18 y 21

0,3,4,10,12,14 y 17

Queso untable

base + 0,3%timol

S.Enteritidis 17 ºC/ 5,0 0,2,7,9,13,14,15 y 20

3. 6 Obtención de curvas de crecimiento o supervivencia. Modelado matemático

En los casos en donde experimentalmente se observó crecimiento bacteriano

se graficó Log N en función del tiempo y en donde se observó muerte bacteriana se

graficó Tiempo en función de declinación logarítmica (Log decline) con el objeto de

obtener una mejor comparación con la información brindada por el programa

predictivo de modelado terciario Pathogen Modeling Program (Agricultural

Research Service, USDA; 2010).

3. 6. 1 Modelado primario

Se describe a continuación los modelos primarios utilizados en esta tesis.

3.6.1.1 Modelo para caracterizar curvas de crecimiento

La ecuación de Gompertz y su forma modificada fue usada primariamente en

el modelado de curvas asimétricas sigmoideas de crecimiento microbiano (Mc

Meekin y col. 1993). La ecuación de Gompertz (Zwietering y col., 1990; Gibson y

col. , 1987; Gibson y col., 1994) para describir crecimiento bacteriano se describe

como:

Log N = A + C exp (-exp ( - B (t – M ))) eq (1)

donde:

52

Log N: Log. decimal del recuento bacteriano a tiempo t

Los parámetros matemáticos estimados (A, B, C y M ) representan las

diferentes regiones de la curva pero no tienen un significado biológico (Figura 14).

Con el propósito de un mejor entendimiento y caracterización de la curva de

crecimiento, dichos parámetros pueden manipularse con el propósito de recalcular a

partir de ellos los parámetros biológicos tiempo de generación (TG): tiempo en que

se duplica la

Figura 14. Parámetros matemáticos de la ecuación de Gompertz

población; velocidad de crecimiento exponencial (VCE):velocidad en el punto de

inflexión de la curva y tiempo de fase lag (LAG): tiempo a partir del cual comienza

el crecimiento, según:

( ) ( ) ( ) ( )

( )( ) ( ) ( )

( ) )4(eqB1

MdíaLAG

3eq1exp

BCdía/g/UFCLogVCE

2eqBC

1exp2LogdíaTG

10

10

−=

=

⋅=

Lo

g N

(U

FC

/g)

Tiempo (día)

53

Los valores de los parámetros se pueden determinar por el ajuste de la función de

Gompertz a los datos experimentales por un procedimiento de estimación iterativa

que determine el mejor ajuste de acuerdo al criterio de los cuadrados mínimos.

3.6.1.2. Modelo para caracterizar curvas de supervivencia

La ecuación de Gompertz modificada para describir supervivencia o

inactivación bacteriana se describe como:

Log [Nt/N0] = C exp (-exp(A + Bt)) – C exp ( -exp(A)) eq (5)

donde

Log [Nt/N0]: fracción logarítmica de supervivencia

Los parámetros estimados (A, B y C) representan las diferentes regiones de

la curva de supervivencia ó inactivación (Figura 15). A: hombro de la curva de

muerte (día); B: velocidad máxima de muerte (1/día) y C: cambio total en el número

de sobrevivientes (-).

Figura 15. Parámetros de la ecuación de Gompertz modificada para muerte

54

3.6.2 Modelo terciario

El progreso logrado en el modelado microbiano ha sido importante y los

modelos presentados han logrado ser una herramienta de mucho valor para evaluar y

diseñar diferentes procesos en la industria alimentaria. Sin embargo no es posible aún

contar únicamente con estos modelos para determinar la seguridad de los alimentos y

sistemas. Las validaciones en laboratorio son aún necesarias para determinar

inequívocamente el crecimiento posible de microorganismos patógenos o su

supervivencia en los alimentos.

El Programa de modelado de patógenos ó su sinónimo en el habla inglesa,

Pathogen Modeling Program (PMP) fue desarrollado por los científicos Whiting y

Buchanan del Departamento de Agricultura de USDA. El mismo es de acceso

gratuito y ofrece una serie de menúes (Figuras 16 y 17) para la entrada del

microorganismo cuya conducta se desea evaluar; la selección de la atmósfera

(aeróbica ó anaeróbica); la población bacteriana inicial; pH; el nivel de cloruro de

sodio; la temperatura y la concentración de nitrito. Luego se puede elegir si se

quieren obtener los parámetros cinéticos, el tiempo estimado para alcanzar una dada

población ó un gráfico mostrando la curva. Las variables pueden ser modificadas

fácilmente permitiendo al usuario estimar que sucedería si las condiciones variaran.

Este programa provee un formato amigable que permite disponer de

modelos de respuestas para Salmonella, S.aureus, L.monocytogenes, S.flexneri,

B.cereus, A.hydrophila y E.coli O157:H7 (Buchanan, 1993).

El Servicio de Inspección y Seguridad Alimentaria de USDA ha utilizado

este modelo para asesorar sobre el crecimiento de microorganismos patógenos en

formulaciones de alimentos a base de carne. Los modelos, sin embargo, no

reemplazan completamente el test microbiológico experimental. Ellos permiten

realizar asesoramiento en cuanto a respuestas microbiológicas esperadas, objetivas y

más eficientes en cuanto a costos posibles.

55

Figura 16: Ejemplo de curva de crecimiento bacteriano

Figura 17: Ejemplo de curva de supervivencia bacteriana

56

3. 7 Análisis estadístico

Los ajustes del modelo de Gompertz y del modelo de Gompertz modificado

para muerte a los datos experimentales se validaron internamente mediante el

análisis de varianza y la aplicación de los siguientes tests (ver Apéndice ).

• Test F de significación de la regresión

• Cálculo del coeficiente de determinación corregido por grados de libertad

del sistema ( R2 aj.)

• Análisis de residuales

Todas las regresiones no lineales se analizaron utilizando el software

Statgraphics plus para Windows, versión 5.1 (Statistical Graphics corp., USA)

57

4. RESULTADOS

58

4.1 Estudios de microbiología predictiva en queso untable. Efecto de la temperatura de almacenamiento

En el presente estudio se evaluó mediante modelado primario la respuesta de

S.aureus en función del tiempo a 2 temperaturas 5 y 15°C, tal como se detalla en

Materiales y Métodos, sección 3.5.1. Una vez realizada la inoculación del queso

untable se almacenó a temperatura de refrigeración (5°C ) y temperatura de abuso

térmico (15°C ) durante 20 días. Cabe aclarar que en este primer estudio no se

evaluó la utilización del programa terciario de modelado de patógenos, PMP dado

que la matriz contenía sorbato de potasio, hecho que no es contemplado por dicho

programa. La Figura 1b muestra los resultados obtenidos. Adicionalmente, con el

propósito de disponer de un control se obtuvieron las curvas de respuesta de S.aureus

en caldo nutritivo (BHI) (Figura 1a).

El desarrollo de S. aureus en caldo BHI a 5°C y 15 °C durante 15 días de

almacenamiento (Figura 1a) resultó predecible dado que dichas temperaturas no son

óptimas para el desarrollo de este microorganismo. Pudo observarse que la

población se mantuvo aproximadamente constante a 5°C durante el almacenamiento,

con leve crecimiento a 15°C durante los primeros días para luego mantenerse

constante.

La población de S.aureus en queso untable (valor inicial ~ 1 x 10 7 UFC/g)

decreció conforme aumentó el tiempo de almacenamiento a las dos temperaturas

ensayadas (Figura 1b). En el caso de almacenamiento del producto a temperatura de

refrigeración (5°C), la inactivación alcanzó 2,0 ciclos logarítmicos en 19 días. En el

caso de almacenamiento del producto inoculado a temperatura de abuso térmico

(15°C), la inactivación fue menos pronunciada, alcanzando solo 1,5 ciclos

logarítmicos en aproximadamente 19 días.

Las curvas de supervivencia fueron modeladas con la versión modificada de

la ecuación de Gompertz para muerte microbiana (Linton y col., 1995) donde los

parámetros obtenidos A, B y C representan las diferentes partes de la curva: hombro

de la curva de muerte ( A), máxima velocidad de muerte (B) y cambio total en el

número de sobrevivientes (C) (Materiales y Método, sección 3.6.1.2).

59

Figura 1: Efecto de la temperatura de almacenamiento : 5°C (-■- ) y 15°C ( -■- ) en

el desarrollo de S.aureus inoculado en caldo BHI (a) y en queso untable (b); (I)

desvío estándar.

a

b

60

Este modelo se ha venido aplicando con éxito para caracterizar el

comportamiento de una variada gama de microorganismos y alimentos. Bhaduri y

col. (1991) fueron los primeros en demostrar que la curva descripta por la ecuación

de Gompertz modificada podía describir el comportamiento no lineal de curvas de

supervivencia en el caso de L.monocytogenes en pasta de salchichas.

Posteriormente, Linton y col. (1995) utilizaron exitosamente esta ecuación para

describir el comportamiento no lineal de L.monocytogenes y encontraron que esta

ecuación era efectiva para modelar curvas de supervivencia lineales y curvas de

supervivencia con región de hombro y cola.

Char (2006) estudió la respuesta de L.innocua en jugo de naranja combinando

tratamientos térmicos a diferentes temperaturas (57 a 61ºC) y adicionando diferentes

niveles de vainillina (0 a 1100 ppm). La ecuación de Gompertz modificada explicaba

más del 98% de las variaciones observadas .En general altas concentraciones de

vainillina combinada con tratamientos térmicos se traducían en curvas cercanas a la

linealidad con pequeños o ausentes hombros (con consecuentes bajos valores del

parámetro A) y altas tasa de muerte caracterizadas a través del parámetro B. Un

descenso en el parámetro B refleja una disminución en la resistencia microbiana.

Chhabra y col. (2002) obtuvieron similares respuestas cuando estudiaron la

respuesta de L.monocytogenes en cuanto a resistencia térmica (50, 60 y 65ºC) en

diferentes condiciones de pH y niveles de grasa en leche. Ellos también encontraron

que este modelo era muy versátil describiendo diferentes tipos de curvas de

inactivación (curvas cercanas a la linealidad, curvas con región de hombro y curvas

sigmoideas) con altos niveles de correlación.

Como puede observarse en la Figura 2, en el caso de S.aureus inoculado en

queso untable almacenado a 5ºC, el modelo ajustó correctamente con valores

predichos muy cercanos a los obtenidos experimentalmente. El análisis de la

varianza (Tabla 1) arrojó un coeficiente de determinación ajustado por grados de

libertad elevado, con lo cual se evidencia que el modelo pudo explicar un 73% de las

variaciones observadas en las repuesta con un valor del estadístico F significativo (α

< 0,05%). El análisis de valores observados vs. valores predichos mostró una

distribución homogénea alrededor

61

Figura 2: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de

S.aureus en queso untable almacenado a 5ºC, (�) valores experimentales; (—)

predicción .

Tiempo (día)

LogN

/N0

0 4 8 12 16 20 24-2,4

-2

-1,6

-1,2

-0,8

-0,4

0

Tabla 1: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros

característicos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable

almacenado a 5 ºC.

Parámetro Estimador Error Estándar

A 1,21 0,08

B -0,35 0,03

C -8,6 8,1

ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN

Fuente SS gl FISHER

MODELO 10,12 3 1348*

RESIDUAL 0,005 2

R2 ajustado 99,70

1SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (día) ; B : máxima velocidad de muerte (1/día) y C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).

de la diagonal mientras que la distribución de los residuales no mostró anomalías de

conos o herraduras (Apéndice)(Figura 3a y b).

62

Este modelo predijo un hombro inicial (A) de ~ 1 día; una velocidad de

muerte (B ) de 0,35 día-1 y un cambio global en el número de sobrevivientes que

cuadriplica al observado (C= 8,6), hecho que probablemente se deba a la ausencia de

una cola marcada en la curva de muerte (Alzamora y col,2010).

Ferrante y col. (2007) utilizó el modelo de Gompertz modificado para

modelar supervivencia de L.monocytogenes en jugo de naranja fresco (pH 3.5)

ultrasonicado (600 W,2 0 KHz, 95.2 µm de amplitud de onda; 45ºC). Este modelo

representó exitosamente las curvas de supervivencia de L.monocytogenes que

resultaron completamente sigmoideas y semi-sigmoideas dependiendo del

tratamiento. Estos autores también describieron la sobreestimación del parámetro C

para las condiciones más severas en donde combinaban 1000 y 1500 ppm de

vainillina mas tratamiento con ultrasonido dado que la población microbiana

disminuía muy rápidamente describiendo una curva sin cola.

Figura 3 : Validación interna del modelo propuesto para la inactivación de S.aureus

en queso untable almacenado a 5ºC: a) Valores observados vs valores predichos; b)

Residuales vs. valores predichos . (�) valores experimentales; (—) predicción.

valores predichos

valo

res

obse

rvad

os

-2,4 -2 -1,6 -1,2 -0,8 -0,4 0-2,4

-2

-1,6

-1,2

-0,8

-0,4

0

valores predichos

resi

dual

es

-2,4 -2 -1,6 -1,2 -0,8 -0,4 0-0,06

-0,04

-0,02

0

0,02

0,04

0,06

Cuando este modelo se utilizó para caracterizar la curva de supervivencia de

S. aureus en queso untable almacenado a 15°C, se observó que el mismo ajustó

correctamente con valores predichos muy cercanos a los obtenidos

experimentalmente (Figura 4). El análisis de la varianza (Tabla 2) arrojó un

coeficiente de determinación ajustado por grados de libertad elevado (98,6 %) , con

lo cual se evidencia que el modelo pudo explicar un importante % de las variaciones

observadas en las repuesta con un valor del estadístico F significativo (α < 0,05%).

El análisis de valores observados vs. valores predichos mostró una

(a) (b)

63

distribución homogénea alrededor de la diagonal mientras que la distribución de los

residuales no mostró anomalías de conos o herraduras (Figura 5 a y b). Este

modelo predijo para S. aureus inoculado en queso untable base almacenado a 15°C

un hombro inicial (A) de 4,55 días; una velocidad de muerte (B) de 0,39 día-1 y un

cambio global (C) de 1,55 ciclos, el cual es muy cercano al valor observado

experimentalmente.

Figura 4 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de

S.aureus en queso untable almacenado a 15ºC, (�) valores experimentales; (—)

predicción.

Tiempo (día)

LogN

/N0

0 4 8 12 16 20-1,8

-1,5

-1,2

-0,9

-0,6

-0,3

0

64

Tabla 2 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros


almacenado a 15 ºC.


A 4,55 0,17

B -0,39 0,04

C -1,65 2,97


Fuente SS gl FISHER

MODELO 6,49 3 432

RESIDUAL 0,03 6

R2 ajustado 98,59


Figura 5: Validación interna del modelo propuesto para la inactivación de S.aureus

en queso untable almacenado a 15 ºC: a) Valores observados vs valores predichos; b)

Residuales vs. valores predichos . (�) valores experimentales; (—) predicción.

valores predichos

Val

ores

obs

erva

dos

-1,8 -1,5 -1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0-1,8

-1,5

-1,2

-0,9

-0,6

-0,3

0

Valores predichos

Res

idua

les

-1,8 -1,5 -1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0-0,14

-0,09

-0,04

0,01

0,06

0,11

0,16

4.2 Estudio en queso untable base

Con el propósito de estudiar si la presencia de sorbato de potasio en el queso

untable afectaba el crecimiento de S. aureus, se trabajó con la misma matriz

alimentaria pero sin la presencia de este aditivo. La experiencia se realizó tal como se

(a) (b)

65

detalla en Materiales y Métodos, sección 3.5.2. Para ello se trabajó con la misma

cepa de S.aureus y una vez inoculado el queso untable base (sin agregado de 1000

ppm de sorbato de potasio) se procedió a incubarlo a 15ºC.

En este caso se observó un leve decaimiento de la población (1 ciclo

logarítmico en ~ 18 días). Este comportamiento fue similar al observado en queso

untable con la presencia de sorbato de potasio a igual temperatura de

almacenamiento (Figura 6).

Estos datos experimentales podrían estar indicando la falta de relación entre

el comportamiento observado de S. aureus en el queso untable y la presencia del

sorbato de potasio ya que en ausencia del mismo el perfil de supervivencia de la

población se mantuvo.

Figura 6: Comportamiento de S.aureus a 15ºC en queso untable sin (base, -▲-) y

con agregado de 1000 ppm de sorbato de potasio (-■-); (I) desvío estándar.

Con el propósito de caracterizar dichas curvas y de realizar una comparación

más cuantitativa, se aplicó el modelo de Gompertz modificado a las curvas de

inactivación de S. aureus en queso untable base (sin agregado de sorbato de potasio)

almacenado a 15°C, obteniendo los parámetros característicos del mismo, según la

metodología descripta en Materiales y Métodos, sección 3.6.1.2. La Figura 7

presenta las curvas de supervivencia predichas por el modelo, junto a los respectivos

datos experimentales. La Tabla 3 exhibe los parámetros estimados que representan

66

las diferentes regiones de la curva de supervivencia: el hombro inicial (A~ 5,9 días),

la máxima velocidad de muerte (B~ 0,5 día-1) y el cambio global en el número de

sobrevivientes (C~ 1,4 ciclos), junto a los estadísticos de ajuste del modelo. Se

obtuvo un R2 ajustado por grados de libertad 99%. El valor de F muy significativo

(α<0,01), demostró que el modelo fue apropiado para describir el comportamiento

observado. La validación interna determinó concordancia entre los valores

observados y predichos y una adecuada distribución de residuales (Figura 8 a y b).

Figura 7 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación

de S.aureus en queso untable base almacenado a 15ºC, (�) valores experimentales;

(—) predicción .

Tiempo (día)

Log

N/N

0

0 3 6 9 12 15 18-1,1

-0,9

-0,7

-0,5

-0,3

-0,1

0,1



base almacenado a 15 ºC.


A 5,88 1,84

B -0,43 0,15

C -1,35 0,22


Fuente SS gl FISHER

MODELO 1,95 3 325**

RESIDUAL 0,006 3

R2 ajustado 99,08 1SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día) ; B : máxima velocidad de muerte (1/día) y C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).

67

Figura 8 : Validación interna del modelo propuesto para la inactivación de S.aureus

en queso untable base almacenado a 15 ºC: a) Valores observados vs valores

predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (�) valores experimentales; (—)

predicción.

Valores predichos

Val

ores

obs

erva

dos

-1,1 -0,9 -0,7 -0,5 -0,3 -0,1 0,1-1,1

-0,9

-0,7

-0,5

-0,3

-0,1

0,1

Valores predichos

Res

idua

les

-1,1 -0,9 -0,7 -0,5 -0,3 -0,1 0,1-45

-25

-5

15

35

55(X 0,001)

El modelo de Gompertz modificado permitió mediante la adecuada

caracterización de las curvas de supervivencia establecer que la presencia de sorbato

de potasio no tuvo una influencia notoria en modificación de los parámetros A, B y

C que caracterizan a las curvas de supervivencia (Tablas 2 y 3).

Un estudio realizado utilizando diferentes bacterias patógenas tales como

E.coli O157:H7,Salmonella , L .monocytogenes y S. aureus (Roberts y col.,2002)

inoculadas en diferentes tipos de queso (mozzarella y cheddar) durante un período de

almacenamiento que rondó entre los 14 y los 50 días demostró que, en general, se

observó un decaimiento significativo de recuento bacteriano en el producto lácteo

(queso) con respecto al control que se puso de manifiesto a partir del día 14.

Roberts y col. (2002) describen que el sorbato (aditivo generalmente

reconocido como seguro) es uno de los más usados en la industria láctea como

preservante debido a su poder inhibitorio sobre microorganismos patógenos, no así

sobre flora fermentativa. También hace mención a situaciones en donde se observó

una ineficiente protección del mismo.

Si bien no se observaron diferencias notorias en la respuesta del

microorganismo de prueba (S. aureus) inoculado en ambas matrices, se decidió

evaluar los resultados posteriores de este trabajo utilizando como matriz, queso

untable base con el propósito de evitar introducir un agente de stress microbiano (tal

como es el uso de sorbato de potasio) y así poder estudiar la influencia de distintos

factores evaluados.

(a) (b)

68

4.3 Efecto combinado del pH y la temperatura de almacenamiento

Con el objeto de evaluar la influencia que el pH ejerce sobre el crecimiento

de S.aureus en el queso untable base se estudió su comportamiento a pH original

del queso (5,0) y un pH más bajo (4,3) pero organolépticamente aceptable tal como

se detalla en Materiales y Métodos, sección 3.5.3. Esta experiencia se llevó a cabo a

10, 15 y 22 °C.

En la Figura 9a se puede observar que hubo un decaimiento de la población

de S. aureus en queso untable base con pH 5,0 durante el almacenamiento a 10 y

15ºC pero se observó crecimiento de la misma a 22ºC. Puede observarse que la

reducción de pH a 4,3 (Figura 9b) provoca la muerte del microorganismo a las tres

temperaturas estudiadas siendo este descenso más pronunciado conforme aumenta la

temperatura.

Los resultados obtenidos muestran que el efecto a pH 4,3 resultó

desfavorable para el normal crecimiento de S. aureus coincidiendo con lo descripto

por Freitas y Malcata (2000), tanto a 10ºC ,como a 15ºC y 22ºC, quienes

observaron que tanto en quesos semi-duros como en quesos blandos elaborados con

leche de oveja la flora microbiana contaminante compuesta por diferentes géneros

de la familia Enterobacteriaceae y el género Staphylococcus disminuía lentamente.

La única flora constitutiva que se encontraba presente era la correspondiente a

Bacterias Ácido Lácticas (BAL) (predominantemente los géneros Lactococcus,

Lactobacillus y Leuconostoc) la cual, aumentaba su concentración desde un

recuento inicial aproximado de 106-107 UFC/g en el día 0 hasta aproximadamente

108 UFC/g luego de 20 días de maduración. Estos autores observaron también que

las BAL aumentaron su concentración desde el día 7 al 21 aproximadamente y luego

se estabilizaron a los 35 días de almacenamiento. Por el contrario, el género

Staphylococcus disminuía 2 ciclos logarítmicos a los 140 días.

Con un propósito predictivo y de comparación con los resultados

experimentales, se utilizó el programa de modelado de patógenos Pathogen

Modeling Program (PMP), tal como se describe en Materiales y Métodos, sección

3.6.2. En el queso untable base (pH 5,0) y almacenado a 10ºC se observó una

disminución de aproximadamente 4,5 ciclos logarítmicos en 40 días (Figura 9a).

Esta situación se contradice con lo predicho por el programa PMP, el cual

69

Figura 9 : Comportamiento de S. aureus en el queso untable base almacenado a

10ºC (-♦- ), 15ºC ( -■- ) y 22ºC ( -▲-). (a) pH 5,0; (b) pH 4,3; (I): desvío estándar.

a

b

70

establece crecimiento de S. aureus (en un caldo de cultivo) con una fase de latencia

de 10 días, aumento exponencial de la población hasta el día 35 y fase estacionaria a

partir de allí (Figura 10a).

En queso untable base almacenado a 15ºC, la respuesta de S.aureus fue

nuevamente de muerte a lo largo del tiempo de almacenamiento pero con una

reducción de 1 ciclo logarítmico en 22 días contradiciéndose nuevamente con lo

predicho por el programa PMP (Figura 10 b).

La Figura 10c muestra la curva de crecimiento de S. aureus en queso untable

base (pH 5,0) a 22ºC junto a los datos predichos mediante la aplicación del

programa predictivo PMP. En la misma se observa que el comportamiento de S.

aureus a 22°C, predicho por el programa PMP determina que la fase de crecimiento

exponencial comienza inmediatamente (sin período de fase lag) y termina en el día 5,

mientras que experimentalmente se observó que el crecimiento exponencial

comienza a partir del día 12 (tiempo de fase lag) y termina aproximadamente el día

28. Es decir que, si bien hay coincidencia en los valores observados y predichos para

este microorganismo en las condiciones estudiadas, se produce un corrimiento en el

tiempo ya que el comportamiento en la matriz alimentaria presenta un período de

adaptación inicial que retrasa el crecimiento exponencial.

Si bien este software predictivo es de muchísima utilidad en sistemas simples

(como los sistemas modelo y medios de cultivo), en alimentos reales podría fallar

dado que los factores intrínsecos propios del alimento así como también las

interacciones que pudieran derivar entre ellos y los microorganismos (se trate de

sinergismos o antagonismos) alteran la respuesta observada y la alejan de la

predicción. En todo modelo predicho el comportamiento bacteriano está descripto

para un medio de cultivo con los nutrientes óptimos para permitir, si fuera factible, el

crecimiento bacteriano. Esta es posiblemente la causa por la que no se observó

concordancia con la predicción (Whiting, 1997).

71

Figura 10 : Comportamiento de S.aureus en el queso untable base a pH 5,0 y

diferentes temperaturas de almacenamiento. (a): 10º C, (b): 15ºC y (c): 22ºC . ( ▬ )

predicción , ( --- ) limite de confianza superior predicho, ( --- ) limite de confianza

inferior predicho, (-♦- ) datos experimentales; (I) desvío estándar.

b

c

a

72

Los modelos matemáticos usualmente se realizan con una mezcla de 3 a 5

cepas “típicas” (Whiting, 1997). De esta forma estos modelos predichos se traducen

muchas veces en rápido crecimiento o por decirlo de otra forma en cepas de fácil

desarrollo. Este mecanismo tiene la ventaja de que el modelo se convierta en un

sistema “seguro”. Pero existe una diversidad natural en los tiempos de crecimiento o

supervivencia de cepas de microorganismos patógenos. La otra fuente de variación

no incluída en los modelos existentes es el estado fisiológico de la cepa y su historia

previa. Hudson (1993) ha demostrado que la duración de la fase lag de Aeromonas

hydrofila depende de la temperatura a la cual la cepa estaba sometida o mantenida en

su estadío previo y de la nueva temperatura en la cual la cepa se encuentra en el

alimento que ha contaminado. En cambio la fase de crecimiento exponencial

posterior a la finalización de la fase lag no es afectada por la temperatura previa. Un

patógeno en un determinado alimento adaptado a temperatura de refrigeración en una

planta de procesamiento a 10ºC presentará una fase lag más corta y un comienzo más

temprano del crecimiento exponencial ,si accidentalmente contamina ese mismo

alimento refrigerado, que la que debería observarse en un modelo corriente. Baranyi

y Roberts (1994) consideraron que la fase lag es una consecuencia de dos procesos,

el primero reflejado por el estado previo en el que se encontraba la bacteria (por

ejemplo temperatura) y el segundo dependiente del grado de ajuste de un ambiente

(fisiológica y bioquímicamente) al siguiente ambiente o medio intrínseco.

Con el propósito de determinar estadísticamente la influencia de la variable

temperatura se realizó un análisis cuantitativo. Dado que a pH 5,0 se observó

decaimiento de la población durante el almacenamiento a 10 y 15 °C se

caracterizaron dichas curvas mediante la utilización del modelo primario antes

descripto: Gompertz modificado.

En el caso en donde se trabajó con queso untable base (pH 5,0) inoculado y

almacenado a una temperatura de almacenamiento de 10ºC se observó que el modelo

ajustó adecuadamente a los datos experimentales (Figura 11) con un coeficiente de

determinación R2 de 99%. La Tabla 4 muestra los parámetros A, B y C que

caracterizan a la curva así como también la significación del modelo (F = 927 muy

significativo, α<0,01). La validación interna (Figura 12a y b) del modelo propuesto

mostró concordancia entre los datos experimentales y predichos así como también

73

una distribución homogénea de los residuales. Como puede analizarse el modelo

predijo la ausencia de hombro inicial (A= - 0,16 días); una velocidad de muerte de

0,05 día-1 y un cambio global (C) de 9,4 ciclos. Al parecer este modelo falló en la

predicción de la caída total observada y esto pudiera deberse a la ausencia de una

cola marcada en los datos experimentales, hecho que ya ha sido comentado.


S.aureus en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 10ºC, (�) valores

experimentales; (—) predicción .

Tiempo (día)

Log

N/N

0

0 10 20 30 40-4,4

-3,4

-2,4

-1,4

-0,4

0,6





A -0,16 1,17

B -0,05 0,03

C -9,38 8,64


Fuente SS gl FISHER

MODELO 55,61 3 927**

RESIDUAL 0,12 5

R2 ajustado 99,01


74

Figura 12 : Validación interna del modelo propuesto para la inactivación de

S.aureus en queso untable base almacenado a 10 ºC: a) Valores observados vs

valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (�) valores experimentales;

(—) predicción.

Valores predichos

Val

ores

obs

erva

dos

-4,4 -3,4 -2,4 -1,4 -0,4 0,6-4,4

-3,4

-2,4

-1,4

-0,4

0,6

Valores predichosR

esid

uale

s-4,4 -3,4 -2,4 -1,4 -0,4 0,6

-0,28

-0,18

-0,08

0,02

0,12

0,22

0,32

El análisis correspondiente a queso untable base (pH 5,0) inoculado y

almacenado a 15ºC fue efectuado en el ítem anterior (sección 4.2, Tabla 3) en donde

se obtuvo en comparación con la temperatura anterior evaluada, 10 °C, un hombro

inicial mayor (A= 5,9 días), una velocidad de muerte similar (B = - 0,43 d-1) y un

cambio global en el numero de sobrevivientes significativamente menor (C = 1,4),

hecho que está de acuerdo con el establecimiento de una temperatura más propicia

para el desarrollo del microorganismo.

A 22°C se observó crecimiento de S. aureus en queso untable base (pH 5,0).

Dado que el comportamiento observado no fue lineal, se caracterizó la curva

mediante el modelo de Gompertz (Figura 13), obteniendo los parámetros

matemáticos característicos del mismo: A, B, C y M.

Tal como se describió en Materiales y Métodos, sección 3.6.1.1 con los

valores matemáticos de los parámetros correspondientes a la curva se obtuvieron los

parámetros biológicos tiempo de generación (TG); velocidad de crecimiento

exponencial (VCE) y tiempo de fase lag (LAG). La Figura 13 muestra una adecuada

correlación entre los datos experimentales y los predichos por este modelo primario.

(a) (b)

75

Figura 13: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de crecimiento de

S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 22ºC, (�) valores

experimentales; (—) predicción

Tiempo (dia)

Log

N

0 10 20 30 404,1

5,1

6,1

7,1

8,1

9,1

La Tabla 5 resume el análisis de la varianza para el modelo propuesto. El

valor de F para la regresión completa resultó muy significativo (α< 0,01) indicando

que existe una relación estadísticamente significativa entre la respuesta observada y

el modelo. El valor del coeficiente de determinación (R2) ajustado por grados de

libertad indica que casi el 95,8 % de la variación de la respuesta ha sido explicada

por el modelo propuesto. La Tabla 5 también presenta a los fines comparativos los

valores de TG; VCE y LAG predichos por el programa terciario PMP para el

microorganismo y condiciones estudiadas.

Se realizó también validación interna del modelo mediante métodos gráficos,

los cuales se presentan en la Figura 14. El gráfico de valores observados versus los

valores predichos (Figura 14 a) presenta una distribución homogénea alrededor de

la diagonal, con puntos muy cercanos a la misma, indicando alta correlación entre los

mismos. Cuando se graficaron los residuales en función de los valores predichos

(Figura 14b) se observó una distribución homogénea de los mismos en una banda

horizontal alrededor de la predicción sin detectar conos o herraduras. Por todo lo

expuesto, se concluyó que no existe razón para dudar que el modelo propuesto sea

adecuado para describir la respuesta observada.

76

Figura 14 : Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de

S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 22 ºC: a) Valores observados



Valores predichos

Va

lore

s ob

serv

ado

s

4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,54,1

5,1

6,1

7,1

8,1

9,1

Valores predichos

Re

sidu

ale

s

4,1 5,1 6,1 7,1 8,1 9,1-0,6

-0,4

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

Tabla 5: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos experimentales y

sus respectivos parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de

S.aureus en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 22 ºC


A 4,54 0,18

B 0,14 0,05

C 4,43 0,73

M 18,60 1,70

ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN 1

Fuente SS gl FISHER3

MODELO 510,35 4 981**

RESIDUAL 1,02 8

R2 ajustado 95,85

PARAMETROS BIOLÓGICOS2

Gompertz PMP

TG (día) 1,17 0,10

VCE (Log UFC/g/día) 0,26 1,35

LAG (día) 18 0,67

1 SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de determinación ajustado por grados de libertad.2 TG: tiempo de generación; VCE: velocidad de crecimiento exponencial; LAG: tiempo de fase lag.3NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy significativo al 1%.

(a) (b)

77

El análisis de la Tabla 5 determina que comparando los parámetros

biológicos característicos de la curva de crecimiento de S. aureus en queso base (pH

5,0; 22 °C) adecuadamente estimados por el modelo de Gompertz con la estimación

del programa PMP puede verse que, este programa predice escaso tiempo de latencia

(0,7 días vs. 18 días); triplica la velocidad de crecimiento exponencial respecto de la

observada (1,4 Log UFC/g/día vs 0,3 Log UFC/g/día) y disminuye notoriamente el

tiempo de generación respecto del observado (0,1 día vs 1,2 días). Si bien la

temperatura favorece el crecimiento del microorganismo el alimento real no ofrece

en este caso condiciones tan favorables como el medio de cultivo probablemente

debido a la presencia de flora competitiva y/o posibles inhibidores.

El análisis del comportamiento predicho por el programa PMP para la

supervivencia de S. aureus en queso untable base con pH reducido (4,3) a 10, 15 y 22

°C se exhibe en la Figura 15 junto a los datos experimentales observados.

Se observa que a 10ºC los datos experimentales siguen un comportamiento

similar que el predicho por el programa PMP considerando los límites de confianza

superior e inferior (Figura 15a). Hasta el día 20, la caída en ciclos logarítmicos en

función del tiempo es perfectamente coincidente con el modelo. A partir de allí y

hasta el día 40 se observa que experimentalmente el decrecimiento de la población se

detiene registrándose una mayor pendiente lo que significa que la muerte del

microorganismo se desacelera. Aún así el comportamiento bacteriano experimental

entra dentro del rango predicho por el modelo. Para el tiempo de almacenamiento

evaluado (~ 40 días) el programa PMP predice, en promedio, una declinación de 4

ciclos logarítmicos.

A 15ºC (Figura 15 b) se observa que el programa PMP no predice

decaimiento hasta el día 10 (1 ciclo logarítmico). Los datos experimentales

demostraron que hubo un decaimiento de 3 ciclos logarítmicos en 14 días mientras

que el programa PMP predice un decaimiento igual en 29 días. Esta tendencia se

mantuvo conforme fue transcurriendo el tiempo de almacenamiento.

Algo similar se observó a 22ºC (Figura 15 c) en donde los datos

experimentales demostraron una caída de 4 ciclos logarítmicos en 18 días mientras

que el programa PMP predice la misma caída en 30 días.

78

Figura 15: Comportamiento de S.aureus a pH 4,3 y 10º C(a), 15ºC (b) y 22ºC (c):

(▬) predicción , ( --- ) límite de confianza superior predicho, ( --- ) límite de

confianza inferior predicho ,(-♦- ) datos experimentales.

a

b

c

79

Si bien en las experiencias de reto microbiano realizadas en queso untable

base con pH reducido (pH 4,3) se dispuso de escasos puntos experimentales se

realizó un modelado primario solo con el fin de orientar sobre los parámetros

característicos de las curvas obtenidas a 10, 15 y 22 °C y comparar con la predicción

del programa PMP.

A 10ºC se observó que el modelo de Gompertz modificado para

supervivencia ajustó adecuadamente los datos experimentales (Figura 16). El

análisis de la varianza (Tabla 6) estimó un valor de coeficiente de determinación R2

de 99,99% con un valor de F muy significativo (F = 8,4x108; α<0,001). El modelo

fue validado internamente observando una distribución homogénea en torno a la

línea diagonal de valores experimentales vs. valores predichos y desestimando

anomalías en la distribución de residuales (Figura 17 a y b). En estas condiciones, el

modelo estimó un hombro inicial de 3 días (A); una velocidad de muerte (B) de 0,17

día-1 y un cambio global en el número de sobrevivientes al final del almacenamiento

de 3,6 ciclos logarítmicos (C), siendo este valor algo inferior a la caída predicha por

el PMP (~ 4 ciclos logarítmicos, Figura 15a).


de S.aureus en queso untable base (pH 4.3) almacenado a 10ºC, (�) valores


Tiempo (día)

Log

N/N

0

0 10 20 30 40-3,5

-2,5

-1,5

-0,5

0,5

80



S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 10 ºC


A 2,91 1,0x104

B -0,17 0,9x103

C -3,56 0,5x104


Fuente SS gl FISHER

MODELO 25,25 3 8,4x108**

RESIDUAL 1,0x10-8 1

R2 ajustado 99,99

1SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día) ; B : máxima velocidad de muerte (1/día) y C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -)

Figura 17: Validación interna: Análisis estadístico del modelo propuesto para el

crecimiento de S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 10 ºC: a)

Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (�)

valores experimentales; (—) predicción

Valores predichos

Val

ores

obs

erva

dos

-3,5 -2,5 -1,5 -0,5 0,5-3,5

-2,5

-1,5

-0,5

0,5

Valores predichos

Res

idua

les

-3,5 -2,5 -1,5 -0,5 0,5-8

-4

0

4

8(X 0,00001)

A 15ºC el modelo primario de Gompertz modificado ajustó adecuadamente

con un valor de R2 de 94% con un F muy significativo (Figura 18 y Tabla 7) .Esto

indicaría que el modelo explica el 94% de las diferencias encontradas.

(a) (b)

81


S.aureus en queso untable base (pH 4.3) almacenado a 15ºC, (�) valores


Tiempo (día)

Log

N/N

0

0 3 6 9 12 15-3

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

El análisis de validación interna (Figura 19 a y b), mostró una distribución

homogénea de los datos experimentales alrededor de los datos predichos y una

distribución sin alteraciones de los residuales en torno a una banda horizontal.

Este modelo predijo un hombro inicial (A) cercano a los 2 días mientras que

en la práctica éste resulto de aproximadamente 3 días. El parámetro C en ambos

casos rondó los 3 ciclos logarítmicos en 15 días de almacenamiento y no se observó

cola ya que la predicción es que la caída en ciclos logarítmicos continúa conforme

transcurre el tiempo.

82





A 1,60 0,90

B -0,20 0,17

C -3,89 2,14


Fuente SS gl FISHER

MODELO 14,76 3 49**

RESIDUAL 0,20 2

R2 ajustado 94,12

1SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día) ; B : máxima velocidad de muerte (1/día) y C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).

Figura 19: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus

en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 15 ºC: a) Valores observados vs


(—) predicción.

Valores predichos

Val

ores

obs

erva

dos

-3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0-3

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

Valores predichos

Res

idua

les

-3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0-0,26

-0,16

-0,06

0,04

0,14

0,24

0,34

El análisis de la aplicación del modelo de Gompertz modificado a la curva de

supervivencia de S. aureus en queso untable base con pH reducido (pH 4,3) y 22°C

mostró que el mismo ajustó adecuadamente a los datos experimentales (Figura 20 y

Tabla 8). El modelo representó en un 99,9 % la variación en la respuesta observada

con la obtención del estadístico F muy significativo (α<0,01). La validación interna

(a) (b)

83

realizada no mostró anomalías (Figuras 21 y 22). El modelo no predijo, tal como se

observó experimentalmente, un hombro inicial (A); predijo una velocidad de muerte

de 0,3 día-1 y un cambio global en el número de sobrevivientes (C) en 18 días de

almacenamiento muy superior al observado experimentalmente (9 vs 4). Ya se ha

comentado la debilidad de este modelo para predecir un salto en el número de

sobrevivientes cuando la curva de supervivencia carece de cola marcada. Otros

autores han observado igual desenvolvimiento del modelo en otros sistemas

alimenticios estudiados.


de S.aureus en queso untable base ( pH 4.3) almacenado a 22ºC, (�) valores


Tiempo (día)

Log

(N/N

0)

0 4 8 12 16 20-4

-3

-2

-1

0

84





A -0,49 0,25

B -0,27 0,01

C -8,80 1,62


Fuente SS gl FISHER

MODELO 26,95 3 22458**

RESIDUAL 0,0004 1

R2 ajustado 99,98%

1SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día) ; B : máxima velocidad de muerte (1/día) y C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).


en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22 ºC: Valores observados vs valores

predichos;

Valores predichos

Val

ores

obs

erva

dos

-4 -3 -2 -1 0-4

-3

-2

-1

0

85


en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22 ºC:Residuales vs. valores predichos

. (�) valores experimentales; (—) predicción

Valores predichos

Res

idua

les

-4 -3 -2 -1 0-17

-7

3

13

23(X 0,001)

Ferrante y col. (2007) observaron que el valor del parámetro C estaba

sobreestimado para las condiciones más severas de su experiencia en jugo de naranja

tratado con ultrasonido y crecientes concentraciones de vainillina a modo de inhibir

el crecimiento de L.monocytogenes.

Linton y col. (1995) evaluaron la resistencia térmica de L.monocytogenes en

fórmulas de alimentos infantiles tratadas a 50, 55 y 60ºC, pH cuyos valores

ascendían de 5 a 7 y a concentraciones crecientes de NaCl (0,2 a 4 %).Estos autores

observaron que conforme al aumento de temperatura se producía aceleración de la

muerte bacteriana describiendo curvas con escasa o nula región de hombro y cola. El

modelo sobreestimó el parámetro C.

86

4.4 Estudio de reto microbiano en queso untable base utilizando cepas

responsables de ETA.

4.4.1 S.aureus

Una vez evaluado el comportamiento de S.aureus en queso untable base

frente a las diferentes variables estudiadas (temperatura, presencia de conservante y

pH) se procedió a estudiar de manera análoga el comportamiento de cuatro

bacterias distribuidas en el medio ambiente, fuertemente relacionadas con

enfermedades transmitidas por alimentos y frecuentemente encontradas en productos

lácteos: S.aureus, E.coli, S. Enteritidis y L.monocytogenes (Araujo y col., 2002). La

experiencia se llevó a cabo tal como se describe en Materiales y Métodos, sección

3.5.4, en primer lugar, inoculando S.aureus en queso untable base y almacenando

dicho producto a 6, 17 y 25°C para su posterior análisis.

Se observó un decrecimiento no lineal de la población de S. aureus a 6ºC y

17ºC (Figura 23). A 25ºC, el comportamiento del mismo fue de neto crecimiento

describiendo una curva algo sigmoidea. Todos estos datos resultaron coincidentes

con los ensayos anteriormente descriptos a temperaturas similares (10°C; 15ºC y

22ºC) (Figura 9a ).

La Figura 24a muestra la predicción por modelado terciario (programa PMP)

del comportamiento de este microorganismo en un medio de cultivo pH 5,0

almacenado a 6°C, junto a los datos experimentales. El programa predice, en

coincidencia con lo observado, un decrecimiento de la población. La muerte de este

microorganismo en el queso untable base fue más rápida que la predicción promedio

en un medio de cultivo a un dado tiempo de almacenamiento, más cercana al límite

inferior predicho.

De la misma manera la Figura 24b muestra que en queso untable base

almacenado a 17ºC y pH 5.0, mientras experimentalmente se observó muerte de este

microorganismo, el programa de modelado de patógenos, PMP predice el

crecimiento del mismo. Las bacterias ácido-lácticas presentes en quesos son

generalmente inhibitorias del crecimiento de S.aureus (Jorgensen y col., 2005). El

pH y la presencia de flora láctica competitiva son factores importantes que

probablemente afecten la presencia del patógeno ensayado (Ercolini y col., 2005).

87

Figura 23: Evaluación del comportamiento de S.aureus en queso untable base, pH

5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6ºC (-♦- ), 17ºC ( -■- ) y 25ºC ( -

▲-); (I) desvío estándar.

La eficacia de los organismos competidores para controlar el crecimiento

depende de la proporción del competidor con respecto a las células de

microorganismo en cuestión (en este caso, S.aureus), del tipo de competidor, de la

temperatura y del sustrato de crecimiento. El efecto de los competidores en la

inhibición del crecimiento de S.aureus es muy variable, dependiendo del organismo

y de la cepa. Las interacciones de los factores extrínsecos e intrínsecos sobre el

crecimiento, sobre la supervivencia y sobre la muerte de S.aureus limitan el

crecimiento a temperaturas sub-óptimas y retardan el crecimiento a temperaturas

óptimas (ICMSF, 1996)

A 25ºC, se observó que los datos experimentales describían un

comportamiento similar al predicho por el programa PMP pero con una fase de

latencia mayor, dato concordante con la necesidad de las células de S.aureus de

llegar a una situación de equilibrio o situación amigable con los factores intrínsecos

de la matriz alimentaria (Figura 24c).

88

Figura 24: Comportamiento predicho de S.aureus a pH 5,0 y 6º C (a), 17ºC (b) y

25ºC (c) : ( ▬ ) predicción, ( --- ) límite de confianza superior predicho, ( --- ) límite

de confianza inferior predicho, (-♦-) datos experimentales.

a

b

c

89

Dado que las curvas cinéticas obtenidas exhibieron un comportamiento no

lineal, se realizó una evaluación cuantitativa de las mismas mediante la aplicación

de modelado primario (Materiales y Métodos 3.6.1). Se aplicó los modelos de

Gompertz en el caso en donde se observó crecimiento (25°C) y de Gompertz

modificado en los casos de muerte (6 °C y 17°C).

En las Figuras 25 y 27 se observa que la aplicación del modelo de Gompertz

modificado representó adecuadamente el comportamiento de S.aureus en queso

untable base almacenado a 6ºC y 17°C, respectivamente. Las Tabla 9 y 10

exhiben los parámetros A, B y C característicos del modelo junto a los estadísticos

relacionados. Los ajustes logrados fue satisfactorios, obteniéndose valores de R2

ajustado entre 93% y 96 % con valores de F significativos (α<0.05). El análisis de

los valores observados vs valores predichos (Figuras 26a y 28a) demostró que hubo

una adecuada correlación entre los mismos. La distribución de residuales en torno a

los valores predichos (Figuras 26b y 28b) fue homogénea no detectando

esparcimiento en forma de herradura ó cono.


S.aureus en queso untable base almacenado a 6ºC, (�) valores experimentales; (—)

predicción

Tiempo (día)

Log(

N/N

0)

0 10 20 30 40-3,4

-2,4

-1,4

-0,4

0,6

90



base (pH 5.0) almacenado a 6 ºC


A -1,17 0,43

B -0,06 0,006

C -14,43 1,27



MODELO 39,38 3 146*

RESIDUAL 0,38 4

R2 ajustado 93,00

1SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de determinación ajustado por grados de libertad. 2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (día) ; B : máxima velocidad de muerte (1/día) y C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).

Figura 26: Validación del modelo propuesto para la inactivación de S.aureus en

queso untable base almacenado a 6 ºC: a) Valores observados vs valores predichos;

b) Residuales vs. valores predichos . (�) valores experimentales; (—) predicción

Valores predichos

Val

ores

obs

erva

dos

-3,4 -2,4 -1,4 -0,4 0,6-3,4

-2,4

-1,4

-0,4

0,6

Valores predichos

Res

idua

les

-3,4 -2,4 -1,4 -0,4 0,6-0,49

-0,29

-0,09

0,11

0,31

0,51

(a) (b)

91


S.aureus en queso untable base almacenado a 17ºC, (�) valores experimentales; (—)

predicción.

Tiempo (día)

Log(

N/N

0)

0 4 8 12 16 20-1,9

-1,5

-1,1

-0,7

-0,3

0,1





A -0,39 0,096

B -0,46 0,073

C -3,44 0,74



MODELO 15,65 3 261**

RESIDUAL 0,07 4

R2 ajustado 96,00% 1SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día); B : máxima velocidad de muerte (1/día) y C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).

92

Figura 28 : Validación del modelo propuesto para la inactivación de S.aureus en

queso untable base almacenado a 17 ºC: a) Valores observados vs valores predichos;

b) Residuales vs. valores predichos . (�) valores experimentales; (—) predicción.

Valores predichos

Val

ores

obs

erva

dos

-1,9 -1,5 -1,1 -0,7 -0,3 0,1-1,9

-1,5

-1,1

-0,7

-0,3

0,1

Valores predichos

Res

idua

les

-1,9 -1,5 -1,1 -0,7 -0,3 0,1-0,22

-0,12

-0,02

0,08

0,18

0,28

Nuevamente el modelo de Gompertz modificado falló en predecir la caída

global del numero de sobrevivientes a 6 °C (C=14,4 ciclos) donde la curva

experimental no presenta cola marcada con un descenso final a 34 días de

almacenamiento de ~3,4 ciclos logarítmicos. Esto no ocurrió a 17°C donde la

predicción de la caída global (C=3,4) fue más cercana a la observada

experimentalmente (~ 2 ciclos) debido a la presencia de una fracción importante de

microorganismos resistentes. Roberts (2002) observó caídas similares de la

población de S. aureus en queso cheddar (pH 5,4) y en mozzarella (pH 5,3) sin

agregado de sorbato de potasio y almacenados a 10°C, de entre 2,4 y 4 ciclos

logarítmicos, respectivamente.

Ambas condiciones de almacenamiento provocaron que la curva de muerte de

este microorganismo no presentara hombro inicial (valores negativos de A). La

velocidad de muerte fue algo mayor a 17°C (B = - 0,46 día-1) , hecho que

probablemente se atribuya a que a esta temperatura se observó un descenso constante

de la población durante todo el período de almacenamiento ensayado, hecho que

podría atribuirse a una mayor proliferación a esta temperatura de flora competitiva.

En el caso del comportamiento de S.aureus en queso untable base

almacenado a 25ºC se observó crecimiento. Se aplicó el modelo de Gompertz

modificado (Figura 29) obteniendo los parámetros característicos del mismo,

(a) (b)

93

encontrándose que la aplicación de este modelo representó adecuadamente su

comportamiento.

Tal como se describió en Materiales y Métodos, sección 3.6.1.1 con los

valores matemáticos de los parámetros correspondientes a la curva se obtuvieron los

parámetros biológicos. Se determinaron por el ajuste de datos a la función de

Gompertz por un procedimiento de estimación iterativa que determinó el mejor

ajuste (Tabla 11). Al observarse una correcta representación del modelo se

asimilaron dichos parámetros biológicos como los característicos de la curva

experimental. El elevado valor de R2 ajustado, indica que el modelo ajustó

adecuadamente a los datos experimentales, pudiendo explicar el 98,5 % de las

variaciones en la respuesta observada. Asimismo, el estadístico F resultó muy

significativo (α≤0,01) lo que confirma que las variaciones de la información

explicada por el modelo es significativamente mayor que la variación debida a

causas no identificables y que el efecto observado no se debió al azar. En el gráfico

de valores observados vs valores predichos (Figura 30a) se observa que hubo una

adecuada correlación .Los distribución de residuales (Figura 30 b) también fue

homogénea entorno a los valores predichos.

Se realizó finalmente el estudio comparativo de los datos biológicos tiempo

de generación (TG), fase de latencia (LAG) y crecimiento exponencial (VCE),

calculados a partir de los parámetros extraídos de la ecuación de Gompertz con los

valores predichos por el programa de modelado terciario, PMP.

En el caso de S.aureus inoculado en queso crema base almacenado a 25ºC, se

observa que el tiempo de generación, predicho por PMP fue 0,07 días mientras que

el predicho por el modelo primario fue 0,54 días. Ambos modelos, en concordancia,

predijeron TG inferiores a 1 día aunque, como es de esperar algo menor en el caso de

la predicción medio de cultivo donde no se considera la presencia de flora

competitiva y/o inhibidores (Tabla 11). Ambos modelos coincidieron en la

predicción de la velocidad de crecimiento. La fase de latencia predicha por el modelo

primario fue superior (5días) a la estimación del programa PMP (0,42 días). La fase

de latencia representa el tiempo de ajuste que necesita el inóculo desde la fase de pre-

incubación en su medio de cultivo

94


S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25ºC, (�) valores


Tiempo (dia)

Log

N

0 3 6 9 12 15 185

6

7

8

9





A 5,11 0,12

B 1,41 0,30

C 2,79 0,18

M 6,42 3,29



MODELO 313,63 4 2613** RESIDUAL 0,09 3 R2 ajustado 98,46


Gompertz PMP

TG (día) 0,54 0,07


LAG (día) 5,0 0,42

1SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy significativo al 1%.

95


en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 ºC: a) Valores observados vs

valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos. (�) valores experimentales;

(—) predicción

Valores predichos

Val

ore

s o

bse

rvad

os

5,1 5,6 6,1 6,6 7,1 7,6 8,15

6

7

8

9

Valores predichos

Re

sid

ua

les

5 6 7 8 9-0,19

-0,09

0,01

0,11

0,21

óptimo y la nueva fase, probablemente menos favorable, con otras condiciones

intrínsecas (pH, nutrientes, flora extra, etc) .La duración de la fase de latencia

depende de ambas situaciones : la primera situación de crecimiento en el medio de

cultivo y la nueva situación de crecimiento en el queso (Hudson,1993).

(a) (b)

96

4.4.2 E. coli

Los datos experimentales correspondientes al desarrollo de E. coli en queso

unatble base a 6ºC; 17ºC y a 25ºC mostraron un comportamiento similar al

observado con S.aureus (Figura 31).

Utilizando el programa de modelado terciario PMP se observó que, en el caso

de temperatura de almacenamiento 6ºC, el mismo predice una disminución de la

población de E. coli en medio de cultivo, de forma coincidente con los datos

experimentales observados pero con un perfil muy diferente (Figura 32a). Mientras

el programa PMP predice un hombro inicial de aproximadamente 7 días, para luego

inmediatamente caer 3 ciclos logarítmicos y a partir de allí un descenso progresivo,

la curva experimental no presenta hombro y exhibe una declinación muy escasa de la

población.

A 17ºC, la población de E.coli disminuyó conforme aumentó el tiempo de

almacenamiento, resultados que no condicen con la predicción del programa PMP,

el cual, propone crecimiento para dichas condiciones y en medio de cultivo (Figura

32b). Las diferencias observadas se deben posiblemente a que se trata de una

temperatura sub-óptima y que E.coli patógena no desarrolla en los quesos

fermentados a pH <5,4 (ICMSF,1996). Ya se ha comentado que también podría

deberse a la presencia de algún componente inhibidor de crecimiento en el queso.

Montville (1997) describió que el crecimiento bacteriano está gobernado al

menos por tres factores (pH, aw y temperatura) y en muchos casos existen

interacciones entre ellos. Estos autores mencionaron también que estas interacciones

o sinergismos describen como diferentes factores extrínsecos e intrínsecos del

alimento afectan la habilidad del microorganismo de sobrevivir o iniciar su fase de

crecimiento. Ciertas investigaciones (Roberts e Ingram, 1973) observaron la

necesidad de estudiar los efectos interactivos de varios parámetros influyentes en el

crecimiento bacteriano sumado a la producción de metabolitos tóxicos. Esto podría

explicar la no coincidencia con lo predicho por el programa PMP.

A 25ºC, temperatura cercana a la temperatura óptima de crecimiento (35ºC-

40ºC) definida en la bibliografía (ICMSF,1996), se observó que los datos

experimentales son coincidentes con lo predicho por el programa de modelado de

patógenos, PMP con la diferencia de una fase de latencia de mayor duración (3 días

97

aproximadamente), una fase de crecimiento exponencial que va desde el día 3 al día

8 (con una pendiente ó velocidad de crecimiento menos pronunciada que la predicha)

,para finalmente, a partir del día 8, llegar al período de crecimiento estacionario,

perfil que es coincidente con lo comentado en los párrafos anteriores (Figura 32c ).

Figura 31: Evaluación del comportamiento de E.coli en queso untable base, pH 5,0

a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6ºC (-♦- ),17ºC ( -■- ) y 25ºC (-▲- );

(I):desvío estándar.

Dado que las curvas de inactivación presentaron desviaciones significativas

de la linealidad, se consideró apropiado aplicar regresión no lineal, teniendo en

cuenta todas las partes de la curva de inactivación (Linton y col., 1995).

Se aplicó el modelo de Gompertz modificado a las curvas de inactivación de E. coli

obtenidas a 6°C y 17°C, calculando los parámetros característicos del mismo, según

la metodología descripta en Materiales y Métodos, 3.6.1.2 Las Figuras 33 y 35

muestran un correcto ajuste del modelo a los datos experimentales. Las tablas 12 y

13 exhiben los parámetros característicos A; B y C junto a los estadísticos

relacionados. El modelo ajustó correctamente en ambos casos, tal como se evidencia

por los elevados coeficientes de determinación obtenidos (R2 = 99,9 y 98,1%,

respectivamente); la adecuada correlación entre valores observados y predichos y

una homogénea distribución de residuales (Figuras 34 y 36).

98

Figura 32: Comportamiento predicho de E.coli a pH 5,0 y 6º C (a), 17ºC (b) y 25ºC

(c): ( ▬ ) predicción , ( --- ) límite de confianza superior predicho, ( --- ) límite de

confianza inferior predicho, (-♦- ) datos experimentales

a

b

c

99


E.coli en queso untable base almacenado a 6ºC, (�) valores experimentales; (—)

predicción

Tiempo (día)

Log(

N/N

0)

0 4 8 12 16 20-0,43

-0,33

-0,23

-0,13

-0,03

0,07


característicos, correspondientes al comportamiento de E.coli en queso untable base

(pH 5.0) almacenado a 6 ºC


A 2,39 0,06

B -0,10 0,01

C -1,84 0,37



MODELO 0,28 3 13283**

RESIDUAL 0,00002 3

R2 ajustado 99,98

1SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día); B : máxima velocidad de muerte (1/día) y C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).

100

Figura 34: Validación interna del modelo propuesto para la supervivencia de E.coli

en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 6 ºC: a) Valores observados vs valores


predicción.

Valores predichos

Val

ores

obs

erva

dos

-0,43 -0,33 -0,23 -0,13 -0,03 0,07-0,43

-0,33

-0,23

-0,13

-0,03

0,07

Valores predichos

Res

idua

les

-0,43 -0,33 -0,23 -0,13 -0,03 0,07-32

-12

8

28

48(X 0,0001)


E.coli en queso untable base almacenado a 17ºC, (�) valores experimentales; (—)

predicción.

Tiempo (día)

Log(

N/N

0)

0 3 6 9 12 15 18-2,4

-1,9

-1,4

-0,9

-0,4

0,1

0,6

(a) (b)

101



(pH 5.0) almacenado a 17 ºC.


A 2,88 2,00

B -0,25 0,20

C -2,80 0,89



MODELO 8,02 3 133**

RESIDUAL 0,04 2

R2 ajustado 98,12

1SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (día); B: máxima velocidad de muerte (1/día) y C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).

Figura 36: Validación interna del modelo propuesto para el comportamiento de

E.coli en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 17 ºC: a) Valores observados vs


(—) predicción

Valores predichos

Val

ores

obs

erva

dos

-2,4 -1,9 -1,4 -0,9 -0,4 0,1 0,6-2,4

-1,9

-1,4

-0,9

-0,4

0,1

0,6

Valores predichos

Res

idua

les

-2,4 -1,9 -1,4 -0,9 -0,4 0,1 0,6-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

El análisis del comportamiento de E.coli que permite el modelo de Gompertz

modificado define a 17 °C una curva sigmoidea con un hombro extenso en función

del tiempo (~ 3 días) para luego exhibir una caída mayor que la estimada a 6°C.

(a) (b)

102

Esto sugiere la presencia de otros factores influyentes en el comportamiento ó

adaptación de las células bacterianas al alimento.

Roberts y col. (2002) describieron que no hubo diferencias significativas en

el recuento bacteriano de E. coli O157:H7 entre el sistema control (0% sorbato de

potasio) y sistemas con concentraciones crecientes de sorbato de potasio (0.1, 0.15,

0,20 y 0.30 %) en queso cheddar y mozzarella, durante 70 días de almacenamiento a

10°C. Esto podría ser una evidencia de que la muerte observada de E.coli en queso

con humedad media y alta no estaría relacionada al poder inhibitorio de un

conservante químico.

Se ajustó con éxito el modelo de Gompertz a la curva de crecimiento de

E.coli en queso crema base a 25ºC (Figura 37). La Tabla 14 exhibe los parámetros

característicos del modelo junto a los estadísticos relacionados evidenciando que el

ajuste logrado fue muy satisfactorio (α< 0,01) obteniéndose un R2 ajustado de

94,5%; adecuada distribución de valores observados en torno a los predichos y de

residuales vs. valores predichos (Figura 38 a y b).


E.coli en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25ºC, (�) valores


Tiempo (dia)

Log

N

0 2 4 6 8 103,4

4,4

5,4

6,4

7,4

8,4

103



(pH 5.0) almacenado a 25 ºC


A 3,93 0,19

B 0,56 0,05

C 5,33 1,63

M 6,77 1,00



MODELO 239,77 4 399 **

RESIDUAL 0,60 4

R2 ajustado 94,51

PARAMETROS BIOLÓGICOS 2

Gompertz PMP

TG (día) 0,26 0,04


LAG (día) 5,75 0,22

1SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *: significativo al 5% ;**: muy significativo al 1%.

El estudio comparativo entre los parámetros biológicos que caracterizan el

crecimiento de E.coli almacenado a 25ºC entre y los valores predichos por PMP

evidencian que el PMP predice LAG y TG menores, concordantes con una VCE

mayor que los correspondientes estimados por Gompertz (Tabla 14).

104

Figura 38: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de E.coli en

queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 ºC: a) Valores observados vs valores


predicción.

Valores predichos

Val

ore

s o

bse

rvad

os

3,9 4,9 5,9 6,9 7,9 8,93,4

4,4

5,4

6,4

7,4

8,4

Valores predichos

Res

idua

les

3,4 4,4 5,4 6,4 7,4 8,4-0,45

-0,25

-0,05

0,15

0,35

0,55

Con lo anteriormente observado se puede deducir que el microorganismo en

queso precisó mayor adaptación al medio y asimismo creció a menor velocidad que

la predicha en un sistema ideal.

Datos bibliográficos (Lars, 2004) indican que ciertas especies de los géneros

más usados en la industria láctea, Lactococcus y Leuconostoc, desarrollan a

temperatura de refrigeración (~ 10ºC) y no desarrollan a mayores temperaturas (~

40ºC) hecho que podría relacionarse con su mayor y menor poder inhibitorio,

respectivamente.

Si bien en el presente estudio se utilizaron 2 temperaturas cercanas a 10ºC (6

y 17 ºC) y una temperatura mayor (25ºC) el comportamiento observado no se

contradice con lo anteriormente explicado ya que E.coli presentó muerte conforme

transcurrió el tiempo (6 y 17ºC) y neto crecimiento a mayor temperatura (25ºC). Su

comportamiento frente a las temperaturas estudiadas es justamente inverso al

comportamiento de las bacterias lácticas; dicho de otra manera mientras a bajas

temperaturas algunas bacterias lácticas desarrollan el patógeno E.coli muere. Lars

(2004) afirma que las bacterias lácticas tienen un importante rol en la preservación de

alimentos. Sería causa de otros estudios para explicar la mayor caída (aunque leve)

en ciclos log observada a 17ºC con respecto a lo observado a 6°C.

(a) (b)

105

4.4.3. S. Enteritidis

En la Figura 39 puede observarse el desarrollo de S.Enteritidis en queso

untable base almacenado a 6ºC, 17ºC y 25ºC. Al igual que con S. aureus y E. coli; la

población de S.Enteritidis decreció en función del tiempo a 6ºC y 17ºC pero mostró

crecimiento neto a 25°C.

El programa PMP predijo a 6ºC y 17ºC muerte bacteriana coincidente con los

resultados obtenidos, pero si se observan los gráficos superpuestos (Figura 40 a y b)

se evidencia la curva de muerte de S.Enteritidis en el queso untable base a una

velocidad muy inferior (2 ciclos logarítmicos en 37 días) a la predicha por el

programa PMP, el cual estimó una caída de 5 ciclos logarítmicos en 2,5 días.

A 25ºC experimentalmente se comprobó crecimiento a pesar que la

predicción por el PMP es de muerte bacteriana Figura 39 c) ; PMP predice

crecimiento de S.Enteritidis a 25ºC a un pH > 5.4 (en caldo nutritivo).

Figura 39: Evaluación del comportamiento de S.Enteritidis en queso untable base,

pH 5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6ºC (-♦- ),17ºC ( -■- ) y 25ºC

( -▲- ); (I):desvío estándar.

106

Figura 40 : Comportamiento predicho de S.Enteritidis a pH 5,0 y 6º C (a), 17ºC (b)

, 25ºC (c) : ( ▬ ) predicción, ( --- ) límite de confianza superior predicho, ( --- )

límite de confianza inferior predicho, (-♦- ) datos experimentales.

*en este caso no se superpuso la respuesta observada ya que se registró crecimiento (ver figura 39)

a

c*

b

107

Datos bibliográficos indican que Salmonella spp. en medios ligeramente ácidos

(pH 5.5) (prechoque) seguida de la exposición de las células adaptadas al valor

de pH menor (choque ácido) desencadenan una compleja respuesta de

ácidotolerancia que potencia la supervivencia del microorganismo en medios

ácidos (pH< 5,4). La respuesta se traduce en una síntesis de de 43 proteínas de

choque ácido en la fase logarítmica de crecimiento y de 15 proteínas de choque

ácido en la fase estacionaria. Probablemente estos sistemas actúan en los medios

ácidos que predominan en los alimentos fermentados y acidificados. El estrés

ácido también puede desencadenar resistencia bacteriana aumentada frente a

otras condiciones ambientales adversas (Daoust, 1997).

Las curvas de supervivencia obtenidas a 6 y 17°C se caracterizaron utilizando

el modelo de Gompertz modificado. Las Figura 41 y 43 muestra un adecuado ajuste

del modelo a los datos experimentales. El análisis de la varianza (Tablas 15 y 16)

arrojó valores de R2 entre 99,2% y 97,3% con F muy significativo (α < 0,01). La

validación interna realizada (Figuras 42 y 44) mostró que en los gráficos de valores

observados vs predichos así como en el gráfico de residuales vs. valores observados

los datos experimentales y los predichos presentaron distribución homogénea.


de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 6ºC, (�) valores


Tiempo (día)

Log(

N/N

0)

0 10 20 30 40-2

-1,6

-1,2

-0,8

-0,4

0

108


característicos, correspondientes al comportamiento de S.Enteritidis en queso untable



A 1,12 0,28

B -0,12 0,02

C -2,17 0,16



MODELO 15,23 3 1016**

RESIDUAL 0,02 4

R2 ajustado 99,23


Figura 42: Validación interna del modelo propuesto para S.Enteritidis en queso

untable base (pH 5,0) almacenado a 6 ºC: a) Valores observados vs valores


predicción

Valores predichos

Val

ores

obs

erva

dos

-2,1 -1,7 -1,3 -0,9 -0,5 -0,1 0,3-2,1

-1,7

-1,3

-0,9

-0,5

-0,1

0,3

Valores predichos

Res

idua

les

-2 -1,6 -1,2 -0,8 -0,4 0-0,1

-0,06

-0,02

0,02

0,06

0,1

(a) (b)

109


S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 17ºC, (�) valores


Tiempo (día)

Log(

N/N

0)

0 4 8 12 16 20 24-3,1

-2,1

-1,1

-0,1

0,9





A 0,94 0,03

B -0,16 0,06

C -3,65 0,07



MODELO 29,90 3 249**

RESIDUAL 0,15 4

R2 ajustado 97,29


110

Figura 44: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de

S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 17 ºC: a) Valores

observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (�) valores


Valores predichos

Val

ores

obs

erva

dos

-3,1 -2,1 -1,1 -0,1 0,9-3,1

-2,1

-1,1

-0,1

0,9

Valores predichosR

esid

uale

s

-3,1 -2,1 -1,1 -0,1 0,9-0,27

-0,17

-0,07

0,03

0,13

0,23

0,33

De acuerdo a los parámetros estimados, S. Enteritidis en queso untable base

almacenado presentó perfiles de supervivencia similar a 6° C y 17°C con valores de

hombro inicial (A) cercanos a 1 día; velocidades de muerte similares (B) entre 0,12 y

0,16 día-1 y una caída global algo mayor a 17°C que a 6°C, tal como se observó con

los otros microorganismos estudiados.

Dado que S. Enteritidis creció en el queso untable base almacenado a 25°C,

se caracterizó dicha curva mediante el modelo de Gompertz. En la Figura 45, puede

observarse que hubo un buen ajuste con el modelo propuesto ya que la predicción es

coincidente con los valores experimentales. El análisis de la varianza (Tabla 17)

arrojó un R2 de 96,5% con F significativo (α < 0,05). La validación interna del

modelo no mostró tampoco en este caso anomalías (Figura 46 a y b).

(b) (a)

111


S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25ºC, (�) valores


Tiempo (dia)

Log

N

0 2 4 6 8 103,7

4,7

5,7

6,7

7,7

8,7

Varios estudios han subrayado la capacidad aumentada de los

microorganismos que crecen en condiciones ácidas (pH~5) o en medios de salinidad

elevada (>2% NaCl) a temperaturas óptimas para su crecimiento o cercanas

(Ferreira, 1987;Thomas, 1992). El género Salmonella está integrado por

microorganismos resistentes que se adaptan fácilmente a las condiciones extremas

del medio. Además, la capacidad de adaptación fisiológica de Salmonella spp. se

demuestra por su capacidad de multiplicarse a valores de pH desde 4.5 a 9.5 con un

pH óptimo de crecimiento de 6.5 hasta 7.5 al igual a lo observado con respecto a la

temperatura de almacenamiento (temperatura óptima de crecimiento 37ºC con un

rango que va desde 2ºC a 54ºC), tal como se ha observado en el presente estudio.

112





A 4,14 0,16

B 0,82 0,16

C 4,42 0,71

M 7,04 0,40



MODELO 213,98 4 668**

RESIDUAL 0,24 3

R2 ajustado 96,50


Gompertz PMP

TG (día) 0,27 ---

VCE (Log UFC/g/día) 1,10 ---

LAG (día) 5,33 ---

1 SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de determinación ajustado por grados de libertad.2 TG: tiempo de generación; VCE: velocidad de crecimiento exponencial; LAG: tiempo de fase lag.3NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy significativo al 1%. Figura 46: Validación interna: Análisis estadístico del modelo propuesto para el crecimiento de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 ºC: a) Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (�) valores experimentales; (—) predicción

Valores predichos

Va

lore

s o

bse

rva

do

s

4,1 5,1 6,1 7,1 8,13,7

4,7

5,7

6,7

7,7

8,7

Valores predichos

Res

idua

les

4,4 5,4 6,4 7,4 8,4-0,06

-0,04

-0,02

0

0,02

0,04

0,06

(a) (b)

113

4.4.4. L.monocytogenes

La Figura 47 exhibe el comportamiento de L.monocytogenes inoculada en el

queso untable base a pH 5,0 y almacenado a 6ºC, 17ºC y 25ºC. Esta experiencia se

llevó a cabo tal como se describe en Materiales y Métodos, sección 3.4.5.4. Puede

observarse una disminución de la población, con similar perfil de inactivación en

todos los casos aunque a 6°C, se observó una leve recuperación parcial de la

población a partir de los 23 días de almacenamiento.

Figura 47: Evaluación del comportamiento de L.monocytogenes en queso untable

base, pH 5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6ºC (-♦- ),17ºC ( -■- ) y

25ºC ( -▲- ); (I): desvío estandar.

Haciendo un estudio comparativo entre los datos experimentales y los

predichos por el programa de modelado de patógenos PMP se observó (Figura 48)

que mientras a las tres temperaturas estudiadas el programa PMP predice crecimiento

en caldo de cultivo, los datos experimentales confirmaron muerte de la población

bacteriana. Debe considerarse una vez más, que la inhibición del crecimiento

encontrada experimentalmente en el queso untable base no es contemplada por el

programa de modelado terciario PMP ya que están presentes ciertas variables

propias del queso untable que no son consideradas en el modelo predicho.

114

Figura 48: Comportamiento predicho de L.monocytogenes a pH 5,0 y 6º C

(a), 17ºC (b) y 25ºC (c) : ( ▬ ) predicción, ( --- ) límite de confianza superior

predicho, ( --- ) límite de confianza inferior predicho, (-♦- ) datos experimentales.

b

a

c

115

Una de las bacterias lácticas utilizadas en la elaboración del queso es

Lactococcus lactis subsp.lactis, productor de nisina. La nisina, fue la primer

bacteriocina aislada a partir de la bacteria ácido láctica Lactococcus lactis subsp

lactis. Es la bacteriocina mejor caracterizada y es utilizada como conservador de

alimentos .Es la única reconocida por la FDA con categoría GRAS (Generally

Recognized as Safe). Se produce de forma natural en algunos productos lácteos y se

utiliza en la producción de alimentos como un aditivo en dichos productos para

prevenir la descomposición ocasionada por bacterias Gram positivas, especialmente

de los géneros Clostridium, Staphylococcus, Bacillus y Listeria ( Delves-Broughton,

1990 ; Gonzalez y col.,2003). Esta podría ser la razón de la diferencia observada

entre los datos experimentales y los predichos por el programa de modelado de

patógenos PMP.

Con el propósito de caracterizar las curvas de muerte obtenidas se aplicó el

modelo de Gompertz modificado a las tres temperaturas estudiadas. Las Tablas 18;

19 y 20 exhiben los parámetros estimados que representan las diferentes regiones de

la curva de supervivencia junto a los estadísticos de ajuste del modelo. El ajuste del

modelo resultó altamente satisfactorio a las 3 temperaturas de almacenamiento,

obteniéndose valores de R2 ajustado por grados de libertad entre 94 y 98%.El mismo

describió a las 3 temperaturas curvas sigmoideas donde la temperatura pareció no

tener influencia en el cambio global de numeró de sobrevivientes. Los valores de F

muy significativos (α<0,01), demostraron que el modelo fue apropiado para describir

el comportamiento observado tal como se observa en la Figura 49. La validación del

modelo fue correcta tal como puede observarse en los gráficos de valores observados

y predichos (Figuras 50).

116

Figura 49 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de

L.monocytogenes en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 6ºC (a),17°C (b) y

25°C (c) (�) valores experimentales; (—) predicción

Tiempo (día)

LogN

N0

0 10 20 30 40 50-3,3

-2,3

-1,3

-0,3

0,7

Tiempo (día)

LogN

N0

0 4 8 12 16 20 24-3,2

-2,2

-1,2

-0,2

0,8

Tiempo (día)

LogN

N0

0 10 20 30 40-3,3

-2,3

-1,3

-0,3

0,7

A 6ºC y 25°C el modelo primario de Gompertz modificado estimó valores

de los parámetros característicos similares: una región de hombro (A) muy poco

marcada coincidiendo con los datos experimentales observados. El cambio global en

el número de sobrevivientes (C) en los 3 ciclos logarítmicos observando una cola

larga (Figura 49 a). El modelo, como ocurre generalmente, no pudo caracterizar la

leve recuperación observada luego de 27 días de almacenamiento.

A 17ºC el modelo estimó un mayor tiempo de latencia antes de comenzar la

inactivación del microorganismo (hombro). Tal como ocurrió en los apartados

anteriores, el mismo sobrestimó el cambio global en el número de sobrevivientes (C)

en comparación con los valores observados.

El parámetro B, el cual indica la velocidad de muerte máxima, fue similar a

las 3 temperaturas estudiadas, demostrando que la temperatura no tuvo influencia en

al inactivación observada. Este hecho confirma, junto con la predicción de

crecimiento a estas temperaturas del programa PMP la posible presencia de un

agente inhibidor en el queso untable base.

(a) (b)

(c)

117


característicos, correspondientes al comportamiento de L.monocytogenes en queso

untable base (pH 5.0) almacenado a 6 ºC


A 1,64 0,27

B -0,25 0,10

C -3,02 0,18



MODELO 51,77 3 215**

RESIDUAL 0,41 5

R2 ajustado 94,26





A 1,78 0,50

B -0,11 0,05

C -4,76 1,65



MODELO 21,18 3 235**

RESIDUAL 0,12 4

R2 ajustado 98,14

1SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día); B : máxima velocidad de muerte (1/día) y C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -)

118





A 1,34 0,65

B -0,22 0,08

C -3,36 0,37



MODELO 18,83 3 76**

RESIDUAL 0,33 4

R2 ajustado 94,23


119

Figura 50: Validación interna: Análisis estadístico del modelo propuesto para el

crecimiento de L.monocytogenes en queso untable base (pH 5,0). a) Valores

observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . (�) valores


- 6°C

Valores predichos

Val

ores

obs

erva

dos

-3,3 -2,3 -1,3 -0,3 0,7-3,3

-2,3

-1,3

-0,3

0,7

Valores predichos

Res

idua

les

-3,3 -2,3 -1,3 -0,3 0,7-3

-2

-1

0

1

2

3

- 17°C

Valores predichos

Val

ores

obs

erva

dos

-3,2 -2,2 -1,2 -0,2 0,8-3,2

-2,2

-1,2

-0,2

0,8

Valores predichos

Res

idua

les

-3,3 -2,3 -1,3 -0,3 0,7-0,4

-0,2

0

0,2

0,4

- 25°C

Valores predichos

Val

ores

obs

erva

dos

-3,3 -2,3 -1,3 -0,3 0,7-3,3

-2,3

-1,3

-0,3

0,7

Valores predichos

Res

idua

les

-3,3 -2,3 -1,3 -0,3 0,7-6

-4

-2

0

2

4

6

La bibliografía reporta resultados contradictorios en cuanto al desarrollo de L.

monocytogenes en quesos.

(a) (b)

120

Roberts (2002) encontró que este microorganismo no se desarrollaba cuando

se lo inoculaba en queso mozzarella (pH 5,3) y cheddar (pH 5,0) almacenado a 10°C

y sin la presencia de sorbato de potasio siguiendo, en concordancia con este trabajo,

una cinética no lineal. Por otro lado, Urlich y col. (2006) estudiaron el

comportamiento de L.monocytogenes en queso Blanco (queso blanco, semi-blando

elaborado con leche pasteurizada ,sal, enzimas y cultivos lácticos, sin aditivos) y

observaron que a las diferentes temperaturas de almacenamiento (5ºC, 10ºC, 15ºC,

20ºC y 25ºC) el microorganismo describía una marcada curva de crecimiento de

forma típicamente sigmoidea.

La leche y los quesos fueron los alimentos investigados primero y se

encuentran entre los alimentos estudiados más extensamente. Pueden estar

contaminada una gran variedad de quesos, pero son de interés máximo los quesos

blandos con una frecuencia de contaminación con L.monocytogenes del 2 al 10%.

Rocourt (1997) vió que existe una correlación significativa del crecimiento

de L.monocytogenes con los valores de pH (>5.5) y con la ausencia de cultivos

iniciadores durante la fabricación del queso. El yogur (los cultivos lácticos termófilos

inhiben el crecimiento de Listeria) rara vez está contaminado

Queda por evaluar si la única recuperación observada experimentalmente

luego de los 35 días de almacenamiento a 6ºC no responde al patrón descripto por

Urlich y col. (2002) luego de superado un período de stress traducido en muerte

bacteriana.

Los resultados de reto microbiano con patógenos relevantes obtenidos en esta

tesis están en concordancia con otros resultados reportados en bibliografía. Smittle y

Flowers (1994) observaron que el programa PMP falló en predecir el

comportamiento de Salmonella spp. y L. monocytogenes en una ensalada con jamón.

Hudson y Mott (1993) observaron que L. monocytogenes, Aeromonas hydrophila; y

Yersinia entercolítica creció más lentamente a 4°C y 10°C en paté que lo que predijo

el programa PMP. Estudios realizados por Buchanan y Bagi (1994) han demostrado

que este programa puede proveer una buena primera estimación del comportamiento

de E. coli O157:H7 en alimentos. Walls y Scott (1997) encontraron discrepancias

entre la predicción del tiempo de fase lag en este programa y el crecimiento de

Listeria spp en un alimento infantil estéril evaluado a diferentes temperaturas (12-

35°C), pH (5,3-6,8) y niveles de sal agregada (2,9%-4,1% NaCl).

121

4.5 Uso de antimicrobianos naturales: timol

Con el objetivo de evaluar la posible capacidad antimicrobiana del timol se

estudió el comportamiento a lo largo del tiempo de S.aureus en queso untable base

con el agregado de (0,3% p/p) timol y almacenado a 6ºC, 17ºC y 25ºC y de

S.Enteritidis en la misma matriz alimenticia, almacenada a 17ºC. La experiencia se

llevó a cabo tal como se describió en Materiales y Métodos, sección 3.4.5.5. La

concentración de timol utilizada resultó ser la más apropiada desde el punto de vista

organoléptico (Materiales y Métodos, sección 3.4.2).

Los datos experimentales muestran que a 6 y 17ºC (Figura 51 a y b) S.aureus

y a 17ºC S.Enteritidis (Figura 52) respectivamente la pendiente de la curva de

inactivación descripta fue mayor en ausencia de timol.

La experiencia observada fue diferente conforme aumentó la temperatura de

almacenamiento (Figura 51 c). Tal es así, que a 25ºC la curva descripta por S.aureus

demostró crecimiento pero llamativamente el crecimiento observado fue mayor en

ausencia de timol.

En muchos estudios se ha observado una rápida acción germicida del timol.

Zhou y col. (2006), Viuda-Martos y col.(2006) investigaron la actividad

antimicrobiana de cinamaldehido, timol y carvacrol contra S. typhimurium en un

medio de cultivo. Ellos encontraron que concentraciones de estos compuestos entre

0,02 y 0,04% p/p fueron suficientes para inhibir a este microorganismo. Sokmeny

col. (2004) demostraron la capacidad del aceite esencial de tomillo en para inhibir el

crecimiento de hongos como Alternaria spp, A. flavus, Fusarium spp. y Penicillium

spp. Esta capacidad antifúngica del aceite esencial de tomillo también ha sido

demostrada por Montes y Carvajal (1998) y Basilico y Basilico (1999) sobre los

hongos, tales como A. flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus ochraceus,

Aspergillus fumigatus y Fusarium spp. Según Soliman y Badeea (2002), este efecto

antifúngico podría ser causada por el contenido de b-pineno de aceite esencial de

tomillo, ya que puede alcanzan valores de 30 a 37.6%.

En el presente estudio el tratamiento con timol en una concentración superior

(0,3% p/p) no resultó en una mayor inactivación bacteriana sino que por el contrario,

el mismo ejerció una acción protectora.

122

Figura 51: Comportamiento de S.aureus en queso untable base con (-♦-) y sin

agregado de (-♦-) timol (0,3% p/p), pH 5,0, almacenado a tres temperaturas: (a)

6ºC, (b) 17ºC, (c) 25ºC ; (I):desvío estándar.

a

b

c

123

Figura 52: Comportamiento de S.Enteritidis en queso untable base con (-♦-) y sin

agregado de (-♦-) timol (0,3% p/p), pH 5,0 almacenado a 17ºC; (I): desvío estandar.

Juven y col. (1994) sugirieron que los alimentos con cierto tenor de grasa

(Materiales y Métodos, sección 3.1.1) podrían formar una barrera protectora

alrededor de las bacterias protegiéndolas de los agentes antimicrobianos. Estos

estudios sugirieron también que la fracción lipídica del alimento absorbe el agente

antimicrobiano, reduce su concentración en la fase acuosa y por ende su acción

bactericida. El contenido proteico del alimento podría también ser un factor

influyente en la inefectividad del timol ya que la albúmina de suero bovino

neutralizaba la acción antimicrobiana del timol sugiriendo formación de complejos

entre los componentes fenólicos del timol y las proteínas del alimento. Estas

reacciones podrían haber prevenido toda otra formación de complejos similares entre

compuestos fenólicos y proteínas u otros componentes de la membrana celular

bacteriana que es considerada el sitio de acción blanco de los aceites esenciales

(Peter, 2004).

Es necesario evaluar también el comportamiento de la flora láctica frente al

timol. Nuevos estudios serían necesarios para evaluar si el timol tiene algún tipo de

efecto sobre su crecimiento lo que provocaría que el accionar metabólico de las BAL

se vea alterado así como también su capacidad competitiva. Esto, de comprobarse,

podría explicar la causa por la cual la muerte bacteriana observada tanto en S. aureus

124

como en S. Enteritidis a las temperaturas ensayadas es menor con timol que sin la

presencia del mismo. Es decir, el timol en cierta forma altera la capacidad

biopreservativa y competitiva de las BAL permitiendo mayor desarrollo de otra flora

acompañante.

El análisis de modelado terciario no se pudo incluir en el estudio del

comportamiento microbiano en queso con y sin timol ya que el programa PMP no

contempla, dentro de las variables que ofrece, el agregado de este producto. Esta es

la razón por la cual no fue posible comparar las respuestas observadas y las

predichas.

Con el propósito de caracterizar las curvas de supervivencia de los

microorganismos estudiados en queso untable base adicionado con aceite esencial de

timol se aplicó el modelado primario utilizando la ecuación de Gompertz

modificado.(Materiales y Métodos,3.6.1.2).

Las Tablas 21; 22 y 23 exhiben los parámetros estimados que representan

las diferentes regiones de la curva de supervivencia junto a los estadísticos de ajuste

del modelo. El ajuste del modelo resultó altamente satisfactorio, obteniéndose

valores de R2 ajustado por grados de libertad entre 89,3% y 99,1%. Los valores de F

muy significativos (α<0,01), demostraron que el modelo fue apropiado para describir

el comportamiento observado tanto para S. aureus a 6°C y 17°C como para S.

Enteritidis a 17°C tal como se observa en la Figura 53. La validación del modelo fue

correcta tal como puede observarse en los gráficos de valores observados y predichos

y la distribución de residuales (Figuras 54).

En el caso del comportamiento de S.aureus en queso untable base

almacenado a 6ºC, el perfil de las curvas de supervivencia difiere escasamente, sobre

todo en los primeros días de almacenamiento donde la caída de la población es más

acelerada en el caso del queso sin adición de timol (Figura 51a). El modelo de

Gompertz modificado caracterizó correctamente el cambio global observado dada la

presencia de una cola marcada (C= 4,2 ciclos; Tabla 21), mientras que en ausencia

de timol, la falta de cola marcada hizo que el modelo sobrestimara dicho valor(C=

14,4 ciclos; Tabla 9); cuando en realidad el cambio observado experimentalmente

fue de 3,4 ciclos logarítmicos (Figura 51a). Aunque finalmente este

microorganismo termina muriendo en un nivel similar al observado en queso base sin

125

timol, la presencia de timol aumentaría levemente su resistencia a esta temperatura o

bien, actuaría indirectamente, inhibiendo la flora competitiva.

A 17°C, se observó que las curvas de supervivencia de S. aureus en queso

untable base con timol presentaron un perfil de curva quebrada similar al observado

para la curva de supervivencia en igual sistema sin agregado de timol, aunque la

inactivación fue mucho menor. Ello queda evidenciado en los parámetros

característicos de ambas curvas. En el caso de la presencia de timol (Tabla 22), la

curva no presentó hombro inicial (A ~ - 4 días) al igual que en ausencia de timol

(Tabla 10). La velocidad de muerte y el cambio global en el numero de

sobrevivientes fueron significativamente mayores (Bc/ timol=1,3 día-1 ; Bs/ timol= 0,5

día-1 ; Cc/ timol= 3,4 ciclos; Cs/ timol =0,07 ciclos). Tal como se comentó anteriormente,

son varios los factores que en combinación podrían estar generando este efecto

protector observado. Estos estudios debieran intensificarse evaluando varias

concentraciones de este antimicrobiano con el propósito de arribar a una conclusión

más definitiva.

En el caso de S. Enteritidis en queso untable base con agregado de timol

almacenado a 17°C, la misma fue más indiferente a la presencia de este

antimicrobiano natural generando una curva de inactivación de perfil similar a la

obtenida en ausencia del mismo. Ello se evidencia también en la concordancia de los

parametros característicos de las mismas. En presencia de timol (Tabla 23), el

parámetro A (hombro inicial) indica un valor predicho de 1,76 días. El cambio global

en el numero de sobrevivientes (C) en 20 días de almacenamiento fue de 3,3 ciclos

logarítmicos y la velocidad de muerte (B), 0,20 día-1. Cuando se caracterizó la

respuesta de este microorganismo en iguales condiciones pero en ausencia de timol

(Tabla 16) se obtuvieron similares valores de hombro inicial (A~ 1 día); de

velocidad de muerte (B= 0,16 día-1) y de caída global predicha en 20 días (C=3,7

ciclos).

126


S.aureus en queso untable base con timol (pH 5,0) almacenado a 6ºC (a); 17°C (b); y

de S. Enteritidis en igual matriz almacenada a 17°C (c) (�) valores experimentales;

(—) predicción

Tiempo (día)

Log

(N/N

0)

0 10 20 30 40-3

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

Tiempo (día)Lo

g (N

/N0)

0 4 8 12 16 20 24-0,81

-0,61

-0,41

-0,21

-0,01

0,19

Tiempo (día)

Log

(N/N

0)

0 4 8 12 16 20-3

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

(a) (b)

(c)

127



base (pH 5.0) con timol almacenado a 6 ºC.


A 1,43 0,30

B 0,08 0,02

C -4,19 0,82


Fuente SS gl FISHER

MODELO 30,97 3 516**

RESIDUAL 0,06 4

R2 ajustado 99,07





A -4,17 102,50

B -1,33 27,11

C -0,07 0,31


Fuente SS gl FISHER

MODELO 1,67 3 55**

RESIDUAL 0,03 4

R2 ajustado 89,29


128





A 1,76 0,47

B -0,20 0,06

C -3,28 0,34


Fuente SS gl FISHER

MODELO 26,44 3 367**

RESIDUAL 0,12 5

R2 ajustado 98,27


En el caso de S. aureus inoculado en queso untable base con ó sin agregado

de timol y almacenado a 25°C se observó crecimiento por lo que las curvas se

caracterizaron mediante el modelo de Gompertz, obteniendo los parámetros

matemáticos (A;B;C y M) a partir de los cuales se calcularon los parámetros

biológicos TG;VCE y LAG. En la Figura 54, puede observarse que hubo un buen

ajuste con el modelo propuesto ya que la predicción es coincidente con los valores

experimentales. El análisis de la varianza (Tabla 24) arrojó un R2 de 99,1% con F

muy significativo (α < 0,01). La validación interna del modelo no mostró tampoco

en este caso anomalías (Figura 55 a y b). Los perfiles de las curvas de supervivencia

predichas en este caso fueron similares , del tipo sigmoideo con valores semejantes

(Tablas 11 y 24) de tiempo de generación (TGc/timol=0,51días;TGs/timol=0,54 días);

velocidad de crecimiento (VCEc/timol=0,59 LogUFC/gr /día ; VCEs/timol= 0,55

LogUFC/gr/día) y tiempo de fase lag (LAGc/timol=5,5 días; LAGs/timol=5,0 días)

aunque con una tendencia a mayor crecimiento en el caso del sistema con timol. La

observación de las curvas experimentales de crecimiento (Figura 51c) evidencian que

S. aureus en queso untable

129


en queso untable base (pH 5,0) con timol almacenado a 6ºC ; 17°C; y de S.

Enteritidis en igual matriz almacenada a 17°C: a) Valores observados vs valores


predicción.

S.aureus- 6°C

Valores predichos

Val

ores

obs

erva

dos

-3,2 -2,2 -1,2 -0,2 0,8-3,2

-2,2

-1,2

-0,2

0,8

Valores predichos

Res

idua

les

-3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0-0,18

-0,08

0,02

0,12

0,22

S.aureus- 17°C

Valores predichos

Val

ores

obs

erva

dos

-0,81 -0,61 -0,41 -0,21 -0,01 0,19-0,81

-0,61

-0,41

-0,21

-0,01

0,19

Valores predichos

Res

idua

les

-0,81 -0,61 -0,41 -0,21 -0,01 0,19-0,12

-0,08

-0,04

0

0,04

0,08

0,12

S.Enteritidis- 17°C

Valores predichos

Val

ores

obs

erva

dos

-3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0-3

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

Valores predichos

Res

idua

les

-3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0-0,19

-0,09

0,01

0,11

0,21

130


S.aureus en queso untable base con timol almacenado a 25ºC, (�) valores


Tiempo (dia)

Log

N

0 3 6 9 12 15 183,9

4,9

5,9

6,9

7,9

8,9



base con timol (pH 5.0) almacenado a 25 ºC


A 4,01 0,20

B 0,26 0,46

C 5,24 0,05

M 7,49 0,61



MODELO 314,25 4 1964**

RESIDUAL 0,12 3

R2 ajustado 99,14


Gompertz PMP

TG (día) 0,51 ---

VCE (Log UFC/g/día) 0,59 ---

LAG (día) 5,5 ---

1 SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de determinación ajustado por grados de libertad.2 TG: tiempo de generación; VCE: velocidad de crecimiento exponencial; LAG: tiempo de fase lag.3NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy significativo al 1%

131


en queso untable base con timol (pH 5,0) almacenado a 25 ºC: a) Valores observados

vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos. (�) valores


(a) (b)

Valores predichos

Val

ores

obs

erva

dos

4 5 6 7 8 93,9

4,9

5,9

6,9

7,9

8,9

Valores predichosR

esi

du

ale

s3,9 4,9 5,9 6,9 7,9 8,9

-0,27

-0,17

-0,07

0,03

0,13

0,23

0,33

con agregado de timol creció aproximadamente 2 ciclos logarítmicos más que en

queso untable sin agregado de (0,3%p/p) timol y con una tendencia hacia el final del

almacenamiento estudiado de seguir incrementándose la población mientras que, en

el caso de la ausencia de timol, la población alcanzó un estado estacionario a los 11

días de almacenamiento, el cuál mantuvo hasta el final del mismo (17 días).

Estos estudios coincidentes, si bien deben profundizarse con más condiciones

de prueba y ensayando más microorganismos, permiten inferir una posible acción

protectora de este antimicrobiano natural presente en la esencia de orégano y pone

atención en la necesidad de tener en cuenta este hecho al momento de elaborar

quesos untables saborizados.

132

5. CONCLUSIONES

133

La microbiología predictiva se ha convertido en los últimos años en una

herramienta muy valorable y necesaria para un correcto diseño de los procesos de

preservación de alimentos. Los modelos matemáticos generales que se utilizan para

describir el crecimiento ó la inactivación microbiana generalmente se derivan de

estudios en sistemas modelo con factores ambientales controlados tales como el pH;

el nivel de sal; la temperatura; etc. La comparación de las predicciones brindadas

por estos modelos con el comportamiento de los microorganismos en un alimento

real puso en evidencia en este estudio las limitaciones de los mismos. En particular,

cuando no todas las condiciones ensayadas quedaron bien descriptas este análisis

permitió determinar qué factores adicionales (ó consideraciones del microambiente)

se necesitan incluir en el modelo o considerar para aumentar su aplicabilidad. En

particular este estudio permitió arribar a las siguientes conclusiones:

� La aplicación de modelos matemáticos no lineales conceptualmente diferentes

como modelos primarios y terciarios , resultó muy útil para explicar de forma más

completa el crecimiento ó lasupervivencia/ inactivación microbiana en queso

untable, brindando información complementaria para la industria para la selección de

las combinaciones más efectivas y seguras desde el punto de vista microbiológico.

� La observación de una respuesta de crecimiento/supervivencia no lineal y su

caracterización mediante modelos primarios (Gompertz y Gompertz modificado),

especialmente en los niveles de factores de estrés más críticos, resultó de destacada

importancia.

� El modelo de Gompertz, utilizado para describir el crecimiento microbiano no

presentó limitaciones estadísticas. No ocurrió lo mismo con el modelo de Gompertz

modificado para muerte, el cuál sobreestimó la caída global al final del

almacenamiento debido a la ausencia en esos casos de una verdadera curva

sigmoidea con cola marcada.

� La presencia de sorbato de potasio (1000 ppm) no generó diferencias en las

curvas de supervivencia obtenidas con el microorganismo de prueba (S. aureus) en el

queso, hecho por el cuál no se lo consideró responsable de la diferencia de respuesta

134

observada entre el medio de cultivo (crecimiento) y el alimento real (supervivencia

/inactivación)

� La reducción del pH del queso untable base (pH 5,0) hasta un valor

organolépticamente aceptable (pH 4,3) generó una alternativa interesante ya que

aumentó notoriamente la inactivación observada del microorganismo de prueba (S.

aureus) sobretodo en situaciones de abuso térmico (15 y 22°C), donde este efecto se

ve incrementado. Es posible que al aumentar la temperatura, la flora acidoláctica, que

no se ve afectada por el descenso de pH, incremente su población por tener una

temperatura más propicia y por lo tanto aumente su poder biopreservante eliminando

al microorganismo de prueba que es más sensible al microambiente imperante.

� El programa de simulación modelado de patógenos mostró debilidades al

momento de predecir la conducta microbiana en el queso untable debido

seguramente a las limitaciones biológicas imperantes en el queso. En algunos casos

(p.e S.aureus ; pH 5,0 y T: 6, 10; 15;17; 22 y 25°C; E. coli pH 5,0 T: 17 y 25°C

L.monocytogenes; pH 5,0 T: 6,17 y 25°C) realizó una predicción errada pero

conservativa ya que predijo un crecimiento más acelerado del realmente observado o

de modo más extremo predijo crecimiento y se observó muerte bacteriana. En otros

casos su predicción fue de riesgo (p.e. E.coli pH 5,0 T: 6°C; S.Enteritidis pH 5,0 T:

6 y 17 °C) pues predijo muerte a velocidades más rápidas que las observadas y en el

peor de los casos predijo muerte y se observó crecimiento (S.Enteritidis pH 5,0

T:25°C). La posible presencia de inhibidores en el queso así como también el

establecimiento de flora competitiva, factores no considerados en la predicción de

este programa, podrían ser los causantes de las diferencias observadas y ponen en

alerta sobre una cautelosa utilización de este programa.

� La inclusión de timol (0,3%) con el posible propósito de su utilización como

agente antimicrobiano y a su vez saborizante no condujo a los resultados esperados.

No se observó actividad antimicrobiana adicional contra S.aureus y S. Enteritidis

presentes en queso untable, sino que por el contrario se incrementó la resistencia de

los mismos en presencia de este compuesto en todas las condiciones ensayadas. Este

135

resultado fue relevante pues señala un punto de inicio para futuras investigaciones y

aspectos a tener en cuenta al momento de desarrollar quesos untables saborizados.

� Actualmente y por ahora, no es posible basarse solamente en la predicción de los

modelos matemáticos para determinar la seguridad de los alimentos y los procesos.

Los estudios de reto microbiano en el alimento son aun inequívocamente necesarios

para determinar la propensión al crecimiento de patógenos en el alimento.

136

6. APÉNDICE

137

Este capítulo incluye información con respecto a los métodos estadísticos que se

utilizaron para el análisis de los resultados, definiciones y fórmulas.

6.1 Definiciones y Fórmulas

6.1.1- Población estadística

Una población estadística se define como un conjunto completo de elementos

de interés. La medidas tomadas sobre los elementos de una población están

gobernadas por una distribución de probabilidad, usualmente expresada en forma de

ecuación matemática, la cual relaciona la ocurrencia de un valor específico con la

probabilidad de dicha ocurrencia.

6.1.2-Distribución normal

Distribución normal es el tipo de distribución que más comunmente se

encuentra. En general cuando se procesan los datos estadísticamente se asume que su

distribución es normal. La siguiente fórmula es la función de la distribución normal y

se puede usar para verificar si realmente una serie de mediciones sigue tal

distribución

( ) [ ]22 2/)(exp2/1)( σπσ YYxf −∗= (6.1)

Donde:

exp = función exponencial con base e

Y= medición realizada

Y = media del total de las mediciones

σ = desviación estándar

σ² = varianza

138

6.1.3- Parámetros y estimadores

Un parámetro estadístico es una función definida sobre los valores numéricos

de la población. Es un valor representativo de una población que provee

información sobre su distribución como la media aritmética o su desviación típica.

En estadística aplicada se asume que la forma de la distribución aplicada es

conocida pero no así los parámetros que la representan. Los mismos deben ser

estimados mediante la aplicación de funciones matemáticas a las mediciones

obtenidas. Los datos estadísticos extraídos de dichas funciones se denominan

estimadores.

Media de la distribución ( Y ); es el promedio aritmético de las mediciones

realizadas:

N

YY

N

1ii∑

== (6.2)

donde Yi : valor individual del sistema i

N: número total de datos

Desviación estándar (σ) o desviación típica; es una medida de dispersión de

las variables con respecto a su media y es de gran utilidad en la estadística

descriptiva. Es en realidad la raíz cuadrada de la varianza:

(

( )1N

)YY 2N

1ii

−

−=σ∑

= (6.3)

Varianza ( σ2 ); la varianza de una variable es una medida de la dispersión.

Corresponde al promedio del cuadrado de la distancia de los distintos valores de la

variable con respecto a su media .

139

(

2N

1ii

2

1N

)YY

−

−=σ∑

= (6.4)

Error estándar de la media (SE); está relacionado a la desviación estándar y

el número de los casos con los cuales se trabaja. Su fórmula es:

N

SEσ= (6.5)

Intervalos de confianza; es siempre aconsejable que un analista determine los

intervalos de confianza de los parámetros que dermina. Los intervalos de confianza

dan información sobre la precisión de los cálculos realizados. Habitualmente se

utiliza el intervalo de confianza a dos colas, es decir el que precisa el límite superior

e inferior. Se calcula con la siguiente formula utilizando la mediaY :

N

tY2

1n,2

σ⋅± −α (6.6)

Donde

tα/2,n-1 = el estadístico t de Student de nivel de confianza α/2 y de n-1 grados

de libertad del sistema.

Grados de libertad (gl) ;se usan para estimar el número de categorías

independientes en un test o experimento.

gl=n-r (6.7)

donde:

n= el número de sujetos en la muestra

r=el número de sujetos estadisticamente dependientes.

Cuando se trata de ajustar modelos estadísticos a un conjunto de datos, los

residuos se encuentran habitualmente en un espacio de menor dimensión que aquél

140

en el que se encontraban los datos originales. Los grados de libertad del error los

determina, precisamente, el valor de esta menor dimensión.

6.1.4 - Significancia estadística

Un resultado se denomina estadísticamente significativo cuando no es probable

que haya sido debido al azar. Una "diferencia estadísticamente significativa"

significa que hay evidencias estadísticas de que hay una diferencia. El nivel de

significación muchas veces se asocia con los test a los cuales se someten los datos

con fin de verificar una hipótesis. En cuanto al test de la hipotesis nula, el nivel de

significación es nada más que la probabilidad de tomar la decision de rechazar la

hipotesis nula cuando ella es verdad (cometiendo el error tipo I o α) o de aceptar la

hipótesis nula cuando la última no es cierta (cometiendo el error tipo II o β). En la

toma de la esa decisión muchas veces se usa el valor P donde P= 1- α. Entonces el

valor experimental se compara con el valor correspondiente a la tabla (para dado

nivel de significación y dados grados de libertad). Si el valor experimental es

superior al número de la tabla la hipótesis nula se rechaza mientras que al ser

superior el número de la tabla la hipótesis nula se tiene que aceptar para dado nivel

de significación. Cuanto mayor sea el valor experimental , más significativo será el

resultado y más fuerte será la evidencia de que el resultado no se debe a una mera

coincidencia. El nivel de significación es comunmente representado por el símbolo

griego α (alpha). Cuando se hacen este tipo de comparaciones es importante tomar en

cuenta si el ensayo es unilateral o bilateral. Por ejemplo si el ensayo es unilateral y

se trabaja en un nivel de significación α = 0,05 en realidad 5 valores en cada cien se

pueden dar por azar y entonces la probabilidad de que sean no debidos al azar es P=

1-0,05=0,95. Si, en cambio, el ensayo es bilateral en el mismo caso P= 1-2α = 0,90.

En muchos trabajos el nivel de significación se denota con una , dos o tres

estrellitas. Existen tres niveles; cuando P ≥ 0,95 (α ≤ 0,05); P ≥ 0,99 (α ≤ 0,01 ) y P

≥ 0,999 (α ≤ 0,001 ) cuya mención indica la significación de las conclusiones que se

formulan. Cuando el valor experimental obtenido es inferior al tabulado se concluye

que "no hay significación" y se indica con (-) ó (NS); cuando dicho valor supera al

valor tabulado para P ≥ 0,95 y no al tabulado para P ≥ 0,99 se indica con (*); si el

141

valor experimental es mayor que el tabulado para P ≥ 0,99 la conclusión es (**) y

para P ≥ 0,999 (***). Cuando :

VE < VT (NS)/(-)

VE> VT(P 0,95) *

VE > VT(P O,99) **

VE > VT(P 0,999) ***

Siendo VE=valor experimental; VT=valor tabulado

Generalmente, en el caso de los alimentos lod niveles (*) y (**) se consideran

suficientes.

6.2 - Análisis de varianza (ANOVA )

Análisis de varianza (ANOVA )es un método general con aplicaciones muy

variadas y que puede llegar a ser complejo de acuerdo a las derivaciones que tome.

Se utiliza en reemplazo del uso de una batería de test t-Student cuando se poseen

varias muestras. Cuanto mayor es el número de sistemas de análisis, realizar una

batería de test t no solo resulta dificultoso sino que ofrece pocas ventajas. Esta

técnica compara las medias de varias muestras y verifica si todas ellas pertenecen a

la misma población o si, unao más son significativamente diferentes y provienen de

poblaciones diferentes. El ANOVA debe ser considerado en la práctica un test de

diferencias de medias a dos colas (ya que las medias en sí mismas pueden aumentar o

decrecer) que opera vía un test de cambio de varianza a una cola, el cual se describirá

más adelante (test F).

La variación total que existe en una distribución global de valores o medidas

puede ser segregada en categorías representando por un lado los efectos

identificables y por otro lado la variación debida a causas no identificables. La

variación total del conjunto de datos es llamada Suma de Cuadrados Totales (SST).

Dicha suma puede dividirse en dos contribuciones: una Suma de Cuadrados debida

a la Regresión (SSR) y una Suma de Cuadrados Residual (SSE).

142

Suma de Cuadrados Totales (SST) se obtiene sumando los cuadrados de las

desviaciones del valor observado en cada sistema Yi respecto de la media Y .

( )2N

1ii YYSST ∑

=

−= (6.9)

La Suma de cuadrados Totales tiene asociados N-1 grados de libertad ya que

existe la restricción

0YYN

1ii =−∑

=

(6.10)

Suma de Cuadrados debida a la Regresión (SSR) es una expresión de la

variación que resulta tomando en cuenta por un lado la relación de la variable

independiente con la dependiente a partir del modelo de regresión aplicado y por

otro lado la medición de la variable dependiente que se obtiene experimentalmente.

En otras palabras es la suma para N elementos de la población de los cuadrados de

la diferencia entre la media Y muestreal y el valor predicho del modelo iY para una

corrida i.

( )2

i YYSSR ∑ −= (6.11)

Los grados de libertad en este caso se definen a partir del número de

parámetros p que usa el modelo para relacionar la variable medida y la variables

independientes del experimento. Esta suma de cuadrados tiene asociados p-1 grados

de libertad.

Dividiendo la SSR por p-1 obtenemos la Media de Cuadrados debida a la

Regresión (MSR):

(6.12)

Suma de Cuadrados Residual(SSE) es la variación debida a causas no

identificables y representa el error observado de las variables medidas (dado que el

modelo es correcto). Se define como la suma de los cuadrados de las diferencias

1pSSR

MSR−

=

143

entre los valores medidos de N elementos de la población y los valores de los

mismos elementos tal como son predichos por el modelo.

( ) ∑∑==

=−=N

1i

2i

2N

1iii rYYSSE (6.13)

En el caso de la Suma de Cuadrados Residual se asocian N-p grados de

libertad

La SSE se usa para calcular la Media de Cuadrados Residual(MSE) al

dividirla por los grados de libertad asociados a ella, según la siguiente fórmula:

(6.14)

Los residuales se usan para evaluar el ajuste del modelo a los valores

experimentales. La suma de los residuales de cada corrida teóricamente es siempre

cero, sin embargo, en la práctica puede no serlo exactamente pero debería

aproximarse.

Modelo de los parámetros de un ANOVA

Fuente gl Suma de Cuadrados Media de cuadrados

SSR DEBIDO A p-1 SSR MSR = LA REGRESION p-1

SSE RESIDUAL N-p SSE MSE = N-p

TOTAL N-1 SST

6.2.1- Test F de significación de la regresión

Un test que comunmente se realiza para verificar la significancia de la

regresión es el test F. Si el valor calculado de F > F tablas nos permite inferir que

pNSSE

MSE−

=

144

la variación de la información explicada por el modelo o relación propuestos es

significativamente mayor que la variación debida a causas no identificables

(residuales) y que el efecto observado no se debió al azar . Es de destacar que los

test t-Student y F son esencialmente los mismos . Para un diseño completamente

aleatorio donde se estudian sólo dos tratamientos y dos test t a dos colas para

muestras independientes se verifica que:

F = t² (6.15)

( )( )pNSSE

1pSSRMSEMSR

F−−== (6.16)

Una vez calculado el F se busca en las correspondientes tablas el valor de F

para el nivel de significación con el cual se trabaja para grados de libertad p-1 y N-

1.

El F de las tablas se compara con el F calculado. Si el valor del F calculado es

mayor que el de las tablas la hipótesis nula se rechaza para α nivel de significación,

y significa que por lo menos un parámetro de los que describen la regresión tiene

efecto sobre la respuesta. Cuanto más grande sea el F calculado mejor describirá la

regresión el modelo propuesto ya que también significa que aumenta la razón de la

varianza debida a la regresión sobre la viarianza debida a causas no identificables.

6.2.2 -Coeficiente de determinación (R2)

El coeficiente de determinación nos informa sobre la proporción de la

variación que existe entre los valores experimentales y lo propuesto por el modelo.

Es un estadístico que evalúa cuán bien se ajusta el modelo estadístico aplicado. En

la regresión, en particular, el coeficiente de determinación es una medida de cuánto

la linea de regresión se aproxima a los datos experimenteles. Su expresión

porcentual se da por la fórmula:

100SSTSSR

R2 ⋅= (6.17)

145

También se usa el coeficiente de determinación ajustado por los grados de

libertad del modelo:

( )( )1NSST

pNSSE1R2

aj −−−= (6.18)

Siempre se busca que tanto R2 como R2aj se acercan a lo posible al 100 ya

que es una medida del ajuste del modelo. Cabe añadir que por mucho que se

acerque el coeficiente de deteriminación al cien nunca lo será, ya que en este caso

se trabajaría sin error.

6.2.3 - Análisis de residuales

En el análisis de los residuales siempre se asume que los errores:

• son normalmente distribuídos con media igual a cero

• tienen varianza constante

• son independientes entre ellos

Existen herramientas gráficas y pruebas estadísticas se usan con fin de

comprobar la validez de las suposiciones recién mencionadas.

6.2.3.1- Versus valores predichos, i

Y∧

Se grafican los valores de los residuales (ri) versus los valores predichos por

el modelo. Dichos residuales no se grafican en función de los valores observados

(Y i) debido a que ambos grupos de valores están correlacionados. Debe observarse

una distribución uniforme horizontal de los residuales en torno a los valores

predichos,i

Y∧

(homocedasticidad). Pueden manifestarse algunos comportamientos

anormales tales como los que se describen a continuación.

• Si la varianza del modelo no es constante y se incrementa, es necesario

realizar un análisis de cuadrados mínimos especial o bien una

transformación (Ln (Y); Y ; 1/Y; etc.) en la respuesta de interés :

146

• Si el término independiente β0 no fue incluido en el análisis, la banda se

desplaza:

• Si falta incluir algunos términos lineales y/o cuadráticos en el modelo

postulado la banda se curva:

Estas desviaciones, además de detectarse visualmente, pueden medirse

mediante parámetros definidos, los cuales no se detallarán en este apéndice.

iY∧

r i

r i

iY∧

iY∧

r i

147

7. BIBLIOGRAFÍA

.

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BIOQ. MIRYAM SICILIANO DRA. SANDRA GUERRERO

TESISTA DIRECTORA

TESIS de Maestría en “Tecnología de los Alimentos” "ESTUDIO DE ...

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